CN105400895B - Shisa4基因作为椎间盘退行性病变诊治标志物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了SHISA4基因及其表达产物可以作为椎间盘退行性病变诊治的分子标志物。本发明通过检测受试者椎间盘组织中SHISA4基因及其表达产物的含量可以判断受试者是否患有椎间盘退行性病变或者诊断受试者是否存在患有椎间盘退行性病变的风险。另外，本发明通过研究体外培养的髓核细胞的生长、衰老、凋亡指标证明SHISA4基因作为治疗椎间盘退行性病变的药物靶点。

Description

SHISA4基因作为椎间盘退行性病变诊治标志物的用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人SHISA4基因在椎间盘退行性病变的诊断、治疗中的用途。
背景技术
椎间盘退行性病变(Degenerative disc disease)，表现为椎间盘空间变小、突出、挤压、封存等症状，与背部疼痛密切相关，且该病造成了严重的社会经济负担。针对椎间盘退行性病变的手术治疗存在较大风险，而早期的介入治疗可以达到更好的疗效，另外，目前对该病的具体发病机制尚未明确阐述。因此，寻找椎间盘退行性病变早期诊断及预后相关的特异性分子标志物对实现椎间盘退行性病变的早期诊断及个体化治疗具有深远意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于椎间盘退行性病变早期诊断的分子标志物。相比传统的椎间盘退行性病变的诊断方法，使用基因标志物来诊断椎间盘退行性病变的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测SHISA4基因表达的产品在制备诊断椎间盘退行性病变的工具中的应用。
进一步，所述检测SHISA4基因表达的产品包括检测SHISA4基因mRNA水平的产品、和/或检测SHISA4蛋白水平的产品。
进一步，所述检测SHISA4基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测SHISA4基因及其表达产物的表达水平以诊断椎间盘退行性病变的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括一对特异扩增SHISA4基因的引物；所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括一对特异扩增SHISA4基因的引物；所述用免疫检测诊断椎间盘退行性病变的产品包括：与SHISA4蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断椎间盘退行性病变的产品包括：与SHISA4基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断椎间盘退行性病变的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与SHISA4蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与SHISA4基因的核酸序列杂交的探针。
所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括的一对特异扩增SHISA4基因的引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
所述检测SHISA4基因表达的产品可以是检测SHISA4基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
所述诊断椎间盘退行性病变的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断椎间盘退行性病变的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知SHISA4基因的异常与椎间盘退行性病变相关也属于SHISA4基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断椎间盘退行性病变的工具，所述工具包括检测SHISA4基因表达的试剂；所述试剂包括检测SHISA4基因mRNA的引物和/或探针、和/或检测SHISA4蛋白的抗体。
所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测SHISA4基因转录水平的针对SHISA4基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的SHISA4蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括SHISA4基因在内的多个基因(例如，与椎间盘退行性病变相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括SHISA4蛋白在内的多个蛋白质(例如与椎间盘退行性病变相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与椎间盘退行性病变的标志物同时检测，可大大提高椎间盘退行性病变诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测SHISA4基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括SHISA4蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测SHISA4基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对SHISA4基因的引物和/或探针。根据SHISA4基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测SHISA4基因表达水平的引物和探针。
所述试纸包括检测SHISA4基因表达的试剂。
所述高通量测序平台包括检测SHISA4基因表达的试剂。
与SHISA4基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述SHISA4蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述SHISA4蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与SHISA4蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述检测SHISA4基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物对。
