KR101438524B1

KR101438524B1 - 돼지 ｍｙｆ５ 유전자의 snp를 이용한 육질향상 확인용 dna 표지인자

Info

Publication number: KR101438524B1
Application number: KR1020120116973A
Authority: KR
Inventors: 홍기창; 김준모; 이은아; 임규상
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2012-10-19
Filing date: 2012-10-19
Publication date: 2014-09-12
Also published as: KR20140050493A

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열에서, 474번째 C 염기 포함하는 15 내지 800개의 연속서열로 구성되는 돼지의 육질 향상 확인용 DNA 표지인자 및 이를 이용한 돼지의 육질 향상 확인용 SNP 분석용 키트에 관한 것이다. 상기한 본 발명에 의하면, 돼지 근섬유타입 IIb 조성 및 pH45min, 유리육즙량(Drip loss) 등 육질 향상 여부를 DNA 수준에서 확인할 수 있어, 육질이 향상된 개체를 조기에 선발하여 육종 및 생산함으로써 품질이 향상된 고급육의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

돼지 ＭＹＦ５ 유전자의 SNP를 이용한 육질향상 확인용 DNA 표지인자{DNA marker for detecting increase of porcine meat quality using a SNP in porcine MYF5 gene}

본 발명은 돼지의 육질향상 확인용 DNA 표지인자에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 돼지 MYF5 유전자의 SNP를 이용하여 육질이 향상된 개체를 조기에 선발할 수 있는 돼지의 육질향상 확인용 DNA 표지인자 및 이를 이용한 SNP 분석용 키트에 관한 것이다.

오랜 기간 돼지육종은 사료효율과 성장률을 증가시키는 방향으로 이루어져 왔으며, 등지방을 비롯한 지방량을 줄이고 적육비율을 높인 살코기형 돈육생산 방향으로 진행되어 왔다 (Brocks 등, 2000). 현재 적육생산 효율면에서 상당한 발전을 가져왔으나 이는 주로 근세포의 크기 성장에 의한 결과로 해석되고 있으며 (Rehfeldt 등, 2000), 이러한 결과로 스트레스에 민감한 돼지가 발생하고 이상돈육 발생이 증가하는 등 육질의 저하를 가져오게 되었다 (Cameron, 1990). 따라서, 기존의 적육생산능력과 함께 육질을 향상시키기 위한 개량체계의 마련은 시급하다.

골격근의 성장과 발달을 이해하는 것은 육용가축의 적육생산량과 육질적 측면에서 매우 중요한 의미를 지니고 있다 (Karlsson 등, 1993). 근육은 근섬유로 이루어져 있으며 근육생산량은 근섬유의 수와 크기에 의해 결정되는데, 출생 전 결정되는 근섬유의 수와 출생 후 근섬유 크기 성장을 통해 적육생산량이 증가하게 된다 (Rehfeldt and Fiedler, 1984). 그러나 육질의 경우는, 근섬유 수와 크기보다는 근섬유조성에 의해 크게 영향을 받는다 (Ryu and Kim, 2005).

돼지의 근육내 근섬유는 ATPase 활성을 담당하는 미오신-중쇄(myosin-heavy chain)의 종류에 따라서 크게 세 가지 형태로 구분이 된다 (Brooke and Kaiser, 1970). 근섬유 타입 I(type I)의 경우는 느린-산화작용(slow-oxidative)의 성질을 띠어 사후 대사속도를 지연시켜 함량이 높을 경우 육질에 긍정적인 영향을 미치게 되며, 이와는 반대로 타입 IIb(type IIb)의 경우는 빠른-당분해(fast-glycolytic)의 성질을 갖게 되어 빠른 사후 대사속도로 인해 함량이 많을 경우 돈육질이 육색이 창백하고, 조직이 흐물거리며 육즙이 많이 나오는(pale, soft, exudative; PSE) 이상육으로 판정될 가능성이 커진다 (Klont 등, 1998). 나머지 하나인 타입 IIa(type IIa)는 이들 둘과 중간의 성질인 느린-당분해(slow-glycolytic)의 성질을 갖는다. 이들 세 가지 형태의 근섬유형에 따라서 근섬유조성이 결정되어 지며, 돼지의 등심근(longissimus dorsi)은 대부분 백색근 계열로써 타입 IIb의 비율은 80% 정도를 차지하여, 근육내 근섬유 조성 중 타입 I의 비율을 높여주기 위한 연구가 필요하다고 볼 수 있다.

근섬유조성을 포함하는 근섬유특성은 유전적인 요인에 의해 크게 영향을 받는다. 특히, 돼지의 경우 근세포조성의 유전력이 근섬유형별로 37~58%로서 높고, 육질관련 형질과의 유전상관 관계도 높기 때문에 유전적인 개량을 통해서 각 개체의 근세포조성의 조절이 가능할 것으로 판단되어 진다 (Larzul 등, 1997). DNA 표지인자를 이용한 선발 방법인 MAS(Marker Assisted Selection)는 가축의 육종에 있어서 선발의 정확도를 높이고 개량속도를 증가시켜, 유전적 개량량을 극대화할 수 있는 방법으로써 최근 첨단 분자육종기법으로 각광받고 있다. 근섬유조성의 변이가 대부분 유전적 요인에 의해 발생한다는 점은 MAS를 접목한 개량이 매우 효율적일 수 있음을 시사한다.

