CN102803516A - 病毒试验 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测病毒的试验，特别是用于检测在组织样品中病毒复制的试验。本发明也涉及测定动物对于病毒的敏感性的方法，和繁殖具有对于病毒的敏感性下降的动物的方法。

Description

病毒试验

技术领域

本发明涉及用于检测病毒的试验，特别是用于检测在组织样品中病毒复制的试验。本发明也涉及测定动物对于病毒的敏感性的方法，以及繁殖对于病毒的敏感性下降的动物的方法。

技术背景

在人类和动物中，病毒感染仍然是具有不利的经济影响和社会影响的重要的健康问题。例如，许多病毒病原体在经济学上重要的家畜动物如鸡、猪、鱼、羊和牛中引起疾病。家畜动物的病毒疾病包括出现在鸡中的禽流感、新城疫病、鸡贫血和鸡传染性法氏囊病，偶蹄类动物中的口蹄疫，猪类中的猪生殖和呼吸综合症（PRRS）和猪瘟，羊中的蓝舌病和赤羽病，和鱼类中的传染性的鲑鱼贫血、传染性造血坏死病毒病（IHNV）、病毒出血性败血病和传染性胰脏坏死病。

保护动物预防病毒疾病的一种主要途径是接种疫苗。由于生产和施用疫苗存在成本，家畜的疫苗接种在一些情况下不是商业上可行的。此外，许多疫苗没有提供完全的保护和可能难以区分已接种的和感染的动物。

选取和繁殖具有对于病毒的敏感性的降低的动物可以帮助开发具有对于病毒病原体的增加的先天免疫的动物种族，因此最终可能降低商业家畜的疫苗接种的需求。然而，一些目前用于测定动物对于病毒的敏感性的方法的主要的限制是为了获得合适的组织样品，动物需要安乐死。因而，这种方法不能用于选取用于繁殖目的的动物。一些目前的方法的另一个限制是在测定动物对于病毒的敏感性之前，必须建立来自动物的细胞培养系或者培养组织。这种涉及细胞或者组织培养的建立方法是费时的。

降低动物对于病毒的敏感性的另一个途径可以是在动物中通过插入转基因来提供先天的病毒抵抗力。该病毒抵抗力将持续动物的一生，并将遗传给它们的后代。这种病毒抵抗力可以通过转基因给予，所述转基因表达双链RNA（dsRNA），从而利用RNA干扰提供对于病毒病原体的先天免疫。在可选的途径中，转基因可以表达产自于宿主动物所属的动物物种的基因，和其可以是例如，增加动物对于病毒病原体的免疫性的细胞因子。在这种情况下，可能需要能筛选具有降低的对于病毒的敏感性的转基因动物，以便可以用那些动物繁殖。

仍然需要适用于测定动物对于病毒感染的敏感性的试验，所述试验可以在活的动物中进行。例如，可以使用这种试验选取具有降低的对于病毒的敏感性的用于繁殖的动物。

发明概述

本发明的发明人展示出能够在从动物中获得的组织样品中复制的病毒，并且在组织样品中病毒复制的检测可以提供动物对于感染的敏感性的标示。

因此，本发明提供一种用于测定受试者对于病毒的敏感性的方法，所述方法包含：将从受试者中获得的组织样品与病毒接触，培养所述组织样品足够的时间用于病毒复制，并检测在组织样品中是否存在病毒。

本发明进一步提供一种用于检测源自受试者的组织样品中的病毒复制的方法，该方法包含：将从受试者中获得的组织样品与病毒接触，培养组织样品足够的时间用于病毒复制，并检测在组织样品中是否存在病毒。

在一个具体实施方式中，该方法进一步包含在培养样品足够时间用于复制之前，去除没有附着于组织样品中细胞上的病毒。

在另一个具体实施方式中，病毒的存在表明对于病毒的敏感性。

在本发明的另一具体实施方式中，该方法进一步包含比较该样品与对照样品中病毒的水平。对照样品可以是包含已知的病毒水平的样品，或者没有包含任何病毒的样品。

本发明的方法可以与对照样品相比检测样品中病毒水平的增减。

在一个具体实施方式中，与对照样品相比，组织样品中的病毒的水平减少表明对于病毒的降低的敏感性。

虽然本发明的方法可以在任何合适的受试者上进行，但在一个特殊的具体实施方式中，受试者是包括家禽的禽类，比如鸡。

在另一个具体实施方式中，受试者是鱼，比如鲑鱼属鱼。优选地，所述鲑鱼属鱼是鲑鱼或者鳟鱼。

适用于本发明的方法的组织包括，但不局限于，皮肤、羽髓、垂肉、鸡冠、包括细胞组分的血液、卵、上皮、粘膜、肺、脾、肝脏、肾、结膜、胸腺、粘液囊、鱼翅和鳃。

通过使用包含比如皮肤和/或羽髓的组织样品，该试验可以有利地在活的动物上进行。其它的合适可以从活的动物上获得的组织样品包括，但不局限于，垂肉、鸡冠、血液、卵、鱼翅和鳃。

本发明人发现流感病毒在组织外植体中复制，如皮肤和羽髓的外植体。流感病毒可以在这些组织外植体中复制是先前未知的或未预期的。

因此，在本发明的一个优选的具体实施方式中，组织样品包含皮肤。

本发明的方法采用任何合适的用于检测病毒在组织样品中的存在、缺失和/或复制的方法。比如，可以通过检测病毒多肽来检测病毒（如通过使用特异性抗体），或者通过检测病毒核酸，通过检测细胞病变效应（CPE）或者通过任何其它的本领域技术人员所知的合适的方法。用于检测在样品中的流感病毒的试验的一个例子是血凝试验。

在一个具体实施方式中，检测在组织样品中是否存在病毒包含从组织样品中分离核酸。所述方法可以进一步包含试图扩增来自分离的核酸的病毒核酸。

在一个具体实施方式中，从组织样品中分离的核酸是RNA。

通过本发明的方法检测的病毒包括，但不局限于，病毒如流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、口蹄疫病毒、猪呼吸生殖综合症病毒、猪瘟病毒、蓝舌病病毒、阿卡斑病毒、传染性的鲑鱼贫血病毒、传染性造血坏死病病毒、病毒出血性败血病病毒和传染性胰脏坏死病病毒。

