KR101158475B1 - Ｆａｓｎ 유전자내의 한우육 품질 판별용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우육 품질 판별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한우육의 육색(meat color), 조직감(texture), 등지방두께(backfat thickness) 또는 육량지수(quantity index)의 판단에 유용한 FASN (fatty acid synthase) 유전자내의 단일염기다형성 (SNP, single nucleotide polymorphism) 마커, 이 마커를 사용하여 한우육의 품질을 판단하는 방법 및 한우육의 육색, 조직감, 등지방두께 또는 육량지수의 판단에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 SNP 마커를 이용한 한우육의 품질 판단 방법에 의하면 한우육의 육색, 조직감, 등지방두께 또는 육량지수를 매우 간편한 방법으로 신속하게 판단할 수 있으며, 한우육 품질에 관해 구축된 데이터베이스를 토대로 우육 품질이 우수한 한우품종을 개량하는데 유용하게 사용될 수 있다.

FASN, SNPs, HRM 분석, 한우, 우육품질

Description

ＦＡＳＮ 유전자내의 한우육 품질 판별용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우육 품질 판별방법{Single Nucleotide Polymorphic Marker in Hanwoo FASN Gene for Distinction of Beef Quality and Method for Determining the Hanwoo Beef Quality Using the Same SNP Marker}

본 발명은 한우의 FASN 유전자내의 한우육 품질 판별용 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism) 마커 및 이 마커를 이용한 한우육의 품질 판별방법에 관한 것이다.

쇠고기의 품질은 육색, 지방색, 연도 및 근내지방도 등에 의해서 좌우되며 (Hocquette 등, 2005; Geay 등, 2001), 이 중에서 근내지방은 소고기의 풍미와 연도를 증가시켜 육질등급결정에 있어서 중요한 척도가 되고 있다 (Hovenier 등, 1992; Tatum 등, 1982). 소고기의 근내지방을 구성하는 중요한 성분인 중성지방의 지방산조성은 크게 포화지방산과 불포화지방산으로 구성된다. 올레산 (oleic acid, C18:1n-9)은 불포화지방산의 한 종류로 소고기내 가장 많은 비율을 차지하는 지방 산으로써 이 지방산의 고기내 함량은 풍미와 상관관계에 있다고 알려져 있고, 근내지방도가 증가하면 지방산의 조성비율의 변화와 함께 올레산 비율이 증가한다고 보고되었다(Smith 등, 2006).

지방산합성효소(FASN, Fatty acid synthase)는 동물이나 효모의 지방산 합성 효소계로서 다효소복합체로 아세틸기 전이 및 축합, 3-케토아실기 환원, 탈수 그리고 환원을 일으키는 각 효소가 한조로 구성된 복합체가 이량체로 이루어진 복합성 효소이며 아세틸-CoA와 말로닐-CoA를 합성하여 긴 사슬의 지방산 사슬을 만든다 (Wakil 등, 1989; Smith 등, 1994). FASN 유전자는 지방산합성의 완성에 관여하며, 포유동물의 우유 생성기작 및 고기의 지방산 조성에 중요한 영향을 미치는 후보유전자로 잘 알려져 있다 (Lin 과 Smith 등, 1978; Wakil 등, 1983).

FASN 유전자내의 엑손(exon) 39번부터 42번까지의 부분은 TE 효소를 코딩하는 염기서열 부분인데 Pazirandeh 등, (1989)은 C14 아실-ACP 와 C16 아실-ACP 가 TE의 작용산물임을 증명하였다. Roy 등, (2006)과 Morris 등 (2007)의 연구에 의해 TE 부분에 존재하는 g.17924 G>A의 유전자 변이가 포유동물의 우유 속에 함유하는 자방산 조성에 연관이 있다고 보고하였고, Zhang 등 (2008)은 g.17924 G>A 유전자 변이의 유전자형 GG 형은 고기내 올레산(Oleic acid, 불포화 지방산) 함량을 높이고, 팔미트산 (Palmitic acid, 포화지방산)는 낮추는 반면, AA형을 가진 쇠고기는 올레산(Oleic acid, 불포화 지방산)의 함량이 상대적으로 낮고, 팔미트산 (Palmitic acid, 포화지방산)은 높은 것으로 보고하였다. 올레산(Oleic acid, C18:1)의 증가는 근내지방의 증과와 밀접한 관계가 있으며, 올레인산과 고기의 풍 미는 양(positive)의 상관관계에 있다고 이미 오래전에 알려져 있다 (Waldman 등, 1968; Westerling 과 Hedrick 등 1979).

소에서 지방산합성효소(FASN)는 19번 염색체에 위치하여 있으며 42개의 엑손(exon)으로 이루어져 있다고 보고되었다(Pazirandeh 등, 1989; Singh 등, 1984). 저지(Jersey)/리무진(Limousin) 소의 전형매 교배를 통해서 염색체 19번 60-90cM 사이에 유지방과 지방산 조성에 큰 영향력을 미치는 QTL 영역이 존재 한다는 것이 규명되었으며, FASN 유전자와 동일한 위치에 있다고 보고되었다 (Morris 등, 2007; Beatriz 등 2008).

