JPH09176043A - 魚類用のイリドウイルス感染症ワクチンと診断剤並びにこれ等の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】１９９０年以来，マダイ，スズキ，ブリ等の魚
類イリドウイルス感染症が養殖場で大規模に発生し，し
かも，患魚マダイでの斃死率は多いときには９０％にも
達し，その被害は稚魚から成魚にわたり広範囲で甚大な
ことが知られている．この感染症は今や養殖業とその関
連産業の経営に警鐘を鳴らしており，その予防法の確立
は急務である． 【解決手段】上記感染症の病原体ウイルスとその継代
株，該感染症の予防に有効なワクチン，簡便な確定診断
や早期診断に有用な診断剤，及びかかるウイルス抗原の
量産法並びに精製法を提供する．技術的には，魚類イリ
ドウイルス感染症の患魚から得られる新鮮分離ウイルス
を感受性宿主で継代し，取得した馴化株を使用すること
により，イリドウイルス抗原あるいはイリドウイルス由
来抗原を量産すると共に精製の後，かかる抗原を有効成
分として用いるワクチン及び診断剤を調製する．

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は，魚類，例えば，ス
ズキ目，フグ目，カレイ目等に属する魚，例えば，マダ
イ，チダイ，イシダイ，イシガキダイ，スズキ，ブリ，
カンパチ，ヒラマサ，シマアジ，トラフグ，キジハタ，
ヒラメ等での感染や発症が確認されているイリドウイル
ス感染症の病原体ウイルス，ワクチン，診断剤，該ウイ
ルス抗原の製法と精製法，基礎研究並びに臨床あるいは
応用研究用の試薬に関するものである．

【０００２】

【従来の技術】国際ウイルス分類委員会の第６回報告に
よれば，イリドウイルス科に属するウイルスは，直径１
３０−１７０ｎｍの正２０面体であり，その内部に線状
の２本鎖ＤＮＡを有し，エンベロープの有無は属により
異なり，現在，次の５属，宿主が昆虫のＩｒｉｄｏｖｉ
ｒｕｓとＣｈｌｏｒｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓ，カエルを宿
主とする Ｒａｎａｖｉｒｕｓ，ヒラメ，ブリ，マダ
イ，スズキ等の魚類に感染するＬｙｍｐｈｏｃｙｓｔｉ
ｖｉｒｕｓ，及びキンギョを宿主とする“ｇｏｌｄｆｉ
ｓｈ ｖｉｒｕｓ １−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ”に
大別されている（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １０，ｐ．９５−９
９，１９９５）．

【０００３】一方，本発明者らは，既知のイリドウイル
ス感染症とは症状が異なる病魚から新規なウイルスを発
見かつ分離すると共に，この感染症とその病原体ウイル
スに関し，分類学的には暫定的にイリドウイルス科の範
疇に入れ，世界で最初に種々の基礎研究を行った．以
下，これ等の研究の経緯の概要を記載する：１９９０年
の８〜９月にかけ，四国の複数の養殖場で養殖マダイに
原因不明の大量斃死が発生したので，発明者らは，いち
早く，かかる自然発病魚の外部観察，剖検，生検，電子
顕微鏡による形態観察，ウイルス分離等を行い，得られ
た知見に基づき，この感染症の病原体が未報告の新しい
イリドウイルスであることを報告した（魚病研究，第２
７巻（２号），ｐ．１９−２７，１９９２）．更に，こ
のイリドウイルスの培養を試み，生物学的及び物理化学
的な性状に関するウイルス学的解析を行った（魚病研
究，第２９巻（１号），ｐ．２９−３３，１９９４）．
また，該ウイルスに対するモノクローナル抗体の作製に
成功すると共に，それを用いる免疫学的診断法を開拓し
た（魚病研究，第３０巻（１号），ｐ．４７−５１，１
９９５）．なお，この発明でいうイリドウイルスとは，
前述の国際ウイルス分類委員会の第６回報告に基づく既
知のイリドウイルスではなく，本発明者らが発見かつ分
離した上記の新規なイリドウイルスを意味する．また，
この発明でいうイリドウイルス感染症とは，該ウイルス
の感染により生じる魚病を意味する．かかる感染症の特
徴は極めて高い斃死率にあり，病魚の外観の特徴は，体
色の黒化や褪色，体表や鯛の出血性のスレ，部分的な立
鱗，眼球の軽い突出や出血等である．剖検と生検の所
見，病理学的観察，ウイルス学的性状及び免疫学的特徴
は前記３報（魚病研究）に詳述されている．

【０００４】本願発明のイリドウイルスに関する技術と
しては，モノクローナル抗体とそれを製造するためのハ
イブリドーマ（特開平６−１５３９７９号），ＰＣＲ
（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ）用のオリゴヌクレオチドプライマー（特開平６−１
６５６７７号）等が知られている．

【０００５】しかし，かかるイリドウイルスの継代や大
量培養は容易ではなく，その抗原の量産や精製法は現在
なお未確立の状態にあり，該ウイルス抗原を用いるワク
チンや診断剤等の開発や提供は，知られておらず，待望
されている．

