CN104098687A - 一种猪fto重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

一种猪fto重组蛋白及其制备方法 Download PDF

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CN104098687A CN201410269855.4A CN201410269855A CN104098687A CN 104098687 A CN104098687 A CN 104098687A CN 201410269855 A CN201410269855 A CN 201410269855A CN 104098687 A CN104098687 A CN 104098687A
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陈小玲
黄志清
周波
罗燕柳
贾刚
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Sichuan Agricultural University
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Abstract

本发明公开了一种猪FTO重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：提取猪背最长肌的总RNA并进行反转录，得到反转录的cDNA，进行PCR扩增；构建含有PCR扩增产物的重组质粒，重组质粒在C端融合了一段带有6×Hi s纯化标签；构建猪FTO表达菌；培养猪FTO表达菌，使用IPTG诱导猪FTO表达菌，产生粗猪FTO重组蛋白，纯化粗猪FTO重组蛋白，得到猪FTO重组蛋白。本发明利用RT-PCR技术从猪背最长肌中克隆了猪FTO基因的序列，并实现了其在大肠杆菌中的高效表达，该方法具有技术简单、成本低、操作快速、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白易于纯化和具有生物学活性。

Description

一种猪FTO重组蛋白及其制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种猪FTO重组蛋白的制备方法。
背景技术
猪肉是人类膳食的重要组成部分，占肉产量的60％以上。近年来，随着遗传育种和外来良种猪的引入，显著提高了猪的生长，但随之引起猪肉品质的严重下降。随着人们生活水平的提高，消费者对猪肉品质提出更高的要求，因此猪肉肉质也越来越被养猪业者所关注。肌内脂肪(intramuscular fat，IMF)含量是影响肉品质的重要因素，与肉的色泽、嫩度和风味等有关。猪的肉质性状是由多基因控制的，因此深入挖掘影响肌内脂肪沉积的基因将成为今后肉品质性状研究的热点。
脂肪量与肥胖相关基因(Fat mass and obesity associated gene，FTO)是2007年首次通过外显子捕获分析方法从患有脚趾融合(Fusedtoes，Ft)的小鼠上克隆出来的，通过全基因组扫描技术发现的首个与普通人群肥胖相关的候选基因。在人和鼠上的研究发现，该基因在控制食欲和能量消耗方面具有重要作用。FTO基因敲除小鼠(FTO-/-与FtoI367F)与野生型小鼠相比，体重和脂肪含量均显著降低，表明FTO基因与脂肪沉积密切相关。
猪FTO基因的研究起步较晚，该基因定位在6号染色体上，这一染色体区域被认为是调控许多脂肪性状的数量性状位点的区域。猪FTO基因cDNA全长为1542bp，其中ORF为1518bp，编码一个含505个氨基酸的蛋白。生物信息学方法分析该基因的核苷酸序列和氨基酸序列在人、鼠、猪以及其他哺乳动物之间高度保守。FTO蛋白隶属于二价铁离子和α-酮戊二酸的一种双加氧酶，参与DNA修复、脂肪酸代谢和翻译后修饰。通过分析FTO基因在动物不同组织中的分布发现，该基因主要作用于脑部组织，尤其是下丘脑和海马部位，调节食欲和能量代谢。
基因组关联分析发现，FTO基因序列中含有大量单核苷酸多态性位点。研究发现，FTO基因的单核苷酸多态性与人肥胖有很强的相关性。在猪上，国内外大量研究表明，FTO基因的单核苷酸多态性位点与肌内脂肪沉积存在显著相关性。由此可见，FTO基因可能在肌内猪脂肪沉积中发挥重要的作用。但是目前，对猪FTO基因的功能的研究尚未开展，该基因是否影响猪的肌内脂肪沉积而影响猪肉品质也仍不清楚。因此，获得具有活性的猪FTO重组蛋白对于开展其生物学功能及分子机制的研究具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪FTO重组蛋白的制备方法。
1.本发明所采用的技术方案是，一种猪FTO重组蛋白的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、提取猪背最长肌的总RNA并进行反转录，得到反转录的cDNA，进行PCR扩增；
步骤2、构建含有步骤1的PCR扩增产物的重组质粒pET30a-FTO，所述重组质粒pET30a-FTO在C端融合有6×His纯化标签；
步骤3、将步骤2获得的重组质粒pET30a-FTO加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态细胞中，于冰上放置28min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素的LB培养基中培养1h后涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃条件下培养过夜，得到猪FTO表达菌pET30a-FTO/BL21；