Zhang 등 (2008)은 미국의 육우인 앵거스 집단을 이용하여 엑손(exon) 39번에 위치한 g.17924 G>A와 엑손(exon) 42번에 위치한 g.18663 G>C의 두 개의 단일염기변이다형성에 대해 연구하였다. g.17924 G>A의 GG형과 g.18663 G>C의 CC형 두 유전자형은 미리스트산 (myristic acid ;C14:0)과 팔미트산 (palmitic acid; C16:0)과 같은 포화지방산 함량과는 연관되지 않지만 높은 건강지수 (health index)와 연관성이 있으며, 또한 g.17924 G>A 염기서열 변이는 트레오닌 (threonine)으로부터 알라닌(alanine)으로의 아미노산 변이가 올레산(C18:1)과 총 단가불포화지방산 함량과 밀접한 관계를 가지고 있다고 보고하였다.

Choi 등 (2008)은 한우와 화우 및 앵거스 집단을 대상으로 지방산 분석을 한 결과 포화지방산 중, 팔미트산 (C16:0)은 앵거스 집단이 한우와 일본 화우교잡집단보다 다소 높은 경향이 있었으며, 불포화 지방산인 팔미토레인산(16:1) 및 올레산 (C18:1)의 함량은 근내지방도가 높은 한우와 화우집단이 앵거스 집단보다 많이 함 유되어 있는 것으로 보고되었다.

고기의 지방산 조성가운데 포화지방산과 불포화지방의 비율은 인간의 대사성질환에 연관이 있다고 알려져 있는데 특히 포화지방산은 중성지방산 수치를 증가시키고 이로 인해 동맥경화의 위험이 높아지며 심장병, 뇌졸중 등 혈관질환이 발생하게 된다. 이에 반하여 불포화 지방산은 혈소판의 응집을 억제하여 혈전형성을 막는 효과가 있기 때문에 심장질환으로 인한 사망률을 줄여주는 것으로 보고되었다 (Alo 등, 1999). 그동안 한우육에서는 올레산의 함량이 다른 품종의 쇠고기보다 높은 것으로 알려져 있지만 그 유전적인 요인에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허가 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 소고기 육질에 중요한 결정요인인 지방산 함량과 조성에 영향을 미치는 것으로 알려진 지방산합성효소 (FASN, fatty acid synthase) 유전자의 염기서열과 염기변이간의 연관특성을 한우에서 심도있게 분석하고, 이 과정에서 발굴한 한우의 FASN 유전자 변이가 한우육의 육질특성에 어떠한 영향을 미치는지에 대해 연구하였다. 그 결과, FASN 유전자내에 4개의 단일염기다형성 (SNP, single nucleotide polymorphism) 마커가 한우의 육색, 고기 조직감, 등지방두께 및 육량지수 등 우육품질에 통계적 유의성을 가짐을 발견하였으며 동시에 이 마커가 고급 품질의 우육을 갖는 한우의 개발 및 생산에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 한우육의 육색(meat color), 조직감(texture), 등지방두께(backfat thickness) 또는 육량지수(quantity index)의 판단에 유용한 SNP 마커를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 이용하여 한우육의 육색, 조직감, 등지방두께 또는 육량지수를 판단하는 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 한우육의 육색, 조직감, 등지방두께 또는 육량지수를 판단하는 데 사용되는 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열의 98 번째 또는 서열목록 제 2 서열의 68 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 한우육의 육색(meat color) 또는 조직감(texture)의 판단에 유용한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 3 서열의 60 번째 또는 서열목록 제 4 서열의 97 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 한우육의 등지방두께(backfat thickness) 또는 육량지수(quantity index)의 판단에 유용한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "한우(韓牛, Korean Cattle, Hanwoo)" 는 종래부터 한반도에서 운반용이나 농경용으로 사육해오던 재래종의 역우(役牛)를 말하는 것으로 한국소(Bos taurus coreanae)를 의미한다.

본 명세서에서 용어, "뉴클레오타이드"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 서열목록 제 1 서열의 98 번째 단일염기다형성을 나타내는 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에서 SNP 변이는 "g.10568 C>T"또는 "10568Y" 로도 표시하여 기재한다. 또한, 서열목록 제 2 서열의 68 번째 단일염기다형성을 나타내는 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에서 SNP 변이는 "g.11280 G>A" 또는 "11280R" 로도 표시하여 기재하고, 서열목록 제 3 서열의 60 번째 단일염기다형성을 나타내는 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 서 SNP 변이는 "g.13125 C>T" 또는 "13125Y" 로도 표시하여 기재한다. 또한, 서열목록 제 4 서열의 97 번째 단일염기다형성을 나타내는 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에서 SNP 변이는 "g.17924 G>A" 또는 "17924R" 로도 표시하여 기재한다.

상기 4개의 단일염기다형성(SNP)은 g.10568 C>T, g.11280 G>A, g.13125 C>T, g.17924 G>A는 한우 FASN 유전자의 인트론(intron) 18번과 엑손(exon) 39번 사이에 존재하며, 이들 SNP는 한우육의 품질 즉, 육색, 조직감, 등지방두께 및 육량지수의 표현형과 강한 연관관계를 보인다.