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】この発明に係るイリド
ウイルス感染症は１９９０年，四国地域での初発以来，
特に，西日本各地のマダイ養殖場で大規模な発生が見ら
れるようになり，しかも，稚魚だけではなく育成魚や親
魚に至るまで発生している．更に，その斃死率はマダイ
で多い時には９０％にも達し，被害は，稚魚から成魚に
わたり，広範囲で甚大なことが知られている．その上，
感染や発症は，マダイのみならず，チダイ，イシダイ，
イシガキダイ，スズキ，ブリ，カンパチ，ヒラマサ，シ
マアジ，トラフグ，キジハタ，ヒラメ等が属するスズキ
目，フグ目，カレイ目等におよぶ魚類で広く確認されて
いる．このように，イリドウイルス感染症は，今や養殖
業とその関連産業での需要と供給及び経営に警鐘を鳴ら
している．

【０００７】

【課題を解決するための手段】この発明は，イリドウイ
ルス感染症の病原体ウイルスとその継代株，かかる感染
症の予防に有効なワクチン，また，簡便な早期診断や確
定診断に有用な診断剤，イリドウイルス抗原の製法と精
製法，更に，基礎研究並びに臨床あるいは応用研究で重
宝な試薬を提供することにより，前記課題を解決するも
のである．

【０００８】

【発明の実施の形態】

（１）ウイルス分離の材料：病原体ウイルスは，イリド
ウイルスの感染により発症又は死亡した魚類，例えば，
スズキ目，フグ目，カレイ目等に属する魚，例えば，マ
ダイ，チダイ，イシダイ，イシガキダイ，スズキ，ブ
リ，カンパチ，ヒラマサ，シマアジ，トラフグ，キジハ
タ，ヒラメ等から切除又は摘出した器官から分離でき
る．かかる器官としては，例えば，脾臓，心臓，腎臓，
鰓，肝臓等を用いることができる．これ等のウイルス分
離材料は，例えば，眼科用鋏で細切れにし，これに常用
の塩類溶液や培地等，例えば，後述のリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ）やＭＥＭ培地を添加してホモジナイザーで磨砕
し，約５−３０％（Ｗ／Ｗ）組織乳剤を調製の後，低速
遠心し，その上清又は沈渣組織の再浮遊液をウイルス分
離材料として下記の宿主に接種して用いる．なお，かか
る材料は，膜濾過法により除菌できるし，抗生物質を添
加できる．

【０００９】（２）ウイルスの増幅・分離・継代・馴化
・量産のための宿主：病原体ウイルスの増殖が可能な該
ウイルス感受性の宿主を選択して使用できる．魚体内を
宿主として用いる場合には，スズキ目，フグ目，カレイ
目等に属する魚，例えば，マダイ，チダイ，イシダイ，
イシガキダイ，スズキ，ブリ，カンパチ，ヒラマサ，シ
マアジ，トラフグ，キジハタ，ヒラメ等が例示できる．
ウイルス分離材料は，かかる宿主の腹腔内，皮下，又は
筋肉内に接種する．また，種々の細胞培養を宿主として
用いる場合には，例えば，ＢＦ−２，ＦＨＭ，ＣＨＳＥ
−２１４，ＪＳＫＧ，ＫＲＥ−３，ＲＴＧ−２，ＹＴ
Ｆ，ＧＦ等の公知の細胞株を挙げることができる．但
し，これ等の細胞培養にのみ限定されるものではなく，
該ウイルス感受性の宿主である限り，種々の初代あるい
はその継代細胞培養，株化細胞等を採用できる．また，
ウイルスの増幅・継代・馴化において使用できる感受性
宿主は，同一の宿主に限定されず，ウイルスの増幅・継
代・馴化の途中で，ウイルス増殖の可否に基づき宿主を
変更できる．即ち，１種以上の宿主を組合わせて使用で
きる．

【００１０】（３）ウイルス培養と細胞培養のための培
地と塩類溶液：これには公知や市販のもの，例えば，１
９９培地，ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ´ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地，ＢＭＥ（Ｅ
ａｇｌｅ´ｓ ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍ）培地，Ｈａｎ
ｋｓ液，Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等
を使用できる．これ等の組成と調製法は，ウイルス実
験，細胞培養，組織培養等に関する常用テキスト，例え
ば，「組織培養の技術」（日本組織培養学会編，朝倉書
店１９８２年発行）や市販製品カタログ等に詳述されて
いる．また，かかる培地や塩類溶液は，添加剤を添加混
合し修飾できる．添加剤としては，常用の物質，例え
ば，市販のヒト血清，ウシ胎児血清ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ
ＣａｌｆＳｅｒｕｍ），抗生物質，炭酸水素ナトリウ
ム溶液，塩化ナトリウム，非必須アミノ酸［大日本製薬
（株）製］等から適宜選択し，適量使用できる．例え
ば，培地１Ｌ当たりに添加混合するこれ等の最終濃度
は，血清類は約３−２５％（Ｖ／Ｖ），炭酸水素ナトリ
ウムは約１−６ｇ，塩化ナトリウムは約０．１−０．２
５モル，また，非必須アミノ酸は製品カタログに記載の
標準量が望ましい．