在一个本发明的具体实施方式中，病毒是流感病毒。

在一个具体实施方式中，流感病毒是甲型流感病毒。甲型流感病毒可以是任何甲型流感病毒株，但在一个具体实施方式中，甲型流感病毒是甲型禽流感病毒。

为了检测样品中的病毒或者病毒复制，可以扩增任何合适的病毒靶病毒核酸。在一个本发明的具体实施方式中，扩增的病毒核酸是流感病毒的M基因的区域。

在一个特殊的具体实施方式中，病毒核酸包含序列号1的至少15个连续的核苷酸。

在另一个具体实施方式中，病毒核酸包含序列号2。

在一个优选的具体实施方式中，在组织样品与病毒接触之前不需要细胞或者组织培养。

进行本发明的方法，组织样品与病毒接触以便病毒能附着于样品中的细胞上。在一个具体实施方式中，病毒与组织样品接触大约15分钟至大约2小时。

在另一个具体实施方式中，病毒与组织样品接触大约1小时。

本发明的方法进一步包含将组织样品培养足够时间以进行病毒复制。比如，该方法可以包括培养组织样品大约1小时至大约48小时。

在一个具体实施方式中，培养样品大约48小时。

典型地，在适用于维持样品在存活状态的环境中进行组织样品的培养。本领域技术人员将理解影响选择培养环境的因素包括，比如从动物中获得的组织样品的类型，和动物是暖血还是冷血脊椎动物。

在一个具体实施方式中，培养是在大约37℃进行。

在另一个具体实施方式中，病毒是传染性的鲑鱼贫血病毒。

在一个具体实施方式中，扩增的病毒核酸是传染性鲑鱼贫血病毒的片段7或8的区域。比如核酸可以包括序列号10或序列号11的至少15个连续的核苷酸。在一个特殊的具体实施方式中，病毒核酸包含序列号12或者序列号13。

在一个具体实施方式中，病毒与组织样品接触大约15分钟至大约3小时。在一个特殊的具体实施方式中，病毒与组织样品接触大约1.5小时。

在一个具体实施方式中，该方法包含培养组织样品大约1天至大约10天。

在另一个具体实施方式中，该方法包含培养组织样品大约3天至大约10天。

在已从冷血脊椎动物中获得组织样品的情况下，可能需要在低于37℃的温度下培养样品。比如，可能需要在大约10℃到20℃下培养组织样品。在一个特殊的具体实施方式中，培养在大约15℃进行。

在一个特殊的具体实施方式中，组织样品的培养在包含大约5%的CO₂的湿润气氛下进行。

本发明的方法也可以在从转基因动物中获得的组织样品上进行。这种转基因动物可以比如包括影响动物对于病毒病原体的敏感性的转基因。因此，在一个本发明的具体实施方式中，组织样品包含转基因细胞。

在一个具体实施方式中，转基因细胞包括编码dsRNA分子的转基因，比如短发夹RNA（shRNA）分子。

当转基因编码dsRNA分子时，dsRNA分子可以包括病毒核酸序列，或者可选地动物内源性的核酸序列。

在一个具体实施方式中，病毒核酸序列是甲型流感核酸序列。

在另一个具体实施方式中，进行本发明的方法之前受试者没有暴露于病毒。

本发明进一步提供一种用于鉴定动物的方法，所述动物具有对于病毒的降低的敏感性，该方法包含

（i）进行本发明的方法，和

（ii）鉴定具有对于病毒降低的敏感性的动物。

本发明进一步提供一种用于繁殖动物的方法，该方法包含

( i）进行本发明的方法；

（ii）选择具有对于病毒降低的敏感性的动物；和

（iii）由该动物繁殖。

在一个具体实施方式中，用于繁殖动物的方法进一步包含

（i）选择具有对于病毒降低的敏感性的第一性别的第一种动物；和

（ii）选择具有对于病毒降低的敏感性的相反性别的第二种动物；和

（iii）使第一和第二种动物交配以产生后代。<0}

本发明进一步提供一种用于进行本发明的方法的试剂盒，该试剂盒包含用于检测病毒的工具。

在一个具体实施方式中，试剂盒包含至少一种核酸分子，该核酸分子在严格条件下与病毒核酸杂交。

在另一个具体实施方式中，至少一种核酸分子是用于扩增病毒核酸的引物。

在还一个具体实施方式中，试剂盒进一步包含病毒的样品。

明显地，本发明的一个方面的优选的特征和特性适用于本发明的许多其它的方面。

整个说明书中词组“包含（comprise）”，或者变形如“包含（comprises）”或者“包含（comprising）”将理解为意味包括一个指定的成分、整体或者步骤、或者一组成分，整体或者步骤，然而并不排除任何其它的成分，整体或者步骤，或者一组成分，整体或者步骤。

以下通过下列非限制性例子并参考附图来描述本发明。

附图概述

图 1在外植体组织样品中甲型流感病毒复制。从12日龄的小鸡中取皮肤（A）、拇指（亦称“小翼羽”）（B）和羽髓（C）。用甲型流感PR8病毒感染组织样品，并且培养1至48小时。从受感染的样品中提取出RNA，然后用对于甲型流感基质（M）基因的特异性引物进行实时PCR来分析。实时PCR结果显示与感染后1小时相比感染后48小时在M基因mRNA上有一个连续并显著的增加。

 

图 2来自用CEF培养物转化并用H5N1流感感染的RCAS的HA，所述CEF培养物表达shRNA。1-CEFs单独与RCAS载体整合。2-CEFs与表达PB 1-2257 shRNA的RCAS整合。

图 3在大西洋鲑外植体中的传染性的鲑鱼贫血病毒的定量PCR。通过qPCR在感染后第0、3和10天测定在鳃外植体样品中ISAV RNA成倍增加。

序列表的关键

序列号1 - 甲型流感M基因的编码序列。

序列号2 - 甲型流感M基因的区域。

序列号3 - shRNA靶向的PBl序列。

序列号4 - ISAV S7-F1 寡聚核苷酸引物。

序列号5 - ISAV S7-R1寡聚核苷酸引物。

序列号6 - ISAV S7-探针。

序列号7 - ISAV S8-F1寡聚核苷酸引物。

序列号8 - ISAV S8-R1 寡聚核苷酸引物。

序列号9 - ISAV S8-探针

序列号10 -传染性的鲑鱼贫血病毒片段7的核苷酸序列。

序列号11 - 传染性的鲑鱼贫血病毒片段8的核苷酸序列。

序列号12 -传染性的鲑鱼贫血病毒片段7扩增子。

序列号13 -传染性的鲑鱼贫血病毒片段8扩增子。

发明详述

常规技术和已选的定义

除非另外具体地限定，本文使用的所有的技术和科学术语应该认为具有如所属领域（例如在细胞培养、微生物学尤其病毒学、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学）普通技术人员通常理解的相同含义。

除非另有指明，本发明使用的微生物学的、细胞培养和免疫技术是标准程序，也是所属领域技术人员所熟知的。在原始资料中遍及文献描述和解释了这些技术，如，J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley 和 Sons (1984), J. Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rded., Cold Spring Harbour Laboratory Press (2001), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover和B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), 和F. M. Ausubel 等, (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates 和Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow和David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 和J.E. Coligan 等, (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons （包含目前为止的所有更新）。

如本文所使用的，术语“受试者”指的是动物，比如鸟、鱼或者哺乳动物和包括人类。在一个具体实施方式中，受试者可以是禽类，比如家禽如鸡、火鸡或者鸭。在其它的具体实施方式中，受试者可以是，如羊、猪或牛。

