CN102727879A - 一种石斑鱼虹彩病毒（sgiv）灭活疫苗的转瓶生产方法 - Google Patents
一种石斑鱼虹彩病毒（sgiv）灭活疫苗的转瓶生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法。它包括细胞的转瓶培养、病毒的扩增和收获和病毒灭活。应用本发明的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法可以大规模的生产石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗，由于是工业流程化生产，其生产成本低、劳动强度小，生产出来的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗经过疫苗检验，从细胞水平和鱼体水平证明该石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗是安全的，疫苗效力检测证明，本发明的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的相对保护率为87.0%~95.7%，说明此石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗对受免石斑鱼提供了显著的保护，具有良好的免疫保护效力，且批间质量稳定。
Description
技术领域：
本发明属于水产动物疫苗领域，具体涉及一种石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法。
背景技术：
石斑鱼肉质鲜美蛋白含量高，是一种经济价值极高的食用鱼类，也是我国创汇的优良鱼类品种。但近年来随着养殖规模的扩大和养殖环境的日益恶化，各种病害特别是病毒性疾病频繁爆发，造成了重大的经济损失。虹彩病毒是石斑鱼的重要致病病原，它可以造成鱼类的死亡率从30%(成鱼中)到100%(幼苗阶段)。这种病毒在亚洲，特别是在22℃以上的高水温，极易感染中国、日本和东南亚等国养殖的海水名贵鱼类，如石斑鱼、尖吻鲈、真鲷、牙鲆和大黄鱼等，致使鱼类大面积的死亡，造成严重的经济损失，因而被称之为“海洋口蹄疫”。石斑鱼虹彩病毒（SGIV）是从养殖的石斑鱼中分离到的一株新的虹彩病毒，可导致石斑鱼死亡率达90%以上，给石斑鱼的养殖带来巨大的经济损失。因此，如何预防和治疗虹彩病毒病已成为当今世界上石斑鱼养殖业急需解决的重要问题。
众所周知，疫苗作为化学药品和抗生素的替代品，是治疗疾病、特别是病毒病的最好选择。灭活疫苗具有较强的安全性和免疫原性。专利公开号为102178945A的专利申请，公开了一种制备石斑鱼虹彩病毒β-丙内酯灭活疫苗的方法，制备的灭活疫苗可以使赤点石斑鱼获得十分理想的免疫保护效果，相对免疫保护率在90%以上，对防治石斑鱼虹彩病毒病有很高的实践应用价值。但是该方法只是在实验室里制备细胞灭活疫苗，其生产成本高，劳动强度大，还无法在工业上大规模的应用。
发明内容：
本发明的目的是提供一种生产成本低、劳动强度小，能适用于GMP条件下大规模生产安全有效的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法。
本发明的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）细胞的转瓶培养：将石斑鱼脾组织细胞接入转瓶中，加入细胞生长液，充分摇匀后置于转瓶机上培养，培养温度为28℃，转速为16~20转/小时，所述的细胞生长液为：含体积分数8~10%的胎牛血清、质量分数0.266%NaCl和5mM HEPES的L15培养基；
（2）病毒的扩增和收获：转瓶培养石斑鱼脾组织细胞直至长满单层，接种0.01MOI的石斑鱼虹彩病毒于对数生长期的石斑鱼脾组织细胞中，于28℃培养，转瓶机转速设置为16~20转/小时，培养2~3小时以吸附病毒，随后将转瓶机转速设为3~5转/小时，以扩增病毒，观察病毒病变效应，直至细胞病变完全，然后反复冻融2~3次；
（3）将冻融后的病毒液中的病毒灭活后获得石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗。
所述的石斑鱼脾组织细胞是通过以下方法培养的：将长满单层的石斑鱼脾组织细胞，去除原有培养液，磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗一遍后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1~2分钟，加入新的细胞生长液，吹匀后分至细胞培养瓶中于28℃进行培养扩增，所述的细胞生长液为含体积分数8~10%的胎牛血清、质量分数0.266%NaCl和5mM HEPES的L15培养基。