그러나, 근세포 특성은 도체의 등심근에서만 측정이 가능한 형질로써, 생체에서의 측정이 불가능하다. 따라서, 이를 위주로 한 선발과 개량을 위해서는 도축을 하지 않고도 개체의 근세포 특성을 예측할 수 있는 방법이 필요하다. 바로 이러한 점에서 DNA 표지인자의 개발이 근본적으로 요구되며, 후보유전자의 개발과 유전자 구조 분석을 통한 유전자원확보가 필수적으로 선행되어야 한다.

포유동물의 근섬유 형성은 배발달과정에서 결정되며 이에 관여하는 유전자로 현재 MyoD gene family가 제안되고 있으며 (te Pas 등, 2000), 주로 동물 중 생쥐에서 이들의 분자기전이 연구되고 있다. 이들은 전사 단계에서 근섬유의 분할을 조절하는 인자로서 이들에 의해 근섬유 분화가 결정되어지는 것으로 알려져 있다. 따라서 이들의 분자기전에 대한 연구는 근섬유의 분화를 조절하여 소비자의 기호에 적합한 돈육을 생산하는데 필수적이라고 하겠다. 돼지에 있어 근육의 성장과 조절 기능의 역할을 하는 이들 유전자군은 MYOD1, myogenin, MYF5, MRF4 등으로 구성되어있으며, 이러한 유전자군은 근육형성과정 중 근원세포의 증식, 분화에 관여하며 일부 유전자는 출생 후에도 지속적으로 발현하여 근육형성을 조절하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 배경 기술로, 대한민국 특허공보 10-0786534(2007.12.17)에는 한우의 일당 증체량에 대한 유전능력을 조기에 예측하고 식별하는 DNA 표지인자를 개발하여 한우의 육종개량 프로그램에 이용하는 것에 대해 기재되어 있고, 대한민국 공개특허공보 10-2009-0065714(2009.06.23.)는 돼지의 생산형질과 높은 연관성이 있는 LEP, GYS1, MYF1 및 MYF5를 이용한 돼지의 조기 선발 진단 기법에 대한 것으로, MYF5의 프로모터 부분에 존재하는 C580T 변이를 확인하기 위해 FokI 제한효소로 절단하여 유전자형을 구분하고 일당 증체량 및 FC에 대하여 연관성 분석을 하였다고 기재되어 있다.

그러나, 현재까지 MYF5의 exon1에 나타난 SNP를 이용하여 돼지 근섬유 조성을 식별하여 돼지의 육질 향상 확인용 DNA 표지인자에 관해서는 알려진 바가 없다.

다양한 DNA 표지인자들이 근섬유를 구성하고 있는 근섬유 구조 단백질의 발현과 분화에 미치는 영향을 분석하여 실용화할 경우 돼지 산육형질에 대한 신속하고 효과적인 육종지표로 이용할 수 있을 것이다. 이러한 연구결과는 가축생산에 있어서 큰 생산효율의 증가를 가져올 수 있을 뿐만 아니라, 보다 합리적인 육종지표를 확립함에 따라서 가축생산비 절감의 효과도 얻을 수 있을 것이다. 나아가 근세포 분화관련 유전자의 다형성을 분석하고 표지인자를 실용화하는 발명은 국내 양돈 산업이 국제 경쟁력이 있는 산업으로 발돋움할 수 있는 계기를 마련해 줄 수 있을 것이다.

대한민국 특허공보 10-0786534(2007.12.17) 대한민국 공개특허공보 10-2009-0065714(2009.06.23.)

본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 주된 목적은, 돼지 근섬유타입 IIb 조성 비율 및 육질 향상과 관련되어 돼지 산육형질에 대한 신속하고 효과적인 육종지표로 활용될 수 있는 MYF5 유전자 exon1에 존재하는 유전적 변이(SNP)를 이용한 DNA 단편 표지인자 및 이를 이용한 SNP 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 육질 향상 관련 DNA 단편 표지인자를 이용한 돼지의 육질 향상 여부를 확인하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열에서, 474번째 C 염기를 포함하는 15 내지 800개의 연속서열로 구성되는 돼지의 육질 향상 확인용 DNA 표지인자를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 12와 서열번호 3으로 표시된 올리고뉴클레오티드로 구성되는, 돼지 MYF5 유전자의 육질 향상 관련 SNP를 탐색하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 서열번호 12 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트, PCR 반응혼합물 및 RFLP 분석용 제한효소인 HhaI을 포함하는 돼지의 육질 향상 확인용 SNP 분석용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 의하면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 돼지의 육질 향상 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

a) 돼지로부터 게노믹 DNA를 분리하는 단계;

b) 상기 a)단계의 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1로 표시된 MYF5 유전자의 474번째 염기를 포함하는 특정부위를 증폭시키는 단계;

c) 상기 b)단계에서 증폭된 DNA를 제한효소 HhaI으로 처리하는 단계; 및

d) 상기 c)단계에서 얻어진 유전자 단편들에서 다형성(RFLP; restriction fragment length polymorphism)을 비교하는 단계.

이하, 본 발명을 첨부된 도면을 참조하면서 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 근세포 분화에 작용하는 유전적인 요인을 찾기 위한 연구를 오랫동안 진행하였고, 그 과정 중에 MYF5 유전자를 분석하였다(도 1a ~ 도 2). 본 발명에서는 그 결과 exon1에서 나타나는 단일염기변이(SNP) 부위를 발견하였다. 이 부위는 GC로 염기가 전환(transversion) 됨으로써, GlyGln으로 아미노산 변화를 가져오게 되어 근세포분화에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 본 발명에서는 또한 이들을 손쉽게 검색할 수 있는 kit를 개발하였으며, 특이적인 프라이머를 제작하여 PCR-RFLP 방법을 이용하는 방식을 적용하였다(도 3).

