CN101988065A - 杂色鲍钙调蛋白cDNA序列 - Google Patents

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姜敬哲
王江勇
刘广锋
王瑞旋
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Abstract

本发明公开了一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，它的核苷酸序列如SEQIDNO.1所述。本发明提供的钙调蛋白基因在鲍鱼中属于首次发现，并且只在鲍鱼的重要的免疫器官鳃中表达。由于弧菌病原的感染能够上调其表达，说明该钙调蛋白基因在鲍鱼免疫抗病反应中发挥重要作用。

Description

杂色鲍钙调蛋白cDNA序列
技术领域
本发明涉及分子生物学及功能基因应用相关领域，尤其是涉及杂色鲍钙调蛋白cDNA序列。
背景技术
钙调蛋白(Calmodulin)是一种存在于几乎所有的真核细胞中的钙结合蛋白。它与Ca2+结合后可以进一步结合多种目标蛋白，从而调节包括炎症反应、代谢、细胞凋亡、肌肉收缩、胞内运动、短期和长期记忆、神经生长及免疫反应等多种生理过程。因此，钙调蛋白属于细胞信号通路中的上游关键基因，其表达量的上调或下降会引起下游信号途径中一系列多种多样的反应和变化。目前，尚未在鲍鱼物种中鉴定到钙调蛋白相关基因及产物。
发明内容
本发明的目的是提供一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列。
本发明以杂色鲍为材料，提取全组织(肌肉和内脏团)的总RNA，进行反转录后进一步构建cDNA文库。挑取大量文库克隆送由测序公司测序后，通过生物信息学的方法从众多序列中鉴定到一个钙调蛋白基因序列，具有钙调蛋白的保守结构域及活性中心。其具体DNA核苷酸如下：
cattagattg ccgtcttgta taacaaaggc gaaacatttc tgtgaatccg agtccgagcg   60
atgtccaatc tgtcgcagag ggagaaacag ctgtacacca ggttcttcca ccaggtggac  120
attgatggaa acgggtacat caccctggat gaactagcaa ccttgtgcaa aaaactcaag  180
ctcggcttga cgcgacaaca gattgtggac gtgtttatga acatggacac cgacaacaac  240
ttgaccatta ccttaaacga attcttgtcg gcaatgccaa agattgaacg tgaacaactc  300
tcgtatggtg agatgaggtg ggcatttgac cagatagaca cagatggcag cggcctgctt  360
gacgctgatg agctgaagga agtgctgctc aaatgtggac gttcattgac gttgtcacaa  420
gtgaagacta tgattgccaa agtcgacatc aacggtgacg gcaaattgaa ctttgatgaa  480
tttattactc tttttggcta agactacgta ctccatgtaa tgacctcagt tcgacgaacg  540
tcaaagttga gtgatggttg ttcctaacgt cgtg                              574
其相应的氨基酸序列如下：
Met Ser Asn Leu Ser Gln Arg Glu Lys Gln Leu Try Thr Arg Phe
1                5                  10                  15
Phe His Gln Val Asp Ile Asp Gly Asn Gln Tyr Ile Thr Leu Asp
16             20                   25                  30
Glu Leu Ala Thr Leu Cys Lys Lys Leu Lys Leu Gly Leu Thr Arg
31              35                   40                 45
Gln Gln Ile Val Asp Val Phe Met Asn Met Asp Thr Asn Asn Asn
