CN101926990A - 肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗及其制备方法和应用。本发明减毒活疫苗是利用基因工程原理将绿色荧光蛋白GFP报告基因替代肿大细胞病毒vsocs基因，构建重组转移载体，同源重组后，经分离、纯化，获得重组vsocs基因缺失的肿大细胞病毒，将其作为肿大细胞病毒基因工程疫苗。本发明减毒活疫苗具有免疫力强、用量少、成本低、可联合使用、同时启动细胞免疫和体液免疫、保护时间长、不需添加佐剂的优点，通过水体浸泡感染即可使宿主鱼体产生免疫，不仅弥补了传统肿大细胞病毒灭活疫苗、弱毒疫苗或基因工程亚单位疫苗的不足，还有利于大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
我国是世界海水养殖产业大国，养殖规模和产量居世界第一。但是，随着养殖品种的增多和养殖规模的扩大，各种养殖品种每年发病率均在50%以上，而死亡率高达20%以上，直接造成的经济损失每年超过百亿元人民币。病害已经成为水产养殖可持续发展的主要障碍。
肿大细胞病毒是新近出现的对鱼类具有重大危害作用的恶性传染病的病原，分子流行病学研究发现，有50多种的海水鱼类和近10种的淡水鱼类是这种病毒的携带者。肿大细胞病毒对世界各国，特别是东亚、东南亚及澳大利亚等国家和地区的水产养殖业构成巨大威胁，每年都能造成重大经济损失。目前，肿大细胞病毒的主要毒株有流行于于中国大陆的鳜传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、斜带石斑鱼虹彩病毒（OSGIV）、大黄鱼虹彩病毒（LYCIV）、大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）、斑石鲷虹彩病毒（SKIV）；流行于日本的真鲷虹彩病毒（RSIV）、石斑鱼昏睡病虹彩病毒(GSDIV)、非洲灯笼鱼虹彩病毒（ALIV）和闪电丽鱼虹彩病毒（DGIV）；流行于韩国的条石鲷虹彩病毒（RBIV）、牙鲆虹彩病毒（FLIV）、大菱鲆虹彩病毒(TBIV)；流行于中国台湾的真鲷虹彩病毒和台湾石斑鱼虹彩病毒(TGIV)；出现在新加坡的鲻鱼和虎斑虹彩病毒及流行于澳大利亚的巨鳕银鲈虹彩病毒(MCIV)和丽丽鱼虹彩病毒(DGIV)等。肿大细胞病毒的宿主覆盖了众多具有重大经济价值的养殖鱼类，对肿大细胞病毒所引发的系列鱼病的控制成为有关国家的共识。
开展免疫防治是控制肿大细胞病毒流行和危害的有效手段。国际上，日本借助RSIV的高敏感细胞系GF（石鲈鳍条细胞系）研制的RSIV全细胞灭活疫苗成功实现了商业化生产，已经比较广泛地应用于真鲷等海水养殖鱼类。RSIV灭活苗也曾经出口到我国广东及海南等沿海养殖区，在一些名贵海水养殖鱼类（石斑鱼，真鲷）中有所应用，总体效果不错。但由于价格偏贵（注射免疫，约1元/尾），注射免疫耗时耗力等不利因素的影响，日本进口的RSIV灭活苗在我国的应用比较有限。此外，由于灭活疫苗存在免疫期短、保护力低、用量大以及通常需要加入佐剂，并缺乏自然感染的局部免疫保护的因素限制了该类疫苗的发展。因此，开发新型的渔用基因工程疫苗成为当前水产病害控制的首要问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种肿大细胞病毒基因缺失活疫苗，该疫苗可以通过水体浸泡的方法用于鱼类肿大细胞病毒的预防，大大降低水产业病毒性疾病的发病率和操作成本。
本发明的另一个目的是提供上述肿大细胞病毒疫苗的制备方法，该制备方法简单，成本低，有利于大规模推广应用。
本发明的另一个目的是提供上述肿大细胞病毒疫苗在鱼类肿大细胞病毒预防中的应用。
本发明的上述目的通过以下方案予以实现：
一种肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗，该疫苗是通过在鱼类细胞中通过基因工程技术将外源GFP基因替代肿大细胞病毒的vsocs基因而得到的重组vsocs基因缺失病毒，收获病毒液并稀释后得到的。
