CN102206707A - 通过基于改变liph功能的分子方法获得雷克斯动物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鉴别基本上具有或仅具有绒毛的毛皮动物的体外方法,其中所述方法包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中存在脂肪酶H(LIPH)基因突变的步骤。本发明方法还通过包括检测LIPH基因的表达水平的步骤改善针毛的减少。
Description
技术领域
本发明涉及鉴别并获得仅具有雷克斯(rex)表型皮毛的动物。本发明涉及毛皮动物领域,优选地,本发明涉及具有主要由绒毛组成或仅由绒毛组成的皮毛的动物的鉴别方法。本发明包括基于与毛囊正常功能改变有关的基因突变的分子方法的用途,这种改变干扰毛发生长过程。所述改变被认为有利于兔产业。
背景技术
和人类不同,大多数毛皮动物例如兔在其与特定天生功能有关的皮毛中具有三种不同类型的毛发。由“中心初级毛囊”产生的最长类型形成外面的毛皮,称为“针毛(guard hair)”,由“侧面初级毛囊”产生的中间层称为“芒发(awn hair)”,以及由“次级毛囊”产生的最短“绒毛(down hair)”也称为短毛,其具有非常薄的毛杆。毛囊在由“三组”形成的多组中组织化,其在三组内由中心初级毛囊和具有次级毛囊的两种侧面初级飞羽组成。
从1929年起为人所知的家兔(Oryctolagus cuniculus)中的“雷克斯(rex)”表型指的是基本上具有触感惊人的柔软的绒毛(即次级毛囊毛发)的动物。从那以后,表型也在许多其他毛皮动物中发现,例如小鼠(Mus musculus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、家猫(Felis catus)、金仓鼠(Mesocricetus auratus)、土拨鼠(Cavia porcellus)。即使已经在不同基因中鉴定了许多突变,该表型的遗传基础是多种多样的而且了解甚少。
在兔中,皮毛的雷克斯表型的特征在于:
1)显著减少的针毛量和增加的绒毛量,这可以导致针毛完全缺失的极端表型(针毛定义为纤维直径大于30μm且长度最短30mm的纤维)。
2)当剩余针毛存在时它的极大缩短和绒毛的少量缩短,这是由剩余针毛和绒毛两者的长度的轻微差异或无差异引起的,和
3)胡须的卷曲。
这三个标准都用来评估和分类具有或不具有雷克斯皮毛表型的兔。雷克斯皮毛表型的毛皮质量赋予这些动物经济优势并经由专业饲养员挑选。
发明内容
本发明涉及鉴别具有至少95%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括步骤(i):检测由所述毛皮动物获得的生物样品中脂肪酶H(LIPH)基因突变的存在。
在另一个具体的实施方式中,本发明方法在步骤(i)之前还包括步骤(i’):转化所述动物的细胞,用于显示LIPH基因的突变。
本发明还涉及鉴别具有至少98%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中LIPH基因的表达水平的步骤。
本发明还涉及根据本发明和包括步骤(i’)的方法获得的非人类转基因毛皮动物。
本发明进一步涉及特异性抑制LIPH基因表达的化合物用于获得具有至少95%的绒毛的毛皮动物的用途。
附图说明
图1:外显子9中的雷克斯1362delA突变的侧翼序列。和“野生型”(非雷克斯)基因型相比,观察到雷克斯个体的两个等位基因(纯合动物)中的腺嘌呤的缺失。杂合状态显示雷克斯和“野生型”等位基因两者有重叠。
图2:根据回交模型的兔参考家族的结构。“RR”和“Rr”分别指野生型,“rr”指雷克斯型。
图3:雷克斯性状(INRAR)的精细定位。
图4:以下兔种群中的qPCR:雷克斯表型、杂合体和普通型。
具体实施方式
本发明人已确定,在LIPH基因的外显子9中显示移码突变的兔具有绒毛比例增加的雷克斯表型皮毛。
本发明人已显示,突变的LIPH蛋白的表达导致雷克斯表型。因此本发明提供用于鉴别具有至少95%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括步骤(i):检测由所述毛皮动物获得的生物样品中脂肪酶H(LIPH)基因突变的存在。
在本发明的一种实施方式中,该方法还包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中LIPH基因的表达水平的步骤。
如本发明所使用的,术语“绒毛”指的是直径小于30μm,优选小于20μm,且长度最大为25mm,即短于25mm,优选短于20mm的纤维。
如本发明所使用的,术语“毛皮动物”指的是选自绵羊、山羊、欧洲盘羊、骆驼、羊驼和南美骆驼(美洲驼、原驼、小羊驼)、牛、马、海狸、狐狸、貂、麝鼠、海狸鼠、鼬鼠、臭猫和兔的哺乳动物。优选地,所述毛皮动物是兔,最优选地,所述毛皮动物是家兔(Oryctolagus cuniculus)。