在一个具体实施方式中，受试者是鸡。

在另一个具体实施方式中，受试者是鲑鱼属鱼。

如本文所使用的，术语“禽类”指的是分类学鸟纲的生物体中的任何的的种、亚种或者种族，比如然而不局限于，这种生物体如鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀类、鹰、乌鸦、包括鸵鸟、鸸鹋和食火鸡的平胸类鸟。术语包括各种的已知的原鸡（鸡）的族，比如白来杭鸡（White Leghorn）、棕色来杭鸡（Brown Leghorn）、Barred-Rock、Sussex、New Hampshire、Rhode Island、澳洲黑鸡（Australorp）、科尼什鸡（Cornish）、米诺卡鸡（Minorca）、Amrox、California Gray、Italian Partidge-coloured，以及火鸡、野鸡、鹌鹑、鸭、鸵鸟及其他通常以商业数量繁殖的家禽。

术语“家禽”包括所有的圈养的、捕获的、或者为了肉或蛋驯化的禽类，比如鸡、火鸡、鸵鸟、斗鸡、雏鸟、珍珠鸡、野鸡、鹌鹑、鸭、鹅和鸸鹋。

如本文所使用的，术语“鲑鱼属鱼”指的是鲑科族的鱼和包括鲑鱼、鳟鱼、红点鲑和白鲑。鲑鱼的非限制性例子包括大西洋鲑、奇努克鲑鱼、细鳞大麻哈鱼、银鲑、马苏大麻哈鱼、红鲑和大麻哈鱼。鳟鱼的非限制性例子包括虹鳟、褐鳟、溪红点鲑和湖红点鲑。

“样品”可以是任何合适的类型，可以以非限制性例子的方式涉及组织样品如皮肤、羽髓、垂肉、鸡冠、包括它的细胞部分的血液、卵、上皮、粘膜、肺、脾、肝脏、肾、结膜、胸腺、粘液囊、鱼翅和鳃。

如文本所使用的，“敏感性”指的是动物被病毒感染的能力，其包括临床或者亚临床感染。“降低的敏感性”，它意思是当与常规种群相比时，敏感性的水平减少。

“没有附着于细胞的病毒”，它意思指不具有在寄主细胞表面上的特异性受体相关联的表面蛋白的病毒颗粒。

如本文所使用的，“病毒复制”指的是在寄主细胞中病毒基因组的扩增。

如本文所使用的，“禽流感病毒”指的是任何可以感染鸟类的甲型流感病毒。禽流感病毒的例子包括，但不限于Hl到H16和Nl到N9亚型的任一项或多项，以及包括高致病性和低致病性的株。在一个具体实施方式中，禽流感病毒是H5亚型。在另一个具体实施方式中，禽流感病毒是H7亚型。在另一个具体实施方式中，禽流感病毒是H5N1亚型。

如本文所使用的，术语“大约”是指给定值的+/-5%的范围。

试验

本发明的方法提供以下试验，在试验中来自受试者的组织样品与病毒接触，和在用于病毒复制的足够时间后，检测样品中是否存在病毒。

在一个具体实施方式中，本发明提供一种用于检测来自动物的组织样品中病毒复制的方法，该方法包含：将从动物中获得的组织样品与病毒接触，培养组织样品足够的时间用于病毒复制，并检测在组织样品中是否存在病毒。

技术人员将理解进行这种试验的条件可以取决于组织样品源自的物种和/或与组织样品接触的病毒，比如，取决于试验中使用的受试者的物种和病毒的物种，因素如温度、湿度、大气组成和组织样品与病毒接触的时间和随后培养将不同。这种条件可以通常地是由技术人员确定。

比如，就对于流感病毒在鸡皮样品中的复制的测试来说，样品可以在大约37℃在包含大约5% CO₂的湿润气氛下培养。

进行试验的温度可以是在大约37℃，但是取决于测试样品获得自的物种和被测试的病毒的物种，温度可以更低或更高。例如，当测试从鱼中获得的样品中病毒复制时，样品可以培养在大约8至18℃。

组织样品可以与病毒接触一个合适的时间以允许病毒进入样品中的细胞。比如，组织样品可以与病毒接触大约15分钟至大约2小时。在一个具体实施方式中，病毒与组织样品接触大约1小时。在另一个具体实施方式中，病毒与样品接触大约1.5小时。

然后培养组织样品足够时间用于病毒复制。培养时间可以是，比如大约1小时到大约48小时。在培养组织样品在较低的温度和/或减慢病毒生长的情况下，培养时间可以是大约1天到大约10天。技术人员可以容易地测定一个合适的培养期。

与病毒接触的组织样品可以放置在合适容器的孔中如在微量滴定法容器或者其它的多孔板。在一个具体实施方式中，添加病毒的等分试样（例如，连续地稀释的等分试样）到组织样品中，去除病毒然后在允许病毒复制的条件下培养组织样品，其是适用于维持特殊的宿主组织样品的活性的典型的条件。在一个具体实施方式中，病毒的复制后，通过组织样品的细胞的裂解释放病毒核酸，根据需要使用促进裂解的条件或者试剂。

在一个具体实施方式中，试图从分离的核酸扩增病毒的核酸。扩增的核酸可以是RNA或者DNA。

在其它的具体实施方式中，包括病毒核酸的核酸，在许多裂解产物中，如列阵，在结合核酸的条件下转移和固定到膜上（适当洗涤以去除蛋白质及其他污染物）。然后膜与一种标记的病毒-特异性的探针杂交可以用来鉴定和定量病毒-特异性核酸在列阵上每一个点的相对量，对应在每一个原始的培养孔。用于核酸转移、结合、洗清和杂交的条件和材料可以是由常规分子的生物技术如“斑点印迹”杂交（如本领域描述，参见如在Sambrook 等，上述，和Ausubel等，上述中的分子生物技术）改变而来。

可选地，可以使用蛋白质检测技术来测定样品中病毒的存在或者缺失。在一个具体实施方式中，对病毒多肽特异性的抗体被用来检测样品中是否存在病毒。用于检测病毒多肽的任何合适的方法可以用于本发明的方法中。

在本发明的方法中，可能需要来与对照样品比较病毒复制的水平，或者定量样品中病毒复制的水平。通过包含合适的对照样品能够轻易地提供这种量化。内部对照的例子是一个或多个具有病毒的已知量和/或已知没有包含病毒的样品。内部对照的其它的例子可以是组织样品，其中在样品中特殊的目的病毒已知是能复制的，或者反之在样品中已知该病毒不能复制。

如本领域技术人员所知的，当内部对照没有包括在每个进行的试验中时，对照可以源自于确定的数据设置。

病毒核酸的检测

“分离的核酸”，意思是一种核酸，其通常从核苷酸序列中分离，所述核苷酸以它的天然状态结合或者连接（如果它本存在于自然界中）着核苷酸序列。优选地，分离的核酸是至少60%不受，更优选地至少75%不受，再优选地至少90%不受核酸天然的连接着的其它的成分的影响。

