TW201930336A - 疫苗製劑，以及魚類之虹彩病毒感染症之預防方法 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題為提供對石鯛屬魚種等之更有效的魚類之虹彩病毒感染症之防除手段。
本發明之解決手段為提供對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑，其含有經去活化之虹彩病毒作為抗原，且每一次投予107.0 TCID50 以上；等。藉由以經去活化之虹彩病毒作為抗原並每一次投予107.0 TCID50 以上，即便是對以往被認為疫苗效果較低之石鯛屬魚種等，亦可有效地預防真鯛虹彩病毒病等虹彩病毒感染症。藉由含有使虹彩病毒以培養細胞進行增殖時之培養上清液之濃縮液，或培養上清液及經病毒感染之培養細胞等，可提高虹彩病毒在疫苗製劑中之濃度直至可每一次投予107.0 TCID50 以上之程度。

Description

疫苗製劑，以及魚類之虹彩病毒感染症之預防方法
本發明係關於對抗真鯛虹彩病毒病等魚類虹彩病毒感染症之疫苗製劑，其含有經去活化之虹彩病毒作為抗原，且每一次投予107.0 TCID50 以上；魚類之虹彩病毒感染症之預防方法等。
由可增大收穫量，可價格較低廉地安定供給之方面等而言，養殖已在許多魚類中廣泛普及。另一方面，在養殖之情況，相較於天然魚而言，飼育密度較高且環境條件亦容易惡化，故感染症便容易發生／傳播。
作為魚類之虹彩病毒感染症，已知例如真鯛虹彩病毒病。真鯛虹彩病毒病為真鯛虹彩病毒(Red sea bream iridoviral disease)所引發之病毒感染症，其係呈現出顯著的貧血所引發之鰓褪色、脾臟腫大等症狀之致死性較高的疾患，在養殖場之死亡率達到20～60%。於1990年在西日本在養殖真鯛中初次確認其發生，其以後，感染亦擴大至各種養殖魚，迄今為止已以鱸形目為中心在30種以上魚種中確認發生。
相對於此，作為對抗本疾病之防除手段之一，已開發出福馬林去活化疫苗製劑，以真鯛、鰤屬魚類、黃帶擬鰺、瑪拉巴石斑、點帶石斑、褐石斑、七帶石斑為對象，其疫苗製劑已上市。例如在專利文獻1中，已記載將在特定的繼代中所獲得之虹彩病毒株進行去活化／調製而得之魚類用虹彩病毒感染症疫苗。
另一方面，已得知在上述以外之魚種中，此已上市之福馬林去活化疫苗製劑的疫苗效果較低，遂謀求對此等魚種有效的疫苗開發。例如在非專利文獻1中，已提及「在石鯛中，相較於其他魚種而言，被動免疫所引發之防禦效果較低，在使用感染耐過魚的血清之被動免疫試驗中，……在死亡率上看不出顯著差異」此點，以及「在石鯛中之感染防禦中僅為體液性免疫而並不充分，一般認為需要細胞性免疫等另外的防禦機制的參與」此點等，此外，在非專利文獻2中，已提及「對石鯛或斑石鯛之類的石鯛屬魚種之疫苗效果較低」此點，以及「應嘗試進行對石鯛或斑石鯛之有效的疫苗開發」此點等。
[先前技術文獻]
[專利文獻1]
日本特開2007-197454號公報
[非專利文獻1]
松山知正等人，「對海產5魚種中之真鯛虹彩病毒病之被動免疫的效果」，魚病研究Fish Pathology，51(1)，32-35，2016，3
[非專利文獻2]
河東康彥等人，「真鯛虹彩病毒病」，魚病研究Fish Pathology，52(2)，57-62，2017，6
[發明所欲解決之課題]
