JP2008074797A - 魚類滑走細菌症ワクチン - Google Patents
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Abstract
【課題】 マダイ、カンパチ等の海産魚類が、テナキバクラム マリティマムに感染して、滑走細菌症を発病するのを効果的に防止することができるとともに、食品衛生上の問題や、環境中への拡散による公衆衛生上の問題を生じさせない新規製剤を提供する。
【解決手段】 テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類滑走細菌症ワクチンとする。
【選択図】 図１
【解決手段】 テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類滑走細菌症ワクチンとする。
【選択図】 図１
Description
本発明は魚類滑走細菌症ワクチンに関し、より詳細には、テナキバクラム マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）不活化菌体又はその成分を有効成分とする、主に浸漬用の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
滑走細菌症は、マダイ、カンパチ、ヒラメ、フグ等の海産魚類に発病する病気で、その原因菌はテナキバクラム マリティマム〔Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ（以前はＦｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）〕であることが判明している（非特許文献１）。テナキバクラム マリティマムによる滑走細菌症は、最初にアメリカでサケ科魚類に発生が報告された魚病で、日本でも１９７０年頃から種々の海産養殖魚に発生して、ときには大きな被害をもたらすようになった（非特許文献２）。
特に稚魚期に於いて、滑走細菌症による被害が多く、その症状は、稚魚では口唇部や尾鰭に糜爛や壊死あるいは崩壊が起こり、幼魚や成魚では頭部、躯幹、鰭、鰓等に発赤や出血ときには潰瘍が見られる（非特許文献３）。閉鎖系である養殖領域に於ける滑走細菌症は、個体が高密度に存在していることから、それらの感染の影響は大きく、海産養殖産業において深刻な問題となっている。
特に稚魚期に於いて、滑走細菌症による被害が多く、その症状は、稚魚では口唇部や尾鰭に糜爛や壊死あるいは崩壊が起こり、幼魚や成魚では頭部、躯幹、鰭、鰓等に発赤や出血ときには潰瘍が見られる（非特許文献３）。閉鎖系である養殖領域に於ける滑走細菌症は、個体が高密度に存在していることから、それらの感染の影響は大きく、海産養殖産業において深刻な問題となっている。
滑走細菌は、ニフルスチレン酸（特許文献１）や、テトラサイクリン系の抗生物質に感受性があるので、滑走細菌症の防除対策としては、その大部分をこれら薬剤に頼っているのが現状である。例えば、ニフルスチレン酸ナトリウムに関しては、水産用医薬品としても承認されているし、オキシテトラサイクリン等の抗生物質を経口投与することが有効である（特許文献２）ことも報告されている。
しかしながら、これら抗菌性薬剤等の使用は、多剤耐性菌の増加や、薬剤の魚体への残留による食品衛生上の問題および環境中への拡散による公衆衛生上の問題を孕んでいる。さらに経口投与は餌を喰わない重症魚には効果が無いことや、ニフルスチレン酸ナトリウムは、現在ヒラメの稚魚にしか使用できないこと等の問題もある。
以上より、マダイ、カンパチ等の海産魚類の滑走細菌症予防に有効であって、且つ環境汚染等の問題が生じない新規製剤の開発が望まれている。
しかしながら、これら抗菌性薬剤等の使用は、多剤耐性菌の増加や、薬剤の魚体への残留による食品衛生上の問題および環境中への拡散による公衆衛生上の問題を孕んでいる。さらに経口投与は餌を喰わない重症魚には効果が無いことや、ニフルスチレン酸ナトリウムは、現在ヒラメの稚魚にしか使用できないこと等の問題もある。
以上より、マダイ、カンパチ等の海産魚類の滑走細菌症予防に有効であって、且つ環境汚染等の問題が生じない新規製剤の開発が望まれている。
Wakabayashi H, Hikida M, Masumura K. Flexibacter maritimus sp.nov., a pathogens of marine fishes. Int.J.Sys.Bac.1986; 36: 396-398
Hikida M, Wakabayashi H, Egusa S, Masumura K. Flexibacter sp., a gliding bacterium pathogenic to some marine fishes in Japan. Bull.Jpn Soc. Fish. 1979; 45: 421-428
Bernardet J-F, Kerouault B, Michel C. Comparative study on Flexibacter maritimus strains isolated from farmed sea bass (Dicentrarchus labrax) in France. Fish Pathol. 1994; 29: 105-111.