따라서, 본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열에서 474번째 C염기를 포함하는 15 내지 800개의 연속서열로 구성되는, 돼지의 근육 내 근섬유 타입 IIb 감소 여부 확인 내지 육질 향상 확인이 가능한 DNA 표지인자를 제공한다. 본 발명자들은 서열번호 1로 표시된 MYF5 유전자에서 돼지의 근육 내 근섬유 조성과 관련된 단염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 찾아내고, 이러한 SNP가 돼지 개체로부터 근육 내 근섬유 조성 및 유전자형과의 연관성을 분석하였다. 상기 DNA 표지인자는 유전자의 서열 중 일부로서, 특정부위에서 G 또는 C로 염기가 치환된 SNP(single nucleotide polymorphism) 부위를 포함한다.

상기 SNP는 MYF5 유전자의 엑손 1의 Gly41Gln 변이를 일으키게 되는데, 간단히 설명하면, 전체 cDNA서열상 121번째 염기의 단일염기다형성(G/C)은 Exon 1 내에 존재하며, 전체 아미노산 서열 41번째의 아미노산을 지칭하는 유전암호를 GAC 혹은 CAC로 유발하여 각각 Gly 혹은 Gln으로 서로 다른 아미노산을 지칭하는 변이(Gly41Gln)를 발생시키게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 DNA 단편은 돼지 근섬유 특성과 MYF5 유전자의 새로운 유전적 변이 부위(SNP site)인 474번째 C염기를 포함하는 DNA 표지인자이다. 이 유전적 변이 부위는 GC로 염기가 치환되어 GlyGln으로 아미노산 변화를 가져와 유전자의 발현에 차이를 주게 되어 결과적으로 근섬유 조성 중 타입 IIb의 비율이 감소되어 육질 향상에 영향을 미친다.

상기 DNA 단편의 크기는 전체 유전자의 전장(full length)이 아닌 한 상기 SNP 부위를 포함하는 어떤 단편 크기일 수 있으나, 바람직하게는 15 내지 수백 염기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 15 내지 800 염기일 수 있다. 특히 15 내지 30 염기의 경우는 상기 SNP를 탐지하기 위한 프로브(probe)나 프라이머로 이용될 수 있으며, 상기 프라이머 및 프로브를 사용하여 SNP 부위에 특정한 대립인자를 가진 뉴클레오티드 서열을 증폭하거나 그 존재를 확인할 수 있다. 상기 30 염기 이상의 크기를 갖는 염기의 경우는 본 발명의 실시예에서와 같이, PCR-RFLP 방법으로 탐지하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 도 2과 같이, 상기 SNP 부위를 포함하는 600 bp 크기(서열번호 13)의 DNA 단편을 DNA 표지인자로 이용하였다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 육질의 향상은 pH의 증가 및 유리육즙량(drip loss)의 감소를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 실시예 3에서와 같이, SNP에 따른 유전자형(GG, GC, CC)과 근섬유형질 및 육질의 연관성 분석을 분석하여 GG 유전자형이 근섬유 타입 Ⅱb가 감소된 근섬유 조성을 가지며 이로 인해 향상된 육질을 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 사용된 "PCR-RFLP" 방법은 가축의 유전적 특성이나 능력개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR(Polymerase Chain Reaction) 기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점 돌연변이(point mutation) 부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 DNA의 다형성을 비교하여 각 개체의 바람직한 유전자형을 보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다.

본 발명에서, 돼지의 육질특성은 고기의 질을 pH, 육색, 근내지방도, 지방색, 조직감, 성숙도 등에 따라 등급을 구분하게 되는데, 이 중 특히 pH와 육색은 돼지고기의 육질 특성을 나타내는데 중요한 판별 기준이 된다. 최근 돼지고기의 가격이 급등하고 있기 때문에 육질이 우수한 돼지를 선발하고 육종 및 생산함으로써 품질이 향상된 고급육의 개발이 중요하다. 따라서 본 발명의 DNA 표지인자를 이용하면 근섬유 타입 IIb가 감소된 개체를 조기에 진단하고 선별하여 육질이 향상된 고급육을 손쉽게 선별할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 12와 서열번호 3으로 표시된 올리고뉴클레오티드로 구성되는, 돼지 MYF5 유전자의 육질향상 관련 SNP를 탐색하기 위한 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 실시예에서는 Genebank (accession no. Y17154)에 등록된 유전자 서열에 기초하여 본 발명의 MYF5 유전자에 존재하는 SNP를 탐색할 수 있는 프라이머를 제작하였다. 본 발명의 프라이머는 종래 밝혀지지 않은 SNP를 포함하는 유전자 단편을 증폭하기 위한 것으로, 돼지 MYF5 유전자 서열 중 특정 부위(서열번호 1에서 474번째 염기)에서 SNP를 포함하는 유전자 단편을 제조할 수 있게 해준다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 12 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트, PCR 반응혼합물 및 RFLP 분석용 제한효소인 HhaI을 포함하는 돼지의 육질 향상 확인용 SNP 분석용 키트를 제공한다. 상기 SNP 분석용 키트에 의하면 근육 내 근섬유 타입 Ⅱb 감소 및 육질 향상 여부를 확인할 수 있다. 본 발명의 SNP 분석용 키트는 PCR-RFLP 기법을 이용하는 것으로, MYF5 유전자의 발현 조절 즉, 근섬유 조성에 관여하는 유전자의 다양한 발현을 분석하기 위하여 특정한 제한효소인 HhaI을 포함한다. 이러한 특정 제한효소는 본 발명자들이 근섬유 조성의 변화를 일으키는 SNP를 밝혀내고 이 SNP에 기초하여 선택된 것이다.

