KR20230158908A - 한우 유래 지방산합성효소 변이체의 근육위성세포 증식 촉진 용도 및 이를 이용한 세포 배양육 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 한우 유래 지방산합성효소(fatty acid synthase) 변이체, 이의 근육위성세포 증식 촉진 용도, 상기 지방산합성효소 변이체를 갖는 근육위성세포를 이용한 세포 배양육 제조방법, 상기 방법으로 제조된 한우 유래 세포 배양육, 및 상기 한우 유래 세포 배양육을 포함하는 식품에 관한 것이다. 본 발명의 한우 유래 지방산합성효소 변이체(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로 치환된 변이체)는 근육위성세포의 증식을 촉진시키는 활성을 갖는바, 세포 배양육 제조를 위한 근육위성세포로 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 세포농업(cellular agriculture) 및 배양육을 소재로 하는 다양한 식품 산업분야에서 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 한우 유래 지방산합성효소(fatty acid synthase, FAS) 변이체; 이의 근육위성세포 증식 촉진 용도; 상기 지방산합성효소 변이체를 갖는 근육위성세포를 이용한 세포 배양육 제조방법; 상기 방법으로 제조된 한우 유래 세포 배양육; 및 상기 한우 유래 세포 배양육을 포함하는 식품에 관한 것이다.
최근 국제연합식량농업기구(FAO)에서 발간한 보고서에 따르면, 세계 인류는 2018년 7월 기준 76억 4천만 명에서 2050년에는 92억 명으로 매년 0.6% 증가할 것으로 예측되며, 이러한 인구의 증가와 맞물려 인류의 육류 소비량 역시 465백만 톤에 달할 것으로 추정되고 있다.
이에 국제연합식량농업기구(FAO)는 증가하는 육류 수요를 맞추기 위해 매년 2억 톤의 추가 생산이 필요함을 발표한 바 있다. 또한, 최근 들어 가축 광우병, 구제역 등의 가축 질병 문제, 가축 내장에 함유되어 있던 병원균이 가공 과정에서 사멸되지 않음으로 인해 각종 질환을 야기시키는 사례가 속속 발생하고 있어 사회적으로 큰 문제점을 야기시키고 있다.
이처럼 인구 증가 및 도축 가축에서 발생되는 질환 발생의 문제 등을 해결하기 위한 방안으로 최근 '배양육'이 주목 받고 있다.
배양육이라 함은 살아있는 동물의 세포를 채취한 뒤 세포 공학 기술로 증식하여 얻게 되는 식용 고기를 의미하며, 가축을 사육하는 과정을 거치지 않고 고기를 얻는 세포농업 (cellular agriculture)의 한 분야라고 할 수 있다. 한국어로는 배양육, 대체육 혹은 인공 고기라는 말로 불리며, 영어로는 시험관에서 키운다는 의미로 in vitro meat, 천연이 아닌 인간이 줄기세포를 이용하여 합성한다는 의미에서 artificial meat, 전통적인 사육시설이 아닌 청정한 생산시설에서 생산된다는 의미로 clean meat, 일부 시제품은 실험실에서 만들어지기도 해서 lab-grown meat로 불리고 있다.
배양육은 세포공학기술 중 조직배양기술(tissue engineering)을 이용한다. 세포는 살아있는 동물에서 얻지만 고통 없이 확보하고 줄기세포를 배양하는 방법을 이용한다. 따라서 배양육은 동물을 살리면서, 환경오염도 줄이는 이상적인 식량생산 기술에 해당한다.
한편, 한우는 우리나라의 고유 품종의 소로서 이전에는 역우로서 사용하였지만, 1980년 이후 개량을 통하여 근내지방 침착도가 높은 고급육으로서의 품종으로 개량되었다. 특히, 한우는 서구의 다른 품종들과 달리 근내지방 침착도가 매우 높은 품종으로 알려져 왔고, 이에 대한 유전자 발현량도 다르다고 보고된 바 있다. 한우의 경우 지방세포 및 근육세포에서 지방산을 합성하는 지방산합성효소(fatty acid synthase, FAS)의 역가가 Angus 등의 서구 품종에 비해 활성이 높은 것으로 알려져 있다. 같은 사료와 같은 환경에서 사육함에도 불구하고 지방축적이 낮은 개체도 발생하기도 한다.