상기 SNP와 우육 품질과의 연관관계에 대해 보다 상세히 설명하면, 한우 FASN 유전자의 g.10568 C>T 변이에서 CC 유전자형을 가진 개체의 우육은 육색과 조직감 형질에서 CT 유전자형의 것보다 우수하고, TT 유전자형의 것보다는 육색이 훨신 우수하고 조직감은 약간 낮은 특성을 보인다. 따라서, g.10568 C>T 변이의 SNP 위치에서 CC 유전자형 개체는 육색과 조직감 형질이 좋은 것으로 판단할 수 있다.

또한, 한우 FASN 유전자의 g.11280 G>A 변이는 g.10568 C>T 변이와 높은 연관비평형(Linkage Disequilibrium) 상태에 있기 때문에 역시 동일한 유의적인 효과가 관찰 가능하다.

또한, 한우 FASN 유전자의 g.17924 G>A 변이에서 GG 유전자형을 가진 개체가 가장 낮은 등지방두께와 높은 육량지수를 보였고, GA 유전자형을 가진 개체는 그 다음으로 우수하였으며, AA 유전자형을 가진 개체가 가장 낮은 품질을 보인다. 따라서, g.17924 G>A 변이의 SNP 위치에서 GG 유전자형 개체는 등지방두께가 낮고 높 은 육량지수 형질을 갖는 것으로 판단할 수 있다.

또한, 한우 FASN 유전자의 g.13125 C>T 변이는 g.17924 G>A 변이와 높은 연관비평형 상태에 있기 때문에 역시 동일한 유의적인 효과가 관찰 가능하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "연관비평형(Linkage Disequilibrium)" 이란 집단유전학에서 반드시 동일 염색체상에 존재하지는 않는 둘 이상의 유전자좌(loci)에서의 대립유전자의 비-무작위적 연관(non-random association)을 의미한다. 즉, 연관비평형은 서로 다른 위치의 대립형질들간의 결합의 척도로서, 만약 각 유전자가 완전히 독립적으로 배합된다면, 유전자 집합은 아마도 연관 평형(linkage equilibrium)을 유지할 것이나, 어떤 대립유전자들은 서로 같이 발견되는 예가 많으며 즉, 무작위적으로 뒤섞이지 않으며, 이런 대립유전자는 연관 비평형상태에 있다. 이러한 연관 비평형 상태는 대립유전자들이 서로 근접하여 위치하거나, 대립형질들이 서로 모여 있으면 더 유리한 경우에 자연선택의 결과로 나타나는 것으로 해석되고 있다.

본 발명은 상기 서열목록 제 1 서열 내지 제 4 서열에서 각 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중가닥의 gDNA(genomic DNA)에서 발견되는 경우, 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오타이드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 한우육의 육색(meat color), 조직감(texture), 등지방두께(backfat thickness) 또는 육 량지수(quantity index)의 판단 방법을 제공한다: (a) 한우육으로부터 핵산분자를 분리하는 단계; 및 (b) 서열목록 제 1 서열의 98번째, 제 2 서열의 68번째, 제 3 서열의 60번째, 또는 제 4 서열의 97 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP)의 염기타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계.

본 명세서에서 용어 "핵산분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, ChemicalReviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 핵산분자는 한우육의 다양한 소스로부터 얻을 수 있으며, 예컨대, 근육, 표피, 혈액, 뼈, 장기로부터 얻을 수 있고, 가장 바람직하게는 근육 또는 혈액으로부터 얻는다.

본 발명의 방법에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Rogers & Bendich (1994)). 출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 동물세포로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 특정 서열을 규명하는 데 이용되는 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석 (SSCA, Orita et al., PNAS, USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석 (Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동 (DGGE, Wartell et al., Nucl.Acids Res., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질 (예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법 (Modrich, Ann. Rev. Genet., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

서열변화가 단일-가닥 분자내 염기 결합의 차이를 초래하여, 이동성이 다른 밴드를 출현하게 하는 데, SSCA는 이 밴드를 검출한다. DGGE 분석은 변성 구배 젤을 이용하여, 야생형 서열과 다른 이동성을 나타내는 서열을 검출한다. 다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 식물체로부터 분리한 DNA 또 는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널(hybridization signal)을 이용하는 분석에서, 본 발명의 SNP를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 SNP 변이체 여부를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 (substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오타이드인 서열목록 제 1 서열의 98번째, 제 2 서열의 68번째, 제 3 서열의 60번째 또는 제 4 서열의 97번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스 (duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정 되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach , IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명 방법의 단계 (b)는 대립형-특이 유전자 증폭 방법에 의해 실시될 수 있다. SNP가 유전자 증폭 방법에 적용되는 경우, 특히 SNAP (single nucleotide amplified polymophism)라 통칭된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이러한 유전자 증폭은 SNP 뉴클레오타이드인 서열목록 제 1 서열의 98번째, 제 2 서열의 68번째, 제 3 서열의 60번째, 또는 제 4 서열의 97번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍(primer pair)을 기본적으로 이용한다.

