CN102549156A - 毛发形状易感性基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与毛发形状相关的基因多态性和毛发形状易感性基因，以及用于判定各个被检测者中对毛发形状的遗传易感性的方法。所述毛发形状易感性基因是与以下单倍域相重叠的基因，并且是包含该单倍域的碱基序列的一部分或者全部的基因，其中，所述单倍域是在人1号染色体的1q32.1～1q32.2区域(D1S249～D1S2891)上的、通过对等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)标记进行连锁不平衡分析来确定的、并且由序列号1～3中任意一个所表示的碱基序列构成的单倍域。

Description

毛发形状易感性基因

技术领域

本发明涉及与毛发形状相关的基因、以及对于毛发形状的遗传易感性的判定、毛发形状类型的检测和/或判定、以及用于对毛发形状的调节有效的成分的筛选的标记、以及该标记的用途。

背景技术

根据毛发的卷曲程度，人的自然毛发形状一般可以分为直发、波浪发(wavy hair)、卷发(curly hair)、卷缩发(kinky hair、coiled hair)。因为毛发形状和发型是作为人的身体特征而容易识别的特性之一，另外，也是决定人的第一印象的重要因素，所以成为不论男女老少在美容上都重要关心的事。在卷曲程度强的卷缩发和卷发的情况下，因为发型的自由度受到限制而出现不能形成期望的造型等烦恼。另一方面，即使在直发的情况下，又会出现没有发量，容易看出素颜等烦恼。

作为改变毛发形状和发型的方法，广泛进行的有通过各种定型剂和吹风机/烫发器进行的理发、卷曲/拉直烫发处理等。但是虽然这些处理能够有效地改变毛发的形状，却对决定毛发形状的原因完全没有效果。因此，这些解决对策不是根本的对策，只是一时的方法，要维持毛发的形状以及发型的话需要频繁地重复这些处理，反而会增大对毛发的伤害，结果损坏美容上的价值。因此，期待开发出在毛发生长出来的时候就能改变毛发的形状，从根本上调节毛发形状的调节方法。

探索决定毛发形状的原因，希望在开发从根本上调节毛发形状的调节方法上，认定作为其原因的基因可以提供有用的信息。对于有关毛发形状的因素和基因，在引起毛发形状变化的遗传病(非专利文献1～3)和药剂产生的后天的卷发(非专利文献4)，或者卷发模型动物(非专利文献5、6)等中有报告。但是，其中展示的因素和基因只不过是表示对毛发形状产生影响的一个特殊例子，很难认为是决定人的自然毛发的形状的原因。

但是，近些年来基因组分析技术也有飞跃的进步，疾病和基因之间的关联性也慢慢被解开。特别是，不仅仅是在由单基因发生变异或者异常所产生的所谓遗传病中，而且在以糖尿病、高血压等生活习惯病为首的频率高的常见疾病(Common Disease)这样以低的外显率(Penetrance：在某种基因中具有变异的个体患有某疾病的比例)为特征的多基因性疾病中，频繁进行使用了患病同胞对连锁分析等的非参数连锁分析方法的发病基因(responsible gene)的探索(例如，参照非专利文献7)。另外，世界上也在大力进行基于常见疾病的疾病关联基因的变异为频率高的基因多态性(Common Variant)，虽然在健康人中也存在，但是在患者身上保有率显著较高的假说(CommonDisease-Common Variant)，通过使用了基因多态性(例如，SNP(SingleNucleotide Polymorphism)：单核苷酸多态性)的连锁不平衡分析来寻找发病基因(例如，参照非专利文献8)。

进一步，最近根据国际人类基因单倍体型图计划(The InternationalHapMap Project)的进展，整理了4个人群体中100万处以上的频率高的一般多态性(SNP)的数据库，不仅是对常见疾病，还对关系到取决于人种或者群体其表现型不同的一般特性、例如皮肤颜色和头发颜色、眼睛颜色等的基因的研究也在进行中(例如，参照非专利文献9、10)。

认为关于人的自然毛发的形状也是同样，也是根据人种或者群体其表现型不同的一般的特性。概括来说，亚洲人种多为直发，非洲人种主要为卷缩发(或者卷发)。印欧人种则为这中间的波浪发(wavyhair)特性的比例较高。对于此遗传模式，Rostand，J等首先观察，报告了相对于直发，卷发为常染色体(半)显性的特性(非专利文献11)。另外，NCBI的人的孟德尔式遗传数据库(OMIM、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/)中也有关于卷发特性的记载。但是，对于成为决定人的自然的头发形状的原因的基因，还没有彻底地进行系统的基因组分析研究，因此尚未发现。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Norgett EE et al.，Hum.Mol.Genet.9(18)，p.2761-2766，2000

非专利文献2：Moller LB et al.，Hum.Mutat.26(2)，p.84-93，2005

非专利文献3：Kjaer KW et al.，Am.J.Med.Genet.A.127A(2)，p.152-157，2004

非专利文献4：Cullen SI et al.，Arch.Dermatol.125(2)，p.252-255，1989

非专利文献5：Du X et al.Genetics.166(1)，p.331-340，2004

非专利文献6：Mann GB et al.，Cell.73(2)，p.249-61，1993

非专利文献7：Hanis CL et al.，Nat.Genet.13(2)，p161-166，1996

非专利文献8：Altshuler D et al.，Nat.Genet.26(1)，p.76-80，2000

非专利文献9：Sulem P et al.，Nat.Genet.39(12)，p.1443-1452，2007

非专利文献10：Sabeti PC et al.，Nature.449(7164)，p.913-918，2007

非专利文献11：Rostand J et al.，「An Atlas of Human Genetics 」，Hutchinson Scientific&Technical，London，pp.26-29，1964

发明内容

本发明提供一种毛发形状易感性基因，其中，所述毛发形状易感性基因是与以下单倍域相重叠的基因，并且是包含该单倍域的碱基序列的一部分或者全部的基因，其中，所述单倍域是在人1号染色体的1q32.1～1q32.2区域(D1S249～D1S2891)上的、通过对等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)标记进行连锁不平衡分析来确定的、并且由序列号1～3中任意一个所表示的碱基序列构成的单倍域。

另外，本发明还提供一种毛发形状判定标记，其中，所述毛发形状判定标记是包含以下部分碱基序列的寡核苷酸或者多核苷酸或者它们的互补链，其中，所述部分碱基序列是上述单倍域的碱基序列中的部分碱基序列，并且，所述部分碱基序列由连续的碱基序列构成，所述连续的碱基序列含有一个以上的单核苷酸多态性，所述单核苷酸多态性包括等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)、以及与该SNP连锁的SNP。

另外，本发明还提供一种对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定方法，其中，包括以下工序(a)～(c)：

(a)调制来自被检测者的基因组DNA的工序；

(b)从该基因组DNA中，检测出存在于上述单倍域中，等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)以及与该SNP连锁的单核苷酸多态性(SNP)的工序；以及

(c)在该检测出的SNP的等位基因频率在卷发者群体中比在非卷发者群体中在统计学上显著高的情况下，判定为该被检测者具有卷发的遗传素质；在该被检测出的SNP的等位基因频率在任意非卷发者群体中比在卷发者群体中在统计学上显著高的情况下，判定为该被检测者不具有卷发的遗传素质的工序。

另外，本发明还提供一种对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定方法，其中，所述判定方法包含在来自被检测者的基因组DNA中的序列号1～3所表示的碱基序列中的下述表中所示的碱基号的碱基中的任意一个以上中，识别该碱基是碱基(i)还是碱基(ii)，在为碱基(i)的情况下，判定为被检测者具有卷发的素质，在为碱基(ii)的情况下，判定为被检测者不具有卷发的素质的工序。

[表1]

另外，本发明还提供一种对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定用试药，其中，所述判定用试药含有在严格的条件下与本发明的毛发形状判定标记杂交的探针和/或引物。

另外，本发明还提供一种对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定用试剂盒，其中，所述判定用试剂盒含有上述试药。

另外，本发明还提供一种筛选毛发形状调节剂的方法，其中，

包括以下工序(a)和(b)：

(a)用被检测物质向含有本发明的毛发形状易感性基因的细胞给药的工序；以及

(b)从给药的被检测物质中，选择能够使存在于该毛发形状易感性基因上或者其附近、并且等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)以及和该SNP连锁的单核苷酸多态性(SNP)标记的碱基的多态性变换为其它多态性的物质作为毛发形状调节剂的工序。

另外，本发明提供一种毛发形状类型的标记，其中，所述毛发形状类型的标记由多核苷酸或者其部分多核苷酸构成；或者由多肽或者其部分多肽构成，其中，所述多核苷酸由序列号42、序列号44或者序列号46所表示的碱基序列、与其互补的碱基序列构成，所述多肽由序列号43、序列号45或者序列号47所表示的氨基酸序列构成。

另外，本发明提供一种用于扩增本发明的毛发形状类型的标记的引物，其中，所述引物由多核苷酸的部分多核苷酸构成，其中，所述多核苷酸由序列号42、序列号44或者序列号46所示的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成。

另外，本发明提供一种用于检测本发明的毛发形状类型的标记的探针，其中，所述探针由多核苷酸或者其部分多核苷酸构成，其中，所述多核苷酸由序列号42、序列号44或者序列号46所示的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成。

另外，本发明提供一种用于检测本发明的毛发形状类型的标记的抗体，其中，所述抗体特异性识别由序列号43、序列号45或者序列号47所示的氨基酸序列构成的多肽或者其部分多肽。

另外，本发明提供一种毛发形状类型的检测和/或判定方法，其中，

包括以下工序(a)～(c)：

(a)测定在来自被检测者的样品中本发明的毛发形状类型的标记的表达量的工序；

(b)将该(a)的测定结果与非卷发者的测定结果相比较的工序；以及，

(c)基于(b)的结果判断毛发形状类型的工序。

另外，本发明还提供一种毛发形状调节剂的评价或者选择方法，其特征在于，

包括以下(a)～(d)的工序：

(a)使被检测物质与本发明的毛发形状易感性基因或者由该基因编码的蛋白质可能表达的细胞相接触的工序；

(b)测定被接触的细胞的该基因或者该蛋白质的表达量的工序；

(c)将(b)中测定的表达量与不接触被检测物质的对照细胞的该基因或者该蛋白质的表达量进行比较的工序；

(d)基于(c)的结果，选择使该基因或者该蛋白质的表达量减少或者增多的被检测物质作为毛发形状调节剂的工序。

另外，本发明还提供一种毛发形状调节剂的评价或者选择方法，其特征在于，

包括以下的(a)～(c)的工序：

(a)向本发明的毛发形状易感性基因可能表达的细胞中，导入该毛发形状易感性基因的表达控制区域和报告基因的融合基因，并在被检测物质的存在条件下以及不存在条件下培养该细胞的工序；

(b)测定在被检测物质的存在条件下培养的细胞培养物中的报告基因表达产物的表达量，并将该量与在被检测物质的不存在条件下培养的细胞培养物中的报告基因表达产物的表达量进行比较的工序；

(c)基于所述(b)的比较结果，选择使报告基因表达产物的表达量增减的被检测物质作为毛发形状调节剂的工序。

另外，本发明提供一种毛发形状调节剂的评价或者选择方法，其特征在于，

包括以下的(a)～(c)的工序：

(a)使被检测物质和含有本发明的毛发形状易感性基因编码的蛋白质的水溶液、细胞或者由该细胞调制的细胞组分接触的工序；

(b)测定接触了该被检测物质的水溶液、细胞或者细胞组分中的该蛋白质的机能或者活性，并将该机能或者活性与不接触被检测物质的对照水溶液、对照细胞或者对照细胞组分中所述蛋白质的机能或者活性比较的工序；

(c)基于所述(b)的比较结果，选择使该蛋白质的机能或者活性增减的被检测物质作为毛发形状调节剂的工序。

另外，本发明还提供一种毛发形状类型的调节方法，其特征在于，控制人的头发发根部的本发明的毛发形状易感性基因的表达。

在一个实施方式中，本发明的毛发形状易感性基因选自CSRP1、NAV1、IPO9、TMEM58以及NUCKS1。

在本发明的毛发形状判定标记的一个实施方式中，所述的SNP是选自以下的碱基中的SNP：

(1)序列号1所表示的碱基序列中，碱基号1(dbSNP数据库ID：rs576697、T或者C)、1635(rs645390、G或者A)、2527(rs3767542、G或者A)、以及3766(rs675508、C或者A)所表示的碱基；

(2)序列号2所表示的碱基序列中，碱基号为7519(rs2271763、G或者A)、16901(rs10920260、T或者G)、30270(rs16849387、A或者G)、31333(rs12127375、C或者G)、50038(rs1495840、T或者A)、以及63008(rs10920269、G或者T)所表示的碱基；以及，

(3)序列号3所表示的碱基序列中，碱基号为24524(rs3805、T或者G)、以及60701(rs823114、G或者A)所表示的碱基。

在其它的实施方式中，上述毛发形状判定标记由10～601个碱基长度的连续碱基序列构成。

在本发明的对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定用试药的一个实施方式中，上述探针和/或者引物和含有上述(1)～(3)记载的碱基的SNP的区域杂交。

在本发明的毛发形状类型的标记的一个实施方式中，部分多核苷酸为15个碱基以上的多核苷酸。

在本发明的毛发形状类型的检测和/或判定方法的一个实施方式中，来自被检测者的样品是由从被检测者采集的活体样品调制的RNA或者由该RNA转录的互补多核苷酸。

在本发明的毛发形状类型的检测和/或判定方法的其它实施方式中，上述工序(a)是使从被检测者采集的活体样品和本发明的用于检测毛发形状类型的标记的抗体相接触，测定与该抗体结合的该活体样品中的本发明的毛发形状类型的标记的量的工序。

在本发明的毛发形状类型的检测和/或判定方法的其它实施方式中，从被检测者采集的活体样品为来自上皮组织或者上皮细胞的活体样品。

附图说明

[图1]毛发形状的表现型的图。

[图2]1号染色体中由患病同胞对连锁分析得到的微卫星标记和最大LOD。

[图3]11号染色体中由患病同胞对连锁分析得到的微卫星标记和最大LOD。

[图4]1号染色体中由患病同胞对连锁分析得到的微卫星标记和最大LOD.

[图5]含有SNP：rs576697，从SNP：rs576697到SNP：rs12403361的由序列号1所表示的碱基序列所示的3,926bp构成的单倍域的概念图。

[图6]含有SNP：rs1495840，从SNP：rs2820290到SNP：rs2250377的由序列号2所表示的碱基序列所示的76,945bp构成的单倍域的概念图。

[图7]含有SNP：rs823114，从SNP：rs823103到SNP：rs1772150的由序列号3所表示的碱基序列所示的68,637bp构成的单倍域的概念图。

[图8-1]表示卷发群和直发群的头发发根上的毛发形状易感性基因的表达量的图。A：CSRP1基因、B：IPO9基因。

[图8-2]表示卷发群和直发群的头发发根上的毛发形状易感性基因的表达量的图。C：NUCKS1基因。

[图9]表示各人种毛囊组织像的照片。箭头表示弯曲部位。

[图10]表示在人的毛囊器官培养体系中随着培养天数的经过的毛囊形态变化的照片。

[图11]表示毛发形状易感性基因表达调节剂对于毛囊形态的效果的图。A：石胡荽(Centipeda minima)、B：白豆蔻(Amomum kravanh)。

具体实施方式

本发明涉及提供与卷发或直发这样的人的自然毛发形状相关的基因多态性以及毛发形状易感性基因，进一步提供以这些信息为基础，用于判定对各个被检测者的毛发形状的遗传易感性的方法。另外，本发明涉及提供用于简单实施该方法的有用的试药以及试药试剂盒。进一步，本发明涉及提供用于检测·判定卷发和直发这样的人的自然毛发形状类型的标记(多核苷酸、多肽)，以及在使用该标记的毛发形状类型的检测和/或判定、和对毛发形状的调节有效的成分的评价·选择等中的该标记的用途。

本发明者们以寻找作为决定人的自然毛发形状的原因的基因为目的，以日本人卷发家族、以及日本人卷发者群体和非卷发者群体为对象进行基因组分析，其结果在1号染色体1q32.1～1q32.2区域上认定与毛发形状相关的基因多态性、也就是毛发形状易感性SNP标记，同时认定毛发形状易感性基因。另外，本发明者们探索了毛发形状和毛发发根部处各种基因的基因表达之间的关系，结果发现非卷发者和卷发者之间在发根部上述毛发形状易感性基因的表达量显著不同。这些基因为毛发形状易感性基因，可以作为用于检测和/或判定毛发形状类型的标记。基于这些发现，本发明者们完成本发明。

根据本发明，提供与卷发和直发这样的人的自然的毛发形状关联的毛发形状易感性基因以及毛发形状易感性SNP标记、以及利用了这些的毛发形状判定标记。通过对本发明的毛发形状易感性基因和SNP标记、以及毛发形状判定标记进行详细地分析，可以进行与毛发形状相关联的毛发形成的机理、以及用于实现毛发形状的调节的确切方法的开发等的应用研究。

另外，通过本发明的对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定方法，可以更加简便并且迅速地进行决定各个被检测者的毛发形状的主要原因的基因的探索，以及对各个被检测者的后天的毛发形状的变化的易感性，也就是将来毛发形状变化的风险度的判定。进一步，基于此结果，可以提供对于各个人的确切的毛发形状的调节方法。另外，通过本发明的对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定用试药以及含有该试药的试剂盒，可以进一步简便并且迅速地实施上述判定方法。

另外，根据本发明，可以不对毛发造成伤害而检测·判定卷发、卷缩发这样的毛发形状或者性状。另外，通过本发明的筛选对调节毛发形状有效的成分的方法而选择的物质，可以作为对毛发形状调节有效的毛发形状调节剂使用，另外，还可以用于含有该试剂的医药品、医药部外品、化妆品、或者健康食品等的制造。另外，根据本发明，可以提供利用本发明得到的毛发形状易感性SNP标记的毛发形状的调节方法。

1.本发明所使用的用语的定义

本说明书中的碱基序列(核苷酸序列)、核酸等的通过略号的表示是根据IUPAC-IUB的规定(IUPAC-IUB communication on BiologicalNomenclature，Eur.J.Biochem.，138，9，1984)、《用于制作包含碱基序列或者氨基酸序列的说明书等的指导原则》(日本特许厅编)、以及该技术领域中惯用记号而进行的表示。

在本说明书中，“DNA”不仅包含双链DNA，还包含构成该双链DNA的有义链和反义链这样的各单链DNA。本说明书中“基因”，只要没有特别提到，包含含有人类基因组DNA的双链DNA、以及单链DNA(有义链)、以及具有和该有义链互补的序列的单链DNA(反义链)、以及这些DNA的片段中的任意种。另外，在本说明书中“基因”只要是没有特别提到，不区分表示调节区域、编码区域、外显子以及内含子。另外，在该“基因”或者“DNA”中，不仅包括以特定碱基序列表示的“基因”或者“DNA”，还以与其所编码的蛋白质在生物学的机能上同等为限，包括编码其同源物(homologue)、衍生物以及变异体的“基因”或者“DNA”。

另外，在本说明书中，“核苷酸”、“寡核苷酸”以及“多核苷酸”与核酸同义，含有DNA、RNA这两者。该DNA中含有cDNA、基因组DNA以及合成DNA中的任意种。另外，该RNA中包含总RNA(totalRNA)、mRNA、rRNA、以及合成的RNA中的任意种。另外，“核苷酸”、“寡核苷酸”、以及“多核苷酸”可以为双链也可以为单链，在称作具有某种序列的“核苷酸”(或者“寡核苷酸”、“多核苷酸”)的情况下，只要不特别提到，也包含具有与其互补的序列的“核苷酸”(或者“寡核苷酸”、“多核苷酸”)的意思。进一步，在“核苷酸”(或者“寡核苷酸”、“多核苷酸”)为RNA的情况下，序列表所示的碱基记号“T”改称为“U”。

