CN103172722A - 斜带石斑鱼钙调蛋白基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了斜带石斑鱼钙调蛋白基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用。本发明首次获得了斜带石斑鱼的钙调蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质。经实验证明，斜带石斑鱼钙调蛋白可以提高石斑鱼抗应激能力，可以应用于制备与水产动物相关的免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用潜力。

Description

斜带石斑鱼钙调蛋白基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程研发技术领域，具体涉及斜带石斑鱼钙调蛋白以及编码该蛋白的基因，包含该基因的载体以及该蛋白的应用。

背景技术

钙调蛋白（CaM）是Ca²⁺信号通路中的重要调控蛋白之一。Ca²⁺作为细胞内的第二信使，在行使其传递信息流作用中，要依赖于钙依赖性调节蛋白的相互作用，其中，钙调蛋白是在真核细胞中广泛分布的。于1964年，美籍华人张槐耀对胞内cAMP的相关研究工作中发现钙调蛋白的存在。钙调蛋白具有特殊的结构，是一种酸性的单链蛋白，两端各包含有两个高度保守的Ca²⁺结合区域，每个Ca²⁺结合区域能够结合一分子的Ca²⁺，中间由α螺旋结构相连，其分子量一般在1.7KDa，约由149个氨基酸组成。在其氨基酸组成当中，酸性氨基酸占了约30%，从而能够提供羧基（-COOH）与钙离子结合。在功能上，钙调蛋白单体一般以非活性状态存在于细胞内，当细胞受到外界刺激以后，能够迅速捕获胞质内的Ca²⁺，从而引起自身的构象发生改变，形成具有高度活性的Ca²⁺-CaM复合物，由于在其氨基酸组成中不包含有羟脯氨基酸，从而保证了肽链的高灵活性，作用于靶酶的激活位点，引起其空间结构发生变化，促使后者从非活性态转变成活性态。靶酶被激活后，又会作用于下游的关键因子，进一步在逆境中调节细胞的代谢，在增强鱼类自身免疫能力的方面，对机体的免疫防御发挥出重要的作用。

斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）属于鲈形目(Perciformes)，鮨科(Serranidae)，石斑鱼亚科(Epinephelinae)，石斑鱼属(Epinephelus)，是暖水性的礁栖鱼类，在印度洋和太平洋的热带、亚热带海域广泛分布。石斑鱼属于名贵海产鱼类之一，其肉质鲜美，倍受各地消费者的喜爱，经济价值巨大。但是，由于面对着目前的急剧的气候变化灾害和严重污染的水质问题，从而导致了其致病率和死亡率居高不下，对石斑鱼的人工养殖造成严重的经济打击，也是一个难以解决的问题。如何增强石斑鱼的抗逆能力，提高养殖存活率，是目前亟待解决的难题。

发明内容

针对现有问题，本发明的目的在于提供一种斜带石斑鱼钙调蛋白、该蛋白的编码基因、以及该蛋白的应用。

本发明所采取的技术方案是：

斜带石斑鱼钙调蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。

编码上述斜带石斑鱼钙调蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种克隆载体，其含有斜带石斑鱼钙调蛋白基因。