优选地,所述毛皮动物具有至少95%的绒毛,更优选至少98%的绒毛,进一步优选100%的绒毛。
优选地,所述毛皮动物具有雷克斯表型。本发明人已经显示在毛皮动物的LIPH基因的两个等位基因上突变的存在与所述动物的雷克斯表型有关。
如本发明所使用的,术语“具有至少95%绒毛的毛皮动物”指的是与所述动物所具有的毛发总量相比,具有至少95%绒毛的毛皮动物。如本发明所使用,术语“生物样品”指的是固体组织,例如,组织活检物;以及指流体或排泄物,例如口腔拭子、痰、诱导痰、血、血清、血浆、尿。生物样品可从任何细胞来源或组织活检中获得。可用的细胞来源的非限定性例子包括但不限于血细胞、口腔细胞、上皮细胞、成纤维细胞、或任何存在于由活检获得的组织中的细胞。细胞也可从体液例如血、血浆、血清或者淋巴中获得。
如本发明所使用的,术语“脂肪酶H(LIPH)”相当于催化2-酰基溶血磷脂酸(LPA)产生的酶,LPA是具有包括血小板凝聚、平滑肌收缩和刺激细胞增殖和运动性的多种生物学性质的脂性介质。所述LIPH基因可由本领域技术人员根据其常识来简单鉴别。通常,LIPH基因可通过扩增来检测,LIPH蛋白可用抗体法检测。
例如,可以例举:
-来自小家鼠的LIPH基因(编码LIPH同工型1的cDNA鉴定为SEQ ID N°3,编码LIPH同工型2的cDNA鉴定为SEQ ID N°5,LIPH同工型1鉴定为SEQ ID N°4,LIPH同工型2鉴定为SEQ ID N°6),和
-来自家兔的LIPH基因(编码LIPH的cDNA鉴定为SEQ ID N°1,蛋白LIPH鉴定为SEQ ID N°2)。
DNA可以利用本领域已知的任何方法提取,例如记载在Sambrook等,1989中的方法。RNA也可以利用本领域技术人员熟知的标准方法,例如硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法,例如从组织活检物中分离。
如本发明所使用的,术语“突变”相当于原始核酸序列的任何序列改变。这些突变包括小规模突变,或大规模突变。小规模突变是那些以一个或几个核苷酸影响基因的突变,包括DNA中一个或多个附加核苷酸的点突变、插入或缺失。点突变可以是错义和无义突变。基因组结构中的大规模突变,例如其作用是排列先前分离的DNA片段的基因复制、缺失或突变,可能组装分离基因以形成功能上截然不同的融合基因。这些最终突变包括染色体易位、中间缺失、染色体倒位和杂合性丧失。
通常,LIPH基因中的突变可通过分析LIPH核酸分子来检测。在本发明的上下文中,LIPH核酸分子包括mRNA、基因组DNA和由mRNA获得的cDNA。DNA或RNA可以是单链或者双链的。优选地,LIPH核酸是基因组DNA,或RNA。LIPH核酸分子例如可用于通过扩增和/或用探针杂交来检测。
如本发明所使用的,检测脂肪酶H基因中存在突变的步骤指的是检测脂肪酶H基因的两个等位基因中存在突变的步骤。因此,本发明涉及鉴别具有至少95%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中脂肪酶H(LIPH)基因的两个等位基因中存在突变的步骤。
本发明的LIPH基因突变可选自插入、缺失和相当于错义突变和无义突变的点突变。优选本发明的LIPH基因的突变是非沉默突变。优选本发明的LIPH基因的突变是缺失。更优选该突变是脂肪酶H基因的外显子9上的缺失。更优选该突变是脂肪酶H基因的外显子9中的1362delA突变。
如本发明所使用的,术语“LIPH基因中的突变”相当于野生型LIPH基因序列即脂肪酶H基因的两个等位基因的改变,使得:
a)其表达导致相应的截短脂肪酶H,或
b)其表达导致和野生型脂肪酶H没有相同功能的相应蛋白质,或
c)LIPH基因不被表达。
用于检测突变存在的典型技术可包括限制性片段长度多态性分析法、杂交技术、DNA测序法、核酸外切酶抗性分析法、微量测序法、利用ddNTP的固相延伸法、利用ddNTP的溶液中延伸法、寡核苷酸连接分析法,用于检测单核苷酸多态性的方法例如动态等位基因-特异性杂交法、连接链反应法、微型测序法、DNA″芯片″法、结合PCR或结合分子信标的使用单或双标记探针的等位基因特异性寡核苷酸杂交法、及其他。
有利地,该突变通过本领域技术人员熟知的PCR和测序法或SNP阵列对LIPH基因的cDNA检测。
在分子生物学中,SNP阵列是一种用于检测种群内多态性的DNA微阵列类型。SNP阵列的基本原理和DNA微阵列相同。这些是DNA杂交原理、荧光显微镜检查原理和固体表面DNA捕获原理的集合。SNP阵列的这三个必要组成是:i)含有固定的核酸序列或靶标的阵列;ii)一种或多种标记的等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针;和iii)记录并解释杂交信号的检测系统(参见Sheils,O.,Finn,S.和O′Leary J.(2003)“Nucleic acid microarray:an overview”,Current Diagnostic Pathology.p:155-158页)。