上述肿大细胞病毒减毒活疫苗的制备方法，其具体步骤如下：
（1）重组vsocs基因缺失病毒转移载体的构建（图1）：通过PCR扩增vsocs基因在ISKNV基因组上下游各约1000bp的DNA片段，分别插入同一个克隆载体pUC18中；通过双酶切真核表达载体pEGFP-C3，获得含CMV启动子的绿色荧光蛋白GFP真核表达框，插入上述pUC18载体的vsocs基因上下游片段之间，该克隆载体为vsocs基因缺失病毒转移载体；
（2）细胞的制备：将鱼类细胞系经酶消化分散后，进行细胞培养成片，用于接种肿大细胞病毒；
（3）重组vsocs基因缺失病毒的接种和培养：上述鱼类细胞培养成片后，吸出培养瓶中的培养基，然后加入重组vsocs基因缺失病毒液，进行病毒吸附；病毒吸附结束后，吸出感染上清，加入细胞维持液，再次进行细胞培养，至细胞出现明显病变为止；
（4）重组vsocs基因缺失病毒液的收集、稀释和保存：将上述病变的细胞经三次冻融后，收获病毒液，经0.22μm滤器过滤后，稀释于PBS溶液中，分装并保存于-80℃冰箱中，即得肿大病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗成品；
（5）减毒活疫苗的使用：将上述重组vsocs基因缺失病毒液以1:2,000-1：100,000的不同浓度稀释于水体中，即可通过浸泡感染的途径对鱼体进行免疫。
上述步骤（1）中,病毒缺失基因为vsocs基因（如ISKNV ORF103及其同源基因）。
上述步骤（2）中，消化时可用胰酶，细胞培养成片时可采用DMEM完全培养液中27℃培养。
上述步骤（3）中，病毒吸附可以选择在27℃的温度下吸附1小时，细胞维持液可选择采用添加有10%FBS的DMEM。本发明的FBS（胎牛血清）和DMEM均为本领域通用试剂，市售。
上述步骤（4）中，用于稀释病毒灭活液的盐类缓冲液可以选择无菌磷酸盐缓冲液，稀释倍数为10倍。
上述步骤（5）中，稀释后的病毒液与浸泡水体的体积比为1：1:2,000-1：100,000。鱼体浸泡免疫时间为2~4 h，带浸泡免疫后的鱼体即可放回养殖池。
本发明的肿大细胞病毒疫苗可用于预防海鱼类、淡水鱼类的肿大细胞病毒感染。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1. 本发明的肿大细胞病毒疫苗对鱼类预防肿大细胞病毒感染的保护作用可达80%；
2. 本发明的疫苗本身不含对人类有害的成分，对注射疫苗的鱼类可以安全食用；
3. 疫苗本身对鱼类生长没有影响，在保证水环境和饲料的情况下，被注射有疫苗的鱼类生长状况良好；
4. 避免了传统减毒疫苗的返祖而重新获得毒力;
5. 免疫力持续时间长达半年以上；
6. 可通过水体浸泡免疫，操作简单、节省各种人工费用；
7. 本发明的疫苗制备方法简单，所用试剂成本低，有利于大规模推广；
8. 本发明的疫苗本身不易失效，普通冰箱4℃放置一周仍有效。
附图说明
图1为重组vSOCS基因的转移载体构建流程；
图2为减毒活疫苗组、阴性对照组和病毒组三组鱼在免疫期间的死亡情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 肿大细胞病毒重组转移载体的构建
本实施例的选取ISKNV vsocs基因作为研究对象，利用病毒在细胞内复制过程中的同源重组原理，将外源GFP基因替代vsocs基因，从而获得重组vsocs基因缺失的ISKNV。
本实施例肿大细胞病毒重组转移载体的构建，包括如下步骤：
（1）通过PCR扩增vsocs基因在ISKNV基因组上下游各约1000bp的DNA片段，分别插入同一个克隆载体pUC18中；
（2）通过双酶切真核表达载体pEGFP-C3，获得含CMV启动子的绿色荧光蛋白GFP真核表达框，插入上述pUC18载体的vsocs基因上下游片段之间，该克隆载体为vsocs基因缺失病毒转移载体。