본 발명의 실시예에서는 구체적으로, 본 발명의 상기 SNP 부위를 인식할 수 있는 제한효소인 HhaI의 처리에 따라서 다르게 나타나는 밴드 패턴을 파악하여 유전자형을 구분하였다. 예를 들어, 유전자형은 GG, GC, CC로 나타나며, G allele는 346 bp, 93 bp, 83 bp, 78 bp로, C allele는 197 bp, 149 bp, 93 bp, 83 bp, 78bp로 밴드가 나타남을 확인하였다 (도 3 참조).

상기 프라이머를 이용하여 제조된 유전자 단편의 염기서열의 결정은, 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 디데옥시 법에 의하여 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나, SNP 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있다. 혼성화의 정도는 예를 들면, 검출가능한 표지를 표적 DNA에 표지하여, 혼성화된 표적 DNA 만을 특이적으로 검출함으로써 이루어질 수 있으나, 그외 전기적 신호 검출방법 등이 사용될 수 있다.

구체적으로, 대립형질 특이적 프로브 혼성화 방법(allele-specific probe hybridization), 대립형질 특이적 증폭 방법(allele-specific amplification), 서열분석법(sequencing), 5' 뉴클레아제 분해법(5' nuclease digestion), 분자 비콘 어세이법(molecular beacon assay), 올리고뉴클레오티드 결합 어세이법(oligonucleotide ligation assay), 크기 분석법(size analysis), 단일 가닥 배좌 다형성법(single-stranded conformation polymorphism) 등의 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 서열번호 1의 474번째 염기의 SNP를 확인하여 돼지의 근섬유 타입 IIb가 감소 및 돼지의 육질 향상 여부를 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 상기 SNP는 근섬유 타입 IIb가 감소, pH 및 보수력 지표인 FFU를 포함하여 돼지의 육질특성과 관련이 있으므로, 상기 SNP의 변이를 확인함으로써 돼지의 육질 향상 여부를 용이하게 확인할 수 있다. 상기 SNP의 변이는 공지된 다양한 방법에 의해 확인할 수 있으며, 예를 들어 PCR-RFLP 분석법 및 직접서열분석법 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는 돼지의 육질향상 여부를 확인하는 방법을 제공한다:

a) 돼지로부터 게노믹 DNA를 분리하는 단계;

본 발명의 방법에서, 상기 b)단계에서 서열번호 12와 서열번호 3으로 표시된 프라이머를 이용하여 증폭시키는 것을 특징으로 한다. 상기 b)단계의 DNA 증폭은 MYF5 유전자 단편의 474번째 염기인 SNP가 포함된 특정부위를 증폭시킬 수 있는 어떤 프라이머일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 12와 서열번호 3으로 표시된 올리고뉴클레오티드로 구성된 프라이머를 이용하여 증폭시킬 수 있다.

본 발명의 방법에서, 상기 유전자 단편들의 다형성은 상기 SNP 부위를 인식할 수 있는 어떠한 제한효소로 처리하는 것이 가능하나, 바람직하게는 제한효소 HhaI으로 처리하는 것이 적당하다. 본 발명은 상기 SNP 부위 인식에서 표지유전자를 한 번의 PCR 반응과 효소처리로서 탐색하고 진단해 낼 수 있는 가장 효율적인 방법의 하나로 PCR-RFLP 방법을 이용한 탐색기법을 개발하였다. 구체적으로, 본 발명의 상기 SNP 부위를 인식할 수 있는 제한효소인 HhaI의 처리에 따라 다르게 나타나는 밴드 패턴을 파악하여 유전자형을 구분하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 MYF5 유전자 exon1에 존재하는 유전적 변이(SNP)는 근섬유 조성과 관련이 있어, 본 발명에 의한 SNP는 돼지 근섬유타입 IIb 조성 비율 및 pH_45min, 유리육즙량(Drip loss) 등 육질 향상 여부를 확인할 수 있는 DNA 표지인자로 사용될 수 있고, 종축 선발 현장 등에서 용이하게 활용될 수 있는 SNP 분석용 키트를 제공할 수 있다. 이러한 본 발명에 의한 SNP 표지인자 분석기법은 DNA 수준에서의 육질예측방안으로서 돼지 육종기술에 매우 유용하게 적용될 수 있어, 육질이 향상된 개체를 조기에 선발하여 육종 및 생산함으로써 품질이 향상된 고급육의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 서열번호 1로 표시된 돼지 MYF5 유전자의 exnon1번 영역에 대한 염기서열을 분석한 결과를 나타내는 도면으로서, 서열번호 1의 474번째 염기(GC 치환)는 새로 발견된 단일염기변이부위(SNP)이다.
도 2는 본 발명에 의한 상기 SNP 부위를 포함하는 600 bp 크기(서열번호 13)의 DNA 단편 표지인자를 나타내는 도면이다.
도 3은 돼지 MYF5 유전자의 exnon1번 영역에 위치한 서열번호 1의 474번째 염기서열을 포함한 DNA 단편에 대한 PCR-RFLP를 실시한 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 돼지 MYF5 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석.