“由互补的碱基序列构成的多核苷酸”是指相对于任意的碱基序列(有义链)构成的多核苷酸具有碱基互补关系的多核苷酸(互补链、反义链)。互补的碱基序列中，除了形成与作为对象的碱基序列完全互补的序列的情况之外，还包含将其在严格条件下杂交所得到的碱基序列。在此，严格条件可以举通常“1×SSC、0.1％SDS、37℃”左右的清洁条件，作为更加严格的杂交条件可以举“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”左右，作为进一步严格的杂交条件可以举“0.1×SSC、0.1％SDS、65℃”左右的条件。另外，本领域普通技术人员可以根据一般的教导(例如，Sambrook，J.&Russell，D.，2001，Molecular Cloning：a LaboratoryManual，3rd edition.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring HarborLaboratory)来决定严格的杂交条件。例如，作为在严格的条件下和作为对象的碱基序列杂交得到的碱基序列，可以举和作为对象的碱基序列具有90％以上、优选为95％以上的同一性的碱基序列。

“蛋白质”或者“多肽”中不仅包含以特定的碱基序列或者氨基酸序列表示的“蛋白质”或者“多肽”，还以与其生物学上机能同等为限度，包含其片段、同源物、衍生物以及变异体。另外，上述变异体中，包含天然存在的等位基因变异体、天然不存在的变异体以及具有通过人为的缺失、取代、添加以及插入而改变的氨基酸序列的变异体。另外，作为上述变异体，可以举与未变异的蛋白质或者多肽在氨基酸序列中具有80％以上、更加优选为90％以上、进一步优选为95％以上，更加进一步优选为98％以上的同一性的变异体。

在本说明书中，氨基酸序列以及碱基序列的同一性是通过Lipman-Pearson法(Science，227，1435，1985)计算的。具体来说，是使用遗传信息处理软件Genetyx-Win(Software开发)的同源分析(Search homology)程序，并使参数Unit size to compare(ktup)为2进行分析而算出来的。

“抗体”中，包含多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、以及Fab片段、Fab表达库等生成的片段样的具有抗原结合性的上述抗体的一部分。

在本说明书中，“基因多态性”是指在具有2个以上的遗传所决定的等位基因的情况下，指这些的等位基因。具体来说，在人的群体之中，以某个个体的基因组序列作为基准，在其它的一个或多个个体基因组中的特定部位上，存在一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、转位、反位等变异的时候，此变异在统计学上确实不是在该1个或者多个个体内产生的突然变异，或者不是该个体内的特异变异，而是在遗传学上证明以1％以上的频率在群体内存在的情况，将该变异作为“基因多态性”。在本说明书中所用的“基因多态性”中，有例如，一个碱基被其它碱基取代的情况，也就是单核苷酸多态性(SNP：SingleNucleotide Polymorphism)、1～数十个碱基缺失或者被插入的情况(DIP)、2～数十个碱基为1个单元的序列重复存在的部位中其重复次数不同的情况(将重复单元为2～4个碱基的情况称为微卫星多态性、数个～数十个碱基的情况称为VNTR(Variable Number of TandemRepeat))等。

在本说明书中“毛发形状”是指直发、波状发(Wavy hair)、卷发、卷缩发(kinky hair、Coiled hair)等由于一根一根毛发的形状导致的头部的毛发整体的形状的倾向。

在本说明书中“卷发”，如果没有特别的说明的话，是概括地指相比于直发的情况下直发以外的形状的用语。因此，在本说明书中，相比于“卷发”的情况，如果没有特别的说明，“直发”和“非卷发”是按相同意义来使用的。“卷发”、“非卷发”以及“直发”是相对的性质，可以按照后述的种种方法定义。“卷发特性”、“非卷发特性”以及“直发特性”是指表示“卷发”、“非卷发”以及“直发”的表现型。

在本说明书中，“毛发形状易感性基因”是指成为决定作为多基因性的特性的毛发形状的原因的基因，“毛发形状易感性SNP标记”是指表示和该个体的毛发形状的特性具有关联性的SNP的部位的碱基。

在本说明书中，“对毛发形状的遗传易感性”、“毛发形状判定标记”、以及“毛发形状类型的标记”，分别是指与个体所保有的特定毛发形状相关的遗传素质、以及用于判定该素质的标记。

在本说明书中，“患病同胞对连锁分析(Affected Sib-Pair LinkageAnalysis)”是作为利用连锁来推定目的基因(疾病易感性基因等)的存在场所的方法之一，指不假定遗传方式(常染色体显性遗传、隐性遗传、性连锁基因等)和外显率的非参数连锁分析的代表分析方法。在患病同胞对连锁分析中，集合包括患病的(或者有特定的特性)的同胞(兄弟姐妹)的家族，以此家族的观察数据为基础进行似然计算，锁定和疾病(或者特定的特性)连锁的标记基因位点区域。在一般的(没有患病，或者没有特定的特性)的同胞的群体中，如果对一个基因位点进行考虑，孩子得到双亲中的一方的2个等位基因内的1个(考虑双亲中的一方即使为同型接合体其各自的等位基因也不同)。因此，同胞在这种时候，会有与接受相同等位基因的情况不相同的接受不相同的等位基因的情况。因为孩子的2个等位基因来源为来自双亲中的各1个，因此如果从双亲的来源而考虑同胞接受了哪个相同等位基因的话，有0、1、2的情况。将这3个情况分别称为IBD(Identity By Descent)为0、1、2。考虑多个同胞对的话，应该可以数出IBD＝0的对、IBD＝1的对、IBD＝2的对的数，并且该数的比例根据概率法则而成为一定的比例(1∶2∶1)。对此，集中患病(或者具有特定特性)的同胞对此群体进行同样的调查，认为如果观察的标记基因与疾病(或者特定的特性)连锁的情况下会偏离此比例(1∶2∶1)(IBD＝2的对的数增加、IBD＝0的对的数减少)。同时，认为在与疾病(或者特定的特性)所关联的基因不连锁的标记基因中，和任意的同胞形成相同的分配(1∶2∶1)。在患病同胞对连锁分析中，利用此假设，将在患病同胞对中等位基因共有比例的偏离作为指标算出观察数据的似然。似然通过下式表示。

$L\left(Z\right)=\underset{j=1}{\overset{N}{\mathrm{\Π}}}\underset{i=0}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}\mathrm{ZiWij}$

在此，Wij为第j号家族中患病同胞对为IBD＝i的概率。变数Z＝(Z0、Z1、Z2)，自由度为2(Z2＝1-Z1-Z0，独立变数仅为Z0、Z1两个)。取得当标记基因与疾病(或者特定的特性)所关联的基因不连锁时候(也就是，Z0＝0.25，Z1＝0.5，Z2＝0.25)的似然比，通过似然最大化法(最大似然法)，求得似然最大的Z。

在本说明书中，“基因频率”是指对于一个基因位点，在群体中存在的全部基因数中，其等位基因所占的比例。

在本说明书中，“单倍体型”是指在一个等位基因(单倍体)中存在的基因变异的组合。

在本说明书中，“连锁不平衡分析”或者“单倍体型分析”是指分析在基因组区域中连锁不平衡的强度的程度。

在本说明书中，“连锁不平衡”是指在群体中，发现多个基因位点的等位基因或者遗传标记(多态性)之间不是随机相关性，也就是这些特定组合(单倍体型)的频率显著高的群体遗传学现象。这些一般是存在于同一染色体上的遗传连锁，但是有时候即使连锁也有不能发现连锁不平衡的情况，另外，例外的也会有在别的染色体上发现的情况。例如，在基因位点X上具有等位基因a和b(它们以相同的频率存在)，其附近的基因位点Y上有等位基因c和d(他们也以相同的频率存在)的情况下，期望作为各个基因多态性的组合的单倍体型ac在群体中以0.25的频率存在。在单倍体型ac大于此期望值的情况下，也就是在称作ac的特定基因型频繁出现的情况下，就称等位基因ac为连锁不平衡。连锁不平衡是等位基因的特定组合的自然选择或者从进化的角度看被导入群体的时期是最近的而产生的，是由于连锁的等位基因之间没有达到平衡而产生的。因此，如民族和人种等那样，不同的群体中连锁不平衡的模式不一样，即使在某个群体中ac连锁不平衡的情况下，在其它群体中也有作为ad连锁不平衡的关系的情况。连锁不平衡的基因多态性检测，虽然该多态性本身不引起直接疾病，但却对检测对于疾病的易感性有效。例如，对于某基因位点X的等位基因a来说，虽然它不是作为疾病的原因的基因要素，但是由于和基因位点Y上的等位基因c连锁不平衡，因此可能显示疾病易感性。

在本说明书中，“单倍域”是指作为分割基本没有发现历史重组的基因组的范围，规定在该范围内强的连锁不平衡存在的区域。本领域的技术人员可以根据连锁不平衡的区域适当地确定单倍域，例如，可以根据Gabriel等的报告(Gabriel，SB.et al.，Science，296(5576)，p2225-2229，2002)进行。在本发明中，“强的连锁不平衡”是指在连锁不平衡分析中计算的连锁不平衡系数D’的95％置信区间的上限超过0.98，其下限高于0.7的状态，“具有强的历史重组的证据”是指连锁不平衡系数D’的95％置信区间的上限不足0.9的状态。

在本说明书中“次要等位基因”是指在一个基因的位点上存在2个等位基因的情况下，基因频率较低的等位基因(allele)。

在本说明书中，“基因频率”和“等位基因频率”用于同样意义，是指特定的等位基因在任意的基因群体中所占的比例的用语。

在本说明书中，“统计学上显著不同”是指在任意的统计学的方法中进行检测的情况下，风险率(p值)小于0.1％，优选为小于0.07％，更加优选为小于0.05％，更加进一步优选为小于0.01％的状态。

2.毛发形状易感性基因以及毛发形状易感性SNP标记的认定

寻找以及认定成为决定多因子性的一般特性的人的自然毛发形状的原因的基因(毛发形状易感性基因)，可以通过使用形状作图(traitmapping)的方法进行遗传统计分析。即，通过患病同胞对连锁分析来认定卷发特性位点，以及根据以卷发特性位点为对象的病例·对照例关联分析，可以有效地选择处于和毛发形状易感性基因连锁不平衡状态中的SNP，并将含有此SNP的单倍域中存在的基因认定为毛发形状易感性基因。

本发明的毛发形状易感性基因以及毛发形状易感性SNP标记的确认具体在后述的实施例中记载，但是可以通过具有实施具有下述工序的认定方法来进行。

(i)定义毛发形状，并收集卷发家族、以及具有卷发特质的人(病例)和具有直发特性的人(对照例)的工序、

(ii)使用来自卷发家族的样品，实施以全基因组作为对象的患病同胞对连锁分析，认定卷发特性位点的工序、

(iii)对在工序(ii)中确认的卷发特性位点，选定在该区域全体范围内均匀分布的多个SNP标记的工序、

(iv)对在工序(iii)中选定的SNP标记，用来自病例和对照例的样品进行分型，根据统计学处理比较其结果，将确认有显著差的SNP标记认定为毛发形状易感性SNP标记的工序、以及

(v)对毛发形状易感性SNP标记使用国际人类基因单倍体型图计划数据库(the International HapMap Project database)的HapMap PHASE数据，通过将作为在对象候选区域内确认连锁不平衡的区域，并且含有毛发形状易感性SNP标记的区域(单倍域)进行特定，从而认定毛发形状易感性基因的工序。

(vi)对于在工序(v)中特定的单倍域中提取的单倍体型，使用国际人类基因单倍体型图计划数据库的HapMap PHASE数据，将与在工序(iv)中认定的毛发形状易感性SNP标记位点连锁的SNP位点进行特定，并将该SNP追加认定为新的毛发形状易感性SNP标记的工序。

上述工序(i)为毛发形状(卷发或者直发)的定义和特性绘图的分析对象者的收集的工序。在特性绘图中，有必要在某种程度上定量地处理作为对象的特性，将对象者规定为卷发特性或者直发特性的毛发形状的定义，是在实施特性绘图中的重要工序。人的毛发形状多种多样，其计测方法、以及分类或者定义的方法也各种各样。例如，作为定义毛发形状的方法，可以举将卷发＝1、直发＝0的二值化方法，和用一些方法测定卷发的程度来数值化的方法，以及本领域的技术人员所公知的方法(例如，特开2005-350801、特开2008-268229、特许第4159515号等)，但是不限定于这些。作为定义方法的更加具体的例子，有将毛发形状按照整体的形状、毛发的卷曲程度(卷曲半径)、卷曲出现的频率、以及/或者与周围的毛发群的卷曲的协调性等特征分类为数个等级(例如，2～10个等级，优选为3～8个等级，更加优选为5～7个等级)，并将所述分类中卷缩发、以及卷发或者强的波浪发等的卷曲半径有小的倾向的毛发形状定义为卷发特性，将波浪发、大略直发、或者微波浪发、直发等卷曲半径有大的倾向的毛发形状定义为直发特性的方法。

上述工序(ii)为使用来自卷发家族的样品，以全基因组作为对象实施患病同胞对连锁分析的工序。作为实施患病同胞对连锁分析的卷发家族的构成成员，为在上述工序(i)中判定为卷发特性的同胞(兄弟姐妹对，2名)。更加优选为还加上同胞的双亲的家人4名(或者3名)，进一步也可以加上其他的兄弟姐妹(不论毛发形状)和祖父母等。另外，为了实施患病同胞对连锁分析必需的卷发家族的数目，可以通过推测和/或观测卷发特性在母群体中的频率和构成其原因的基因频率(等位基因频率)、或者同胞相对风险率，并通过模拟来计算，但是一般的为50个家族到数百个家族。

作为患病同胞对连锁分析使用的遗传标记，只要是基因多态性就没有特别的限定，但是优选使用在基因组中均匀存在的等位基因数较多的微卫星，扩增以及检测此微卫星的试剂盒(全基因组扫描、连锁分析试剂盒Linkage Mapping Set)是从Applied Biosystems，Inc.(ABI)购买的。另外，在本发明中使用以平均9.2cM的间隔覆盖人染色体的ABI PRISM Linkage Mapping Set-MD 10v2.5(ABI制造)，以及以平均5cM的间隔覆盖人染色体的ABI PRISM Linkage Mapping Set-MD 5v2.5(ABI制造)。

另外，作为遗传标记的微卫星可以任意选定，也可以通过TheMammalian Genoytping Service的Comprehensive human genetic maps(http://research.marshfieldclinic.org/genetics/GeneticResearch/compMaps.asp)、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等检索。此时，优选基因组中以0.1～数cM的间隔存在、且等位基因多的杂合度高的微卫星。进一步，对于认定连锁的染色体，可以追加微卫星标记，窄化连锁区域(详细作图)。另外，为了扩增和检测任意选定、追加的微卫星的PCR引物可以从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中检索碱基序列，基于此序列，例如可以通过市售的核苷酸合成机按常用方法制作。此时，为了能够迅速并且容易地检测扩增产物，该探针优选用放射性物质、荧光物质、化学发光物质、或者酶等标识。

在患病同胞对连锁分析中，将来自卷发家族的基因组DNA作为模板，使用全基因组扫描、连锁分析试剂盒(ABI)、或者任意选定的微卫星标记的扩增引物进行PCR，检测扩增产物(片段)。PCR及其扩增产物的检测可以通过常用方法实施。此时，如果将各扩增引物用不同的荧光色素(例如，6-FAM(蓝色)、VIC(绿色)、或者NED(黄色)等发出不同的荧光的色素中的任意种)进行标识，则即使是同一尺寸的扩增产物也可以通过分别辨别出各荧光颜色，从而能够迅速地检测出多个扩增引物。

连锁的检测可以使用能够进行非参数分析的市售或者公开的遗传统计学软件(例如Genehunter、Linkage package、Mapmaker/sibs等)进行。

认定为连锁的区域的判定是根据以下所示的Lander和Kruglyak的指导准则(Nat.Genet.，11(3)，241-247，1995)，基于得到假阳性的连锁的基准而进行的。虽然Lander和Kruglyak的指导准则(多因子疾病中在全基因组内的连锁分析)盛行，但是对于各个基因的连锁分析也要从此基因的功能判断此基因是否能成为其原因。但是因为在全基因组内的分析中不需要在此阶段考虑基因功能，能求得纯粹的数理遗传学上显著的判断标准(阈值)。在此，他们根据模拟，制定了下述表2所示的显著连锁基准。

[表2]

通过本工序，可以筛选全部染色体，检测出能认定和卷发特性连锁的染色体上的区域。进一步，通过详细的作图，可以将染色体上的特定区域认定为卷发特性位点。这样认定的区域是强烈暗示毛发形状易感性基因存在的区域。

上述工序(iii)是对在工序(ii)中确认的卷发特性位点，选定在该区域全体范围内均匀分布的多个SNP标记的工序。SNP标记可以使用dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)、JSNP数据库(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html)等有关SNP的各种数据库来选定。

在SNP标记的选定中，选择对于认定毛发形状易感性基因有用的SNP。具体来说，在日本人群体中，选择次要等位基因的基因频率为10％以上，更加优选为15％以上的SNP。通过使用这样的基因频率的SNP，可以选定置信度高的SNP标记。

另外，在以基因频率作为指标选定SNP标记的情况下，有时候会出现SNP标记不均匀存在于特定的狭窄区域内的情况。这样的情况下，如果将选定的全部SNP标记用于认定毛发形状易感性基因的话，实验会变得复杂，另外，相互靠近的SNP也经常处于连锁不平衡状态而没有效率。因此，优选选定相互之间存在一定程度间隔的SNP标记来使用。这样，通过使存在一定间隔的标记均匀分布，可以进行包含全部对象候选区域的关联分析，使毛发形状易感性基因的认定容易进行。这样选定的相互邻接的SNP标记之间的距离优选为5kb以上，更加优选为5kb～10kb。如果此距离过长，可能出现和SNP标记之间的相互连锁不平衡的强度程度不能确认的区域。另外，此距离过短的话，确认相互具有强的连锁不平衡的SNP太多，因此没有效率。

在对象候选区域的全部范围内彻底地选定SNP标记时，此SNP标记之间的距离，另外可以将标记在对象候选领域内的分布情况，即基因组的每单位距离上的标记的个数作为“标记密度”来表现。标记密度为每10kb基因组为0.5SNP以上，优选为1SNP以上，更加优选为1SNP～2SNP。如果标记密度过低的话，则标记之间的距离过长，有可能产生如前所述的SNP标记之间的连锁不平衡的强度程度不能确认的区域。另一方面，如果标记密度过高的话，则标记之间的距离过短，如前面所述，过密地选定标记而在认定毛发形状易感性基因的情况下实验量增多没有效率。

上述工序(iv)是对在上述工序(iii)中选定的SNP标记进行病例·对照例关联分析的工序。病例·对照例关联分析是在病例(患病者：具有卷发特性的人)群体和对照例(对照者：具有直发特性的人)群体中比较某个遗传标记的等位基因频率，在两个群体之间能在等位基因频率中发现显著差的标记的方法。例如，使用从具有卷发特性的人(病例)以及具有直发特性的人(对照例)得到的样品进行分型，通过统计学处理比较其结果，认定发现显著差的SNP标记作为毛发形状易感性SNP标记。作为特性绘图必需的样品，只要是含有基因组DNA的都没有特别的限定，但是可以举例如末梢血等的血液、唾液、汗等体液、体细胞以及含有这些的组织或者器官等。实施用于病例·对照例关联分析所必需的病例以及对照例的数目虽然可以根据卷发特性在母群体中的频率和构成其原因的基因频率(等位基因频率)、基因型相对风险率等估计，但是一般的话为50～数千人。另外，通过阶段性限定法，可以在限于样品大小和分型数等条件下得到较高的检测能力。另外，病例和对照例优选为由和特定毛发形状易感性基因的人种相同的人种构成，例如，在认定日本人的毛发形状易感性基因时，优选分析对象者为由日本人构成。

作为SNP分型的方法，可以利用PCR-SSCP、PCR-RLFP、PCR-SSO、PCR-ASP、定向测序(direct sequencing)、SNaPshot、dHPLC、Sniper法、MALDI-TOF/MS方法等本领域技术人员所公知的方法(例如，野岛博编，《基因组创药的最前线》(ゲノム創薬の最前線)，p44-p54，羊土社，2001)，采用利用例如TaqMan SNP Genotyping Assays(注册商标)(ABI制造)并且利用TaqMan系统的SNP分型法有效。

