CN105132575B

CN105132575B - 骨质疏松症的分子标志物及其应用

Info

Publication number: CN105132575B
Application number: CN201510627056.4A
Authority: CN
Inventors: 董东; 杨承刚
Original assignee: Gu'an Bojian Biotechnology Co Ltd
Current assignee: GU'AN BOJIAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD.
Priority date: 2015-09-28
Filing date: 2015-09-28
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2035-09-28
Also published as: CN105132575A

Abstract

本发明公开了LYPD3基因及其表达产物可以作为骨质疏松症诊断的分子标志物。本发明通过QPCR实验和Western blot实验证明了LYPD3基因在正常人和骨质疏松症患者的血液或者骨组织存在差异表达，可以作为早期诊断骨质疏松症的指标。另外，本发明还公开了LYPD3基因及其表达产物可以作为骨质疏松症治疗的靶标，用于指导新药的研发。

Description

骨质疏松症的分子标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及LYPD3基因在骨质疏松症的诊断、治疗中的用途。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis)是一种系统性骨病，其特征是骨量下降和骨的微细结构破坏，表现为骨的脆性增加，因而骨折的危险性大为增加，即使是轻微的创伤或无外伤的情况下也容易发生骨折。常常在不知不觉中发生椎体压缩骨折，也可因咳嗽、打喷嚏、轻微外伤等诱发椎体骨折。骨质疏松症是一种多因素所致的慢性疾病。在骨折发生之前，通常无特殊临床表现。该病女性多于男性，但各年龄时期均可发病，常见于绝经后妇女和老年人。随着我国老年人口的增加，骨质疏松症发病率处于上升趋势，在我国乃至全球都是一个值得关注的健康问题。

骨质疏松的危害性主要在于其所引起的骨折，可发生于全身任何部位，最常见于腰椎、髋关节部位和桡骨。1999年调查发现，中国60岁以上骨质疏松患病率，腰椎2～4：男女分别11％和21％；股骨颈：分别为11％和27％。绝经后妇女的1/3～1/2存在骨质疏松症。在美国，该病每年约使150万人发生骨折，与此有关的医疗费用超过100亿美元。年逾65岁的妇女中1/3将发生椎骨骨折，年龄更大时，1/3的女性和1/6的男性将发生髋部骨折，其中20％死于骨折所致的各种并发症，另有30％需要长期的家庭护理。虽然我国目前尚缺乏骨质疏松并有骨折的确切发生率资料，但由于老年人口众多，估计相当可观。骨质疏松症在中国同样不仅是一个医疗问题，也是一个严重的公共卫生和社会问题。

骨质疏松症的检测包括实验室检查指标的检测和辅助检测。

实验室检查指标：

骨质疏松症患者部分血清学生化指标可以反应骨转换(包括骨形成和骨吸收) 状态，在骨的高转换状态(例如Ⅰ型骨质疏松症)下，这些指标可以升高，也可用于监测治疗的早期反应。但其在骨质疏松症中的临床意义仍有待于进一步研究。这些生化测量指标包括：骨特异的碱性磷酸酶(Bone-specific alkaline phosphatase，反应骨形成)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrated resistant acid phosphatse，反应骨吸收)、骨钙素(Osteocalcin，反应骨形成)、Ⅰ型原胶原肽(Type I procollagenpeptidase，反应骨形成)、尿吡啶啉(Urinary pyridinoline)和脱氧吡啶啉(Urinary deoxypyridinoline，反应骨吸收)、Ⅰ型胶原的N-C-末端交联肽(cross-linked N-and C-telopeptide of type I collagen，反应骨吸收)。正如前面所提到的，使用生化指标检测骨质疏松症的精确度不够。

辅助检查：包括骨影像学检查和骨密度检测。辅助检查的对象一般都是骨质疏松症的晚期患者，不能用于早期骨质疏松症患者的筛查。

基于现有技术中检测骨质疏松症的手段的局限性，寻找一种有效的能够在早期即可诊断骨质疏松症发生的方法是亟待解决的问题。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨质疏松症(Osterarthritis，OA)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨质疏松症的诊断方法，使用基因标志物来诊断骨质疏松症的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测LYPD3基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应用。

进一步，所述检测LYPD3基因表达的产品包括检测LYPD3基因mRNA水平的产品、和/或检测LYPD3蛋白水平的产品。

进一步，所述检测LYPD3基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测LYPD3基因表达以诊断骨质疏松症的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增LYPD3基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增LYPD3基因的引物；所述用免疫检测诊断骨质疏松症的产品包括：与LYPD3蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨质疏松症的产品包括：与LYPD3基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨质疏松症的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与LYPD3蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与LYPD3基因的核酸序列杂交的探针。