제1단계 : 클로닝

게노믹 DNA로부터 높은 정제율과 이후 실시될 염기서열 분석의 효율을 높이기 위해서 돼지 MYF5 유전자의 클로닝(cloning)을 실시하였다. 돼지 MYF5(Porcine MYF5) 유전자의 동정을 위하여 Gene bank(accession no. Y17154)에 등록된 genomic DNA sequence를 바탕으로 염기서열 분석을 위하여 약 3kb부위를 각 약 700bp씩 나뉠 수 있도록 internal 한 primer를 제작하였다.

프라이머 세트는 다음과 같이 M5-1 Forward 5'-CCC AGC AGA AAG GCA GTA A-3' (19mer; 서열번호 2), Reverse 5'-CTC TGG TTG GGG TTA GTC GT-3' (20mer; 서열번호 3), M5-2 Forward 5'-AAA GCG TGC AAG AGG AAA TC-3' (20mer; 서열번호 4), Reverse 5'-GCC ACA CTA ATT CGG AGA GAG-3' (21mer; 서열번호 5), M5-3 Forward 5'-CTG GCT GGA AGA TGT TGA TG-3' (20mer; 서열번호 6), Reverse 5'-ACT TGC TTA CGT TGC CCT TT-3' (20mer; 서열번호 7), M5-4 Forward 5'-ACA TTA CCG AGG GTG CTT CT-3' (20mer; 서열번호 8), Reverse 5'- GAG CTA CCT TGG ATG AAT TGC -3' (21mer; 서열번호 9), M5-5 Forward 5'-TGC CAG GAG TGC CTA TTA CA -3' (20mer; 서열번호 10), 5'-AGC CCC AGC TCA AAG ATA AC-3' (20mer; 서열번호 11)로 제작하였다(표 1).

표 2 및 표 3에 나타난 PCR 반응조건으로, PCR 반응을 시켜 증폭한 뒤 (표2, 3), E. coli용 TA-벡터에 클로닝한 후 EcoRI 효소(EcoRI enzyme)를 이용하여 각 삽입(insert)을 확인하였다.

제2단계 : 염기서열 분석

오토시퀀싱 시스템(Autosequencing system)을 이용하여 클로닝을 통하여 확보된 돼지 MYF5(Porcine MYF5 ) 유전자의 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석은 대상 개체군 내에서 무작위(random)로 추출한 10개의 샘플에 대해서 실시하였고, 삽입(insert)을 확인한 클론(clon)을 PCR 산물(PCR product) 내의 반응하고 남은 주형(Template)이나 프라이머를 없애주기 위해서 정제하였다. 이렇게 얻어진 약 700bp씩 분류된 4.1kb의 10개의 샘플에 대한 염기서열을 양방향에서 분석하기 위해서 3 반복씩 총 8번의 시퀀싱 반응 오토시퀀싱 시스템을 통해 실시하였다. 염기서열 분석 결과 exon1번 영역에서 개체간에 변이를 보이는 SNP site(G 또는 C)를 확인할 수 있었다(도 1a ~ 도 2).

실시예 2. DNA 표지인자 탐색용 kit 개발

제1단계 : 돼지의 게노믹 DNA 추출

실험에 사용된 돼지는 공시돈으로 총 235두의 요크셔(Yorkshire) 순종 돼지가 사용되었고 (거세 수컷 83, 암컷 152), 같은 농장의 서로 다른 우리에서 동일한 사료를 먹여 사육되었고, 여섯 번에 걸쳐서 한국 등급판정관리 아래 표준적으로 산업 도살장에서 도살되었다.

상기 유전자 다형성 분석을 위한 게노믹 DNA의 분리는 Sambrook 등 (1989)의 방법에 준하여 실시하였다. 돼지의 경정맥에서 10 ml의 혈액을 채취한 후, 응고를 방지하기 위해서 ACD 용액 (citric acid 0.48 g, sodium citrate 1.32g, glucose 1.47 g to H₂O 100 ml) 2 ml을 첨가하여 4℃ 유지하여 실험실까지 운반하였다. 50 ml 원심 분리용 튜브에 옮긴 후 1,300 g에서 15분간 원심분리하여 buffy coat를 모아 15 ml의 DNA extraction buffer (10mM Tris-Cl, pH 8.0; 0.1M EDTA, pH 8.0; 0.5% SDS; 20%/ml)를 넣고 잘 섞은 후 37 ℃ 항온수조에서 1시간 동안 배양한다. 배양 후 Proteinase K (200 /ml, BRL)를 혼합하여 37 ℃ 항온수조에서 12시간 동안 반응시켰다. 여기에 동량의 0.5M Tris-Cl (pH 8.0)으로 준비된 페놀(Phenol)에 넣고 30분 동안 섞어 추출한 후 실온에서 15 분간 5,000 g로 원심 분리하여 층이 생기도록 하였다. 이 과정을 3번 반복한 후, 직경이 0.3 cm되는 피펫(pippet)으로 상징액을 취하여 50 ml Tris-Cl (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0) 4 L에서 18시간 동안 4 ℃에서 투석하여 chromosomal DNA를 분리하였다. 분리된 DNA 순도는 spectrophotometer (Beckman, USA)를 이용하여 흡광도 A₂₆₀ 과 A₂₈₀의 비율로 측정하였으며, 0.8% 아가로즈 겔 전기영동을 시행하여 DNA의 분자량을 확인하였다.

제2단계 : 본 발명 kit 개발을 위한 PCR - RFLP 분석

표지유전자를 한 번의 PCR 반응과 효소처리로서 탐색하고 진단해 낼 수 있는 가장 효율적인 방법의 하나로써 PCR-RFLP 방법을 이용하여 탐색기법을 개발하였다. Restriction mapper software program을 이용해서 새롭게 밝혀낸 SNP부위를 인식할 수 있는 제한효소(Restriction enzyme)를 찾아내었고, 그렇게 찾아낸 제한효소인 HhaI의 처리에 따라서 다르게 나타나는 밴드(band) 형태를 파악하여 유전자형을 구분할 수 있었다.