关联分析，典型的可以通过在病例群体和对照例群体中比较各SNP标记的基因频率，针对频率之差在统计学上是不是显著而进行χ²检测(东京大学教养学部统计学教室编，《统计学入门-基础统计学I》进行分析，东京大学出版会，1991)，也可以根据采用了针对各SNP标记的基因型频率、显性(或者隐性)模型的情况下的基因型频率、等位基因阳性率中的频率等进行分析。另外，除了χ²检测之外，只要是能通过病例群体和对照例群体进行比较，也就是只要能检测多个群体所区分的特性、疾病等的表现特性和基因多态性的关联，也可以采用其它公知的统计学方法进行。

另外，为了评价基因型的分型误差以及取样的妥当性而进行Hardy-Weinberg平衡检测。Hardy-Weinberg平衡是在基因组统计学的领域内而公知的，存在如SNP等那样的2个等位基因(例如C和T)，它们在群体中各自的频率为p和q的时候，成为(p+q＝1)、C/C同性、C/T异性、T/T同性的基因型频率分别为p²、2pq、q²的(p²+2pq+q²＝1)。在进行关联分析的时候，希望在对照例群体中Hardy-Weinberg平衡成立，但是只要偏离Hardy-Weinberg平衡具有统计学上的显著差的个数在显著水平(典型的是p＝0.01～0.05)的预想范围内的话，可以评价选定的SNP标记为妥当。

作为一个实施形态，针对由病例群体和对照群体得到的各个样品进行分型，用基因型、等位基因型、显性模型、隐性模型4个的方法通过χ²检测来进行显著差检测。即，如果某个基因变异成为毛发形状变化的原因的话，可以预想在病例和对照例中此等位基因频率等中的差。在检测中，在比较少的对象者中实施该关联分析的情况下，或者在提高来自检测对象者的显著差的检测能力的情况下，可以宽松地设定显著水平，在对象者比较多数或者严格判断显著差的情况下，可以严格设定显著水平。通过检测可以将显示显著的基因频率差的SNP认定为毛发形状易感性SNP标记。

接下来进行的工序(v)是对上述特定的毛发形状易感性SNP标记，使用国际人类基因单倍体型图计划数据库的HapMap PHASE数据，通过将作为在对象候选领域内确认连锁不平衡的区域，并且含有毛发形状易感性SNP标记的区域(单倍域)进行特定，从而认定毛发形状易感性基因的工序。

单倍体型分析(连锁不平衡分析)为本领域工作人员公知的方法，可以通过以前进行的各种连锁不平衡分析(例如，镰鼓直之编，postgenome时代的遗传统计学，p183-201，羊土社，2002)进行。单倍体型分析可以使用市售或者公开的各种遗传统计学软件(Haploview，Arlequin，SNP疾病关联分析软件SNPAlyze(注册商标)(株式会社DYNACOM制造))等程序实施。更加具体来说，可以通过EM Algorithm(Laird，N：″The EM Algorithm″，Chap.14，pp 509-520，Handbook of Statistics，Vol.9，Computational Statistics，C.R.Rao(ed.)Elsevier Science Publishers B.V.，1993)进行连锁不平衡分析，算出连锁不平衡系数D’(pair-wise LD coefficient)进行分析。更加具体来说，在单倍体型分析中，分析上述特定的毛发形状易感性SNP标记和其它SNP标记之间是否存在连锁不平衡，认定连锁不平衡存在的区域为单倍域。连锁不平衡分析中所用的其它SNP标记可以从相对于上述毛发形状易感性SNP标记存在于基因组序列的上游以及下游的SNP中任意选择。例如，可以对上述毛发形状易感性SNP标记由近到远处存在的SNP依次进行连锁不平衡分析，或者，也可以对任意选择的远处的SNP实行分析以便将大致的单倍域区域特定之后，再对更近处的SNP将更加详细的单倍域区域进行特定。用于连锁不平衡分析中的其它SNP标记的个数，包括毛发形状易感性SNP标记在内为4SNP以上，优选为20SNP以上，更加优选为32SNP以上，对这些含有多个SNP标记的一系列SNP标记群进行分析。在此，对于2个SNP，以第一SNP的各等位基因为(A，a)，第二SNP的各等位基因为(B，b)，4个单倍体型(AB，Ab，aB，ab)的各频率为P_AB、P_Ab、P_aB、P_ab的话，连锁不平衡系数D’可以通过下式得到。另外，式中Min[(P_AB+P_aB)(P_aB+P_ab)，(P_AB+P_Ab)(P_Ab+P_ab)]表示从(P_AB+P_aB)(P_aB+P_ab)和(P_AB+P_Ab)(P_Ab+P_ab)中取较小值的意思。

D’＝(P_ABP_ab-P_AbP_aB)/Min[(P_AB+P_aB)(P_aB+P_ab)，(P_AB+P_Ab)(P_Ab+P_ab)]

该SNP标记群的标记数会根据形成认定的和毛发形状易感性基因关联的单倍域(连锁不平衡区域)的区域大小而适当变更。另外，在预先能预想到区域的断开处的情况下，可以将此区域断开为6SNP左右的大小。进一步，也可以对开始在剪切毛发形状易感性SNP标记两端5SNP的共计11SNP进行连锁不平衡分析，也可以根据必要增加分析的标记数。

通过进行连锁不平衡分析来特定对象候选区域中SNP连锁的区域(含有确认相互之间有强烈连锁不平衡的SNP标记群的单倍域)。例如，针对选定的SNP标记对全部的2SNP之间的组合算出连锁不平衡系数D’，选择表示D’＞0.9的组合，其中，检测出含有更远的SNP所夹区域的一系列区域。接下来，算出该检测出的区域的外侧与该区域邻接的连续3SNP和该区域内的SNP之间的D’。在确认即使算出的任意组合中D’都为0.9以下的情况下，特定该区域作为“单倍域”。

这样特定了单倍域的话，例如，对此区域，可以利用有关基因组的数据库等，特定在所观察的单倍域中存在的基因。另外，即使在不利用数据库的情况下，也可以根据常用方法决定在单倍域区域中存在的SNP标记附近的碱基序列，由此碱基序列来确定基因。

上述工序(vi)，是对工序(v)中特定的单倍域中提取的单倍体型，使用国际人类基因单倍体型图计划数据库的HapMap PHASE数据，特定在与工序(iv)中认定的毛发形状易感性SNP标记位点连锁的SNP位点，将该SNP追加认定为新的毛发形状易感性SNP标记的工序。

在工序(v)中特定单倍域的同时，可以提取由用于单倍体型分析中的SNP标记群的各个碱基构成的全部单倍体型，求出此单倍体型频率等。

通过比较提取的单倍体型，也就是SNP标记群的各个碱基的组合，可以特定和工序(iv)中认定的毛发形状易感性SNP标记位点连锁的SNP位点，可以将这样认定的SNP位点作为新的毛发形状易感性SNP标记。

通过上述工序(i)～(vi)，可以特定和卷发连锁所确认的染色体区域，接下来，可以从该染色体领域选定毛发形状易感性SNP标记。进一步，通过对选定的SNP标记的单倍体型分析，可以认定在该染色体区域中的与毛发形状关联的单倍域以及基因。之后，进一步，通过特定和毛发形状易感性SNP标记位点连锁的SNP位点，可以认定在该单倍域或者基因中存在的毛发形状易感性SNP标记。

作为通过上述工序而特定的和卷发的连锁被确认的染色体区域，可以举1号染色体和11号染色体，更加具体来说，可以举1号染色体的1q32.1～1q32.2区域(微卫星D1S249～D1S2891所夹的区域)(最大LOD分数＝2.14)。将这些区域特定为卷发特性位点，强烈暗示此区域中存在毛发形状易感性基因。

作为通过上述工序特定的单倍域，可以举在人1号染色体的基因组区域中，由序列号1所示的碱基序列所表示的3,926bp构成的区域、由序列号2所示的碱基序列所表示的76,945bp构成的区域、由序列号3所示的碱基序列所表示的68,637bp构成的区域。

将与这些单倍域相重叠的基因，即含有该单倍域的碱基序列的一部分或者全部的基因，认定为毛发形状易感性基因。在此，“与单倍域相重叠的基因”是指具有和一部分单倍域的区域相同的碱基序列，或者具有和单倍域的整个区域的碱基序列相同的碱基序列的基因这两者。另外，将在这些单倍域中存在、并且等位基因在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)以及和该SNP连锁的SNP，认定为毛发形状易感性SNP标记。

作为与由序列号1所表示的碱基序列所表示的3,926bp构成的单倍域相重叠的基因，可以举人1号染色体上的CSRP1基因。CSRP1基因为在Entrez Gene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)中GeneID：1465表示的基因，如实施例5以及图5所示，该碱基序列的一部分和上述单倍域重叠。

作为序列号1所示的碱基序列中存在的毛发形状易感性SNP标记，可以举碱基号1(dbSNP数据库ID：rs576697、T或者C)、1635(rs645390、G或者A)、2527(rs3767542、G或者A)、以及3766(rs675508、C或者A)所表示的碱基，优选碱基号1(rs576697、T或者C)所表示的碱基。

作为与由序列号2表示的碱基序列所表示的76,945bp构成的单倍域相重叠的基因，可以举人1号染色体上的NAV1基因、IPO9基因以及TMEM58基因。NAV1基因为在Entrez Gene数据库中GeneID：89796所表示的基因，如实施例5以及图6所示，该碱基序列的一部分和上述单倍域重叠。另外，IPO9基因为在Entrez Gene数据库中GeneID：55705所表示的基因，如实施例5以及图6所示，该碱基序列的全部长度和上述单倍域重叠。另外，TMEM58基因为在Entrez Gene数据库中GeneID：149345所表示的基因，如实施例5以及图6所示，该碱基序列的一部分和上述单倍域重叠。

作为序列号2所示的碱基序列中存在的毛发形状易感性SNP标记，可以举碱基号7519(rs2271763、G或者A)、16901(rs10920260、T或者G)、30270(rs16849387、A或者G)、31333(rs12127375、C或者G)、50038(rs1495840、T或者A)、以及63008(rs10920269、G或者T)所表示的碱基，优选碱基号50038(rs1495840、T或者A)所表示的碱基。

作为与由序列号3表示的碱基序列所表示的68,637bp构成的单倍域相重叠的基因，可以举人1号染色体上的NUCKS1基因。NUCKS1基因为在Entrez Gene数据库中GeneID：64710所表示的基因，如实施例5以及图7所示，该碱基序列的全部长度和上述单倍域重叠。

作为序列号3所示的碱基序列中存在的毛发形状易感性SNP标记，可以举碱基号24524(rs3805、T或者G)、60701(rs823114、G或者A)所表示的碱基，优选为碱基号60701(rs823114、G或者A)所表示的碱基。

3.毛发形状判定标记

本发明还提供一种毛发形状判定标记，其中，所述毛发形状判定标记是包含以下部分碱基序列的寡核苷酸或者多核苷酸或者它们的互补链，其中，所述部分碱基序列是在人1号染色体的1q32.1～1q32.2区域(D1S249～D1S2891)上，通过对等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的SNP标记进行连锁不平衡分析而确定的，并且是由序列号1～3中任意一个所表示的碱基序列所构成的单倍域的碱基序列的部分碱基序列，并且，所述部分碱基序列由一个以上含有等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)以及与该SNP连锁的SNP的连续的碱基序列构成。

由这些碱基序列特定的寡核苷酸或者多核苷酸或者它们的互补链，存在于序列号为1～3所示的碱基序列所表示的单倍域中，含有一个以上等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)或者和该SNP连锁的SNP的毛发形状易感性SNP标记，通过检测这些寡核苷酸或者多核苷酸或者它们的互补链，可以检查和/或判定在被检测者中毛发形状的遗传素质(hereditary predisposition)。因此，可以将这些寡核苷酸或者多核苷酸或者它们的互补链规定为用于判定个体所具有的毛发形状的遗传素质的标记并进行使用。

这些寡核苷酸或者多核苷酸或者它们的互补链的长度(碱基长度)只要是在人基因组上能够特异性识别的长度即可，在其限定上没有特别限定。通常为10个碱基长度以上并且1000个碱基以下，优选为20个碱基长度以上并且500个碱基长度以下，更加优选为20个碱基长度以上并且100个碱基长度以下。因此，根据必要，可以选择在包含例如上述序列号1～3所示的碱基序列所表示的单倍域中存在的毛发形状易感性SNP标记的11个碱基(优选为毛发形状易感性SNP标记的5’侧及3’侧各5个碱基)、21个碱基(优选为毛发形状易感性SNP标记的5’侧及3’侧各10个碱基)、101个碱基(优选为毛发形状易感性SNP标记的5’侧及3’侧各50个碱基)、或者601个碱基(优选为毛发形状易感性SNP标记的5’侧及3’侧各300个碱基)等。

作为本发明的毛发形状判定标记中所应含有的本发明中利用的毛发形状易感性SNP标记的例子，可以举如下：

(1)序列号1所表示的碱基序列中，碱基号1(dbSNP数据库ID：rs576697、T或者C)、1635(rs645390、G或者A)、2527(rs3767542、G或者A)、以及3766(rs675508、C或者A)所表示的碱基；

(2)序列号2所表示的碱基序列中，碱基号7519(rs2271763、G或者A)、16901(rs10920260、T或者G)、30270(rs16849387、A或者G)、31333(rs12127375、C或者G)、50038(rs1495840、T或者A)、以及63008(rs10920269、G或者T)所表示的碱基；以及，

(3)序列号3所表示的碱基序列中，碱基号24524(rs3805、T或者G)、以及60701(rs823114、G或者A)所表示的碱基。

上述碱基中，优选序列号1所表示的碱基序列中碱基号1(rs576697、T或者C)所表示的碱基、序列号2所表示的碱基序列中碱基号50038(rs1495840、T或者A)所表示的碱基、序列号3所表示的碱基序列中碱基号60701(rs823114、G或者A)所表示的碱基。

毛发形状易感性SNP标记优选位于本发明的毛发形状判定标记的中央或者中央附近(例如，离中央100个碱基以内，优选为50个碱基以内，更加优选为30个碱基以内，进一步更加优选为10个碱基以内，再更加进一步优选为5个碱基以内)，但是也没有必要必须如此。进一步，在本发明的毛发形状判定标记中含有2个以上的毛发形状易感性SNP标记的情况下，该毛发形状易感性SNP标记中可以全部都处于本发明的毛发形状易感性判定标记的中央或者中央附近，也可以该毛发形状易感性SNP标记中的1个处于中央或者中央附近的位置并且其它处于任意位置，或者也可以是该毛发形状易感性SNP标记中全部都不处在中央或者中央附近。

作为毛发形状易感性SNP标记处于中央的本发明的毛发形状判定标记的具体例子，例如在序列号1所表示的碱基序列中碱基号1所表示的碱基中含有SNP(dbSNP数据库ID：rs576697、T或者C)的情况下，可以举出由序列号1的上游5个碱基到碱基号6的碱基构成的11个碱基长度的多核苷酸、序列号1的上游10个碱基到碱基号11的碱基构成的21个碱基长度的多核苷酸、序列号1的上游50个碱基到碱基号51的碱基构成的101个碱基长度的多核苷酸、以及序列号1的上游300个碱基到碱基号11的碱基构成的601个碱基长度的多核苷酸。另外，还可以利用这些多核苷酸的互补链。同样，也可以决定含有其它SNP的标记的碱基序列。

4.对毛发形状的遗传易感性的判定方法

本发明另外提供判定对被检测者的毛发形状的遗传易感性(遗传素质)的方法。本发明的对毛发形状的遗传易感性的判定方法为包括以下工序(a)、以及(b)的方法，并不限制于此限定：

(a)调制来自被检测者的基因组DNA的工序；以及

(b)从该基因组DNA中，检测出人1号染色体的1q32.1～1q32.2区域(D1S249～D1S2891)中的，通过对等位基因频率在具有卷发特性群体和具有非卷发特性群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)标记进行连锁不平衡分析而确定的，并且存在于序列号1～3的任意种所表示的碱基序列构成的单倍域中的，等位基因频率在具有卷发特性群体和具有非卷发特性群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)以及和该SNP连锁的单核苷酸多态性(SNP)的工序。

上述工序(a)(染色体DNA的提取)和工序(b)(SNP的检测)可以使用公知的方法(例如，Birren Bruce et al.，Genome Analysis，Vol.4/A Laboratory Manual：Mapping Genomes，Cold Spring HarborLaboratory，NY，1999)进行。

在工序(a)中，来自被检测者的基因组DNA可以使用从被检测者及其临床标本等分离出来的所有细胞(包括培养细胞，但是不包括生殖细胞)、组织(包含培养组织)、器官、或者体液(例如，血液、唾液、淋巴液、气管粘膜、精液、汗、尿等)等作为材料。作为该材料，优选由末梢血分离得到的白血球或者单核细胞，更加优选白血球，这些材料可以根据在临床检查中通常所用的方法进行分离。

例如，在将白血球作为材料的情况下，首先从被检测者身上分离出来的末梢血中按照常用方法分离白血球。接下来，向得到的白血球中加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠(SDS)来分解蛋白质，使之变性之后，进行苯酚/氯仿提取得到基因组DNA(含有RNA)。RNA可以根据必要通过RNase除去。另外，基因组DNA的提取不限定于上述方法，可以利用该技术领域中公知的方法(例如，Joseph Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3 Vol.Set)，Cold Spring HarborLaboratory，NY，2001)、市售的DNA提取试剂盒等进行。根据进一步的需要，也可以分离含有人1号染色体的1q32.1～1q32.2区域、或者人1号染色体的基因组区域中的序列号为1～3所表示的碱基序列所表示的单倍域的DNA。该DNA的分离可以使用与1q32.1～1q32.2区域或者该单倍域杂交的引物，通过将基因组DNA作为模板的PCR等进行分离。

在工序(b)中，从工序(a)中得到的基因组DNA检测出等位基因频率在任意的卷发者群体中比在任意的非卷发者群体中高的SNP或者与该SNP连锁的SNP，其中，所述SNP是在人1号染色体的1q32.1～1q32.2区域(D1S249～D1S2891)中，通过对等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)标记进行连锁不平衡分析而确定的，并且是存在于序列号1～3的任意种所表示的碱基序列构成的单倍域中的多态性。序列号1～3所表示的碱基序列为人1号染色体的基因组区域中的序列号1所表示的3,926bp构成的碱基序列、序列号2所表示的76,945bp构成的碱基序列、以及序列号3所表示的68,637bp构成的碱基序列。

上述本发明的判定方法，进一步优选含有下述工序(c)：

(c)在该检测出的SNP的等位基因频率在卷发者群体中比在非卷发者群体中在统计学上显著高的情况下，判定为该被检测者具有卷发的遗传素质；在该检测出的SNP的等位基因频率在任意的非卷发者群体中比在卷发者群体中在统计学上显著高的情况下，判定为该被检测者不具有卷发的遗传素质的工序。

作为上述工序(c)，例如可以举，在来自被检测者的基因组DNA中的序列号1～3所表示的碱基序列中的下述表中所示的碱基号的碱基中的任意一个以上中，识别该碱基为碱基(i)还是碱基(ii)，在为碱基(i)的情况下，判定为被检测者具有卷发的素质，在为碱基(ii)的情况下，判定为被检测者不具有卷发的素质的工序。

[表3]

进一步具体的说，本发明的对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定方法含有下述(1)～(12)中任意一个工序。

