CN100566752C

CN100566752C - 鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN100566752C
Application number: CNB2006101229193A
Authority: CN
Inventors: 何建国; 张旻; 翁少萍
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2006-10-23
Filing date: 2006-10-23
Publication date: 2009-12-09
Anticipated expiration: 2026-10-23
Also published as: CN101168054A

Abstract

本发明提出一种鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗及其制备方法，本发明所提出的基因工程疫苗，含有两个基因重组蛋白抗原protein-24和protein-50，它们分别由筛选自ISKNV基因组中的2个开放读码框ORF24和ORF50，将其克隆，制备重组质粒，表达重组蛋白而成。该疫苗是一种重组蛋白疫苗，可以抑制传染性脾肾坏死病毒对鱼体的感染，使水产鱼类可以健康生长，减少水产业在疾病方面的损失，增加水产产量和效益，同时避免DNA疫苗所存在的弊端。

Description

鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，具体涉及鱼类传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)基因工程疫苗及其制备方法。

背景技术

随着我国水产业的不断发展，各种水产养殖面积和养殖密度不断增加，同时养殖上管理技术的不当，使得养殖水环境日趋恶化，各种疾病频频暴发。在至今报道的多种疾病中，给鱼类养殖带来严重经济损失主要原因之一是病毒病。其中，传染性脾肾坏死病毒(ISKNV，Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)就是其中一种主要的造成鱼类大量死亡的病毒。

该病毒成熟病毒粒子直径150nm。受感染细胞肿大，直径为正常细胞3～4倍，感染后10天内死亡率为90％-100％。由于，这种病毒在多种的鱼类中都发现感染现象，并且主要感染鱼的脾和肾，导致脾肾坏死，因此，暂命名为传染性脾肾坏死病毒。同时，也根据当时的研究，初步确定这种病毒属于虹彩病毒科。ISKNV由此得名。

近年来，在许多国家和地区陆续有报道由ISKNV引起的水产经济动物的大批死亡。在我国，也陆续在鳜鱼、美国红鱼、石斑鱼和大黄鱼等水产养殖中发现ISKNV病害，1994-1998年间和最进两年都有不同地区爆发该病，给水产养殖业带来大量损失。

目前国内外尚无有效抑制传染性脾肾坏死病毒的药物。

通常养殖者采用生石灰、硫酸铜、次氯酸盐、碘盐或投放抗生素等方法，通过改变水体环境抑制病毒的生长。但该病毒生命力非常顽强，暂时的环境变化只能短时间抑制其扩散，并不能将其杀死。长时间下去必将大规模扩散，尤其在水温27-30℃的时候更有可能大规模爆发。如果长期性、经常性的投放以上药物对鱼体本身的生长也相当不利。传统的抗生素对该病毒也不起作用。

日本、韩国有相关报道利用DNA疫苗控制与ISKNV相似的其他虹彩病毒，并取得了一定成果。DNA疫苗是一种利用编码具有免疫活性的特定抗原的病毒DNA来直接诱导鱼体免疫反应的疫苗，但与重组蛋白疫苗相比，其具有潜在的危险性：(1)被注射的、可由宿主吸收的DNA有可能被整合到宿主的染色体中，并引起插入突变。在理论上，外源DNA引人体内敏感细胞中可能通过插入活化致癌基因，插入激活宿主细胞原致癌基因或插入灭活抑制基因引起肿瘤细胞形成.尽管这种概率很低；(2)外源抗原的长期表达可能导致不利的免疫病理反应；(3)使用编码细胞因子或协同刺激分子的基因可能具有额外的危害；(4)有可能形成针对注射DNA的抗体和出现不利的自身免疫紊乱；(5)所表达的抗原可能产生意外的生物活性。

发明内容

本发明的目的是提出一种可以使水产鱼类产生抗ISKNV免疫力的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗及其制备方法，该疫苗是一种重组蛋白疫苗，可以抑制传染性脾肾坏死病毒对鱼体的感染，使水产鱼类可以健康生长，减少水产业在疾病方面的损失，增加水产产量和效益，同时避免DNA疫苗所存在的弊端。