如上述，例如屬於魚類之虹彩病毒感染症之一之真鯛虹彩病毒病已以鱸形目為中心在30種以上魚種中確認發生。然而，在真鯛、鰤屬魚類、黃帶擬鰺、瑪拉巴石斑、點帶石斑、褐石斑、七帶石斑以外之魚種中，福馬林去活化疫苗製劑的疫苗效果較低，現狀為難以有效防除在該等魚種中之相同疾病。
於是，本發明之目的為提供對真鯛、鰤屬魚類、黃帶擬鰺、瑪拉巴石斑、點帶石斑、褐石斑、七帶石斑以外之魚種更有效的虹彩病毒感染症之防除手段等。

[解決課題之手段]
本發明者等人新穎地發現即便在真鯛、鰤屬魚類、黃帶擬鰺、瑪拉巴石斑、點帶石斑、褐石斑、七帶石斑以外之魚種中，藉由提高疫苗中之有效抗原量，即便是以體液性免疫作為主體之免疫，亦可有效地防除虹彩病毒感染症。
於是，在本發明中，提供(1)一種對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑，其含有經去活化之虹彩病毒作為抗原，且每一次投予107.0 TCID50 以上；(2)一種對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑，其以108.0 TCID50 ／mL以上的濃度含有經去活化之虹彩病毒作為抗原；等。
藉由以經去活化之虹彩病毒作為抗原並每一次投予107.0 TCID50 以上，即便在真鯛、鰤屬魚類、黃帶擬鰺、瑪拉巴石斑、點帶石斑、褐石斑、七帶石斑以外之魚種，例如石鯛屬、鯖科、劍旗魚亞目等魚種中，亦可有效地預防真鯛虹彩病毒病等虹彩病毒感染症的發生／感染／傳播／蔓延。例如藉由投予以108.0 TCID50 ／mL以上的濃度含有經去活化之虹彩病毒之疫苗製劑0.1mL以上，便可投予107.0 TCID50 以上。
在使用以培養細胞進行增殖而得之病毒之情況，即，在前述虹彩病毒為以培養細胞進行增殖而得之病毒之情況，原則上可使用單克隆性病毒作為抗原。且，藉由使病毒以培養細胞進行增殖，可較簡易且大量地調製品質均一的抗原。
但是，即便使虹彩病毒以培養細胞進行增殖，一旦其增殖曲線達到平線區，病毒量便不會更進一步增加，因而藉由通常的一般方法提高該培養液中之虹彩病毒的濃度直至可每一次投予107.0 TCID50 以上之程度係困難性非常高。
相對於此，例如藉由以對虹彩病毒高感受性的培養細胞進行增殖，便可提高病毒的濃度。此外，例如藉由含有使前述虹彩病毒以培養細胞進行增殖時之培養上清液之濃縮液，或前述培養液及前述培養細胞作為前述抗原，亦可提高虹彩病毒在疫苗製劑中之濃度直至可每一次投予107.0 TCID50 以上之程度，即便對例如石鯛屬、鯖科、劍旗魚亞目等魚種，亦能夠有效地預防真鯛虹彩病毒病等虹彩病毒感染症。

[發明效果]
藉由本發明，即便在真鯛、鰤屬魚類、黃帶擬鰺、瑪拉巴石斑、點帶石斑、褐石斑、七帶石斑以外之魚種，例如石鯛屬、鯖科、劍旗魚亞目等魚種中，亦可有效地預防虹彩病毒感染症。
＜針對本發明所涉及之疫苗製劑＞
本發明含括下列全部：(1)一種對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑，其含有經去活化之虹彩病毒作為抗原，且每一次投予107.0 TCID50 以上；(2)一種對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑，其以108.0 TCID50 ／mL以上的濃度含有經去活化之虹彩病毒作為抗原；等。