본 발명의 명세서에서 "프라이머(primer)"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로서, 적합한 조건 (4 가지의 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 DNA 또는 RNA 폴리머라아제와 같은 중합효소의 존재), 적합한 온도 및 적합한 버퍼하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다.

프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로서 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명의 방법에 이용될 수 있는 증폭 기술은 PCR 증폭 (참조: Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. et al. (EP 329,822)), 리가아제 체인 반응 (LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), 중합효소 리가아제 체인 반응 (Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), 리페어 체인 반응 (EP 439,182), 3SR (Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) 및 NASBA (U.S. Pat. No. 5,130,238)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는 PCR 증폭 단계에 따라 증폭한다.

증폭기술이 적용되는 경우에, 본 발명의 SNP 염기를 확인하기 위해 적합한 프라이머를 디자인하는 것이 중요하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1 서열의 98번째, 제 2 서열의 68번째, 제 3 서열의 60번째, 또는 제 4 서열의 97번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 포함하는 한우육의 육색(meat color), 조직감(texture), 등지방두께(backfat thickness) 또는 육량지수(quantity index)의 판단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적 으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 4 서열의 97 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되며 한우육과 미국산우육과의 구분 판단에 유용한 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

서열목록 제 4 서열의 97 번째 단일염기다형성을 나타내는 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에서 SNP 변이 (g.17924 G>A) 위치에서 한우집단은 AA 유전자형이 거의 발견되지 않고 G 대립유전자의 빈도가 0.71 로서 매우 높게 나타나는 반면, 미국산우육에서는 A 대립유전자 빈도가 0.65로서 높게 나타난다. 따라서, g.17924 G>A의 SNP 위치에서 G 대립유전자의 존재는 시료가 한우육일 확률이 매우 높고, A 대립유전자의 존재는 시료가 미국산우육일 확률이 매우 높다는 것을 지시하므로, g.17924 G>A의 SNP 위치에서의 유전자형을 분석하면 높은 신뢰도로 한우육과 미국산육의 판별이 가능하다.

이상에서 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명은 한우육의 육색(meat color), 조직감(texture), 등지방두께(backfat thickness) 또는 육량지수(quantity index)의 판단에 유용한 SNP 마커를 제공하고, 이를 사용하여 한우육의 품질을 판단하는 방법을 제공하며, 한우육의 육색, 조직감, 등지방두께 또는 육량지수의 판단에 사용되는 키트를 제공한다. 본 발명의 SNP 마커를 이용한 한우육의 품질 판단 방법에 의하면 한우육의 육색, 조직감, 등지방두께 또는 육량지수를 간편한 방법으로 판단할 수 있으며, 이를 토대로 우육 품질이 우수한 한우품종을 개량하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

1. 공시재료와 DNA 의 추출

본 발명에서 사용된 시료는 일반 한우사육 농가에서 2007년도 10월부터 12월 사이에 출하된 한우비육우중 경기도 평택시에 위치한 (주)평농에서 도축된 100두의 등급판정결과(축산물등급판정소 제공)를 이용하였는데, 냉도체 판정 후 등심조직에서 샘플을 채취하여 Genomic DNA Prep Kit (Solgent, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다.

조사한 표현형질은 한우 등급판정결과의 도체형질인 도체중, 등지방두께, 배장근단면적, 육량지수, 육량등급, 근내지방도, 육색, 지방색, 조직감, 성숙도, 육질등급, 육량등급 및 성별 등 12 개 항목에 대하여 실시하였으며 농림부 고시 (축산물 등급판정 세부기준, 제 2004-66호)의 측정방법을 이용하였다.

미국산 육우집단의 Genomic DNA는 Michigan Cattlemen's Association (MCA)/Michigan State University (MSU) Farm에서 제공받은 샘플이다. 이에 해당되는 자료들은 웹사이트(.org)에서 찾아볼 수 있다.

2. FASN 유전자 변이 탐색을 위한 PCR 및 염기서열 분석

본 실험을 위하여 제작된 프라이머는 모두 NCBI GenBank accession number AF285607을 참조하여 Oligo 6 (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, USA)프로그램을 이용하여 제작하였다(표 1).

[표 1] 본 발명의 실험에서 사용된 프라이머

상기 표 1의 모든 프라이머들은 NCBI GenBank 접근번호 AF285607의 소 FASN 염기서열에 기초하여 제작하였다.