特開平８−００９８２１号公報
特開平６−１６５６４６号公報
本発明の目的は、上記従来技術の問題点に鑑み、マダイ、カンパチ等の海産魚類が、テナキバクラム マリティマムに感染して、滑走細菌症を発病するのを効果的に防止することができるとともに、食品衛生上の問題や、環境中への拡散による公衆衛生上の問題を生じさせない新規製剤を提供することにある。
本発明者らは、鋭意研究の結果、テナキバクラム マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）不活化菌体又はその成分を有効成分とするワクチンが、マダイ等の海産魚類に発病する滑走細菌症を効果的に防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、請求項１に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項２に係る発明は、浸漬ワクチンである請求項１記載の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項３に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの菌株が、Ｒ２、ＳＭ３３２２ｃ、ＯＭ３５１０、ＭＣ９２１０からなる群より選択される何れか１つである請求項１又は２に記載の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項４に係る発明は、マダイの滑走細菌症に適応される請求項１乃至３何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項５に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を含有する魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項６に係る発明は、浸漬用のワクチン組成物である請求項５記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項７に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの菌株が、Ｒ２、ＳＭ３３２２ｃ、ＯＭ３５１０、ＭＣ９２１０からなる群より選択される何れか１つである請求項５又は６に記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項８に係る発明は、マダイの滑走細菌症に適応される請求項５乃至７何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項９に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分の有効量を浸漬法によって投与することを特徴とする魚類滑走細菌症の予防法に関する。
請求項１０に係る発明は、沖出しの１〜２週間前に、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を懸濁した溶液に２０分以上浸漬する請求項９に記載の魚類滑走細菌症の予防法に関する。
請求項２に係る発明は、浸漬ワクチンである請求項１記載の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項３に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの菌株が、Ｒ２、ＳＭ３３２２ｃ、ＯＭ３５１０、ＭＣ９２１０からなる群より選択される何れか１つである請求項１又は２に記載の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項４に係る発明は、マダイの滑走細菌症に適応される請求項１乃至３何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチンに関する。
請求項５に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を含有する魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項６に係る発明は、浸漬用のワクチン組成物である請求項５記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項７に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの菌株が、Ｒ２、ＳＭ３３２２ｃ、ＯＭ３５１０、ＭＣ９２１０からなる群より選択される何れか１つである請求項５又は６に記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項８に係る発明は、マダイの滑走細菌症に適応される請求項５乃至７何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物に関する。