本发明还提供了SHISA4基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗椎间盘退行性病变的药物中的应用。
所述促进剂包括促进SHISA4基因表达的试剂和促进SHISA4基因表达产物的试剂；所述促进SHISA4基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进SHISA4蛋白含量的试剂；所述促进SHISA4基因表达产物的试剂包括促进SHISA4基因表达产物稳定性的试剂、促进SHISA4基因表达产物活性的试剂、促进SHISA4基因表达产物功能的试剂。
具体地，所述促进SHISA4基因表达的试剂包括：含有SHISA4基因的试剂、携带SHISA4基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有SHISA4蛋白质的试剂。
本发明的促进剂一方面可以用于补充内源性的SHISA4蛋白的缺失或不足，通过提高SHISA4蛋白的表达，从而治疗因SHISA4蛋白缺乏导致的椎间盘退行性病变。另一方面可以用于促进SHISA4蛋白的活性或者功能，从而治疗椎间盘退行性病变。
本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
本发明还提供了一种用于治疗椎间盘退行性病变的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的SHISA4基因和/或其表达产物的促进剂。
进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有SHISA4基因的药物或者含有SHISA4蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有SHISA4基因的药物或者含有SHISA4蛋白质的药物注入体内组织中。
本发明的药物还可与其他治疗椎间盘退行性病变的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
在本发明的上下文中，“SHISA4基因”包括SHISA4基因以及SHISA4基因的任何功能等同物的多核苷酸。SHISA4基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中SHISA4基因(NC_000001.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
优选地，SHISA4基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述SHISA4基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，SHISA4基因表达产物包括SHISA4蛋白以及SHISA4蛋白的部分肽。所述SHISA4蛋白的部分肽含有与椎间盘退行性病变相关的功能域。
“SHISA4蛋白”包括SHISA4蛋白以及SHISA4蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括SHISA4蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与SHISA4的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，SHISA4蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述SHISA4蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是SHISA4蛋白的融合蛋白。对于与SHISA4蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留SHISA4蛋白的生物学活性即可。
本发明的SHISA4蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留SHISA4蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断椎间盘退行性病变”既包括判断受试者是否已经患有椎间盘退行性病变、也包括判断受试者是否存在患有椎间盘退行性病变的风险。
在本发明的上下文中，“治疗椎间盘退行性病变”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。
本发明使用体外培养的髓核细胞来研究SHISA4基因对椎间盘退行性病变的治疗作用。本领域技术人员可知，椎间盘退行性病变发生的一个重要的生理特征在于髓核细胞的增殖减缓、衰老加快、凋亡加剧，因此本发明利用髓核细胞生长凋亡指标的变化来研究SHISA4基因与椎间盘退行性病变治疗的关系。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了SHISA4基因表达与椎间盘退行性病变相关，通过检测受试者SHISA4的表达，可以判断受试者是否患有椎间盘退行性病变、或者判断受试者是否存在患有椎间盘退行性病变的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-SHISA4基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现椎间盘退行性病变的早期诊断，从而降低椎间盘退行性病变的死亡率。
附图说明
图1显示利用基因芯片检测SHISA4基因在椎间盘退行性病变组织中的表达情况；
图2显示利用Western blot检测SHISA4蛋白在椎间盘退行性病变组织中的表达情况；
图3显示利用QPCR检测siRNA对SHISA4基因表达的干扰效率；
图4显示利用Western blot检测siRNA对SHISA4基因表达的干扰效率；
图5显示SHISA4抗体对髓核细胞增殖的影响；
图6显示利用Annexin V-FITC/PI双染色法检测SHISA4基因对髓核细胞凋亡的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1椎间盘退行性病变组织和正常对照组织中SHISA4基因的表达差异
1、样本收集
人正常椎间盘组织40例，取自外伤致脊柱爆裂性骨折患者。取椎间盘退行性病变手术患者的椎间盘组织40例，平均年龄75岁，根据Gr1es〔5〕评分标准，均为重度退变。样本收集时均得到患者及其家属同意。
2、髓核组织提取
正常髓核组织：手术接近完整摘取正常椎间盘组织，可见到外周白色的纤维环和中心胶冻样的髓核组织。用含双抗(青一链霉素)的生理盐水浸泡椎间盘10分钟，用刮匙轻轻将髓核组织从椎间盘中分离，双抗生理盐水浸泡冲洗直至无明显血迹为止，大约3-4次。
退变髓核组织：手术均从后侧入路，不能完整取出椎间盘。分离纤维环组织与髓核组织时，依靠肉眼、手感等进行区分。髓核组织呈胶冻状半透明状，纤维环呈白色柔韧状。髓核组织用眼科剪容易剪碎，无韧性。
3、在转录水平上检测SHISA4基因的表达