유전자내 단일염기 변이를 조사하기 위하여 미국 미시건 샘플중에 헤리퍼드(Herford), 앵거스(Angus), 시멘탈(Simmental) 품종을 교잡하여 생산된 비육우 4개 샘플의 DNA를 혼합하여 3개 그룹을 만들고 한우집단에서는 임의로 선택한 2개의 샘플의 DNA를 혼합하여 4개 그룹을 만들어서 총 7 개의 혼합 DNA 샘플을 주형 DNA로 이용하였다. DNA 증폭을 위해 사용된 PCR 기계는 PTC-200 themocycler (MJ Research, Watertown MA, USA)이며, DNA 중합효소는 h-Taq 폴리머라아제 (Solgent, Korea)를 사용하였다. PCR 반응조건은 주형 DNA 25 ng, 프라이머 0.01 μM, dNTP 5 mM, 10X PCR 완충액 2.5 ㎕, 그리고 h-Taq DNA 폴리머라아제 0.625 유닛(unit)를 넣어 최종 반응액 25 ㎕을 이용하였다. 반응조건은 최초 95℃에서 15분간 예비 가열한 후 95 ℃에서 20초 동안 변성시키고, 각 프라이머(primer)에 대응하는 어닐링(annealing) 온도 (표 1)에서 20초 및 72℃에서 30초간 합성(extension)시키는 총 40 사이클 반복 증폭하고 72℃에서 5분간의 마지막 합성단계(final extension)를 수행한후 DNA 증폭을 중지하였다. 증폭 산물은 4㎕를 취하여 모두 2％ 아가로스젤(agarose gel)에서 100mv 전압에서 20 분간 전기영동을 통해 확인하였다.

증폭산물은 Geneclean turbo kit (MP Biomedicals, USA)를 이용하여 정제한 후 Applied Biosystems 3730 DNA sequencer (PE Applied Biosystems, USA)를 이용하여 염기서열분석을 수행하였다. 얻어진 염기서열들에 대해 Sequencher ver 4.7 (Gene codes, version 4.7, Ann RBOR, MI)을 사용하여 4 품종 사이에서 나타나는 단일염기변이를 조사하였다(도 1).

3. HRM (High Resolution Melt) 시스템을 이용한 유전자형 결정

발굴된 g.10568 C>T, g.11280 G>A, g.13125 C>T, g.17924 G>A 등 4개의 단일염기다형성(SNPs)분석은 Roror-Gene^TM 6000 (Corbett) Real-Time PCR 기계를 이용하여 HRM (High Resolution Melt) 시스템을 이용하여 한우 집단 100두 에서 유전자형 결정을 수행하였다. Zhang 등(2007)이 보고한 FASN-Ex39-G17924A 단일염기변이는 미국 미시간 육우집단에서도 유전자형 결정을 실시하였다. HRM 시스템을 이용할 목적으로 제작한 프라이머(primer)는 하기 표 2에 나열하였다.

[표 2] HRM 분석용 프라이머 디자인

연관분석을 위해 4개의 SNPs에 대해 한우에서 HRM 유전자형 분석을 행하였다. PCR 반응조건은 주형 DNA 50 ng, 프라이머 0.1 μM, 2X SensiMix HRM^TM 10 ㎕, 그리고 EvaGreen 0.5 ㎕를 넣어 최종 반응액 20 ㎕을 이용하였다. 반응조건은 최초 95 ℃에서 15 분간 예비가열한 후 95 ℃에서 30초 동안 변성시키고, 각 프라이머(primer)에 대응하는 어닐링 (annealing) 온도(표 2)에서 30초 그리고 72℃에서 40초 합성(extension)시키는 총 40 사이클을 반복 증폭하고 72℃에서 5분 마지막 합성단계(final extension)를 수행한 후 HRM 시스템을 이용하여 유전자형 결정을 행하였다.

4. 통계 분석

SNPAlyze^TM (version 7.0) 프로그램을 구동한 후 결정되어진 각 반수체형(haplotype)별로 FASN 유전자내의 임의의 두 마커간의 연관 비평형 (Linkage Disequilibrium, LD)를 아래와 같은 r-square 방법을 이용하여 측정하였다.

상시 식에서 p_i 는 첫 번째 마커 대립인자 i (예: 1st SNP allele '1')의 빈도이며, qj는 두 번째 마커 대립인자 j의 (예: 2nd SNP allele '1') 빈도를 가리킨다. 따라서 마커 한 쌍 당 총 4개의 반수체형(haplotype) (11, 12, 21, 22)이 존재한다. hij는 두 마커에 있는 ij 반수체형(haplotype)의 빈도를 가리킨다.

조사된 경제형질 측정치에 대한 유전자형의 효과를 추정하기 위해 SAS 9.1 Package/PC를 이용하여 일반선형모형(GLM) 분석을 하였으며, 유전자형의 효과가 유의한 형질들에 대해 최소 유의차 검정으로 평균간 차이에 대한 유의성을 조사하였다. 통계분석에 이용한 모형은 다음과 같다.

Y _ijk =μ+ S _i + G _j + e _ijk

상기 식에서, Y _ijk , μ, S _i , G _j , e _ijk 는 각각 형질의 측정치, 전체평균, 성별효과, 개체의 유전자형 효과, 임의오차를 나타낸다.

실험결과

1. FASN 유전자의 단일 염기 다형성 및 특성분석

소의 FASN 유전자는 19번 염색체상에 위치하여 있으며 염기서열상으로 볼 때 FASN은 42개의 엑손(exon)과 41개의 인트론(intron)으로 이루어져 있다(도 2). 본 발명의 실험에서 FASN 유전자내의 염기서열에서 한우 품종과 미국산 육우 3개 집단에서 단일염기다형성(SNPs)을 탐색하였다. 8개 프라이머(primer) 쌍을 이용해 엑손(exon) 9 부터 인트론(intron) 38 까지 염기서열분석을 수행하였고, 엑손 39 내지 42의 변이 분석은 Zhang 등 (2008)이 사용한 TE-a-F/R, TE-b-F/R, TE-c-FR, MSC-F/R 등 4 쌍의 프라이머(primer) 들을 이용하였다.