(1)在序列号1所示的碱基序列中，识别碱基号1所表示的碱基为T还是为C，在为C的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为T的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(2)在序列号1所示的碱基序列中，识别碱基号1635所表示的碱基为G还是为A，在为A的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为G的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(3)在序列号1所示的碱基序列中，识别碱基号2527所表示的碱基为G还是为A，在为A的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为G的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(4)在序列号1所示的碱基序列中，识别碱基号3766所表示的碱基为C还是为A，在为A的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为C的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(5)在序列号2所示的碱基序列中，识别碱基号7519所表示的碱基为G还是为A，在为A的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为G的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(6)在序列号2所示的碱基序列中，识别碱基号16901所表示的碱基为T还是为G，在为G的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为T的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(7)在序列号2所示的碱基序列中，识别碱基号30270所表示的碱基为A还是为G，在为G的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为A的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(8)在序列号2所示的碱基序列中，识别碱基号31333所表示的碱基为C还是为G，在为G的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为C的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(9)在序列号2所示的碱基序列中，识别碱基号50038所表示的碱基为T还是为A，在为A的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为T的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(10)在序列号2所示的碱基序列中，识别碱基号63008所表示的碱基为G还是为T，在为T的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为G的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(11)在序列号3所示的碱基序列中，识别碱基号24524所表示的碱基为T还是为G，在为G的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为T的情况下，判定为不具有卷发的素质。

(12)在序列号3所示的碱基序列中，识别碱基号60701所表示的碱基为G还是为A，在为A的情况下，判定为具有卷发的素质，另外，在为G的情况下，判定为不具有卷发的素质。

另外，在本发明的判定对毛发形状的遗传易感性(遗传素质)的方法中检测出来的SNP，可以为上述SNP中的任意1个，也可以是2个以上。优选为检测出2个以上的SNP，这样关于作为多基因性的一般特性的毛发形状，可以明确被检测者的遗传素质的种类及其有无，可以以更高的精度检索构成确定被检测者的毛发形状的主要原因的基因。

该SNP的检测，可以通过直接确定从含有基因组DNA的样品中分离出来的人1号染色体的1q32.1～1q32.2区域、或者人1号染色体的基因组区域中的序列号1～3所示的碱基序列所表示的单倍域的碱基序列来进行。或者作为检测出多态性的方法，除了直接确定上述的该区域的基因序列的方法之外，还有在多态性序列为限制性内切酶识别部位的情况下，利用限制性内切酶切断方式的不同来确定基因型的方法(以下，称为RFLP)；以使用多态性特异的探针杂交为基础的方法(例如，在芯片和载玻片、尼龙膜上贴上特定的探针，通过检测出对这些探针的杂交强度的差来确定多态性的种类，或者通过检测特异的探针的杂交效率，检测在扩增双链模板时聚合酶分解的探针的量来特定基因型的方法；或者通过某种双链特异的荧光色素发出的荧光随着温度变化而检测双链融解时候的温度差，这样来特定多态性的方法；在多态性部位特异的寡核苷酸探针的两端加上互补的序列，利用由于温度造成该探针在自身的分子内形成二级结构；或者在目标区域中杂交的差别来特定基因型的方法等)。或者进一步还有，由模板特异的引物通过聚合酶进行碱基延伸反应，特定此时在多态性部位所引入的碱基的方法(使用双脱氧核苷酸分别进行荧光标记，并检测出各荧光的方法；通过质谱分析检测引入的双脱氧核苷酸的方法)，进一步，还有通过酶识别在模板特异的引物上所接的变异部位上互补的碱基对或者非互补的碱基对的有无的方法等。

以下列出现有的公知的代表性的基因多态性的检测方法，但是本发明不限于这些。(a)RFLP(限制性片段长度多态性(restriction fragmentlength polymorphism))法、(b)PCR-SSCP法(单链构象多态性分析(single strand conformation polymorphism)，Biotechniques，16，p296-297，1994，以及Biotechniques，21，p510-514，1996)、(c)ASO杂交法(Clin.Chim.Acta.，189，p153-157，1990)、(d)定向测序法(directsequencing)(Biotechniques，11，p246-249，1991)、(e)ARMS法(Nuc.Acids Res.，19，p3561-3567，1991、以及Nuc.Acids Res.，20，p4831-4837，1992)、(f)变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gelelectrophoresis)(DGGE)法(Biotechniques，27，p1016-1018，1999)、(g)RNaseA切断法(DNA Cell Biol.，14，p87-94，1995)、(h)化学切断法(Biotechniques，21，p216-218，1996)、(i)DOL法(Genome Res.，8，p549-556，1998)、(j)TaqMan-PCR法(Genet.Anal.，14，p143-149，1999、以及J.Clin.Microbiol.，34，p2933-2936，1996)、(k)入侵(Invader)法(Science，5109，p778-783，1993、J.Bio.Chem.，30，p21387-21394，1999、以及Nat.Biotechnol.，17，p292-296，1999)、(1)MALDI-TOF/MS法(Genome Res.，7，p378-388，1997、以及Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.，35，p545-548，1997)、(m)TDI法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，p10756-10761，1997)、(n)分子信标(molecular beacon)法(Nat.Biotechnol.，16，p 49-53，1998)、(o)动态等位基因特异性杂交(Dynamic Allele-Specific Hybridization)(DASH)法(Nat.Biotechnol.，17，p 87-88，1999)、(p)锁式探针法(Nat.Genet.，3，p225-232，1998)、(q)DNA芯片或者DNA微阵列(中村祐辅等，《SMP基因多态性的战略》(《SNP遺伝子多型の戦略》)，中山书店，p128-135，2000)、(r)ECA法(Anal.Chem.，72，p1334-1341，2000)。

以上是代表性的基因多态性检测方法，但是对于本发明的毛发形状的遗传易感性(遗传素质)的判定方法，并不限定于此，可以广泛使用其它公知或者将来开发的基因多态性检测方法。另外，在检测本发明的基因多态性的时候，可以单独使用这些基因多态性的检测方法，或者也可以组合2种以上的方法。下面作为代表的方法，针对在后述实施例中使用的TaqMan-PCR法以及入侵法，进行更详细地说明。

(1)TaqMan-PCR法

TaqMan-PCR法是利用了经过荧光标记的等位基因特异的寡核苷酸(TaqMan探针)和Taq DNA聚合酶产生的PCR的方法。作为TaqMan探针，使用含有在人1号染色体的基因组区域中，作为以序列号1～3所示的碱基序列表示的单倍域的部分碱基序列，并且含有上述任意的多态性部位的碱基的约15～约30个碱基连续的碱基序列的寡核苷酸(例如，在后述本发明的毛发形状判定用试药中含有的核酸探针)。该探针在其5’末端用FAM和VIC等荧光色素、3’末端用TAMRA等淬灭剂(quencher)(消光物质)分别标记，在这样的状态下，因为淬灭剂会吸收掉荧光能量所以不能检测出荧光。探针要针对双方的等位基因来调制，为了一次检测出来而优选用荧光波长互相不同的荧光色素(例如，一方的等位基因用FAM，另一方用VIC)标识。另外为了不引起TaqMan探针导致的PCR延伸反应而将3’末端磷酸化。如果将为扩增含有和TaqMan探针杂交的区域的基因组DNA的部分序列而设计的引物以及TaqDNA聚合酶同时进行PCR的话，TaqMan探针和模板DNA杂交，同时引起PCR引物开始的延伸反应，进行延伸反应的话由TaqDNA聚合酶的5’核苷酸活性使杂交的TaqMan探针被切断，荧光色素游离而不受淬灭剂的影响，从而检测出荧光。由于模板的扩增造成荧光强度呈指数规律地增大。例如，在序列号1所示的碱基序列中，在检测碱基号1(rs576697、T或者C)所示的碱基中的多态性时，将含有该碱基的等位基因特异的寡核苷酸(约15～约30个碱基长度；在5’末端C等位基因用FAM、T等位基因用VIC标识，3’末端则都用TAMRA标识)作为TaqMan探针使用的情况下，被检测者的基因型如果为CC或者TT的话，则分别能识别出FAM或者VIC的强荧光强度，基本不能识别另一种荧光。另一方面，如果被检测者的基因型为CT的话，能检测出FAM以及VIC两种荧光。

(2)入侵法

在入侵法中，与TaqMan-PCR法不一样，等位基因特异的寡核苷酸(等位基因探针)自身不被标识，在多态性部位的碱基的5’侧具有和模板DNA没有互补性的序列(折翼(flap))，3’侧具有和模板特异的互补序列。在入侵法中，进一步使用在模板的多态性部位的3’侧具有特异的互补序列的寡核苷酸(入侵探针，该探针的与作为5’末端的多态性部位相当的碱基为任意碱基)；以及FRET(FluorescenceResonance Energy Transfer)探针，其特征为在5’侧具有能得到发夹结构的序列，在形成发夹结构时从与5’末端的碱基成对的碱基开始连续到3’侧的序列是和等位基因探针的折翼互补的序列。FRET探针的5’末端上用了荧光标识(例如，FAM和VIC等)，其附近结合有淬灭剂(例如，TAMRA等)，在这样的状态(发夹结构)下不能检测出荧光。如果使作为模板的基因组DNA和等位基因探针以及入侵探针反应的话，三者互补结合的时候入侵探针的3’末端侵入多态性部位中。如果使用识别此多态性部位的结构的酶(裂解酶(Cleavase))来切断等位基因探针的单链部分(即，多态性部位的碱基开始的5’侧的折翼部分)的话，折翼和FRET探针互补地结合，折翼的多态性部位侵入FRET探针的发夹结构中。通过裂解酶识别此结构并切断，FRET探针的末端标识的荧光色素游离不受淬灭剂的影响而能够检测出荧光。多态性部位的碱基和模板不匹配的等位基因探针不能通过裂解酶切断，但是没被切断的等位基因探针也能和FRET探针杂交，所以同样也能检测出荧光。但是，因为反应效率不同，所以在多态性部位的碱基所匹配的等位基因探针中，与不匹配的等位基因探针相比荧光强度显著较强。通常，在使其与3种探针以及裂解酶反应之前，优选将模板DNA使用能扩增含有等位基因探针及入侵探针所杂交的部分的区域的引物，通过PCR进行扩增。

人的毛发形状能够通过烫发处理和定型剂处理、梳理等可以使之自在地变化，并且也可以由于年龄增加和代谢等变化而产生后天的变化。因此，人本来自然的头发形状仅仅从其表现型难以正确地判定或者分类。另外，考虑毛发形状为复杂的多基因性的一般特性，针对各个人，认为从上述所举的本发明的毛发形状易感性基因中，构成决定毛发形状的主要原因的基因分别不同。因此，通过检查和/或判定毛发形状的遗传素质，可以提供针对各个人的准确的毛发形状的调节方法。

进一步，根据该方法，可以判定被检测者的对后天的毛发形状的变化的易感性，即，毛发形状变化的风险度。毛发形状变化的风险度是将上述多态性作为基准(指标)，不需要医生等具有专门知识的人的判断，可以机械进行。因此，本发明的方法也可以作为毛发形状变化的风险度的检测方法利用。

通过本发明的对被检测者的毛发形状的遗传易感性(遗传素质)的判定方法，可以针对作为多基因性的一般特性的毛发形状，明确被检测者的遗传素质的种类和其有无，从本发明的毛发形状易感性基因中，可以探索作为决定该被检测者的毛发形状的主要原因的基因。进一步基于此结果，对于该被检测者，可以寻求用于调节毛发形状的准确对策。因此，本发明作为根本的用于毛发形状的调节的检查和/或判定方法非常有用。

5.对毛发形状的遗传易感性(遗传素质)的判定用试药以及含有 该试药的试剂盒

本发明另外还提供用于上述本发明的判定方法中使用的试药以及含有该试药的试剂盒。即，本发明的判定用试药以及含有该试药的试剂盒含有能检测出下面所述的SNP以及从与该SNP连锁的SNP中选择的1个以上的SNP的核酸探针和/或引物，其中，所述SNP为在人1号染色体的1q32.1～1q32.2区域(D1S249～D1S2891)中，通过对等位基因在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)标志进行连锁不平衡分析而确定的，而且为存在于由序列号1所表示的3,926bp的碱基序列、序列号2所表示的76,945bp的碱基序列、或者序列号3所表示的68,637bp的碱基序列构成的单倍域中的单核苷酸多态性(SNP)，并且是一方的等位基因频率在任意的卷发者群体中比在任意的非卷发者群体中更高的SNP。

在一个实施方式中，在本发明的判定用试药和含有该试药的试剂盒中使用的核酸探针是与含有上述本发明的检查和/或判定方法中应该检测出的SNP部位的碱基的基因组DNA的区域特异杂交的核酸，例如是与本发明的毛发形状判定标记序列特异杂交的探针。该核酸探针只要对于应该杂交的目标部位是特异的并且能容易地检测出多态性，对其长度(和基因组DNA杂交的部分的碱基长度)没有特别的限定，例如为约10个碱基以上，优选为约15个碱基以上，更加优选为约15～约600个碱基、更加进一步优选为约15～约200个碱基，再进一步优选为约15～约50个碱基。另外，“对于目标部位(序列)特异杂交”是指在通常的杂交条件下，优选在严格的杂交条件下(例如，JosephSambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3Vol.Set)，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，2001中记载的条件)，和其它DNA不明显地产生杂交。优选该核酸探针对于含有应该检测出多态性部位碱基的区域的碱基序列具有互补的碱基序列，但是只要可以进行相关的特异杂交，没有必要完全互补。

该核酸探针也可以含有适合多态性检测的附加序列(和基因组DNA不互补的序列)。例如，上述入侵法中使用的等位基因探针在多态性部位的碱基的5’末端具有被称为折翼的附加序列。另外，该探针也可以使用适当的标识剂，例如，放射性同位素(例如：¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C等)、酶(例如：β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等)、荧光物质(例如：荧光胺、异硫氰酸荧光素等)、发光物质(例如：发光氨、发光氨衍生物、荧光素、光泽精等)等标识。或者，也可以进一步在荧光物质(例如：FAM、VIC)的附近进一步结合吸收该荧光物质所发的荧光能量的淬灭剂(消光物质)。在相关的实施方式中，在检测反应的时候荧光物质和淬灭剂分离而能检测出荧光。

该核酸探针可以固定于任意的固相上使用。因此，本发明的试药和含有该试药的试剂盒另外可以作为将上述探针固定于任意固相载体上而形成的固定化探针(例如固定有探针的基因芯片、cDNA微阵列、寡DNA阵列、薄膜过滤器等)来提供。该固定化探针优选作为毛发形状易感性基因检测用的DNA芯片来提供。

用于固定的固相载体，只要是能够固定核酸的都没有特别的限定，例如可以举玻璃板、尼龙薄膜、微珠、硅芯片、毛细管或者其它的载体等。核酸固定于固相载体上可以是将预先合成的核酸载于固相上的方法，或者也可以是在固相上合成目标核酸的方法。固定方法，例如如果是DNA微阵列的话，可以利用市售的测位仪(Amersham公司制造等)等，根据固定化探针的种类使用在该技术领域中公知的技术(例如，通过光刻蚀(photolithographic)技术(Affymetrix公司)、喷墨技术(Rosetta Inpharmatics公司)原位合成寡核苷酸等)。

本发明的判定用试药以及含有该试药的试剂盒中使用的核酸引物，只要是能特异地杂交于含有上述本发明的检查和/或判定方法中应该检测出的SNP部位的碱基的基因组DNA的区域，能特异地扩增该核酸序列而设计的核酸引物即可。例如，该引物是特异地杂交于本发明的毛发形状判定标记的核酸序列上，并扩增该核酸序列的引物。在此，“对目标部位(序列)特异杂交”是指在通常的杂交条件之下，优选为严格的杂交条件之下(例如，Joseph Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual(3Vol.Set)，Cold Spring Harbor Laboratory，NY，2001中记载的条件)，与其它DNA不会显著产生交叉杂交。

作为该引物导致的核酸序列的扩增方法，只要是该领域中通常使用的方法都没有特别的限定。例如一般广泛使用PCR法，但是可以举RCA(Rolling Circle Amplification：Proc.Natl.Acad.Sci，vol.92，4641-4645(1995))、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiatedAmplification of Nucleic acids)、LAMP(Loop-Mediated IsothermalAmplification of DNA；Bio Industry，第18卷，第2期(2001))、NASBA(Nucleic acid Sequence-based Amplification method；Nature，350，91～(1991))、TMA(Transcription mediated amplification method；J.ClinMicrobiol.第31卷，3270～(1993))等。扩增中所必需的该核酸引物的数量以及种类会依赖扩增方法而变化。例如，在使用PCR法的情况下，作为必要的引物可以举如下所述的一对核酸引物，其中，所述一对核酸引物是：含有作为人1号染色体的基因组区域中序列号1～3所示的碱基序列所表示的单倍域的部分碱基序列，与比应该检测出的多态性部位的碱基靠近5’侧的互补链序列的一部分特异地杂交的约10～约50个碱基、优选为约15～约50个碱基、更加优选为约15～约30个碱基的碱基序列的核酸；和含有作为该部分碱基序列，并且与比该多态性部位的碱基靠近3’侧的互补链序列的一部分特异地杂交的约10～约50个碱基、优选为约15～约50个碱基、更加优选为约15～约30个碱基的碱基序列的核酸的组合，并且由此扩增的核酸的片段长度为约50～约1000个碱基、优选为约50～约500个碱基、更加优选为约50～约200个碱基。

该引物也可以含有适合于多态性检测的附加序列(和基因组DNA不互补的序列)，例如也可以含有接头序列。另外，该引物也可以使用适当的标识剂，例如，放射性同位素(例如，¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C等)、酶(例如：β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、苹果酸脱氢酶等)、荧光物质(例如：荧光胺、异硫氰酸荧光素等)、发光物质(例如：发光氨、发光氨衍生物、荧光素、光泽精等)等标识。

优选本发明的判定用试药以及含有该试药的试剂盒中所用的核酸探针和/或引物含有本发明的毛发形状易感性SNP标记，即以下所示的碱基：

(1)序列号1所表示的碱基序列中，碱基号1(dbSNP数据库ID：rs576697、T或者C)、1635(rs645390、G或者A)、2527(rs3767542、G或者A)、以及3766(rs675508、C或者A)所表示的碱基；

(2)序列号2所表示的碱基序列中，碱基号为7519(rs2271763、G或者A)、16901(rs10920260、T或者G)、30270(rs16849387、A或者G)、31333(rs12127375、C或者G)、50038(rs1495840、T或者A)、以及63008(rs10920269、G或者T)所表示的碱基；

(3)序列号3所表示的碱基序列中，碱基号为24524(rs3805、T或者G)、以及60701(rs823114、G或者A)所表示的碱基；

更加优选，本发明的判定用试药以及含有该试药的试剂盒中所用的核酸探针和/或引物为序列号1所表示的碱基序列中，碱基号1(rs576697、T或者C)所表示的碱基；序列号2所表示的碱基序列中，碱基号50038(rs1495840、T或者A)所表示的碱基；以及序列号3所表示的碱基序列中，碱基号为60701(rs823114、G或者A)所表示的碱基。

作为具有上述的多态性部位的碱基的核酸探针，可以根据使用的多态性检测方法，对各多态性部位使用具有任意一种的等位基因的碱基的核酸，也可以使用具有分别对应于各等位基因的碱基的2种核酸。另外，对于在上述入侵法中使用的入侵探针，多态性部位的碱基(即，3’末端的碱基)可以为任意的碱基。

本发明的判定用试药以及含有该试药的试剂盒中所用的核酸探针和/或引物可以为DNA也可以为RNA，另外，可以为单链也可以为双链。为双链的情况下，可以为双链DNA、双链RNA、DNA/RNA杂交体中的任意种。上述核酸探针和/或引物，可以根据碱基序列的信息，例如利用市售的核苷酸合成机按照常用方法来制作。

上述核酸探针和/或引物可以各自分别(或者可能的话以混合的状态)溶解于水或者适当的缓冲液(例如：TE缓冲剂等)中至适当的浓度(例如：按照2～20×浓度，为1～50μM等)，在约-20℃下保存。本发明的判定用试药以及含有该试药的试剂盒也可以根据使用的多态性检测方法，进一步含有该方法的实施中必要的其它成分，例如杂交反应用的缓冲剂、用于核酸扩增反应的酶、缓冲剂以及其它必要的试药、标识用试药、标识检测用试药、以及这些反应和步骤所需要的器具等来作为构成。例如，在该试药以及含有该试药的试剂盒为根据由TaqMan-PCR法的多态性检测用的情况下，该试药以及含有该试药的试剂盒进一步可以含有10×PCR反应缓冲液、10×MgCl₂水溶液、10×dNTPs水溶液、Taq DNA聚合酶(5U/μL)等。