实施例2 肿大细胞病毒减毒活疫苗的制备
本实施例的生物材料选择鳜鱼，病毒选择重组vsocs基因缺失ISKNV病毒。
本实施例肿大细胞病毒疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）细胞的制备：将鳜仔鱼细胞系（MMF-1）用胰酶消化分散，加入DMEM完全培养液在27℃培养成片，用于接种重组vsocs基因缺失ISKNV病毒；
（2）病毒接种和培养：将上述MMF-1细胞培养成片后，吸出培养瓶中的培养基，然后加入实施例1所述的重组vsocs基因缺失病毒液，置27℃约1 h 进行病毒吸附。后吸出感染上清，加入细胞维持液（含10% FBS的DMEM），再置于27℃细胞培养箱中培养大约72 h，至细胞出现明显病变为止；
（3）病毒收集、灭活和稀释：病变的细胞经三次冻融后，经0.22μm滤器过滤后，以1:20体积比稀释于无菌磷酸盐缓冲溶液中，分装并保存于-80℃冰箱中；
（4）疫苗制备：将上述重组vsocs基因缺失病毒液以1:2,000~1：100,000的不同浓度稀释于水体中，即可通过浸泡感染的途径对鱼体进行免疫。
本实施例所用试剂均为本领域技术人员通用试剂。
实施例3 肿大细胞病毒减毒活疫苗水体浸泡免疫鳜鱼用于预防ISKNV感染
用实施例2制备所得肿大细胞病毒减毒活疫苗通过浸泡免疫方法进行预防ISKNV感染试验。
1. 试验鱼及其饲养条件
鳜鱼购自广东南海某养殖场，暂养于本实验室的鱼池中，平均规格约125 g，水温保持在25~27 ℃，空气动力泵自动充气，循环水系统即时将鱼池中的废物吸出，日常投喂鲜活饵料鱼，一天投喂一次，免疫前鳜鱼在饲养池中最少暂养2周以上。
2. 免疫
减毒活疫苗组：随即选择15尾鳜鱼，实施例1所得肿大细胞病毒疫苗以1:2,000体积比（最终的TCID50 为5×106）稀释于30L水体内，浸泡鳜鱼2h；
阴性对照组：随即选择15尾鳜鱼，取同上述相等体积的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释于30L水体内，浸泡鳜鱼2h；
将两组处理后的鳜鱼放养在3.5×1.0×0.5 m3的中等水泥鱼池中。
3. 攻毒
免疫3周后，取ISKNV病毒悬以TCID50终浓度为5×106/ml稀释于30L水体内，浸泡存活的鳜鱼2h。
免疫和感染期间继续投喂鲜活饵料鱼，池水温度稳定在25~27℃。每日不定时观察，死鱼及时清理，印片法检测死亡鱼类的脾脏肿大情况。
4. 疫苗和对照组处理后，再感染ISKNV病毒，鳜鱼的死亡情况如表1所示。
表1 攻毒后三组鱼的死亡情况
传染性脾肾坏死病毒（ISKNV，Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus）是一种主要的造成鱼类大量死亡的病毒，感染后10~12天死亡率为90~100%，目前国内外尚无有效抑制ISKNV的药物，通常养殖者采用生石灰、硫酸铜、次氯酸盐、碘盐或投放抗生素等方法，通过改变水体环境抑制病毒生长，但是该病毒生命力非常顽强，无法起到预防作用，尤其在水温30~37℃时更有大规模的爆发，传统的抗生素对该病毒也不起作用。
但是从表1可以看出，感染了ISKNV后，对照组的鳜鱼在第7天开始死亡，尤其是在感染后的8~9天集中死亡，感染后的12天全部死亡。在而灭活疫苗组注射了本发明方法制备的肿大细胞病毒疫苗，明显地推迟了病毒的发病时间，在感染后的第10天鳜鱼开始死亡2尾，10~14天再死亡1尾，在感染后的21天中，仅有2尾鱼发病死亡。由此可以看出本发明肿大细胞病毒疫苗其预防肿大细胞病毒感染的保护作用可达到80%（图2）。
Claims (10)