一种表达载体，其含有斜带石斑鱼钙调蛋白基因。

生产斜带石斑鱼钙调蛋白的方法，包括将含有斜带石斑鱼钙调蛋白基因的表达载体导入宿主细胞中，表达得到斜带石斑鱼钙调蛋白。

所述宿主细胞为毕赤酵母。

斜带石斑鱼钙调蛋白在制备水产动物免疫增强剂中的应用。

本发明的有益效果是：

（1）本发明首次获得了斜带石斑鱼的钙调蛋白CaM基因序列，可以应用于制备重组蛋白、鱼类免疫制剂和饲料添加剂，为斜带石斑鱼的生理免疫研究提供了新的实践基础；

（2）本发明所提供的斜带石斑鱼CaM重组蛋白，经实验证明可以提高石斑鱼抗应激能力，可以应用于制备与鱼类相关的免疫制剂或饲料添加剂，具有广阔的应用潜力；

（3）将斜带石斑鱼CaM核苷酸序列在巴斯德毕赤酵母重组菌株中表达，可以应用于产业化生存，降低了成本的投入，具有较高的经济价值。

附图说明

图1是斜带石斑鱼CaM基因ORF的PCR扩增产物的电泳鉴定图；

图2是石斑鱼CaM基因ORF连接酶切接头（EcoRI 、XbaI）的PCR扩增产物的电泳鉴定图；

图3是克隆载体pMD18-T-CaM双酶切（EcoRI 、XbaI）和表达载体pPICZaA双酶切（EcoRI 、XbaI）的电泳鉴定图；

图4是pPICZaA表达载体和所构建的pPICZaA-CaM表达载体单酶切（Sacl）的电泳鉴定图；

图5是重组菌株pPICZaA-CaM-X-33表达产物CaM重组蛋白的Tricine-SDS-Page电泳分析图；

图6是重组菌株pPICZaA-CaM-X-33表达产物CaM重组蛋白的western blot鉴定图；

图7是pPICZaA-CaM毕赤酵母表达载体构建示意图；

图8是斜带石斑鱼CaM蛋白的氨基酸序列和人CaM蛋白的氨基酸序列对比图；

图9是斜带石斑鱼CaM蛋白抗原表位预测分析结果；

图10是重组菌株pPICZaA-CaM-X-33高密度发酵产物CaM重组蛋白的SDS-Page电泳分析图；

图11是在低温应激中的，A，B，C三组鱼血细胞数目随应激时间的变化情况；

图12是在低温应激中A、B、C三组鱼血细胞呼吸爆发水平随应激时间的变化情况；

图13是在低温应激中A、B、C三组鱼血细胞凋亡情况随应激时间的变化情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件。

一、通过设计兼并引物获得斜带石斑鱼 CaM 基因的 ORF

依据CaM蛋白氨基酸序列在各个物种中的保守性，设计兼并引物。第一条引物为CAMS1，【5’-GACATGGCTGACCAACTAACA】（SEQ ID NO:3），第二条引物为CAMA1，【5’-AGTTCATTTGGCGGTCATAA】（SEQ ID NO:4），以M-MLV reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA)反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，经过touchdown PCR技术，获得PCR扩增产物，对其进行测序并比对，确定为CaM基因，其长度为468bp（SEQ ID NO：1），并推测出其氨基酸序列（SEQ ID NO：2）。PCR反应条件为：94℃预变性4分钟；（1）94℃变性30s,退火72℃ 30s，共5个循环；（2）94℃变性30s,退火70℃ 30s，延伸72℃，共5个循环；（3）94℃变性30s，退火53℃ 30s，延伸72℃，共30个循环；最后72℃继续延伸10分钟。PCR扩增产物的电泳图见图1，其中：M为DS2000 Marker；1，2为PCR扩增产物。PCR产物送去华大基因公司测序，测序结果和比对结果一致。

二、生物信息学方法分析斜带石斑鱼 CaM 蛋白序列

使用clustal-X和GeneDoc两个序列分析软件，将斜带石斑鱼CaM基因的氨基酸序列和人CaM基因的氨基酸序列进行序列比对，发现斜带石斑鱼CaM蛋白序列和人类CaM蛋白序列有较高的同源性（图8），并通过DNAstar软件分析斜带石斑鱼CaM蛋白的抗原表位（图9）。

三、斜带石斑鱼 CaM 基因序列的合成

根据分析好的斜带石斑鱼CaM基因的cDNA序列，设计合成上下游两端的引物。上游引物是CAMSP，在该片段第一位碱基起前加入EcoR1的限制酶切位点以及其保护碱基【5’- CCGGAATTCATGGCTGATCAGCTTACAGA】（SEQ ID NO:5）；下游引物是CAMAP1M，在该片段后插入XbaI的限制酶切位点以及该酶切位点的保护碱基、6×his标签、终止密码子【5’- TGCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGCTTCGCCGTCATCATTTGT】（SEQ ID NO:6）。以反转录得到的斜带石斑鱼肝脏cDNA为模板，经PCR方法扩增石斑鱼的CaM基因，PCR反应条件为：94℃预变性3分钟；下边为40个循环：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30分钟；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物的电泳鉴定图见图2，其中，M：DS 2000 marker；1，2：PCR扩增产物。从图2可见PCR扩增后获得一段约460bp的序列。