PCR 반응시 프라이머는 Forward(5'-TGC GGT GGG ATA TGC TAA TA-3' 20mer)(서열번호 12)와 Reverse(5'-CTC TGG TTG GGG TTA GTC GT-3'(서열번호 3)로 제작하여 각각 1㎕(20pmol/㎕)씩 첨가하였고, 그 외의 반응 첨가물은 10xPCR buffer(100mM Tris-Cl; pH 8.3, 500mM KCl, 15mM Mg₂Cl) 5㎕, 10xdNTP mix(each 25mM) 5㎕, 10xEnhancer 5㎕, Taq DNA polymerase(5 unit/㎕; Genenmed) 0.5㎕ 와 ddH₂O 30.5㎕, Template DNA 2㎕(약 100ng)였다.

PCR 반응에는 GeneAmp PCR system 2400(Perkin-Elmer Co., USA)기기를 사용하였고, PCR 반응조건은 94℃에서 5분간 pre-denaturation 한 후, 94℃에서 denaturation 1분, annealing 60℃ 1분, extension 72℃ 1분을 한 cycle로 하여 35cycle을 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 15분으로 PCR 반응을 종료하였다.

이렇게 확보된 DNA 단편을 restriction mapper software program을 이용해서 찾아낸 HhaI 제한효소로 처리하였다. HhaI enzyme 처리 첨가물은 HhaI enzyme 2㎕(2 unit/㎕, NEB(New England BioLabs)), 10xEnzyme buffer 1㎕, 10xBSA 1㎕, ddH₂O 3㎕, PCR product 3㎕로 총 volume이 10㎕였다(표 4). 이 혼합물을 37℃Incubator에서 약 3시간 동안 반응시키고, 3% 아가로즈 겔에서 100V로 30분 동안 전기영동하여 그 밴드 패턴을 확인하였다(도 3).

제한효소인 HhaI의 처리에 따라서 다르게 나타나는 밴드 패턴을 파악하여 유전자형을 구분하였다. 예를 들어, 유전자형은 GG, GC, CC로 나타나며, G allele는 346 bp, 93 bp, 83 bp, 78 bp로, C allele는 197 bp, 149 bp, 93 bp, 83 bp, 78bp로 밴드가 나타남을 확인하였다(도 3).

실시예 3. 본 발명에 의한 kit 를 이용한 표지유전자형별 육량 및 육질형질 확인.

1) 근섬유특성 분석

근섬유특성 분석을 위하여, 사후 45분이 지난 8번 흉추의 등심근의 근육샘플을 수집하였고, 0.5 x 0.5 x 1.0 cm의 조각으로 자르고, 액체 질소로 재빠르게 얼리고, 분석 전까지는 -80℃에서 보관되었다. 횡단부분(10 ㎛ thick)은 20℃상에서 크라이오스태트(cryostat; CM1850, Leica, Germany) 기계로 준비되었고, 근섬유형 식별 분석을 위해 Type I, IIa와 IIb 섬유를 프리인큐베이션(acid preincubation, pH 4.35)을 처리한 액토미오신(actomyosin) ATPase 방법으로 염색하여 분류하였다. 모든 샘플은 CCD 카메라(charge-coupled device color camera; IK-642K, Toshiba, Japan)와 이미지 분석 시스템(the image analysis system; Image-Pro Plus, Media Cybernetics, USA) 장치를 이용하여 근섬유 특성이 분석되었다.

2) 육질 분석

근육의 pH는 사후 45분에 스피어-형 전극(spear-type electrode)의 사용으로 등뼈 13번/14번 부분에서 측정되었다. 육색(Lightness)은 색도계(chromameter; CR-300, Minolta Camera Co., Japan)를 사용하여 등심근의 사후 45분경에 측정하였다. 유리육즙량(drip loss)은 2℃에서 48시간 동안 플라스틱 백에서 표면에 있는 근육 샘플의 양의 차이를 측정하는 방법으로 분석되었다 (Honikel, K. O. (1987). Martinus Nijhoff, In P. V. Tarrant, G. Eikelenboom, & G. Monin (Eds.): 129-142).

도 3에서 보는 바와 같이, 본 발명에 의한 kit를 이용한 유전자형 분석 결과 나타나는 유전자형 및 유전자 빈도는 하기 표 5과 같다.

전체 235마리의 분석 결과 중에서 유전자형이 CC인 개체는 19마리로, 10% 미만의 빈도를 보여 분석대상에서 제외하였고, GC와 CC 유전자형을 비교 분석하였다. 통계분석 프로그램으로는 SAS 9.13 package에서 제공되는 SAS/GLM procedure를 이용하였고, 최소제곱평균(Least Squares Means)을 구하여 유의차를 평가하고 연관성을 분석하였다. 통계분석 모델은 다음과 같다.

유전자형과 근섬유형질 및 육질 등의 측정형질과의 연관성 분석결과는 하기 표 6에 나타내었다. 분석결과 나타난 근섬유조성 중 타입 IIb 면적(type IIb area composition; P = 0.0370)에서의 유전자형간의 유의적인 차이는 MYF5의 근섬유특성과 깊은 관련이 있음을 확인할 수 있었다.