从传染性脾肾坏死病毒ISKNV全基因序列中筛选两个与病毒感染细胞密切相关的开放读码框(Open Reading Frame，ORF)ORF24和ORF50，将其克隆，制备重组质粒，表达重组蛋白，再以重组蛋白为抗原，制备基因工程疫苗，对鱼类进行免疫试验，证明该疫苗可以使水产鱼类产生抗ISKNV免疫力。

本发明所提出的基因工程疫苗，含有两个基因重组蛋白抗原protein-24和protein-50，

所述的protein-24和protein-50的氨基酸序列分别为：

protein-24：

MDKYVLRPSDPHLWAMYKKAVASFWTVEEVDLSTDVRHWTEKLTEAERRFMSHILAFFAMADGIVGDNLVCNFAKELDYI

PEARAFYGFQVAMENIHAEMYTQLIITLVAKENQAALFSAAEDMPCVKAKAQWAAQWLNATHKSIATRLLAFAAVEGVMF

SGSFAAIFWLKKRSLMPGLAFSNELISRDEGLHCDFACMLFRQMANKPCQDDAHQIISDAVDIETAFFQEALKTPLLGMN

SDSMRLYIQFVADRLLDALGYAKMYNVANPFDFMDNISIEGKTNFFERRVSEYQRMGVFTPSSMEFTMTEDF.

protein-50：

MYPECPGMEECLIDLFAKHGYTWWFRRVMFAYNRDKIHTPVPVTPNLYAHVLREICDSDNPALTYATFIAMCAVTCGTAT

KDCAVQCANALANDQGFQAIGWARLYRYMTEELPDHFETVGALCIACVFFGSTVYMCARLMK.

所述的基因工程疫苗中还包括有佐剂(MONTANIDE ISA 763A，seppic，france)。

所述的两个基因重组蛋白protein-24和protein-50，它们分别由筛选自ISKNV基因组中的2个开放读码框ORF24和ORF50，将其克隆，制备重组质粒，表达重组蛋白而成。

本发明疫苗的具体制备方法如下：

以病鱼脾脏基因组DNA为模板，根据序列设计PCR引物如下：

ORF24扩增引物：

Primer24F：5’-CGGGATCCATGGATAAGTATG-3’

Primer24R：5’-CGGGGTACCTTAGAAATCTTCAGTC-3’

ORF50扩增引物：

Primer50F：5’-ATGGATCCATGTACCCTGAG-3’

Primer50R：5’-GCGCGCTGCAGTTATTTCATAAGTC-3’

ORF24扩增长度939bp，ORF50扩增长度429bp。

得到PCR扩增片断后，再利用质粒载体pET-32a，通过酶切、连接、抗性筛选，制备并提纯重组质粒ORF24-pET-32a和ORF50-pET-32a，利用大肠杆菌DE3原核表达并纯化重组蛋白protein-24和protein-50。将两种蛋白作为抗原，以质量比1∶1均匀悬浮于PBS缓冲液中。

制备疫苗时，将蛋白溶液与佐剂(MONTANIDE ISA 763A，seppic，france)以体积比1∶1混匀，直至呈现水乳交融状态，则疫苗制备完成，于4℃保存。

为了检验该疫苗抗原是否适合大规模工业化生产。我们利用发酵罐sartorius BBI systemsGMBH(5L)制备抗原蛋白，结果使用普通LB培养基也可制备8g左右，符合工业化生产标准。

本基因工程疫苗的免疫试验效果如下：

免疫步骤：

免疫方式一般采用背部肌肉注射或胸鳍腹腔注射。抗原注射量以0.5g/kg为标准。疫苗注射体积按鱼体重决定，平均体重500g以下的注射0.1-0.5ml/尾，500g以上的注射1ml/尾。

例如：在广东南海利用传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗共免疫2000尾鳜鱼，平均体重约100g。则每尾注射疫苗0.1ml，总共需要疫苗体积200ml，包含抗原100mg，再按以上工艺流程制备。