四、含斜带石斑鱼 CaM 序列的克隆载体 pMD18-T-CaM 的构建

将上述所获得的基因片段分离纯化，然后与pMD18-T（TAKARA）载体按照该试剂盒提供的体系4℃连接过夜（13h），将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经Amp+抗性和蓝白斑筛选出阳性克隆；通过质粒小提试剂盒(Omega，USA)提取质粒，质粒经过双酶切验证以及测序验证，证明斜带石斑鱼CaM序列克隆到载体中，命名为pMD18-T-CaM，克隆载体转化大肠杆菌DH5α所得到的重组菌株命名为pMD18-T-CaM-DH5α。使用EcoRI 、 XbaI对克隆载体pMD18-T-CaM进行双酶切，酶切图谱见图3所示：M为DS 5000 Marker；1：为pMD18-T-CaM的EcoRI 、 XbaI 双酶切产物；2：pPICZaA表达载体的EcoRI 、 XbaI 双酶切产物。

五、含斜带石斑鱼 CaM 序列的表达载体 pPICZaA- CaM 的构建

克隆载体pMD18-T-CaM经小提质粒试剂盒（Omega,USA）抽提后，用限制性内切酶EcoRI和XbaI进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，产物用E.Z.N.A.^® Gel Extraction Kit回收，分离纯化约460bp的斜带石斑鱼CaM序列；

载体质粒pPICZaA经限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切后分离纯化3.6kb的大片段，与约460bp的斜带石斑鱼CaM的基因片段以1:3比例混合，用T4连接酶于16℃过夜连接（约15h）。然后，用CaCl₂法将质粒转入大肠杆菌DH5a中，于低盐LB平板筛选出具Zeocin抗性的转化子。以标准方法提取质粒，筛选大小约4.0 kb的重组质粒，经送往Invitrogen公司测序，对测序结果进行比对，为斜带石斑鱼CaM的基因序列，并正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZaA中，重组质粒命名为PICZaA-CaM。质粒构建流程见图7。使用EcoRI 、 XbaI对表达载体pPICZaA-CaM进行双酶切，酶切分析图见图4，其中M：DS5000 Marker；1：pPICZaA载体；2：pPICZaA载体的Sac1酶切产物；3：表达载体pPICZaA-CaM；4：pPICZaA-CaM表达载体的Sac1酶切产物。

六、能高效表达斜带石斑鱼 CaM 蛋白的毕赤酵母重组菌株 pPICZaA-CaM -X-33 构建

按照Invitrogen公司的The Easyselect^TM Pichia Expression Kit说明书制备毕赤酵母X-33感受态细胞，重组质粒pPICZaA-CaM用SacI 线形化后凝胶回收，用电击法将重组质粒pPICZaA-CaM转化到毕赤酵母X-33感受态细胞中，在含有Zeocin 350μg/ml的YPDS平板上28℃进行培养。约3d后长出单克隆菌株。挑取单克隆经诱导培养与鉴定筛选出能高效表达斜带石斑鱼CaM重组蛋白的毕赤酵母重组株pPICZaA- CaM -X-33。

七、利用毕赤酵母基因工程菌 pPICZaA- CaM -X-33 生产重组斜带石斑鱼 CaM 蛋白

分别挑取各单克隆工程菌，接种于BMGY中，28℃，200rpm培养OD600至2-6，离心换等体积培养基BMMY，稀释OD600至1.0，每隔24h向培养基中补加0.5%甲醇，培养约96h后，5000rpm离心2min，4℃收集上清。取约1ml上清，用DOC-TCA-丙酮沉淀法对蛋白进行浓缩后，加入5×电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，同时取阴性对照按同样方法处理后电泳。阴性对照为空载质粒pPICZaA转化X-33后长出的单克隆培养后的上清蛋白。结果见图5，其中：M：蛋白分子量标准；NC：重组菌株pPICZaA- X-33表达产物；1：重组菌株pPICZaA- CaM-X-33表达产物。NC作为阴性对照，位于17Kd和26Kd之间出现一条新的蛋白条带，而阴性对照不出现此蛋白带。