표 6의 결과에서, 유전자형에 따른 각 개체들에서 총 섬유수(total fibers number)와 근섬유 하나 당 섬유의 크기를 나타내는 섬유의 단면적(CSA of fibers)와 단위 면적당 섬유수(fiber number per unit area), 섬유 수 조성(fiber number composition)은 차이가 없었고 섬유 면적 조성(fiber area composition)은 GG 유전자형에서 타입 IIb가 낮게 나타났다. 이는 근섬유 조성과 관련하여 GG 유전자형이 타입 IIb의 감소된 개체임을 의미하는 것이다.

또한 육질 특성(meat quality traits)에서는 GG 유전자형이 육질의 가장 중요한 특성인 pH(pH_45min)는 높고 보수력(Drip loss)은 낮게 나타남으로써 향상된 육질을 갖는 개체로 판단할 수 있었다.

따라서 본 발명의 돼지 MYF5 유전자의 Gly41Gln 다형성, 즉 서열번호 1의 474번째에 C염기가 G염기로 치환(substitution)된 경우 근섬유 타입 IIb가 감소하고 육질이 향상된 것으로 판단할 수 있으므로, 본 발명의 SNP가 육질향상 여부를 확인하는 DNA 표지인자로서 사용될 수 있음을 증명하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.　따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> DNA marker for detecting increase of porcine meat quality using a SNP in porcine MYF5 gene <130> P11-120828-02 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3033 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 cccagcagaa aggcagtaaa accattagcg tcgaagggcc ggtaaacagc ccactgtctc 60 taaaggaaag gcggaggttt gcccaaacag ccccggcggg ggttgcggtg ggatatgcta 120 atagtgccgg gccactgggg ccggcctccc tcccccaaga acatataaag ggccccaacc 180 ccagcgcggc cgacccaggc cgccaggcgt ctgcccctgt taattagcag agcaaccgag 240 cagggagttc cgcccgcgac gtgcccgccc gcggaggcgc caggccccgg gcttctcccc 300 gatctgatct atctcgcagc tgcccaggtg caccgcccgc ctgtccgcag aagatggacc 360 tgatggacgg ctgccagttc tcgccttctg agtacttcta cgatggctcc tgcatcccat 420 cccccgaggg cgagttcggg gacgagtttg agccacgagt ggctgctttc gggccgcaca 480 aagcagacct gcccggctca gacgaggaag agcacgtgcg agcacctacg ggccaccacc 540 aggccggcca ctgcctcatg tgggcctgca aagcgtgcaa gaggaaatcc accaccatgg 600 atcggcggaa ggcggccacc atgcgcgagc ggagacgcct gaagaaggtc aaccaggcgt 660 ttgagacgct caagaggtgc accacgacta accccaacca gaggctgccc aaggtggaga 720 tcctcaggaa tgccatccgc tacattgaga gcctgcagga gctgctgagg gaacaggtgg 780 aaaactaata cagcctgccc aggcagagct gctctgagcc caccagcccc acctccagct 840 gctccgacgg catggtaaga gaaagctcgg gacctcctag gcccttctaa tcttttccaa 900 aaaactttac ctctcgttta agccaggtgt agcaaccgaa tattctgata gttggctgtg 960 ggggtgagga ggcagttgcc ctaagagaga tgccccattt agacagacgc caggaaaccg 1020 ctgctgaaga gcataatact ttgcctccca agttctaggt gaacgttgcc gggggaggtt 1080 ctcatgtgag acgggtggct gtgaatgatc agaggttttc tccattactc actttacttc 1140 cgatatatac cccccgtgga ccccaccgta cactaacgtt taaaggcaac tgacggaggc 1200 tccccatagc gcatggtttc taactctagg cagaaatggg atgaaacacc cgcatggccc 1260 cggttgctgc tctgctgagg cctggctgga agatgttgat gcattctttt cagagggtgt 1320 ctgctctaac gctgccaggt tttaatgtgt ttttgccctg ggaaagtgtt ctctctccga 1380 attagtgtgg cttccttcca ccccaatcca ttttgcatgg ttaacccagt gcacgttgct 1440 gccgaattcc accccgcccc tctccttttc tcccagtaca gtgactgacc tcagcgccct 1500 tgccatttgg ggaggcgagc ccttcctaaa tcaaggcagt gaaggtgact gagagtcgtc 1560 aactttcgaa gctggagggc aagcactgcc tcaccctcca tcagagcacc tttcgccaag 1620 acctgaaaac aaatgccttc ttttgtgtct tttattatag cctgaatgca acagccctgt 1680 ctggtcccga aagaacagca gttttgacag tatctactgt ccggatgtac caaatggtaa 1740 gaacgaacgc ctttagagga ggttaaagac cagttcaact tcacagttca gcccatcaaa 1800 tcagtctgtc cttccaggca gttatctgga ggaaaagaga atggttttta cagggacttt 1860 ttggcggagc aaaataaaca tctgctcaaa attcccctca gagatactcc catgcacaca 1920 cacaggcaca tgagcttttg cttaaaacat taccgagggt gcttttccac tccccacctg 1980 cacccccatg aattgctaga tatatatgtt gcaaatttct acactggggt ctctgtgacc 2040 acctgacctc tgggtttcaa aggagctgac ctgcagttca aagggcaacg taagcaagtc 2100 tacctattgg gttttttttt ttttaacgtt tttttttccc cttgtatctt tagtatatgc 2160 cacggataaa agctccttat ccagcctgga ttgcttatcc agcatagtgg atcggatcag 2220 caactccgag caacctggac tgcctctcca ggacccagcc tctctctctc cagttgccag 2280 caccgattct cagcctgcaa ctccaggggc ctctagttcc agacttatct atcacgtgct 2340 atgaactaaa aatctagtct agaccatttc tgccaggagt gcctattaca caggaggaag 2400 gaggcccaaa aggcccaaaa gcaagacaac ctgtatataa acattttttt tcagttgtaa 2460 atttgtaaat actatcttgc cactttataa gaaagtgtat ttaactaaaa agtcactatt 2520 gcaattaatt ctttatttct tcttcttttc ctttgtcttg gcattaaata tatagttcca 2580 atgatattat ttcttatagg ggcaattcat ccaagggtag ctcgttgcaa tgcttaactt 2640 atacttttta taatattgct tatcaaaata ttacctctgt ttagagcttt atttttttcc 2700 cctttaaaaa tattagaaca aatactagaa ctggaaatca agttataggg agttttaaat 2760 atatttaact tttttgcttc tctttaatcc tttggttata ttgtgttaag taaaaatata 2820 acatactgcc taatggtata tattttgatc ttataagaaa tgcatctttt taatgtaagc 2880 acaaaatagt actttgtgga tgatttcaag atgtaagaga ttttggaaat tccaccataa 2940 ataaaattgt ttaaatgaag aatcatttga tttatgattt tgttaaaaga acctctaata 3000 gcattggcag tgattgatac gtatctttga gct 3033 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 2 cccagcagaa aggcagtaa 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 3 ctctggttgg ggttagtcgt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 4 aaagcgtgca agaggaaatc 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 5 gccacactaa ttcggagaga g 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 6 ctggctggaa gatgttgatg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 7 acttgcttac gttgcccttt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 8 acattaccga gggtgcttct 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 9 gagctacctt ggatgaattg c 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 10 tgccaggagt gcctattaca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 11 agccccagct caaagataac 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 12 tgcggtggga tatgctaata 20 <210> 13 <211> 597 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 13 tgcggtggga tatgctaata gtgccgggcc actggggccg gcctccctcc cccaagaaca 60 tataaagggc cccaacccca gcgcggccga cccaggccgc caggcgtctg cccctgttaa 120 ttagcagagc aaccgagcag ggagttccgc ccgcgacgtg cccgcccgcg gaggcgccag 180 gccccgggct tctccccgat ctgatctatc tcgcagctgc ccaggtgcac cgcccgcctg 240 tccgcagaag atggacctga tggacggctg ccagttctcg ccttctgagt acttctacga 300 tggctcctgc atcccatccc ccgagggcga gttcggggac gagtttgagc cacgagtggc 360 tgctttcggg ccgcacaaag cagacctgcc cggctcagac gaggaagagc acgtgcgagc 420 acctacgggc caccaccagg ccggccactg cctcatgtgg gcctgcaaag cgtgcaagag 480 gaaatccacc accatggatc ggcggaaggc ggccaccatg cgcgagcgga gacgcctgaa 540 gaaggtcaac caggcgtttg agacgctcaa gaggtgcacc acgactaacc ccaacca 597