在此疫苗製劑中，係使用經去活化處理之虹彩病毒作為抗原。就虹彩病毒而言，可廣泛採用公知者，並無特別限定。作為魚類之虹彩病毒，可列舉虹彩病毒科巨大細胞病毒屬(Megalocytivirus屬)的虹彩病毒，例如真鯛虹彩病毒、傳染性脾臟腎臟壞死病毒(ISKNV；Infectious spleen and kidney necrosis virus)等。例如可使用公知的分離株，亦可使用自虹彩病毒感染症已發病之魚類中分離出之分離株。
藉由使此等分離株感染至培養細胞，可使該虹彩病毒分離株進行增殖。例如藉由反覆進行在培養細胞之培養液中加入病毒液而使病毒感染至培養細胞，感染數日後，回收培養細胞及培養液，將其培養上清液作為病毒液再加至培養細胞中之作業，便可使該病毒株進行繼代／增殖，可調製疫苗用抗原。就培養細胞而言，可使用公知的細胞株，例如GF細胞、BF-2細胞等。
例如藉由使虹彩病毒株以培養細胞進行增殖，便可調製含有虹彩病毒作為抗原，前述虹彩病毒為以培養細胞進行增殖而得之病毒之疫苗製劑之原液。
為了每一次投予107.0 TCID50 以上(例如107.0 TCID50 ～1010 TCID50 ，以下相同)，必須調製高濃度的抗原。因此，亦可例如藉由使虹彩病毒株以對虹彩病毒高感受性的培養細胞進行增殖，使病毒進行比通常更高的表現，而調製高濃度抗原。關於對虹彩病毒高感受性的培養細胞，可藉由公知的方法，例如將採取自對真鯛虹彩病毒感受性較高的魚種(例如真鯛、石鯛、斑石鯛、尖吻鱸等鱸魚類等)之組織／細胞進行接種並培養，將各細胞進行單克隆化並繼代，同時使虹彩病毒株感染至該各培養細胞，選出病毒增殖性較高的培養細胞株，而較穩定地樹立對虹彩病毒高感受性的培養細胞株。此外，作為對虹彩病毒高感受性的培養細胞，亦可採用對真鯛虹彩病毒感受性較高的魚種之體外受精卵(胚細胞)或源自於該等之培養細胞等。
此外，亦可例如藉由將使虹彩病毒以培養細胞進行增殖時之培養上清液進行濃縮，而調製高濃度抗原。濃縮手段可廣泛採用離心超過濾等公知的手段。例如藉由將含有虹彩病毒之培養上清液進行濃縮而調製108.0 TCID50 ／mL以上(例如108.0 TCID50 ～1011 TCID50 ，以下相同)的疫苗製劑(之原液)，並投予0.1mL以上該溶液，便可每一次投予107.0 TCID50 以上虹彩病毒。
此外，為了調製高濃度抗原，亦可使用使虹彩病毒以培養細胞進行增殖時之培養液及培養細胞作為疫苗製劑(之原液)。藉由不僅含有培養液，亦含有有效量的培養細胞，即，藉由含有含虹彩病毒之培養液及含感染中之虹彩病毒之培養細胞兩者作為有效抗原，便可調製108.0 TCID50 ／mL以上的疫苗製劑(之原液)，藉由投予0.1mL以上該溶液，便可每一次投予107.0 TCID50 以上虹彩病毒。
如此，藉由製成含有(1)使前述虹彩病毒以培養細胞進行增殖時之培養上清液之濃縮液，或(2)使前述虹彩病毒以培養細胞進行增殖時之前述培養液及前述培養細胞作為前述抗原之疫苗製劑，便能夠每一次投予107.0 TCID50 以上虹彩病毒作為高濃度抗原。
本發明所涉及之抗原亦可為去活化抗原。虹彩病毒的去活化可例如藉由對本發明所涉及之含高濃度抗原之液施以物理性處理(紫外線照射、X射線照射、熱處理、超音波處理等)、化學性處理(經由福馬林等之處理、經由氯仿／醇等之有機溶媒處理、經由醋酸等弱酸之酸處理、經由氯／水銀等之處理)等處理而進行。