종래 보고된 연구에서는 FAS의 특정 유전자의 변이가 비육우 등심 내의 올레인산 함량의 변화가 있는 것으로 보고된 바 있다. 그러나 FAS의 변이가 세포증식에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 연구 결과는 전무한 실정이다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 한우에서 FAS 유전자내 티오에스터라아제(Thioesterase) 도메인 영역의 엑손 39번에 위치한 g.17924번째 염기서열의 SNP 유전자형(G/A) 종류에 따른 근육위성세포의 세포증식능을 확인하였다. 그 결과, 한우에서 유래된 근육위성세포 중 FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열이 A를 갖는 세포의 경우(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로 치환됨), 근육세포의 증식 시 세포증식능이 매우 우수한바, 세포 배양육 제조를 위한 근육위성세포로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 근육위성세포의 증식을 촉진시키는 활성을 갖는 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육위성세포 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 갖는 근육위성세포를 이용하여 세포 배양육을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 한우 유래 세포 배양육을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 한우 유래 세포 배양육을 포함하는 식품을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 한우 유래 지방산합성효소 변이체로, 상기 변이체는 서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제(Thioesterase) 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 돌연변이되며, 상기 변이체는 근육위성세포의 증식을 촉진시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 한우 유래 지방산합성효소 변이체을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 56번째 아미노산이 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로 치환될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 근육위성세포 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 갖는 근육위성세포를 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는, 세포 배양육 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지는 올레산(oleic acid)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 단계 이후 증식된 근육위성세포를 근세포(myocyte) 및 근관세포(myotube)로 분화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 한우 유래 세포 배양육을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 한우 유래 세포 배양육을 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 한우 유래 지방산합성효소 변이체(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로 치환된 변이체)는 근육위성세포의 증식을 촉진시키는 활성을 갖는바, 세포 배양육 제조를 위한 근육위성세포로 유용하게 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 세포농업(cellular agriculture) 및 배양육을 소재로 하는 다양한 식품 산업분야에서 활용이 가능하다.
도 1은 FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열의 SNP(G/A) 유전자형의 종류에 따른 근육위성세포(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 알라닌 또는 트레오닌을 갖는 근육위성세포)의 세포증식능을 보여주는 결과이다(Glu: glucose, OA: oleic acid).
본 발명은 한우 유래 지방산합성효소 변이체로, 상기 변이체는 서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제(Thioesterase) 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 돌연변이되며, 상기 변이체는 근육위성세포의 증식을 촉진시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 제공한다.
본 발명의 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 56번째 아미노산이 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로 치환된 변이체이다.
본 발명에서 상기 ‘지방산합성효소(fatty acid synthase, FAS)’란 소의 19번 염색체에 위치한 42개의 엑손(exon)으로 이루어진 유전자로 19760 bp를 가지며, FAS 단백질은 2513개의 아미노산 서열로 구성되어 있다.
한편, 소의 FAS 유전자내 g.17924 G>A 염기서열 변이는 단백질 아미노산 구조에 변화를 주는 미스센스 돌연변이이다( G CC[알라닌]-> A CC[트레오닌]).
본 발명의 한우 유래 지방산합성효소 변이체는 한우의 FAS 유전자내 g.17924 G>A 염기서열 변이로 인해, 해당 부위의 아미노산이 알라닌( G CC)에서 트레오닌( A CC)으로 치환된 변이체로서, 자세하게는 서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제(Thioesterase) 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 알라닌에서 트레오닌으로 치환된 변이체이다.
참고로, 한우 집단에서는 FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열의 경우 G 대립유전자의 빈도는 매우 높게 관찰되며, A 대립유전자 빈도는 매우 낮게 나타난다(Minor Allele Frequency: 0.219). 이에, 한우에서 FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열이 A인 경우(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 트레오닌에 해당함)는 돌연변이에 해당한다.