步骤4、培养猪FTO表达菌pET30a-FTO/BL21，使用IPTG诱导猪FTO表达菌pET30a-FTO/BL21，产生粗猪FTO重组蛋白，其中IPTG诱导条件为IPTG浓度0.75mM，诱导时间为4h；
步骤5、纯化粗猪FTO重组蛋白，得到猪FTO重组蛋白，所述猪FTO重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的特点还在于，
2.步骤1具体按照以下步骤实施：
无菌条件下取5-8g猪背最长肌样品，剪碎后于研钵中加液氮充分研磨，再将研磨样置于无菌去RNA酶的1.5mL离心管中，加1mLTrizol剧烈摇晃使粉末充分溶解，4℃12,000g离心10min，移上清至一新的1.5mL离心管，加0.2mL氯仿后剧烈晃动15s，室温放置3min后4℃12,000g离心15min，移上清至一新的1.5mL离心管，加0.4mL冰预冷的异丙醇，上下颠倒6-8次后室温静置10min，4℃12,000g离心10min，弃上清，加1mL75％乙醇洗涤沉淀一次，4℃12,000g离心5min，弃上清，真空抽干后加适量DEPC水溶解沉淀；取RNA样品于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余的RNA样品于-80℃保存备用；取1μg总RNA，采用TaKaRa公司PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒将其反转录成cDNA。
PCR扩增具体按照以下步骤实施：以步骤1中的反转录的cDNA为模板，利用上游引物Fo-Pet30-Nde-F：5’-GGAATTCCATATGAAGCGAACCCCAACCGCCGAG-3’(含NdeI)和下游引物Fo-Pet30-Xho-R：5’-CCGCTCGAGGGGTTTGGCTTCCAGAAGCAG-3’(含XhoI))进行PCR扩增，其中，PCR扩增反应条件为94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃100s，35个循环；72℃7min。
步骤2中构建含有步骤1的PCR扩增产物的重组质粒pET30a-FTO，具体为：用上海生工UNIQ-10柱回收试剂盒对所扩增的PCR产物进行切胶回收。将切胶回收后的PCR产物和pET30a载体分别用NdeI和XhoI进行双酶切，用T4连接酶将两个双酶切产物于16℃连接3h左右，再将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，于37℃培养过夜；挑取出单菌落，即为重组质粒pET30a-FTO，在表达载体pET30a(+)多克隆位点(MCS)的NdeI和XhoI插入了不含终止密码子的猪FTO基因CDS区，使重组表达载体pET30a(+)-pFTO的C端融合了6×His标签。
3.纯化步骤为：
a.将猪FTO重组蛋白表达液于6,000g、4℃离心8min，采用Ni-Denature-GuHCl缓冲液(100mM NaH2PO4，300mM NaCl，6MGuHCl，pH8.0)溶解菌体，10,000g4℃离心20min；收集上清液，过0.45μm滤膜；
b.用10倍体积Ni-Denature-urea缓冲液(100mM NaH2PO4，300mM NaCl，8M urea，pH8.0)平衡柱子，控制流速为1mL/min；
c.加样于柱子上，流速控制为0.5-1mL/min；
d.加10倍柱体积的Ni-Denature-urea缓冲液洗柱子；
e.加5倍柱体积的Ni-Denature-250缓冲液(100mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM Imidazole，8M urea，pH8.0)洗脱柱子，控制流速为1mL/min，收集洗脱液；猪FTO重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，含猪FTO蛋白序列、XhoI酶切位点对应的氨基酸序列和6个组氨酸序列。
本发明的有益效果是：利用RT-PCR技术从猪背最长肌中克隆了猪FTO基因的序列，并实现了其在大肠杆菌中的高效表达，表达产物猪FTO重组蛋白具有明显的生物学活性。该方法具有技术简单、成本低、操作快速、蛋白表达量高等特点，并且制备的重组蛋白易于纯化和具有生物学活性。
附图说明
图1是本发明猪FTO基因克隆图；M：DNA标准分子量；1：PCR扩增产物
图2是本发明猪FTO基因克隆测序结果及其氨基酸序列图；
图3是本发明图3pET30a-pFTO重组表达载体的构建图谱；
图4是本发明猪FTO重组蛋白优化条件下表达产物的SDS-PAGE电泳图；
图5是本发明猪FTO重组蛋白的纯化电泳图；M：蛋白质分子量标准；1：变性条件下重组蛋白纯化结果；2：IPTG诱导表达结果；3：重组子未诱导表达结果；
图6是本发明猪FTO重组蛋白的Western blot分析图；
图7是本发明猪FTO重组蛋白的活性分析图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明还提供一种猪FTO重组蛋白的制备方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、提取猪FTO基因的总RNA并进行反转录，得到反转录的cDNA，进行PCR扩增，
步骤2、构建含有步骤1中的PCR扩增产物的重组质粒pET30a-FTO；