所述的步骤（1）具体为：取10~15个长满单层石斑鱼脾组织细胞的75cm2细胞培养瓶，去除原有培养液，用磷酸盐缓冲溶液漂洗一遍后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1~2分钟，加入新的细胞生长液吹匀，然后转移至5L转瓶中，加入新的细胞生长液至总体积500ml，充分摇匀后置于转瓶机上培养，温度控制为28℃，转速为16~20转/小时；所述的步骤（2）具体为待培养2~3天后，石斑鱼脾组织细胞长满单层，接种0.01MOI的石斑鱼虹彩病毒于对数生长期的石斑鱼脾组织细胞中，置于28℃培养，转瓶机转速设置为16~20转/小时，培养2~3个小时以吸附病毒，随后将转瓶机转速设为3~5转/小时，以扩增病毒，连续培养4~6天后，细胞病变完全，反复冻融2-3次，所述的细胞生长液为含体积分数8~10%的胎牛血清、质量分数0.266%NaCl和5mM HEPES的L15培养基；所述的步骤（3）具体为将冻融后的病毒液用氢氧化钠溶液调pH值至7.4~7.6，加入β-丙内酯，β-丙内酯与病毒液的体积比为1：500，混匀后在4℃灭活处理16~20小时，灭活期间维持pH值在7.4~7.6之间，灭活结束后病毒液于37℃水浴水解2小时，以充分水解残留的β-丙内酯，由此获得石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗。
HEPES其中文名为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，其对细胞无毒性作用，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。
L15培养基是现有技术中的常规培养基，可以从市场上购买到。
应用本发明的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法可以大规模的生产石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗，由于是工业流程化生产，其生产成本低、劳动强度小，生产出来的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗经过疫苗检验，从细胞水平和鱼体水平证明该石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗是安全的，疫苗效力检测证明，本发明的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的相对保护率为87.0%~95.7%，说明此石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗对受免石斑鱼提供了显著的保护，具有良好的免疫保护效力，且批间质量稳定。
由此可见，本发明的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法具有生产成本低、劳动强度小的优点，能适用于GMP条件下大规模生产安全有效的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗。
附图说明：
图1每尾石斑鱼幼鱼腹腔注射106TCID50/0.1毫升的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗，对照组注射同样剂量的L15培养基，15天后攻毒，腹腔注射接种病毒，统计15天，计算各组的累积死亡率的图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
整个石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的生产均在珠江水产研究所广州普麟生物制品有限公司的GMP车间进行，该公司拥有目前为止我国首家符合兽用生物制品GMP要求的水产疫苗生产车间。
一、石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的制备
实施例1：
细胞生长液：Leibovitz’s-15（L15）培养基，按照公司产品说明配制，另加入质量分数0.266%NaCl，5mM HEPES，调pH至7.2~7.6，本实施例调pH至7.6，经0.22μm滤膜过滤，使用前加入胎牛血清，使其体积分数为8~10%，本实施例为含体积分数10%胎牛血清。
1、石斑鱼脾组织细胞的小瓶培养。取长满单层的石斑鱼脾组织细胞，去除原有培养液，磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗一遍后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1~2分钟，再加入上述细胞生长液，吹匀后分至3个细胞培养瓶中于28℃进行培养扩增。
2、细胞的转瓶培养：取上述15个长满单层石斑鱼脾组织细胞的75cm2细胞培养瓶，去除原有培养液，磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗一遍后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1~2分钟，再加入上述细胞生长液吹匀，转移入5L转瓶中，加入新鲜上述细胞生长液至总体积为500ml，充分摇匀后置于转瓶机上培养，温度控制为28℃，转速为16转/小时。