如本发明所使用的,“LIPH基因的非沉默突变”相当于导致与野生型LIPH多肽具有至少一个氨基酸差异且具有不同的功能和/或构象的多肽的突变。因此,LIPH基因的所述突变可以在蛋白质水平检测。
所述突变可以根据本领域已知的任何适当方法检测。特别是,从受试者获得的样品例如组织活检物可以和突变型LIPH特异性抗体接触,该抗体即,能够区分LIPH的突变型和野生型蛋白质(或任何其他蛋白质)以确定LIPH中突变的存在或不存在的抗体。
本发明还涉及鉴别具有至少98%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中LIPH基因的表达水平的步骤。本发明人已经举例证明了在具有雷克斯表型的动物组中,存在LIPH基因的差异表达。因此,他们已经表明,尽管LIPH基因中突变的存在必然和雷克斯表型有关,但雷克斯表型兔组中的针毛的数量可能变化。事实上这在具有雷克斯表型的兔子的非常具体的种中显示,其被称为
而且,本发明人已经显示,LIPH的表达水平在普通兔中比在具有雷克斯表型的兔中重要三倍。
因此,LIPH基因的表达水平提供了关于所测试动物的表型和针毛和绒毛数量的决定性信息,并允许鉴别具有更多量绒毛的毛皮动物。因此所述方法非常适于在雷克斯表型动物中鉴别具有更多量绒毛的动物。
如本文所使用的,术语“LIPH基因的表达水平”指的是转录产物例如mRNA的量或浓度,或翻译产物例如蛋白质或多肽的量或浓度。
通常,mRNA表达水平可以用诸如每个细胞中的转录物或每微克组织中的毫微克这样的单位来表示。多肽水平例如可以用每微克组织中的毫微克或每毫升培养基中的毫微克来表示。或者,可以使用相对单位描述表达水平。优选地,所述检测LIPH基因的表达水平的步骤是检测LIPH mRNA的表达水平的步骤。
如本发明所使用的,术语“mRNA”指的是由不含内含子的DNA序列的RNA聚合酶催化的转录产生的成熟产物,其可被细胞翻译为多肽。
如本发明所使用的,表述“检测LIPH基因的表达水平”包括检测转录产物(优选由所述基因的转录获得的mRNA)的量的步骤,和/或检测翻译产物(优选由所述基因翻译获得的蛋白质)的量的步骤。优选地,检测基因表达的步骤指的是检测由所述基因的转录获得的mRNA的数量的步骤。通常,所述检测所述基因的表达水平的步骤通过任何传统技术例如qPCR或DNA微阵列技术进行。
优选地,本发明方法还包括将LIPH基因表达图谱与阈值比较的步骤。将LIPH基因的表达水平与阈值比较的所述步骤对于鉴别在LIPH基因中存在突变的动物是有用的。
因此本发明方法适于:
-基于LIPH基因上突变的存在,鉴别具有雷克斯表型的动物;和
-基于LIPH基因的表达水平,鉴别带有较少针毛的动物。
具有雷克斯表型的动物的特征在于至少95%的绒毛。因此,本发明提供在具有雷克斯表型的动物中尽可能筛选具有最少针毛的动物的方法。基于检测LIPH基因的表达水平,这种方法事实上允许鉴别具有至少98%绒毛的毛皮动物。
通常,“阈值”可通过实验、经验或理论确定。通常,所述阈值相当于由普通动物或杂合体动物即在LIPH基因的两个等位基因上不存在突变的动物获得的LIPH基因的表达水平。所述阈值也可以通过对不同种群兔子(普通、杂合体和雷克斯)进行统计分析而获得。本领域技术人员了解用来确定所述阈值的统计技术。与所述阈值的比较非常适于鉴别具有雷克斯表型的动物。
在一个具体实施方式中,本发明涉及获得具有至少95%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括转化所述动物的细胞的步骤,用于在LIPH基因的两个等位基因上显示突变或用于表达截短LIPH蛋白。
优选地,所述细胞转化步骤是诱变步骤。优选地,所述突变发生在LIPH基因的两个等位基因中而且是LIPH基因的外显子9中的1362delA。所述方法适合于获得在LIPH基因的两个等位基因中显示突变,即显示雷克斯表型的动物。
“显示突变”指的是“具有突变”。通常,用于显示突变的细胞的转化通过传统和众所周知的技术例如定点诱变进行操作。
在一个具体的实施方式中,本发明涉及具有至少95%绒毛的毛皮动物的鉴别方法,其中所述方法包括步骤(i):检测由所述毛皮动物获得的生物样品中编码具有序列SEQ ID N°2的多肽的LIPH基因的各等位基因上突变的存在。
本发明还提供用于鉴别具有至少95%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括步骤:
(i)检测所述毛皮动物的生物样品中脂肪酶H(LIPH)基因的两个等位基因上突变的存在,和/或
(ii)检测所述毛皮动物的生物样品中LIPH蛋白上突变的存在。
优选地,步骤(ii)是检测所述毛皮动物的生物样品中截短LIPH蛋白的存在的步骤。