步骤3、将步骤2获得的重组质粒pET30a-FTO加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态中，于冰上放置28min后于42℃水浴热击90s；加入200μL无抗生素的LB培养基中培养1h后涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃条件下培养过夜，挑单个菌落培养后即为猪FTO表达菌，命名为pET30a-FTO/BL21。
步骤4、将猪FTO表达菌pET30a-FTO/BL21接种于LB培养基中，摇菌过夜后再转接于新的LB培养基中，摇菌至OD600为0.4-0.6之间，然后选择不同的诱导条件进行诱导表达，产生表达量最高的猪FTO重组蛋白；其中，最适诱导条件为：IPTG浓度0.75mM，诱导时间为4h。
步骤5、用Ni-IDA亲和层析柱纯化猪FTO重组蛋白，并对纯化的猪FTO重组蛋白进行Western blot鉴定。
步骤6、将纯化的猪FTO重组蛋白经稀释法进行复性，并研究了其对3T3-L1前体脂肪细胞增殖的影响，表明猪FTO重组蛋白能影响3T3-L1前体脂肪细胞的增殖，得到有活性的猪FTO重组蛋白。
实施例1
1、原核表达载体pET30a-FTO的构建及鉴定
1.1猪背最长肌RNA提取和反转录
无菌条件下取5-8g猪背最长肌样品，剪碎后于研钵中加液氮充分研磨，再将研磨样置于无菌去RNA酶的1.5mL离心管中，加1mLTrizol剧烈摇晃使粉末充分溶解，4℃12,000g离心10min，移上清至一新的1.5mL离心管，加0.2mL氯仿后剧烈晃动15s，室温放置3min后4℃12,000g离心15min，移上清至一新的1.5mL离心管，加0.4mL冰预冷的异丙醇，上下轻轻颠倒6-8次后室温静置10min，4℃12,000g离心10min，弃上清，加1mL75％乙醇洗涤沉淀一次，4℃12,000g离心5min，弃上清，真空抽干后加适量DEPC水溶解沉淀。取RNA样品于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余的RNA样品于-80℃保存备用。取1μg总RNA，采用TaKaRa公司PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒将其反转录成cDNA。
1.2猪FTO基因扩增
参照GenBank登录号JX873956的序列设计上游引物Fo-Pet30-Nde-F：5’-GGAATTCCATATGAAGCGAACCCCAACCGCCGAG-3’(含NdeI)(SEQ ID：4)和下游引物Fo-Pet30-Xho-R：5’-CCGCTCGAGGGGTTTGGCTTCCAGAAGCAG-3’(含XhoI且不含终止密码子)(SEQ ID：5)。
以1.1中反转录的cDNA为模板，利用所设计的引物(上游引物Fo-Pet30-Nde-F：5’-GGAATTCCATATGAAGCGAACCCCAACCGCCGAG-3’(含NdeI)和下游引物Fo-Pet30-Xho-R：5’-CCGCTCGAGGGGTTTGGCTTCCAGAAGCAG-3’(含XhoI)进行PCR扩增。反应条件为94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃100s，35个循环；72℃7min。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。由图1可见，在1500bp左右处有一清晰的亮带，与预期大小吻合。
1.3构建重组质粒pET30a-FTO
用上海生工UNIQ-10柱回收试剂盒对所扩增的PCR产物进行切胶回收。将切胶回收后的PCR产物和pET30a(+)载体(购自Novagen公司)分别用NdeI和XhoI进行双酶切，用T4连接酶将两个双酶切产物于16℃连接3h左右，再将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)，于37℃培养过夜。随机挑取长出的单菌落若干，以1.2中的引物进行菌落PCR鉴定，并按1.2中PCR扩增反应条件进行。PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。挑取2-3个鉴定为阳性克隆的单菌落测序，如图2所示，结果表明，猪FTO基因编码区片段大小1518bp，编码505个氨基酸，其猪FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所编码完成的猪FTO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所获得的重组质粒命名为pET30a-FTO，重组质粒也是上文所指的原核表达载体。在表达载体pET30a(+)多克隆位点(MCS)的NdeI和XhoI插入了不含终止密码子的猪FTO基因CDS区，使重组表达载体pET30a(+)-pFTO的C端融合了6×His标签便于蛋白纯化；且所构建的重组质粒pET30a-FTO在猪FTO蛋白的氨基酸C端融合了pET30a(+)载体上一段带有6×His纯化标签，便于后续的蛋白纯化。重组质粒pET30a-FTO的构建图谱见图3。
实施例2
2、猪FTO重组蛋白的表达
2.1重组质粒pET30a-FTO的提取
挑取测序成功的单菌落接种到4mL含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)中，250rpm37℃振荡培养过夜，按照OMEGA bio-tek公司的E.Z.N.A质粒小量提取试剂盒进行重组质粒的提取。质粒提取完成后将其做好标记放入-20℃冰箱保存备用。