46              50                  55                  60
Leu Thr Ile Thr Leu Asn Glu Phe Leu Ser Ala Met Pro Lys Ile
61              65                  70                  75
Glu Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gly Glu Met Arg Trp Ala Phe Asp
76              80                  85                  90
Gln Ile Asp Thr Asp Gly Ser Gly Leu Leu Asp Ala Asp Glu Leu
91              95                  100                 105
Lys Glu Val Leu Leu Lys Cys Gly Arg Ser Leu Thr Leu Ser Gln
106             110                115                  120
Val Lys Thr Met Ile Ala Lys Val Asp Ile Asn Gly Asp Gly Lys
121            125                 130                 135
Leu Asn Phe Asp Glu Phe Ile Thr Leu Phe Gly
136             140                 145
本发明还根据上述基因序列设计引物，对杂色鲍各组织的钙调蛋白表达丰度，以及弧菌病原感染下鳃中表达量变化进行了RT-PCR分析。发现：该基因只在鳃中表达，病原感染后的1小时，钙调蛋白基因表达被明显诱导，并在4小时后逐渐回落到正常水平，说明该基因在鲍鱼免疫反应中发挥重要作用。
本发明的优点：钙调蛋白基因在鲍鱼中属于首次发现，并且只在鲍鱼的重要的免疫器官鳃中表达。由于弧菌病原的感染能够上调其表达，说明该钙调蛋白基因在鲍鱼免疫抗病反应中发挥重要作用。
附图说明
图1是杂色鲍肌肉和内脏团总RNA电泳图；
1：肌肉总RNA；2：内脏团总RNA；
图2是杂色鲍cDNA的一链和二链的合成与均一化电泳图；
M：DL2000plus；泳道1：LD-PCR扩增cDNA双链结果；
泳道2：11个循环的Control；泳道3：1/4倍DSN酶处理；
泳道4：1/2倍DSN酶处理；泳道5：1倍的DSN酶处理；
泳道6：1倍DSN处理的样品再次PCR扩增12个循环；
图3是菌落PCR鉴定插入片段电泳图；
A图：插入片段为0.5-1kb的文库克隆；
B图：插入片段为1-3kb的文库克隆；
M：DL2000plus；
图4是杂色鲍钙调蛋白基因(plt32-e291)与其它物种中钙调蛋白基因Clustalw聚类分析结果；
图5是RT-PCR检测钙调蛋白(plt32-e291)在鲍鱼各组织中的表达的电泳图；
其中，actin为内参基因；
图6是RT-PCR检测病原感染下钙调蛋白在杂色鲍鳃中的表达情况的电泳图。
具体实施方式
1.主要试剂
弧菌选择性培养基(TCBS)购自北京路桥生物技术有限公司；Trizol总RNA提取试剂购自Invitrogen公司；Creator SMART cDNA Construction Kit购自Clontech公司；Trimmer-Director kit购自Evrogen公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 Marker、pDNR-LIB载体连接试剂盒、胶回收试剂盒等购自TaKaRa公司。
2.处理与采样
杂色鲍暂养于水温24±1℃、盐度3％的过滤海水中，观察3天后用于实验。取哈维氏弧菌B2D接种至营养琼脂培养基，28℃培养24h后，接种于TCBS培养基，28℃培养24h，用灭菌生理盐水稀释至5×105cfu/mL。取暂养的雌雄各5只杂色鲍，分别注射100μL菌液，24h后，分别取肌肉和内脏团(包括鳃、肝胰腺、外套膜、性腺等)组织、用于提取总RNA。
2.cDNA文库的构建
2.1总RNA提取
按照Trizol操作手册提取杂色鲍肌肉总RNA和内脏团总RNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA质量和含量，提取结果见图1，箭头所示的上方条带为28srRNA，下方为18s rRNA，OD260nm/280nm比值分别为2.02和2.05，介于1.9～2.2之间，符合RNA纯度要求。
