CN102382840A

CN102382840A - 杂色鲍钙调蛋白cDNA序列

Info

Publication number: CN102382840A
Application number: CN2011103453601A
Authority: CN
Inventors: 姜敬哲; 王江勇; 刘广锋; 王瑞旋
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2031-11-04
Also published as: CN102382840B; CN101988065A

Abstract

本发明公开了一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。本发明提供的钙调蛋白基因在鲍鱼中属于首次发现，并且只在鲍鱼的重要的免疫器官鳃中表达。由于弧菌病原的感染能够上调其表达，说明该钙调蛋白基因在鲍鱼免疫抗病反应中发挥重要作用。

Description

杂色鲍钙调蛋白cDNA序列

技术领域

本发明涉及分子生物学及功能基因应用相关领域，尤其是涉及杂色鲍钙调蛋白cDNA序列。

背景技术

钙调蛋白（Calmodulin）是一种存在于几乎所有的真核细胞中的钙结合蛋白。它与Ca²⁺结合后可以进一步结合多种目标蛋白，从而调节包括炎症反应、代谢、细胞凋亡、肌肉收缩、胞内运动、短期和长期记忆、神经生长及免疫反应等多种生理过程。因此，钙调蛋白属于细胞信号通路中的上游关键基因，其表达量的上调或下降会引起下游信号途径中一系列多种多样的反应和变化。目前，尚未在鲍鱼物种中鉴定到钙调蛋白相关基因及产物。

发明内容

本发明的目的是提供一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列。

本发明以杂色鲍为材料，提取全组织（肌肉和内脏团）的总RNA，进行反转录后cDNA。然后对所得的cDNA进行sfiI酶切，分别割胶回收0.5~1和1~3kb之间的片段，并与pDNR-LIB载体连接转化大肠杆菌DH10B感受态，建立cDNA文库。通过生物信息学的方法从众多序列中鉴定到一个与已知钙调蛋白基因序列相似的序列。根据鉴定得到的基因序列设计特异引物，上游引物：5’-CGAAACATTTCTGTGAAT-3’；下游引物：5’-TGAGGTCATTACATGGAG-3’。以文库中钙调蛋白cDNA序列为模板，采用上述特异引物进行PCR扩增得到杂色鲍钙调蛋白基因序列，其具有钙调蛋白的保守结构域及活性中心，其四个保守结构域分别位于蛋白序列的16—36、45—72和84—109和118—145区间；第一个保守结构域的活性中心包括：Asp-20、Asp-22、Asn-24和Glu-31；第二个保守结构域的活性中心包括：Asp-56、Asn-58、Asn-60和Glu-67；第三个保守结构域的活性中心包括：Asp-93、Asp-95、Ser-97和Glu-104；第四个保守结构域的活性中心包括：Asp-129、Asn-131、Asp-133和Glu-140。

本发明所得的杂色鲍钙调蛋白基因序列，其具体DNA核苷酸如下：

cattagattg ccgtcttgta taacaaaggc gaaacatttc tgtgaatccg agtccgagcg 60

atgtccaatc tgtcgcagag ggagaaacag ctgtacacca ggttcttcca ccaggtggac 120

attgatggaa acgggtacat caccctggat gaactagcaa ccttgtgcaa aaaactcaag 180

ctcggcttga cgcgacaaca gattgtggac gtgtttatga acatggacac cgacaacaac 240

ttgaccatta ccttaaacga attcttgtcg gcaatgccaa agattgaacg tgaacaactc 300

tcgtatggtg agatgaggtg ggcatttgac cagatagaca cagatggcag cggcctgctt 360

gacgctgatg agctgaagga agtgctgctc aaatgtggac gttcattgac gttgtcacaa 420

gtgaagacta tgattgccaa agtcgacatc aacggtgacg gcaaattgaa ctttgatgaa 480

tttattactc tttttggcta agactacgta ctccatgtaa tgacctcagt tcgacgaacg 540

tcaaagttga gtgatggttg ttcctaacgt cgtg 574

其相应的氨基酸序列如下：

Met Ser Asn Leu Ser Gln Arg Glu Lys Gln Leu Try Thr Arg Phe

1 5 10 15

Phe His Gln Val Asp Ile Asp Gly Asn Gln Tyr Ile Thr Leu Asp

16 20 25 30

Glu Leu Ala Thr Leu Cys Lys Lys Leu Lys Leu Gly Leu Thr Arg

31 35 40 45

Gln Gln Ile Val Asp Val Phe Met Asn Met Asp Thr Asn Asn Asn

46 50 55 60

Leu Thr Ile Thr Leu Asn Glu Phe Leu Ser Ala Met Pro Lys Ile

61 65 70 75

Glu Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gly Glu Met Arg Trp Ala Phe Asp

