CN101392255A

CN101392255A - 与猪肌肉品质性状相关的fto基因克隆及作为分子标记的应用

Info

Publication number: CN101392255A
Application number: CNA2008101972217A
Authority: CN
Inventors: 徐学文; 张莹; 刘榜; 赵书红; 李奎; 樊斌; 朱猛进; 余梅
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2028-10-10
Also published as: CN101392255B

Abstract

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择应用的与猪肌肉品质性状相关的分子标记及其应用。所述的分子标记由FTO基因克隆得到，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。在序列表SEQ ID NO：2的第37bp处有一个有一个A37－G37的碱基替换，该替换导致Bsh1236I PCR－RFLP酶切多态性。本发明还公开了扩增FTO基因完整cDNA序列和部分DNA序列所用的引物以及用于多态性检测的方法，为猪的标记辅助选择提供了一个新的分子标记。

Description

与猪肌肉品质性状相关的FTO基因克隆及作为分子标记的应用

技术领域

本发明属于家畜基因工程技术领域，具体涉及一种与猪肌肉品质相关的FTO基因克隆及作为分子标记的应用。

背景技术

猪肉是我国人民动物蛋白的主要来源。在过去数十年时间里，随着国外高瘦肉率和快生长速度种猪的引进，我国猪肉生产在数量上逐渐满足了市场的需求。但是，对瘦肉率和生长速度过度选择而培育的种猪在肌肉品质方面却不及中国地方猪。随着生活水平的提高和消费观念的改变，色、香、味俱佳且安全、营养的瘦肉越来越受到消费者的青睐。因此，肌肉品质的改良已成为当今优质猪育种工作的重要目标，相关分子标记的寻找是实现这一目标的重要手段。

肌肉品质是一个综合性状，常常通过肌肉pH值、肌内脂肪含量、大理石纹、系水力、剪切力、滴水损失、肉色、嫩度、肌纤维直径等指标进行度量。这些指标之间并不是独立的，而是彼此联系，共同决定最终的肌肉品质。对于猪肌肉品质等复杂性状的分子标记筛选通常采用QTL扫描结合候选基因克隆的策略，即首先构建一个资源群体，测定肌肉品质相关的各种指标，并进行全基因组的QTL扫描，再在QTL区域内采用功能候选基因法或位置克隆的策略筛选相应的标记。依据PigQTLdb(http://www.animalgenome.org/QTLdb/pig.html)的统计数据，与肌肉品质相关的QTL已经超过1000个，几乎分布在猪所有的染色体上，其中2号、4号、5号、6号、7号、11号、14号、15号和17号染色体上与肌肉品质相关的QTL最为密集。

尽管大量与肌肉品质相关的QTL被定位，但是影响肌肉品质的基因及分子标记研究却远远落后于此。目前，国内外已经鉴定的影响肌肉品质的主效基因包括：(1)RYRl基因(Fujii，J等，Identification of amutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia.Science，1991，253：448-451)，研究表明该基因的C1843T错义突变是导致猪产生应激综合症而发生肌肉品质下降的主要原因。(2)PRKAG3基因(Milan，D等，A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content inpig skeletal muscle.Science，2000，288：1248-1251)，研究表明该基因的一个突变是导致汉普夏猪产生“酸肉”的主要原因。这两个基因的致因突变均已被鉴定，且得到了很好的分子生物学解释，因此已被作为分子标记用于淘汰“氟烷”敏感基因和“酸肉”基因的育种实践中。

而其他一些与肌肉品质相关的基因尽管现在还没找到致因突变，但是却发现其多态与肌肉品质性状存在显著相关，这些基因包括：(1)CAST基因(Ciobanu，D C等，New alleles in calpastatin geneareassociated with meat quality traits in pigs.Journal of Animal Science，2004，82：2829-2839)，研究表明该基因的多个SNP与肌肉嫩度等多个肉质性状存在显著相关。(2)H-FABP基因(Gerbens，F等，The effectof adipocyte and heart fatty acid-binding protein genes on intramuscular fat and backfat content inMeishan crossbred pigs.Journal of Animal Science，2000，78：552-559)，研究表明该基因的突变与肌内脂肪含量存在显著相关。(3)CA3基因(Wang，HL等，Molecular characterization and association analysisof porcine CA3.Cytogenetic and Genome Research，2006，115：129-133)，研究表明该基因的突变与肌内脂肪含量及腿臀比例存在极显著相关。与已经定位的QTL相比，已经鉴定出致因突变或发现存在相关的基因数目远远不够，说明大量的与肌肉品质相关的基因有待进一步鉴定。