1.一种肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗，其特征在于该疫苗是利用基因工程原理将绿色荧光蛋白GFP报告基因替代肿大细胞病毒vsocs基因，构建并分离、纯化获得重组vsocs基因缺失病毒，将其作为肿大细胞病毒减毒活疫苗，该减毒活疫苗通过水体浸泡感染而使宿主鱼体产生免疫。
2.权利要求1所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：
（1）重组vsocs基因缺失病毒转移载体的构建：通过PCR扩增vsocs基因在ISKNV基因组上下游各约1000bp的DNA片段，分别插入同一个克隆载体pUC18中；通过双酶切真核表达载体pEGFP-C3，获得含CMV启动子的绿色荧光蛋白GFP真核表达框，插入上述pUC18载体的vsocs基因上下游片段之间，该克隆载体为vsocs基因缺失病毒转移载体；
（2）重组vsocs基因缺失病毒的同源重组：鳜鱼仔鱼细胞先通过瞬时转染vsocs基因缺失病毒转移载体5h后，再感染病毒1h，根据病毒复制的同源重组原理，72-96h预期获得GFP基因替代vsocs基因的重组vsocs基因缺失病毒；
（3）重组vsocs基因缺失病毒的分离和纯化：通过荧光显微镜观察并挑取发生病变且表达GFP蛋白的细胞，通过有限稀释法获得单克隆化的重组vsocs基因缺失病毒；
（4）肿大细胞病毒基因缺失减毒活疫苗的制备：上述单克隆化的重组vsocs基因缺失病毒，通过感染MFF-1细胞，扩大培养；将病变的细胞经三次冻融后，收获病毒液，经0.22μm滤器过滤后，稀释于PBS溶液中，分装并保存于-80℃冰箱中，即得肿大病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗成品；
（5）水体浸泡感染体系：以不同稀释度的重组vsocs基因缺失病毒，通过水体浸泡感染鳜鱼2~4 h，记录感染鳜3周内的发病情况和死亡率，评定重组vsocs基因缺失病毒作为肿大细胞病毒的基因工程活疫苗的可行性，将暂养3周的重组vsocs基因缺失病毒感染鳜再次进行攻毒实验，记录感染鳜4周内的存活率和保护率。
3.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述vsocs基因作为肿大细胞病毒减毒活疫苗的基因缺失对象。
4.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（1）中，通过PCR扩增vsocs基因上下游约1000bp的片段作为重组转移载体的组成部分。
5.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中，先瞬时vsocs基因缺失病毒转移载体4~6h后，再感染病毒。
6.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（2）中，利用GFP基因替代vsocs基因的重组vsocs基因缺失病毒。
7.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（3）中，通过有限稀释法获得单克隆化的重组vsocs基因缺失病毒。
8.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（4）中，单克隆化的重组vsocs基因缺失病毒，稀释于PBS溶液中即得肿大病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗成品。
9.根据权利要求2所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤（5）中，水体浸泡重组vsocs基因缺失病毒感染鳜鱼2~4 h，作为疫苗免疫途径和免疫时间。
10.权利要求1所述肿大细胞病毒vsocs基因缺失减毒活疫苗在预防鱼类肿大细胞病毒感染中的应用。
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