术语“核酸分子”或者“多核苷酸”涉及一种寡核苷酸、多核苷酸或其任意片段。它可以是基因组的或合成起源的DNA或者RNA。

在一个具体实施方式中，本发明提供一种用于测定受试者对于病毒的敏感性的方法，方法包含将从受试者中获得的组织样品与病毒接触，培养组织样品足够的时间用于病毒复制，和检测在组织样品中是否存在病毒，其中该方法进一步包含从组织样品中分离核酸。在另一个具体实施方式中，该方法进一步包含试图从所分离的核酸扩增病毒核酸。技术人员将理解用于检测病毒核酸的任何合适的技术可以用于本发明的方法中。

技术人员将理解可以用本发明的方法检测任何合适的病毒核酸序列。任何允许用于核酸检测的合适技术都可以使用，其包括允许定量评价组织中特异基因的表达水平的技术。对比可以通过参考标准对照来进行，或者参考在未感染组织中发现的对照水平。比如，转录基因的水平可以通过Northern杂交和/或RT - PCR来测定。随着定量的（实时的）PCR的出现，存在于任何RNA群中的基因拷贝的数目可以准确地通过使用合适的用于目的基因的引物来测定。现在可以通过在基因列阵杂交监测多个转录基因的水平，该基因列阵包含固定在一个固体表面上来自所有目的基因的核酸序列。核酸可以被标记并在基因列阵杂交，在这种情况下基因浓度将直接与列阵里的产生的放射性或者荧光信号的强度成正比。

多聚核苷酸的扩增

 “聚合酶链反应”（“PCR”）是一种反应，其中复制拷贝由靶多聚核苷酸制成，其使用一个由“上游”和“下游”组成的“引物对”或“一套引物”、和聚合催化剂，如DNA聚合酶，和典型地热-稳定聚合酶。用于PCR的方法是本领域已知的，例如，在"PCR" (Ed. MJ. McPherson 和 S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford)中所启示的。PCR可以从分离自生物样品的逆转录mRNA中获得cDNA上进行。

一种引物是寡聚核苷酸，通常大约15到大约50核苷酸的长度，寡核苷酸能够以序列杂交特异性方式与靶序列杂交，并在PCR期间延伸。扩增子或者PCR产物或PCR片段或扩增产物是延伸产物，该延伸产物包括引物和新合成靶序列的拷贝。多重PCR系统包含多套引物，该引物导致多于一种扩增子的同时产生。引物可以完美地与靶序列相配，或者它们可以包含内部错配碱基，这可能导致在特异性靶序列上引入限制性内切酶或者催化的核酸识别/切割位点。引物也可以包含另外的序列和/或修饰或标记的核酸以利于捕获或检测扩增子。DNA热变性的重复周期，引物对于它们的互补序列的退火和用聚合酶的退火引物的延伸导致靶序列的指数式扩增。术语靶或者靶序列涉及扩增的核酸序列。

另一个核酸扩增技术是逆转录聚合酶链反应（RT - PCR）。首先，使用逆转录酶，由RNA模板制成互补DNA（cDNA），然后在获得的cDNA上进行PCR。

EP0320308中公开了用于扩增的另一个方法是连接酶链反应（“LCR”）。在LCR中，制备两个互补探针对，在靶序列存在下，每对将与靶目标的相对的互补链结合以使它们邻接。在连接酶存在下，两个探针对将连接形成单个单元。通过温度周期变化，如在PCR中那样，结合绑定单元从靶目标分离，然后作为“靶序列”用于绑定多余的探针对。美国专利号4,883,750描述了一种类似于LCR用于将探针对结合到靶序列的方法。

在本发明中，Qβ复制酶同时还可以用作另一种扩增方法。在该方法中，在RNA聚合酶存在下，具有与靶目标区域为互补区域的RNA的复制型序列添加到样品中。聚合酶拷贝复制型序列后，然后可以检测复制型序列。

一种等温的扩增方法也可以用于本发明的核酸的扩增（Walke等, 1992a），其中限制性内切酶和连接酶用来完成靶分子的扩增，所述靶分子在限制性位点的一条链上包含核苷酸5'α-硫-三磷酸盐。

链置换扩增（SDA）是另一种执行核酸等温的扩增的方法，其包括多轮链置换和合成，即切口平移（Walker等, 1992b）。

靶特异性序列还可以使用循环探针反应（CPR）来检测。在CPR中，具有非特异性DNA的3'和5’序列和特异性RNA的中间序列的探针杂交到存在于样品中的DNA。杂交后，用核糖核酸酶H和消化后释放的称为鉴别性产物的探针的产物处理反应。原始的模板退火到另一个循环探针并重复反应。

等温的扩增技术的另一个实例是LAMP（DNA的环介导的等温扩增），该技术在Notomi, T. 等, 2000中描述。

英国申请号2202328和PCT申请号PCT/US89/01025中描述了进一步扩增的方法，这些方法可以根据本发明使用。在前面的申请中，“修饰的”引物用于PCR类似，模板-和酶-依赖的合成。引物可以通过用捕获部分（例如，生物素）和/或检测部分（例如酶）标记来修饰。在后面的申请中，向样品中添加过量的标记的探针。在靶序列存在的情况下，探针结合并被催化分解。分解后，靶序列完整释放，与过量的探针结合。标记的探针的分解标志着靶序列的存在。

其它的核酸扩增步骤包括基于转录的扩增系统（TAS），其包括基于核酸序列的扩增（NASBA）和3SR（Kwoh等，1989；WO88/10315）。在NASBA中，可以通过标准的苯酚/氯仿萃取，临床样品的热变性，用裂解缓冲液处理，和小型离心过滤柱用于DNA和RNA的分离，或RNA的 盐酸胍的萃取来制备核酸用于扩增。这些扩增技术包括具有特异性靶序列的引物退火。聚合后，用核糖核酸酶H消化DNA/RNA杂交物，同时加热双链DNA分子使其再次变性。在两种情况下，通过添加第二特异性靶引物的，单链DNA都完全地产生双链，接着聚合。然后双链DNA分子通过RNA聚合酶如T7或SP6多转录。在等温的循环反应中，RNAs逆转录为单链DNA，然后其变为双链DNA，然后再一次用RNA聚合酶如T7或SP6转录。获得的产物，无论截断或者完整，都显示了靶特异性的序列。

用于核苷酸序列的直接测序的方法为本领域技术人员所熟知，可以举出作为例子的有Ausubel 等, eds., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley, ( 1995)和Sambrook 等，Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)。可以通过任何合适的方法进行测序，例如双脱氧法测序，化学测序或其变形。直接测序具有测定特异性序列中任何碱基对的变化的优点。