FTO(Fat mass and obesity associated)基因是近年来通过全基因组关联分析发现的与人类肥胖相关的一个新基因，其分子生物学功能目前尚未知晓。全基因组关联分析结果显示该基因与体质指数(BodyMass Index(BMI)：是用体重公斤数除以身高米数平方得出的数字，是目前国际上常用的衡量人体胖瘦程度以及是否健康的一个标准)显著相关(Frayling，T.M.，Genome-wide association studies provide newinsights into type 2 diabetes aetiology.Nature Reviews Genetics，2007，8：657-62)。目前在人FTO基因中已经鉴定出一系列SNP，其中部分SNP与糖尿病和BMI指数有极大关联(Dina，C.等，Variation in FTOcontributes to childhood obesity and severe adult obesity.Nature Genetics，2007，39：724-6)。SNPrs9939609就是其中的一个典型代表，它与人类二型糖尿病显著相关，每增加一个等位基因A，BMI平均增长0.4kg/m²(Shoulders，C.C.The FTO(fat mass and obesity-associated)gene：big in adipocytelipolysis？Journal of Lipid Research，2008，49：495-6.)。FTO基因在大多数组织中都有表达，但在下丘脑、脑垂体和肾上垂体前叶高度表达(Dina，C.等，Variation in FTO contributes to childhood obesity andsevere adult obesity.Nature Genetics，2007，39：724-6)。实时定量PCR检测FTO基因在小鼠各组织中的表达量揭示该基因对能量稳态的调控起主要作用(Fredriksson，R.等，The obesity gene，FTO，is ofancient origin，up-regulated during food deprivation and expressed in neurons of feeding-related nucleiofthe brain.Endocrinology，2008，149：2062-71.)，并且它在BMI不同的人体脂肪组织中的表达量是不同的，因此研究推测FTO基因通过中枢神经系统作用于脂肪细胞，起到解脂作用(Wahlen，K.等，Thecommon rs9939609 gene variant of the fat mass-and obesity-associated gene FTO is related to fat celllipolysis.Journal of Lipid Research，2008，49：607-11)。由此可见，FTO基因可能在脂肪沉积中发挥重要功能。但是目前，对猪FTO基因的研究尚未开展，该基因是否影响猪的脂肪沉积，从而影响猪肉品质也尚未可知。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对这个基因的突变位点进行了多态研究和关联分析，以期研究该基因的功能，并鉴定与肌肉品质相关的分子标记。

发明内容

本发明的目的在于克隆一种与猪肌肉品质相关的基因片段，为猪标记辅助选择提供一种分子标记。

本发明通过以下技术实现：

申请人克隆得到一种与猪肌肉品质相关的FTO基因片段，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所述。所获得的cDNA序列全长为4320bp，包含1518bp的完整CDS，编码505个氨基酸。

依据获得的如序列表SEQ ID NO：1所述cDNA序列设计引物，通过扩增和测序获得了FTO基因的第三外显子部分DNA序列，其序列如序列表SEQ ID NO：2所述。该序列长度为200bp，其中第37bp处有一个A37-G37的碱基突变，导致Bsh1236IPCR-RFLP多态性。

本发明设计了所述基因片段碱基突变的引物对，所述引物的正向引物为5′

GGGACTCCACAAAGAGGTTCA3′，反向引物为5′TTGCATCAGAGCCCTTCACT3′。

一种制备与猪肌肉品质性状相关FTO基因分子标记的方法，按照以下步骤：

用人FTO基因mRNA序列为探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后拼接猪EST-重叠群；根据EST-重叠群序列设计引物，通过扩增获得如序列表SEQ ID NO：1所述的mRNA序列；依据该mRNA序列设计引物扩猪基因组DNA，获得如序列表SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列。

本发明的具体实施方案如《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的与猪肌肉品质性状相关的FTO基因的mRNA序列。

序列表SEQ ID NO：2是本发明中用于Bsh12361 PCR-RFLP分型所用的猪FTO基因DNA序列片段。

图1：是本发明技术流程图。

图2：是本发明中用于Bsh1236IPCR-RFLP分型所用的猪FTO基因DNA序列片段，所述引物用下划线表示，第37位(A/G)代表A-G突变。

图3：是本发明克隆的猪FTO基因第3外显子的Bsh1236IPCR-RFLP的三种基因型电泳结果。图中：M：DNA分子量标准(DL2000)。

具体实施方式

实施例1 FTO基因的核苷酸序列克隆及SNP扫描

1.FTO基因的cDNA克隆

(1)引物设计

利用人FTO基因的mRNA序列(GenBank收录号：NM_001080432)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为90％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，利用DNAStar软件中的SeqMan程序构建猪FTO基因EST-重叠群，据此分别设计用于5’RACE和3’RACE以及用于编码区(CDS)及3’非翻译区(3’UTR)扩增的引物，引物DNA序列如表1所示：