在另一个具体的实施方式中,本发明方法在步骤(i)之前还包括步骤(i’):转化所述动物的细胞,用于在LIPH基因的两个等位基因上显示突变或表达截短LIPH蛋白。
因此,本发明涉及鉴别具有至少95%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括以下步骤:
-转化所述动物的细胞,用于在LIPH基因的两个等位基因中显示突变,或用于表达截短LIPH蛋白;和
-检测所述毛皮动物的生物样品中脂肪酶H(LIPH)基因的两个等位基因存在突变,和/或检测所述毛皮动物的生物样品中存在LIPH蛋白突变。
通常,所述方法还可以包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中的LIPH基因的表达水平,优选LIPH基因的转录产物的表达水平的步骤。
本发明还涉及由本发明的包括步骤(i’)的方法获得的非人类转基因毛皮动物。
优选所述动物是兔。更优选所述动物是家兔。
优选地,检测LIPH蛋白上突变的存在通过抗体进行。因此特异性地识别突变LIPH的抗体也是本发明的一部分。该抗体对于突变LIPH是特异性的,即它们不与野生型LIPH交叉反应。本发明的抗体可以是单克隆或多克隆抗体、单链或双链,嵌合抗体、人源化抗体、或免疫球蛋白分子的部分,包括本领域已知作为抗原结合片段Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)的那些部分。它们也可以例如与毒素或标记抗体免疫结合。所述抗体可用标签标记,以便本领域技术人员能够鉴定突变的LIPH。进行这样的鉴定属于本领域技术人员的能力范围。尽管可以使用多克隆抗体,但优选单克隆抗体,因为它们从长远来看更可重复。产生“多克隆抗体”的方法也是熟知的。多克隆抗体可以由针对适当的抗原进行免疫的动物的血清获得,所述抗体可由遗传工程,例如按照本领域技术人员熟知的标准方法制备。通常,这种抗体可如下产生:将突变LIPH皮下给药予新西兰白兔,所述新西兰白兔预先采血以获得免疫前血清。该抗原可以在六个不同部位以每个部位100μl总体积注射。每个注射的材料可以包含佐剂,含有或者不含SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后磨碎的含蛋白质或多肽的丙烯酰胺凝胶。第一次注射后两个星期,使兔采血,然后每六周三次用相同抗原定期加强。每次加强后的10天收集血清样品。然后利用捕获该抗体的相应抗原通过亲和色谱法从血清中回收多克隆抗体。产生多克隆抗体的该方法及其它方法由Harlow等人(1988)描述,该文献以引用方式合并于此。
各种语法形式的“单克隆抗体”是指仅包含一种能够与特定表位起免疫反应的抗体结合位点的抗体分子群。因此单克隆抗体通常对和它起免疫反应的任一表位显示单一的结合亲和力。因此单克隆抗体可以包含具有许多抗体结合位点的抗体分子,每一个对不同的表位具有免疫特异性,例如双特异性单克隆抗体。虽然历史上单克隆抗体是通过分泌免疫球蛋白的无性系纯细胞系的无限增殖化来制备,但单克隆纯抗体分子群也可以通过本发明方法制备。
制备单克隆抗体的实验室方法是本领域所熟知的(例如参见Harlow等人,1988)。单克隆抗体(mAbs)可以通过将哺乳动物,例如小鼠、大鼠、人等哺乳动物用纯化的突变TXAS免疫来制备。分离被免疫的哺乳动物中的抗体产生细胞,并与骨髓瘤或异源骨髓瘤细胞融合来制备杂合细胞(杂交瘤)。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞用作所期望的单克隆抗体的来源。杂交瘤培养的标准方法记载在Kohler和Milstein(1975)中。
虽然mAbs可通过杂交瘤培养来制备,但本发明不限于此。也可预期通过表达克隆自本发明杂交瘤的核酸制备的mAbs的用途。也就是说,表达由本发明杂交瘤分泌的分子的核酸可以转移到另一个细胞系中以制备转化体。转化体在遗传型上和原始杂交瘤不同,但也能产生本发明抗体分子,包括整体抗体分子的免疫活性片段,相当于由杂交瘤分泌的那些。例如参见Reading的美国专利No.4,642,334;PCT公布说明书No.;Winter等人的欧洲专利公布说明书No.0239400和Cabilly等人的No.0125023。
也可预期不涉及免疫的抗体生成技术,例如利用检查天然库(得自非免疫动物)的噬菌体展示技术;参见Barbas等人(1992)和Waterhouse等人(1993)。
抗突变LIPH的抗体可以与野生型LIPH交叉反应。因此需要选择突变LIPH的特异性抗体。这可通过从抗体池中排除那些与野生型LIPH反应的抗体,例如通过使产生的抗体进行针对野生型LIPH的亲和色谱来实现。
本发明还涉及抑制LIPH基因表达的化合物用于获得具有至少95%绒毛的毛皮动物的用途。通常,所述LIPH基因表达抑制剂是下调LIPH表达的试剂。通常,下调LIPH基因表达的试剂含有干扰LIPH基因表达的核酸。这种化合物可以是反义分子或含有所述反义分子的载体。