본 발명에서는 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 갖는 근육위성세포의 경우 세포증식능이 두드러지게 촉진되는 것을 확인하였다. 자세하게는, FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열의 SNP(G/A)의 종류에 따른 한우 유래 근육위성세포를 분류하였으며, 분류된 근육위성세포를 글루코오스 및 올레산이 첨가된 배지에서 증식시킨 결과, FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열이 A를 갖는(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 트레오닌에 해당함) 근육위성세포에서 세포증식 활성이 두드러지게 증되된 것을 확인하였다.
이에, 상기와 같은 결과를 통해 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 56번째 아미노산이 알라닌에서 트레오닌으로 치환된, 본 발명의 한우 유래 지방산합성효소 변이체가 근육위성세포의 증식을 촉진시키는 활성을 가짐을 최초로 규명하였다.
또한, 본 발명은 한우 유래 지방산합성효소 변이체(서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 56번째 아미노산이 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로 치환된 변이체)를 암호화하는 유전자; 이를 포함하는 재조합 벡터; 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 암호화하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.
상기 재조합 벡터로는 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하다.
상기 형질전환된 세포는 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현할 수 있는 세포로서, 바람직하게는 근육위성세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 근육위성세포 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 근육위성세포 증식 촉진용 조성물은 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 것으로, 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 세포를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 갖는 근육위성세포를 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는, 세포 배양육 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 ‘세포 배양육’이란 살아있는 동물의 세포를 채취한 뒤 세포 공학 기술로 증식하여 얻게 되는 식용 고기를 의미하며, 배양육과 동일한 의미를 지닌다.
본 발명에서 ‘근육위성세포(myosatellite cell)’라 함은 골격근 외측의 근섬유와 기저막 사이에 낀 방추형의 단핵세포를 의미하며, 근육이 손상되었을 때 위성세포는 분열하여 근육의 재생을 가능하게 하는 기능을 한다. 근육위성세포는 근위성세포, 근육줄기세포 등으로 불린다.
본 발명에서 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 갖는 근육위성세포는 한우의 근육 조직에서 FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열의 SNP를 분석하여, 상기 위치의 염기서열이 A인(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 트레오닌에 해당함) 세포를 분류함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 갖는 근육위성세포는 올레산(oleic acid)이 포함된 배지에서 증식시키는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 글루코오스 및 올레산이 포함된 배지에서 증식시키는 것이 좋다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 증식시키는 단계 이후 증식된 근육위성세포를 근세포(myocyte) 및 근관세포(myotube)로 분화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 방법으로 제조된 한우 유래 세포 배양육을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포 배양육을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물 또는 식품을 제공한다.
상기 식품은 세포 배양육은 인공 고기로 사용하는 식품으로서, 햄버거 패티 등을 예시할 수 있으나, 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
한우로부터 근육위성세포 추출
도축장에서 25개월령 이상의 한우 수소의 도체에서 도축 즉시 200g의 우둔(엉덩이살) 부위의 근육을 채취하여 실험실로 옮겨 준비하였다. 실험실 내 분리 기법을 이용해 한우 유래 근육위성세포를 채취하여 사용하였다. 모든 도구는 멸균화시키고, 멸균 작업대에서 실험을 진행하였다.
제일 먼저 근육 내의 결제조직을 제거하고, 멸균하여 준비한 만육기(고기분쇄기)를 이용하여 고기를 갈아 준비하였다. 분쇄된 한우 근육을 0.1% pronasee(Calbiochem)을 Earl’s Balanced Salt Solution(Sima-Aldrich)에 녹여서 준비한 용액에 넣고, 37℃에서 1시간 동안 진탕배양을 하였다. 진탕배양이 끝난 후, 1,500 × g에서 4분간 원심분리 후 상층액을 제거한 후에 침전물에 phosphate-buffered salin(PBS, Gibco, 140 mM NaCl, 1mM KH2PO4, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4)를 넣고 잘 섞은 후에 500 × g에서 10분간 원심분리 하였다. 이후 상층액을 다시 1,500 × g에서 10분동안 원심분리 한후 세포를 수득하였다. 이러한 과정을 2회 반복하였다.