請求項９に係る発明は、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分の有効量を浸漬法によって投与することを特徴とする魚類滑走細菌症の予防法に関する。
請求項１０に係る発明は、沖出しの１〜２週間前に、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を懸濁した溶液に２０分以上浸漬する請求項９に記載の魚類滑走細菌症の予防法に関する。
本発明のワクチン又はワクチン組成物を用いれば、ブリ、カンパチ、マダイ等の魚類滑走細菌症を効率的に予防することができるとともに、元来自然物であるので、食品衛生上の問題や環境中への拡散による公衆衛生上の問題を生じさせることもない。
本発明者らは、鋭意研究の結果、テナキバクラム マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）（以下「本菌」と称す場合がある）の不活化菌体、又はその成分を有効成分とするワクチンが、滑走細菌症の予防に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明のワクチンは、テナキバクラム マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）の不活化菌体またはその成分を用いる。詳細には、テナキバクラム マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）のＲ２株、ＳＭ３３２２ｃ株、ＯＭ３５１０株、ＭＣ９２１０株の不活化菌体またはその成分を用いるのが、より強力な滑走細菌症の予防効果を得る観点から望ましい。
テナキバクラム マリティマムは、グラム陰性、好気性で、屈曲運動をする黄色色素（カロテノイド）をもつ長桿菌（０．５×２〜３μm）である。その発育は３０℃、ｐＨ７が最適で、海水（３０％）を必要とする他、性状がカラムナリス病菌や、その他の細菌と違っているので、日本で新種として命名された。この細菌はタンパク質を分解するが、デンプンその他の多糖を分解せず、細菌を溶解（溶菌）する作用をもっている。
通常、細菌を培養した場合、誘導期、対数増殖期、定常期、死滅期及び生残期に分けられるが、本発明のワクチンでは、対数増殖期のものを用いるのが望ましい。
通常、細菌を培養した場合、誘導期、対数増殖期、定常期、死滅期及び生残期に分けられるが、本発明のワクチンでは、対数増殖期のものを用いるのが望ましい。
本発明のワクチンに用いる菌体（テナキバクラム マリティマム）は、本菌を常法により培養し、対数増殖期に採取することにより得られる。本菌の培養は、本菌を適当な培地に接種し常法に従って培養すればよい。例えば、テナキバクラム マリティマム（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）を、７０％海水サイトファーガ寒天培地で、２５℃、４８時間培養するのが望ましい。
本菌の成分には、菌体の膜成分及び分泌物が含まれる。これらの成分を採取するには、不活化菌体の超音波破砕等により行うのが好ましい。
得られた不活化菌体又はその成分は、濾過、蒸発脱水法、濃縮、凍結乾燥等により濃縮して用いるのが好ましい。
得られた不活化菌体又はその成分は、濾過、蒸発脱水法、濃縮、凍結乾燥等により濃縮して用いるのが好ましい。
本菌の不活化菌体又はその成分は、そのままワクチンとして使用してもよいが、薬学的に許容される液状、又は固体状の担体とともにワクチン組成物として使用してもよい。
当該ワクチン組成物の形態としては、注射用組成物、経口投与組成物、魚類浸漬用組成物、飼料組成物等が挙げられるが、魚類浸漬用組成物とするのが望ましい。
液状の担体としては、リン酸緩衝液が挙げられる。固体状の担体としては、タルク、シュークロースなどの賦形剤が挙げられる。飼料組成物とするには、通常の魚類の飼料に本菌の不活化菌体又はその成分を混合すればよい。又、これらのワクチン組成物にはアジュバントを添加して抗原性を高めてもよい。
当該ワクチン組成物の形態としては、注射用組成物、経口投与組成物、魚類浸漬用組成物、飼料組成物等が挙げられるが、魚類浸漬用組成物とするのが望ましい。
液状の担体としては、リン酸緩衝液が挙げられる。固体状の担体としては、タルク、シュークロースなどの賦形剤が挙げられる。飼料組成物とするには、通常の魚類の飼料に本菌の不活化菌体又はその成分を混合すればよい。又、これらのワクチン組成物にはアジュバントを添加して抗原性を高めてもよい。
本発明のワクチン又はワクチン組成物の対象魚種としては、本菌による滑走細菌症になる魚類であれば制限されず、例えばブリ、カンパチ等のブリ属魚類の他、マダイ、ヒラメ等の海産魚類が挙げられるが、マダイの滑走細菌症に対するのが最も効果的である。
〔ワクチン接種方法〕