表1：用于FTO基因cDNA克隆的引物序列设计

(2)RACE及RT-PCR扩增

参照TriZoL试剂盒(美国GIBCO公司产品)说明书步骤，利用该试剂盒从成年通城猪肌肉组织中提取总RNA；利用经DEPC处理的超纯水溶解总RNA，利用Dnase I酶(美国Promega公司产品)于37℃处理30分钟、并经等体积的酚-仿抽提进行RNA的纯化；通过核酸-蛋白质浓度测定仪(美国Beckman公司产品)测定RNA的浓度，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

利用RACE试剂盒(美国CLONTECH公司产品)首先进行cDNA第一链的合成，cDNA第一链合成之后首先以此产物为扩增模版，利用基因特异性外侧引物(FTO-5O和FTO-3O)及上述RACE试剂盒中的通用引物，用金牌快速Taq酶(北京博大泰克生物基因技术有限公司产品)进行第一轮PCR扩增，扩增体系按照该试剂盒说明书配置；扩增条件为：95℃ 5min；2^*(94℃，20sec，68℃，10sec，72℃，10sec)；3^*(94℃，20sec，65℃，10sec，72℃，10sec)；25^*(94℃，20sec，62℃，10sec，72℃，10sec)；72℃，5min；15℃，2min。在此基础上，将第一轮PCR扩增产物稀释100倍，以此稀释液为模版，利用基因特异性内侧引物(FTO-5I和FTO-3I)及RACE试剂盒中的内侧通用引物，用银牌快速Taq酶(北京博大泰克生物基因技术有限公司产品)进行第二轮PCR扩增，扩增体系按照说明书配置，PCR反应条件与第一轮扩增条件相同。

以上述cDNA第一链为扩增模板，利用FTO-CS与FTO-CR配对扩增FTO基因的编码区，利用FTO-US与FTO-UR配对扩增FTO基因的3’非翻译区，PCR反应均采用上述银牌快速Taq酶完成，扩增条件为：95℃ 5min；34^*(94℃ 20sec，60℃，10sec，72℃，15sec)；72℃，5min。

(3)产物克隆与测序

将RACE及RT-PCR扩增产物与pGEM-T载体(美国Promega公司产品)连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl SoulutionI，0.5μl的pGEM-T载体，2μl的PCR产物，于4℃冰箱连接过夜；无菌状态下取100～120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代—β-D—半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养；用牙签挑取单克隆置于1.5ml Eppendorf管中，37℃培养6～8小时，取1μl菌液作为PCR扩增的模版，利用RACE扩增的内侧引物(GSP5I/GSP3I)配合通用引物进行PCR扩增，有阳性扩增产物者即为阳性克隆子；阳性菌液送由北京奥科生物技术有限公司完成测序。

猪FTO基因cDNA克隆的结果：通过Seqman拼接测序序列并去掉外源的通用引物已获得猪FTO基因cDNA序列4320bp，通过ORF预测发现猪FTO基因编码505个氨基酸。

2.FTO基因的SNP扫描

利用上述RNA提取及纯化方法，同时利用外来猪长白猪和中国地方猪通城猪两种不同来源的肌肉组织提取总RNA并纯化，采用M-MLV反转录酶(美国Promega公司产品)制备cDNA。利用上述用于猪FTO基因CDS及3’UTR扩增的引物同时扩增两种来源的cDNA，PCR产物经天根生化科技(北京)有限公司的纯化试剂盒回收后，直接送交北京奥科生物技术有限公司完成测序。利用DNAStar软件的Seqman程序进行拼接和序列比对，搜寻其中的SNP位点。

FTO基因的SNP扫描结果：通过比较两种扩增产物测序结果分析，发现了位于第三外显子的90bp处的一个A-G碱基突变，位于第三外显子的471bp处的一个C-G碱基突变和位于第四外显子的62bp处的一个T-C碱基突变。

实施例2 FTO基因A37G Bsh1236I PCR-RFLP基因型遗传多样性检测及与肉质性状的关联分析

1.Bsh1236IPCR-RFLP检测方法的建立

(1)引物设计

针对发现的第三外显子的90bp处A-G碱基突变，设计了下列扩增引物：

FTO-S：5′GGGACTCCACAAAGAGGTTCA3′，

FTO-R：5′TTGCATCAGAGCCCTTCACT3′。

依据突变位点在扩增片段中位于第37位，将此突变命名为A37G。

(2)PCR扩增条件

PCR反应总体积10μl，其中包含约100ng猪基因组DNA，含1×PCR Buffer，1.5mmol/L MgCl₂，150μmol每种dNTP，0.3μmol每条引物，1单位Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序是：94℃ 5min，(94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 20s)循环35次，72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)Bsh1236IRFLP基因分型

