CN109966481A - 疫苗制剂及鱼类的虹彩病毒感染性疾病的预防方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供针对石鲷属鱼种(genus Oplegnathus)等的更有效的鱼类的虹彩病毒(iridovirus)感染性疾病的防除方法。提供含有非活化的虹彩病毒作为抗原且每次给要10^7.0TCID₅₀以上的针对鱼类的虹彩病毒感染性疾病的疫苗制剂等。通过包含非活化的虹彩病毒作为抗原且每次给要10^7.0TCID₅₀以上，即使对以往被视为疫苗效果低的石鲷属鱼种等也可有效地预防。可通过含有使虹彩病毒在培养细胞中增殖时的培养上清的浓缩液或者培养上清液及病毒感染的培养细胞等，来将疫苗制剂中的虹彩病毒的浓度可提高至每次给药10^7.0TCID₅₀以上。

Description

疫苗制剂及鱼类的虹彩病毒感染性疾病的预防方法

技术领域

本发明涉及含有非活化的虹彩病毒(iridovirus)作为抗原、每次给药10^7.0TCID₅₀以上的与真鲷虹彩病毒病等鱼类虹彩病毒感染性疾病相关的疫苗制剂、鱼类的虹彩病毒感染性疾病预防方法等。

背景技术

从可增加收获量，以较低廉的价格稳定供给的点等，在很多鱼类中广发普及养殖。另一方面，在养殖的情况下，与天然鱼相比，饲育密度高且环境条件也容易恶化，因此容易发生并传播感染性疾病。

作为鱼类的虹彩病毒感染性疾病，例如，公知真鲷虹彩病毒病。真鲷虹彩病毒病为基于真鲷虹彩病毒(Red sea bream iridoviral disease)的病毒感染性疾病，是呈现显著的贫血引起的鳃的褪色、脾脏的肿大等的症状的致死性高的疾病，在养殖场的死亡率达到20～60％。1990年作为养殖真鲷在西日本中初次确认，从此以后感染扩大到各种养殖鱼，目前为止，以鲈形目为中心在30种以上的鱼种中确认到发生。

对此，作为对本疾病的防除手段的一种，开发福尔马林非活化疫苗制剂，并以真鲷、鲂鱼属鱼类、黄带拟鲹、黑带石斑鱼、点带石斑鱼、褐石斑鱼及七带石斑鱼为对象，其疫苗制剂已上市。例如，专利文献1中记载了利用特定的继代得到的虹彩病毒株非活化调制而成的鱼类用虹彩病毒感染性疾病疫苗。

另一方面，查明在除了上述以外的鱼种中，该上市的福尔马林非活化疫苗制剂的疫苗效果低，对于这些鱼种需要开发有效的疫苗。例如，在非专利文献1中涉及如下：“与其他鱼种相比，在条石鲷中基于被动免疫的防御效果低，在使用感染耐过鱼的血清的被动免疫试验中，……未确认到显著的死亡率”的问题及“认为条石鲷的感染防御仅用液性免疫不充分，需要细胞性免疫等其他防御机构的参与”的问题，并且在非专利文献2中涉及如下：“如条石鲷或斑石鲷对于石鲷属鱼种(genus Oplegnathus)的疫苗效果低”的问题以及“需要试图与条石鲷或斑石鲷相关的有效疫苗开发”的问题等。

专利文献1

日本特开2007-197454号公报

非专利文献1

松山知正等，“海産5魚種におけるマダイイリドウイルス病に対する受動免疫の効果(对海洋5鱼种的真鲷虹彩病毒病的受动免疫效果)”，鱼病研究Fish Pathology,51(1),32-35,2016,3

非专利文献2

河东康彦等，“マダイイリドウイルス病(真鲷虹彩病毒病)”，Fish Pathology,52(2),57-62,2017,6

发明内容

发明所要解决的问题

如上述，例如，在以鲈形目为中心的30种以上的鱼种中确认过作为鱼类的虹彩病毒感染性疾病的一种的真鲷虹彩病毒病。但是在除了真鲷、鲂鱼属鱼类、黄带拟鲹、黑带石斑鱼、点带石斑鱼、褐石斑鱼、七带石斑鱼以外的鱼种中福尔马林非活化疫苗制剂的疫苗效果低，当前难以有效地防除在那些鱼种中的相同族病。