本发明的判定用试药和含有该试药的试剂盒可以在对毛发形状的遗传易感性(遗传素质)的检查和/或判定中使用。

6.毛发形状易感性基因或者其编码的蛋白质的使用

按上述顺序认定的毛发形状易感性基因或者其表达产物，其表达和活性与毛发形状相关联而变化。因此，该毛发形状易感性基因及其表达产物可以作为用于检测和/或判定被检测者的毛发形状类型的毛发形状类型的标记使用。或者，通过测定和评价该毛发形状易感性基因或者其表达产物的表达量，可以进行人的毛发形状调节剂的评价或者选择。或者通过控制该毛发形状易感性基因或者其表达产物的表达量可以调节人的毛发形状。

在本发明中，对于作为有必要检测和/或判定上述毛发形状类型，或者调节毛发形状的对象的人来说，虽然不限定特定的人种和群体，但是，优选为亚洲人种，更加优选日本人。

作为用作毛发形状判定标记的毛发形状易感性基因及其表达产物来说，只要是与由序列号1～3中任意一个表示的碱基序列构成的单倍域相重叠的基因及其表达产物即可，优选的可以举CSRP1基因、NAV1基因、IPO9基因、TMEM58基因以及NUCKS1基因、及其表达产物，其中更加优选CSRP1基因、IPO9基因以及NUCKS1基因及其表达产物。

CSRP1基因是由序列号42所示的多核苷酸构成的基因，其编码的CSRP1蛋白质由序列号43所示的氨基酸序列构成。报告有CSRP1基因作为可能具有认为是在包括基因的转录和发育的种种情况下的蛋白质间识别和细胞骨骼相互作用上发挥机能的LIM区域，并且暗示其可能与发育和细胞分化的重要调节过程相关的基因(Wang X et al.，J.Biol.Chem.267(13)，p9176-84，1992)。该基因可以在NCBI的基因数据库中，以GeneID：1465查找。该基因可以通过公知的基因操作方法得到。CSRP1蛋白质可以由序列号42所表示的多核苷酸构成的基因表达得到，另外，还可以根据序列号43中所示的氨基酸序列信息，通过通常的化学合成方法制造。

如后述的实施例所示，分析了日本人的卷发者和非卷发者的毛发发根部中的基因表达，发现和非卷发群相比较，在卷发群中CSRP1基因的表达量显著增加，另外，通过将如白豆蔻那样具有直发作用的物质给药，从而卷发被改善了，CSRP1基因的表达量也降低。

IPO9基因是序列号44所示的多核苷酸构成的基因，其编码的IPO9蛋白质由序列号45所示的氨基酸序列构成。报告有IPO9基因具有负责从细胞质到核内输送物质的机能(Okada N et al.，J.Cell.Mol.Med.12(5B)，p1863-71，2008)。该基因可以在NCBI的基因数据库中，以GeneID：55705查找。该基因可以通过公知的基因操作方法得到。IPO9蛋白质可以由序列号44所表示的多核苷酸构成的基因表达得到，另外，还可以根据序列号45中所示的氨基酸序列信息，通过通常的化学合成方法制造。

如后述的实施例所示，分析了日本人的卷发者和非卷发者的毛发发根部中的基因表达，发现和非卷发群相比较，在卷发群中IPO9基因的表达量显著降低，另外，通过将如石胡荽那样具有直发作用的物质给药，从而卷发被改善，IPO9基因的表达量增加。

NUCKS1基因是序列号46所示的多核苷酸构成的基因，其编码的NUCKS1蛋白质由序列号47所示的氨基酸序列构成。报告有NUCKS1基因作为编码在核中存在的高磷酸化了的DNA结合蛋白质的基因(Ostvo1d AC et al.，Eur.J.Biochem.268(8)，p2430-40，2001)。该基因可以在NCBI的基因数据库中，以GeneID：64710查找。该基因可以通过公知的基因操作方法得到。NUCKS1蛋白质可以由序列号46所表示的多核苷酸构成的基因表达得到，另外，还可以根据序列号47中所示的氨基酸序列信息，通过通常的化学合成方法制造。

如后述的实施例所示，分析了日本人的卷发者和非卷发者的毛发发根部中的基因表达，发现和非卷发群相比较，在卷发群中NUCKS1基因的表达量显著降低，另外，通过将如白豆蔻那样具有直发作用的物质给药，从而卷发被改善，NUCKS1基因的表达量增加。

(1)用于检测和/或判定毛发形状类型的多核苷酸标记

通过本发明，得到用于检测和/或判定毛发形状类型的标记(毛发形状类型的标记)为具有本发明的毛发形状易感性基因的碱基序列的多核苷酸或者其部分多核苷酸。例如，作为本发明的毛发形状类型的标记，可以举CSRP1基因、NAV1基因、IPO9基因、TMEM58基因或者NUCKS1基因的碱基序列构成的多核苷酸，优选为CSRP1基因、IPO9基因或者NUCKS1基因的碱基序列构成的多核苷酸，更加优选为序列号42、序列号44或者序列号46所示的碱基序列构成的多核苷酸；和这些碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸；以及这些多核苷酸的部分多核苷酸。

另外，本发明的毛发形状类型的标记中，可以含有相对于上述互补的碱基序列构成的多核苷酸或者其部分多核苷酸的碱基序列，进一步具有互补关系的碱基序列构成的链。

上述多核苷酸及其互补链可以以各自单链的形态作为本发明的标记使用，也可以以双链的形态作为本发明的标记使用。

作为部分多核苷酸来说，在本发明的毛发形状易感性基因的碱基序列或者和其互补的碱基序列构成的多核苷酸中，例如可以举连续的具有15个碱基以上的长度的部分多核苷酸。部分多核苷酸的长度可以根据其用途适当设定。

(2)用于扩增毛发形状类型的标记的引物以及用于检测该标记的 探针

由本发明的毛发形状易感性基因的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成的多核苷酸的部分多核苷酸能形成用于扩增所述毛发形状类型的标记的引物。优选引物扩增由序列号42、序列号44或者序列号46所表示的碱基序列、或者与其互补的碱基序列所构成的多核苷酸，或者这些多核苷酸的部分多核苷酸。

另外，由本发明的毛发形状易感性基因的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成的多核苷酸，或者这些多核苷酸的部分多核苷酸能形成用于检测所述毛发形状类型的标记的探针。优选探针检测由序列号42、序列号44或者序列号46所表示的碱基序列、或者与其互补的碱基序列所构成的多核苷酸，或者这些多核苷酸的部分多核苷酸。

即，用于特异性识别并扩增本发明的CSRP1基因、IPO9基因或者NUCKS1基因的表达所产生的RNA或者从其得到的多核苷酸的引物，或者用于特异地检测出该RNA或者从其得到的多核苷酸的探针与此相符。

具体来说，可以在Northern杂交法(Northern Blot)、RT-PCR法、原位杂交法等特异地检测出特定基因的公知方法中，根据常用方法用作引物或者探针。

作为引物使用的情况下，其碱基长度通常为15～100个碱基、优选为15～50个碱基、更加优选为15～35个碱基。

另外，作为检测探针使用的情况下，可以举通常为具有15个碱基以上，优选为15～1000个碱基、更加优选为100～1000个碱基的碱基长度的探针。

在此，“特异性识别”是指在例如Northern杂交法中，能够特异地检测出序列号42、序列号44或者序列号46所示的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成的多核苷酸，或者这些多核苷酸的部分多核苷酸，或者在例如RT-PCR法中，如能使该多核苷酸特异生成等，能判断上述检测物或者生成物为序列号42、序列号44或者序列号46或者与其互补的碱基序列所构成的多核苷酸，或者这些多核苷酸的部分多核苷酸。

序列号42、序列号44或者序列号46所表示的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成的多核苷酸的部分多核苷酸可以基于上述序列号所表示的CSRP1基因、IPO9基因或者NUCKS1基因的碱基序列，用例如primier 3或者Vector NTI的软件进行设计。得到的引物或者探针的候选序列或者至少含有一部分该序列的序列设计为引物或者探针。

(3)用于检测和/或判定毛发形状类型的多肽标记

与上述列举的毛发形状易感性基因同样，这些基因的表达产物(毛发形状易感性基因编码的蛋白质、或者来自这些蛋白质的多肽、或者这些多肽的部分多肽)也能形成毛发形状类型的标记(多肽)。

例如，作为上述表达产物，可以举作为CSRP1基因、NAV1基因、IPO9基因、TMEM58基因或者NUCKS1基因编码的蛋白质的CSRP1蛋白质、NAV1蛋白质、IPO9蛋白质、TMEM58蛋白质以及NUCKS1蛋白质(或者也称为CSRP1、NAV1、IPO9、TMEM58或者NUCKS1)，以及来自这些蛋白质的多肽，以及这些多肽的部分多肽，优选为CSRP1、IPO9或者NUCKS1，以及来自这些蛋白质的多肽，以及这些多肽的部分多肽。

更加优选上述表达产物是由序列号42、序列号44或者序列号46所表示的碱基序列构成的多核苷酸编码的蛋白质，进一步优选为由序列号43、序列号45或者序列号47所表示的氨基酸序列构成的蛋白质。

另外，在上述表达产物中，还包含由序列号43、序列号45或者序列号47所表示的氨基酸序列中1个或者多个氨基酸缺失、取代或者附加而得到的氨基酸序列构成的，而且和序列号43、序列号45或者序列号47所表示的氨基酸构成的蛋白质具有同等的生物学机能的蛋白质和/或具有同等的免疫学活性的蛋白质(所谓的CSRP1、IPO9或者NUCKS1的相同物)。

在此，作为具有同等的生物学机能的蛋白质，可以举和CSRP1、IPO9或者NUCKS1在生化学或者药理学的机能上相同的蛋白质。另外，作为具有同等的免疫学活性的蛋白质，可以举在适当的动物或者其细胞中诱发特定的免疫反应，而且具有和对CSRP1、IPO9或者NUCKS1的抗体特异结合的能力的蛋白质。

另外，确定氨基酸残基的取代、插入或者缺失的指标，可以使用本领域技术人员公知的电脑程序，例如使用DNA Star软件来发现。例如，变异数典型的为总氨基酸的10％以内，优选为总氨基酸的5％以内，更加优选为总氨基酸的1％以内。另外，从保持蛋白质的结构的观点出发，被取代的氨基酸优选为在氨基酸的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、两亲性等方面具有和取代前的氨基酸相似的性质的氨基酸。

作为部分多肽，可以举由本发明的毛发形状易感性基因编码的氨基酸序列(例如，序列号43、序列号45或者序列号47中所示的氨基酸序列)中至少连续的5个氨基酸，优选为10～100个氨基酸构成的多肽，可以举和本发明的毛发形状易感性基因的表达产物(例如，CSRP1、IPO9或者NUCKS1)具有同等的生物学机能和/或同等的免疫学活性的多肽。

本发明的毛发形状易感性基因编码的多肽，可以通过基于该毛发性状易感性基因的碱基序列信息，通过DNA克隆、各质粒的构筑、到宿主的转染、转化体的培养以及从培养物中回收蛋白质的操作得到。这些操作可以按照公知的方法，例如，可以按照Molecular Cloning，T.Maniatis et al.，CSH Laboratory(1983)，DNA Cloning，DM.Glover，IRLPRESS(1985))等上记载的方法进行。

具体来说，制作编码CSRP1、IPO9或者NUCKS1的基因在所希望的宿主细胞中能表达的重组DNA(表达载体)，将其导入到宿主细胞中进行转化，培养该转化体，从得到的培养物中，通过回收目标蛋白质而得到。

另外，由本发明的毛发形状易感性基因编码的多肽，可以按照该毛发形状易感性基因编码的氨基酸序列，通过一般的化学合成法制造。

(4)用于特异性识别毛发形状类型的标记(多肽)的抗体

特异性识别由本发明的毛发形状易感性基因编码的氨基酸序列构成的多肽或者其部分多肽的抗体，可以成为用于检测上述毛发形状类型的标记(多肽)的抗体。

如后面所述，通过使用相关的抗体可以检测出被检测者的组织内的毛发形状类型的标记(多肽)(例如，CSRP1、IPO9、NUCKS1，或者来自这些蛋白质的多肽，或者这些多肽的部分多肽)的表达的有无、以及其表达的程度。具体来说，用活组织检查等采集被检测者的毛发发根部等的一部分，由此按照常用方法调制蛋白质，例如，在Western杂交(Western Blot)法、ELISA法等公知的检测方法中，通过按照常用方法使用本发明的抗体，可以检测出在该组织中存在的上述毛发形状类型的标记(多肽)。

该毛发形状类型的检测用抗体可以是将毛发形状类型的标记(多肽)作为免疫抗原的多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。

这些抗体，可以按照公知的方法制造(Current protocols inMolecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.12-11.13)。具体来说，多克隆抗体可以按照常用方法使用在大肠杆菌等中表达并精制的本发明的毛发形状易感性基因编码的氨基酸序列构成的多肽(例如，CSRP1、IPO9或者NUCKS1)，或者按照常用方法合成该多肽的部分多肽，对家兔等非人的动物进行免疫，由该免疫动物的血清按照常用方法而得到。

另一方面，单克隆抗体可以按照常用方法通过用在大肠杆菌等中表达并精制的上述多肽或者其部分多肽对小鼠等非人动物进行免疫，从将得到的脾脏细胞和骨髓细胞进行细胞融合而调制的杂交瘤细胞中得到(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley and Sons.Section 11.4-11.11)。

作为在此使用的部分多肽，为具有由本发明的毛发形状易感性基因编码的氨基酸序列构成的多肽(例如，CSRP1、IPO9或者NUCKS1)的部分氨基酸的寡肽，虽然不需要具有机能性的生物活性，但是优选具有与由上述氨基酸序列构成的蛋白质同等的免疫原特性。例如，可以举由上述氨基酸序列构成的蛋白质，优选具有和CSRP1、IPO9或者NUCKS1同等的免疫原特性而且由在上述氨基酸序列中至少连续的8个氨基酸，优选为15个氨基酸、更加优选为20个氨基酸构成的寡肽。

对于相关部分多肽的抗体的制造，也可以通过根据宿主使用种种佐剂提高免疫学反应来进行。虽然没有限定，但是这样的佐剂中含有弗氏佐剂(Freund′s adjuvant)、氢氧化铝这样的矿物胶；以及溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇(Pluronic polyol)、聚阴离子(polyanion)、肽、油乳剂、钥孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin)、以及二硝基苯酚(dinitrophenol)这样的表面活性物质；BCG(Bacillus Calmette-Guérin、卡介苗)和棒状杆菌属(Corynebacterium)等人用佐剂。

(5)毛发形状类型的检测和/或判定

毛发形状类型的检测·判定是在进行活组织检查等中采集被检测者的毛发发根组织等的一部分，将其中含有的本发明的毛发形状类型的标记作为指标，检测和/或判定毛发形状类型。例如，在上述方法中，通过测定本发明的毛发形状易感性基因(CSRP1基因、IPO9基因或者NUCKS1基因)、其互补链、或者其部分多核苷酸的表达水平(表达量)、或者由该基因得到的蛋白质(例如CSRP1、IPO9或者NUCKS1)、其相同物、或者其部分多肽的表达量，从而检测和/或判定毛发形状类型。

另外，本发明的检测·判定方法在例如卷发者中，在将改善该卷发的医药品和化妆品等进行给药的情况下，也可以用于判定该卷发改善的有无或者其程度。

1)活体样品

在此使用的活体样品为含有被检测者的上皮组织或者上皮细胞、例如毛发发根部和皮肤等可能表达本发明的毛发形状易感性基因(例如，CSRP1基因、IPO9基因或者NUCKS1基因)的细胞的组织，由这些组织调制的RNA或者由这些RNA进一步调制的多核苷酸或者由上述组织调制的蛋白质。这些RNA、多核苷酸以及蛋白质可以是在例如在活组织检查等中采集被检测者的毛发发根部的一部分之后，按照常用方法调制。

2)标记的检测和/或测定

标记的检测以及测定是对作为测定对象使用的活体样品的种类，具体如下面所述的实施。

(i)利用RNA作为测定对象的活体样品的情况

利用RNA作为活体样品的情况下，通过检测、测定该RNA中的上述本发明的毛发形状类型的标记(多核苷酸)，例如CSRP1基因、IPO9基因、NUCKS1基因、或者其部分多核苷酸等的表达水平来实施。

在此，上述标记的表达量的测定，具体来说，可以使用用于扩增能形成前面所述的本发明标记的多核苷酸的引物或者用于检测该多核苷酸的探针，通过Northern杂交法、RT-PCR法、DNA芯片分析法、原位杂交分析法等公知的方法实施。

在利用Northern杂交法的情况下，通过使用本发明的探针，可以检测、测定RNA中的上述标记(例如，CSRP1基因、IPO9基因、NUCKS1基因、或者其部分多核苷酸)的表达的有无和表达水平。

具体来说，首先用放射性同位素(³²P、³³P等：RI)、荧光物质等标识探针DNA。接下来，将得到的标识疾病标记按照常用方法和转移到尼龙薄膜等上的来自被检测者的活体组织的RNA杂交。之后，可以例示如下方法，该方法是将形成的标识疾病标记(DNA)和RNA的双链用放射线检测器(BAS-1800II、富士胶卷公司制造)、荧光检测器等来检测、测定该标识疾病标记的标识物(RI、荧光物质等)发出的信号。

另外，也可以采用如下方法，该方法是使用AlkPhos Direct^TMLabelling and Detection System(Amersham Pharamcia Biotech公司制造)，根据该规程来标识探针DNA，将其与来自被检测者的活体组织的RNA杂交之后，用Multibio Imager STORM860(AmershamPharmaciaBiotech公司制造)检测、测定由该探针DNA的标识物发出的信号。

在利用RT-PCR法的情况下，使用本发明的引物，可以检测、测定RNA中的上述标记的表达的有无和表达水平。具体来说，首先从来自被检测者的活体组织的RNA中按照常用方法调制cDNA，以将其作为模板以扩增目标标记的区域的方式，将从本发明的标记多核苷酸调制的一对引物(上述cDNA(-链)上结合的正链、+链上结合的负链)与其杂交。之后，按照常用方法进行PCR法，检测得到的扩增双链DNA。

在扩增的双链DNA的检测中，可以使用如下方法：检测通过使用预先用RI、荧光物质等标识的引物进行上述PCR而产生的标识双链DNA的方法；按照常用方法将产生的双链DNA转移到尼龙薄膜等上，将标识的疾病标记用作探针与其杂交来检测的方法。生成的标识双链DNA产物可以用Agilent 2100 bioanalyzer(Yokogawa Analytical SystemsInc.制造)等测定。另外，在SYBR(注册商标)Green RT-PCR Reagents(Applied Biosystems公司制造)中按照该规程调制RT-PCR反应液，使其在ABI PRIME(注册商标)7700Sequence Detection System(AppliedBiosystems公司制造)中反应，也能检测出该反应物。对于使用了所述的RT-PCR法的被检测者RNA中的本发明的毛发形状类型的标记(多核苷酸)的表达水平的检测、测定，在后面的实施例中详细叙述。

在利用DNA芯片分析的情况下，准备附有本发明的DNA探针(单链或者双链)的DNA芯片，在其上杂交从来自被检测者的活体组织的RNA按照常用方法调制的cRNA，将形成的DNA和cRNA的双链与由本发明的标记多核苷酸调制的标识探针结合，从而能够检测、测定本发明的标记的表达的有无以及表达水平。

另外，作为上述的DNA芯片，也可以使用能够检测、测定本发明的标记的表达水平的DNA芯片。作为该DNA芯片来说，可以举例如Affymetrix公司的GeneChip(注册商标)Human Genome U133 plus 2。

(ii)使用蛋白质作为测定对象的活体样品的情况

在使用蛋白质作为测定对象的情况下，可以通过使本发明的抗体和活体样品相接触，检测和该抗体结合的活体样品中的本发明的毛发形状类型的标记(多肽)，例如CSRP1、IPO9、NUCKS1、或者其部分多肽，测定其量(水平)来实施。