【００１１】（４）ウイルス培養の温度と時間：培養温
度は，水温，又は約１０−３７℃，好ましくは約２０−
３０℃であり，培養日数は約２−２１日，望ましくは約
４−１６日である．

【００１２】（５）病原体ウイルス分離と新鮮分離株：
前記（２）の分離材料と宿主を用い，ウイルスを増幅す
ることにより新鮮分離株を得ることができる．なお，分
離の確率を高めるには，分離材料として感染死亡マダイ
の脾臓，宿主としてマダイ稚魚を用いる腹腔内接種が望
ましい．なお，ウイルス分離の際にウイルスを増幅する
ための継代回数は通常，約１−１０回，望ましくは約１
−５回である．なお，分離した病原体ウイルスを確定す
るために，分離操作と並行して病原体ウイルスの同定を
行う必要がある．かかる同定には，分離材料器官の検
定，例えば，器官切片やスタンプ標本のフォイルゲン反
応による核酸染色やアルコール固定下でギムザ染色した
組織細胞の光学顕微鏡観察，器官切片及び新鮮分離株ウ
イルスの電子顕微鏡による形態観察，更に，宿主魚類，
例えば，マダイ稚魚への新鮮分離株ウイルスの感染実験
等を組み合わせて採用できる．

【００１３】（６）新鮮分離株の継代による馴化とワク
チン製造用ウイルス株の確立：新鮮分離株を，前記
（２）のウイルス感受性の魚体内や細胞培養からなる宿
主群から選ばれる１種以上の宿主に約１代以上，好まし
くは約５代以上継代し，かかる宿主に馴化させることに
より，ワクチン製造用ウイルス株を確立できる．なお，
ウイルス抗原の量産，及びウイルスの収量と抗原性の安
定化の確保を目的とした宿主への馴化の総継代数は約１
−１００代，好ましくは約５−３０代である．また，抗
原製造用の宿主は，免疫学的観点から，魚類由来細胞が
望ましい．例えば，マダイ稚魚に３代継代した後，更に
魚類由来のＧＦ細胞に１０代継代したイリドウイルスＥ
ｈｉｍｅ−１株は，ウイルス抗原製造用ウイルス株，即
ち，製造用シードとして適当である．なお，かかる製造
用ウイルス株の確立には，ウイルス抗原の量産収率と品
質を高め，これ等の安定化と製造コストの低減を図るた
めに，ウイルス培養の宿主の選択，ウイルス継代法の工
夫，ウイルス培養の諸条件設定等を行う必要がある．例
えば，製造用宿主としてのＧＦ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
５８）やＢＦ−２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９１）等へ
のウイルスの馴化，ウイルスやその感染細胞を細胞培養
モノシートに接種し培養する継代，未感染細胞浮遊液に
ウイルスを接種し同時培養する継代，感染細胞と未感染
細胞との混合培養による継代，持続感染細胞の継代，超
音波や凍結融解処理による感染細胞の破砕液を細胞培養
モノシートに接種し培養する継代，ウイルス又はその感
染細胞のシードとしての使用，感染多重度（ＭＯＩ）に
基づくウイルス培養日数の概算，この発明に係るウイル
ス感染細胞はラウンディングを呈するので，かかる細胞
変性効果（ＣＰＥ）の細胞モノシートでの広がりの程
度，約５０−９０％を指標としたウイルスとその感染細
胞の採取等を行うことができる．