因此，本发明的目的在于，提供对于除了真鲷、鲂鱼属鱼类、黄带拟鲹、黑带石斑鱼、点带石斑鱼、褐石斑鱼及七带石斑鱼以外的鱼种，提供更有效的虹彩病毒感染性疾病的防除手段。

用于解决问题的手段

本发明人新发现还在除了真鲷、鲂鱼属鱼类、黄带拟鲹、黑带石斑鱼、点带石斑鱼、褐石斑鱼及七带石斑鱼以外的鱼种中，通过提高疫苗中的有効抗原量，来可有效防除将液性免疫作为主体的免疫中还可有效地防除虹彩病毒感染性疾病。

因此，本发明中提供(1)含有非活化的人虹彩病毒作为抗原且每次给药10^7.0TCID₅₀以上的针对鱼类的虹彩病毒感染性疾病的疫苗制剂，(2)以10^8.0TCID₅₀/mL以上的浓度含有非活化的人虹彩病毒作为抗原的针对鱼类的虹彩病毒感染性疾病的疫苗制剂等。

通过将非活化的虹彩病毒作为抗原，每次给药10^7.0TCID₅₀以上，来在真鲷、鲂鱼属鱼类、黄带拟鲹、黑带石斑鱼、点带石斑鱼、褐石斑鱼及七带石斑鱼以外的鱼种，例如，在石鲷属、鲭科、旗鱼亚目等的鱼种中，还可预防真鲷虹彩病毒病等虹彩病毒感染性疾病的发生、感染、传播及蔓延。例如，，通过将以10^8.0TCID₅₀/mL以上的浓度含有非活化的虹彩病毒的疫苗制剂给药0.1mL以上，来可给药10^7.0TCID₅₀以上。

在使用在培养细胞中增殖的病毒的情况下，即，在上述虹彩病毒为在培养细胞中进行增殖的病毒的情况下，原则上使用单克隆性病毒可作为抗原。并且，使病毒在培养细胞中增殖，来能够较简单且大量调制均匀品质的抗原。

但是，即便使虹彩病毒在培养细胞中增殖，若其增殖曲线达到稳定水平，则病毒量不增加为其以上，因此难以通过通常的常规方法将其培养液中的虹彩病毒的浓度提高至每次可给药10^7.0TCID₅₀以上的程度。

对此，例如，对于虹彩病毒通过在高感受性的培养细胞中增殖，来可提高病毒的浓度。并且，例如，作为上述抗原，通过在使上述虹彩病毒在培养细胞中增殖时的培養上清的浓缩液或者含有上述培养液及上述培养细胞，来将疫苗制剂中的虹彩病毒的浓度可提高至每次可给药107.0TCID₅₀以上的程度，例如，对石鲷属、鲭科、旗鱼亚目等的鱼种，还可实现有效预防。

发明的效果

根据本发明在真鲷、鲂鱼属鱼类、黄带拟鲹、黑带石斑鱼、点带石斑鱼、褐石斑鱼、七带石斑鱼以外的鱼种，例如，在石鲷属、鲭科、旗鱼亚目等鱼种中，还可有效预防虹彩病毒感染性疾病。

附图说明

图1为示出在实施例1中对细胞混入抗原进行免疫的情况下的条石鲷的成活率的图表。

图2为示出在实施例2中对浓缩抗原或细胞混入抗原进行免疫的情况下的条石鲷的成活率的图表。

图3为示出在实施例3中对50倍浓缩抗原进行免疫的情况下的条石鲷的成活率的图表。

具体实施方式

关于本发明的疫苗制剂

本发明均包含(1)含有非活化的人虹彩病毒作为抗原且每次给药10^7.0TCID₅₀以上的针对鱼类的虹彩病毒感染性疾病的疫苗制剂，(2)以10^8.0TCID₅₀/mL以上的浓度含有非活化的人虹彩病毒作为抗原的针对鱼类的虹彩病毒感染性疾病的疫苗制剂等。

在该疫苗制剂中使用非活化处理的虹彩病毒作为抗原。虹彩病毒可广泛采用公知的虹彩病毒，并不特别限定。作为鱼类的人虹彩病毒，可例举虹彩病毒科细胞肿大病毒属(Megalocytivirus属)的虹彩病毒、例如，真鲷虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV；Infectious spleen and kidney necrosis virus)等。例如，可使用公知的分离株，还可以使用从得虹彩病毒感染性疾病的鱼类分离的分離株。