하기 표 3에서 나타낸 바와 같이 모두 한우와 미국 육우 샘플에서 15개의 SNP를 발견하였다.

[표 3] 본 발명의 실험에서 발견된 소의 FASN 유전자의 SNPs

^* 신규 SNPs

^** 뉴클레오타이드 위치는 GenBank 접근 번호 AF285607에 나타난 바와 같이 FASN 유전자의 최초 염기에 따른 숫자로 표시하였다.

본 실험에서 수행한 소 FASN 유전자 염기서열 결과를 기존에 보고된 염기서 열과 및 에서 비교하였을 때 6 개의 SNP는 이미 보고되었던 SNP 이었고, 나머지 9개의 SNP들은 본 실험을 통해 새로 발굴된 것으로 확인되었다. 그리고 총 15개의 발견된 SNP들 가운데 6개의 SNP는 인트론(intron)에서, 9개는 엑손(exon) 부위에 위치하였고, 2개의 g.13125 C>T, g.17924 G>A SNP 가 단백질 아미노산 구조에 변화를 주는 미스센스(Missense) SNP 로 확인되었다 (표 3 참조).

2. 한우와 미국육우 집단에서의 FASN-ex39-A17924G 유전자 변이 조사

본 실험에서는 FASN 유전자내 엑손(exon) 39 번에 위치한 g.17924 G>A 변이를 추가 조사하기 위해 한우와 미국육우 집단을 이용하여 유전자형 결정을 하였다(표 4).

[표 4] 9 종의 상이한 품종 소에서 FASN (17924A>G) 유전자의 유전자형 및 대립유전자(allele) 빈도

표 4에서 조사된 바와 같이, g.17924A 대립유전자는 팔미트산(palmitic acid, 포화지방산)의 함량은 높고 올레산(oleic acid, 불포화 지방산)의 함량은 낮은 유전자형으로써 미국육우집단에서 A 대립유전자 빈도(0.65)가 많이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 반면 한우집단에서는 AA의 유전자형이 한 두도 발견되지 않았으며, 올레산 함량을 증가시키는 것으로 알려진 G 대립유전자의 빈도 (0.71)는 매우 높게 관찰되었다.

3. 한우집단에서 FASN 유전자내의 SNPs 의 연관비평형 및 반수체 구역 분석

발굴된 SNP 가운데 총 4개의 SNP를 선별하여 SNP간의 연관성을 분석한 결과, g.10568 C>T와 g.11280 G>A 마커는 연관비평형 (Linkage Disequilibrium, LD)이 r²=0.94 으로 유의적으로 매우 높게 나타났다. 또한 g.13125 C>T 와 g.17924 G>A 역시 연관 비평형(LD)이 유의수준 (r²=0.1)으로 나타났다.

반수체구역(haplotype block)은 연관 비평형 r-square (0.1) 유의수준에 따라 계산된 반수체구역 A (10568Y, 11280R)와 반수체구역 B (13125Y, 17924R)로 나누었으며, 반수체구역 A의 반수체형 1 (C+G)의 빈도는 0.5404의 빈도로 가장 높게 나타났으며, 반수체형 2 (T+A)의 빈도도 0.4494의 빈도로 높게 나타났으며, 높은 LD값(0.94)으로 알 수 있듯이, g.13125 C는 g.11280 G와 완전한 LD를 가지고 있어서 반수체구역 A의 반수체형 3 (T+G)의 빈도는 0.0102로 현저히 낮은 것을 관찰할 수 있었다. 이와는 다르게 반수체구역 B의 반수체형 (T+G), 2(C+G), 3(T+A)들의 빈도는 각각 0.3964, 0.3850, 0.0102 나타났다. 반수체구역 A의 반수체형들과 반수체 구역B의 반수체형들의 조합의 빈도는 하기 표 5에 나타내었다.

[표 5] 한우에서 FASN 유전자에서의 반수체구역 (Haplotype Block)

4. 한우 집단에서 FASN 유전자내의 SNPs 유전자형 빈도와 도체 형질과의 연관성 분석

한우집단 시료 100두를 이용하여 연관비평형으로 존재하는 4개의 SNP에 대한 유전자형을 결정하였으며, 표 6에서 4종 모두 DNA 변이를 확인 할 수 있었다. 표 7에서 보는 것과 같이 등지방두께와 육량지수에 유의적으로 연관된 좌위는 티오에스터라아제(Thioesterase, TE) 도메인 영역의 엑손 39 번에 존재하는 g.17924 G>A의 다형이 5％ 수준의 통계적 유의성이 인정되었다. 이 다형은 표 7 에서 보는 것 처럼 상가적 (additive) 효과를 나타내었는데, GG 유전자형이 가장 낮은 등지방두께와 높은 육량지수를 보였고, GA 유전자형이 그 다음으로 높았으며, AA 유전자형은 가장 낮은 근내지방 함량을 나타내었다.