例如藉由在含高濃度抗原之液中以0.01～2.0%，更適當為0.05～1.0%的容量濃度添加福馬林，將培養菌液於4～30℃敏化1～10日，便可施行經由福馬林之去活化。此外，亦可例如在去活化處理後，以緩衝液等進行洗淨而去除福馬林等去活化劑，或者添加中和劑來進行中和。
如上述，例如在每一次投予0.1mL疫苗製劑之情況，藉由將該疫苗製劑中之虹彩病毒的濃度調製成108.0 TCID50 ／mL以上，便可每一次投予107.0 TCID50 以上虹彩病毒。就本發明所涉及之疫苗製劑中之虹彩病毒的濃度而言，例如可使用去活化前之病毒感染效價作為指標，亦可使用相當於直接測定疫苗製劑中之去活化虹彩病毒量所獲得之值之感染效價作為指標。另外，去活化虹彩病毒量可例如藉由以ELISA法、蛋白質定量法等直接進行測定而推斷出。
本發明所涉及之疫苗製劑亦可為病毒抗原以外之總蛋白量為0.1%以下(1.0mg／mL以下)者。將虹彩病毒以培養細胞進行增殖時，有時會在其培養液中添加血清等。在該情況，在疫苗製劑(之原液)中亦殘留該等夾雜蛋白質，因而亦可使用例如以超過濾等公知的手段排除該等夾雜蛋白質而得者作為疫苗製劑(之原液)。藉由排除源自血清等之夾雜蛋白質，並將製劑中之總蛋白量壓制於例如0.1mg／mL以下，會有可提高抗原濃度，更加提高疫苗效果之可能性，除此以外，可減輕以該等夾雜蛋白質為成因之副作用等的發生風險。
本發明所涉及之疫苗製劑亦可含有佐劑。
就佐劑而言，可廣泛使用公知者。可列舉例如包含動物油(角鯊烯等)或該等之硬化油、植物油(棕櫚油、蓖麻油等)或該等之硬化油、無水甘露糖醇／油酸酯、流動石蠟、聚丁烯、辛酸、油酸、高級脂肪酸酯等之油性佐劑、PCPP、皂苷、葡萄糖酸錳、葡萄糖酸鈣、甘油磷酸錳、可溶性醋酸鋁、水楊酸鋁、丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、馬來酸酐共聚物、烯基衍生物聚合物、水中油型乳液、含有四級銨鹽之陽離子脂質等水溶性佐劑、氫氧化鋁(明礬)、氫氧化鈉等沉降性佐劑、霍亂毒素、大腸菌易熱性毒素等源自微生物之毒素成分，除此以外，膨潤土、胞壁醯二肽(muramyl dipeptide)衍生物、介白素等。此外，亦可為將此等進行混合而得者。
此外，本發明所涉及之疫苗製劑亦可因應目的／用途等，適宜添加緩衝劑、等張化劑、無痛化劑、防腐劑、抗菌劑、抗氧化劑、pH調節劑、分散劑、芳香劑、著色劑、消泡劑等。
作為緩衝劑之適當例，可使用例如磷酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽酒石酸鹽、三羥甲基胺基甲烷、HEPES等緩衝液等。
作為等張化劑之適當例，可使用例如氯化鈉、甘油、D-甘露糖醇等。
作為無痛化劑之適當例，可使用例如苄醇等。
作為以防腐為目的之藥劑之適當例，可使用例如硫柳汞(thimerosal)、對羥基安息香酸酯類、苯氧基乙醇、氯丁醇、苄醇、苯乙醇、脫氫醋酸、山梨酸，除此以外，各種防腐劑、抗生物質、合成抗菌劑等。
作為抗氧化劑之適當例，可使用例如亞硫酸鹽、抗壞血酸等。
作為pH調節劑之適當例，可使用例如鹽酸、碳酸、醋酸、檸檬酸、磷酸、硼酸、硫酸等酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、氫氧化鎂等鹼金屬氫氧化物、碳酸鈉等鹼金屬碳酸鹽或碳酸氫鹽、醋酸鈉等鹼金屬醋酸鹽、檸檬酸鈉等鹼金屬檸檬酸鹽、三羥甲基胺基甲烷(trometamol)等鹼、單乙醇胺、二異丙醇胺等。