通过使这些分離株感染培养细胞，来可增殖虹彩病毒分離株。例如，通过在培养细胞的培养液中加入病毒液，来使病毒感染培养细胞，感染数日后回收培养细胞和培养液，并且通过将其培養上清作为病毒液且重复加入培养细胞的作业，来可继代增殖其病毒株，可调制疫苗用抗原。培养细胞可使用公知的细胞株，例如，GF细胞、BF-2细胞等。

例如，通过使虹彩病毒株在培养细胞中增殖，来含有虹彩病毒作为抗原，并且可调制作为上述虹彩病毒在培养细胞中增殖的病毒疫苗制剂的原液。

为了每次给药10^7.0TCID₅₀以上(例如，10^7.0TCID₅₀～10¹⁰TCID₅₀，以下相同)，需要调制高浓度的抗原。因此，对于虹彩病毒在搞感受性的培养细胞中增殖虹彩病毒株，来比通常高表达病毒，从而可以调制高浓度抗原。对于虹彩病毒高感受性的培养细胞采用公知的方法例如，通过播种从对真鲷虹彩病毒感受性高的鱼种(例如，真鲷、条石鲷、斑石鲷、盲曹鱼等海鲈类等)采集的组织、细胞来培养，并且对各个细胞进行单克隆化来继代的同时，使虹彩病毒株感染各个培养细胞，并且筛选病毒增殖性高的培养细胞，来可较正常地树立对虹彩病毒高感受性的培养细胞株。并且，作为对虹彩病毒高感受性的培养细胞，可采用对真鲷虹彩病毒感受性高的鱼种的体外受精卵(胚细胞)或者来源于其的培养细胞等。

并且，可通过对在培养细胞中增殖虹彩病毒的时候的上清进行浓缩，来调制高浓度抗原。浓缩手段可广发采用离心超滤等公知的手段。例如，通过对含有虹彩病毒的培养上清，来调制10^8.0TCID₅₀/mL以上(例如，10^8.0TCID₅₀～10¹¹TCID₅₀、以下相同)的疫苗制剂(的原液)，并且可将其溶液给药0.1mL以上，来将虹彩病毒每次给药10^7.0TCID₅₀以上。

并且，为了调制高浓度抗原，可将在培养细胞中增殖虹彩病毒时的培养液及培养细胞用作疫苗制剂(的原液)。不仅含有培养液，而且还含有有効量的培养细胞，即，可通过含有虹彩病毒作为有効抗原的培养液以及含有感染中的虹彩病毒的培养细胞的两者，来调制10^8.0TCID₅₀/mL以上的疫苗制剂(的原液)，并且可通过给药0.1mL以上的其溶液，来将虹彩病毒每次给药10^7.0TCID₅₀以上。

像这样，通过作为含有(1)在培养细胞中增殖上述虹彩病毒时的培養上清的浓缩液或者(2)在培养细胞中增殖上述虹彩病毒时的上述培养液及上述培养细胞的疫苗制剂，来作为高浓度抗原可实现将虹彩病毒每次给药10^7.0TCID₅₀以上。

本发明的抗原可以为非活化抗原。虹彩病毒的非活化，例如，对本发明的高浓度抗原含有液可实施物理处理(紫外线照射、X线照射、热处理、超声波处理等)、化学的处理(基于福尔马林等的处理、基于氯仿·乙醇等的有机溶剂处理、基于乙酸等的弱酸的酸处理、基于氯、汞等的处理)等处理。

例如，在高浓度抗原含有液中添加0.01～2.0％的福尔马林，更优选地，以0.05～1.0％得容量浓度添加，可通过在4～30℃的温度下，使培養菌液致敏1～10日，来进行基于福尔马林的非活化。并且，例如，非活化处理后利用缓冲液的清洗来除去福尔马林等的非活化剂或可以添加中和剂。

如上述，例如，在将疫苗制剂每次给药0.1mL的情况下，通过将其疫苗制剂中的虹彩病毒的浓度调制为10^8.0TCID₅₀/mL以上，来可实现将虹彩病毒每次给药10^7.0TCID₅₀以上。例如，本发明的疫苗制剂中的虹彩病毒的浓度可以将非活化前的病毒感染值作为指标，还可以将相当于直接测定疫苗制剂中的非活化虹彩病毒量的值作为指标使用。另外，例如，非活化虹彩病毒量可利用酶联免疫吸附实验(ELISA)法、蛋白质定量法等直接测定而推量。