在此，蛋白质的结合量的测定，可以通过使用Western杂交法等公知的方法进行。

Western杂交法可以通过在使用本发明的抗体作为第一抗体之后，使用与用¹²⁵I等的放射性同位素、荧光物质、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase、HRP)等酶等标识的第一抗体相结合的抗体作为第二抗体，标识其第一抗体，用放射线测定器、荧光检测器等测定这些标识物质发出的信号来实施。另外，也可以在使用本发明的抗体作为第一抗体之后，使用ECL Plus Western Blotting Detction System(Amersham Pharmacia Biotech公司制造)，按照该规程检测，用Multibio Imager STORM860(AmershamPharmacia Biotech公司制造)进行测定。

3)毛发形状类型的判定

毛发形状类型的判定可以通过将按照上述测定的被检测者的活体样品中本发明的标记的水平(例如，CSRP1基因、IPO9基因、NUCKS1基因的基因表达水平，或者CSRP1、IPO9或者NUCKS1的量等)，与非卷发者的该水平相比较，判定两者的不同来进行。

被检测者的活体样品和非卷发者的活体样品之间的标记多核苷酸或者多肽的表达水平的比较，可以通过同时进行将被检测者的活体样品和非卷发者的活体样品作为对象的测定来实施。另外，即使不同时进行，也可以预先求得使用多个(至少2个，优选为3个以上，更加优选为5个以上)的非卷发者的组织在均匀的测定条件下测定得到的标记多核苷酸(CSRP1基因、IPO9基因、NUCKS1基因、或者其部分多核苷酸等)的基因表达水平或者标记多肽(CSRP1、IPO9、NUCKS1、或者其部分多肽等)的表达水平的平均值或者统计的中间值，将此作为非卷发者的标记多核苷酸或者多肽的表达水平，用于被检测者中的测定值的比较。

被检测者的毛发形状类型的判定可以将被检测者的组织中的标记多核苷酸(CSRP1基因、IPO9基因、NUCKS1基因、或者其部分多核苷酸等)的基因表达水平或者标记多肽(CSRP1、IPO9、NUCKS1、或者其部分多肽等)的表达水平与非卷发者的这些比较的情况下的增加或者减少的程度(例如2倍以上，优选为3倍以上左右)作为指标进行。

例如，如果被检测者的CSRP1基因或者CSRP1蛋白质的表达水平与非卷发者的这些水平相比多的话，则可以判断该被检测者为卷发者，或者怀疑将来可能会出现卷发。

另外例如，如果被检测者的IPO9基因或者IPO9蛋白质的表达水平与非卷发者的这些水平相比少的话，则可以判断该被检测者为卷发者，或者怀疑将来可能会出现卷发。

另外例如，如果被检测者的NUCKS1基因或者NUCKS1蛋白质的表达水平与非卷发者的这些水平相比少的话，则可以判断该被检测者为卷发者，或者怀疑将来可能会出现卷发。

7.毛发形状的调节方法

通过变换位于本发明的毛发形状易感性SNP标记处的碱基可以根本上调节个体的毛发形状。

即，本发明另外还提供个体的毛发形状的调节方法。在一个实施方式中，该方法可以为以美容为目的的调节毛发形状的非治疗的方法，可以由美容师或理发师等进行。另外，在本说明书中，“非治疗的”是指不含医疗行为，即通过治疗对人体的处置行为的概念。

该方法可以通过变换位于上述列举的本发明的毛发形状易感性SNP标记处的碱基来达成。作为具体的手法，只要是能够达成上述目的的方法都没有特别的限定，可以使用以前公知的方法以及将来开发的手法的任意方法，例如可以举例利用基因重组的方法等。

或者，本发明的毛发形状的调节方法，可以通过控制有必要进行毛发形状调节的人的毛发发根部的本发明的毛发形状易感性基因的表达来进行。

例如，对于困扰于卷发和卷缩发的人来说，通过诱导或者促进其表达对直发的表现型起作用的毛发形状易感性基因，例如IPO9基因或者NUCKS1基因的表达，可以抑制卷发和卷缩发。或者，通过阻碍其表达会对卷发或者卷缩发的表现型起作用的毛发形状易感性基因，例如CSRP1基因的表达，可以抑制卷发和卷缩发。另一方面对于希望头发波浪化的人来说，可以通过诱导或者促进其表达对卷发和卷缩发的表现型起作用的毛发易感性基因，例如CSRP1基因的表达，能够表达或者促进波浪化。或者通过阻碍其表达对直发的表现型起作用的毛发形状易感性基因，例如IPO9基因或者NUCKS1基因的表达，能够表达或者促进波浪化。

例如，在抑制卷发和卷缩发的情况下，可以使人的毛发发根部的IPO9基因或者NUCKS1基因的表达水平达到非卷发者中该基因的mRNA表达水平以上，例如为约3～10倍以上。另一方面，在以促进波浪化为目的的情况下，可以使IPO9基因或者NUCKS1基因的表达水平比非卷发者中该基因的mRNA表达水平低，例如为约3～10倍以下。

另外例如，在抑制卷发和卷缩发的情况下，可以使人的毛发发根部的CSRP1基因的表达水平达到非卷发者中该基因的mRNA表达水平以下，例如为约3～10倍以下。另一方面，在以促进波浪化为目的的情况下，可以使CSRP1基因的表达水平比非卷发者中该基因的mRNA表达水平高，例如为约3～10倍以上。

抑制、诱导或者促进人的毛发发根部上毛发形状易感性基因的表达，可以按照常用方法进行。例如，在基因抑制中，可以举出通过反义核苷酸的方法，例如阻碍从mRNA的翻译的方法等的手段，而在诱导或者促进中，则通过病毒载体等基因导入等来表达毛发形状易感性基因的手段等。另外，抑制毛发形状易感性基因编码的蛋白质的表达，基本上可以通过抑制该基因的表达的手段实现，另外，在诱导或者促进该蛋白质的表达中，除了使该基因高表达之外，可以举向皮内直接注入该蛋白质的人重组蛋白质的手段等。

利用上述反义核苷酸的基因导入可以和通常基因治疗中使用的方法同样进行，例如，通过以反义寡核苷酸或者其化学修饰体直接对被检测者的体内给药来控制本发明的毛发形状易感性基因的表达的方法，或者通过向患者的目标细胞中导入反义RNA通过该细胞控制本发明的毛发形状易感性基因的表达的方法来实施。

在此，“反义核苷酸”中包含对应于本发明的毛发形状易感性基因的至少8个碱基以上的部分的反义寡核苷酸、反义RNA、反义DNA等。在其化学修饰体中，包含例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯、烷基亚磷酰胺等能提高向细胞内转移性和在细胞内的稳定性的衍生物(″Antisense RNA and DNA″，WILEY-LISS期刊，1992年，pp.1-50，J.Med.Chem.36，1923-1937(1993))。

反义核苷酸或者其化学修饰体在细胞内与有义链mRNA结合，可以控制毛发形状易感性基因的表达，即，毛发形状易感性基因编码的蛋白质的表达，并能控制相关的该蛋白质的机能(活性)。

在将反义寡核苷酸或者其化学修饰体直接对活体内给药的方法中，所用的反义寡核苷酸或者其化学修饰体优选具有5～200个碱基长度，更加优选为8～25个碱基长度，最优选为12～25个碱基的长度。在给药的时候，可以对反义寡核苷酸或者其化学修饰体使用通常使用的稳定剂、缓冲液、溶剂等进行制剂化。

在将反义RNA导入被检测者的目标细胞中的方法中，所用的反义RNA优选为具有100个碱基以上，更加优选为具有300个碱基以上，更加优选为具有500个碱基以上的长度。另外，此方法包含向活体内的细胞中导入反义基因的体内(in vivo)法以及向一旦取出体外的细胞中导入反义基因，再将该细胞放回体内的体外(ex vivo)法(参考NIKKEI SCIENCE，1994年4月号，20-45页、月刊药事，36(1)，23-48(1994)、实验医学增刊，12(15)，全页(1994)等)。其中，优选体内法，体内法中有病毒导入法(使用重组病毒的方法)和非病毒导入法(参考前面所述各文献)。

作为使用重组病毒的方法，例如，可以举向逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒(adeno-associated virus)、疱疹病毒(herpesvirus)、牛痘病毒(vaccinia virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)等病毒基因组中重组MLTK基因的反义核苷酸而导入活体内的方法。其中，特别优选使用逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等的方法。作为非病毒导入法，可以举脂质体(liposome)法、脂质体转染(lipofection)法等，特别优选使用脂质体法。作为其它的非病毒导入法，也可以举例如，微注射法、磷酸钙法、电穿孔法等。

基因导入用制剂组合物是以上述反义核苷酸或者其化学修饰体，含有这些的重组病毒以及导入了这些病毒的感染细胞等为有效成分的组合物。

将该组合物向被检测者的给药，可以以例如注射剂等的适当的给药方式，向静脉、动脉、皮下、肌肉内等给药，另外还可以从患者的皮肤直接给药、导入。在采用体内法的情况下，基因导入用组合物除了可以是含有毛发形状易感性基因的反义核苷酸的注射剂等的给药形态之外，还可以制成例如将含有毛发形状易感性基因的反义核苷酸的病毒载体包埋在脂质体或者膜融合脂质体中的形态(仙台病毒(Hemagglutinating virus of Japan，HVJ)-脂质体等)。这些脂质体制剂的形态中，含有悬浊液、冷冻剂、离心分离浓缩冷冻剂等。另外，基因导入用组合物也可以制成被导入了含有上述毛发形状易感性基因的反义核苷酸的载体的病毒所感染的细胞培养液的形态。这些各种形态的制剂中的有效成分的给药量可以根据作为治疗目的的疾病的程度、患者的年龄、体重等进行适当的调节。通常，在相对于毛发形状易感性基因的反义核苷酸的情况下，设定为被检测者成人每1人在数天～数月内一次给药约0.0001～100mg，优选为约0.001～10mg的量即可。

在含有反义核苷酸的逆转录病毒载体的情况下，作为逆转录病毒滴度，可以从1天患者体重每1kg约1×10³pfu～1×101⁵pfu的量的范围内选择。在导入了反义核苷酸的细胞的情况下，可以以1×10⁴细胞/body～1×10¹⁵细胞/body左右给药。

8.毛发形状调节剂的评价或者选择方法

另外，本发明提供用于评价或者选择毛发形状调节剂的方法(筛选方法)。

该筛选方法可以按照例如下面所述的工序实施。

(a)向含有本发明的毛发形状易感性基因的细胞将被检测物质给药的工序；以及

(b)从被给药的被检测物质中，选择使在该毛发形状易感性基因之上或者其附近，例如存在于该基因所属的单倍域上的本发明的毛发形状易感性SNP标记的碱基的多态性变换为另一种多态性的物质作为毛发形状调节剂的工序。

在上述工序(a)(被检测物质的给药工序)中使用的细胞，只要是能够导入人1号染色体的基因组区域中序列号1～3表示的碱基序列所表示的单倍域、或者至少是与该单倍域相重叠的基因，即本发明的毛发形状易感性基因，并且能够稳定地保持该基因的细胞即可，其来源(例如，原核细胞以及真核细胞的区别、昆虫细胞和动物细胞的区别等)没有特别的限制，另外，基因导入和细胞培养等可以任意使用在本领域中现有公知的方法来实施(例如，Joseph Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3 Vol.Set)，Cold Spring HarborLaboratory，NY，2001、日本组织培养学会编，《组织培养的技术、第3版、基础编·应用编》，朝仓书店，1996等)。该细胞可以在用于评价或者选择对调节毛发形状有效的物质的方法(筛选方法)中，作为筛选工具有效利用。

被给药的被检测物质没有特别的限制。例如，可以举天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质以及肽等单一化合物、以及化合物库、基因库的表达产物、细胞提取物、细胞培养上清液、发酵微生物产生物、海洋生物提取物、植物提取物等任意的化合物或者组合物。

在上述的工序(b)(毛发形状调节剂的选择工序)中，检测出碱基的多态性的变换的有无以及变换后的碱基的种类。作为用于检测碱基多态性的变换的有无以及变换了的碱基的种类的方法，可以是直接测定碱基的种类的方法，另外也可以是能间接评价碱基变化的方法。例如，作为直接测定碱基的方法，可以举PCR-SSCP、PCR-RLFP、PCR-SSO、PCR-ASP、定向测序法、SNaPshot、dHPLC、Sniper法、MALDI-TOF/MS法等本领域的技术人员公知的方法，作为间接评价的方法，可以举通过测定作为该目的的碱基变换所产生/增加、或者消失/降低的机能、活性或者特定的mRNA量、蛋白质量的方法。

用该方法选择的物质，可以作为对毛发形状的调节有效的毛发形状调节剂使用，另外，可以在用于制造含有该制剂的医药品、医药部外品、化妆品或者健康食品等的制造中使用。根据必要，通过将选择的物质进一步用于其它的药理试验和临床试验以及毒性试验，可以取得对人类更有效并安全的毛发形状调节剂。

或者，上述筛选方法也可以在例如本发明的毛发形状易感性基因或者该基因编码的蛋白质可能表达的组织或细胞中，将该基因或者蛋白质的表达作为指标进行。

具体可以通过下面的(a)～(d)的工序进行。

(a)使被检测物质与本发明的毛发形状易感性基因或者该基因编码的蛋白质可能表达的组织或者细胞相接触的工序；

(b)测定该组织或者细胞的该基因或者该蛋白质的表达量的工序；

(c)将(b)中测定的表达量和不接触被检测物质的对照组织或者细胞的该基因或者该蛋白质的表达量进行比较的工序；

(d)基于(c)的结果，选择使该基因或者该蛋白质的表达量减少或者增加的被检测物质作为毛发形状调节剂的工序。

在此，作为被使用的本发明的毛发形状易感性基因或者该基因编码的蛋白质可能表达的组织或者细胞，只要是表达该基因或者该蛋白质的组织或者细胞，不问其种类，可以是哺乳动物的组织或者细胞，例如可以举从人身上采集的皮肤组织、毛发发根部组织(毛囊组织)、表皮角化细胞、来自毛发发根部的细胞、以及上皮组织的细胞株等。该细胞中，也包含用本发明的毛发形状易感性基因(具有该基因的表达载体)转化而成的转化细胞。

将该组织或者细胞与被检测物质接触，例如，可以在将被检测物质预先添加到培养液中达到所规定的浓度之后，将组织或者细胞载置于培养液中或者可以通过向载置有组织或者细胞的培养液中添加被检测物质到所规定的浓度来进行。

培养液可以举例如DMEM培养基、MCDB培养基、Willam’s E培养基、RPMI1640培养基、DMEM/HamF12(1∶1)培养基、以及市售的各种上皮细胞用培养基等，也可以添加适当的琼脂和明胶。另外，也可以根据必要，添加抗生素、氨基酸、血清、生长因子、活体提取物等。

组织培养可以通过例如向添加了培养液的24孔细胞培养板中加入采集的毛发发根部组织(毛囊组织)，在37℃的温度下，在含有CO₂的空气气相条件下，通常培养1～30天，优选为1～21天时间来进行。

另外，细胞培养可以通过例如向添加了培养液的24孔细胞培养板中加入细胞，在37℃的温度下，在含有CO₂的空气气相条件下，通常培养1～7天，优选为1～3天时间来进行。

上述基因的表达的测定(定量)可以根据前面所述的毛发形状类型的标记的检测·测定((5)-2)-(i))中记载的方法进行。即，使用用于扩增能成为本发明的标记的多核苷酸的引物或用于检测该多核苷酸的探针，通过进行Northern杂交法、RT-PCR法、DNA芯片分析法、原位杂交分析法等公知的方法来实施。

另外，上述蛋白质的表达的测定(定量)可以根据前面所述的毛发形状类型的标记的检测·测定((5)-2)-(ii))中记载的方法进行。即，使用了识别本发明的毛发形状类型的标记(多肽)的抗体的Western杂交法等公知的方法进行定量。

2)另外，本发明的毛发形状易感性基因的表达水平的测定可以在控制该基因的表达的基因区域(表达控制区域)上，使用导入了结合有例如萤光素酶基因等的报告基因的融合基因的细胞株，通过测定来自报告基因的蛋白质量或者其活性来实施。

即，本发明中毛发形状调节剂的评价或者选择方法另外可以通过以下的(a)～(c)的工序进行。

(a)向本发明的毛发形状易感性基因可能表达的细胞中，导入该毛发形状易感性基因的表达控制区域和报告基因的融合基因，并在被检测物质的存在条件下和不存在条件下培养该细胞的工序；

(b)测定在被检测物质的存在条件下培养的细胞培养物中的报告基因表达产物的表达量，并将该量与在被检测物质的不存在条件下培养的细胞培养物中的报告基因表达产物的表达量进行比较的工序；

(c)基于上述(b)的比较结果，选择使该报告基因表达产物的表达量增减的被检测物质作为毛发形状调节剂的工序。

作为上述报告基因，优选催化发光反应或者显色反应的酶的结构基因。具体来说，可以举上述荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因、氯霉素乙酰基转移酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、β-半乳糖苷酶基因、水母发光蛋白基因等。

另外，作为毛发形状易感性基因的表达控制区域，可以使用例如该基因的转录开始部位上游约1kb～约10kb，优选为约2kb，例如，对于CSRP1基因、IPO9基因、或者NUCKS1基因，分别可以举序列号48～50所示的碱基序列构成的区域。融合基因的制作和来自报告基因的活性测定可以按照公知的方法进行。

所谓降低毛发形状易感性基因的表达量的物质，是指抑制与构成该基因的多核苷酸有互补性的mRNA的表达或者促进其分解的物质，所谓降低毛发形状易感性基因编码的蛋白质的表达量的物质，是指抑制该毛发形状易感性基因或者其蛋白质的表达，或者促进该基因或者蛋白质的分解，作为结果减少其蛋白质的表达量的物质。

所谓增加毛发形状易感性基因的表达量的物质，是指促进与构成该基因的多核苷酸有互补性的mRNA的表达或者抑制其分解的物质，所谓增加毛发形状易感性基因编码的蛋白质的表达量的物质，是指促进该毛发形状易感性基因或者其蛋白质的表达，或者抑制该基因或者蛋白质的分解，作为结果增加其蛋白质的表达量的物质。

增加毛发形状易感性基因或者该基因编码的蛋白质的表达量的物质成为卷发和卷缩发的降低剂或者促进剂。例如，增加CSRP1基因、IPO9基因、或者NUCKS1基因，或者这些基因编码的蛋白质的表达量的物质，可以作为卷发和卷缩发的降低剂或者改善剂，另一方面，降低这些的基因或者蛋白质的表达的物质，可以作为卷发和卷缩发的促进剂或者波浪化促进剂。另外，例如，增加IVL基因或者由其编码的蛋白质的表达量的物质，可以作为卷发和卷缩发的促进剂或者波浪化的促进剂，另一方面，降低该基因或者蛋白质的表达的物质，可以作为卷发或者卷缩发的降低剂或者改善剂。通过以相关的毛发形状调节剂对人给药，可以得到用于改善卷发或者卷缩发或者促进毛发的波浪化的医药品、化妆品等。

3)另外，本发明的毛发形状调节剂的评价或者选择方法，也可以将本发明的毛发形状易感性基因编码的蛋白质的机能(活性)作为指标进行。

上述蛋白质的机能或者活性可以举例如，乙酰胆碱受体活性(Nguyen VT et al.，J.Biol.Chem.275(38)，p29466-76，2000)和磷脂酰丝氨酸结合能(Goebeler V et al.，FEBS Lett.546(2-3)，p359-64，2003)，该蛋白质的量和机能或者活性具有一定的相关关系。因此，代替测定上述蛋白质的量，也可以通过进行该蛋白质的机能或者活性的测定，进行毛发形状调节剂的评价或者选择。

具体来说，通过下述的工序(a)、(b)以及(c)的工序进行。

(a)使被检测物质和含有本发明的毛发形状易感性基因编码的蛋白质的水溶液、组织细胞或者由该组织细胞调制的细胞组分接触的工序；

(b)测定接触了被检测物质的水溶液、组织细胞或者细胞组分中的该蛋白质的机能或者活性，并将该机能或者活性与不接触被检测物质的对照水溶液、对照细胞或者对照细胞组分中的该蛋白质的机能或者活性相比较的工序；