魚類ワクチンの接種法として代表的なものに、経口法、注射法及び浸漬法が知られているが、経口法は、胃の消化酵素等によりワクチンの免疫原性が低下してしまうことから高い有効性・持続性を得ることは困難である等の欠点が、また注射法は、稚魚への適用が困難であること、多大な労力が必要であること、魚に与えるストレスが大きいこと、作業者への誤注射の危険性があること等の欠点がある。特に注射法は、稚魚への適用が困難なので、滑走細菌症のような稚魚期に甚大な被害をもたらす疾病に用いることができない。
一方、浸漬法は（経口法に比べ）有効性が高く大量の魚を同時に処理することができ、注射法のように多大な労力が必要である等といった欠点もない。また稚魚への適用も可能である。但し、魚体に取り込まれるワクチンが少量である為、高い有効性が認められるのは、ビブリオ病など一部の疾病に対するワクチンに限られている。
魚類ワクチンの接種法として代表的なものに、経口法、注射法及び浸漬法が知られているが、経口法は、胃の消化酵素等によりワクチンの免疫原性が低下してしまうことから高い有効性・持続性を得ることは困難である等の欠点が、また注射法は、稚魚への適用が困難であること、多大な労力が必要であること、魚に与えるストレスが大きいこと、作業者への誤注射の危険性があること等の欠点がある。特に注射法は、稚魚への適用が困難なので、滑走細菌症のような稚魚期に甚大な被害をもたらす疾病に用いることができない。
一方、浸漬法は（経口法に比べ）有効性が高く大量の魚を同時に処理することができ、注射法のように多大な労力が必要である等といった欠点もない。また稚魚への適用も可能である。但し、魚体に取り込まれるワクチンが少量である為、高い有効性が認められるのは、ビブリオ病など一部の疾病に対するワクチンに限られている。
本発明のワクチン又はワクチン組成物を接種する方法としては「浸漬法」によるのが好ましい。即ち、本発明のワクチン又はワクチン組成物は「浸漬法」によっても十分に高い有効性が認められ、浸漬法の長所である多大な労力が必要ないこと、稚魚への適用も可能であること等から、主に浸漬用として、本発明のワクチン又はワクチン組成物が、特に稚魚期に甚大な被害をもたらす滑走細菌症に対するワクチンとして極めて有用である。
本発明のワクチン又はワクチン組成物の投与は成魚でもよいが、滑走細菌症に罹患する前、例えば稚魚の段階が好ましい。
投与方法は、上記したとおり「浸漬法」によるのが好ましいが、浸漬に用いるワクチン溶液としては、本発明のワクチン又はワクチン組成物を１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、海水に懸濁したもの等が望ましい。
投与方法は、上記したとおり「浸漬法」によるのが好ましいが、浸漬に用いるワクチン溶液としては、本発明のワクチン又はワクチン組成物を１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、海水に懸濁したもの等が望ましい。
〔ワクチンの浸漬時間〕
ワクチンの浸漬（投与）時間としては、１０分以上行うのが好ましいが、２０分以上行うのがより好ましい。この理由は、１０分を下回る時間、浸漬したとしても十分なワクチン効果を発揮することができないからである。
尚、後述する実施例に於いて、１５分間浸漬した試験区よりも３０分間浸漬した試験区の方が、高いワクチン効果が得られることが実証されている（図３参照）。
ワクチンの浸漬（投与）時間としては、１０分以上行うのが好ましいが、２０分以上行うのがより好ましい。この理由は、１０分を下回る時間、浸漬したとしても十分なワクチン効果を発揮することができないからである。
尚、後述する実施例に於いて、１５分間浸漬した試験区よりも３０分間浸漬した試験区の方が、高いワクチン効果が得られることが実証されている（図３参照）。
〔ワクチンの浸漬濃度〕
投与方法は、上記したとおり「浸漬法」によるのが好ましく、海水に本発明のワクチン又はワクチン組成物を１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁したものが好ましく使用される。
投与方法は、上記したとおり「浸漬法」によるのが好ましく、海水に本発明のワクチン又はワクチン組成物を１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁したものが好ましく使用される。
〔ワクチンの浸漬回数〕
浸漬（投与）回数は１回でもよいが、２回以上行うのがワクチン効果をより強固に発揮するためには好ましい。後述する実施例に於いても、１回投与の試験区よりも２回投与の試験区で、より高いワクチン効果（有効率が高い傾向）が認められている（図６参照）。
浸漬（投与）回数は１回でもよいが、２回以上行うのがワクチン効果をより強固に発揮するためには好ましい。後述する実施例に於いても、１回投与の試験区よりも２回投与の試験区で、より高いワクチン効果（有効率が高い傾向）が認められている（図６参照）。
〔ワクチン浸漬後、沖出しする迄の経過日数〕
より高いワクチン効果（有効率が高い効果）を得る為には、ワクチンの浸漬時間は２０分以上行うのがより好ましいが、この場合、ワクチンの浸漬（投与）は沖出しする少なくとも１週間前（好ましくは１〜２週間）に行うのが、好ましい（図１及び２参照）。