疫苗注射后大约1个月鱼体产生抗体，免疫力至少可持续半年。建议在鱼龄较小时注射疫苗，这样效果更佳。

本疫苗适用于鳜鱼、石斑鱼、军曹鱼、大黄鱼等鱼类防治病害，无论淡水环境还是海水环境皆有效，还适用于池塘养殖和网箱养殖。

免疫试验试验情况和分析：

(1)鳜鱼主动免疫试验

实验原料为0.5公斤左右的鳜鱼。抽查检测无感染ISKNV。利用鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗进行实验。

实验分为三组，阳性对照，阴性对照，抗原组。每组20尾鱼。疫苗组以0.5mg抗原/kg为标准(以下亦同)注射混合疫苗，一个月后攻毒。攻毒时阴性对照只注射1ml PBS/尾，阳性对照和疫苗组注射病毒液1ml/尾。将水温升至28℃，饲养3个星期，观察鳜鱼状态，免疫结果如下(表1)。

从表1显示，阳性对照组两个星期后全部发病死亡。阴性对照一直状况良好。疫苗组共死亡5尾，剩余15尾于3星期后一直良好。可见ORF24+50的混合抗原有一定免疫作用，保护率75％左右。

(2)广东南海池养鳜鱼中试试验

2005年6月，在广东南海利用该疫苗共免疫了2000尾鳜鱼(约100g)。免疫1个月，随机获取20尾已经免疫的鳜鱼进行攻毒保护实验，同时取40尾同一个鳜鱼育苗场同一批次没有免疫的鳜鱼，分成三组，即阳性对照组，阴性对照组和抗原组，每组20尾。先在实验室28℃水温暂养7天，然后注射感染ISKNV或PBS，免疫结果如下(表2)

从表2显示，阳性对照组(没有免疫)感染ISKNV两个星期后全部发病死亡，死亡率100％。阴性对照(没有免疫也没有感染病毒)一直状况良好，没有死亡发生。抗原组(免疫且攻毒组)3个星期内共死亡6尾，存活14尾，保护率70％。ORF24+50的混合抗原有较好的免疫保护作用。

由试验显示，本疫苗具有以下优点：

a.鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗对鳜鱼、斜带石斑鱼、大黄鱼、军曹鱼等水产鱼类具有较强的免疫保护作用，保护率超过70％。

b.疫苗本身不含对人体有害的成分，对注射疫苗的鱼类可以安全食用。

c.疫苗本身对鱼类生长没有影响，在保证水环境和饲料的情况下，被免疫的鱼类生长良好。

d.免疫力持续时间长达半年以上。

e.疫苗制备流程相对简便，在原材料充足的前提下，实验室条件下一个星期左右即可制备出上千尾鱼的注射量。

f.疫苗本身不易失效，普通冰箱4℃放置一周仍有效。

g.适合大规模工业化生产。利用发酵罐sartorius BBI systems GMBH(5L)制备抗原蛋白，使用普通LB培养基也可制备8g左右。

h.生产成本相对较低。

附图说明

图1是PCR扩增ORF24电泳鉴定结果。

图2是PCR扩增ORF50电泳鉴定结果。

图3是重组质粒ORF24-pET-32a酶切、电泳鉴定结果。

图4是重组这里ORF50-pET-32a酶切、电泳鉴定结果。

图5是ORF24基因诱导表达蛋白SDS-PAGE结果。

图6是ORF50基因诱导表达蛋白SDS-PAGE结果。

图7是表达质粒pET-32a构建图。

具体实施方式

疫苗组成：

本疫苗由含有两个基因重组蛋白protein-24和protein-50抗原的蛋白溶液和佐剂(MONTANIDE ISA 763A，seppic，france)组成，

所述的基因重组蛋白protein-24和protein-50的制备：

在ISKNV基因组中筛选了2个编码ISKNV囊膜蛋白开放读码框(Open Reading Frame，ORF)ORF24和ORF50。ORF24编码蛋白长度为313AA，在148-170位置上有一跨膜区。ORF50编码蛋白长度为143AA。在116-138AA位置上有一跨膜区。