<실시예 2>
한우 유래 지방산합성효소(fatty acid synthase) 유전자내 g.17924번째 단일염기다형성으로 인한 아미노산 변이 분석
지방산합성효소(fatty acid synthase, 이하 간략하게 ‘FAS’라 약칭함)는 소의 19번 염색체에 위치한 42개의 엑손(exon)으로 이루어진 유전자이며, 우유의 지방산조성에 영향을 미치는 후보유전자로 보고된바 있다. 소의 FAS 유전자는 19760 bp를 가지며, FAS 단백질은 2513개의 아미노산 서열로 구성되어 있다.
이전 연구에서는 소의 FAS 유전자 변이를 조사한 결과, 소의 FAS 유전자내 티오에스터라아제(Thioesterase) 도메인 영역의 엑손 39번에 위치한 g.17924번째 염기서열에서 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 확인한바 있다. 또 다른 연구에서는, 한우와 미국육우 집단을 대상으로 하여 FAS 유전자내 변이를 확인하기 위하여 9 종의 상이한 품종 소에서 FAS g.17924A>G 유전자의 유전자형 및 대립유전자(allele) 빈도를 조사하였으며, 그 결과 미국육우 집단에서는 A 대립유전자 빈도가 가장 많이 나타났으나, 반대로 한우 집단에서는 G 대립유전자의 빈도는 매우 높게 관찰되었으며, A 대립유전자 빈도는 매우 낮게 나타났다(한국축산학회지 v.51 no.3 , 2009년, pp.185 - 192, “소 FASN 유전자 변이의 연관불균형과 한우 도체형질에 미치는 영향”; 및 Journal of Animal Science and Technology 53(5) 389~395, 2011, “ 한우의 Fatty Acid Synthase (FASN)와 Acetyl CoA Carboxylase-α (ACACA) 유전자내의 단일염기변이가 한우집단내의 도체형질에 미치는 영향” 참조). 한편, 소의 FAS 유전자내 g.17924 G>A 염기서열 변이는 단백질 아미노산 구조에 변화를 주는 미스센스 돌연변이이다( G CC[알라닌]-> A CC[트레오닌]).
본 실험에서는 한우에서 FAS 염기서열을 분석하고, g.17924번째 염기서열에서 SNP를 확인하여, 상기 SNP(G/A)의 종류에 따라 근육위성세포를 분류하였다. 자세한 실험내용은 하기와 같다.
<2-1> 한우 genomic DNA 분리
먼저, 1.5mL 튜브에 500μL 핵 용해 용액(Nuclei Lysis Solution) 및 120μL 0.5M EDTA 용액(pH 8.0)을 준비하고 으깬 얼음 위에 놓은 다음, 10-20mg(0.5-1cm)의 근육 조직을 용액과 함께 튜브에 첨가하였다. 이후, 17.5μL 20mg/mL Proteinase K를 추가하고 10초 동안 균질화한 후 55℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 이후, 단백질 침전 용액 200μl를 추가하고, 20초 동안 볼텍싱하고 얼음 위에서 5분 동안 식힌 다음, 13,000-16,000 × g에서 6분 동안 원심분리하여 단백질을 침전시켰다. DNA 침전을 진행하기 위하여 이소프로판올이 함유된 새 튜브에 상기 원심분리하여 얻은 상층액을 첨가하여 부드럽게 섞은 후 13,000-16,000 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이후, 용액을 제거하고(DNA가 튜브에 부착됨) 실온의 70% 에탄올 600μl를 추가한 후 혼합하여 세척하였으며, 13,000-16,000 × g에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 흡입하여 제거하고 KimTech 티슈 위에 펠릿을 거꾸로 오도록 위치시키고 건조시켰다. 건조가 완료된 다음 DNA 재수화 용액(DNA Rehydration Solution) 100μl를 추가하여 DNA를 재수화시켰다. 샘플을 65℃에서 1시간 동안 방치한 다음 추가 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다.