【００１４】（７）ワクチン用抗原の調製：ワクチン製
造用ウイルス株を馴化させた宿主を用いて該ウイルスを
培養し，ワクチン用の抗原あるいは有効成分を量産す
る．宿主に魚生体を用いた場合には，ウイルス増殖の器
官，例えば，感染稚魚マダイの脾臓の約５−３０％（Ｗ
／Ｗ）組織乳剤を前記（１）の方法で調製し，かかる組
織乳剤そのもの，それを低速遠心した上清，その沈渣組
織の再度浮遊液等をワクチン原液として用いることがで
きる．宿主に細胞培養を用いた場合には，例えば，ウイ
ルス培養液を低速遠心した上清，感染細胞画分を採取し
超音波処理した破壊細胞懸濁液，ドライアイスと有機溶
媒で凍結融解したウイルスとその感染細胞の浮遊液，か
かる浮遊液を低速遠心した上清，その沈渣細胞の再浮遊
液等をワクチン原液として用いることができる．なお，
かかるワクチン原液は，膜濾過法により除菌できるし，
抗生物質も添加できる．また，これ等のワクチン原液中
のウイルス抗原は，蔗糖クッションを用いる超遠心法に
より濃縮かつ精製できる．例えば，蔗糖濃度４０％（Ｗ
／Ｖ）の蔗糖溶液層をクッションとして，その上にワク
チン原液を重層し，超遠心にかけ，ウイルス抗原を遠心
管底に沈降させた後，その沈降物を再浮遊液して精製ウ
イルス抗原を調製できる．この発明において採用できる
蔗糖濃度は約１５−５５％（Ｗ／Ｖ）の範囲にあり，遠
心条件は約５万−１０万Ｇで，約３０−１５０分であ
る．更にまた，ワクチン用抗原として，完全ウイルス粒
子であるビリオン，不完全ウイルス粒子，ビリオン構成
成分とその翻訳後修飾体，ビリオン非構造タンパクとそ
の翻訳後修飾体，感染防御抗原，中和反応のエピトープ
等を使用できる．かかるワクチン用抗原は常用の不活化
剤で固定化することにより立体構造を安定化できる．特
にビリオンは，不活化剤でその感染能を失活させ，不活
化抗原として使用することが望ましい．不活化剤として
は，例えば，ホルマリン，グルタルジアルデヒド，β−
プロピオラクトン等をワクチン原液の調製の前又は後に
添加して用いることができる．ホルマリンを使用の場
合，その添加量は約０．０００４−０．７％（Ｖ／
Ｖ），不活化温度は約２−３０℃，不活化時間は，約５
−１８０日である．但し，不活化により抗原性が損なわ
れる場合には，不活化条件を緩和するための創意工夫を
要する．かかる緩和は，例えば，不活化剤の減量，中性
アミノ酸や塩基性アミノ酸等の添加，不活化温度の低下
等により達成できる．また，不活化工程で残存する遊離
ホルムアルデヒドは，必要なら，等量の亜硫酸水素ナト
リウムを添加してこれを中和するか，透析により除去で
きる．

【００１５】（８）ワクチンの調製：例えば，ワクチン
用抗原の量が，感染ウイルス量ＴＣＩＤ_５０（Ｍｅｄｉ
ａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｆｅｃｔｉ
ｖｅＤｏｓｅ）の対数値ｌｏｇ（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）
に換算して約４−９になるよう塩類溶液や培地等，例え
ば，培地ＢＭＥでワクチン原液を希釈する．即ち，かか
る希釈により，ワクチン中の抗原量が抗体産生に必要な
量になるよう調整する．更にその際，ワクチンの耐熱性
を増強する安定化剤や，免疫原性を高める補助剤として
のアジュバントを添加混合できる．例えば，安定化剤と
して，糖類やアミノ酸類，また，アジュバントとして，
鉱物油，植物油，ミョウバン，リン酸アルミニウム，ベ
ントナイト，シリカ，ムラミルジペプチド誘導体，サイ
モシン，インターロイキン等を利用できる．次いで，適
当な容積，例えば，約１０−５００ｍｌ容のバイアルに
分注し，密栓・密封の後，ワクチンとして使用に供す
る．かかるワクチンは，液状のみならず，分注後に凍結
乾燥を行うことにより，乾燥製剤として使用に供するこ
とができる．なお，調製したワクチン製剤は，使用に供
する前に，その品質を保証するため，安全性と有効性に
関する検定を行う必要がある．かかる検定は，この発明
に係るワクチンと類似の既存製剤，例えば，薬事法（昭
和３５年法律第１４５号）に基づく「動物用生物学的製
剤基準」に定める「日本脳炎不活化ワクチン」，「狂犬
病組織培養不活化ワクチン」等の規程に準拠して行うこ
とができる．

【００１６】（９）ワクチンの用法：感染の危険性があ
る任意の年齢の魚類に使用できる．但し，養魚保全の観
点から，幼魚ないしは稚魚への使用が望ましい．使用法
として，例えば，腹腔内，皮下，又は筋肉内接種，浸漬
法，経口投与等が可能である．接種の場合，前記（７）
の抗原量を，１ドーズ約０．０５−１．０ｍｌ使用が望
ましく，浸漬による免疫には飼育水又は低張飼育水でワ
クチンを約１０−１００倍に希釈して用いることができ
る．ワクチンは，凍結しない冷温，例えば，約２−８℃
の冷暗所で保存する．

【００１７】（１０）診断剤の調製：前記（６）の要領
で，ウイルス浮遊液，精製抗原等を調製し，これ等を診
断用抗原，例えば，沈降反応，凝集反応，中和反応，蛍
光抗体法，酵素免疫測定法，ラジオイムノアッセイ等の
抗原として使用できる．更に，診断用抗原やワクチン原
液を動物，例えば，ウサギ，モルモット，マウス等の腹
腔内，皮下や筋肉内に接種し，抗体産生させたこれ等の
動物の血清から抗体を作製できる．かかる抗体は，例え
ば，上記の各種診断法での抗原の検出に使用できる．な
お，この発明に係る診断用の抗原や抗体は，これ等の診
断剤中の含量が，抗原抗体反応を生じるに必要な量とな
るよう希釈調整し，使用に供する．