76 80 85 90

Gln Ile Asp Thr Asp Gly Ser Gly Leu Leu Asp Ala Asp Glu Leu

91 95 100 105

Lys Glu Val Leu Leu Lys Cys Gly Arg Ser Leu Thr Leu Ser Gln

106 110 115 120

Val Lys Thr Met Ile Ala Lys Val Asp Ile Asn Gly Asp Gly Lys

121 125 130 135

Leu Asn Phe Asp Glu Phe Ile Thr Leu Phe Gly

136 140 145

本发明根据拼接好的钙调蛋白基因cDNA全序列，设计合成一对引物，上游引物(e291F56)：GGTCGGATCCATGTCCAATCTGTCGCAGAG，引入BamH I酶切位点；下游引物（e291R540）：GTCGAAAGCTTGTCATTACATGGAGTACGTAGTCTTAGCC，引入HindIII酶切位点。对杂色鲍的cDNA进行PCR扩增，将扩增产物和表达载体pRSETA分别同时用BamHI和HindIII内切酶切割，使用T4 DNA ligase将载体与片段连接，再将连接产物热激法转化到BL21（DE3）plyS菌株中，然后对阳性克隆进行培养，得到钙调蛋白融合蛋白，该蛋白具有较强的钙离子结合活性。本发明还通过对杂色鲍各组织的钙调蛋白表达丰度进行了RT-PCR分析，发现：该基因只在鳃中表达。

本发明的优点：钙调蛋白基因在鲍鱼中属于首次发现，并且只在鲍鱼的重要的免疫器官鳃中表达。

附图说明

图1是杂色鲍肌肉和内脏团总RNA电泳图；

1：肌肉总RNA；2：内脏团总RNA。

图2是杂色鲍cDNA的一链和二链的合成与均一化电泳图；

M：DL2000 plus；泳道1：LD-PCR扩增cDNA双链结果；

泳道2：11个循环的Control；泳道3：1/4倍DSN酶处理；

泳道4：1/2倍DSN酶处理；泳道5：1倍的DSN酶处理；

泳道6：1倍DSN处理的样品再次PCR扩增12个循环。

图3是菌落PCR鉴定插入片段电泳图；

A图：插入片段为0.5-1kb的文库克隆；

B图：插入片段为1-3kb的文库克隆；

M: DL2000 plus。

图4 是杂色鲍钙调蛋白基因与其它物种中钙调蛋白基因Clustalw聚类分析结果。

图5 是RT-PCR检测钙调蛋白在鲍鱼各组织中的表达的电泳图；

其中，actin为内参基因。

图6是大肠杆菌（BL21）中诱导表达钙调蛋白的电泳图；

1hour和8hour分别为钙调蛋白表达载体在大肠杆菌中诱导表达1小时和8小时结果，箭头所示20.8kDa处为钙调蛋白条带，CK-为空载体诱导1hour表达结果。

图7是融合表达的钙调蛋白纯化的电泳图；

CK+为诱导过夜后的可溶性总蛋白；50mM和100mM分别表示用50mmol/L和100mmol/L咪唑洗脱的蛋白产物，其中100mM洗脱产物可见目的条带；箭头所示为融合表达的钙调蛋白。

图8是钙调蛋白活性测定结果的曲线图；

Calmodulin为钙调蛋白；BSA为牛血清白蛋白，作为对照。

具体实施方式

主要试剂

弧菌选择性培养基（TCBS）购自北京路桥生物技术有限公司；Trizol总RNA提取试剂购自Invitrogen公司；Creator SMART cDNA Construction Kit 购自Clontech公司；Trimmer-Director kit购自Evrogen公司；Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 Marker、pDNR-LIB载体连接试剂盒、胶回收试剂盒等购自TaKaRa公司。

处理与采样

杂色鲍暂养于水温24±1℃、盐度3%的过滤海水中，观察3天后用于实验。取哈维氏弧菌B2D接种至营养琼脂培养基，28℃培养24h后，接种于TCBS培养基，28℃培养24h，用灭菌生理盐水稀释至5×10⁵cfu/mL。取暂养的雌雄各5只杂色鲍，分别注射100μL菌液，24h后，分别取肌肉和内脏团（包括鳃、肝胰腺、外套膜、性腺等）组织、用于提取总RNA。