八、斜带石斑鱼 CaM 蛋白抗原活性鉴定实验

采用蛋白印迹方法（western blot）对重组斜带石斑鱼CaM蛋白进行免疫鉴定。其中，一抗采用鼠源his单克隆抗体（Novagen），二抗采用马抗小鼠IgG-AP(鼎国生物公司)。结果如图6所示。其中，M：蛋白分子量标准；NC：重组菌株pPICZaA-X-33表达产物Western blot鉴定图谱；1：重组菌株pPICZaA- CaM-X-33表达产物Western blot鉴定图谱。NC作为阴性对照，说明鼠源his单克隆抗体能够识别带有6×his标签的重组斜带石斑鱼CaM蛋白，证明得到的蛋白为斜带石斑鱼CaM蛋白。

九、毕赤酵母工程菌 pPICZaA- CaM -X-33 的高密度发酵

发酵过程参照Invitrogen公司的Pichia Fermentation Process Guidelines，具体步骤如下：

1. 分别在YPDS(Zeocin⁺)提取单克隆菌株，pPICZαA-CaM-X-33和pPICZαA-X-33，其中pPICZαA-X-33菌株作为空载对照。加入200ml MGY液体培养基到1L的锥形瓶中，30℃，200rpm振荡培养至OD600=2-6（约16-24h）。

2. 组装好发酵罐，加入3L含有4% 甘油的发酵基础培养基（配方见Pichia Fermentation Process Guidelines），然后121℃，灭菌15min，待冷却后，用流加瓶加入氨水，调pH到5。

3. 在火焰圈保护下，将步骤1.1中摇好的菌种接种于发酵罐中。调节通气量，灌压，转速来维持溶氧，使其高于20%。设定发酵温度为28℃，自动流加氨水控制pH 5±0.05。

4. 当发酵罐中的甘油耗尽后（约接种后20个小时），用流加瓶流加每升含12ml PTM1（配方见Pichia Fermentation Process Guideline），设置流加速度为54.45ml/h，直到细胞湿重为200 g/liter结束（流加大约4个小时）。

5. 甘油消耗尽后，开始添加每升含12ml PTM1的甲醇，设定流加速度为10.8 ml/h，两个小时，设定流加速度为21.9 ml/h；两个小时后，设定流加速度为32.7 ml/h，保持这个速度直到发酵结束。这个阶段需要60个小时，总共添加约1.2L的甲醇。此时的细胞湿重约为290 g/liter。

6. 分别取pPICZαA-CaM-X-33与pPICZαA-X-33发酵的菌液各1ml，上清用DOC-TCA-丙酮沉淀法浓缩后，加5×电泳上样缓冲液，煮沸10分钟后按标准方法跑Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳，pPICZαA-X-33发酵的菌液做为阴性对照组，结果见图10。其中，M：蛋白分子量标准；NC：空载菌株pPICZαA-X-33表达产物；1：重组菌株pPICZaA- CaM-X-33表达产物。显示pPICZaA- CaM -X-33在17Kd和26Kd之间出现一条蛋白条带，而阴性对照不出现此带。结果说明，pPICZaA- rC3B -X-33菌种发酵产生了高浓度的重组蛋白。

7. 把发酵液用喷雾干燥器处理，得到粉末，pPICZaA-CaM -X-33菌种的发酵液粉末做为饲料添加剂，pPICZαA-X-33菌种的发酵液粉末做为对照，用于饲养实验。

十、动物实验

1 实验条件

选取同一批次、体质健康、规格相近的斜带石斑鱼放养在养殖桶中。水温25～30℃，水体盐度28～32‰，pH值8.1～8.3，溶解氧值大于5.0 mg/L，并且水体持续循环。

2 饲料配置

饲料共分为3种，A为商品料，B为商品料＋1wt% pPICZαA-X-33菌种的发酵液粉末，C为商品料＋1wt%pPICZaA- CaM-X-33菌种的发酵液粉末。（分别将各组粉料搅拌均匀，每天投喂前准确称量，用水稀释后制备成湿颗粒饲料投喂）。

3 实验鱼饲养

本试验设3个实验组，每组30条鱼。分别投喂A、B、C组饲料。试验鱼平均体重0.90±0.03g，长度为3±0.6cm。养殖水不断充气，水温29± 2℃，水体pH值8.1～8.3，水体盐度28～32‰。上午和下午按照鱼体重的8%左右各投喂一次，雨天少量投喂。每天及时清理残饵，观察记录，饲养时间7周。实验前禁食一天。