【００１８】前述のワクチンは，魚類のイリドウイルス
感染症の免疫ないしは予防に極めて有効である．また，
前記ウイルス抗原，及びかかる抗原を用いて作製された
抗体は，種々の免疫学的診断において，特異的かつ高感
度に抗原抗体反応すると共に，確定診断のための診断剤
として有用である．

【００１９】以下，この発明の態様並びに構成と効果
を，実験例及び実施例を示し，具体的に説明する．但
し，本発明は，これ等に限定されるものではない．

【００２０】

【実験例１】 病原体ウイルスの分離材料：マダイイリドウイルス感染
死亡魚の脾臓を摘出し，これを眼科用鋏で細切れにした
後，９倍容のＢＭＥ培地（最終濃度３００単位／ｍｌの
ぺニシリンと３００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンと
を添加混合）を添加し，氷冷下で滅菌ガラスホモジナイ
ザーにより磨砕し，１０％（Ｗ／Ｗ）の脾臓乳剤を調製
する．次いで，これを低速遠心（３，０００ｒｐｍ，２
０分）し，その上清を採取の後，濾孔が４５０ｎｍのメ
ンブランフィルターで除菌濾過し，その濾液を病原体ウ
イルスの分離材料として爾後の使用に供する．

【００２１】

【実験例２】 魚生体内による病原体ウイルスの分離と継代：実験例１
で調製した濾液をマダイ稚魚１０尾（平均体長４．０ｃ
ｍ，平均体重１．５ｇ）の腹腔内に各魚０．１ｍｌずつ
接種した後，水温２５±１℃の隔離した飼育水槽（内容
積６０Ｌの水槽に海水４０Ｌを入れ，これに新鮮海水を
２Ｌ／ｍｉｎ流入かつ旧水を等量排出し飼育海水を連続
交換する）で飼育し，発症の有無を観察する．飼育開始
後，早ければ３日目に発症魚が出現し始める．各発症魚
は死亡の直前にその都度回収し，実験例１に記載の方法
と同様にして脾臓乳剤の上清を調製し，これを新鮮分離
株ウイルス浮遊液として爾後の継代に供する．マダイ生
体内での新鮮分離株ウイルスの継代は，かかる操作を繰
り返し行う．

【００２２】

【実験例３】 細胞培養による病原体ウイルスの分離と継代：２５ｃｍ
^２のプラスチック瓶５本に培養したＧＦ細胞の各瓶に，
実験例１で調製した濾液を０．５ｍｌずつ接種し，２５
℃で３０分間吸着させた後，培地ＢＭＥ（最終濃度１５
％（Ｖ／Ｖ）のウシ胎児血清，標準量の非必須アミノ
酸，１．２ｍｇ／ｍｌの炭酸水素ナトリウム，１００単
位／ｍｌのぺニシリン，及び１００μｇ／ｍｌのストレ
プトマイシンを添加混合）を各瓶１０ｍｌずつ添加し．
２５℃で静置培養する．新鮮培地との交換は接種日から
３日目ごとに行う．細胞培養の状態の判定と，病原体ウ
イルス感染の指標となる細胞変性効果の有無を検出する
ための鏡検は毎日行う．培養開始後，１４日目までに細
胞変性効果，即ち，細胞のラウンディングが細胞モノシ
ートの約７０％の領域に広がる．この時点で，各培養瓶
ごとに培地を採取し，新鮮分離株ウイルスの浮遊液とし
て爾後の継代に供する．同時に，感染細胞モノシート
は，常法のＥＤＴＡ・トリプシン液（ＣａとＭｇの両イ
オンを除いたＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳに最終濃度０．
０８％（Ｗ／Ｖ）ＥＤＴＡ ３Ｎａと０．１２５％（Ｗ
／Ｖ）トリプシンとを添加混合）で培養瓶ごとに剥離
し，低速遠心してその沈渣を回収の後，これを上記の培
地ＢＭＥ２ｍｌに再浮遊し，新鮮分離株ウイルスの感染
細胞として爾後の継代に供する．細胞培養による新鮮分
離株ウイルスの継代は，ウイルス浮遊液とその感染細胞
の両者を用い，次の通り行う：ＧＦ細胞モノシートへ両
者をそれぞれ接種し培養する；未感染ＧＦ細胞浮遊液に
ウイルス浮遊液を接種し同時培養する；２０万細胞／ｍ
ｌの未感染ＧＦ細胞浮遊液にその１／１０容の感染細胞
を接種し混合培養する；及び感染細胞浮遊液を調製しこ
れを前記の新鮮培地ＢＭＥで５倍希釈し培養する持続感
染細胞培養により行う．