所用ORF碱基序列为：

ORF24：

ATGGATAAGTATGTGCTCAGACCAAGCGACCCACATTTGTGGGCCATGTACAAGAAGGCCGTTGCGTCTTTTTGGACCGT

TGAGGAGGTGGATCTTAGTACTGATGTACGCCATTGGACAGAAAAACTGACCGAGGCTGAGCGCAGGTTCATGTCTCACA

TACTGGCATTCTTTGCAATGGCAGATGGCATTGTAGGCGACAACCTTGTGTGCAATTTCGCAAAAGAACTTGACTATATT

CCAGAAGCCAGAGCTTTCTATGGGTTTCAGGTGGCAATGGAAAATATACATGCTGAAATGTATACTCAGCTGATTATCAC

ATTAGTAGCTAAAGAGAATCAAGCCGCATTGTTTTCAGCAGCTGAAGATATGCCATGTGTTAAAGCCAAGGCACAGTGGG

CTGCACAATGGCTGAATGCCACACATAAGTCTATCGCAACACGTCTCTTGGCCTTTGCGGCTGTTGAAGGCGTCATGTTT

TCTGGGTCATTTGCGGCCATATTCTGGCTGAAGAAACGTTCGCTCATGCCAGGGTTGGCGTTTTCCAACGAGTTGATTAG

CCGTGACGAAGGTCTACACTGTGACTTTGCTTGTATGCTGTTTAGGCAAATGGCAAACAAACCGTGTCAGGACGATGCAC

ATCAAATCATATCTGATGCCGTTGACATTGAGACGGCTTTCTTCCAAGAGGCACTAAAGACACCCCTACTTGGTATGAAT

AGTGACAGTATGAGACTGTACATACAGTTTGTTGCAGATCGCCTGCTCGATGCCCTGGGTTATGCAAAGATGTATAACGT

TGCCAATCCATTTGATTTCATGGATAACATTAGCATTGAAGGTAAAACAAACTTCTTTGAACGCCGTGTGAGTGAATATC

AGCGAATGGGTGTTTTCACGCCAAGCAGCATGGAATTTACAATGACTGAAGATTTCTAA

ORF50：

ATGTACCCTGAGTGTCCCGGAATGGAAGAGTGTCTCATCGACCTCTTTGCAAAGCACGGGTACACGTGGTGGTTCA

GACGCGTCATGTTTGCCTACAACAGAGACAAAATCCACACCCCTGTGCCAGTGACTCCGAACTTGTATGCCCATGTCCTG

AGAGAGATTTGCGACAGCGATAACCCAGCACTGACGTATGCAACTTTCATCGCCATGTGCGCCGTGACCTGCGGTACCGC

CACCAAAGACTGTGCTGTGCAATGTGCCAATGCATTGGCCAACGACCAAGGCTTTCAGGCCATAGGCTGGGCCCGCCTGT

ACCGCTACATGACAGAAGAATTACCTGACCATTTCGAGACAGTGGGTGCACTGTGCATTGCCTGTGTGTTCTTTGGAAGC

ACTGTGTATATGTGTGCAAGACTTATGAAATAA

以病鱼脾脏基因组DNA为模板，根据序列设计PCR引物如下：

ORF24扩增引物：

Primer24F：5’-CGGGATCCATGGATAAGTATG-3’

Primer24R：5’-CGGGGTACCTTAGAAATCTTCAGTC-3’

ORF50扩增引物：

Primer50F：5’-ATGGATCCATGTACCCTGAG-3’

Primer50R：5’-GCGCGCTGCAGTTATTTCATAAGTC-3’

ORF24扩增长度939bp(如图1所示，图中，M为DNAMarker DL2000，1为PCR扩增产物)，ORF50扩增长度429bp(如图2所示，图中，M为DNA Marker DL2000，1、2、3为PCR扩增产物)。