より高いワクチン効果（有効率が高い効果）を得る為には、ワクチンの浸漬時間は２０分以上行うのがより好ましいが、この場合、ワクチンの浸漬（投与）は沖出しする少なくとも１週間前（好ましくは１〜２週間）に行うのが、好ましい（図１及び２参照）。
以下に実施例を示すが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
実験Ｉ 「供試菌株の相違によるワクチン有効性の比較」
マダイ由来１４株、ヒラメ由来１株およびトラフグ由来１株で不活化ワクチンを作製し、その有効性をマダイにおいて検討した。
マダイ由来１４株、ヒラメ由来１株およびトラフグ由来１株で不活化ワクチンを作製し、その有効性をマダイにおいて検討した。
〔供試魚〕
近畿大学水産研究所白浜実験場で２００３年に生産されたマダイ（平均全長５．４ｃｍ，平均体重３．１ｇ）を４５０尾使用した。
近畿大学水産研究所白浜実験場で２００３年に生産されたマダイ（平均全長５．４ｃｍ，平均体重３．１ｇ）を４５０尾使用した。
〔供試ワクチン〕
マダイ由来１２株（強毒株６株，弱毒株６株），ヒラメ由来１株（弱毒株），トラフグ由来１株（強毒株）を７０％海水改変サイトファーガ寒天培地で２５℃、４８時間培養した後、１．５％ホルマリンＰＢＳで４℃，２４時間不活化した菌体を供試ワクチンとした。
マダイ由来１２株（強毒株６株，弱毒株６株），ヒラメ由来１株（弱毒株），トラフグ由来１株（強毒株）を７０％海水改変サイトファーガ寒天培地で２５℃、４８時間培養した後、１．５％ホルマリンＰＢＳで４℃，２４時間不活化した菌体を供試ワクチンとした。
〔試験区設定およびワクチンの投与〕
２００Ｌ容ポリカーボネイト水槽１５基に３０尾ずつ収容した。１４基をワクチン投与区、１基を対照区に設定した。ワクチン投与は浸漬法によって行い、浸漬濃度は湿菌重量で２０μｇ／ｍＬ、浸漬時間は３０分とした。
２００Ｌ容ポリカーボネイト水槽１５基に３０尾ずつ収容した。１４基をワクチン投与区、１基を対照区に設定した。ワクチン投与は浸漬法によって行い、浸漬濃度は湿菌重量で２０μｇ／ｍＬ、浸漬時間は３０分とした。
〔人為感染〕
７０％海水改変サイトファーガ寒天培地で２５℃、約２４時間培養したテナキバクラム マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）Ｒ２株を、濾過海水で１００μｇ／ｍＬに懸濁し、供試魚を３０分間浸漬した。人為感染の翌日から１０日後まで約１２時間ごとに死亡魚を取り上げ、有効率を〔数１〕における式において算出した。
Ｒ２株を１００ｍｇ／ｍＬの濃度に懸濁した菌液をＢＣＧ接種用管針で供試魚体表に接種し、人為感染の翌日から１４日後まで約１２時間ごとに死亡魚を取り上げた。
結果を下記の〔表１〕に示す。
７０％海水改変サイトファーガ寒天培地で２５℃、約２４時間培養したテナキバクラム マリティマム（Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ）Ｒ２株を、濾過海水で１００μｇ／ｍＬに懸濁し、供試魚を３０分間浸漬した。人為感染の翌日から１０日後まで約１２時間ごとに死亡魚を取り上げ、有効率を〔数１〕における式において算出した。
Ｒ２株を１００ｍｇ／ｍＬの濃度に懸濁した菌液をＢＣＧ接種用管針で供試魚体表に接種し、人為感染の翌日から１４日後まで約１２時間ごとに死亡魚を取り上げた。
結果を下記の〔表１〕に示す。
〔結果〕
・ 強毒株群では生残率２０〜９０％、有効率１７．２〜８９．７％であった。
・ また、弱毒株群では生残率０〜７２．４％，有効率０〜７１．５％であった。
・ 対照区の生残率は３．３％であった。
・ 強毒株群では、ＳＭ２２０２ｓを除き、４０％以上の有効率が認められた。
・ 特に、ＳＭ３３２２ｃ区およびＯＭ３５１０区では有効率７５％以上であった。
・ 弱毒株群ではＭＣ９２１０区で７１．５％の有効率が得られたものの、それ以外の試験区では０〜３４．５％であった。
以上より、テナキバクラム マリティマムの中でも、Ｒ２株、ＳＭ３３２２ｃ株、ＯＭ３５１０株、ＭＣ９２１０株の不活化菌体またはその成分を用いるのが望ましいことが示された。
・ 強毒株群では生残率２０〜９０％、有効率１７．２〜８９．７％であった。
・ また、弱毒株群では生残率０〜７２．４％，有効率０〜７１．５％であった。
・ 対照区の生残率は３．３％であった。
・ 強毒株群では、ＳＭ２２０２ｓを除き、４０％以上の有効率が認められた。
・ 特に、ＳＭ３３２２ｃ区およびＯＭ３５１０区では有効率７５％以上であった。
・ 弱毒株群ではＭＣ９２１０区で７１．５％の有効率が得られたものの、それ以外の試験区では０〜３４．５％であった。
以上より、テナキバクラム マリティマムの中でも、Ｒ２株、ＳＭ３３２２ｃ株、ＯＭ３５１０株、ＭＣ９２１０株の不活化菌体またはその成分を用いるのが望ましいことが示された。
〔ホルマリン不活化ワクチンの浸漬投与によるマダイの滑走細菌症の防除〕