反义分子是mRNA小片段的互补链。用于设计有效反义分子的方法是众所周知的(例如参见US6165990),设计能够下调LIPH基因表达的反义分子属于本领域技术人员的能力范围。其他例子是RNA干扰(RNAi)分子,例如,短干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。RNAi是指引入同源双链RNA以特异性针对基因的产物,在目前的情况下是LIPH mRNA,导致无效的或亚效等位基因表型。用于设计有效RNAi分子的方法是众所周知的(参见Hannon和Rossi Nature的评论.2004年9月16日;431(70006):371-8),设计能够下调LIPH基因表达的RNAi分子属于本领域技术人员的能力范围。
在本发明进一步的实施方式中,LIPH基因表达的抑制剂是抗LIPH的抗体或其抑制LIPH生物活性的片段或衍生物。本领域技术人员知道用于制备这样的特异性抗体的标准方法。例如,特异性抗体或其生物活性片段或衍生物可通过用LIPH或LIPH片段免疫动物例如KO LIPH小鼠并通过选择与LIPH结合的抗体来产生。本领域技术人员了解用于制备多克隆和单克隆抗体和其生物活性片段及衍生物的标准方法。其生物活性片段或衍生物是指其能够结合与抗体相同的表位,在目前的情况下,LIPH的表位。保留表位-结合能力和特异性的抗体片段,特别是Fab片段及其他片段也是众所周知的,例如是嵌合抗体,和“人源化”抗体,其中抗体的结构(非决定抗原特异性)区域由另一物种的类似或相似区域代替。因此在小鼠中产生的抗体可以“人源化”以减少当给药于人类受试者时可能发生的副作用。因此本发明包括LIPH特异性抗体的用途,所述抗体包括F(ab′)2、F(ab)2、Fab、Fv和Fd抗体片段、嵌合抗体,其中一个或多个区域已经被同源的人或非人部分替代。本领域技术人员还了解生物活性抗体衍生物例如ScFv片段和二价ScFv-型分子可以利用重组方法制备。
优选地,所述LIPH基因表达的抑制剂是寡核苷酸,选自反义DNA和RNA分子、核酶、siRNA和适配子。
更优选地,所述基因LIPH的基因表达抑制剂是具有与SEQ ID N°1互补序列的siRNA或其片段。任何具有siRNA特征的序列可用于设计优选在基因的3′UTR区域的合适序列。
以下通过参照氨基酸序列、核酸序列和实施例对本发明进行更详细的描述。然而,所述实施例的细节不应视为对本发明的限制。相反,本发明适合于任何包含未在这些实施例中明确提到的细节、但本领域技术人员可以不经过创造性劳动得到的实施方式。
实施例1:鉴别具有LIPH基因突变的动物
本发明人分离了具有雷克斯表型的兔家系。选择定位克隆方法来定位雷克斯性状。用一组有限的微随体进行第一基因组扫描。因此以40厘摩(cM)间隔将雷克斯性状定位在兔染色体14上。在该区域中鉴定其他172个微随体标记物,其中68个在兔家系组上进行基因型分型,用于精细定位。雷克斯性状最后定位在0.5cM间隔内,LOD(奇数对数)得分为78(图3)。在最后的700kb间隔中,LIPH基因被鉴定为候选基因,因为文献中存在该基因的敲除小鼠,该基因导致毛发生长缺陷。通过对雷克斯和非雷克斯兔中LIPH基因的完全编码区测序,已经鉴别了在雷克斯兔中以纯合状态位于外显子9中的1个核苷酸的缺失(图1)。
1、兔家族
a.交配计划
基于回交模型,三个兔INRA系用于构建三代家系(图2)。进行两次杂交来产生F1代:i)8个INRA 2066野生型(RR)雄性和22个雷克斯雌性(rr)杂交,和ii)3个雷克斯雄性(rr)和12个雷克斯雌性(rr)杂交。然后使来自i)杂交的53个F1雌性(Rr)与来自ii)杂交的29个F1雄性(rr)交配,这产生853个G2兔,理论上是50%的纯合雷克斯类型(rr)和50%的显示野生表型的杂合体(Rr)。
b.确定兔关于雷克斯性状的表型
通过分析一股毛发来确认兔皮毛质地的表型。测量皮毛的最长和最短长度和毛的平均直径。根据OFDA方法(Rafat等人,2007),进一步分析99个G2兔的亚组(表1)的平均纤维直径和粗纤维含量(直径>30μm)。
表1:正常和雷克斯皮毛兔的平均纤维直径和粗纤维含量的OFDA测量
c.确定基因型
用Jeanpierre(1987)描述的方法,通过心脏穿刺采集8ml血样至乙二胺四乙酸(EDTA)(K3EDTA,Vacutainer B-D;Becton Dickinson,Rutherford,NJ,USA)上,从中回收外周血单核细胞,再从该细胞中提取DNA。Schuelke(2000)描述的低成本技术用于确定微随体的基因型。用三种引物进行聚合酶链式反应(PCR),包括待被扩增和用17个核苷酸的通用序列(5’-GACCGGCAGCAAAATTG-3’,确认为SEQ ID N°7)延伸的基因座的特异性引物,该基因座的特异性反向引物和由6-Fam、Hex或Tet(MWGAGBiotech,Ebersberg,Germany)5′-标记的17个核苷酸的通用引物。1.用Genetic Profiler v1.1软件(ABIPrism377A测序仪;Applied Biosystems,FosterCity,CA,USA)或Genotyper软件(MegaBACE1000 sequencer;AmershamBiosciences,New Haven,CT,USA)分析结果。使用内部程序(A.Neau,个人通信)检查基因型定型数据,该程序按照谱系分析各标记物的等位基因分布的一致性。