3、病毒的扩增和收获：培养2天后，石斑鱼脾组织细胞长满单层，接种0.01MOI（multiplicityof infection，感染复数）的石斑鱼虹彩病毒于对数生长期的石斑鱼脾组织细胞中，置于28℃培养，转瓶机转速设置为16转/小时培养3个小时以吸附病毒，随后将转瓶机转速设为5转/小时，以扩增病毒。每天观察细胞病变效应，连续培养4天后，细胞病变完全（90%以上细胞出现病变），反复冻融3次，用于以下的病毒灭活。
4、病毒的灭活。病毒液用氢氧化钠溶液调pH值至7.4，加入β-丙内酯，β-丙内酯与病毒液的体积比为1：500，混匀后在4℃灭活处理20小时，灭活期间不时调整pH值以维持pH值在7.4~7.6之间。灭活结束后病毒液37℃水浴水解2小时，以充分水解残留的β-丙内酯，由此制得2个批次石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗，即为批次1和批次2的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗。
实施例2：
细胞生长液：Leibovitz’s-15（L15）培养基，按照公司产品说明配制，另加入质量分数0.266%NaCl，5mM HEPES，调pH至7.2~7.6，本实施例调pH至7.2，经0.22μm滤膜过滤，使用前加入胎牛血清，使其体积分数为8~10%，本实施例体积分数为8%胎牛血清。
1、石斑鱼脾组织细胞的小瓶培养。取长满单层的石斑鱼脾组织细胞，去除原有培养液，磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗一遍后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1~2分钟，再加入上述细胞生长液，吹匀后分至3个细胞培养瓶中于28℃进行培养扩增。
2、细胞的转瓶培养：取上述10个长满单层石斑鱼脾组织细胞的75cm2细胞培养瓶，去除原有培养液，磷酸盐缓冲溶液（PBS）漂洗一遍后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1~2分钟，再加入上述细胞生长液吹匀，转移入5L转瓶中，加入新鲜上述细胞生长液至总体积为500ml，充分摇匀后置于转瓶机上培养，温度控制为28℃，转速为20转/小时。
3、病毒的扩增和收获：培养3天后，石斑鱼脾组织细胞长满单层，接种0.01MOI（multiplicityof infection，感染复数）的石斑鱼虹彩病毒于对数生长期的石斑鱼脾组织细胞中，置于28℃培养，转瓶机转速设置为20转/小时，培养2个小时以吸附病毒，随后将转瓶机转速设为3转/小时，以扩增病毒。每天观察细胞病变效应，连续培养6天后，细胞病变完全（90%以上细胞出现病变），反复冻融2次，用于以下的病毒灭活。
4、病毒的灭活。病毒液用氢氧化钠溶液调pH值至7.6，加入β-丙内酯，β-丙内酯与病毒液的体积比为1：500，混匀后在4℃灭活处理16小时，灭活期间不时调整pH值以维持pH值在7.4~7.6之间。灭活结束后病毒液于37℃水浴水解2小时，以充分水解残留的β-丙内酯，由此制得2批次的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗，即为批次3和批次4的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗。
二、石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的效果
1、疫苗检验
按以上实施例的方法生产了4批次的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗，每批都进行安全性和效力检验。
(1)细胞水平的安全性实验
将4批次的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗分别接种石斑鱼脾组织细胞，观察细胞病变效应（cytopathic effect,CPE），连续传3代均没有观察到CPE，证明灭活完全，不再具备感染性。
(2)鱼体水平的安全性实验
a、单剂量接种的安全性试验
每尾石斑鱼幼鱼腹腔接种0.1ml的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗（4批次的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗分别进行实验），每批疫苗接种8尾，共32尾石斑鱼进行了单剂量接种的安全性试验。试验期间各组幼鱼食欲、行为活动正常，体征未见异常表现，注射局部和全身均无任何不良反应，试验所用幼鱼全部存活。注射后第14天全部处死，解剖观察各组试验幼鱼均未见异常病理学变化。本试验结果说明制备的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗对幼鱼无明显的毒副作用。
b、单剂量重复接种的安全性试验