<2-2> 중합효소연쇄반응(PCR)
하기 표 1의 조성을 갖는 조성물을 준비한 후 볼텍싱한 다음 원심분리하여 튜브 바닥에 침전된 PCR 반응 조성물을 수득하였다. 프라이머 세트(FAS g. 16024 A>G; Primer F: ACC TTG ACA CGG CTC AAC TC; Primer R: GTA GCC ATA GGT GGG ATC)를 이용하여 DNA를 증폭하였다. PCR 증폭 조건은 하기 표 2에서 나타내었으며, 30-40 사이클을 진행하였다. 증폭된 DNA는 아가로스겔 전기영동으로 확인하였다(PCR Product size: 127bp).
| Amount | Components |
| 14.4μl | Water (DEPC) |
| 2μl | h-taq buffer |
| 0.4μl | dNTP (Deoxynucleotide mix) |
| 1μl | Forward primer (F) |
| 1μl | Reverse primer (R) |
| 0.2μl | h-Taq |
| 4μl | DNA template |
| Purpose | Temperature | Time |
| Denature template | 95℃ | 15min |
| Denature template | 95℃ | 30sec |
| Anneal primers | 52℃ | 30sec |
| Extension | 72℃ | 40sec |
| Extension | 72℃ | 5min |
<2-3> PCR-RFLP(PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism)
0.5 ml 튜브에 상기 <2-2>의 PCR 반응산물(5 μL)을 첨가하고 5 μL의 효소 혼합물을 첨가하여 잘 섞어주었다. 하기 표 3에서 효소 혼합물의 구성성분 및 용량을 자세히 나타내었다. 이후, 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다.
제한효소로 처리된 산물을 3% 아가로스겔 전기영동을 통해 유전자형을 결정하였다. 간략하게는, 아가로스겔을 준비하고 30분 동안 굳힌 다음, 3 μL의 DNA ladder를 첫 번째 웰(well)에 넣고, 3μL 로딩 염료(6X LD)와 10mL 제한효소 처리 산물을 혼합한 후 DNA ladder 옆에 있는 웰(well)에 넣었다.
FAS 유전자내 티오에스터라아제(Thioesterase) 도메인 영역의 엑손 39번에 위치한 g.17924번째 염기서열이 G인 경우 PCR product는 제한효소(HhaI)에 의한 분해가 이루어지지 않아 전기영동 상에서 127bp 크기의 밴드를 확인할 수 있었으며, A인 경우 제한효소 분해로 인해 94bp 및 33bp 크기의 밴드를 확인할 수 있었다. 제한효소 분해로 인한 PCR product의 크기 확인을 통해, SNP(G/A)의 유전자형 종류에 따른 근육위성세포를 분류하였다.
| Amount | Components |
| 3.9 μL | Water |
| 1 μL | Buffer |
| 0.1 | HhaI(제한효소) |
| 5 μL | PCR product |
<실시예 3>
한우 유래 FAS 특정위치의 아미노산 변이에 따른 근육위성세포의 세포증식에 미치는 영향
상기 <실시예 2>에서는 한우 유래 FAS g.17924번째 염기서열에서 SNP를 확인하여, 상기 SNP(G/A)의 유전자형의 종류에 따라 근육위성세포를 분류하였다. 소의 FAS 유전자내 g.17924 G>A 염기서열 변이는 단백질 아미노산 구조에 변화를 주는 미스센스 돌연변이( G CC[알라닌]-> A CC[트레오닌])에 해당하는바, 상기 SNP(G/A)의 종류에 따라 아미노산 변이가 일어나게 된다. 본 실험에서는 이러한 아미노산 변이에 따른 근육위성세포에서의 세포증식에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
배양에 사용된 근육위성세포는 1×104의 세포를 각각의 세포 배양 디쉬에 분주하고, 37℃, 5% CO2의 농도로 배양하였다. 배지는 DMEM 배지에 3% horse serum을 첨가하여 사용하였다. 여기에 다양한 농도의 포도당과 올레산(oleic acid)을 첨가하여 96시간 동안 배양하였다(표 4 참조). 96시간 배양 후, 세포 수 측정기를 이용하여 증식된 근육위성세포의 수를 측정하였다.