然后，等比例混合杂色鲍肌肉总RNA和内脏团总RNA。按照Creator SMART cDNAConstruction Kit的操作手册将混合后的总RNA合成一链和二链，用LD-PCR方法扩增一链和二链。所得的产物再根据Trimmer-Director kit(Evrogen，Cat.No.NK002)操作，去除高拷贝基因，并对DSN处理的样品进行第二次PCR扩增。取5μL第二次PCR扩增所得的产物，于1.1％含EB的胶上电泳检测cDNA合成结果(图2的A图)。可见cDNA长度大于5000bp，Smear条带主要位于0.5～5kb之间，尤其在0.75～2kb处有明显的高拷贝基因带，说明需要对产物做均一化处理。
根据Trimmer-Director kit操作说明，进行均一化处理。从图2的B图中可以看出，1倍DSN处理(泳道5)后，高拷贝基因条带已全部消除、smear带很均匀。取1倍DSN处理的样品进行第二次PCR扩增，12个循环后取5μL产物电泳检测(图2的C图)。由第6泳道的结果可见，cDNA片段长度比图B中的结果提高明显，达到了预期效果。
2.2连接产物的转化和文库鉴定
将二次PCR产物用胶回收试剂盒纯化后进行SfiI酶切，然后分别割胶回收0.5～1和1～3kb之间的片段，并与pDNR-LIB载体连接转化大肠杆菌DH10B感受态。取适量菌液按比例稀释后涂于氯霉素平板上，37℃培养过夜，统计克隆数并计算文库滴度，两个文库库容均为2.5×105cfu/mL。
3.菌落鉴定及随机克隆测序
挑取平板上15个菌落克隆，进行菌落PCR鉴定。PCR反应程序：94℃预变性4分钟；35个循环：94℃变性40秒，53.6℃退火40秒，72℃延伸4分钟；72℃充分延伸10分钟。取适量PCR产物电泳检测并估算片段长度(图3)。由图3的A图可见插入片段长度基本在0.5-1kb之间，图3的B图中插入片段基本在1-3kb之间，并且PCR阳性率均达到了100％。
随机挑取10000个克隆送北京华大基因研究中心测序，使用phrap软件对EST序列进行拼接，并在NCBI网站上进行Blastx比对分析，以查找目标基因序列，发现其中一条EST序列与其它物种中已知的钙调蛋白序列最相似(氨基酸水平相似性达到60％)，其序列参见序列表SEQ ID NO.1，由其推测的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO.2，但聚类结果表明该序列位于动物、植物钙调蛋白之外的另一分支(图4)。
4.钙调蛋白特异引物设计及测序验证
根据NCBI的序列分析结果，以本发明的文库中钙调蛋白cDNA序列为模板，利用NCBI网站上Primer-BLAST软件设计特异引物：
上游：5’-CGAAACATTTCTGTGAAT-3’；
下游：5’-TGAGGTCATTACATGGAG-3’
然后，进行PCR扩增全组织cDNA样品。对扩增得到的目的条带进行凝胶回收并送由测序公司进行测序验证，测序结果与文库序列完全一致。
5.钙调蛋白在鲍鱼各组织中的表达量
分别切取成熟杂色鲍的血细胞、外套膜、鳃、性腺、腹足及肝胰腺各组织，提取总RNA，对RNA定量后取等量RNA反转录，以actin基因为内参基因，PCR特异扩增调整模板用量使其一致，再使用上述钙调蛋白特异引物进行PCR检测，以比较不同组织样品中钙调蛋白的表达量(图5)。
6.病原感染下钙调蛋白基因鳃中的表达变化
取哈维氏弧菌B2D接种至营养琼脂培养基，28℃培养24h后，接种于TCBS培养基，28℃培养24h，用灭菌生理盐水稀释至5×105cfu/mL，取壳长一致、成熟的杂色鲍雌雄各20只杂色鲍，各注射100μL菌液，分别于0、1、2、4、8小时后取正常鲍鱼的鳃组织，每个时间点雌雄各3只，合计30个样品，分别提取总RNA。将相同时间点的RNA样品等量混合，反转录后进行RT-PCR检测。由电泳结果可见(图6)，细菌注射感染的鲍鱼鳃中，钙调蛋白在1小时和2小时表达量明显上调，4小时后表达量有所回落，直到8小时降至感染之前(0小时)水平，而注射PBS的鲍鱼中表达量没有明显变化。

Claims (2)

1.一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
2.根据权利要求1所述的杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。
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