実験 II ： ワクチン浸漬時間および浸漬後経過日数の長短による比較
実験 III： ワクチン２回投与の検討
実験 II ： ワクチン浸漬時間および浸漬後経過日数の長短による比較
実験 III： ワクチン２回投与の検討
実験 II ： ワクチン浸漬時間および浸漬後経過日数の長短による比較
「材料と方法」
（１）供試魚 ： マダイ稚魚４００尾（平均全長８．８ｃｍ，平均体重１４．６ｇ）
（２）供試ワクチン ： Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、７０％海水サイトファーガ寒天培地で、２５℃、４８時間培養し、１．５％ホルマリンＰＢＳで４℃，４８時間の条件で不活化した。このようにして得られたワクチンを、以下「ＦＫＣ」（Formalin killed cells）と称す。尚、ＦＫＣは本発明にかかるワクチンである。
（３）飼育水槽 ： ２００Ｌ容パンライト水槽
（４）収容尾数 ： ５０尾ずつ
（５）ワクチン（ＦＫＣ）投与 ： ２０ｍｇ／ｍＬのＦＫＣ懸濁海水に浸漬させることにより行った。ＦＫＣ投与は、１５分間浸漬、３０分間浸漬の２通りで実施した。
（６）平均水温 ： ２０．７℃
（７）人為感染 ： 人為感染は、Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２を１．１×１０８ＣＦＵ／ｍＬに懸濁した海水に２０分間浸漬することにより行った。
「材料と方法」
（１）供試魚 ： マダイ稚魚４００尾（平均全長８．８ｃｍ，平均体重１４．６ｇ）
（２）供試ワクチン ： Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、７０％海水サイトファーガ寒天培地で、２５℃、４８時間培養し、１．５％ホルマリンＰＢＳで４℃，４８時間の条件で不活化した。このようにして得られたワクチンを、以下「ＦＫＣ」（Formalin killed cells）と称す。尚、ＦＫＣは本発明にかかるワクチンである。
（３）飼育水槽 ： ２００Ｌ容パンライト水槽
（４）収容尾数 ： ５０尾ずつ
（５）ワクチン（ＦＫＣ）投与 ： ２０ｍｇ／ｍＬのＦＫＣ懸濁海水に浸漬させることにより行った。ＦＫＣ投与は、１５分間浸漬、３０分間浸漬の２通りで実施した。
（６）平均水温 ： ２０．７℃
（７）人為感染 ： 人為感染は、Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２を１．１×１０８ＣＦＵ／ｍＬに懸濁した海水に２０分間浸漬することにより行った。
供試魚にＦＫＣを投与（５）した後、人為感染（７）を行い、ＦＫＣの感染防御効果を検討した。ＦＫＣ投与から３日後、１週間後および２週間後に、人為感染させた試験区を夫々設け、ＦＫＣ非投与の対照区と比較することにより、ＦＫＣの有効率を算出した。
尚、有効率は〔数１〕における式において算出した。表２に各試験区を示す。
尚、有効率は〔数１〕における式において算出した。表２に各試験区を示す。
〔結果〕
１）図１は、本発明にかかる滑走細菌症ワクチンを「１５分間浸漬させた場合」におけるマダイの生存率（％）の推移を示したグラフであるが、ＦＫＣ投与から人為感染までの日数が１週間のもの（前記表２における第２段目）が、３日のもの（同第１段目）及び２週間（同第３段目）のものと比して、格段に高い生存率（％）が示された。
２）図２は、本発明にかかる滑走細菌症ワクチンを「３０分間浸漬させた場合」におけるマダイの生存率（％）の推移を示したグラフであるが、ＦＫＣ投与から人為感染迄の日数が１週間、２週間のものが、３日のものと比して、格段に高い生存率（％）が示された。
３）以上より、本発明のワクチンを３０分浸漬させた場合の方が、１５分間浸漬させた場合と比して、高いワクチン効果（生存率％）を発揮することが示された。
さらに、１５分浸漬の場合および３０分間浸漬の場合の双方において、ワクチン浸漬後の沖出し迄の日数は、１週間程度（厳密には４日以上であることが本発明者らによって確認されている）、若しくはそれ以上（〜２週間）空けることが、より高いワクチン効果（有効率が高い効果）を得る為には好ましいことが示された。
１）図１は、本発明にかかる滑走細菌症ワクチンを「１５分間浸漬させた場合」におけるマダイの生存率（％）の推移を示したグラフであるが、ＦＫＣ投与から人為感染までの日数が１週間のもの（前記表２における第２段目）が、３日のもの（同第１段目）及び２週間（同第３段目）のものと比して、格段に高い生存率（％）が示された。
２）図２は、本発明にかかる滑走細菌症ワクチンを「３０分間浸漬させた場合」におけるマダイの生存率（％）の推移を示したグラフであるが、ＦＫＣ投与から人為感染迄の日数が１週間、２週間のものが、３日のものと比して、格段に高い生存率（％）が示された。
３）以上より、本発明のワクチンを３０分浸漬させた場合の方が、１５分間浸漬させた場合と比して、高いワクチン効果（生存率％）を発揮することが示された。