| 처리구 | T1 | T2 | T3 |
| 포도당 (mM) | 0 | 12.5 | 25 |
| 올레산 (mM) | 100 | 100 | 100 |
그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열이 G인 경우(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 알라닌에 해당함), 배지에 글루코오스 및 올레산 첨가에 따른 근육위성세포의 증식에 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 반면에, FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열이 A인 경우(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 트레오닌에 해당함), 배지에 글루코오스 및 올레산 첨가에 따른 근육위성세포의 증식이 두드러지게 증대되는 것을 확인할 수 있었다.
참고로, 한우 집단에서는 FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열의 경우 G 대립유전자의 빈도는 매우 높게 관찰되며, A 대립유전자 빈도는 매우 낮게 나타난다(Minor Allele Frequency: 0.219). 이에, 한우에서 FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열이 A인 경우(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 트레오닌에 해당함)는 돌연변이에 해당한다.
상기와 같은 결과를 통해, 한우에서 유래된 근육위성세포 중 FAS 유전자내 g.17924번째 염기서열이 A를 갖는(서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 트레오닌에 해당함) 세포의 경우, 근육세포의 증식 시 세포증식능이 매우 우수한바 세포 배양육 제조를 위한 근육위성세포로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Use of Hanwoo derived fatty acid synthetase mutant to promote
muscle satellite cell proliferation and cell cultured meat
manufacturing method using the same
<130> NPDC-105065
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 305
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polypeptide sequence of hanwoo derived thioesterase domain
<400> 1
Phe Gly Ser Pro Ala Gln Ser His Thr Gln Leu Asn Leu Ser Thr Leu
1 5 10 15
Leu Val Asn Pro Glu Gly Pro Thr Leu Thr Arg Leu Asn Ser Val Gln
20 25 30
Ser Ser Glu Arg Pro Leu Phe Leu Val His Pro Ile Glu Gly Ser Thr
35 40 45
Thr Val Phe His Ser Leu Ala Ala Lys Leu Ser Ile Pro Thr Tyr Gly
50 55 60
Leu Gln Cys Thr Gly Ala Ala Pro Leu Asp Ser Ile Gln Ser Leu Ala
65 70 75 80
Thr Tyr Tyr Ile Glu Cys Ile Arg Gln Val Gln Pro Glu Gly Asn Tyr
85 90 95
Arg Ile Ala Gly Tyr Ser Tyr Gly Ala Cys Val Ala Phe Glu Met Cys
100 105 110
Ser Gln Leu Gln Ala Gln Gln Asn Ala Gly Pro Thr Asn Asn Ser Leu
115 120 125
Phe Leu Phe Asp Gly Ser His Thr Phe Val Met Ala Tyr Thr Gln Ser
130 135 140
Tyr Arg Ala Lys Leu Asn Pro Gly Cys Glu Ala Glu Ala Glu Ala Glu
145 150 155 160
Ala Met Cys Phe Phe Met Gln Gln Phe Thr Glu Ala Glu His Ser Arg
165 170 175
Val Leu Glu Ala Leu Leu Pro Leu Gly Asp Leu Glu Ala Arg Val Ala
180 185 190
Ala Thr Val Glu Leu Ile Val Gln Ser His Ala Gly Leu Asp Arg His
195 200 205
Ala Leu Ser Phe Ala Ala Arg Ser Phe Tyr His Lys Leu Arg Ala Ala
210 215 220
Glu Glu Tyr Thr Pro Arg Ala Thr Tyr His Gly Asn Val Thr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Ala Lys Met Gly Ser Ala Tyr Gln Glu Gly Leu Gly Ala Asp Tyr
245 250 255
Asn Leu Ser Gln Val Cys Asp Gly Lys Val Ser Val His Ile Ile Glu
260 265 270