得到PCR扩增片断后，再利用质粒载体pET-32a(如图7所示)，通过酶切、连接、抗性筛选，制备并提纯重组质粒ORF24-pET-32a(如图3所示，图中，M为DNA Marker DL2000，1为双酶切产物)和ORF50-pET-32a(如图4所示，M为DNA Marker DL2000，1为双酶切产物)，利用大肠杆菌DE3原核表达并纯化重组蛋白protein-24(如图5所示，图中，M为蛋白Marker，1为ORF24表达产物with IPTG，2为ORF24表达产物without IPTG，3为空pET-32a表达产物with IPTG，4为空pET-32a表达产物without IPTG)和protein-50(如图6所示，图中，M为蛋白Marker，1、3为ORF50表达产物with IPTG，2、4、5、6、7为ORF50表达产物withIPTG，8为空pET-32a表达产物with IPTG，9为空pET-32a表达产物with IPTG)。将两种蛋白作为抗原，以质量比1∶1均匀悬浮于PBS缓冲液中。

疫苗制备：

将蛋白溶液与佐剂(MONTANIDE ISA 763A，seppic，france)以体积比1∶1混匀，直至呈现水乳交融状态，则疫苗制备完成，于4℃保存。

序列表

<110>中山大学

<120>鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗及其制备方法

<130>无

<140>200610122919.3

<141>2006-10-23

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>312

<212>PRT

<213>传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)

<220>

<221>TRANSMEM

<222>(148)..(170)

<400>1

Met Asp Lys Tyr Val Leu Arg Pro Ser Asp Pro His Leu Trp Ala Met

1 5 10 15

Tyr Lys Lys Ala Val Ala Ser Phe Trp Thr Val Glu Glu Val Asp Leu

20 25 30

Ser Thr Asp Val Arg His Trp Thr Glu Lys Leu Thr Glu Ala Glu Arg

35 40 45

Arg Phe Met Ser His Ile Leu Ala Phe Phe Ala Met Ala Asp Gly Ile

50 55 60

Val Gly Asp Asn Leu Val Cys Asn Phe Ala Lys Glu Leu Asp Tyr Ile

65 70 75 80

Pro Glu Ala Arg Ala Phe Tyr Gly Phe Gln Val Ala Met Glu Asn Ile

85 90 95

His Ala Glu Met Tyr Thr Gln Leu Ile Ile Thr Leu Val Ala Lys Glu

100 105 110

Asn Gln Ala Ala Leu Phe Ser Ala Ala Glu Asp Met Pro Cys Val Lys

115 120 125

Ala Lys Ala Gln Trp Ala Ala Gln Trp Leu Asn Ala Thr His Lys Ser

130 135 140 145

Ile Ala Thr Arg Leu Leu Ala Phe Ala Ala Val Glu Gly Val Met Phe

150 155 160

Ser Gly Ser Phe Ala Ala Ile Phe Trp Leu Lys Lys Arg Ser Leu Met

165 170 175

Pro Gly Leu Ala Phe Ser Asn Glu Leu Ile Ser Arg Asp Glu Gly Leu

180 185 190

His Cys Asp Phe Ala Cys Met Leu Phe Arg Gln Met Ala Asn Lys Pro

195 200 205

Cys Gln Asp Asp Ala His Gln Ile Ile Ser Asp Ala Val Asp Ile Glu

210 215 220 225

Thr Ala Phe Phe Gln Glu Ala Leu Lys Thr Pro Leu Leu Gly Met Asn

230 235 240

Ser Asp Ser Met Arg Leu Tyr Ile Gln Phe Val Ala Asp Arg Leu Leu

245 250 255

Asp Ala Leu Gly Tyr Ala Lys Met Tyr Asn Val Ala Asn Pro Phe Asp

260 265 270

Phe Met Asp Asn Ile Ser Ile Glu Gly Lys Thr Asn Phe Phe Glu Arg

275 280 285

Arg Val Ser Glu Tyr Gln Arg Met Gly Val Phe Thr Pro Ser Ser Met

290 295 300 305

Glu Phe Thr Met Thr Glu Asp Phe

310

<210>2

<211>142

<212>PRT

<213>传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)

<220>

<221>TRANSMEM

<222>(116)..(138)