さらに、１５分浸漬の場合および３０分間浸漬の場合の双方において、ワクチン浸漬後の沖出し迄の日数は、１週間程度（厳密には４日以上であることが本発明者らによって確認されている）、若しくはそれ以上（〜２週間）空けることが、より高いワクチン効果（有効率が高い効果）を得る為には好ましいことが示された。
実験 III： ワクチン２回投与の検討
「材料と方法」
（１）供試魚 ： マダイ稚魚２４０尾（平均全長４．９ｃｍ，平均体重１．６ｇ）
（２）供試ワクチン（ＦＫＣ） ：
Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、７０％海水サイトファーガ寒天培地で、２５℃、４８時間培養し、１．５％ホルマリンＰＢＳで４℃，４８時間の条件で不活化した。尚、ＦＫＣは本発明にかかるワクチンである。
（３）飼育水槽 ： ５００Ｌ容パンライト水槽
（４）収容尾数 ： ６０尾ずつ
（５）ワクチン（ＦＫＣ）投与 ：
２０ｍｇ／ｍＬのＦＫＣ懸濁海水に３０分間浸漬させることにより行った。
ＦＫＣ投与（浸漬）は、２回投与（人為感染２週間前および１週間前の２回）、人為感染２週間前の１回投与、人為感染１週間前の１回投与の３通りで実施した（表３参照）。
（６）平均水温 ： ２０．０℃
（７）人為感染 ： Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、懸濁海水に３０尾ずつ２０分間浸漬することにより行った。
（８）浸漬濃度 ：
前記人為感染（７）において、Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株の浸漬濃度として、（１）１．６×１０７ＣＦＵ／ｍＬの場合と、（２）２．４×１０７ＣＦＵ／ｍＬの場合の２通りで実施した（表４参照）。
「材料と方法」
（１）供試魚 ： マダイ稚魚２４０尾（平均全長４．９ｃｍ，平均体重１．６ｇ）
（２）供試ワクチン（ＦＫＣ） ：
Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、７０％海水サイトファーガ寒天培地で、２５℃、４８時間培養し、１．５％ホルマリンＰＢＳで４℃，４８時間の条件で不活化した。尚、ＦＫＣは本発明にかかるワクチンである。
（３）飼育水槽 ： ５００Ｌ容パンライト水槽
（４）収容尾数 ： ６０尾ずつ
（５）ワクチン（ＦＫＣ）投与 ：
２０ｍｇ／ｍＬのＦＫＣ懸濁海水に３０分間浸漬させることにより行った。
ＦＫＣ投与（浸漬）は、２回投与（人為感染２週間前および１週間前の２回）、人為感染２週間前の１回投与、人為感染１週間前の１回投与の３通りで実施した（表３参照）。
（６）平均水温 ： ２０．０℃
（７）人為感染 ： Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、懸濁海水に３０尾ずつ２０分間浸漬することにより行った。
（８）浸漬濃度 ：
前記人為感染（７）において、Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株の浸漬濃度として、（１）１．６×１０７ＣＦＵ／ｍＬの場合と、（２）２．４×１０７ＣＦＵ／ｍＬの場合の２通りで実施した（表４参照）。
〔結果〕
１）図４は、Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、１．６×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度で浸漬させた場合におけるマダイの生存率（％）の推移を示したグラフであるが、人為感染２週間前から１週間置きにＦＫＣを２回投与したもの（前記表３における第１段目）について最も高い生存率（％）が認められ（８０，０％）、次いで、人為感染１週間前にＦＫＣを１回投与したもの（同第２段目）についても高い生存率（％）が認められた（６５，０％）。
２）図５は、Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、２．４×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度で浸漬させた場合におけるマダイの生存率（％）の推移を示したグラフであるが、人為感染２週間前から１週間置きにＦＫＣを２回投与したものについて最も高い生存率（％）が認められ（７４．１％）、次いで、人為感染１週間前および２週間前にＦＫＣを１回投与したもの（前記表３における第２及び３段目）についても高い生存率（％）が認められた（ともに５９．３％）。
３）以上より、本発明のワクチンを２回浸漬した方が、１回のみの浸漬と比して、高いワクチン効果（生存率％）を発揮することが示された（図６参照）。
１）図４は、Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、１．６×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度で浸漬させた場合におけるマダイの生存率（％）の推移を示したグラフであるが、人為感染２週間前から１週間置きにＦＫＣを２回投与したもの（前記表３における第１段目）について最も高い生存率（％）が認められ（８０，０％）、次いで、人為感染１週間前にＦＫＣを１回投与したもの（同第２段目）についても高い生存率（％）が認められた（６５，０％）。