2、雷克斯基因的第一定位
通过针对兔遗传图谱(Chantry等,2005)的98个微随体标记物确定187个G2兔的基因型来完成基因组扫描。
用CRI-MAP 2.4软件(Green等.1990)构建遗传图谱。第一步使用两点选项通过两点分析鉴定连锁的标记物。在第二步中,使用建立和flipsn选项通过多点分折检测连锁群。连锁数据和细胞遗传学图谱数据合并以确定标记物的顺序或鉴定分离的或弱信息标记物的连锁。这些各种各样的分析用LOD值为3(在少数情况下低于1.8,其中标记物的细胞遗传位置可以确认连锁)来进行。通过累加所有连锁群的遗传距离,在各群两端加上15cM,并包括各未连锁标记物两侧的15cM来计算遗传图谱的大小。
3、雷克斯基因的精细定位
a.微随体标记物的表征
通过筛选BAC(DNA的大片段)和通过计算机(in silico)技术产生定位在第一定位间隔的其他微随体标记物。
称为“LBAB”的BAC兔库构建在Jouy-en-Josas(Rogel-Gaillard等人,2001)的INRA的放射生物学和基因组研究实验室(LREG)。该库由提取自雄性新西兰兔的淋巴细胞的基因组DNA构建并包括平均插入尺寸为110kb的84,480个克隆(载体pBeloBAC 11),这相当于3个基因组等价物(3X)。相当于兔中初级定位间隔的人区域基因通过比较作图列出。用于这些兔基因的表达序列标签(EST)得自http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/iccare/。用于这些EST的引物使用软件Primer3(Rozen和Skaletsky,2000)确定,并用来筛选兔BAC库LBAB。BAC库的筛选采用2个步骤进行,来自超级池的最初一组47个PCR和属于步骤1中选定的超级池的24个平板上的第二组44介PCR DNA。用20-40ng DNA混合物、2mM MgCl2、1X缓冲液、0.25mM dNTP、1pmol的各引物以及1U的酶Taq聚合酶Goflexi,以最终容积为10μl进行PCR。PCR条件如下:在95℃下5min,然后在95℃下变性30秒,在55℃下杂交30秒,以及在72℃下延伸30秒,循环35次,然后在72℃下最后延伸5min。PCR产物通过在琼脂糖凝胶上电泳来进行分析。然后PCR条件通过改变杂交温度和/或循环次数来进行优化。包含于各选定BAC中的预期EST的身份通过测序来证实。亚克隆通过用其特异性引物的PCR法扩增。然后,利用柱(Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System,Promega)纯化扩增子。根据以下方法利用Big Dye Terminator试剂盒(Perkin Elmer)进行测序反应。1到3ng的纯化DNA与10pmol的用于扩增EST片段的正向引物混合,再混合4μl的Big Dye Terminator得到12μl的最终反应体积。然后DNA通过PCR法扩增。在94℃下进行1min的变性,然后进行包括在94℃下变性10秒、在50℃下杂交5秒和在60℃下引物延伸4min的35次循环。用软件BioEdit(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htmL)读色谱图,并利用BLASTN程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)(Altschul等人1990)与存在于数据库中的序列进行比较。对于已知为人或其他物种的基因序列,参数“e值”低于10-5的值被认为对于证实分离的兔BAC克隆的身份是可接受的。