2.2重组蛋白的诱导条件的优化和鉴定
对诱导剂IPTG浓度和诱导时间进行了优化
将2.1提取的重组质粒pET30a-FTO加入到冰预冷的大肠杆菌BL21(购自天根生化科技(北京)有限公司)感受态中，于冰上放置28min后于42℃水浴热击90s；加入200μL无抗生素的LB培养基中培养1h后涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃条件下培养过夜，挑单个菌落培养后即为猪FTO表达菌，命名为pET30a-FTO/BL21。将FTO表达菌pET30a-FTO/BL21接种于3mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、250rpm摇菌过夜。取活化后的菌液按1％转接于装有50mLLB培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，摇菌至OD600为0.4-0.6之间，然后选择不同的诱导条件进行诱导表达，得到高表达量的猪FTO重组蛋白。诱导表达后收集菌体，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况，以确定最优的诱导条件。由图4可知，最优的诱导条件为：IPTG浓度0.75mM，诱导时间为4h，在此条件下可获得表达量最高的猪FTO重组蛋白。
2.3猪FTO重组蛋白的纯化
蛋白纯化参照上海生物工程技术有限公司的Ni-IDA琼脂糖亲和层析柱中的变性条件(Ni-Denature-GuHCl法)纯化蛋白的方法对猪FTO重组蛋白进行纯化。步骤如下：
a.将猪FTO重组蛋白表达液于6,000g、4℃离心8min，采用Ni-Denature-GuHCl缓冲液(100mMNaH2PO4，300mM NaCl，6MGuHCl，pH8.0)溶解菌体，10,000g4℃离心20min。收集上清液，过0.45μm滤膜；
b.用10倍体积Ni-Denature-urea缓冲液(100mM NaH2PO4，300mM NaCl，8M urea，pH8.0)平衡柱子，控制流速为1mL/min；
c.加样于柱子上，流速控制为0.5-1mL/min；
d.加10倍柱体积的Ni-Denature-urea缓冲液洗柱子；
e.加5倍柱体积的Ni-Denature-250缓冲液(100mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM Imidazole，8M urea，pH8.0)洗脱柱子，控制流速为1mL/min，收集洗脱液；
猪FTO重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，含猪FTO蛋白序列、XhoI酶切位点对应的氨基酸序列和6个组氨酸序列。将纯化的猪FTO重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图5所示，目的蛋白纯化几乎达100％，通过与蛋白Marker的对照可以看出，目的蛋白的分子量为56kDa左右，与理论预测的大小相符。1LLB培养基可获得猪FTO重组蛋白1.8mg。
2.4猪FTO重组蛋白的WesternBlot鉴定
纯化的猪FTO重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转移到硝酸纤维素膜上后，用封闭液(含3％脱脂奶粉的1×TBS/T)于杂交炉中室温最低速转动1h进行封闭，加入一抗(ant-His(c-term)antibody)(1:2000)，于4℃过夜孵育，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG的二抗(1:5000)，于杂交炉中室温低速转动孵育1h，先后用适量1×TBS/T和PBS漂洗硝酸纤维素膜，去除残留的PBS，按每cm2膜面积加入0.125mL化学发光底物，室温下反应5min；去除过多的化学发光底物，置于凝胶成像仪中拍照。如图6所示，可见一条特异性反应条带，表明重组表达产物可被抗体所识别，本试验所获得的表达产物为猪FTO重组蛋白。
2.5纯化蛋白的复性
将2.3中变性纯化的目的蛋白装入透析袋，连续用含6mmol/L脲素的PBS缓冲液，含4mmol/L脲素的PBS缓冲液，含2mmol/L脲素的PBS缓冲液和PBS缓冲液分别于4℃透析，每步复性24h。复性完的蛋白收集后放-20℃保存。
实施例3
3、猪FTO重组蛋白的活性检测
将实验室冻存的3T3-L1前体脂肪细胞复苏后用完全生长培养液(DMEM/10％FBS/S/P)于37℃、5％CO2条件下培养，每2d换液一次，当细胞生长至70％-80％汇合时进行计数，同时按每孔1×104个细胞铺板到24孔细胞培养板中，继续用完全生长培养液于37℃、5％CO2培养，每2d换液一次。48h后，分别添加0μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL复性的纯化猪FTO重组蛋白。24h后，按Invitrogen公司的EdU增殖分析试剂盒(EdU ImagingKits)说明书进行细胞增殖分析。结果如图7所示，猪FTO重组蛋白能影响3T3-L1前体脂肪细胞的增殖，以2μg/mL蛋白处理组影响显著。表明所获得的猪FTO重组蛋白具有很好的生物学活性。
序  列  表
<110>  四川农业大学
　　　
<120>  一种猪FTO重组蛋白的制备方法
 