作為分散劑之適當例，可使用例如羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、聚山梨酸酯80(TWEEN80)等。
作為芳香劑之適當例，可使用例如檸檬、橙、葡萄柚等柑橘系香料、胡椒薄荷、綠薄荷、薄荷醇、鳳梨、櫻桃、水果、優格、咖啡等。
作為著色劑之適當例，可使用例如焦糖色素、梔子色素、花青素色素、胭脂樹紅色素、辣椒色素、紅花色素、紅麴色素、胡蘿蔔素色素、類胡蘿蔔素色素、類黃酮色素、胭脂紅色素、莧菜紅(紅色2號)、赤蘚紅(紅色3號)、誘惑紅AC(紅色40號)、新胭脂紅(紅色102號)、玫瑰紅(紅色104號)、孟加拉玫瑰紅(紅色105號)、酸性紅(紅色106號)、檸檬黃(黃色4號)、日落黃FCF(黃色5號)、堅牢綠FCF(綠色3號)、亮藍FCF(藍色1號)、靛胭脂(藍色2號)、葉綠素銅、葉綠素銅鈉等。
作為消泡劑之適當例，可使用例如二甲矽油(dimethicone)、西甲矽油(simethicone)、聚矽氧乳液、山梨糖醇酐倍半油酸酯(sorbitan sesquioleate)、非離子系物質等。
除了上述以外，在本製劑中，亦可含有輔助成分，例如成為保存／效能的助劑之光吸收色素(核黃素、腺嘌呤、腺苷等)、用於安定化之螯合劑／還原劑(維生素C、檸檬酸等)、碳水化合物(山梨糖醇、乳糖、甘露糖醇、澱粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚醣等)、酪蛋白消化物、各種維生素等。
針對疫苗製劑的劑型等，可採用公知者，並無特別限定。亦可例如以液體製劑之形式使用。
除此以外，此疫苗製劑亦可為與對抗其他疾患之一或複數種疫苗混合之疫苗製劑。
＜針對本發明所涉及之魚類之虹彩病毒感染症之預防方法＞
本發明廣泛地含括一種魚類之虹彩病毒感染症之預防方法，其係以經去活化之虹彩病毒作為抗原並每一次投予107.0 TCID50 以上。
藉由將上述高濃度抗原投予至魚類，可在廣泛的魚種中，有效地預防真鯛虹彩病毒病等虹彩病毒感染症的發生／感染／傳播／蔓延。
本發明能夠廣泛應用於真鯛、鰤屬魚類、黃帶擬鰺、瑪拉巴石斑、點帶石斑、褐石斑、七帶石斑以外之可受到虹彩病毒感染之魚種中。作為成為應用對象之魚類，可列舉例如石鯛屬魚類(例如石鯛、斑石鯛等)、鯖科魚類(例如鮪魚／黃鰭鮪／長鰭鮪／短鮪等鮪屬魚類、巴鰹等巴鰹屬魚類、鯖魚等鯖屬魚類、鰹魚等鰹屬魚類等)、劍旗魚亞目魚類(劍旗魚等劍旗魚科魚類、正旗魚等正旗魚科魚類)等。
作為本發明所涉及之去活化疫苗製劑之投予方法，可採用例如注射法。
為了每一次投予107.0 TCID50 以上，亦可例如對肌肉內或腹腔內投予將去活化處理前之虹彩病毒的濃度調製成108.0 TCID50 ／mL以上而得之去活化疫苗製劑0.1mL以上。此外，亦可因應每種魚種或每種個體的尺寸等，例如在以可每一次投予107.0 TCID50 以上之方式適宜調整病毒濃度之後，或在將去活化處理前之虹彩病毒的濃度調製成108.0 TCID50 ／mL以上之後，以0.05mL～5.0mL，更適當為0.05～3.0mL，最適當為0.05～1.5mL的範圍投予該去活化疫苗製劑。將去活化處理前之虹彩病毒的濃度調製成108.0 TCID50 ／mL以上之方法係如上述。