在本发明的疫苗制剂中，病毒抗原以外的总蛋白量可以为0.1％以下(1.0mg/mL以下)。在将虹彩病毒在培养细胞中增殖时，存在在其培养液中添加血清等的情况。在此情况下，由于在疫苗制剂(原液)中还残留有夹杂蛋白，例如，利用超滤等公知的手段，排除夹杂蛋白可用作疫苗制剂(原液)。例如，排除来源于血清等的夹杂蛋白，将制剂中的总蛋白量抑制成0.1mg/mL，来提高抗原浓度，并且可进一步提高疫苗效果，除此之外，还可减轻产生将其夹杂蛋白作为原因的副作用等的风险。

本发明的疫苗制剂还可含有佐剂。

佐剂可广泛使用公知的。例如，油性佐剂，包含动物油(角鲨烯等)或它们的硬化油、植物油(棕榈油、蓖麻油等)或它们的硬化油、失水甘露糖醇油酸酯、液体石蜡、聚丁烯、辛酸、油酸、高级脂肪酸酯等；水溶性佐剂，如PCPP、皂苷、葡萄糖酸锰、葡萄糖酸钙、甘油磷酸锰、可溶性乙酸铝、水杨酸铝、丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸酸共聚物、马来酸酐共聚物、烯基衍生物聚合物、水包油型乳液，含有季铵盐等的阳离子脂质；沉降性佐剂，如氢氧化铝(明矾)、氢氧化钠等；微生物来源毒素成分，如霍乱毒素、大肠杆菌不耐热毒素等，其他膨润土，胞壁酰二肽衍生物，白细胞介素等。此外，可以是这些的混合物。

并且，本发明的可根据目的、用途等适当添加缓冲剂、等渗剂、安抚剂、防腐剂、抗菌剂、抗氧化剂、pH调节剂、分散剂、芳香剂、着色剂、消泡剂等。

作为缓冲剂的优选例，例如，可使用磷酸盐，乙酸盐，碳酸盐，褐色盐酸酒石酸盐，三羟甲基氨基甲烷，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)等缓冲剂等。

作为等渗剂的优选例，例如，可使用氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。

作为安抚剂的优选例，例如，可使用苄醇等。

作为将防腐为目的的药剂的优选例，例如，可使用硫柳汞、对羟基苯甲酸乙酯类、苯氧乙醇、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸、其他各种防腐剂、抗生素、合成抗菌剂等。

作为抗氧化剂的优选例，例如，可使用亚硫酸盐、抗坏血酸等。

作为pH调节剂的优选例，例如，可使用酸，如盐酸，碳酸、乙酸、柠檬酸、磷酸、硼酸、硫酸等；碱金属氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁等；碱金属碳酸盐，如碳酸钠等；或碱金属乙酸盐，如碳酸氢盐、乙酸钠等；碱金属柠檬酸塩，如柠檬酸钠；碱，如氨基丁三醇等；单乙醇胺；二异丙醇胺等。

作为分散剂的优选例，例如，可使用羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨醇酯80(吐温80)等。

作为芳香剂的优选例，例如，可使用柑橘类香料，如柠檬、橙子、葡萄柚等；薄荷、留兰香、薄荷醇、松树、樱桃、水果、酸奶、咖啡等。

作为着色剂的优选例，例如，可使用焦糖色素、栀子黄色素、花青素色素、胭脂树赤色素、辣椒色素、红花色素、红曲色素、胡萝卜素色素、类胡萝卜素色素、黄酮类色素、胭脂虫赤色素、苋菜红(赤色2号)、赤藓赤色素(赤色3号)诱惑红(赤色40号)、胭脂赤色素(赤色第102号)、荧光桃红(赤色104号)、玫瑰红(赤色105号)、酸性红(赤色106号)、柠檬黄(黄色4号)、日落黄(黄色5号)、固绿FCF(绿色3号)、亮蓝(蓝色1号)、靛蓝胭脂红(蓝色2号)、叶绿素铜、叶绿酸铜钠等。

作为消泡剂的优选例，例如，可使用聚二甲基硅氧烷、西甲硅油、硅酮乳液、倍半油酸山梨坦、非离子类物质等。

除上述外，本制剂还可含有辅助成分，例如，作为保存功效的助剂的光吸收色素(核黄素，腺嘌呤，腺苷等)，用于稳定化的螯合剂、还原剂(维生素C、酸等)、碳水化合物(山梨糖醇、乳糖、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖等)，酪蛋白消化物，各种维生素等。