4.应激实验

4.1实验计划

取用饲喂的斜带石斑鱼做温度应激实验，应激温度为10± 0.5℃。实验准备1.0 m×0.5 m× 0.5 m的储物箱3个，在每个储物箱先装满40L的海水，并将装有海水的储物箱置于气候箱中并放入水温计来测定水温，待水温稳定在10±0.5℃，然后每个储物箱分别放A，B，C三组鱼各30条鱼，将做低温应激实验的储物箱置于气候箱中并放入水温计来测定水温。应激12小时，分别在0小时、3小时、6小时、12小时取样，每组取6尾。

4.2血细胞计数以及渗透压的测定

用1 ml一次性无菌注射器臀鳍下方尾静脉或尾动脉抽血，取完血后，拔下针头，将血液注入玻璃采血管中，4℃下静置，取血清。血细胞计数板的计数血细胞方法按照WHO手册进行计数，分别计数血细胞3次，取3次结果的平均值为计数结果。

4.2.1血细胞计数的测定原理

细胞的计数一般使用血球计数板。每块计数板由H形凹槽分为2个同样的计数池，计数池高0.1mm。计数池分为9个大方格，每个大格面积为1.0mm.容积为0.1mm³（μl），其中，中央大方格分成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域。四角的4个大方格是白细胞计数区域。在计数血细胞时，要计算位于中央的大方格中，其正中及四角5个中方格的总细胞数目，再根据公式细胞数/ml=五个中方格内的细胞个数/5×25×10000×稀释倍数。

4.2.2血细胞计数的测定方法

视待测血细胞的浓度，加抗凝剂适当稀释（一般稀释100倍），然后取洁净的血球计数板一块，并在计数区内盖上一块盖玻片。将血细胞轻轻吹打混匀，用移液枪吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴，让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生。静置片刻后，把血球计数板放在显微镜的载物台上然后观察并计数中央的大方格中，其正中及四角5个中方格的总细胞数目。在计数时，要遵循原则：数上线不数下线，数左线不数右线。测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净。每个血样分别计数血细胞3次，取3次结果的平均值为计数结果。

结果显示：应激过程中，在10±0.5℃应激0小时，三种饲料喂养的鱼血细胞数目并没有明显差异。应激3小时后，A，B，C三组的血细胞数目均有下降，但是C组的血细胞数目高于A、B组。应激6小时后，A，B，C三组的血细胞数目进一步下降，但是C组的血细胞数目下降较A、B组少，数目明显高于A、B组。应激12小时后，A，B，C三组的血细胞数目均有上升，C组的血细胞数目略高于A，B组，没有明显差异（见图11）。

4.3 呼吸爆发的测定

4.3.1细胞呼吸爆发的测定原理

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，是机体进行正常细胞生长增殖、发育分化过程中产生，参与了机体衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。2，7-二氯氢化荧光素二脂（2,7-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA）是迄今为止最常用、最灵敏的细胞内活性氧检探针。本身没有荧光的DCFH-DA可穿过细胞膜进入细胞，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。在激发波长502nm，发射波长530nm附近，使用流式细胞仪的FL1通道检测DCF荧光，从而测定细胞内活性氧水平。

4.3.2血细胞呼吸爆发的测定方法

取200μl的血细胞悬液，加入200μl PBS缓冲液（MAS抗凝剂进行稀释），混匀，调整细胞的浓度为1×10⁶个/ml左右，使用荧光染料2，7-二氯氢化荧光素二脂（DCFH-DA）（终浓度10 μM）25℃下避光染色30min。然后使用200目的筛网过滤将细胞悬液转移到上样管中，使用流式细胞仪进行检测，并用Cellquest 软件分析DCF平均荧光强度的变化。

结果显示：A，B，C三组鱼受到低温10±0.5℃应激后，应激0小时，三种饲料喂养的鱼血细胞的活性氧（呼吸爆发）并没有明显差异。随着应激时间的延长，血细胞的活性氧（呼吸爆发）水平不断升高，在6小时达到最大值，并且A，B组的活性氧含量明显高于C组。应激12小时后，A，B，C三组的血细胞的活性氧（呼吸爆发）均有下降，但是C组的血细胞的活性氧（呼吸爆发）明显低于A，B组（见图12）。