Gly Asp His Arg Thr Leu Leu Glu Gly Ser Gly Leu Glu Ser Ile Leu
275 280 285
Ser Ile Ile His Ser Ser Leu Ala Glu Pro Arg Val Ser Val Arg Glu
290 295 300
Gly
305
<210> 2
<211> 915
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide sequence of hanwoo derived thioesterase domain
mutant
<400> 2
ttcggcagcc ctgcccaatc gcacacccag ctgaacctga gcaccctgct ggtgaacccc 60
gagggcccga ccttgacacg gctcaactcg gtgcagagct ccgagcggcc cctgttcctg 120
gtgcacccca tcgagggctc caccaccgtg ttccacagcc tggccaccaa gctcagcatc 180
cccacctatg gcctacagtg tacaggagcg gcacccctgg acagcatcca gagcctggcc 240
acctactaca tcgagtgcat caggcaagtg cagccagagg ggaactaccg catcgctggc 300
tactcctacg gggcctgcgt ggctttcgag atgtgctcac agctgcaggc ccagcagaac 360
gctggcccca cgaacaacag cctcttcctg tttgacggct cgcacacctt cgtgatggcc 420
tacactcaga gctaccgggc caagctgaac cccggctgcg aggcagaggc cgaggccgag 480
gccatgtgct tcttcatgca gcagttcacg gaggcggagc atagtagagt gctggaggcc 540
ctcctgcccc tcggggatct ggaggcgcgt gtggcagcca ccgtcgagct gatcgtgcag 600
agccacgcgg gcctggaccg gcacgcgctc agctttgctg cgcgttcctt ctaccacaag 660
ctgcgcgccg cggaggagta cacgccgcgg gctacctacc acggcaacgt gacgctgctg 720
cgcgccaaga tgggcagcgc ctaccaggag ggcctgggcg ccgactacaa tctgtcccag 780
gtgtgcgacg gcaaggtgtc tgtacacatc atcgagggcg accaccgcac gctgctggag 840
ggcagcggcc tggagtccat ccttagtatt attcacagct ccctggccga gccgcgcgtc 900
agcgtgcggg agggc 915
Claims (8)
- 한우 유래 지방산합성효소 변이체로,
상기 변이체는 서열번호 1로 표시되는 티오에스터라아제(Thioesterase) 도메인 영역의 아미노산 서열로부터 56번째 아미노산이 돌연변이되며,
상기 변이체는 근육위성세포의 증식을 촉진시키는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 한우 유래 지방산합성효소 변이체. - 제1항에 있어서,
상기 56번째 아미노산이 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로 치환되는 것을 특징으로 하는, 한우 유래 지방산합성효소 변이체. - 제1항의 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 유효성분으로 포함하는, 근육위성세포 증식 촉진용 조성물.
- 제1항의 한우 유래 지방산합성효소 변이체를 갖는 근육위성세포를 배지에서 증식시키는 단계를 포함하는, 세포 배양육 제조방법.
- 제4항에 있어서,
상기 배지는 올레산(oleic acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 배양육 제조방법. - 제4항에 있어서,
상기 단계 이후 증식된 근육위성세포를 근세포(myocyte) 및 근관세포(myotube)로 분화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 세포 배양육 제조방법. - 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 한우 유래 세포 배양육.
- 제7항의 한우 유래 세포 배양육을 포함하는 식품.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020220058614A KR20230158908A (ko) | 2022-05-12 | 2022-05-12 | 한우 유래 지방산합성효소 변이체의 근육위성세포 증식 촉진 용도 및 이를 이용한 세포 배양육 제조방법 |
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| KR20230158908A true KR20230158908A (ko) | 2023-11-21 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR101158475B1 (ko) | 2009-05-22 | 2012-06-20 | 충북대학교 산학협력단 | Ｆａｓｎ 유전자내의 한우육 품질 판별용 단일염기다형성 마커 및 이를 이용한 한우육 품질 판별방법 |
-
2022
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