<130>  2014
 
<160>  5    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  505
<212>  PRT
<213>  猪种（Sus scrofa）
 
<400>  1
 
Met Lys Arg Thr Pro Thr Ala Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Lys Lys
1               5                   10                  15     
Leu Arg Leu Leu Glu Glu Leu Glu Asp Thr Trp Leu Pro Tyr Leu Thr
            20                  25                  30         
Pro Lys Asp Asp Glu Phe Tyr Gln Gln Trp Gln Leu Lys Tyr Pro Lys
        35                  40                  45             
Leu Ile Leu Arg Glu Ala Gly Ser Val Pro Glu Gly Leu His Lys Glu
    50                  55                  60                 
Val Gln Glu Ala Phe Leu Ala Leu His Lys His Gly Cys Leu Phe Arg
65                  70                  75                  80 
Asp Leu Val Arg Ile Gln Gly Lys Asp Leu Leu Thr Pro Val Ser Arg
                85                  90                  95     
Leu Leu Ile Gly Asn Pro Gly Cys Thr Tyr Lys Tyr Leu Asn Thr Arg
            100                 105                 110        
Leu Phe Thr Val Pro Trp Pro Val Lys Gly Ser Asp Ala Lys Tyr Asn
        115                 120                 125             
Glu Ala Glu Ile Gly Ala Ala Cys Gln Thr Phe Leu Lys Leu Asn Asp
    130                 135                 140                
Tyr Leu Gln Ile Glu Thr Ile Gln Ala Leu Glu Glu Leu Ala Ala Lys
145                 150                 155                 160
Glu Lys Ala Asn Ile Asp Thr Val Pro Val Cys Ile Gly Pro Asp Phe
                165                 170                 175    
Pro Arg Val Gly Met Gly Ser Ser Phe Asp Gly His Asp Glu Val Asp
            180                 185                 190        
Arg Lys Ser Arg Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Leu Leu Asn Phe Met Asp
        195                 200                 205            
Pro Gln Lys Met Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Pro Tyr Phe Gly Met Gly
    210                 215                 220                 
Lys Met Ala Val Ser Trp His His Asp Glu Asn Leu Val Asp Arg Ser
225                 230                 235                 240
Ala Val Ala Val Tyr Asn Tyr Ser Cys Glu Gly Pro Glu Glu Glu Ser
                245                 250                 255    
Glu Asp Asp Pro Gln Leu Glu Gly Arg Asp Pro Asp Val Trp His Val
            260                 265                 270        
Gly Phe Lys Ile Ser Trp Asp Ile Glu Thr Pro Gly Leu Ala Ile Pro
        275                 280                 285            
Leu His Gln Gly Asp Cys Tyr Phe Met Leu Asp Asp Leu Asn Ala Thr
    290                 295                 300                
His Gln His Cys Val Leu Ala Gly Leu Pro Pro Arg Phe Ser Ser Thr
305                 310                 315                 320
His Arg Val Ala Glu Cys Ser Thr Gly Thr Leu Asp Tyr Ile Leu Gln
                325                 330                 335    
Arg Cys Gln Leu Ala Leu Gln Asn Val Arg Asp Glu Ala Asp Ser Gly
            340                 345                 350        
Glu Val Ser Leu Lys Ser Leu Glu Pro Ala Val Leu Lys Gln Gly Glu
        355                 360                 365            
Glu Ile His Asn Glu Val Glu Phe Glu Trp Leu Arg Gln Phe Trp Phe
    370                 375                 380                
Gln Gly Asn Arg Tyr Lys Lys Cys Thr Asp Trp Trp Cys Gln Pro Met
385                 390                 395                 400
Thr Gln Leu Glu Glu Leu Trp Lys Lys Met Glu Gly Ala Thr His Ala
                405                 410                 415    
Val Leu Arg Glu Val Arg Arg Glu Gly Ala Pro Val Glu Gln Ser Ser
            420                 425                 430        
Asp Ile Leu Thr Ala Ile Leu Ala Val Leu Thr Thr Arg Gln Asn Leu
        435                 440                 445            
Arg Arg Glu Trp His Ala Arg Cys Gln Ser Arg Ile Ala Arg Thr Leu
    450                 455                 460                
Pro Val Asp Gln Lys Pro Glu Cys Arg Pro Tyr Trp Glu Lys Asp Asp
465                 470                 475                 480
Pro Ser Met Pro Leu Pro Phe Asp Leu Thr Asp Thr Val Ala Glu Leu
                485                 490                 495    
Arg Gly Leu Leu Leu Glu Ala Lys Pro
            500                 505
 