【００２３】

【実験例４】 新鮮分離株ウイルスの同定：実験例１で用いた死亡魚，
実験例２で得た発症魚の各脾臓切片及び各スタンプ標本
をそれぞれ，フォイルゲン反応により核酸染色し，異形
肥大細胞の存在と，細胞質部分の赤紫色染色を光学顕微
鏡で鏡検し確認した．また，電子顕微鏡により，実験例
１で用いた死亡魚及び実験例２で得た発症魚の各脾臓中
に存在するウイルスと，新鮮分離株ウイルスとの間のウ
イルス形態が同一であることを確認した．更に，実験例
２に記載の方法により感染実験を行う．即ち，実験例２
と３で得た新鮮分離株ウイルス浮遊液を，マダイ稚魚１
０尾腹腔内に各魚０．１ｍｌずつ接種し，発症魚の症状
を観察すると共に，剖検及び病理組織学的検査を行い，
新鮮分離株ウイルス接種によるマダイ稚魚の発症がイリ
ドウイルス感染症であることを確認した．

【００２４】

【実験例５】 ウイルス感染価の測定：実験例１で用いた培地ＢＭＥを
用い，１Ｌ容のルー瓶で培養したＧＦ細胞モノシートを
ＥＤＴＡ・トリプシン液で剥離の後，低速遠心により細
胞を採取し，同培地で２０万細胞／ｍｌの細胞浮遊液を
調製し，これを２４穴マイクロプレートの各穴に１．０
ｍｌずつ滴下分注する．次いで，同培地で１０倍階段希
釈したウイルス液０．１ｍｌを各穴に接種する．なお，
１列６穴には同一希釈のウイルス液を接種し，２５℃の
炭酸ガス保温器内で１４日間培養の後，ＣＰＥを判定の
指標として，常法によりウイルス感染価，ＴＩＣＤ_５０
／ｍｌを実測し，その結果を対数値，ｌｏｇ（ＴＩＣＤ
_５０／ｍｌ）に換算する．また，感染細胞は，アイスバ
ス中で感染細胞浮遊液２０ｍｌ当たり２分間，超音波発
生装置（ＫＵＢＯＴＡ ２００Ｍ）にかけ，細胞を破砕
懸濁し，その低速遠心（３，０００ｒｐｍ，２０分）上
清をウイルス液としてウイルス感染価を測定する．

【００２５】

【実施例１】 ワクチン用抗原の製造株の確立：実験例１で得た分離材
料から分離したウイルスをイリドウイルスＥｈｉｍｅ−
１株と命名すると共に，実験例２に記載の方法でマダイ
稚魚に３代継代した後，更に，実験例３に記載の方法に
よりＧＦ細胞で継代を重ね馴化させる．かかる継代によ
りＧＦ細胞に馴化したＥｈｉｍｅ−１株を抗原製造用株
として後述の実施例で使用する．なお，実験例３で行っ
た種々の培養法による継代のうち，これ等の代表例とし
て，マダイ稚魚体内と持続感染細胞培養との組合せ継代
による結果を表１に示す．ウイルス分離材料をウイルス
感受性の宿主で継代することにより，ウイルス抗原は増
幅・量産された．

【００２６】

【実施例２】 ワクチン用抗原の量産：実施例１で得たＥｈｉｍｅ−１
株（マダイ稚魚３代・ＧＦ細胞１０代継代）の感染細胞
をシードに用いてワクチンを調製する．先ず，実験例１
で用いた培地ＢＭＥを用い，１Ｌ容のルー瓶１本に培養
した上記Ｅｈｉｍｅ−１株の感染ＧＦ細胞モノシートを
ＥＤＴＡ・トリプシン液で剥離の後，低速遠心（３，０
００ｒｐｍ，２０分）により感染細胞を回収し，５００
ｍｌの同培地ＢＭＥに再浮遊し，感染細胞浮遊液を調製
する．次いで，これを１Ｌ容のルー瓶５本に１００ｍｌ
ずつに分注の後，２５℃で１４日間，静置培養する．新
鮮培地との交換は，培養開始日から３日目ごとに行う．
但し，培養１０−１４日目の間は培地交換をしない．Ｃ
ＰＥが細胞モノシートの約８０％に達する１４日目に培
養液を採取し，低速遠心（３，０００ｒｐｍ，２０分）
の後，その上清を回収しウイルス浮遊液５００ｍｌを調
製した．一方，感染細胞モノシートはＥＤＴＡ・トリプ
シン液で剥離した後，低速遠心（３，０００ｒｐｍ，２
０分）により採取し，ルー瓶５本からプールした細胞を
上記の培地２００ｍｌに再浮遊させ，感染細胞浮遊液を
得た．

【００２７】ワクチン用抗原量の測定：ウイルス浮遊液
と感染細胞浮遊液について，実験例４に記載の方法で両
者の感染価，ｌｏｇ（ＴＩＣＤ_５０／ｍｌ）を測定す
る．その結果，ウイルス浮遊液は６．６，感染細胞浮遊
液は６．２であった．

【００２８】ウイルス不活化と不活化ワクチン原液の調
製：ウイルス浮遊液３００ｍｌと感染細胞浮遊液１８０
ｍｌの各液にホルマリンを最終濃度が０．０３％（Ｖ／
Ｖ）になるよう添加混合し，４℃で３０日間，不活化す
る．不活化終了後，それぞれ，不活化ウイルスワクチン
原液及び不活化感染細胞ワクチン原液として４℃の冷暗
室で保存した．