２）図５は、Ｔｅｎａｃｉｂａｃｕｌｕｍ ｍａｒｉｔｉｍｕｍ Ｒ２株を、２．４×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度で浸漬させた場合におけるマダイの生存率（％）の推移を示したグラフであるが、人為感染２週間前から１週間置きにＦＫＣを２回投与したものについて最も高い生存率（％）が認められ（７４．１％）、次いで、人為感染１週間前および２週間前にＦＫＣを１回投与したもの（前記表３における第２及び３段目）についても高い生存率（％）が認められた（ともに５９．３％）。
３）以上より、本発明のワクチンを２回浸漬した方が、１回のみの浸漬と比して、高いワクチン効果（生存率％）を発揮することが示された（図６参照）。
〔まとめ〕
・ 実験II、実験IIIともにＦＫＣの効果が認められた。
・ 実験IIでは１５分浸漬区よりも３０分浸漬区で有効率が高い傾向が認められた。
・ ＦＫＣを投与してから３日後に攻撃した区では生残率が低かった。
・ 実験IIIでは１回投与区よりも２回投与区で有効率が高い傾向が認められた。
・ 実験II、実験IIIともにＦＫＣの効果が認められた。
・ 実験IIでは１５分浸漬区よりも３０分浸漬区で有効率が高い傾向が認められた。
・ ＦＫＣを投与してから３日後に攻撃した区では生残率が低かった。
・ 実験IIIでは１回投与区よりも２回投与区で有効率が高い傾向が認められた。
〔結論〕
マダイの滑走細菌症の防除に浸漬ワクチンが有効である。
浸漬時間は３０分以上行うのが好ましい。
ワクチンを投与してから少なくとも４日以上経てから沖出しすることが有効である。
ワクチンの充分な防御効果を得るためには沖出し前に水槽内で２回以上免疫することが望ましい。
マダイの滑走細菌症の防除に浸漬ワクチンが有効である。
浸漬時間は３０分以上行うのが好ましい。
ワクチンを投与してから少なくとも４日以上経てから沖出しすることが有効である。
ワクチンの充分な防御効果を得るためには沖出し前に水槽内で２回以上免疫することが望ましい。
Claims (10)
- テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を有効成分とする魚類滑走細菌症ワクチン。
- 浸漬ワクチンである請求項１記載の魚類滑走細菌症ワクチン。
- テナキバクラム マリティマムの菌株が、Ｒ２、ＳＭ３３２２ｃ、ＯＭ３５１０、ＭＣ９２１０からなる群より選択される何れか１つである請求項１又は２に記載の魚類滑走細菌症ワクチン。
- マダイの滑走細菌症に適応される請求項１乃至３何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチン。
- テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を含有する魚類滑走細菌症ワクチン組成物。
- 浸漬用のワクチン組成物である請求項５記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物。
- テナキバクラム マリティマムの菌株が、Ｒ２、ＳＭ３３２２ｃ、ＯＭ３５１０、ＭＣ９２１０からなる群より選択される何れか１つである請求項５又は６に記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物。
- マダイの滑走細菌症に適応される請求項５乃至７何れか記載の魚類滑走細菌症ワクチン組成物。
- テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分の有効量を浸漬法によって投与することを特徴とする魚類滑走細菌症の予防法。
- 沖出しの１〜２週間前に、テナキバクラム マリティマムの不活化菌体又はその成分を懸濁した溶液に２０分以上浸漬する請求項９に記載の魚類滑走細菌症の予防法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006258078A JP5240811B2 (ja) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | マダイ滑走細菌症ワクチン及びマダイ滑走細菌症ワクチン組成物並びにマダイ滑走細菌症の予防法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP2006258078A JP5240811B2 (ja) | 2006-09-22 | 2006-09-22 | マダイ滑走細菌症ワクチン及びマダイ滑走細菌症ワクチン組成物並びにマダイ滑走細菌症の予防法 |
Publications (2)
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