所述用实时定量PCR诊断骨质疏松症的产品至少包括的一对特异扩增LYPD3基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

所述检测LYPD3基因表达的产品可以是检测LYPD3基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。

所述诊断骨质疏松症的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨质疏松症的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知LYPD3基因的异常与骨质疏松症相关也属于LYPD3基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种诊断骨质疏松症的工具，所述工具包括检测LYPD3基因表达的试剂；所述试剂包括检测LYPD3基因mRNA的引物和/或探针、检测LYPD3蛋白的抗体。

所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测LYPD3基因转录水平的针对LYPD3基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的LYPD3蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括LYPD3基因在内的多个基因(例如，与骨质疏松症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括LYPD3蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨质疏松症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨质疏松症的标志物同时检测，可大大提高骨质疏松症诊断的准确率。

其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测LYPD3基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括LYPD3蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测LYPD3基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对LYPD3基因的引物和/或探针。根据LYPD3基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测LYPD3基因表达水平的引物和探针。

所述试纸包括检测LYPD3基因表达的试剂。

所述高通量测序平台包括检测LYPD3基因表达的试剂。

与LYPD3基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

进一步，所述LYPD3蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述LYPD3蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与LYPD3蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述检测LYPD3基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。

本发明还提供了LYPD3基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。所述抑制剂包括抑制LYPD3基因表达的试剂、和/或抑制LYPD3基因表达产物的试剂。

进一步，所述抑制LYPD3基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译的试剂；所述抑制LYPD3基因表达产物的试剂包括抑制LYPD3基因 mRNA的试剂、抑制LYPD3蛋白的试剂。所述抑制LYPD3基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的试剂。所述抑制LYPD3蛋白的试剂包括抑制LYPD3蛋白稳定性的试剂、抑制LYPD3蛋白活性的试剂、抑制LYPD3蛋白功能的试剂。

进一步，抑制LYPD3基因mRNA的试剂包括针对LYPD3基因mRNA的双链核糖核酸；抑制LYPD3蛋白功能的试剂包括LYPD3抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制LYPD3蛋白功能的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。

在本发明的具体实施方案中，所述针对LYPD3基因mRNA的双链核糖核酸是siRNA。为了确保LYPD3基因能够被高效剔除或沉默，根据LYPD3基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of WhiteheadInstitute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi DesignerofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&SullivanExcellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。

优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的LYPD3基因和/或其表达产物的抑制剂。

本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。

本发明的药物组合物还可与其他治疗骨质疏松症的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。

在本发明的上下文中，“LYPD3基因”包括LYPD3基因以及LYPD3基因的任何功能等同物的多核苷酸。LYPD3基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中LYPD3基因(NC_000019.10)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，LYPD3基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述LYPD3基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，LYPD3基因表达产物包括LYPD3蛋白以及LYPD3蛋白的部分肽。所述LYPD3蛋白的部分肽含有与骨质疏松症相关的功能域。

“LYPD3蛋白”包括LYPD3蛋白以及LYPD3蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括LYPD3蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与LYPD3的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，LYPD3蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述LYPD3蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是LYPD3蛋白的融合蛋白。对于与LYPD3蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留LYPD3蛋白的生物学活性即可。

本发明的LYPD3蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留LYPD3蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断骨质疏松症”既包括判断受试者是否已经患有骨质疏松症、也包括判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险。

在本发明的上下文中，“治疗骨质疏松症”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了LYPD3基因表达与骨质疏松症相关，通过检测受试者血液或骨组织中LYPD3的表达，可以判断受试者是否患有骨质疏松症、或者判断受试者是否存在患有骨质疏松症的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种新的分子标记物-LYPD3基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨质疏松症的早期诊断，从而降低骨质疏松症的死亡率。

附图说明

图1显示利用QPCR检测LYPD3基因在血液中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测LYPD3基因在骨组织中的表达情况；

图3显示利用Western blot检测LYPD3蛋白在骨组织中的表达情况；

图4显示利用QPCR检测siRNA对LYPD3基因的干扰效率；

图5显示利用Western blot检测siRNA对LYPD3蛋白表达的影响；

图6显示抑制LYPD3蛋白功能对成骨细胞增殖的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1血液中LYPD3基因的差异表达

1、研究对象：

随机选择即将进行髓关节置换术的患者，检测骨密度，选择骨质疏松症患者50例，正常骨密度对照组(为外伤骨折，检测无骨质疏松症)40例，年龄50-70岁。问卷方式调查受试者生活方式和健康状况等情况。