文库的构建

总RNA提取

按照Trizol操作手册提取杂色鲍肌肉总RNA和内脏团总RNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA质量和含量，提取结果见图1，箭头所示的上方条带为28s rRNA，下方为18s rRNA，OD_260nm/280nm比值分别为2.02和2.05，介于1.9～2.2之间，符合RNA纯度要求。

然后，等比例混合杂色鲍肌肉总RNA和内脏团总RNA。按照Creator SMART cDNA Construction Kit 的操作手册将混合后的总RNA合成一链和二链，用LD-PCR方法扩增一链和二链。所得的产物再根据Trimmer-Director kit（Evrogen，Cat.No.NK002）操作，去除高拷贝基因，并对DSN处理的样品进行第二次PCR扩增。取5μL第二次PCR扩增所得的产物，于1.1%含EB的胶上电泳检测cDNA合成结果（图2的A图）。可见cDNA长度大于5000bp，Smear条带主要位于0.5～5kb之间，尤其在0.75~2kb处有明显的高拷贝基因带，说明需要对产物做均一化处理。

根据Trimmer-Director kit操作说明，进行均一化处理。从图2的B图中可以看出，1倍DSN处理（泳道5）后，高拷贝基因条带已全部消除、smear带很均匀。取1倍DSN处理的样品进行第二次PCR扩增，12个循环后取5μL产物电泳检测（图2的C图）。由第6泳道的结果可见，cDNA片段长度比图B中的结果提高明显，达到了预期效果。

连接产物的转化和文库鉴定

将二次PCR产物用胶回收试剂盒纯化后进行SfiI酶切，然后分别割胶回收0.5~1和1~3kb之间的片段，并与pDNR-LIB载体连接转化大肠杆菌DH10B感受态。取适量菌液按比例稀释后涂于氯霉素平板上，37℃培养过夜，统计克隆数并计算文库滴度，两个文库库容均为2.5×10⁵cfu/mL。

菌落鉴定及随机克隆测序

挑取平板上15个菌落克隆，进行菌落PCR鉴定。PCR反应程序：94℃预变性4分钟；35个循环：94℃变性40秒，53.6℃退火40秒，72℃延伸4分钟；72℃充分延伸10分钟。取适量PCR产物电泳检测并估算片段长度（图3）。由图3的A图可见插入片段长度基本在0.5-1kb之间，图3的B图中插入片段基本在1-3kb之间，并且PCR阳性率均达到了100%。

随机挑取10000个克隆送北京华大基因研究中心测序，使用phrap软件对EST序列进行拼接，并在NCBI网站上进行Blastx比对分析，以查找目标基因序列，发现其中一条EST序列与其它物种中已知的钙调蛋白序列最相似（氨基酸水平相似性达到60%），其序列参见序列表SEQ ID NO.1，由其对应的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO.2，但聚类结果表明该序列位于动物、植物钙调蛋白之外的另一分支（图4）。

钙调蛋白特异引物设计及测序验证

根据NCBI的序列分析结果，以本发明的文库中钙调蛋白cDNA序列为模板，利用NCBI网站上Primer-BLAST软件设计特异引物：

上游引物：5’-CGAAACATTTCTGTGAAT-3’；

下游引物：5’-TGAGGTCATTACATGGAG-3’。

然后，进行PCR扩增全组织cDNA样品。对扩增得到的目的条带进行凝胶回收并送由测序公司进行测序验证，测序结果与文库序列完全一致，其序列参见序列表SEQ ID NO.1，由其对应的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO.2，其具有钙调蛋白的保守结构域及活性中心，其四个保守结构域分别位于蛋白序列的16—36、45—72和84—109和118—145区间；第一个保守结构域的活性中心包括：Asp-20、Asp-22、Asn-24和Glu-31；第二个保守结构域的活性中心包括：Asp-56、Asn-58、Asn-60和Glu-67；第三个保守结构域的活性中心包括：Asp-93、Asp-95、Ser-97和Glu-104；第四个保守结构域的活性中心包括：Asp-129、Asn-131、Asp-133和Glu-140。

钙调蛋白在鲍鱼各组织中的表达量

分别切取成熟杂色鲍的血细胞、外套膜、鳃、性腺、腹足及肝胰腺各组织，提取总RNA，对RNA定量后取等量RNA反转录，以actin基因为内参基因，PCR特异扩增调整模板用量使其一致，再使用上述钙调蛋白特异引物进行PCR检测，以比较不同组织样品中钙调蛋白的表达量，发现该基因只在鳃中表达（图5）。