【００２９】不活化ワクチン原液の検定：ウイルス浮遊
液と感染細胞浮遊液から調製した各不活化ワクチン原液
を１００ｍｌずつ分取し，薬事法（昭和３５年法律第１
４５号）に基づく「動物用生物学的製剤基準」に定める
「狂犬病組織培養不活化ワクチン」の規程に準拠し，不
活化試験，染色試験，異常毒性否定試験，蛋白窒素定量
試験，及び無菌試験を行う．その結果，及び後述する安
全性と有効性に関する実施例３の結果を併せ，両不活化
ワクチン原液は，いずれも，組織培養不活化ワクチン原
液として適格であることが確認された．

【００３０】不活化ワクチンの調製：不活化ウイルスワ
クチン原液５０ｍｌ及び不活化感染細胞ワクチン原液５
０ｍｌをそれぞれ，培地ＢＭＥで１０倍希釈した後，２
０ｍｌ容のバイアルに１０ｍｌずつ分注し．密栓・秘封
の後，不活化ウイルスワクチン及び不活化感染細胞ワク
チンとして使用に供する．

【００３１】

【実施例３】 不活化ワクチンの安全性と有効性：実施例２で調製した
各不活化ワクチンの安全性と有効性とを確認するため，
マダイ稚魚を用いて臨床試験を行う．なお，ウイルスを
接種しない細胞培養の培地上清と非感染細胞浮遊液につ
いて，ワクチン製造と並行して同一の処理を行い，不活
化非感染上清と不活化非感染細胞浮遊液とを調製し，こ
れ等を比較対照検体として使用する．合計１５０尾の健
常なマダイ稚魚（体長４．０−８．０ｃｍ，体重１．５
−１１．５ｇ）を１群３０尾からなる５群に分け，１検
体に１群を用い，各ワクチン又は各比較対照検体を，稚
魚の腹腔内に０．１ｍｌ／尾，接種する．なお，残りの
１群には何も接種しない．これ等の稚魚は，実験例２に
記載の飼育水槽内で，各群３０尾につき１飼育水槽を使
用し，飼育観察する．接種日から１０日目に，各稚魚の
腹腔内にＥｈｉｍｅ−１株の強毒ウイルス浮遊液を０．
１ｍｌずつ接種し，直接攻撃を行う．攻撃ウイルス量ｌ
ｏｇ（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）は，５．０で実施する．か
かる攻撃の後，更に，１４日間，上記水槽内の発症魚と
その生死の有無を飼育観察する．その結果を示す表２に
見られる通り，本発明に係るワクチンは安全かつ有効で
あった．

【００３２】

【実施例４】 不活化ワクチンの試作とその安全性及び有効性の確認：
実施例１で得たＥｈｉｍｅ−１株（マダイ稚魚３代・Ｇ
Ｆ細胞１３代継代）の感染細胞をシードとして用い，実
施例２の記載と同様にして不活化ワクチンを製造する．
即ち，ウイルスをＧＦ細胞で培養の後，培養液を低速遠
心してその培養上清を採取し，５Ｌのウイルス浮遊液
（ウイルス感染価は７．５ｌｏｇＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）
を製造する．次に，該浮遊液に最終濃度０．１％（Ｖ／
Ｖ）になるようホルマリンを添加混合の後，４℃で３０
日間静置して不活化し，ワクチン原液を得る．この原液
について検定に係る各種試験を行い，組織培養不活化ワ
クチンとしての適格性を確認の後，これを培地ＢＭＥで
１０倍希釈し，２００ｍｌ容のバイアルに１００ｍｌず
つ分注し，密栓・密封し小分製品４００本を製造した．
これより無作為抜取りした小分製品２０本について，更
に，薬事法（昭和３５年法律第１４５号）に基づく「動
物用生物学的製剤基準」に定める「狂犬病組織培養不活
化ワクチン」の規程に準拠し，小分製品に係る各種試
験，即ち，特性試験，水素イオン濃度試験，無菌試験，
染色試験，蛋白窒素定量試験，異常毒性否定試験を行
い，組織培養不活化ワクチン小分製品としての適格性を
確認した後，残りの小分製品を下記の安全性と有効性の
両確認試験に供した．

【００３３】安全性と有効性の両確認試験は，実施例３
の記載と同様にして行う．即ち，健常なマダイ稚魚（体
長７．５−８．０ｃｍ，体重９．３−１０．０ｇ）を１
群２５尾からなる６群に分け，無作為抜取りした小分製
品４本（各バイアルにＡ，Ｂ，Ｃ及びＤと符号付けす
る）の各バイアルごとに１群，合計４群，また，比較対
照（非感染ＧＦ細胞の不活化培養液上清）に１群を使用
し，稚魚の腹腔内に０．１ｍｌ／尾，接種する．なお，
残りの１群には何も接種しない．各群２５尾につき１水
槽を使用して飼育観察し，ワクチン接種１０日目に，実
施例３の記載と同様にして，バイアルＢとＤワクチン接
種群を除く全ての群に直接攻撃し，更に，１４日間，水
槽内の発症魚とその生死の有無を飼育観察する．その確
認試験の結果を表３に示す．本発明に係るワクチンは，
不活化ワクチンとしての品質が適格であると共に，安全
かつ有効であった．