<400>2

Met Tyr Pro Glu Cys Pro Gly Met Glu Glu Cys Leu Ile Asp Leu Phe

1 5 10 15

Ala Lys His Gly Tyr Thr Trp Trp Phe Arg Arg Val Met Phe Ala Tyr

20 25 30

Asn Arg Asp Lys Ile His Thr Pro Val Pro Val Thr Pro Asn Leu Tyr

35 40 45

Ala His Val Leu Arg Glu Ile Cys Asp Ser Asp Asn Pro Ala Leu Thr

50 55 60

Tyr Ala Thr Phe Ile Ala Met Cys Ala Val Thr Cys Gly Thr Ala Thr

65 70 75 80

Lys Asp Cys Ala Val Gln Cys Ala Asn Ala Leu Ala Asn Asp Gln Gly

85 90 95

Phe Gln Ala Ile Gly Trp Ala Arg Leu Tyr Arg Tyr Met Thr Glu Glu

100 105 110

Leu Pro Asp His Phe Glu Thr Val Gly Ala Leu Cys Ile Ala Cys Val

115 120 125

Phe Phe Gly Ser Thr Val Tyr Met Cys Ala Arg Leu Met Lys

130 135 140

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用来扩增传染性脾肾坏死病毒ORF24的PCR左端引物

<400>3

cgggatccat ggataagtat g 21

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用来扩增传染性脾肾坏死病毒ORF24的PCR右端引物

<400>4

cggggtacct tagaaatctt cagtc 25

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用来扩增传染性脾肾坏死病毒ORF50的PCR左端引物

<400>5

atggatccat gtaccctgag 20

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用来扩增传染性脾肾坏死病毒ORF50的PCR右端引物

<400>6

gcgcgctgca gttatttcat aagtc 25

<210>7

<211>939

<212>DNA

<213>传染性脾肾坏死病毒(Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(3)

<220>

<221>terminator

<222>(937)..(939)

<400>7

atggataagt atgtgctcag accaagcgac ccacatttgt gggccatgta caagaaggcc 60

gttgcgtctt tttggaccgt tgaggaggtg gatcttagta ctgatgtacg ccattggaca 120

gaaaaactga ccgaggctga gcgcaggttc atgtctcaca tactggcatt ctttgcaatg 180

gcagatggca ttgtaggcga caaccttgtg tgcaatttcg caaaagaact tgactatatt 240

ccagaagcca gagctttcta tgggtttcag gtggcaatgg aaaatataca tgctgaaatg 300

tatactcagc tgattatcac attagtagct aaagagaatc aagccgcatt gttttcagca 360

gctgaagata tgccatgtgt taaagccaag gcacagtggg ctgcacaatg gctgaatgcc 420

acacataagt ctatcgcaac acgtctcttg gcctttgcgg ctgttgaagg cgtcatgttt 480

tctgggtcat ttgcggccat attctggctg aagaaacgtt cgctcatgcc agggttggcg 540

ttttccaacg agttgattag ccgtgacgaa ggtctacact gtgactttgc ttgtatgctg 600

tttaggcaaa tggcaaacaa accgtgtcag gacgatgcac atcaaatcat atctgatgcc 660

gttgacattg agacggcttt cttccaagag gcactaaaga cacccctact tggtatgaat 720

agtgacagta tgagactgta catacagttt gttgcagatc gcctgctcga tgccctgggt 780

tatgcaaaga tgtataacgt tgccaatcca tttgatttca tggataacat tagcattgaa 840

ggtaaaacaa acttctttga acgccgtgtg agtgaatatc agcgaatggg tgttttcacg 900

ccaagcagca tggaatttac aatgactgaa gatttctaa 939

<210>8

<211>429

<212>DNA

<213>传染性脾肾坏死病毒(lnfectious Spleen and Kidney Necrosis Virus)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(3)

<220>

<221>terminator

<222>(427)..(429)