每尾石斑鱼幼鱼腹腔接种0.1ml的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗（4批次的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗分别进行实验），10天后重复接种，每批疫苗接种8尾，共32尾石斑鱼进行了单剂量接种的安全性试验。整个试验期间各组幼鱼食欲、行为活动正常，试验所用幼鱼全部存活。注射后第14天全部处死，解剖观察各组试验幼鱼均未见异常病理学变化。本试验结果再次说明制备的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗对幼鱼无明显的毒副作用。
c、一次超剂量接种的安全性试验
每尾石斑鱼幼鱼腹腔接种1ml的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗（4批次的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗分别进行实验），每批疫苗接种8尾，共32尾石斑鱼进行了单剂量接种的安全性试验。试验期间各组幼鱼食欲、行为活动正常，试验所用幼鱼全部存活。注射后第14天全部处死，解剖观察各组试验幼鱼均未见异常病理学变化。本试验结果进一步说明制备的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗对幼鱼无明显的毒副作用。
（3）疫苗效力检测。取使用剂量即106TCID 50/0.1毫升腹腔免疫石斑鱼幼鱼，对照组注射同样剂量的L15培养基。15天后攻毒，每日统计死亡鱼数，根据统计出来的各组的死亡率，依公式计算相对保护率。具体结果见图1和表1，由图1和表1可以看出，对照组的死亡率在90%以上，疫苗免疫组（批次1、2、3和4的石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗组）的相对保护率为87.0%~95.7%，说明此石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗对受免石斑鱼提供了显著的保护，具有良好的免疫保护效力，且批间质量稳定。
表1：根据统计出来的各组的死亡率，依公式计算相对保护率
Claims (3)
1.一种石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）细胞的转瓶培养：将石斑鱼脾组织细胞接入转瓶中，加入细胞生长液，充分摇匀后置于转瓶机上培养，培养温度为28℃，转速为16~20转/小时，所述的细胞生长液为：含体积分数8~10%的胎牛血清、质量分数0.266%NaCl和5mM HEPES的L15培养基；
（2）病毒的扩增和收获：转瓶培养石斑鱼脾组织细胞直至长满单层，接种0.01MOI的石斑鱼虹彩病毒于对数生长期的石斑鱼脾组织细胞中，于28℃培养，转瓶机转速设置为16~20转/小时，培养2~3小时以吸附病毒，随后将转瓶机转速设为3~5转/小时，以扩增病毒，观察病毒病变效应，直至细胞病变完全，然后反复冻融2~3次；
（3）将冻融后的病毒液中的病毒灭活后获得石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法，其特征在于，所述的石斑鱼脾组织细胞是通过以下方法培养的：将长满单层的石斑鱼脾组织细胞，去除原有培养液，磷酸盐缓冲溶液漂洗一遍后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1~2分钟，加入新的细胞生长液，吹匀后分至细胞培养瓶中于28℃进行培养扩增，所述的细胞生长液为含体积分数8~10%的胎牛血清、质量分数0.266%NaCl和5mM HEPES的L15培养基。
3.根据权利要求1或2所述的石斑鱼虹彩病毒（SGIV）灭活疫苗的转瓶生产方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体为：取10~15个长满单层石斑鱼脾组织细胞的75cm2细胞培养瓶，去除原有培养液，用磷酸盐缓冲溶液漂洗一遍后加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化1~2分钟，加入新的细胞生长液吹匀，然后转移至5L转瓶中，加入新的细胞生长液至总体积500ml，充分摇匀后置于转瓶机上培养，温度控制为28℃，转速为16~20转/小时；所述的步骤（2）具体为待培养2~3天后，石斑鱼脾组织细胞长满单层，接种0.01MOI的石斑鱼虹彩病毒于对数生长期的石斑鱼脾组织细胞中，置于28℃培养，转瓶机转速设置为16~20转/小时，培养2~3个小时以吸附病毒，随后将转瓶机转速设为3~5转/小时，以扩增病毒，连续培养4~6天后，细胞病变完全，反复冻融2-3次，所述的细胞生长液为含体积分数8~10%的胎牛血清、质量分数0.266%NaCl和5mM HEPES的L15培养基；所述的步骤（3）具体为将冻融后的病毒液用氢氧化钠溶液调pH值至7.4~7.6，加入β-丙内酯，β-丙内酯与病毒液的体积比为1：500，混匀后在4℃灭活处理16~20小时，灭活期间维持pH值在7.4~7.6之间，灭活结束后病毒液于37℃水浴水解2小时，以充分水解残留的β-丙内酯，由此获得石斑鱼虹彩病毒灭活疫苗。
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