基于杂交的检测系统包括，但不局限于TaqMan试验和分子信标。TaqMan试验（US 5,962,233）使用特异性等位基因（ASO）探针，用供体染料在一端和受体染料在另一端，以使染料对通过荧光能量共振转移（FRET）相互作用。靶序列是通过改进的PCR扩增来包括标记的ASO探针的添加。调整PCR条件以使单个核苷酸差异将影响探针的结合。由于Taq聚合酶的5'核酸酶作用，在PCR期间完美地互补探针分裂开，同时具有单个错配碱基的探针没有分裂开。探针的分裂从退火受体染料中分离供体染料，极大地增加了供体荧光性。

TaqMan试验的一个替代是分子信标试验（US5,925,517）。在分子信标试验中，探针包含位于靶特异性种侧面的互补序列以便形成发夹结构。发夹的环互补于靶序列，同时每个发夹的臂包含供体或受体染料。当没有杂交到供体序列时，发夹结构促使供体和受体染料靠近从而熄灭供体的荧光。然而，当杂交到特异性靶序列时，供体和受体染料分开来增加荧光最多900倍。通过PCR分子信标可以与靶序列的扩增结合使用，提供一种用于实时检测靶序列存在的和能在扩增后使用的方法。技术人员将理解扩增或检测核酸的任何合适的方法可以用于本发明的方法中。

杂交

在本发明方法中，可以通过任何合适的杂交技术，包括但不限于，Southern、Northern印迹或斑点印迹分析来检测病毒核酸。测试是否存在病毒的样品可以包括细胞、基因组DNA（例如用于Southern印迹分析）、RNA（例如用于Northern印迹分析）、cDNA等等。如果需要，病毒或探针核酸可以是在溶液中或者固定在固体支撑物上，例如微孔板、膜、聚苯乙烯珠、载玻片或其他的固相。

如这里使用的，术语“杂交”指的是两种核酸分子彼此通过氢键结合。影响这种键合的因素包括：溶剂的类型和溶剂的量；反应温度；杂交时间；搅拌；阻断液相分子的非特异性连接到固体支持物的试剂（例如Denhardt试剂或BLOTTO）；分子的浓度；增加分子结合速度的化合物的使用（例如硫酸葡聚糖或聚乙二醇）；和杂交之后的洗清条件的严格性（参见Sambrook 等 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989)）。

“严格性”指的是杂交反应的条件，所述条件有利于非常类似的分子的结合超过不同分子的结合。高度严格的杂交条件定义为，例如42℃下，在包含50%甲酰胺，5 x SSC（150 mM NaCl，15 mM柠檬酸钠，pH 8.0），50 mM磷酸钠（pH7.6），5 x Denhardts溶液，10%硫酸葡聚糖和20微克/ ml变性，切割鲑精子DNA的溶液中过夜培养，继之以在0.1 x SSC以约65℃洗清过滤器。低严格的条件包括在35℃下进行的杂交反应。优选地，用于在本发明的方法中的杂交条件是那些高严格性的条件。

通常，用作探针或引物杂交到病毒核酸分子的的低聚核苷酸是至少大约12到15个核苷酸长度，或至少大约18到20个核苷酸长度，或至少大约21到25个核苷酸长度，和可选地大约26到35个核苷酸长度或更多。优选地，核酸分子与病毒核酸分子杂交至少是本底（background）的两倍，和更典型地是超过本底的10到100倍。

优选地核酸从样品分离出用于测试。合适的方法将为本领域技术人员所知。例如，从样品中分离出来的RNA可以使用常规程序分析，例如通过QIAGEN技术提供的程序。然后这些RNA使用逆转录酶逆转录为DNA，然后可以通过PCR技术使用特异性引物扩增目的DNA分子。

病毒多肽的检测

在一个具体实施方式中，检测一个样本中的病毒多肽或免疫原性片段或其表位，其中，样本中的多肽或免疫原性或表位表明病毒的复制。优选地，该方法包括将获得自样本的蛋白或免疫原性片段与能够结合病毒多肽或免疫原性片段或其表位的结合剂相接触，并检测结合剂与病毒多肽或免疫原性片段或其表位之间所形成的复合体。在一个实施例中，结合剂是抗体。

优选地，结合剂选择性地与病毒多肽结合，而通常不会结合其他不期望结合的多肽。结合剂能够在存在过量其他多肽的情况下，足够紧密地（即以足够高的亲和性）结合病毒多肽，这为病毒多肽的检测提供一个有用的工具。可以通过本领域中的常规手段来确定需要达到这种特异性的参数。优选地，结合剂对病毒多肽的结合至少是本底的两倍，更典型地，是本底的10至100倍。

可以使用的检测系统包括任何的从受试者的生物样本中检测蛋白质的已知技术，例如，SDA/PAGE、等电聚焦、二维凝胶电泳，包括SDS/PAGE和等电聚焦，免疫测定，基于使用蛋白的抗体或非抗体配体的检测系统，配体例如小分子（如化合物、激动剂、拮抗剂、别构调节物、蛋白的竞争性抑制剂，或非竞争性抑制剂）。根据这些实施例，抗体或小分子可以以任何能够检测到蛋白的标准固相或溶液检测形式使用。光学或荧光检测，例如荧光激活细胞分类术（FACS）、质谱测定法、MALDI-TOF、生物传感器技术、短暂纤维光束或荧光共振能量转移，这些都清楚地包括在本发明中。本发明中同样也包括适合于进行高通量筛选样本，尤其是进行高通量光谱共振方法（例如MALDI-TOF，电喷射质谱或纳米-电喷射质谱）的系统。

合适的免疫测定形式包括免疫印迹、Western印迹、斑点印迹、酶联免疫吸附测定（ELISA）、放射免疫测定（RIA）和酶法免疫测定。同样可以使用改良的利用荧光共振能量转移（FRET）、同位素编码亲和标签（ICAT）、基质辅助激光解析串联飞行时间（MALDI-TOF）、电喷射离子化（ESI）、生物传感器技术、短暂纤维光束技术或蛋白质芯片技术的免疫测定。

在一个具体实施方式中，测定是半定量测定或定量测定。

标准固相ELISA形式尤其适合于从不同的样本中确定病毒多肽的浓度。

这种基于ELISA的系统尤其适合于从样本中定量病毒多肽，例如，通过已知的标准量校正检测系统。

在另外一个形式中，ELISA包括将一个特异性结合病毒蛋白的抗体固定在固体基质上，例如，膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔、聚苯乙烯或聚碳酸酯量油尺或玻璃支持物。接着引入样品，与所述抗体物理连接，样品中的抗原就能够被结合或“捕获”。然后可以使用标记的抗体就检测到结合蛋白质。例如，如果从疑似含有流感病毒的样品中捕获了蛋白质，则使用抗流感病毒多肽的抗体去检测捕获的蛋白质。可选地，也可以使用能结合二抗（检测抗体）的标记的三抗。