骨质疏松症患者的纳入标准：(1)符合骨质疏松症诊断标准者，参照《中国人骨质疏松症建议诊断标准(第二稿)；(2)患者均知情同意。

骨质疏松症患者的排除标准：继发性骨质疏松症者。

2、血液总RNA提取

使用百泰克血液RNA提取试剂盒进行血液总RNA的提取

(1)取全血250μl(或0.25g)至RNase-Free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液RLS。

(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无RNA酶的离心管中。

(4)每1ml RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。

(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。

(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。

(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。

(8)加500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。

(9)加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。

(10)加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。

(11)将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(12)取出吸附柱RA，放入一个无RNA酶的离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无RNA酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。

3、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)

NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

4、逆转录

利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。

5、QPCR

(1)引物设计

根据Genbank中LYPD3基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

LYPD3基因：

正向引物为5’-ATCTGTCACCACTTCTAC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-TGTTCTACTCCCTGTCTC-3’(SEQ ID NO.4),

GAPDH基因：

正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)按照表1配制PCR反应体系：

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。

表1 PCR反应体系

试剂	体积
		正向引物	1μl
反向引物	1μl
		SYBR Green聚合酶链式反应体系	12.5μl
模板	2μl
		去离子水	补足25μl

(3)PCR反应条件：95℃5min，(95℃10s，60℃50s)*40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

6、统计学方法

结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图1所示，与正常人相比，骨质疏松症患者的血液中LYPD3基因mRNA表达量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2骨组织中LYPD3基因的差异表达

1、研究对象：

骨质疏松症患者的排除标准：继发性骨质疏松症者。

2、骨组织RNA的获取

从髓关节置换术取下的人股骨头中，取硬质骨1g，迅速置于液氮中保存。在实验室使用Trizol一步法提取人骨组织中的总RNA，通过Nanodrop ND-1000读取260nm和280nm处的吸光度值(A)测定RNA溶液的纯度。经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。

2.2逆转录

步骤同实施例1。

2.3QPCR

步骤同实施例1。

2.4结果

结果如图2所示，与正常人相比，骨质疏松症患者的骨组织中LYPD3基因mRNA表达量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2LYPD3蛋白的差异表达

1、研究对象同实施例1。

1、人成骨细胞的取材和培养

从髓关节置换术取下的人股骨头中取松质骨，剔除软组织，生理盐水反复冲洗骨质，冲洗液澄清后，用PBS液冲洗摇荡3遍，剪成1mm³的碎片，采用酶消化法分离并纯化成骨细胞。将其接种于30ml的培养瓶中(培养瓶加入适量的DMEM-F12(1：1)培养基与10％胎牛血清)，置于37℃、5％的CO₂恒温培养箱中培养。2d后换液并清除未贴壁的细胞，以后每3d换液1次，倒置显微镜下观察。待原代细胞融合成单层后，用2.5g/L的胰酶消化、传代。

2、细胞总蛋白的提取

取对数期生长良好的成骨细胞进行细胞总蛋白的提取，按照EpiQuik全细胞提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。

3、Western blot检测

细胞总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40C过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。

4、统计学处理

将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将LYPD3蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图3所示，与正常人相比，骨质疏松症患者骨组织中LYPD3蛋白的表达水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4抑制LYPD3基因表达

1、实验分组：

实验分为四组：阴性对照组(siRNA-NC)、siRNA1-LYPD3组、siRNA2-LYPD3组、siRNA3-LYPD3组。

2、siRNA设计合成

由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA。

siRNA1-LYPD3：

正义链为5’-AUUUAUGUGCCAGAAACUGAU-3’(SEQ ID NO.7)；

反义链为5’-CAGUUUCUGGCACAUAAAUGC-3’(SEQ ID NO.8)，

siRNA2-LYPD3：

正义链为5’-AAUUAAAUCUUUAUUGAGGCA-3’(SEQ ID NO.9)；

反义链为5’-CCUCAAUAAAGAUUUAAUUAC-3’(SEQ ID NO.10)，

siRNA3-LYPD3：

正义链为5’-AGUAAUUAAAUCUUUAUUGAG-3’(SEQ ID NO.11)；

反义链为5’-CAAUAAAGAUUUAAUUACUUU-3’(SEQ ID NO.12)，

阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：

正义链为5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’(SEQ ID NO.13)；

反义链为5’-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3’(SEQ ID NO.14)。

体外培养骨质疏松症患者的成骨细胞，方法如实施例3，转染前24h将成骨细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板，加入DMEM/F12培养基，贴壁过夜，待细胞汇合达80-90％时进行转染。转染前更换为不含血清的DMEM/F12培养基。用250μl DMEM/F12稀释siRNA(终浓度为33nM)，轻轻吹吸3-5次混匀。轻轻颠倒混匀转染试剂，用250μl DMEM/F12培养基稀释5μl脂质体2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。将转染复合物加入到6孔细胞板中，前后轻摇细胞板混合均匀。细胞板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。转染6h换含血清的DMEM/F12 培养基。