用Sau3A消化来自BAC池的DNA。消化的DNA通过1%低熔点琼脂糖(ICN)凝胶电泳,并选择700到1200碱基对(bp)范围的片段。将含有选定大小DNA片段的琼脂糖凝胶切下,并在65℃下熔化15min,然后在1.5单位GELase(Epicentre)/100mg琼脂糖凝胶的存在下在42℃孵育1h。用苯酚/氯仿提取DNA,在80℃下用0.3M乙酸钠(pH 5.2)和20μg糖原作为DNA载体乙醇沉淀15min,用70%乙醇冲洗DNA沉淀。使用定量DNA分子量标记物(Marker XIV,Roche Diagnostics GmbH),通过经1%琼脂糖凝胶的迁移电泳评估DNA浓度。消化的DNA片段连接到预先由BamH1线性化并脱磷酸化的载体pGEM-4Z。连接在含有100ng消化的DNA、100ng载体和200单位的T4 DNA连接酶以及相关的1缓冲液(Biolabs)的20μl总体积中在8℃进行16h。连接样品在65℃孵育10min以抑制连接酶活性,并通过13mm直径的0.025μM多微孔膜(VSWP,Millipore)对超纯水透析2h。利用电穿孔机Easyject Plus(Eurogentec)在以下参数下将连接产物电穿孔至DH10B大肠杆菌株(Invitrogen):2500V、25μF、201W、5ms。在存在用于重组克隆的蓝-白颜色选择的X-Gal(20μg/ml)和IPTG(200μg/ml)的情况下,将连接产物涂布在补充有100μg/ml的氨苄青霉素的LB-琼脂上。由于LBAB BAC库的平均插入大小是110kb(Rogel-Gaillard等人,2001),20个BAC DNA池涂布约5000个白色克隆。这个数字相当于用含有1kb插入的质粒亚库双倍覆盖每个BAC并含有10%细菌DNA污染,如在用简单的碱裂解方法提取得到的BAC DNA样品中频繁观察到的。基因组库有超过12000个克隆被涂布。克隆转移到Hybond+尼龙膜(Amersham Pharmacia Biotec),并进一步处理用于细菌裂解、DNA变性和中和(Sambrook等人,1989)。用UV照射5min将DNA固定在膜上。膜与用3’DIG标记试剂盒(Boehringer Mannheim)标记的寡核苷酸(TC)12和(TG)12探针杂交。在制造商(Boehringer Mannheim)建议的条件下利用核酸的DIG发光检测试剂盒进行杂交。在相同的杂交条件下进行阳性克隆的二次筛选。
首先用直接通用引物(5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′,识别为SEQ ID N°8)在一条链上对所有阳性克隆测序,再用反向通用引物(5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′,识别为SEQ ID N°9)在第二条链上对它们中的一些测序。用Big Dye Terminator试剂盒(Applied Biosystems)进行DNA测序反应,并在自动测序仪ABI Prism 377A(Applied Biosystems)上进行电泳。去除载体和质量差的序列。微随体引物用Primer3程序(Rozen和Skaletsky2000)地串联重复的侧翼序列中设计。
也使用基于比较作图的计算机(in silico)技术。可用的兔序列(存在于Ensembl(05/06/07)的777 141序列,包括踪迹、EST、序列重叠群、支架及不位于基因组上)通过BLAST与用于初级位点的170Mb-190Mb间隔的染色体3(染色体14q17)的人掩蔽序列比较。仅保留具有重要的BLAST得分、规定“e”值大于或等于10-40的序列。用TandemRepeatFinder(Benson,1999)进行这些序列的微随体识别。最后,扩增微随体组的引物通过利用Primer3(Rozen和Skaletsky,2000)设计。选择三种扩增大小以允许多路技术:100±20bp、150±20bp和200±20bp。我们选择至少重复18次的连续微随体序列以提高检测多态性的可能性。
b.作图
CRI-MAP软件版本2.4(Green等人,1990)用于构建区域图。其允许通过最大相似法构建连锁群。我们使用MultiMap来产生图并通过n个相邻基因座的改变来计算由参考初始顺序获得的顺序可能性。
c.连锁分析
考虑到家族结构、个体数目和标记物数目,我们基于Z评分法用Simwalk2版本2.91(Sobel等人,2001)来进行连锁分析。已经进行采取具有完全外显的隐性模型的参数检验和分别具有选项“参数连锁”分析和“非参数连锁”(NPL)分析的非参数检验。
单体型分析还用Simwalk2的版本2.91进行,其结果利用Haplopainter的版本27β(Thiele,2006)和Gostscript8.54分析。
4、雷克斯基因的表征
对雷克斯和野生型兔进行基因的外显子PCR扩增。用30ng的gDNA、1.5mM的MgCl2、0.5mM的dNTP、1μM的各引物和1.5单位的FlexiDNA聚合酶进行PCR扩增。循环条件包括在94℃初始孵育5min,然后进行包括在94℃下30s、在56-62℃范围退火30s和在72℃下30s的35个循环。PCR产物直接测序,并通过比较基因组和cDNA序列建立外显子-内含子分界。所用的引物列于表2中。
用CAP3装配程序(Huang和Madan,1999)利用缺省参数在相邻序列群中装配序列。
用“multalign”(Corpet,1988)比较2个雷克斯和2个野生型兔的LIPH序列,用NovoSNP软件(Weckx等人,2005)进行SNP检测。