对于疫苗的剂型等可以采用公知的剂型，并不特别限制，例如，可以用作液体制剂。

此外，该疫苗制剂可以是对于其他疾病的一种或多种疾病的混合疫苗制剂。

关于本发明的鱼类的虹彩病毒感染性疾病预防方法

本发明广泛包括将非活化的虹彩病毒且一次给药10^7.0TCID₅₀以上的鱼类的虹彩病毒感染性疾病预防方法。

通过将上述高浓度抗原给药到鱼类，来在广泛的鱼种中可有效地预防真鲷虹彩病毒病等虹彩病毒感染性疾病的发生、感染、传播、蔓延。

本发明可以对真鲷、鲂鱼属鱼类、黄带拟鲹、黑带石斑鱼、点带石斑鱼、褐石斑鱼及七带石斑鱼以外的可感染虹彩病毒的鱼种广泛适用。作为成为适用对象的鱼类，例如，可例举石鲷属鱼类(例如，条石鲷、斑石鲷等)、鲭科鱼类(例如，金枪鱼、黄鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼、大眼金枪鱼等金枪鱼属鱼类、巴鲣等巴鲣属鱼类、鲭鱼等鲭鱼属鱼类、鲣鱼等鲣鱼属鱼类等)、旗鱼亚目鱼类(剑鱼等剑鱼科鱼类、红肉旗鱼等红肉旗鱼科鱼类)等。

作为本发明的非活化疫苗制剂的给药方法，例如，可采用注射法。

为了每次给药10^7.0TCID₅₀以上，例如，可以将0.1mL以上的非活化处理前的虹彩病毒的浓度调制成10^8.0TCID₅₀/mL以上的非活化疫苗制剂给药到肌肉或腹腔内。并且，根据按鱼类或按个体的大小等，例如，在以每次可给药10^7.0TCID₅₀以上的方式适当地调整病毒浓度或者将非活化处理前的虹彩病毒的浓度调制为10^8.0TCID₅₀/mL以上后，可将其非活化疫苗制剂给药0.05mL～5.0mL，更优选为0.05～3.0mL，最优选为以0.05～1.5mL的范围给药。将非活化处理前的虹彩病毒的浓度调制为10^8.0TCID₅₀/mL以上的方法如上述。

在可持续其作用的范围下，非活化疫苗制剂的给药回数1次即可。可根据对象鱼类的大小、疫苗效果的程度等，以1～60日间隔给药多次。例如，优选地，将每次10^7.0TCID₅₀以上的量以1次或隔开1～60日给药2次。

关于用于制备针对本发明的鱼类的虹彩病毒感染性疾病相关的疫苗制剂的使用

本发明广泛地包括用于制备含有非活化的虹彩病毒作为抗原且每次给药10^7.0TCID₅₀以上的、与本发明的鱼类的虹彩病毒感染性疾病相关的疫苗制剂的上述虹彩病毒的使用。

例如，通过使用10^8.0TCID₅₀/mL以上浓度的非活化的虹彩病毒，来可制备每次给药10^7.0TCID₅₀以上的针对与鱼类的虹彩病毒感染性疾病的疫苗制剂。使用的虹彩病毒及其浓度、所制备的疫苗制剂的地方目的、用法、用量、抗原以外的含有成分等与上述相同。

实施例1

实施例1中验证了在将含有使真鲷虹彩病毒在培养细胞中增殖时的培养液和其培养细胞的两者的浓度非活化抗原接种于条石鲷而进行免疫的情况下，与真鲷虹彩病毒病相关的预防效果。

调制细胞混入抗原作为抗原。使真鲷虹彩病毒RIE-124株感染作为附着细胞的GF细胞后，分别分取其细胞和培养液，并混合。该细胞含有感染中的真鲷虹彩病毒，培养液含有真鲷虹彩病毒。在分取的细胞混入培养液中添加0.1％的福尔马林来非活化，并作为“细胞混入抗原”的试样。该试样的虹彩病毒的浓度为10^8.04TCID₅₀/mL。此外，使用的RIE-124株为2012年8月(平成24年8月)在爱媛县的真鲷养殖场中采集患病鱼的脾脏，并且其中，利用培养细胞进行分离、继代来获得的单克隆性真鲷虹彩病毒株。