去活化疫苗製劑的投予次數在其作用持續進行之前提下可為1次，亦可因應對象魚類的大小、疫苗效果的程度等，以1～60日間隔投予複數次。例如較適當為投予1次或以1～60日間隔投予2次，每一次107.0 TCID50 以上。
＜針對本發明所涉及之用於製造對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑之用途＞
本發明廣泛地含括一種虹彩病毒之用途，其係用於製造對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑，該對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑含有經去活化之虹彩病毒作為抗原，且每一次投予107.0 TCID50 以上。
例如藉由使用108.0 TCID50 ／mL以上的濃度的經去活化之虹彩病毒，便可製造每一次投予107.0 TCID50 以上之對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑。所使用之虹彩病毒及其濃度、所製造之疫苗製劑的目的／用法／用量／抗原以外之含有成分等係與上述相同。

[實施例1]
在實施例1中，係驗證在將含有使真鯛虹彩病毒以培養細胞進行增殖時之培養液及該培養細胞兩者之去活化抗原接種至石鯛中來進行免疫之情況，對真鯛虹彩病毒病之預防效果。
調製混入細胞之抗原作為抗原。使真鯛虹彩病毒RIE-124株感染至屬於附連細胞之GF細胞後，各自分離取得該細胞及培養液，進行混合。在此細胞中含有感染中之真鯛虹彩病毒，在培養液中含有真鯛虹彩病毒。在所分離取得之混入細胞之培養液中以0.1%的濃度添加福馬林而進行去活化，製成「混入細胞之抗原」之試料。此試料的虹彩病毒的濃度為108.04 TCID50 ／mL。另外，所使用之RIE-124株為平成24年8月，在愛媛縣的真鯛養殖場採取罹病魚的脾臟，自該處以培養細胞進行分離／繼代所獲得之單克隆性真鯛虹彩病毒株。
調製通常的培養上清液抗原作為陽性對照。與上述同樣地，使真鯛虹彩病毒RIE-124株感染至GF細胞後，獲得其培養上清液。在此培養上清液中，含有真鯛虹彩病毒。在該培養上清液中以0.1%的濃度添加福馬林而進行去活化，製成「培養上清液抗原」之試料。此試料的虹彩病毒的濃度為107.25 TCID50 ／mL。
準備平均體重22.1g的石鯛稚魚90尾，每組30尾而分成三組，每組各自裝入試驗水槽中並進行飼育。
三組中，在第一組之石鯛中係將混入細胞之抗原，在第二組中係將通常的培養上清液抗原，各自在非麻醉下對腹腔內各注射0.1mL來進行免疫，在飼育水溫25℃下飼育觀察14日。另外，在第三組中，並未投予抗原，在同樣的條件下進行飼育觀察作為對照。
接著，準備真鯛虹彩病毒RIE12-1株作為攻擊用株，免疫14日後，對各石鯛在麻醉下以100.5 TCID50 ／尾進行腹腔內注射。且，攻擊後28日，在同樣的條件下持續進行飼育觀察。另外，攻擊時之石鯛的平均體重為31.0g。
將結果示於圖1。圖1為示出在以混入細胞之抗原進行免疫之情況之石鯛的生存率之圖表。圖中，各自而言，橫軸表示自進行攻擊之日起之日數，縱軸表示生存率(%)。圖中，各自而言，「混入細胞之抗原」表示以上述混入細胞之抗原進行免疫之情況之結果，「培養上清液抗原」表示以上述通常的培養上清液抗原進行免疫之情況之結果，「無投予(對照)」表示未以抗原進行免疫之情況之結果。