5、关联研究
用引物Ex_9F/Ex_9R通过缺失的直接测序来确定一组60个野生型兔和60个雷克斯兔的基因型。
表2:用于克隆雷克斯基因的引物
结论
这种突变导致引起预期截短蛋白的移码和提前终止密码子。研究了60个雷克斯兔和60个近交系兔中的1362delA等位基因的分布。所有的60个雷克斯兔测试为1362delA阳性,而所有的60个非雷克斯兔测定为阴性,如图2所示。
实施例2:在具有LIPH基因突变的动物种群内鉴别LIPH基因的差异表达。
基于其表型,兔可以具有各种不同的毛囊组。
如之前提到的,本发明人已证实普通兔和显示存在LIPH基因突变的兔子不具有相同种类的毛发。事实上,具有LIPH基因突变的兔子呈现雷克斯表型并基本上具有绒毛。
因此可以基于针毛的数量在种群内鉴别两种不同的亚群:
因此本发明人假设,尽管那些兔子显示雷克斯表型,该雷克斯表型兔种群内的LIPH mRNA的表达水平可以改变。
为了检验这种假设,他们进行了用于测定以下种群兔子中LIPH mRNA的表达水平的传统qPCR:
-LIPH基因突变的杂合兔,因此这些兔子仅在LIPH基因的一个等位基因上存在突变;和
-普通兔,其不存在LIPH基因突变。
结论
本发明人已显示,发现LIPH mRNA的表达水平适用于:
-在雷克斯表型内鉴别具有较少针毛的动物。
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Claims (15)
1.用于鉴别具有至少95%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中存在脂肪酶H(LIPH)基因突变的步骤。
2.权利要求1的方法,其中所述毛皮动物是选自羊、山羊、欧洲盘羊、骆驼、羊驼、美洲驼、原驼、小羊驼、母牛、马、海狸、狗、猫、狐狸、貂、麝鼠、海狸鼠、鼬鼠、臭猫和兔的哺乳动物。
3.权利要求1的方法,其中所述毛皮动物是兔,优选家兔。
4.权利要求1至3中任一所述的方法,其中所述脂肪酶H基因突变选自插入、缺失和相当于错义突变和无义突变的点突变。
5.权利要求1至4中任一所述的方法,其中所述脂肪酶H基因突变是非沉默突变。
6.权利要求1至5任一所述的方法,其中所述脂肪酶H基因突变是脂肪酶H基因的外显子9的缺失。
7.权利要求1至6任一所述的方法,其中所述脂肪酶H基因突变是脂肪酶H基因的外显子9中的1362delA。
8.权利要求1至7任一所述的方法,其中检测脂肪酶H基因中存在突变的步骤是对所述毛皮动物的脂肪酶H基因的各等位基因实现的。
9.权利要求1至8任一所述的方法,其中所述方法还包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中LIPH基因的表达水平的步骤。
10.鉴别具有至少98%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中LIPH基因的表达水平的步骤。
11.权利要求10的方法,其中检测LIPH基因的表达水平的步骤是检测LIPH mRNA的表达水平的步骤。
12.鉴别具有至少95%绒毛的毛皮动物的方法,其中所述方法包括以下步骤:
-转化所述动物的细胞,用于在LIPH基因的两个等位基因中显示突变或用于表达截短LIPH蛋白;和
-检测由所述毛皮动物获得的生物样品中脂肪酶H(LIPH)基因的两个等位基因存在突变,和/或检测由所述毛皮动物获得的生物样品中存在LIPH蛋白突变。
13.权利要求12的方法,其中所述方法还包括检测由所述毛皮动物获得的生物样品中LIPH基因的表达水平的步骤。
14.一种特异性地抑制脂肪酶H基因表达的化合物用于获得具有至少95%绒毛的毛皮动物的用途。
15.权利要求14的用途,其中所述化合物是寡核苷酸,选自反义DNA和RNA分子、核酶、siRNA和适配子。
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DIRIBARNE M ET AL: "Cartographie fine du caractère rex chez le lapin (Oryctolagus Cuniculus)", 《13ÈMES JOURNÉES DE LA RECHERCHE CUNICOLE.》 * |
DIRIBARNE M ET AL: "Cartographie fine du caractère rex chez le lapin (Oryctolagus Cuniculus)", 《13èMES JOURNéES DE LA RECHERCHE CUNICOLE.》, 18 November 2009 (2009-11-18), pages 1 - 4 * |
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