生物传感器装置通常与电流或阻抗测量元件组合在一起的电极表面整合到与检测底物组合到一起的装置中（例如美国专利US5567301所描述的）。特异性结合目的蛋白的抗体或配体优选被结合到生物传感器装置的表面，而从受试者分离得到的生物样品与所述装置相接触。通过生物传感器检测出的电流或阻抗的改变表明蛋白结合所述抗体或配体。本领域中已知的一些生物传感器形式也依赖于表面等离子体共振来检测蛋白的相互作用，从而表面等离子体共振反射表面的改变表明蛋白结合于配体或抗体（US专利号5,485,277和5,492,840）。

生物传感器尤其是在高通量分析中使用，这是因为很容易就能将系统调整成微米级或纳米级。此外，这种系统可以很方便地调整以结合多种检测试剂，允许在单个生物传感器单元中含有多种检测试剂。

短暂生物传感器通常依赖于与荧光分子相互作用的预定波长的激发光，例如，附着在探针表面附近的荧光抗体，其根据诊断蛋白与抗体或配体的结合会激发出不同波长的荧光。

细胞病变效应（CPE）的检测

这里所使用的术语“细胞病变效应”或“CPE”描述的是细胞结构的改变（即，病理效应）。通常细胞病变效应包括细胞破坏，合胞体（即融合的巨细胞）形成，细胞变圆，液泡形成以及包涵体的形成。CPE是由于病毒对易感细胞的作用而产生的，该作用是病毒为了行使必需的功能以保持活力，而对易感细胞宿主的功能起的负面影响。

病毒的存在通常导致宿主细胞发生形态学改变。这种由于感染而发生的宿主细胞的可检测的改变就是细胞病变效应。细胞病变效应（CPE）包括细胞变圆，失定向，膨胀或收缩，凋亡，从表面脱落等等。

在本发明的一个具体实施方式中，组织样品中病毒的复制可以通过确定样品中是否存在细胞病变效应而检测。

在一个特定的具体实施方式中，可以通过染料对样品进行染色来检测细胞病变效应。适合检测CPE的染料在本领域中是已知的。例如，通过测量细胞吸收的中性红染料的增加来检测CPE。中性红吸收实验可以通过向包含细胞的样品中加入浓度约为0.34%的中性红来实施。2小时后，使用如自动微量板测定仪来确定被细胞吸收的染料的着色强度。

病毒病原体

本发明的方法可以用于确定某个病毒是否能在动物组织样品中进行复制。病毒的复制表明该动物对该病毒病原体是易感的。家禽中重要的病毒性疾病的例子包括但不限于，禽流感、马立克病、新城疫病、传染性法氏囊病、传染性贫血和传染性支气管炎。猪中的猪传染性胃肠炎、猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、伪狂犬病和狂犬病感染，这些都是严重的健康问题。偶蹄类动物的一个重要的疾病是口蹄疫（FMD）。鱼类的重要的病毒病原体包括传染性鲑鱼贫血病毒、传染性造血坏死病毒、病毒性出血性败血症病毒和传染性胰腺坏死病毒。已知的感染动物的病毒病原体的其他例子包括但不限于，蓝舌病病毒、北澳蚊病毒、非洲马瘟病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、牛或羊轮状病毒、禽轮状病毒、牛肠道病毒、猪肠道病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、内罗毕羊病病毒、甲型流感病毒、猪流感病毒和马流感病毒；犬瘟热病毒、牛瘟病毒、牛呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、鱼弹状病毒、传染性支气管炎病毒（IBV）、水牛痘病毒、牛痘病毒、禽痘病毒、绵羊痘病毒、山羊痘病毒、猪痘病毒、小牛侵蚀性口炎病毒、非洲猪瘟病毒、马流产病毒、马疱疹病毒2和3、牛传染性角膜结膜炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛，猪，羊和其他许多物种的腺病毒、禽流感病毒、牛乳头瘤病毒、牛细小病毒和赤羽病病毒。

流感病毒

一个重要的病毒病原体的例子是流感病毒。已知三种类型的流感病毒，甲型、乙型和丙型，它们都属于单链反义包膜RNA病毒科，即正黏液病毒科。病毒的基因组长度约为12000至15000个核苷酸，包括8个RNA段（丙型中是7个），编码11个蛋白。

甲型流感病毒感染多种动物，如人、猪、马、海洋哺乳动物以及鸟类，它们感染呼吸道的上皮细胞。其天然宿主是水生的鸟类，而在鸟类中，大部分的病毒感染导致温和的局部呼吸道和肠道的感染。然而，该病毒能够在家禽中引起高致病作用并突然性的爆发，导致受到影响的家禽的高死亡率。

依据编码表面糖蛋白的两个基因的抗原区的等位基因变异，甲型流感病毒被划分成几个亚型，即血球凝集素（HA）和神经氨酸苷酶（NA），所述糖蛋白用于病毒附着和细胞的释放。其他的主要病毒蛋白包括核蛋白、核衣壳结构蛋白、基质蛋白（M1和M2）、聚合酶（PA、PB1和PB2）、以及非结构蛋白（NS1和NS2）。

已知甲型流感病毒中存在至少16种HA亚型（H1至H16）和9种NA（N1至N9）抗原变异体。禽流感病毒株也分为低致病性品系和高致病性品系。典型地，低致病性品系HA前体切割位点的1和3位上只具有两个碱性氨基酸，而高致病性品系则含有多个碱性切割位点。H5和H7亚型能够引起家禽中的高致病性感染，并且已经表明某些亚型跨越了物种屏障，可以感染人类。高致病性H5和H7型病毒还从驯养家禽中的低致病前体中显现。禽流感病毒感染的症状包括典型流感症状（发烧、咳嗽、喉咙痛和肌肉疼痛）和结膜炎、肺炎、急性呼吸道不适、以及其他威胁生命的并发症。

本发明的方法可以用于鉴定对流感病毒感染具有降低的易感性的动物。任何适合于检测流感病毒的方法都可用于本发明的方法。当检测流感病毒核酸时，待检测核酸序列可以是任意的流感基因或区域，即编码M1基质蛋白、M2基质蛋白、神经氨酸苷酶（NA）、血球凝集素（HA）、非结构蛋白1和2（NS1和NS2）、衣壳蛋白（NP）、聚合酶（PA）、聚合酶1（PB1）或聚合酶2（PB2）的基因。在一个具体实施方式中，扩增的核酸序列是流感病毒的M基因的区域。在一个具体实施方式中，病毒核酸包括序列号：1中的至少15个核苷酸，例如，包括序列号：2。可选地，也可以检测任何流感病毒基因所编码的多肽。

新城疫病毒

新城疫病（ND）是一种家禽的严重的疾病，通常是致命的，因此可能导致严重的经济损失。该疾病是由新城疫病病毒（NDV）所引起的，这种病毒属于副黏液病毒科副黏液病毒属。