如圖1所示，在無投予之情況之病毒攻擊後之生存率為0%，即便在以通常的培養上清液抗原進行免疫之情況，生存率亦為6.7%，相對於此，在以混入細胞之抗原進行免疫之情況，生存率為53.3%，顯著地較高。由此結果，顯示出混入細胞之抗原相較於通常的培養上清液抗原而言，對石鯛屬魚類之虹彩病毒病的預防係顯著地有效。

[實施例2]
在實施例2中，係驗證在將經去活化之真鯛虹彩病毒之高濃度抗原接種至石鯛中來進行免疫之情況，對真鯛虹彩病毒病之預防效果。
如以下調製以下三種抗原。
(1)通常抗原(1倍)：與實施例1同樣地，使真鯛虹彩病毒RIE-124株感染至GF細胞後，進行離心分離而獲得其培養上清液，在該培養上清液中以0.1%的濃度添加福馬林而進行去活化，製成「通常抗原(1倍)」之試料。此試料的虹彩病毒的濃度為107.34 TCID50 ／mL。
(2)濃縮抗原(5倍)：在將與(1)同樣的培養上清液藉由100kDa離心超過濾進行五倍濃縮而得之濃縮液中以0.1%的濃度添加福馬林而進行去活化，製成「濃縮抗原(5倍)」之試料。此試料的虹彩病毒的濃度為108.04 TCID50 ／mL。
(3)混入細胞之抗原：與實施例1同樣地，使真鯛虹彩病毒RIE-124株感染至GF細胞後，各自分離取得／混合該細胞及培養液，在該混入細胞之培養液中以0.1%的濃度添加福馬林而進行去活化，製成「混入細胞之抗原」之試料。此試料的虹彩病毒的濃度為108.24 TCID50 ／mL。
準備平均體重9.4g的石鯛稚魚60尾，每組15尾而分成四組，每組各自裝入試驗水槽中並進行飼育。
四組中，在第一組之石鯛中係將(1)之通常抗原，在第二組中係將(2)之濃縮抗原，在第三組中係將(3)之混入細胞之抗原，各自對腹腔內各注射0.1mL來進行免疫，在飼育水溫25℃下飼育觀察14日。另外，在第四組中，並未投予抗原，在同樣的條件下進行飼育觀察作為對照。
接著，準備真鯛虹彩病毒RIE12-1株作為攻擊用株，免疫14日後，對各石鯛在麻醉下以100.5 TCID50 ／尾進行腹腔內注射。且，攻擊後20日，在同樣的條件下持續進行飼育觀察。另外，攻擊時之石鯛的平均體重為15.6。
將結果示於圖2。圖2為示出在以各抗原進行免疫之情況之石鯛的生存率之圖表。圖中，各自而言，橫軸表示自進行攻擊之日起之日數，縱軸表示生存率(%)。圖中，各自而言，「濃縮抗原(5倍)」表示以上述濃縮抗原進行免疫之情況之結果，「混入細胞之抗原」表示以上述混入細胞之抗原進行免疫之情況之結果，「通常抗原(1倍)」表示以上述通常抗原進行免疫之情況之結果，「無投予(對照)」表示未以抗原進行免疫之情況之結果。
如圖2所示，即便在無投予之情況，生存率亦為33.3%，此外，即便在以通常抗原進行免疫之情況，生存率亦為53.3%，相較於無投予組而言，可觀察到若干生存率的提升，而以濃縮抗原及混入細胞之抗原進行免疫之組之生存率兩者皆為73.3%，相較於以通常抗原進行免疫之組而言，生存率顯著地較高。由此結果，顯示出濃縮抗原及混入細胞之抗原相較於通常的培養上清液抗原而言，對石鯛屬魚類之真鯛虹彩病毒病的預防顯著地有效，此外，暗示藉由將每一次之有效抗原量設為107.0 TCID50 以上，可有效地預防石鯛屬魚類等之真鯛虹彩病毒病。

[實施例3]
在實施例3中，係驗證在將經50倍濃縮之真鯛虹彩病毒之高濃度抗原接種至石鯛中來進行免疫之情況，對真鯛虹彩病毒病之預防效果。