作为阳性对照调制了通常的培养上清抗原。与上述相同，使真鲷虹彩病毒RIE-124株感染GF细胞后，获得了其培养上清。该培养上清含有真鲷虹彩病毒。在其培养上清中以0.1％的浓度添加福尔马林来非活化，并作为“培养上清抗原”的试样。该试样的虹彩病毒的浓度为10^7.25TCID₅₀/mL。

准备90条平均体重为22.1g的条石鲷稚鱼，以每组30条分成三组，并且分别按组放入试验水槽而饲育。

在三组中，分别以每次0.1mL的方式在非麻醉下，对于第一组的条石鲷向腹腔内注射细胞混入抗原，对第二组向腹腔内注射通常的培养上清抗原来免疫，在25℃的饲育温度下，进行14日的饲育观察。此外，在第三组中，作为对照不给药抗原，并在相同的条件下进行饲育观察。

并且，准备真鲷虹彩病毒RIE12-1株作为攻击用株，进行免疫14日后，在麻醉下，对各个条石鲷以10^0.5TCID₅₀/条向腹腔内注射。然后，在攻击后28日间，在相同的条件下继续进行饲育观察。此外，攻击时的条石鲷的平均体重为31.0g。

图1中示出结果。图1为示出在利用细胞混入抗原进行免疫的情况下，条石鲷的成活率的图表。在图中，分别横轴表示从攻击日开始的日数，纵轴表示成活率。在图中，分别“细胞混入抗原”表示利用上述细胞混入抗原进行免疫的情况下的结果，“培养上清抗原”表示利用上述通常的培养上清抗原进行免疫的情况下的结果，“无给药(对照)”表示未利用抗原进行免疫的情况下的结果。

如图1所示，相对于在无给药情况下的病毒攻击后的成活率为0％，还在利用通常的抗原进行免疫的情况下，成活率为6.7％，在利用细胞混入抗原进行免疫的情况下，成活率为53.3533％，显著高。根据该结果示出如下：细胞混入抗原与通常的培养上清抗原相比，对石鲷属鱼类的虹彩病毒病的预防显著有效。

实施例2

实施例2中验证了在非活化的真鲷虹彩病毒的高浓度抗原接种于条石鲷而进行免疫的情况下，与真鲷虹彩病毒病相关的预防效果。

如下调制以下三种类抗原。

(1)通常抗原(1倍)：与实施例1相同，使真鲷虹彩病毒RIE-124株感染细胞后，进行离心分离获得其培养上清，在其培养上清中以0.1％的浓度添加福尔马林来非活化，并作为“通常抗原(1倍)”的试样。该试样的虹彩病毒的浓度为10^7.34TCID₅₀/mL。

(2)浓缩抗原(5倍)：在将与(1)相同的培养上清通过100kDa离心过滤浓缩五倍的浓缩液中，以0.1％的浓度添加福尔马林进行非活化，并作为“浓缩抗原(5倍)”的试样。该试样的虹彩病毒的浓度为10^8.04TCID₅₀/mL。

(3)细胞混入抗原：与实施例1相同，使真鲷虹彩病毒RIE-124株感染细胞后，分别分取其细胞和培养液病混入，并在其细胞混入培养液中以0.1％的浓度添加福尔马林来进行非活化，并作为“细胞混入抗原”的试样。该试样的虹彩病毒的浓度为10^8.24TCID₅₀/mL。

准备60条平均体重为9.4g的条石鲷稚鱼，以每组15条分成四组，并且分别按组放入试验水槽而饲育。

在四组中，分别以每次0.1mL的方式对于第一组的条石鲷向腹腔内注射(1)的通常抗原，对于第二组向腹腔内注射(2)的抗原，对于第三组向腹腔内注射(3)的细胞混入抗原，并且在25℃的饲育水温下进行了14日的饲育观察。此外，在第四组中，作为对照不给药抗原，并在相同的条件下进行饲育观察。

接着，准备真鲷虹彩病毒RIE12-1株作为攻击用株，进行免疫14日后，在麻醉下，对各个条石鲷以10^0.5TCID₅₀/条向腹腔内注射。然后，在攻击后20日间，在相同的条件下继续进行饲育观察。此外，攻击时的条石鲷的平均体重为15.6g。