<210>  2
<211>  1518
<212>  DNA
<213>  猪FTO基因核苷酸序列
 
<400>  2
atgaagcgaa ccccaaccgc cgaggaacga gagcgcgaag ctaagaaact gaggcttctt       60
 
gaagagctgg aagacacttg gcttccttat ctgaccccca aagatgatga attctatcag      120
 
cagtggcagc tgaaataccc taagctaatt ctccgagaag caggcagcgt ccctgaggga      180
 
ctccacaaag aggttcaaga agccttcctc gcactgcaca agcatggctg cttatttcgg      240
 
gacctggtca ggatccaagg caaagatttg ctcacgccag tatctcgcct cctcattggt      300
 
aaccccggct gcacctacaa gtacctgaac accaggctct tcacggtccc ctggccagtg      360
 
aagggctctg atgcaaagta caatgaggcc gagataggcg ccgcctgcca gaccttcctc      420
 
aagctcaacg actacctgca gattgagacc atccaggcgc tggaggaact cgctgccaag      480
 
gagaaagcca atatcgacac cgtgccggtg tgtataggtc cagatttccc cagggtcggc      540
 
atggggtcat cctttgacgg gcatgacgag gtggacagga agagcagagc cgcctacaac      600
 
ctaactttgt tgaacttcat ggatccccag aaaatgccgt acctgaaaga ggagccctac      660
 
tttggcatgg ggaagatggc tgtgagctgg catcacgatg aaaatctggt ggacaggtca      720
 
gcggtggcag tgtacaatta tagctgtgaa ggccctgaag aggaaagcga ggatgatccc      780
 
cagctcgaag gcagagatcc cgatgtgtgg catgttggct ttaagatctc atgggacata      840
 
gagacccctg gtttggcgat accccttcac caaggagact gctactttat gctggatgat      900
 
ctcaatgcca cccaccaaca ctgtgttttg gctggtttac caccccggtt tagttccacc      960
 
caccgagtgg ccgagtgctc gacgggaacc ttggattaca tcttacagcg ctgccagttg     1020
 
gccctgcaga atgtccgtga tgaggcggac agtggtgaag tctctttgaa atccttggag     1080
 
cctgcggttt tgaaacaagg agaagaaatc cacaacgagg tcgagtttga gtggctgaga     1140
 
cagttttggt ttcaaggcaa tcgatacaaa aagtgcaccg attggtggtg tcaacccatg     1200
 
actcagctgg aagagctttg gaagaagatg gaaggtgcga cccatgctgt gcttcgtgaa     1260
 
gttaggagag agggggcccc tgtggaacag agcagtgaca tcctgactgc catcctagcc     1320
 
gtgctcacca ctcgccagaa cctgaggagg gagtggcatg ccaggtgcca gtcccgaatt     1380
 
gcccgaactc tgcctgtgga ccagaagcca gaatgccggc cgtattggga aaaggatgat     1440
 
ccctccatgc ctctgccgtt tgatctcaca gacactgtgg ctgaactcag aggtctgctt     1500
 
ctggaagcca aaccctag                                                   1518
 
 
<210>  3
<211>  513
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  3
 
Met Lys Arg Thr Pro Thr Ala Glu Glu Arg Glu Arg Glu Ala Lys Lys
1               5                   10                  15     
Leu Arg Leu Leu Glu Glu Leu Glu Asp Thr Trp Leu Pro Tyr Leu Thr
            20                  25                  30         
Pro Lys Asp Asp Glu Phe Tyr Gln Gln Trp Gln Leu Lys Tyr Pro Lys
        35                  40                  45              
Leu Ile Leu Arg Glu Ala Gly Ser Val Pro Glu Gly Leu His Lys Glu
    50                  55                  60                 
Val Gln Glu Ala Phe Leu Ala Leu His Lys His Gly Cys Leu Phe Arg
65                  70                  75                  80 
Asp Leu Val Arg Ile Gln Gly Lys Asp Leu Leu Thr Pro Val Ser Arg
                85                  90                  95     
Leu Leu Ile Gly Asn Pro Gly Cys Thr Tyr Lys Tyr Leu Asn Thr Arg
            100                 105                 110        
Leu Phe Thr Val Pro Trp Pro Val Lys Gly Ser Asp Ala Lys Tyr Asn
        115                 120                 125            
Glu Ala Glu Ile Gly Ala Ala Cys Gln Thr Phe Leu Lys Leu Asn Asp
    130                 135                 140                 