PCR产物酶切反应体积是5μl，其中10×R Buffer 0.5μl，PCR产物2μl，限制性内切酶Bsh1236I为2U，用灭菌水补充至5μl，将样品混匀后离心，37℃水浴10小时，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。

利用引物FTO-S与FTO-R配对扩增，获得扩增产物大小为200bp，序列如图2所示。分析发现该片段包含的A37G可以引起Bsh1236I限制性内切酶识别位点(5-CGCˇG-3)的丢失与保留，即当该位点为A等位基因时，不能被Bsh1236I所酶切，而当该位点为G等位基因时，能够被Bsh1236I酶所切开。因此，AA纯合型个体不被酶切，形成一条大小为200bp的片段，而GG纯合型个体酶切产生的片段大小分别为164bp和36bp，AG杂合型则形成三种大小的条带。因此，通过PCR扩增首先获得200bp的产物，经过酶切可以区分三种不同的基因型个体，部分电泳检测结果如图2所示。

2.遗传多样性检测

利用上述建立的FTO基因A37G突变Bsh1236I PCR-RFLP检测方法在国外三个商业品种和国内七个地方品种共213个无亲缘关系的个体中检测两种等位基因的频率，结果如表2所示：

表2.FTO基因A37G突变在不同品种中等位基因频率检测结果

通过上述等位基因检测结果可以看出，国外品种的猪A等位基因占优势，而国内地方品种中G等位基因为优势等位基因，说明该突变在国内外瘦肉型与脂肪型猪中存在相对的差异。

2.标记性状关联分析

利用组建的通城猪群(通城猪为湖北省通城县地方猪种，为公开推广应用的一个地方猪品种)、长白猪群和大白猪群进行性状关联分析，制备了195个DNA样品用于基因型检测，并建立了如下线性模型：

Y＝μ+X_genotype+X_breed+X_batch+ε_ijk，

其中，Y是性状观察值，μ为总体均数，X_genotype为基因型效应，X_batch为性别效应，X_breed为组合的效应，ε_ijk为随机误差。

在一个通城猪实验群体中对FTO基因第三外显子Bsh1236 I PCR-RFLP多态性位点与部分生产与肉质性状进行了关联分析，这些肉质性状包括肌肉pH值、大理石纹评分、滴水损失、剪切力、肌肉颜色等。在所检测的195个个体中，AA型个体为24个，AG型个体为62个，而GG型个体为109个，其中AA型个体滴水损失显著高于GG型个体(P＝0.0179)，基因型间性状观察值的简单均数和标准差分析结果总结如表3所示。

表3.猪FTO基因SNPA37G不同基因型与性状关联分析结果

* 代表达到0.05显著水平。

序列表

<110>华中农业大学

<120>与猪肌肉品质性状相关的FTO基因克隆及作为分子标记的应用

<130>

<141>2008-10-07

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4320

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(4320)

<223>

<220>

<221>polyA_signal

<222>(4271)..(4276)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(223)..(1740)

<223>

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(222)

<223>

<220>

<221>3’UTR

<222>(1741)..(4320)

<223>

<400>1

<210>2

<211>505

<212>PRT

<213>猪(Sus scrofa)

<400>2

<210>3

<211>200

<212>DNA

<213>猪(Sus scrofa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(200)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(181)..(200)

<223>

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(37)..(37)

<223>

<400>3

Claims

1、一种与猪肌肉品质性状相关的FTO基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，它的部分核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所述。

2、根据权利要求1所述的与猪肌肉品质性状相关的FTO基因片段，其特征在于：序列表SEQ ID NO：2的第37bp处为A37-G37的碱基突变，导致Bsh1236I-RFLP多态性。

3、检测权利要求2所述与猪肌肉品质性状相关的FTO基因片段碱基突变的引物对，所述引物的正向引物为5′GGGACTCCACAAAGAGGTTCA 3′，反向引物为5′TTGCATCAGAGCCCTTCACT 3′。

4、权利要求1或2所述的与猪肌肉品质性状相关的FTO基因片段在猪标记辅助选择中的应用。

5、权利要求3所述的与猪肌肉品质性状相关的FTO基因片段碱基突变引物对在猪标记辅助选择中的应用。

6、制备如权利要求1或2所述的基因片段的方法，按照以下步骤：

用人FTO基因cDNA为探针，作同源序列筛选，获得同源性90％以上的表达序列标签(EST)；然后拼接猪EST-重叠群；根据EST-重叠群序列设计引物，通过扩增获得如序列表SEQ ID NO：：1所述的cDNA序列；依据该cDNA序列设计引物扩增猪基因组DNA，获得如序列表SEQ ID NO：2所述的核苷酸序列。