新城疫病毒通过呼吸道和肠道进入动物体内。新城疫病的症状主要与呼吸道和神经有关。呼吸运动失调是最常见的。神经症状包括翅膀和/或腿单侧和双侧的麻痹，头和颈部的圆周摆动、上下/挥舞运动，翅膀、脖颈或腿部肌肉的痉挛。常见的症状还包括食欲下降、产蛋量下降，通常达到40%或更高。

根据涉及病毒的特性和特定群体的免疫状况，死亡率会各有不同。通常来说，致死较快的品系在感染鸟类中的传播能力要比致死较慢的品系稍弱。此外，据推断，在特定种类的家禽诸如鸡中，存在着长期无症状的携带者。在爆发期中，疾病传播的最大风险来源于人的运动和设备的迁移。由于家禽业中许多程序的集中化，因此人员和设备从一个群落到另一个群落的移动是相当庞大的。

不幸的是，目前似乎没有任何方法可以将接种过疫苗的个体和未接种疫苗的个体区分开来，这些没有接种过疫苗的个体受到有毒的，“野生型”版本的新城疫病病毒的毒害。在两个例子中，动物体内都产生了抗体。然而，当前的疫苗接种免疫原所诱导的NDV抗体与有毒的感染性NDV感染后所产生的抗体常常是区分不开的。

本发明的方法允许鉴定对NDV易感性降低的家禽。待检测的NDV核酸序列可以来源于任何基因组的基因序列或区域，例如，来自于编码核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白质（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血球凝集素-神经氨酸苷酶（HN）或大分子量聚合酶蛋白（L）的基因。可选地，本发明的方法也可以检测新城疫病病毒多肽。

鸡贫血病毒

CAV病毒导致鸡的感染性贫血症。该病毒于1979年在日本首次分离得到，因为其在小鸡中引起严重的贫血而得名（Yuasa等，1979）。CAV感染的其他症状是骨髓萎缩和胸腺淋巴细胞的破坏。脾脏和肝脏也会发生损害。

日龄鸡是最易感的。用CAV培养后的4至7天，在这些动物中观察到嗜睡、厌食症和短暂的贫血，大约一半的动物在感染后2至3周内死亡。随着年龄的增加，自然抗性也随之增加。对7日龄的鸡进行感染，它们只表现出短暂的贫血，而14日龄的鸡感染后则没有发生贫血。

CAV似乎是在全世界范围内的传播。在日本开始研究CAV之后很长的一段时间，欧洲才进行首次分离CAV的实验，即德国的Von Bulow（1983）和后来的英国的McNulty等人（1990）。可提供的最直观的数据表明，这些分离株属于一个血清型，但是要检测多个分离株之间的相互关系和在致病性方面的可能存在的差异（McNulty等，1990）。CAV在群落间通常是通过排泄物和空气进行传播感染。而病毒向后代的垂直传染也在CAV传染病学中起着重要的作用。

当使用本发明的方法检测鸡贫血病毒（CAV）时，待检测的核酸序列可以来自于任何CAV基因，例如，CAVgp1、CAVgp2或Cux-1，或可选地检测由CAV基因所编码的多肽。

传染性法氏囊病病毒

传染性法氏囊病是幼鸡的一类急性传染病毒性疾病，通常也称之为传染性华氏囊病（Kibenge等，1988；Lasher等，1997）。病原，IBD病毒（IBDV），对法式囊的细胞具有偏好性，在这里病毒活跃地感染分裂和分化B细胞系的淋巴细胞（Burkhardt和Muller，1987）。IBD是一个致命的免疫抑制类疾病，会引起家禽产业的损失。

IBDV的第一次爆发报道于美国特拉华州的商业鸡群中（Cosgrove，1962）。在爆发期间分离得到的IBDV株现在被确定是经典的血清I型分离株。该疾病第一次在欧洲的报道也是在1962年。1966至1974年间，中东、非洲南部和西部、印度、远东和澳大利亚都报道过IBD。大部分情况下，与爆发相关的IBDV病毒株的毒性都很低，其引起的死亡率只有1至2%（van den Berg等，2000）。

20世纪90年代，欧洲报道了突破母系遗传抗体水平的IBDV分离株，该抗体通常是保护性的。这些分离株，也是所谓的非常毒的IBDV，在爆发期间引起了更严重的临床信号，在易感群体中，死亡率接近100%，而现在几乎在全世界都能找到该株病毒（van den Berg等，2000）。非常毒的IBDV的出现使得对抗该疾病的免疫方法更加复杂。

早期的疫苗接种往往是失败的，这是因为母体抗体的干扰，而该抗体的延迟可能导致地域病毒感染。确定对IBDV感染具有较低易感性的鸡将有助于繁殖和选择疾病抗性品种。

在本发明的一个具体实施方式中，可以检测传染性法氏囊病病毒核酸。该核酸可以来自于IBDVsAgp1、IBDVsAgp2或IBDVsBgp1。可选地，也可以检测由IBDV基因所编码的多肽。

口蹄疫病毒

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒群引起的最严重的家畜疾病之一。在全世界的大部分地区都发现了该病毒，遍及非洲、中东、亚洲和南美洲的至少52个国家中均报道过该疾病。该病毒具有7种血清型：A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1。上述血清型可进一步划分成超过60种病毒株。FMD影响偶蹄类动物（具有偶数蹄的动物），包括牛、水牛、骆驼、绵羊、山羊、鹿和猪。

FMD通过呼吸、唾液、黏液、乳汁或排泄物在动物之间快速传播。该疾病的传播最常见的方式是通过受感染动物的移动。它同样也能通过风或泥浆或肥料在羊毛、毛发、草皮或稻草间传播，而上述泥浆或肥料粘在鞋袜、衣服、家畜设备或汽车轮胎上。

尽管FMD在成年动物中并不是很致命的，但它能杀死动物幼体并带来严重的经济损失。该病的临床症状是发热以及随之出现的在脚趾间，脚后跟，乳腺以及尤其是在唇、舌头和上颚的痘（充满液体的水泡）。这些痘通常会融合形成大的肿胀的水泡，水泡破裂后会留下刺痛的、疼痛性溃疡，需要10天才能痊愈。足部损害会留下残疾，使动物不能行走、进食或饮水。舌头和口腔的伤口非常疼痛，引起动物流口水并停止进食。成年个体通常在几天后就能再次进食，但是幼体可能会越来越虚弱并且死亡，或者会留下足部残疾或者乳腺的损伤。

FMD在动物和动物产品的国际交易中是非常重要的，因为没有这些疾病的国家会禁止或限制从感染疾病的国家进口。这意味着一次爆发将给那些主要的家畜出口国带来巨大的经济影响。