將實施例2中所獲得之培養上清液藉由500kDa離心超過濾進行50倍濃縮，以PBS進行緩衝液更換而去除夾雜蛋白質後，以0.1%的濃度添加福馬林而進行去活化，製成「濃縮抗原(50倍)」之試料。此試料的虹彩病毒的濃度為109.04 TCID50 ／mL。
此外，在實施例2中所獲得之培養上清液中以0.1%的濃度添加福馬林而進行去活化，製成「通常抗原(1倍)」之試料。
準備平均體重8.4g的石鯛稚魚60尾，每組20尾而分成三組，每組各自裝入試驗水槽中並進行飼育。
三組中，在第一組之石鯛中係將濃縮抗原(50倍)，在第二組中係將通常抗原(1倍)，各自在非麻醉下對腹腔內各注射0.1mL來進行免疫，在飼育水溫25℃下飼育觀察14日。另外，在第三組中，投予PBS來代替抗原，在同樣的條件下進行飼育觀察作為對照。
接著，準備真鯛虹彩病毒RIE12-1株作為攻擊用株，免疫14日後，對各石鯛以100.5 TCID50 ／尾進行腹腔內注射。且，攻擊後27日，在同樣的條件下持續進行飼育觀察。
將結果示於圖3。圖3為示出在以50倍濃縮抗原進行免疫之情況之石鯛的生存率之圖表。圖中，各自而言，橫軸表示自進行攻擊之日起之日數，縱軸表示生存率(%)。圖中，各自而言，「濃縮抗原(50倍)」表示以50倍濃縮抗原進行免疫之情況之結果，「通常抗原(1倍)」表示以通常抗原(1倍)進行免疫之情況之結果，「PBS(對照)」表示投予PBS來代替抗原之情況之結果。
如圖3所示，以通常濃度的抗原進行免疫之情況之生存率為10%，其係與屬於陰性對照之PBS投予之情況(15%)同等之值，相對於此，以經50倍濃縮之高濃度抗原進行免疫之情況之生存率為85%，顯著地較高。由此結果，顯示出高濃度抗原相較於通常濃度的抗原而言，對石鯛屬魚類之虹彩病毒病的預防顯著地有效。
[圖1]示出在實施例1中，在以混入細胞之抗原進行免疫之情況之石鯛的生存率之圖表。
[圖2]示出在實施例2中，在以濃縮抗原或混入細胞之抗原進行免疫之情況之石鯛的生存率之圖表。
[圖3]示出在實施例3中，在以50倍濃縮抗原進行免疫之情況之石鯛的生存率之圖表。

Claims (5)

  1. 一種對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑，其以108.0 TCID50 ／mL以上的濃度含有經去活化之虹彩病毒作為抗原。
  2. 如申請專利範圍第1項之疫苗製劑，其中，前述虹彩病毒為以培養細胞進行增殖而得之病毒。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之疫苗製劑，其含有使前述虹彩病毒以培養細胞進行增殖時之培養上清液之濃縮液，或前述培養液及前述培養細胞作為前述抗原。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之疫苗製劑，其中，對象為石鯛屬魚種。
  5. 一種虹彩病毒之用途，其係用於製造對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑，該對抗魚類之虹彩病毒感染症之疫苗製劑含有經去活化之虹彩病毒作為抗原，且每一次投予107.0 TCID50 以上。
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