Tyr Leu Gln Ile Glu Thr Ile Gln Ala Leu Glu Glu Leu Ala Ala Lys
145                 150                 155                 160
Glu Lys Ala Asn Ile Asp Thr Val Pro Val Cys Ile Gly Pro Asp Phe
                165                 170                 175    
Pro Arg Val Gly Met Gly Ser Ser Phe Asp Gly His Asp Glu Val Asp
            180                 185                 190        
Arg Lys Ser Arg Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Leu Leu Asn Phe Met Asp
        195                 200                 205            
Pro Gln Lys Met Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Pro Tyr Phe Gly Met Gly
    210                 215                 220                
Lys Met Ala Val Ser Trp His His Asp Glu Asn Leu Val Asp Arg Ser
225                 230                 235                 240
Ala Val Ala Val Tyr Asn Tyr Ser Cys Glu Gly Pro Glu Glu Glu Ser
                245                 250                 255    
Glu Asp Asp Pro Gln Leu Glu Gly Arg Asp Pro Asp Val Trp His Val
            260                 265                 270        
Gly Phe Lys Ile Ser Trp Asp Ile Glu Thr Pro Gly Leu Ala Ile Pro
        275                 280                 285            
Leu His Gln Gly Asp Cys Tyr Phe Met Leu Asp Asp Leu Asn Ala Thr
    290                 295                 300                
His Gln His Cys Val Leu Ala Gly Leu Pro Pro Arg Phe Ser Ser Thr
305                 310                 315                 320
His Arg Val Ala Glu Cys Ser Thr Gly Thr Leu Asp Tyr Ile Leu Gln
                325                 330                 335    
Arg Cys Gln Leu Ala Leu Gln Asn Val Arg Asp Glu Ala Asp Ser Gly
            340                 345                 350        
Glu Val Ser Leu Lys Ser Leu Glu Pro Ala Val Leu Lys Gln Gly Glu
        355                 360                 365            
Glu Ile His Asn Glu Val Glu Phe Glu Trp Leu Arg Gln Phe Trp Phe
    370                 375                 380                
Gln Gly Asn Arg Tyr Lys Lys Cys Thr Asp Trp Trp Cys Gln Pro Met
385                 390                 395                 400
Thr Gln Leu Glu Glu Leu Trp Lys Lys Met Glu Gly Ala Thr His Ala
                405                 410                 415    
Val Leu Arg Glu Val Arg Arg Glu Gly Ala Pro Val Glu Gln Ser Ser
            420                 425                 430        
Asp Ile Leu Thr Ala Ile Leu Ala Val Leu Thr Thr Arg Gln Asn Leu
        435                 440                 445            
Arg Arg Glu Trp His Ala Arg Cys Gln Ser Arg Ile Ala Arg Thr Leu
    450                 455                 460                
Pro Val Asp Gln Lys Pro Glu Cys Arg Pro Tyr Trp Glu Lys Asp Asp
465                 470                 475                 480
Pro Ser Met Pro Leu Pro Phe Asp Leu Thr Asp Thr Val Ala Glu Leu
                485                 490                 495    
Arg Gly Leu Leu Leu Glu Ala Lys Pro Leu Glu His His His His His
            500                 505                 510         
His
   
 
 
<210>  4
<211>  34
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
ggaattccat atgaagcgaa ccccaaccgc cgag                                   34
 
 
<210>  5
<211>  30
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
ccgctcgagg ggtttggctt ccagaagcag                                        30

Claims (5)