Claims

서열번호 1의 염기서열에서, 474번째 C 염기를 포함하는 15 내지 800개의 연속서열로 구성되는 돼지의 육질 향상 확인용 DNA 표지인자로서,
상기 돼지의 육질 향상은 서열번호 1의 474번째 염기서열이 C 이외의 염기일 때 돼지의 육질이 향상된 것인, DNA 표지인자.
제1항에 있어서, 상기 DNA 표지인자는 돼지의 근육 내 근섬유 조성 중 근섬유 타입 IIb의 비율 감소 및 육질 향상 여부를 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 표지인자.
제2항에 있어서, 상기 DNA 표지인자는 돼지의 육질 관련 형질인 사후 45분 pH를 증가 및 유리유즙량(Drip loss) 감소를 확인할 수 있는 것을 특징으로 하는 DNA 표지인자.
서열번호 12와 서열번호 3으로 표시된 올리고뉴클레오티드로 구성되는, 돼지 MYF5 유전자의 육질 향상 관련 SNP를 탐색하기 위한 프라이머 세트로서,
상기 돼지의 육질 향상은 서열번호 1의 474번째 염기서열이 C 이외의 염기일 때 돼지의 육질이 향상된 것인, 프라이머 세트.
서열번호 12 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트, PCR 반응혼합물 및 RFLP 분석용 제한효소인 HhaI을 포함하는 돼지의 육질 향상 확인용 SNP 분석용 키트로서,
상기 돼지의 육질 향상은 서열번호 1의 474번째 염기서열이 C 이외의 염기일 때 돼지의 육질이 향상된 것인, SNP 분석용 키트.
하기 단계들을 포함하는, 돼지의 육질 향상 여부를 확인하는 방법:
a) 돼지로부터 게노믹 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 a)단계의 DNA를 주형으로 하여 서열번호 1로 표시된 MYF5 유전자의 474번째 염기를 포함하는 특정부위를 증폭시키는 단계;
c) 상기 b)단계에서 증폭된 DNA를 제한효소 HhaI으로 처리하는 단계; 및
d) 상기 c)단계에서 얻어진 유전자 단편들에서 다형성(RFLP; restriction fragment length polymorphism)을 비교하는 단계,
여기서 상기 돼지의 육질 향상은 서열번호 1의 474번째 염기서열이 C 이외의 염기일 때 돼지의 육질이 향상된 것인, 방법.
제6항에 있어서, 상기 b)단계에서 서열번호 12와 서열번호 3으로 표시된 프라이머를 이용하여 증폭시키는 것을 특징으로 하는 방법.