<400>8

atgtaccctg agtgtcccgg aatggaagag tgtctcatcg acctctttgc aaagcacggg 60

tacacgtggt ggttcagacg cgtcatgttt gcctacaaca gagacaaaat ccacacccct 120

gtgccagtga ctccgaactt gtatgcccat gtcctgagag agatttgcga cagcgataac 180

ccagcactga cgtatgcaac tttcatcgcc atgtgcgccg tgacctgcgg taccgccacc 240

aaagactgtg ctgtgcaatg tgccaatgca ttggccaacg accaaggctt tcaggccata 300

ggctgggccc gcctgtaccg ctacatgaca gaagaattac ctgaccattt cgagacagtg 360

ggtgcactgt gcattgcctg tgtgttcttt ggaagcactg tgtatatgtg tgcaagactt 420

atgaaataa 429

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用来扩增传染性脾肾坏死病毒ORF24的PCR左端引物

<400>9

cgggatccat ggataagtat g 21

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用来扩增传染性脾肾坏死病毒ORF24的PCR右端引物

<400>10

cggggtacct tagaaatctt cagtc 25

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用来扩增传染性脾肾坏死病毒ORF50的PCR左端引物

<400>11

atggatccat gtaccctgag 20

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>用来扩增传染性脾肾坏死病毒ORF50的PCR右端引物

<400>12

gcgcgctgca gttatttcat aagtc 25

Claims

1.一种鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗，其特征在于含有两个基因重组蛋白抗原protein-24和protein-50，以及佐剂MONTANIDE ISA 763A，两个基因重组蛋白抗原的质量比为1∶1，它们的氨基酸序列分别为：

protein-24：

MDKYVLRPSDPHLWAMYKKAVASFWTVEEVDLSTDVRHWTEKLTEAERRFMSHILAFFAMADGIVGDNLVCNFAKELDY

IPEARAFYGFQVAMENIHAEMYTQLIITLVAKENQAALFSAAEDMPCVKAKAQWAAQWLNATHKSIATRLLAFAAVEGV

MFSGSFAAIFWLKKRSLMPGLAFSNELISRDEGLHCDFACMLFRQMANKPCQDDAHQIISDAVDIETAFFQEALKTPLL

GMNSDSMRLYIQFVADRLLDALGYAKMYNVANPFDFMDNISIEGKTNFFERRVSEYQRMGVFTPSSMEFTMTEDF，

protein-50：

MYPECPGMEECLIDLFAKHGYTWWFRRVMFAYNRDKIHTPVPVTPNLYAHVLREICDSDNPALTYATFIAMCAVTCGT

ATKDCAVQCANALANDQGFQAIGWARLYRYMTEELPDHFETVGALCIACVFFGSTVYMCARLMK。

2.根据权利要求1所述的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗，其特征在于所述的基因重组蛋白抗原protein-24和protein-50分别由筛选自ISKNV基因组中的2个开放读码框ORF24和ORF50克隆重组而成。

3.权利要求1所述的鱼类传染性脾肾坏死病毒基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：在ISKNV基因组中筛选2个编码ISKNV囊膜蛋白开放读码框ORF24和ORF50，将其克隆，制备重组质粒，表达重组蛋白，再以重组蛋白为抗原，制备成基因工程疫苗，其具体方法如下：

以病鱼脾脏基因组DNA为模板，根据序列设计PCR引物如下：

ORF24扩增引物：

Primer24F：5’-CGGGATCCATGGATAAGTATG-3’

Primer24R：5’-CGGGGTACCTTAGAAATCTTCAGTC-3’

ORF50扩增引物：

Primer50F：5’-ATGGATCCATGTACCCTGAG-3’

Primer50R：5’-GCGCGCTGCAGTTATTTCATAAGTC-3’

ORF24扩增长度939bp，ORF50扩增长度429bp，

得到PCR扩增片断后，再利用质粒载体pET-32a，通过酶切、连接、抗性筛选，分别制备并提纯重组质粒ORF24-pET-32a和ORF50-pET-32a，利用大肠杆菌DE3原核表达并纯化重组蛋白protein-24和protein-50，将两种蛋白作为抗原，以质量比1∶1均匀悬浮于PBS缓冲液中，

将上述蛋白溶液与佐剂MONTANIDE ISA 763A按体积比1∶1混匀，直至呈现水乳交融状态，即制得本疫苗。