또한 인트론(intron) 18 번에 존재하는 g.10568 C>T와 엑손(exon) 21 번에 존재하는 g,11280 G>A는 높은 연관비평형 존재로 육색과 조직감 형질에서 유의적인 연관성이 있는 것으로 나타났다. g.10568 C>T 의 CC형은 육색과 조직감이 CT형 보다 현저히 높았으며, TT형 보다는 육색은 좋으나 조직감에서는 조금의 차이로 낮게 나타났다. g,11280 G>A 역시 g.10568 C>T 와 높은 연관비평형 상태이기 때문에 같은 유의적인 효과를 관찰할 수 있었다. 따라서 육색이 좋으며, 등지방두께는 얇고 육량이 많은 높은 개체들은 g.10568 C>T + g.17924 G>A (C + G) 반수체형을 가진 빈도는 0.365 빈도를 나타내었다.

[표 6] 한우에서 유전자 분석된 FASN 유전자의 4개 다변형의 유전자형 및 마이너 대립유전자(minor allele) 빈도(n=100).

연관비평형 (Linkage Disequilibrium) r-square value 값에 의해 만들어진 반수체구역(haplotype block) 1 영역 (g.10568 C>T 와 g.11280 G>A으로 구성됨)은 육색 (P=0.0004)과 조직감 (P=0.01)에 고도의 유의성이 있었으며, 반수체구역(haplotype block) 2 영역 (g.13125 C>T 와 g.17924 G>A으로 구성됨)은 등지방두께와 (P=0.0179)과 육량지수 (P=0.0495)에 유의성이 관찰되었다 (표 7).

[표 7] 한우에서 도체 특성과 연관된 FASN 유전자의 4개 변이형의 분석

5. 실험결과 정리

본 실험에서는 국내한우집단과 미국산육우집단에서 포화지방산 및 불포화 지방산이 함량에 직접적인 연관이 주는 것으로 알려진 FASN 유전자의 엑손(exon) 39번 g.17924 G>A SNP에 관한 대립유전자 빈도를 조사하였는데, 미국의 육우집단에서는 A 대립유전자형이 많이 나타나는(0.65) 반면 우리나라 한우 집단에서는 G 대립유전자의 개체가 현저히 많은 것으로 나타났다(0.71).

또한, 한우의 FASN 유전자의 엑손(exon) 9 - 엑손(exon) 24 영역에 대한 염기서열 분석을 통해 15개의 SNPs 를 확인하였으며, 그중에서 인트론(intron) 18 - 엑손(exon) 39 사이의 4개의 SNPs (g.10568 C>T, g.11280 G>A, g.13125 C>T, g.17924 G>A)들은 연관비평형 상태를 이루고 있었다. 또한 g.10568 C>T 와 g.11280 G>A 은 육색과 고기의 조직감에 고도의 연관성을 관찰 할 수 있었다. FASN g.10568 C>T 변이에서 CC 형을 가진 개체는 TT 형보다 육색에서 보다 높은 수치를 나타내었다. 그리고 g.17924 G>A 변이는 GG 형을 가진 개체들은 AA형을 가진 개체들보다 등지방두께가 3cm 가량 얇고 육량지수는 높은 것으로 나타났다. FASN 유전자는 지방산 조성 및 근내지방함량을 높이지만, 등지방두께를 감소시키는 결과를 보여준다. 따라서 한우집단 100두 중 육색이 좋으며, 등지방두께는 얇고 육량이 많은 높은 개체들은 g.10568 C>T + g.17924 G>A (C + G) 반수체형을 가진 개체로 판단되며 그 빈도는 0.313 나타내었다. 그 외 반수체형들의 빈도는 0.364 (T +G) 와 0.199 (C +A) 등의 결과를 관찰하였다.

본 발명의 실험결과는 FASN 유전자는 한우의 육질을 조절하는 자방산과의 밀접한 연관성이 있으며 외래품종보다 우수한 육질요인을 가지고 있음을 시사하였고, 한우집단에서의 다양하고 차별적인 육질관련 유전요인을 밝히는데 중요한 기반을 제공할 것으로 기대되며, 아울러 차별화된 고급 한우육을 생산하기 위한 중요한 DNA 마커로써 활용가치가 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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23. 농림부. 2004. 축산물 등급판정 세부기준. 농림부고시 제 2004-66호.

도 1은 3개 품종의 소에서 FASN의 서열분석 결과를 보여주는 도면이다.

도 2a는 염색체 19번상의 FASN 유전자의 물리적 맵(physical map) SNP 위치를 보여주는 도면이다. 총 전장은 19.7kb이고, 엑손은 검은색 블록으로 표시하였다.

도 2b는 염색체 19번상의 FASN 유전자의 각 SNP 및 각 SNP 위치간의 연관비평형(Linkage Disequilibrium)상태를 보여주는 도면이다.

도 3a는 SNP g.10568 C>T를 포함하는 본 발명의 서열목록 제 1 서열, 도 3b는 SNP g.11280 G>A를 포함하는 본 발명의 서열목록 제 2 서열, 도 3c는 SNP g.13125 C>T를 포함하는 본 발명의 서열목록 제 3 서열, 도 3d는 SNP g.17924 G>A를 포함하는 본 발명의 서열목록 제 4 서열이다.