(c)基于上述(b)的比较结果，选择使该蛋白质的机能或者活性增减的被检测物质的工序。

作为含有毛发形状易感性基因编码的蛋白质的水溶液，除了例如CSRP1、IPO9、或者NUCKS1的水溶液之外，可以举出例如含有这些蛋白质的组织细胞溶解液、核提取液或者细胞的培养上清液等。在此，所使用的细胞可以举出表达本发明的毛发形状易感性基因(例如，CSRP1基因、IPO9基因、或者NUCKS1基因)，并且具有由这些基因编码的蛋白质作为其表达产物的细胞。具体来说，可以使用哺乳动物的组织或细胞，例如，从人身上采集的皮肤组织、毛发发根部组织(毛囊组织)、表皮角化细胞、来自毛发发根部的细胞、以及上皮组织的细胞株等。该细胞中也包含用本发明的毛发形状易感性基因(或者具有其的表达载体)转化而成的转化细胞。作为该转化细胞中所用的宿主细胞，可以举例如Hela细胞、COS细胞、HEK293细胞、MDCK细胞、CHO细胞、HL60细胞等公知的细胞。另外，细胞组分是指来自上述细胞的各种组分，其中包含例如细胞膜组分、细胞质组分、细胞核组分等。

本发明的毛发形状易感性基因编码的蛋白质的活性在例如测定乙酰胆碱受体活性和磷脂酰丝氨酸结合能的情况下，可以用结合分析法(binding assay)、免疫共沉淀法、pull-down分析、Two-hybrid法(Y2H)、荧光偏振法、时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)法等公知的方法测定(例如，中内启光/编，免疫学的规程(免疫学的プロトコ一ル)，羊土社，2004年、竹绳忠臣/编，解析蛋白质相互作用的最适方法(タンパク質相互作用を解明する最適メソツド)，Biotechnology-JournalVol.5 No.6、羊土社、2005年)。即，使用含有由毛发形状易感性基因编码的蛋白质的水溶液等将该蛋白质固化成薄膜或者板状，通过检测出用放射性同位素标识的乙酰胆碱或磷脂酰丝氨酸的结合量来测定。抑制(减少)该蛋白质的机能(活性)的物质称为降低乙酰胆碱受体活性或磷脂酰丝氨酸结合能的物质，亢进(增加)该蛋白质的机能(活性)的物质称为增加乙酰胆碱受体活性或磷脂酰丝氨酸结合能的物质。例如，亢进IPO9或者NUCKS1的机能(活性)的物质可以成为卷发和卷缩发的改善剂，抑制这些蛋白质的机能(活性)的物质能成为波浪化促进剂。另外，例如，亢进CSRP1的机能(活性)的物质，可以成为波浪化促进剂，抑制这些蛋白质的机能(活性)的物质，能成为卷发和卷缩发的改善剂。

实施例

举以下的实施例说明本发明。

实施例1毛发形状的定义和卷发家族的收集

在本实施例中，为了认定毛发形状易感性基因，以日本人群体为对象进行患病同胞对连锁分析，以及病例·对照例关联分析。

一般，毛发形状根据人种而会有不同，亚洲人种相对直发较多，非洲人种卷缩发(或者卷发)是主流。印欧人种中为这中间的波状发(波浪发)的特性的比例较高。因为日本人群体为直发占优势的群体，所以将作为毛发形状具有卷发特性的人规定为患病者(病例)，将具有直发特性的人规定为对照者(对照例)。在连锁分析等遗传分析中，有必要将作为对象的特性进行某种程度上的定量，例如，考虑卷发＝1、直发＝0这样的二值化的方法，和将卷发的程度用某些方法测定而数值化的方法。但是，人的毛发形状多种多样，现在其测量和分类的方法也不十分确定。在此，首先进行了毛发形状的表现型的正确的分类。毛发形状根据毛发的总体特征和卷曲的程度(卷曲半径)规定。另外，不仅仅是一根毛发的卷曲特性，其和周围的毛发群的卷曲的同步性也是规定毛发形状的重要因素。在此，基于各种人种的毛发形状实际状态，将毛发形状的表现型分类如表4所示。本分类可以适用于以日本人群体为首的各种人种群体。另外，图1中显示毛发形状的表现型的图像。

[表4]

毛发形状的表现型的分类

另一方面，毛发形状的表现型是在群体中连续变化的量的特性，由评价可知以何种程度判断为卷发特性或者直发特性。在本发明中，基于毛发形状的实际状态，将所述分类中的卷缩发、以及卷发或者强波浪发规定为卷发特性，将波浪发、大略直发或者微波浪发、直发规定为直发(非卷发)特性。

这样虽然可以对毛发形状的表现型进行正确的分类，但是，在收集遗传分析的对象的时候，考虑应该解决以下问题。即，在收集的时候毛发为明显的短发不能进行形状的评价的情况，经过烫发和染发、各种定型剂等化学处理而改变原来的形状的情况。因此，对于能成为遗传分析的对象者的所有候选者，要求其提供在能判断其毛发形状的表现型的时候(例如幼小时期)拍摄的候选者本人的照片。即，不是明显短发、并且毛发未经过化学处理的状态下的照片。同时要求所有的候选者提供多根头发。将提供的头发在化学处理的影响会消失的水浸条件下对毛发进行扭曲和拧曲、卷缩、卷曲特性等详细的形状评价。根据提供的候选者本人的照片进行的毛发形状评价、以及根据提供的毛发的形状评价、进而最后见面时进行的毛发形状调查来确定遗传分析的对象者。

这样，花了约2年时间，从日本全国3000个以上的候选者中收集了68个家族283人的卷发家族。其具体为：41组的2人兄弟姐妹、22组的3人兄弟姐妹、4组的4人兄弟姐妹、1组的5人兄弟姐妹，最终的患病同胞对(具有卷发特性的兄弟姐妹)为100对。考虑遗传因素的强度、兄弟姐妹中的风险率，能预测到以该同胞对数能充分地特定基因位点，因此，实施患病同胞对连锁分析。

在从遗传分析的对象者身上收集检测体的时候，事前得到了伦理委员会的承认，知情同意实施担当者用书面对对象者说明了研究内容，在得到了书面的同意的情况下收集了检测体。

医生或者护士从遗传分析的对象者身上采集了约20mL的血液。从血液检测体中，使用PUREGENE Genomic DNA Purification Kit(Gentra Systems Inc.制造)根据指南提取了基因组DNA。将基因组DNA溶解于2mL的DNA水合溶液(DNA Hydration Solution)中，测定浓度之后，在4℃下保存。基因组DNA的平均收集量为576.2g/20mL血液。

实施例2全基因组内的患病同胞对连锁分析

在本实施例中，首先以日本人卷发家族作为对象，进行包含全基因组的患病同胞对连锁分析。如果简单叙述该方法的原理，是因为患病兄弟姐妹从父母身上继承了构成患病原因的等位基因，因此肯定共有该等位基因。另一方面，兄弟共有的等位基因的数目为1(基于零假设(null hypothesis)的值)。通过探讨多个患病同胞对所共有的等位基因数，根据基于零假设的等位基因数，在能观察较多的等位基因共有的时候，认定为连锁。

患病同胞对连锁分析使用Applied Biosystems，Inc.(ABI)制造的全基因组扫描、连锁分析试剂盒(ABI PRISM Linkage Mapping Set-MD10 v2.5)进行。这是用于扩增作为平均分布于基因组中的多态性丰富的短重复序列的微卫星，并且通过共计400个的分型用荧光引物组以平均9.2cM的间隔来覆盖人染色体的全基因组扫描、连锁分析试剂盒。

将在实施例1中调制的基因组DNA作为模板，使用LinkageMapping Set进行PCR(GeneAmp PCR System 9700G、ABI制造)，通过ABI Prism 3100 Genetic Analyzer(ABI制造)进行扩增产物(片段)的检测。分型用荧光引物组为用6-FAM(蓝色)、VIC(绿色)、NED(黄色)3种荧光色素标识的引物，因此，即使是同一尺寸的片段也能分别判别3种颜色。这样，能迅速地处理大量的样品。片段的分型是通过Genotyper软件v3.7(ABI制造)和GeneScan软件(ABI制造)进行的。

连锁的检测使用作为非参数分析的Genehunter v2.1_r5软件(Kruglyak，L.et al.，Am.J.Hum.Genet.，58(6)，1347-1363，1996)进行。连锁被确认区域的判定是按照以下所示的Lander和Kruglyak的指导原则(Nat.Genet.，11(3)，241-247，1995)，以得到假阳性的连锁为基准。

Lander和Kruglyak的指导原则，虽然现在盛行在多因素疾病中进行全基因组的连锁分析，但是对于各个基因的连锁分析来说，也加上由于该基因功能是否构成原因的判断。但是，因为在全基因组内的分析中不需要在此阶段考虑基因功能，因此，可以求得纯粹的数理遗传学上的显著的判断基准(阈值)。在此，他们根据模拟，设计了下述表5中所示的显著的连锁基准。

[表5]

筛选全部染色体的结果识别出对1号染色体、以及11号染色体连锁。其结果分别如图2、图3所示。如图2所示，在1号染色体中，在1q21～1q23.1区域(D1S498附近)中，最大LOD分数＝3.49，1q32～1q41区域(D1S249～D1S213)中最大LOD分数＝3.13。如图3所示，11号染色体中，11q12～11q13.5区域(D11S905～D11S937)中，最大LOD分数＝2.78。这样得到的值，满足上述Lander和Kruglyak的提示连锁。因此，可以将卷发特性位点特定于1号染色体、以及11号染色体上，强烈暗示此区域上存在毛发形状易感性基因。

实施例3候选区域中的详细绘图

接下来，针对实施例2中认定连锁的1号染色体，以窄化连锁区域为目的，进一步追加微卫星标记，进行患病同胞对连锁分析(详细绘图)。

构成详细绘图的标记的微卫星是使用The Mammalian GenoytpingService的完整人类基因组遗传图谱(Comprehensive human geneticmaps)(http://research.marshfieldclinic.org/genetics/GeneticResearch/compMaps.asp)进行寻找，选择基因组中以1～2cM的间隔存在且杂合度高的微卫星。另外，扩增微卫星的分型用引物是基于人类基因组数据库项目(The Genome Database project)(GDB)(http://www.gdb.org/)而设计的。另外，GDB在结束运作之后，可以根据现在的NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行检索、设计。分型用荧光引物使用ABI制造的产品，一部分分型用引物使用全基因组扫描、连锁分析试剂盒(ABI PRISM Linkage Mapping Set-MD 10v2.5，ABI制造)所包含的产品。作为详细绘图的标记的微卫星、以及分型用荧光引物如表6-1以及表6-2中所示(参照序列号4～41)。

针对1号染色体进行和实施例2同样的患病同胞对连锁分析(详细绘图)，其结果如图4所示。如图4所示，1q21.3区域(D1S2696～D1S2346)中最大LOD分数＝3.60，1q32.1～1q32.2区域(D1S249～D1S2891)中最大LOD分数＝2.14。考虑这样得到的值，分别满足实施例2中所示的Lander和Kruglyak的显著连锁、提示连锁。可以窄化1号染色体的卷发特性位点，强烈暗示此区域上存在毛发形状易感性基因。

实施例4病例·对照例关联分析

为了从上述实施例3中认定为强烈连锁的1号染色体1q32.1～1q32.2区域(D1S249～D1S2891)中认定毛发形状易感性基因，针对在该区域中存在的单核苷酸多态性(SNP)标记通过病例·对照例关联分析进行等位基因频率的比较。

病例(患病者：具有卷发特性的人)以及对照例(对照者：具有直发特性的人)有必要用与认定毛发形状易感性基因的人种相同的人种来构成，因此，本发明中以日本人非血缘关系的具有卷发特性的人和日本人非血缘关系的具有直发特性的人作为对象。基于实施例1中所示的基准同样收集对象者，从43名的日本人非血缘关系的具有卷发特性的人、51名日本人非血缘关系的具有直发特性的人身上分别得到基因组DNA。

进行分型的SNP是参照dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)以及JSNP数据库(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html)，代表该分析区域内的一定区域，并且选择在日本人专门小组中次要等位基因频率为10％以上的SNP，并从该分析区域内选择57个SNP。

SNP的分型中利用TaqMan SNP基因型分析(TaqMan SNPGenotyping Assays)(ABI制造、原名Assays-on-Demand、Assays-by-Design)，通过TaqMan PCR法进行。另外，使用AppliedBiosystems 7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems 7900HTFast Real time PCR System)(ABI制造)、以及Applied Biosystems 7500实时PCR系统(Applied Biosystems 7500 Real time PCR System)(ABI制造)的机器。该方法根据附加于各个机器上的指南进行。

得到的分型数据按照病例、对照例分别总计，以基因型、等位基因型、显性模型、隐性模型的4种方法用χ²检测进行显著差检测。即，如果某些基因变异成为毛发形状变化的原因的话，可以预料到在病例和对照例中在其等位基因频率等上存在差异。另外，在本实施例中，为了在比较少数的对象者中实施该关联分析则将显著性水平定为p＜0.05。进一步，为了提高在一部分中的检测能力，则缓和设定显著性水平(p＜0.1)。

其结果发现，在以下的SNP中，在病例和对照例之间具有统计学的显著(p＜0.05)差。

对于SNP：rs1495840(序列号2表示的碱基序列中，碱基号50038所表示的单核苷酸多态性)来说，相比于具有卷发特性的人，具有直发特性的人平均具有T等位基因的比例显著高，即使根据等位基因型也能在具有直发特性的人和具有卷发特性的人之间观察到显著差(表7-1)。

另外，也发现在以下所示的2个SNP中，在病例和对照例之间具有差别。

对于SNP：rs576697(序列号1表示的碱基序列中，碱基号1所表示的单核苷酸多态性)来说，相比于具有直发特性的人，具有卷发特性的人平均具有C等位基因的比例高(p＝0.096)(表7-2)。

对于SNP：rs823114(序列号3表示的碱基序列中，碱基号60701所表示的单核苷酸多态性)来说，相比于具有直发特性的人，具有卷发特性的人平均具有A等位基因的比例高(p＝0.065)(表7-3)。

对于这3个SNP任意一个都满足Hardy-Weinberg平衡状态。因此，判断这3个SNP为毛发形状易感性SNP，认为与毛发形状相关联。

[表7-1]SNP：rs1495840中的关联分析

[表7-2]SNP：rs576697中的关联分析

[表7-3]SNP：rs823114中的关联分析

实施例5单倍体型分析

在实施例4中分析的结果，发现了3个毛发形状易感性SNP，但是为了确认该SNP周边区域中存在的多态性、特别是没有进行分型的多态性也有相关，并认定毛发形状易感性基因而进行了单倍体型分析。

分析使用Haploview 4.1软件(Barrett，JC.et al.，Bioinformatics，21(2)，263-265，2005)，通过EM算法算出连锁不平衡系数D’(pair-wiseLD coefficient)来分析。使用国际人类基因单倍体型图计划数据库的HapMap PHASE数据(HapMap Data Rel 21/PhaseII Ju106，on NCBIBuild 35 assembly，dbSNP b125)，对该SNP和其周边区域中存在的SNP进行连锁不平衡分析。另外，分析专门小组为JPT+CHB(日本，东京的日本人，以及中国北京的汉族中国人)。

单倍域的推测方法使用置信区间(Gabriel，SB.et al.，Science，296(5576)，p2225-2229，2002)。即，认为特定的单倍域是基本没有发现历史的重组的基因组范围，并且在其区域内存在强烈的连锁不平衡。通常在连锁不平衡系数D’的95％置信区间的上限小于0.9的情况下，判断此区域为有历史的重组证据的区域，另一方面，在D’的95％置信区间的上限超过0.98，其下限高于0.7的情况下，判断此区域为存在强烈的连锁不平衡的区域。

由此结果，发现含有以下所示的3个毛发形状易感性SNP的(1)～(3)的单倍域。

(1)含有SNP：rs576697，且从SNP：rs576697到SNP：rs12403361的由序列号1表示的碱基序列所表示的3,926bp构成的单倍域(图5)。此单倍域为含有CSRP1基因的区域。由此结果认定CSRP1基因为毛发形状易感性基因。

(2)含有SNP：rs1495840，且从SNP：rs2820290到SNP：rs2250377的由序列号2表示的碱基序列所表示的76,945bp构成的单倍域(图6)。此单倍域为含有NAV1基因、IPO9基因、以及TMEM58基因的区域。由此结果认定NAV1基因、IPO9基因、以及TMEM58基因为毛发形状易感性基因。

(3)含有SNP：rs823114，且从SNP：rs823103到SNP：rs1772150的由序列号3表示的碱基序列所表示的68,637bp构成的单倍域(图7)。此单倍域为含有NUCKS1基因的区域。由此结果认定NUCKS1基因为毛发形状易感性基因。

实施例6毛发形状易感性基因SNP标记的认定

在实施例5的单倍域分析中发现单倍域的同时，同样使用Haploview 4.1软件(Barrett，JC.et al.，Bioinformatics，21(2)，263-265，2005)，从各个单倍域中提取单倍体型。通过比较提取的单倍体型，即SNP标记群的各个碱基组合来认定和毛发形状易感性SNP标记位点连锁的SNP位点。这样认定的SNP位点可以作为新的毛发形状易感性SNP标记。

由此结果，实施例4中所示的(1)～(3)的单倍域中，发现以下所示的各个新的毛发形状易感性SNP标记。

(1)由序列号1表示的碱基序列表示的3,926bp构成的单倍域：此单倍域中存在着7种主要的单倍体型(表8)。作为与毛发形状易感性SNP标记的SNP：rs576697连锁的SNP位点，认定以下所示的3个新的毛发形状易感性SNP标记。

SNP：rs645390(序列号1所表示的碱基序列中，碱基号1635所表示的单核苷酸多态性)、SNP：rs3767542(同2527所示的单核苷酸多态性)、SNP：rs675508(同3766所示的单核苷酸多态性)。

[表8]

(2)由序列号2表示的碱基序列表示的76,945bp构成的单倍域：此单倍域中存在着10种主要的单倍体型(表9)。作为与毛发形状易感性SNP标记的SNP：rs1495840连锁的SNP位点，认定以下所示的5个新的毛发形状易感性SNP标记。

SNP：rs2271763(序列号2所表示的碱基序列中，碱基号7519所表示的单核苷酸多态性)、SNP：rs10920260(同16901所表示的单核苷酸多态性)、SNP：rs16849387(同30270所表示的单核苷酸多态性)、SNP：rs12127375(同31333所表示的单核苷酸多态性)、SNP：rs10920269(同63008所表示的单核苷酸多态性)。

[表9]

(3)由序列号3表示的碱基序列表示的68,637bp构成的单倍域：此单倍域中存在着7种主要的单倍体型(表10)。作为与毛发形状易感性SNP标记的SNP：rs832114连锁的SNP位点，认定以下所示的1个新的毛发形状易感性SNP标记。

SNP：rs3805(序列号3所表示的碱基序列中，碱基号24524所表示的单核苷酸多态性)。

[表10]

实施例7卷发者、以及直发者的头发发根的基因表达分析

根据实施例1的分类，收集10名卷发者和10名直发者，进行各被检测者的头发发根的毛发形状易感性基因的表达分析。另外，对于从被检测者身上收集的检测体，事前得到了伦理委员会的承认，在此之上，知情同意实施担当者通过书面对对象者说明了研究内容，并得到了书面的同意。