1.一种猪FTO重组蛋白的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、提取猪背最长肌的总RNA并进行反转录，得到反转录的cDNA，进行PCR扩增；
步骤2、构建含有步骤1的PCR扩增产物的重组质粒pET30a-FTO，所述重组质粒pET30a-FTO在C端融合有6×His纯化标签；
步骤3、将步骤2获得的重组质粒pET30a-FTO加入到冰预冷的大肠杆菌BL21感受态细胞中，于冰上放置28min后于42℃水浴热击90s；加入无抗生素的LB培养基中培养1h后涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃条件下培养过夜，得到猪FTO表达菌pET30a-FTO/BL21；
步骤4、培养猪FTO表达菌pET30a-FTO/BL21，使用IPTG诱导猪FTO表达菌pET30a-FTO/BL21，产生粗猪FTO重组蛋白，其中IPTG诱导条件为IPTG浓度0.75mM，诱导时间为4h；
步骤5、纯化粗猪FTO重组蛋白，得到猪FTO重组蛋白，所述猪FTO重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的猪FTO重组蛋白的制备方法，其特征在于，
所述步骤1具体按照以下步骤实施：
无菌条件下取5-8g猪背最长肌样品，剪碎后于研钵中加液氮充分研磨，再将研磨样置于无菌去RNA酶的1.5mL离心管中，加1mLTrizol剧烈摇晃使粉末充分溶解，4℃12,000g离心10min，移上清至一新的1.5mL离心管，加0.2mL氯仿后剧烈晃动15s，室温放置3min后4℃12,000g离心15min，移上清至一新的1.5mL离心管，加0.4mL冰预冷的异丙醇，上下颠倒6-8次后室温静置10min，4℃12,000g离心10min，弃上清，加1mL75％乙醇洗涤沉淀一次，4℃12,000g离心5min，弃上清，真空抽干后加适量DEPC水溶解沉淀；取RNA样品于紫外/可见光分光光度计测定其浓度及质量，剩余的RNA样品于-80℃保存备用；取1μg总RNA，采用TaKaRa公司PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒将其反转录成cDNA。
3.根据权利要求1所述的猪FTO重组蛋白的制备方法，其特征在于，
所述步骤1中PCR扩增具体按照以下步骤实施：以步骤1中的反转录的cDNA为模板，利用上游引物Fo-Pet30-Nde-F：5’-GGAATTCCATATGAAGCGAACCCCAACCGCCGAG-3’(含NdeI)和下游引物Fo-Pet30-Xho-R：5’-CCGCTCGAGGGGTTTGGCTTCCAGAAGCAG-3’(含XhoI))进行PCR扩增，其中，PCR扩增反应条件为94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃100s，35个循环；72℃7min。
4.根据权利要求1所述的猪FTO重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤2中构建含有步骤1的PCR扩增产物的重组质粒pET30a-FTO，具体为：用上海生工UNIQ-10柱回收试剂盒对所扩增的PCR产物进行切胶回收，将切胶回收后的PCR产物和pET30a载体分别用NdeI和XhoI进行双酶切，用T4连接酶将两个双酶切产物于16℃连接3h左右，再将连接产物转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，于37℃培养过夜；挑取出单菌落，即为重组质粒pET30a-FTO，在表达载体pET30a(+)多克隆位点(MCS)的NdeI和XhoI插入了不含终止密码子的猪FTO基因CDS区，使重组表达载体pET30a(+)-pFTO的C端融合了6×His标签。
5.根据权利要求1所述的猪FTO重组蛋白的制备方法，其特征在于，
所述纯化步骤为：
a.将猪FTO重组蛋白表达液于6,000g、4℃离心8min，采用Ni-Denature-GuHCl缓冲液(100mMNaH2PO4，300mMNaCl，6MGuHCl，pH8.0)溶解菌体，10,000g4℃离心20min；收集上清液，过0.45μm滤膜；
b.用10倍体积Ni-Denature-urea缓冲液(100mM NaH2PO4，300mMNaCl，8M urea，pH8.0)平衡柱子，控制流速为1mL/min；
c.加样于柱子上，流速控制为0.5-1mL/min；
d.加10倍柱体积的Ni-Denature-urea缓冲液洗柱子；
e.加5倍柱体积的Ni-Denature-250缓冲液(100mM NaH2PO4，300mMNaCl，250mM Imidazole，8M urea，pH8.0)洗脱柱子，控制流速为1mL/min，收集洗脱液；猪FTO重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，含猪FTO蛋白序列、XhoI酶切位点对应的氨基酸序列和6个组氨酸序列。
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