重组表达质粒的构建

根据拼接好的钙调蛋白基因cDNA全序列，设计合成一对引物，上游引物(e291F56) ：GGTCGGATCCATGTCCAATCTGTCGCAGAG，引入BamH I酶切位点；下游引物(e291R540)：GTCGAAAGCTTGTCATTACATGGAGTACGTAGTCTTAGCC，引入HindIII酶切位点，引物由invitrogen公司合成，用水配置成10umol/L的母液。以2.1节中内脏团cDNA为模板，使用HS Mix试剂盒（东盛生物，Cat#P1081）进行扩增反应，扩增条件：94℃，5min；94℃ 40sec，55℃ 40sec，72℃ 40sec， 30个循环；72℃ 7min。将扩增产物和表达载体pRSETA分别同时用BamHI和HindIII内切酶37℃切割1小时，使用T4 DNA ligase将载体与片段16℃连接4小时，将连接产物热激法转化到BL21（DE3）plyS菌株中，37℃培养过夜，挑取阳性克隆。

融合蛋白的表达

将阳性克隆菌株和空载体BL21（DE3）plyS菌株分别接种于5ml含氨苄青霉素50ug/ml和35ug/ml氯霉素的LB培养液中，37℃，250r/min振荡培养过夜。所得的阳性克隆菌液和空载体BL21（DE3）plyS菌液分别转接于50mL含氨苄青霉素50ug/ml和35ug/ml氯霉素的LB培养液中，它们均按LB培养液总体积的1％的量进行转接。然后于37℃振荡培养至OD_600nm为0.6左右时，加入终浓度1 mmol/L的 IPTG诱导培养；在诱导后的1h和8h各取1mL样品。阳性克隆菌液和空载体BL21（DE3）plyS菌液的菌液样品分别离心，弃上清，收集菌体，将两种菌体分别悬于200ul含20mmol/L磷酸钠和500mmol/L氯化钠的缓冲液中，缓冲液pH=7.8，超声波破碎菌体，12000rpm离心5min，于上清液中加入适量SDS裂解液裂解，该SDS裂解液含0.6ml pH为6.8的1.0M Tris，50％甘油5ml，10％SDS 2ml，β-巯基乙醇0.5ml，1％溴酚蓝1ml，去离子水0.9ml，共10ml。煮沸5min，Tricine-SDS-PAGE上样电泳，电泳配方：正极缓冲液：pH =8.9的0.2M Tris；负极缓冲液：0.1M Tris，0.1M Tricine，0.1%SDS；凝胶缓冲液：36.342g Tris，0.3g SDS加水定容至100ml pH 8.45，过滤4℃保存；AB-3储存液：49.5%T和3%C；AB-6储存液：49.5%T和6%C；浓缩胶：250uL AB-3，凝胶缓冲液750uL，水2mL，10%AP 22.5uL，TEMED 2.25uL；分离胶：1.6mL AB-6；凝胶缓冲液2.67mL；甘油630uL；水3.1mL；10% AP 40uL；TEMED 4uL。电泳结果如图6所示。

融合表达蛋白的纯化

取200ml阳性克隆菌液诱导过夜后，4℃，5500r/min 离心15min，收集菌体，菌体悬于8ml结合缓冲液，结合缓冲液：20mmol/L磷酸钠和500mmol/L氯化钠，pH=7.8。超声波破碎菌体，加入Triton-100、DNase和RNase至它们的终浓度分别为1%、5ug/ml和5ug/ml，4℃摇床孵育10min，4℃，5000r/min离心30min，上清液用0.45um滤膜过滤备用。将Ni-琼脂糖凝胶混匀，取2ml装入Ni-琼脂糖凝胶6FF层析柱（Sobarbio，Cat#P2010）自然沉降，用3倍体积无菌水冲洗，用3倍体积结合缓冲液平衡凝胶，制备成Ni²⁺亲和柱；将制备的上清液加入Ni²⁺亲和柱，控制流速为10个柱体积/h，用6个柱体积的结合缓冲液洗柱，用4个柱体积的洗涤缓冲液洗柱，洗涤缓冲液：20mmol/L磷酸钠，500mmol/L氯化钠，Ph=6.0；直至流过液A280<0.01，然后在层析柱中加入经过滤处理的上清液，用6个柱体积的100mmol/L的咪唑洗脱缓冲液洗脱蛋白，咪唑洗脱缓冲液为咪唑和洗涤缓冲液的混合液。重复上述操作，洗脱蛋白时采用6个柱体积的50mmol/L的咪唑洗脱缓冲液洗脱蛋白。洗脱后的蛋白Tricine-SDS-PAGE上样电泳检测，如图7所示，箭头所示即为钙调蛋白。