3.1组织总RNA的提取
使用Trizol一步法提取组织中的总RNA，通过Nanodrop ND-1000读取260nm和280nm处的吸光度值(A)测定RNA溶液的纯度。经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。
3.2RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，OD260/OD280为1.8-2.2。
3.3基因芯片杂交及扫描
总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，荧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit纯化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美国Agilent公司的人全基因表达谱芯片(4x 44K基因)，在芯片杂交炉中65℃杂交17h，然后洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
3.4芯片数据处理与分析
杂交后的芯片经芯片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
3.5统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P<0.05差异有显著性意义。
3.6结果
结果如图1所示，与正常对照组织相比，椎间盘退行性病变组织中SHISA4基因的mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
4、在蛋白水平上检测SHISA4基因的差异表达
4.1提取组织总蛋白
按照EpiQuik组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
4.2Western blot检测
将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色。
4.3统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将目的白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4.4结果
结果如图2所示，与正常对照组织相比，椎间盘退行性病变组织中SHISA4蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2干扰SHISA4基因的表达
1、siRNA设计合成
针对SHISA4的siRNA序列：
siRNA1-SHISA4：
正义链为5’-UGUCUUUACAGCUUUAAUCUA-3’(SEQ ID NO.3)；
反义链为5’-GAUUAAAGCUGUAAAGACAUA-3’(SEQ ID NO.4)，
siRNA2-SHISA4：
正义链为5’-UCUUUAGGAAGCCUUUAGGAA-3’(SEQ ID NO.5)；
反义链为5’-CCUAAAGGCUUCCUAAAGACA-3’(SEQ ID NO.6)，
siRNA3-SHISA4：
正义链为5’-UGUUGUAGAGCUGUUGAUCCC-3’(SEQ ID NO.7)；
反义链为5’-GAUCAACAGCUCUACAACAGC-3’(SEQ ID NO.8)
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：
正义链为5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’(SEQ ID NO.9)；
反义链为5’-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3’(SEQ ID NO.10)。
2、细胞培养
椎间盘髓核组织放入盛有10m12％II型胶原酶的100ml烧杯中，磁力搅拌器搅拌约60分钟。待组织完全溶解后，1000r/min离心10分钟，吸出上清液，用含10％胎牛血清的DMEM培养基lml轻轻吹散细胞，吸至50ml培养瓶中，加入10％胎牛血清的DMEM培养基6-8ml，静置于37℃、饱和湿度、5％CO2孵箱中培养3天。3天后倒置显微镜观察细胞贴壁生长情况，隔天换液。
3、细胞转染
将第2代的髓核细胞按1.5×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的高糖1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为、阴性对照组和实验组(20nM)，其中，阴性对照组siRNA与SHISA4基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别转染。
4、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率
4.1提取细胞总RNA
利用QIAGEN公司的组织/细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。
4.2逆转录和QPCR
逆转录：用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
QPCR扩增：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管。配制以下反应体系：SYBRGreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM)1μl，反向引物(5μM)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增SHISA4基因的正向引物序列为5’-AAGACCATAGCAGGCATC-3’(SEQ IDNO.11)，反向引物序列为5’-TAGCAACAGGAACAGAGG-3’(SEQ ID NO.12)；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-AAAGGGTCATCATCTCTG-3’(SEQ ID NO.13)，反向引物序列为5’-GCTGTTGTCATACTTCTC-3’(SEQ ID NO.14)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃10s，60℃60s)*45个循环。以SYBR
Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
4.3统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰SHISA4基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4.4结果