2、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率。

2.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。

2.2逆转录

按照实施例1的方法进行。

2.3QPCR

按照实施例1的方法进行。

2.4结果

结果如图4所示，与siRNA2-LYPD3、siRNA3-LYPD3相比，siRNA1-LYPD3能够更有效的抑制LYPD3基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，使用siRNA1-LYPD3进行后续的实验。

3、Western blot实验检测siRNA1-LYPD3的干扰效率

步骤同实施例3。

结果如图4所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA1-LYPD3的细胞中LYPD3蛋白的含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5LYPD3基因的表达对成骨细胞增殖能力的测定

1、实验分组

组1：正常人成骨细胞转染siRNA-NC(正常+siRNA-NC)；

组2：骨质疏松患者成骨细胞转染siRNA-NC(骨质疏松+siRNA-NC)；

组3：骨质疏松患者成骨细胞转染siRNA-LYPD3(骨质疏松+siRNA-LYPD3)；

2、MTT实验

胰酶消化转染后的成骨细胞，制成细胞悬液，以2×10⁴/ml浓度接种于96孔板，每孔200μl，每组设三个平行孔。转染24h、48h、72h，在每孔中加入MTT(5mg/m1)20μl，置培养箱中继续培养4h，小心弃上清液，加入二甲基亚砜 150μl，振荡5min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在490nm处读取吸光度值(OD值)。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如表2所示，与正常骨密度人相比，骨质疏松患者的成骨细胞增殖缓慢，骨质疏松患者干扰LYPD3基因表达后，成骨细胞的增殖加快，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，LYPD3基因表达抑制了骨质疏松患者成骨细胞的增殖，使用抑制LYPD3基因表达的试剂后成骨细胞的增殖抑制作用解除。

表2成骨细胞MTT实验测定OD值

时间	24h	48h	72h
				实验组	OD值(光密度)	OD值(光密度)	OD值(光密度)
正常+siRNA-NC	0.35±0.03	0.67±0.04	1.15±0.06
				骨质疏松+siRNA-NC	0.21±0.04	0.37±0.05	0.64±0.02
骨质疏松+siRNA-LYPD3	0.31±0.02*	0.58±0.06*	0.96±0.04*

注：*代表与骨质疏松对照组比较，P<0.05

实施例6成骨细胞抗体中和实验

1、步骤：

将成骨细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔2×10³cells/孔/200μl，细胞贴壁后进行如下处理：

实验组1：正常骨密度组织来源的成骨细胞中加入无关单抗(1:30)，作为对照组；

实验组2：骨质疏松患者的成骨细胞中加入无关单抗(1:30)(骨质疏松+无关单抗)；

实验组3：骨质疏松患者的成骨细胞中加入抗人LYPD3单抗(1:30)(骨质疏松+LYPD3单抗)

将细胞在37℃、5％CO₂培养箱孵育24小时后，加入³H-TdR(1μCi/孔)，再培养24小时，收集细胞，加液体闪烁液，β计数仪检测cpm值。

2、统计学方法

3、结果

结果如图6所示，相比于对照组，(骨质疏松+无关单抗)组细胞增殖变慢，而加入LYPD3单抗的(骨质疏松+LYPD3单抗)组细胞的增殖得到了恢复。上述实验结果表明，抑制LYPD3蛋白的功能可以促进成骨细胞增殖。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.检测LYPD3基因表达的产品在制备诊断骨质疏松症的工具中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR检测LYPD3 基因表达以诊断骨质疏松症的产品；通过RT-PCR检测LYPD3 基因表达以诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增LYPD3基因的引物；通过实时定量PCR检测LYPD3 基因表达以诊断骨质疏松症的产品至少包括一对特异扩增LYPD3基因的引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过实时定量PCR检测LYPD3 基因表达以诊断骨质疏松症的产品至少包括的一对特异扩增LYPD3基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。

4.LYPD3基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗骨质疏松症的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制LYPD3基因表达的试剂、和/或抑制LYPD3基因表达产物的试剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑制LYPD3基因表达产物的试剂包括抑制针对LYPD3基因的siRNA、和/或LYPD3蛋白的抗体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述针对LYPD3基因的siRNA序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。