钙调蛋白活性检测

将纯化的钙调蛋白和BSA蛋白（牛血清白蛋白，国产分析纯）分别用20mmol/L pH为7.8的磷酸二氢钠配置成500mg/L的溶液，加入5%的离子亲和树脂Analytical Grade Chelex 100 Resin (Biorad, Cat#142-2822，Lot#5532)，室温搅拌1小时，以除净蛋白中结合的Ca²⁺离子干扰。然后5000rpm，离心5min，吸取上清，按比例加入20mmol/L的磷酸二氢钠（pH7.8），将钙调蛋白和BSA分别稀释成100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L和500mg/L的溶液，向上述溶液中分别加入终浓度为5mmol/L的CaCl₂，室温搅拌30min，期间校正溶液pH使其维持在7.8，使用钙含量比色检测分析试剂盒（Biovision, Cat#K380-250，Lot#95877）测定溶液中的钙离子浓度。如图8所示，钙调蛋白相比于BSA具有很强的钙离子结合活性，而BSA则无钙离子结合活性，因此，钙调蛋白浓度越高，溶液中的可溶性钙含量也越高。

序列表

<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所

<120> 杂色鲍钙调蛋白基因（calmodulin）

<160> 2

<210> 1

<211> 574

<212> RNA

<213> 杂色鲍（Haliotis diversicolor Reeve）

<220>

<221> 3’UTP

<222> (502)...(574)

<220>

<221> 5’UTP

<222> (1)...(60)

<220>

<221> CDS

<222> (61)...(501)

<400> 1

cattagattg ccgtcttgta taacaaaggc gaaacatttc tgtgaatccg agtccgagcg 60

atgtccaatc tgtcgcagag ggagaaacag ctgtacacca ggttcttcca ccaggtggac 120

attgatggaa acgggtacat caccctggat gaactagcaa ccttgtgcaa aaaactcaag 180

ctcggcttga cgcgacaaca gattgtggac gtgtttatga acatggacac cgacaacaac 240

ttgaccatta ccttaaacga attcttgtcg gcaatgccaa agattgaacg tgaacaactc 300

tcgtatggtg agatgaggtg ggcatttgac cagatagaca cagatggcag cggcctgctt 360

gacgctgatg agctgaagga agtgctgctc aaatgtggac gttcattgac gttgtcacaa 420

gtgaagacta tgattgccaa agtcgacatc aacggtgacg gcaaattgaa ctttgatgaa 480

tttattactc tttttggcta agactacgta ctccatgtaa tgacctcagt tcgacgaacg 540

tcaaagttga gtgatggttg ttcctaacgt cgtg 574

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> 杂色鲍（Haliotis diversicolor Reeve）

<400> 2

Met Ser Asn Leu Ser Gln Arg Glu Lys Gln Leu Try Thr Arg Phe

1 5 10 15

Phe His Gln Val Asp Ile Asp Gly Asn Gln Tyr Ile Thr Leu Asp

16 20 25 30

Glu Leu Ala Thr Leu Cys Lys Lys Leu Lys Leu Gly Leu Thr Arg

31 35 40 45

Gln Gln Ile Val Asp Val Phe Met Asn Met Asp Thr Asn Asn Asn

46 50 55 60

Leu Thr Ile Thr Leu Asn Glu Phe Leu Ser Ala Met Pro Lys Ile

61 65 70 75

Glu Arg Glu Gln Leu Ser Tyr Gly Glu Met Arg Trp Ala Phe Asp

76 80 85 90

Gln Ile Asp Thr Asp Gly Ser Gly Leu Leu Asp Ala Asp Glu Leu

91 95 100 105

Lys Glu Val Leu Leu Lys Cys Gly Arg Ser Leu Thr Leu Ser Gln

106 110 115 120

Val Lys Thr Met Ile Ala Lys Val Asp Ile Asn Gly Asp Gly Lys

121 125 130 135

Leu Asn Phe Asp Glu Phe Ile Thr Leu Phe Gly

136 140 145

Claims

1.一种杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，其特征在于：它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。

2.根据权利要求1所述的杂色鲍钙调蛋白cDNA序列，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。