从被检测者的整个头部均匀地拔下每个人约60根头发，仅仅将从发根部的形态判断为处于成长期的头发发根部，回收到装满冰冻的PBS(Invitrogen制造)的浅底盘中。在实体显微镜下用镊子和注射针的刃从发根部尽量除去外毛根鞘和内毛根鞘，分离·调制仅仅发干的发根(发干角化区域)。将发干角化区域放入装有0.5mLRNA提取液ISOGEN(NIPPON GENE CO.，LTD制造)的1.5mL容积的管中，用迷你无绳研磨机(Mini Cordless Grinder)和均质化用研棒充分破碎组织。加入0.5mL的ISOGEN、200μL氯仿，然后用漩涡式搅拌机(vortexmixer)充分搅拌之后，通过小型微量离心分离机离心分离(15000rpm、15分钟)，回收含有RNA的水相约500μL。向回收的溶液中添加50μL的3M醋酸钠和1μL乙醇沉淀核酸载体(ethachinmate)(NIPPON GENECO.，LTD制造)来充分搅拌。进一步，加入1mL的异丙醇搅拌，通过小型微量离心分离机进行离心分离(15000rpm，20分钟)，沉淀出总RNA(total RNA)。舍去上清液之后，加入75％的乙醇，再次通过小型微量离心分离机进行离心分离(15000rpm，10分钟)。舍去上清液，使沉淀风干之后，溶解于20μL的无核酸酶水(Nuclease-free Water)(Invitrogen制造)。使用其一部分，通过吸光度计(GeneQuant：Pharmacia制造、或者NonoDrop：Technologies制造)或者RiboGreenRNA定量试剂盒(RiboGreen RNA Reagent and Kit)(Invitrogen制造)测定RNA浓度。从得到的1μg总RNA中，使用QuantiTect逆转录试剂盒(QuantiTect Reverse Transcription Kit)(QIAGEN制造)，按照附带的规程来合成cDNA，用于由PCR进行的基因表达量的定量。

基因表达量的定量使用Applied Biosystems株式会社(ABI)制造的TaqMan(注册商标)基因表达分析(TaqMan Gene Expression Assays)进行进行。根据附带的规程，混合合成的cDNA、对于检测·定量化基因特异的引物和探针组、以及实时PCR(Real time PCR)试药等(ABI制造)，用Applied Biosystems 7500实时PCR系统(Applied Biosystems7500 Real time PCR System)(ABI制造)来扩增检测·定量化的基因的片段。此时，使用来自已知的标准发干角化区域样品的cDNA同样进行实时PCR来制作标准曲线进行基因表达量的标准化。另外，作为内部标准使用GAPDH基因的同时，还采用认定在样品的发干角化区域中均匀表达的KRT31基因、以及KRT85基因作为内部标准，进行检测·定量的基因表达量的标准化。

作为检测·定量CSRP1基因的表达量的特异的引物和探针组，使用分析序号为Hs00187916_m1的TaqMan基因表达分析(ABI制造)。

作为检测·定量IPO9基因的表达量的特异的引物和探针组，使用分析序号为Hs00949771_m1的TaqMan基因表达分析(ABI制造)。

作为检测·定量NUCKS1基因的表达量的特异的引物和探针组，使用分析序号为Hs00224144_m1的TaqMan基因表达分析(ABI制造)。

卷发群和直发群的头发发根上毛发形状易感性基因的表达量如图8A～C所示。由图8中所示的结果，发现和直发群相比较，在卷发群中的IPO9基因以及NUCKS1基因的表达量降低，而CSRP1基因的表达量增加。因此，判别CSRP1基因、IPO9基因、以及NUCKS1基因是作为评价毛发形状的指标的毛发形状易感性基因，测定在发根部的这些基因的表达量是有意义的。

实施例8调节毛发形状易感性基因的表达量的物质的筛选

在筛选中使用正常人新生儿包皮表皮角化细胞(KK-4009，Kurabo制造)。融解冷冻状态的正常人新生儿包皮表皮角化细胞之后，将细胞以2500个细胞/cm²的密度播种于75cm²烧瓶或者25cm²烧瓶中，在添加了补给物的人角化细胞培养用无血清培养基(DefinedKeratinocyte-SFM、Invitrogen制造)，在37℃、CO₂浓度为5％的条件下培养。在细胞达到分汇合的状态下的时刻进行传代，以2500个细胞/cm²的细胞密度播种于6孔细胞培养板中。在细胞达到分汇合的状态的时候(第0天)将培养基和不含补给物的人角化细胞培养用无血清培养基交换，将第1天的细胞作为筛选用细胞使用。

向上述调制的筛选用细胞的培养基(不含补给物的人角化细胞培养用无血清培养基)中，添加植物提取物至最终浓度达到0.1％、以及1％，在37℃、CO₂浓度为5％的条件下培养细胞24小时。另外，作为对照，添加50％的乙醇(对照例)同样至最终浓度为0.1％、以及1％来培养细胞。

培养结束之后(第2天)，在吸取除去培养基的PBS(Invitrogen制造)中清洗2次细胞之后，在每个孔中添加1mL的ISOGEN(NIPPONGENE CO.，LTD制造)。在用移液管充分溶解混合细胞之后，将溶液回收到1.5mL容量的管中。用和实施例7记载的方法同样的方法提取总RNA，得到通过PCR进行基因表达量的定量所用的cDNA。对毛发形状易感性基因的表达量的定量也通过实施例7中记载的方法进行。

作为调整基因的表达量的物质的判断标准，例如和对照例比较，基因的表达量高10％，优选高30％，更加优选高50％以上的话为显著高，可以选择该被检测物质作为毛发形状易感性基因的表达促进剂。另外，例如与对照例相比，基因的表达量低10％，优选低30％，更加优选低50％以上的话为显著低，可以选择该被检测物质作为毛发形状易感性基因的表达抑制剂。

在上述筛选体系中评价约700种的植物提取物，探索调节毛发形状易感性基因的表达量的物质。其结果，分别发现表11所示的该基因的表达促进剂以及表达抑制剂。

[表11]

调节毛发形状易感性基因的表达量的物质

参考例毛发形状和毛囊的形态之间的关系

一般毛发形状取决于人的种类的不同而有差别，亚洲人种中相对直发比较多，非洲人种中卷缩发(或者卷发)是主流。印欧人种中具有这两者之间的波状发(波浪发)的特性的比例比较高。作为与这样的毛发形状的不同相关联的特征，可以举毛发发根部的毛囊的形态。即，毛囊的形态为弯曲的话，则毛发弯曲；毛囊的形态为直的话，则毛发为直发(Thibaut，S.et al.，Br.J.Dermatol.，152(4)，p.632-638，2005)。

为了更进一步详细调查毛发形状与毛囊的形态的关系，从各人种的人头皮组织来制作毛囊的组织标本，观察毛囊的形态。另外，对于从被检测者身上的检测体的收集，事前得到了伦理委员会的承认，在此之上，知情同意实施担当者通过书面对对象者说明了研究内容，并得到了书面的同意。将采集的毛囊包埋于冷冻组织切片制作用包埋剂Tissue-Tek OCT Compound(Miles制造)冷冻，按照常规制作冷冻标本薄切片之后，施以HE染色，并用显微镜观察。

图9中显示了各人种的毛囊组织像，由图9显示的结果可见直发的亚洲人的毛囊为直的，波浪发的高加索人的毛囊仅发根的最下部弯曲。进一步判别在卷发的美国黑人的情况下，毛囊组织总体为弯曲的。因此，可以确认毛发形状和毛囊的形态有密切的关系。

实施例9由人毛囊器官培养的毛囊形态的评价

作为评价毛发形状、以及毛囊形态的方法，针对人毛囊器官培养的评价方法进行探讨。拿到通过美容整形外科手术切除不要的30～80岁的男女的侧头部或者后头部的头皮组织，用于实验。另外，对于从被检测者身上的检测体的收集，事前得到了伦理委员会的承认，在此之上，知情同意实施担当者通过书面对对象者说明了研究内容，并得到了书面的同意。

将得到的人头皮组织，回收到装满含有1％抗生素·抗真菌剂(nvitrogen制造)的Williams′E培养基(Sigama制造)的浅底盘中。在实体显微镜下用镊子和手术刀或者注射针的刃，在无菌条件下分离出每根毛囊。分离毛囊是在皮脂腺下部的位置处与表皮组织切断，并尽力除去毛囊下部所附着的多余的结合组织、脂肪细胞等。将调制的分离毛囊转移到添加了含有400μL的10μg/mL胰岛素(Invitrogen制造)、40ng/mL氢化可的松(Sigma制造)、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen制造)、1％抗生素·抗真菌剂(Invitrogen制造)的Williams′E培养基(Sigma制造)的24孔培养板中，每孔中一根，开始培养。培养为浮游培养，在37℃、CO₂浓度为5％的条件下进行。以后，在每隔2～3天进行培养基交换的同时，拍摄毛囊的照片。

随着培养天数的经过的毛囊的形态变化的照片如图10所示。毛囊中的发干在培养经过同时增殖伸长。另外，在培养经过同时，从培养开始1天之后(1day)原来为直的毛囊(直发)在培养天数经过的同时慢慢观察到了毛囊(发干)变弯曲的样子。

为了将毛囊的(发干)的弯曲程度数值化，算出末端间距离率。末端间距离率是表示弯曲的程度的指标之一，通过以下的计算求得(Hrdy，D.，Am.J.Phys.Anthropol.，39(1)，p.7-17，1973)。

对象物(毛发、毛囊)的末端间的直线长/沿对象物(毛发、毛囊)的轴的曲线长

即，根据上述式子，末端间距离率表示0～1之间的值，如果直的话则接近1，如果弯曲程度大的话则接近0。

使用图像分析软件(Nexus NewQube Ver.4.23，IMAX System制造)分析图10所示的毛囊照片，求得毛囊(发干)的长度和末端间距离率(表12)。

其结果，可以确认随着培养天数经过，毛囊(发干)在伸长的同时，也在慢慢变弯曲。因此，表示如果使用这个评价体系，可以探索毛发的卷发化剂、或者卷发改善剂(直发化剂)。即向该人毛囊器官培养评价体系中添加被检测物质而培养，测定伸长到一定长度的毛囊(发干)的末端间距离率。如果与不添加被检测物质而培养的对照例相比较，在添加了被检测物质而培养的情况下末端间距离率变小的话，可以选择该被检测物质作为毛发的卷发化剂，如果与不添加被检测物质而培养的对照例相比较，在添加了被检测物质而培养的情况下末端间距离率变大的话，可以选择该被检测物质作为毛发的卷发改善剂(直发化剂)。

[表12]

在毛囊中，随着培养天数的经过，毛囊(发干)的长度和末端距离率的变化

培养天数(day)	毛囊(发干)的长度(mm)	末端间距离
			1	3.465	1.005
3	4.419	1.002
			6	5.732	0.997
8	6.748	0.988
			10	7.571	0.973
12	8.131	0.958
			14	8.758	0.901
16	9.433	0.825
			18	9.720	0.818

实施例10由毛发形状易感性基因的表达调节剂的人毛囊器官培养得到的评价

以验证毛发形状易感性基因表达调节剂对毛囊形态产生的效果为目的，使用人毛囊器官培养评价体系进行评价。

按照实施例9调制人毛囊。将分离毛囊以大小均匀的方式分为2组，每组12根，将一组用添加了表11中记载的作为IPO9基因以及NUCKS1基因的表达促进剂的石胡荽提取物至最终浓度为0.2％的器官培养用培养基(400μL)进行浮游培养15天。另一组作为对照组用添加了50％EtOH(添加到最终浓度为0.83％)的器官培养用培养基(400μL)进行浮游培养15天。以同样的顺序，制作表11中记载的作为CSRP1基因表达促进剂的白豆蔻提取物(终浓度0.2％)的添加组和对照组(50％EtOH、最终浓度0.83％)(各组n＝12)。

培养开始后，在每隔2～3天交换培养基的同时，拍摄毛囊的照片。从毛囊的照片画像上分别测定毛囊的伸长度和弯曲程度(末端间距离率)。

在毛囊(发干)的长度和培养开始的时候相比伸长达到1.5mm以上的时候，测定毛囊(发干)的末端间距离率。其结果判定石胡荽提取物和白豆蔻提取物添加组与添加50％EtOH的对照组相比，表示毛囊(发干)的弯曲程度的末端间距离率显著增加(图11)。由此，表示可以选择毛发形状易感性基因的表达调节剂作为毛发的卷发改善剂(直发化剂)。

Claims (24)

1.一种毛发形状易感性基因，其中，

所述毛发形状易感性基因是与以下单倍域相重叠的基因，并且是包含该单倍域的碱基序列的一部分或者全部的基因，

其中，所述单倍域是在人1号染色体的1q32.1～1q32.2区域(D1S249～D1S2891)上的、通过对等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)标记进行连锁不平衡分析来确定的、并且由序列号1～3中任意一个所表示的碱基序列构成的单倍域。

2.如权利要求1中所述的毛发形状易感性基因，其中，

所述基因选自CSRP1、NAV1、IPO9、TMEM58以及NUCKS1。

3.一种毛发形状判定标记，其中，

所述毛发形状判定标记是包含以下部分碱基序列的寡核苷酸或者多核苷酸或者它们的互补链，其中，

所述部分碱基序列是权利要求1所述的单倍域的碱基序列中的部分碱基序列，

并且，所述部分碱基序列由连续的碱基序列构成，所述连续的碱基序列含有一个以上的单核苷酸多态性，所述单核苷酸多态性包括等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)、以及与该SNP连锁的SNP。

4.如权利要求3中所述的毛发形状判定标记，其中，

所述SNP是选自以下的碱基中的SNP：

(1)序列号1所表示的碱基序列中，碱基号1(dbSNP数据库ID：rs576697、T或者C)、1635(rs645390、G或者A)、2527(rs3767542、G或者A)、以及3766(rs675508、C或者A)所表示的碱基；

(2)序列号2所表示的碱基序列中，碱基号为7519(rs2271763、G或者A)、16901(rs10920260、T或者G)、30270(rs16849387、A或者G)、31333(rs12127375、C或者G)、50038(rs1495840、T或者A)、以及63008(rs10920269、G或者T)所表示的碱基；以及，

(3)序列号3所表示的碱基序列中，碱基号为24524(rs3805、T或者G)、以及60701(rs823114、G或者A)所表示的碱基。

5.如权利要求3或4中所述的毛发形状判定标记，其中，

所述毛发形状判定标记由10～601个碱基长度的连续碱基序列构成。

6.一种对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定方法，其中，

包括以下工序(a)～(c)：

(a)调制来自被检测者的基因组DNA的工序；

(b)从该基因组DNA中，检测出存在于权利要求1所述的单倍域中的、等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)以及与该SNP连锁的单核苷酸多态性(SNP)的工序；以及

(c)在该检测出的SNP的等位基因频率在卷发者群体中比在非卷发者群体中在统计学上显著高的情况下，判定为该被检测者具有卷发的遗传素质；在该被检测出的SNP的等位基因频率在任意非卷发者群体中比在卷发者群体中在统计学上显著高的情况下，判定为该被检测者不具有卷发的遗传素质的工序。

7.一种对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定方法，其中，

包括以下的工序：

在来自被检测者的基因组DNA中的序列号1～3所表示的碱基序列中的下述表中所示的碱基号的碱基中的任意一个以上中，识别该碱基是碱基(i)还是碱基(ii)，在为碱基(i)的情况下，判定为被检测者具有卷发的素质；在为碱基(ii)的情况下，判定为被检测者不具有卷发的素质的工序。

[表13]

8.一种对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定用试药，其中，

所述判定用试药含有在严格的条件下与权利要求3～5中任一项所述的毛发形状判定标记杂交的探针和/或引物。

9.如权利要求8所述的试药，其中，

所述探针和/或引物与所述标记中含有权利要求4所述的SNP的区域杂交。

10.一种对被检测者的毛发形状的遗传易感性的判定用试剂盒，其中，

所述判定用试剂盒含有权利要求8或9所述的试药。

11.一种筛选毛发形状调节剂的方法，其中，

包括以下工序(a)和(b)：

(a)用被检测物质向含有权利要求1或者2中所述的毛发形状易感性基因的细胞给药的工序；以及

(b)从给药的被检测物质中，选择能够使存在于该毛发形状易感性基因上或者其附近、并且等位基因频率在具有卷发特性的群体和具有非卷发特性的群体之间在统计学上显著不同的单核苷酸多态性(SNP)以及和该SNP连锁的单核苷酸多态性(SNP)标记的碱基的多态性变换为其它多态性的物质作为毛发形状调节剂的工序。

12.一种毛发形状类型的标记，其中，

所述毛发形状类型的标记由多核苷酸或者其部分多核苷酸构成；或者由多肽或者其部分多肽构成，

其中，所述多核苷酸由序列号42、序列号44或者序列号46所表示的碱基序列、与其互补的碱基序列构成，

所述多肽由序列号43、序列号45或者序列号47所表示的氨基酸序列构成。

13.如权利要求12所述的标记，其中，

所述部分多核苷酸为15个碱基以上的多核苷酸。

14.一种用于扩增权利要求12所述标记的引物，其中，

所述引物由多核苷酸的部分多核苷酸构成，

其中，所述多核苷酸由序列号42、序列号44或者序列号46所示的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成。

15.一种用于检测权利要求12所述标记的探针，其中，

所述探针由多核苷酸或者其部分多核苷酸构成，

其中，所述多核苷酸由序列号42、序列号44或者序列号46所示的碱基序列或者与其互补的碱基序列构成。

16.一种用于检测权利要求12所述的标记的抗体，其中，

所述抗体特异性识别由序列号43、序列号45或者序列号47所示的氨基酸序列构成的多肽或者其部分多肽。

17.一种毛发形状类型的检测和/或判定方法，其中，

包括以下工序(a)～(c)：

(a)测定在来自被检测者的样品中权利要求12所述的标记的表达量的工序；

(b)将该(a)的测定结果与非卷发者的测定结果相比较的工序；以及，

(c)基于(b)的结果判断毛发形状类型的工序。

18.如权利要求17所述的方法，其中，

所述来自被检测者的样品是由从被检测者采集的活体样品调制的RNA或者由该RNA转录的互补多核苷酸。

19.如权利要求17所述的方法，其中，

所述工序(a)是使从被检测者采集的活体样品和权利要求16所述的抗体相接触，测定与该抗体结合的该活体样品中的权利要求12所述的标记的量的工序。

20.如权利要求17～19中任一项所述的方法，其中，

从被检测者采集的活体样品为来自上皮组织或者上皮细胞的活体样品。

21.一种毛发形状调节剂的评价或者选择方法，其特征在于，

包括以下(a)～(d)的工序：

(a)使被检测物质与权利要求1所述的毛发形状易感性基因或者由该基因编码的蛋白质可能表达的细胞相接触的工序；

(b)测定被接触的细胞的该基因或者该蛋白质的表达量的工序；

(c)将(b)中测定的表达量与不接触被检测物质的对照细胞的该基因或者该蛋白质的表达量进行比较的工序；

(d)基于(c)的结果，选择使该基因或者该蛋白质的表达量减少或者增多的被检测物质作为毛发形状调节剂的工序。

22.一种毛发形状调节剂的评价或者选择方法，其特征在于，

包括以下的(a)～(c)的工序：

(a)向权利要求1所述的毛发形状易感性基因可能表达的细胞中，导入该毛发形状易感性基因的表达控制区域和报告基因的融合基因，并在被检测物质的存在条件下以及不存在条件下培养该细胞的工序；

(b)测定在被检测物质的存在条件下培养的细胞培养物中的报告基因表达产物的表达量，并将该量与在被检测物质的不存在条件下培养的细胞培养物中的报告基因表达产物的表达量进行比较的工序；

(c)基于所述(b)的比较结果，选择使报告基因表达产物的表达量增减的被检测物质作为毛发形状调节剂的工序。

23.一种毛发形状调节剂的评价或者选择方法，其特征在于，

包括以下的(a)～(c)的工序：

(a)使被检测物质和含有权利要求1所述的毛发形状易感性基因编码的蛋白质的水溶液、细胞或者由该细胞调制的细胞组分接触的工序；

(b)测定接触了该被检测物质的水溶液、细胞或者细胞组分中的该蛋白质的机能或者活性，并将该机能或者活性与不接触被检测物质的对照水溶液、对照细胞或者对照细胞组分中所述蛋白质的机能或者活性比较的工序；

(c)基于所述(b)的比较结果，选择使该蛋白质的机能或者活性增减的被检测物质作为毛发形状调节剂的工序。

24.一种毛发形状类型的调节方法，其特征在于，

控制人的毛发发根部的权利要求1所述的毛发形状易感性基因的表达。

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