4.4 细胞凋亡测定

4.4.1血细胞凋亡的测定原理

细胞凋亡是细胞程序性死亡，当细胞发生凋亡时候，细胞膜的通透性增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。血淋巴细胞凋亡的测定原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由膜脂内侧翻向外侧。Annexin V是一种依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。用标记了FITC的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生，正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的。碘化丙啶( propidine iodide,PI) 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够细胞膜与细胞核结合呈现红色。将Annexin V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。在双参数流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为( FIT C－/ PI－) ；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为( FIT C＋/ PI＋) ；而右下象限为凋亡细胞, 显现( FIT C＋/ PI－) 。

4.4.2血淋巴细胞凋亡的测定方法

使用Annexin V/PI apoptosis kit，购自联科生物。具体步骤：

收集血细胞，用MAS抗凝剂进行稀释，调整血细胞浓度大约为1×10⁶ -5×10⁶ cells/ml，取200μl稀释的血细胞，在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-FITC和10μl PI后轻轻混匀，在黑暗环境下静置5分钟，然后使用200目的筛网过滤将细胞悬液转移到上样管中，使用流式细胞仪进行检测。

结果表明：A，B，C三组鱼受到低温10±0.5℃应激后，应激0小时，三种饲料喂养的鱼血细胞的细胞凋亡数目并没有明显差异。随着应激时间的延长，血细胞的细胞凋亡数目不断增加，A、B组血细胞的细胞凋亡数目增加比C组多，在6小时达到最大值，并且A、B组的细胞凋亡数目明显高于C组。应激12小时后，A、B、C三组的血细胞的细胞凋亡数目均有下降，但是C组的血细胞的细胞凋亡数目明显少于A、B组，并且差异显著（见图13）。

以上实验表明：实验组C组，食用了含有重组蛋白CaM的饲料后，在低温应激过程中，其抗应激能力明显优于对照组A、B。由此可见，重组蛋白CaM能够提高鱼类尤其是石斑鱼的免疫力，可用于制备水产动物免疫制剂或饲料添加剂。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 华南师范大学

<120> 斜带石斑鱼钙调蛋白基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 468

<212> DNA

<213> Epinepheluscoioides

<400> 1

atggctgatc agcttacaga agagcagatt gctgagttca aggaggcatt ttcgctcttt 60

gacaaggatg gcgatggcac catcaccacc aaagagctgg gcacagtgat gcgctctctg 120

ggccagaacc ccactgaggc agagctgcag gacatgatca atgaagtgga tgctgatgga 180

aatggaacga tagacttccc agagttcctc accatgatgg ccaggaagat gaaggacaca 240

gacagcgagg aggagatcag agaagcattc cgtgtctttg acaaggatgg caatggatac 300

atcagtgctg ctgagctgcg ccatgtgatg acaaacctgg gggagaagct gactgacgag 360

gaagtggacg agatgatcag agaagcagac attgacggag atggtcaggt caactatgaa 420

gagttcgtac aaatgatgac ggcgaagcat catcatcatc atcattaa 468

<210> 2

<211> 149

<212> PRT

<213> Epinepheluscoioides

<400> 2

Met Ala Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu Phe Lys Glu Ala

1 5 10 15

Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile Thr Thr Lys Glu

20 25 30

Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro Thr Glu Ala Glu

35 40 45

Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly Asn Gly Thr Ile

50 55 60

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Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val Phe Asp Lys Asp

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Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Glu Leu Arg His Val Met Thr Asn

100 105 110

Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu Met Ile Arg Glu

115 120 125

Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu Glu Phe Val Gln

130 135 140

Met Met Thr Ala Lys

145

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gacatggctg accaactaac a 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agttcatttg gcggtcataa 20

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccggaattca tggctgatca gcttacaga 29

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgctctagat taatgatgat gatgatgatg cttcgccgtc atcatttgt 49

Claims (9)

1.斜带石斑鱼钙调蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等或更高活性的蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种克隆载体，含有权利要求2或3所述的基因。

5.一种表达载体，含有权利要求2或3所述的基因。

6.生产斜带石斑鱼钙调蛋白的方法，包括将权利要求5所述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到斜带石斑鱼钙调蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母。

8.权利要求1所述的蛋白在制备水产动物免疫增强剂中的应用。

9.一种免疫增强剂，含有权利要求1所述的蛋白。

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