结果如图3显示，与siRNA2-SHISA4、siRNA3-SHISA4相比，siRNA1-SHISA4能够更有效的抑制SHISA4基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，使用siRNA1-SHISA4进行后续的实验。
5、利用Western blot检测siRNA的干扰效率
步骤和统计学方法同实施例1。
结果如图4所示，siRNA1-SHISA4能够更有效的抑制SHISA4蛋白表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3 SHISA4基因表达对髓核细胞增殖的影响
1、使用Cell Counting kit-8(cck-8)试剂盒用于检测髓核细胞增殖
1.1步骤
按照前面实施例2的方法进行正常髓核细胞的培养和转染，细胞分为三个实验组：
组1：细胞转染siRNA-NC，作为对照组；
组2：细胞转染siRNA1-SHISA4。
转染24h后，以2×105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，每个实验组设计三复孔，每孔100μl，放置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，24h细胞贴壁后，分别在所需检测的培养孔内每孔加入10μl CK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育1h，测定450nm处各孔吸光度值(OD值)。
1.2统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
1.3结果
结果如表1所示，与对照组相比，转染siRNA-SHISA4的髓核细胞增殖缓慢。上述实验结果表明，SHISA4基因过表达能够加快髓核细胞的增殖。
表1髓核细胞OD值
实验组 OD值(光密度)
siRNA-NC 0.1713±0.003
siRNA-SHISA4 0.0886±0.002
2、抗体中和实验
2.1步骤
将髓核细胞接种至96孔培养板中，将抗人SHISA4单抗按照1：25的比例加入培养液中混匀，同时设置无关单抗(1：25)为对照，经过与髓核细胞培养24小时后加入3H-TdR(1μCi/孔)，再培养24小时，收集细胞，加液体闪烁液，β计数仪检测cpm值。
2.2统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
2.3结果
结果如图5所示，与不加人SHISA4单抗的对照组相比，加人SHISA4单抗的髓核细胞增殖明显减慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 SHISA4基因对髓核细胞凋亡的影响
使用Annexin V-FITC/PI双染法利用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，步骤如下：
1、细胞转染：按照实施例2的方法对髓核细胞进行siRNA1-SHISA4和siRNA-NC的转染。
2、细胞转染48h后，收获细胞，按照Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(购自Invitrogen公司)的操作说明进行细胞处理。
3、将经过步骤2处理的细胞通过流式细胞仪检测。
4、统计学方法
统计细胞凋亡率，实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图6所示，与转染siRNA-NC细胞组相比，转染siRNA1-SHISA4的细胞凋亡率升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例5 SHISA4基因对髓核细胞衰老的影响
SA-β-gal染色检测髓核细胞的衰老情况。SA-β-gal是一种可鉴定衰老细胞的生物学标志物。按照细胞衰老测定试剂盒(Biovision公司)说明检测，观察并计数显微镜下细胞质内有蓝色的细胞百分数，判断细胞衰老的情况。每组设3个复孔，每次实验重复3次。
细胞培养和转染同实施例2。
细胞转染48h后进行SA-β-gal染色。
结果显示，转染siRNA-NC细胞组蓝色细胞平均百分数为7％，转染siRNA1-SHISA4细胞组蓝色细胞平均百分数为46％，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，SHISA4过表达可以抑制髓核细胞的衰老过程。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (6)

1.检测SHISA4基因表达的产品在制备诊断椎间盘退行性病变的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、或芯片检测SHISA4基因表达以诊断椎间盘退行性病变的产品；所述用RT-PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括一对特异扩增SHISA4基因的引物；所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括一对特异扩增SHISA4基因的引物；所述用免疫检测诊断椎间盘退行性病变的产品包括：与SHISA4蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断椎间盘退行性病变的产品包括：与SHISA4基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断椎间盘退行性病变的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与SHISA4蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与SHISA4基因的核酸序列杂交的探针。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断椎间盘退行性病变的产品至少包括的一对特异扩增SHISA4基因的引物如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括检测SHISA4基因表达的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测SHISA4基因mRNA的引物和/或探针、和/或检测SHISA4蛋白的抗体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测SHISA4基因mRNA的引物包括SEQID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物对。
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