图2中示出结果。图2为示出在各个抗原中进行免疫的情况下，条石鲷的成活率的图表。在图中，分别横轴表示从攻击日开始的日数，纵轴表示成活率(％)。在图中，分别“浓缩抗原(5倍)”表示利用上述浓缩抗原进行免疫的情况下的结果，“细胞混入抗原”表示利用上述细胞混入抗原进行免疫的情况下的结果，“通常抗原(1倍)”表示利用上述通常抗原进行免疫的情况下的结果，“无给药(对照)”表示未利用抗原进行免疫的情况下的结果。

如图2所示，还在无给药的情况下成活率为33.3％，并且，还在利用通常抗原进行免疫的情况下，成活率为53.3％，与无给药组相比观察到若干的成活率的提高，但是利用浓缩抗原及细胞混入抗原进行免疫的组的成活率两者均为73.3％，与利用通常抗原进行免疫的组相比，成活率显著提高。由该结果示出浓缩抗原及细胞混入抗原与通常的培养上清抗原相比，对石鲷属鱼类的真鲷虹彩病毒病的预防显著有效，并且，示唆可通过将每次有効抗原量设定为10^7.0TCID₅₀以上，来有效预防石鲷属鱼类等真鲷虹彩病毒病。

实施例3

在实施例3中验证了在将50倍浓度的真鲷虹彩病毒的高浓度抗原接种于条石鲷来进行免疫的情况下，与真鲷虹彩病毒病相关的预防效果。

将在实施例2中获得的培养上清通过500kDa的离心超滤浓缩50倍，利用磷酸盐缓冲液(PBS)进行缓冲交换，来除去夹杂蛋白后，以0.1％的浓度添加福尔马林进行非活化，并作为“浓缩抗原(50倍)”的试样。该试样的虹彩病毒的浓度为10^9.04TCID₅₀/mL。

并且，在从实施例2中获得的培养上清中以0.1％的浓度添加福尔马林进行非活化，并作为“通常抗原(1倍)”的试样。

准备60条平均体重为8.4g的条石鲷稚鱼，以每组20条分成三组，并且分别按组放入试验水槽而饲育。

在三组中，分别以每次0.1mL的方式在非麻醉下，对于第一组的条石鲷向腹腔内注射浓缩抗原(50倍)，对第二组向腹腔内注射通常抗原(1倍)，并且在25℃的饲育温度下，进行14日的饲育观察。此外，在第三组中，替代抗原给药磷酸盐缓冲液，并在相同的条件下进行饲育观察。

接着，准备真鲷虹彩病毒RIE12-1株作为攻击用株，进行免疫14日后，对各个条石鲷以10^0.5TCID₅₀/条向腹腔内注射。并且，攻击后27日间，在相同的条件下继续进行饲育观察。

图3中示出结果。图3为示出在利用50倍浓缩抗原进行免疫的情况下，条石鲷的成活率(％)。在图中，分别横轴表示从攻击日开始的日数，纵轴表示成活率(％)。在图中，分别“浓缩抗原(50倍)”表示利用上述浓度抗原进行免疫的情况下的结果，“通常抗原(1倍)”表示利用上述通常抗原进行免疫的情况下的结果，“磷酸盐缓冲液(对照)”表示替代抗原给药磷酸盐缓冲液的情况下的结果。

如图3所示，在利用通常浓度的抗原进行免疫的情况下的成活率为10％，相对于与作为给药阴性对照组的磷酸盐缓冲液的情况值相同，利用50倍浓度的高浓度抗原进行免疫的情况下的成活率为85％，显著高。根据该结果示出如下：高浓度抗原与通常浓度的抗原相比，对石鲷属鱼类的虹彩病毒病的预防显著有效。

Claims (5)

1.一种针对鱼类的虹彩病毒感染性疾病的疫苗制剂，其特征在于，含有10^8.0TCID₅₀/mL以上的浓度的非活化的虹彩病毒作为抗原。

2.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其特征在于，上述虹彩病毒为在培养细胞中进行增殖的病毒。

3.根据权利要求1或2所述的疫苗制剂，其特征在于，包含使上述虹彩病毒在培养细胞中增殖时的培养上清的浓缩液或者上述培养液及上述培养细胞来作为上述抗原。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的疫苗制剂，其特征在于，对象为石鲷属鱼种。

5.一种用于制备针对鱼类的虹彩病毒感染性疾病的疫苗制剂的上述虹彩病毒的使用，其特征在于，含有非活化的虹彩病毒作为抗原且每次给药10^7.0TCID₅₀以上。