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Single Nucleotide Polymorphic Marker in Hanwoo FASN Gene for Distinction of Beef Quality and Method for Determining the Hanwoo Beef Quality Using the Same SNP Marker <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 180 <212> DNA <213> Bovine <400> 1 tgagaatggc aacctgatcg cgagcggtga gcaggggccc tggaccgggc tgcagggtcc 60 ctgctggggg tctctgggta gaccttagct accggctyag ccctgccctc actcaggccc 120 ttctgccatc cctgcccaca gggaaggtat accagtggga agatcccaac cccaagctct 180 180 <210> 2 <211> 133 <212> DNA <213> Bovine <400> 2 ccacagtggc cgacgtggta ataaacaggt gtctggacac cacggtggct ggcggcatct 60 acatctcrag gatccacacc tcggtggccc cccggcatca gcaggagcag ctggtgccca 120 tcctggagaa gtt 133 <210> 3 <211> 147 <212> DNA <213> Bovine <400> 3 gccctgaccc cctcaactca caggatgagt gggagcgcct gtttgctggt gcgtccctgy 60 acctggtggc cctgaagaag tccttctacg gctcggtgct cttcctgtgc cgccggctgg 120 ccccgcttga cagcccaatc ttcctgc 147 <210> 4 <211> 128 <212> DNA <213> Bovine <400> 4 accttgacac ggctcaactc ggtgcagagc tccgagcggc ccctgttcct ggtgcacccc 60 atcgagggct ccaccaccgt gttccacagc ctggccragc tcagcatccc cacctatggc 120 ctacagtg 128 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-9-1804-F <400> 5 cccaacctgc acttccacaa c 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-9-1804-R <400> 6 cgtccttccg atgcctgtc 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-12-15-F <400> 7 atcggaagga cgcaggagac c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-12-15-R <400> 8 gcccacgttg ctgaggaaga 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-16-19-F <400> 9 tctcaggcgt ctccaaggtc t 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-16-19-R <400> 10 cggagctggc ctcaaggata 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-20-22-F <400> 11 catcaccgcc atctacatcc a 21 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-20-22-R <400> 12 aaggcccacc caccgatt 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-23-26-F <400> 13 gacgtgaggt cgcccaactc 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-23-26-R <400> 14 aggaatcggc caggatgttc t 21 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-27-30-F <400> 15 tggactgaga gggcaaga 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-27-30-R <400> 16 cggctgaccc tggcagag 18 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-31-34-F <400> 17 caccatccgc ctgtatcctc a 21 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer-31-34-R <400> 18 ccgrcgggca arrcacct 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-36-38-F <400> 19 tgcggtccca ccctcataac 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-36-38-R <400> 20 cagatggaca agccctgtac ct 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TE-a-F <400> 21 agagctgacg gactccacac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TE-a-F <400> 22 ctgcatgaag aagcacatgg 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TE-b-F <400> 23 ctcgcacacc ttcgtgatg 19 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TE-b-F <400> 24 cacgttgccg tcctaggtag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer TE-c-F <400> 25 cgctcactgt cctgtcctac 20 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer TE-c-F <400> 26 gctgtgaata atactaagga tgga 24 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MSC-F <400> 27 agagctgacg gactccacac 20 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer MSC-R <400> 28 gccgatgcac tcgatgtag 19 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-180-F <400> 29 tgagaatggc aacctgatcg c 21 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-18-R <400> 30 agagcttggg gttgggatct 20 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-21-F <400> 31 ccacagtggc cgacgtg 17 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-21-R <400> 32 aacttctcca ggatgggcac c 21 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-24-F <400> 33 gccctgaccc cctcaac 17 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-24-R <400> 34 gcaggaacat tgggctgtca a 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-39-F <400> 35 accttgacac ggctcaactc 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer FASN-39-R <400> 36 cactgtggcc ataggtggg 19

Claims (9)

1. 서열목록 제 4 서열의 97 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 8-100 개의 연속 뉴클레오타이드로 구성되는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 한우육의 등지방두께(backfat thickness) 또는 육량지수(quantity index) 판단용 조성물.
2. 삭제
3. 다음의 단계를 포함하는 한우육의 등지방두께 또는 육량지수 판단 방법:

   (a) 한우육으로부터 핵산분자를 분리하는 단계; 및

   (b) 서열목록 제 4 서열의 97 번째 뉴클레오타이드에 해당하는 단일뉴클레오타이드다형성(SNP)의 염기타입을 상기 분리된 핵산분자에서 확인하는 단계.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 서열목록 제 4 서열의 97 번째의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 이용하여 상기 분리된 핵산 분자를 증폭하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 핵산분자는 한우의 근육, 표피, 혈액, 뼈, 또는 장기로부터 얻는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 서열목록 제 4 서열의 97 번째 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 증폭할 수 있도록 제작된 프라이머쌍을 포함하는 한우육의 등지방두께 또는 육량지수 판단용 키트.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 키트는 PCR 증폭 완충액, DNA 중합효소 및 dNTPs를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
8. 삭제
9. 삭제

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