【００３４】

【実施例５】 診断用抗原の調製：実施例２の記載と同様にして，ウイ
ルス浮遊液を調製の後，ホルマリンで不活化し，不活化
ウイルス浮遊液を得る．次いで，超遠心管（日立製作
（株）製：機種ＳＣＰ７０ＨのスウィングロータＳＲＰ
２８ＳＡ用）６本の各底部に９．０ｍｌずつ４０％（Ｗ
／Ｖ）蔗糖溶液を入れ，蔗糖クッション層を形成させ，
該蔗糖層の上に静かに不活化ウイルス浮遊液２５ｍｌを
重層し，４℃にて超遠心（９０，０００ｇ，９０分）す
る．各遠心管底に沈降したウイルス粒子をそれぞれ，５
ｍｌのＰＢＳに浮遊し，これ等をプールして，３０ｍｌ
の精製ウイルス抗原液を得た． 受身凝集反応用試薬の調製：洗浄したヒツジ赤血球０．
４ｍｌを１０ｍｌのＰＢＳに浮遊させ，これに上記の抗
原液１．０ｍｌを加えて軽く撹拌の後，ＰＢＳで希釈調
整した濃度２．５％（Ｗ／Ｖ）グルタルジアルデヒド
３．０ｍｌを滴下し十分に混和する．これを室温で６０
分間更に撹拌し，赤血球に抗原を吸着させる．次に，Ｐ
ＢＳで５回洗浄後，１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ７．２）
１．０ｍｌに浮遊させ，８℃で１夜置き，再びＰＢＳで
５回洗浄の後，最終濃度１％（Ｖ／Ｖ）の正常ヒツジ血
清を含有のＰＢＳを添加して，１％（Ｖ／Ｖ）抗原吸着
赤血球浮遊液を調製し，これを受身凝集反応用試薬とし
た． 受身凝集反応によるイリドウイルス抗体の測定：上記の
受身凝集反応用試薬を用い，２倍階段希釈のマイクロタ
イター法により，イリドウイルス感染症魚５尾から採血
した各検体血清，及び健常魚２尾の各血清の抗体価を測
定する．その結果を表３に示す．この発明の診断用抗原
は，極めて特異的な凝集反応を呈し，抗体価の測定によ
る簡便な確定診断を可能にした．

【００３５】

【発明の効果】この発明は以上の説明のように構成され
作用するので，その効果は次の通りである：魚類イリド
ウイルス感染症のワクチンによる予防のみならず，該ウ
イルス抗原を用いる診断剤による簡便な確定診断や早期
診断をも可能にする．更に，この発明が提供する特定宿
主に継代馴化したイリドウイルスとその抗原，及びかか
る抗原を用いて作製される抗体は，魚類イリドウイルス
感染症の基礎研究並びに臨床あるいは応用研究での重宝
な試薬ないしは材料として極めて有用であり，かかる研
究の進展に多大に寄与する．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 前野 幸男 三重県度会郡南勢町中津浜浦422−１ 農 林水産省水産庁 養殖研究所内 (72)発明者 乾 靖夫 三重県度会郡南勢町中津浜浦422−１ 農 林水産省水産庁 養殖研究所内 (72)発明者 真鍋 貞夫 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内 (72)発明者 三宅 信一 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内 (72)発明者 加地 千恵 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内 (72)発明者 横山 憲一 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内 (72)発明者 小野 耕一 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内 (72)発明者 今川 忠 香川県観音寺市八幡町２丁目９番41号 財 団法人阪大微生物病研究会 観音寺研究所 内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イリドウイルス感染症の病魚から分離し
   たウイルスを該ウイルス感受性の魚体内又は細胞培養か
   らなる宿主群から選ばれる１種以上の宿主に継代するこ
   とにより得られるイリドウイルス．
2. 【請求項２】 請求項１記載のイリドウイルスを該ウイ
   ルス感受性の魚体内又は細胞培養内で増殖させることに
   より生産される抗原．
3. 【請求項３】 請求項２記載の抗原を不活化剤で不活化
   することにより調製される不活化抗原．
4. 【請求項４】 請求項２又は請求項３記載の抗原を抗体
   産生又は感染防御を奏する量，含有するイリドウイルス
   感染症ワクチン．
5. 【請求項５】 請求項２又は請求項３記載の抗原を抗原
   抗体反応を呈する量，含有するイリドウイルス感染症診
   断剤．
6. 【請求項６】 蔗糖濃度が１５％（Ｗ／Ｖ）以上５５％
   （Ｗ／Ｖ）以下の単一濃度の蔗糖溶液層にイリドウイル
   ス浮遊液を重層し超遠心することを特徴とするイリドウ
   イルス抗原の精製法．