FMD病毒含有正义链RNA基因组，约8500个核苷酸，由5’非翻译区，编码区和3’非翻译区组成。基因组编码一个单独的多聚蛋白质，而不同的病毒蛋白则从这个多聚蛋白质中切割得到。因此，本发明的方法可包括检测FMD病毒基因组或其产物，例如，结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，或非结构性蛋白L^pro、3D^pol、2A、2B、2C、3A、3B、3C^pro或3D^pol。

猪生殖与呼吸综合症病毒

PRRS是猪的病毒病，其特征是引起母猪的生殖失败（例如母猪的晚期流产，死胎）和小猪的呼吸困难（如幼猪的间质性肺炎）（Collins等，1992；Wensvoort等，1991）。该病毒在北美于1987年，在欧洲于1900年被检测出。

引起该疾病的病原体是一种小的，包膜正义链RNA病毒，主要从受感染的猪的肺泡巨噬细胞和血液中重新获得。它属于动脉炎病毒科，该病毒科还包括马动脉炎病毒（EAV）、小鼠的乳酸脱氢酶升高病毒（LDV）以及猴出血热病毒（SHFV）。和其他动脉炎病毒一样，PRRS病毒主要感染巨噬细胞，在许多组织的定居巨噬细胞中建立持续性感染（Lawson等，1997；Christopher-Hennings等，1995）。

对于动脉炎病毒，如PRRSV，并没有研究过宿主的易感性因素。因此，对于猪的繁殖的PRRSV宿主易感性的标记是不为人所知的。然而，基于实验性的感染，然后处死动物并对间质性肺炎的组织病理学和免疫组织化学，肺中存在PRRSV抗原的进一步检测，人们已经知道不同品系的猪对于PRRSV的易感性是不同的。

因此，本发明提供了一种能用于筛选猪对PRRSV感染的易感性的的方法。此外，筛选结果可以用于育种计划，以降低后代对PRRSV感染的易感性。

能够使用本发明方法检测的猪生殖与呼吸综合症病毒核酸可以选自PRRSVgp1、PRRSVgp2、PRRSVgp3、PRRSVgp4、PRRSVgp5、PRRSVgp6、PRRSVgp7或 PRRSVgp8基因。在另外一个具体实施方式中，可以检测PRRSV基因所编码的多肽。

猪瘟病毒

猪瘟病（CSF），同样被称为猪霍乱病或猪疫，是一种猪的高度传染病毒性疾病。CSF通过污染的排泄物、尿液、鼻腔分泌物和眼泪快速地传播。易感猪与受感染猪的直接接触是最重要的传播方式，然而该病毒同样可以转移到受污染的围栏、猪圈、卡车或覆盖物。用受感染的肉类碎片残羹喂养猪也是一种使CSF传播到新的地区或国家的重要方式。

急性CSF引起急性发热。受感染的猪首先会表现出昏昏欲睡，之后会出现严重的情绪低落和食欲不振。它们相互拥挤在一起，摇晃，偶尔还抽搐和发抖；常见呕吐、咳嗽、腹泻。通常在受感染动物的耳朵、嘴、四肢和腹部的皮肤上会出现红色或紫色的斑点。致死率能够达到90%。该病的慢性形式也会产生相似的临床信号，尽管以一种更温和的形式；通常在感染后30天或更长时间发生死亡，这常常与二次细菌感染有关。

猪瘟病毒（CSFV）的基因组是单链正义RNA，长度约为12300个核苷酸。在每个末端（5’NTR和3’NTR）均含有非翻译区，含有编码大蛋白质（PestiV2gp1多聚蛋白质）的单个的开放阅读框，该蛋白能够被切割成更小的片段。因此，在本发明的方法中，可以通过检测PestiV2gp1基因或其基因产物确定CSFV的存在，例如，检测CSFV多聚蛋白质、N-pro、衣壳蛋白、核糖核酸酶、包膜糖蛋白E1、E2、E2*、非结构蛋白p7、NTPase/RNA解旋酶、非结构蛋白质NS4A、NS4B和NS5A或者RNA依赖的RNA聚合酶。

蓝舌病毒

蓝舌病是一种反刍动物的虫媒传播的传染性病毒疾病。牛和山羊易于感染BTV，但不会引起广泛的血管损伤，因此这些物种并不会表现出明显的临床信号。相反，该疾病在绵羊中的特征在于口腔，鼻腔和前胃的黏膜卡他性炎，冠状带以及蹄的薄层的炎症。首先在上皮细胞中会出现表皮脱落，最终颊黏膜坏死；浮肿和发炎的舌头和口腔会呈现蓝色，该疾病因此而得名（Spreull，1905）。该疾病在绵羊中的致死率估计为1-30%。

BTV是一种环状病毒属（呼肠孤病毒科）的原型病毒，由至少24个不同的血清型（Wilson等，2000）组成。BTV的不同种系在全世界都被鉴定出，遍及热带和温带。BTV在反刍动物中不是传染性的，因此BTV的散布依赖于coides sp.的节肢动物病媒物种的存在（蠓），而世界的不同地区都会有不同的病媒物种。近期的数据表明，基因漂移和建立者效应导致BTV种系个体基因片段的多样性（Bonneau等，2001）。据显示，BTV血清反应阳性的动物对同源BTV血清型的再次感染是具有抗性的。

为了确定蓝舌病毒存在与否，可以检测蓝舌病毒基因或由蓝舌病毒基因所编码的多肽。蓝舌病毒基因包括BTVs1gp1、BTVs1gp1、BTVs2gp1、BTVs3gp1、BTVs4gp1、BTVs5gp1、BTVs6gp1、BTVs7gp1、BTVs8gp1、BTVs9gp1和BTVs10gp1基因。

阿卡班病毒

阿卡班是一种昆虫传播病毒，会引起反刍动物中枢神经系统的先天性异常。这种由阿卡班病毒引起的疾病已经在澳大利亚、以色列、日本和韩国被确认；在许多东南亚、中东和非洲国家也已经找到了该病毒的抗体。该病影响牛、绵羊和山羊的胎儿。无症状感染通过血清学已经在地方病区域中的马、水牛和鹿（但没有在人类和猪）中被确定。

阿卡班病毒诱导疾病的发生率受妊娠期的影响，而感染发生在该时期，同样也受到病毒种系的影响。怀孕的后3个月内的感染将会导致相对低的疾病发生率（5-10%的牛犊受到影响）。感染后第3个月和第4个月是发病率的高峰时期，达到40%的牛犊可能出生时便带有缺陷。阿卡班病毒的一些种系产生极低的畸形率（<20%），甚至在妊娠期最易感染的阶段，然而最严重的种系则会导致高达80%的动物受感染。

在本发明的方法中，可以检测任何阿卡班基因组核酸或多肽。阿卡班病毒基因包括AKAV sSgp1（核壳蛋白）、AKAV sSgp2（非结构蛋白）、AKAV sMgp1（M基因）和AKAV sLgp1（Pol）基因。

传染性鲑鱼贫血病毒

传染性鲑鱼贫血症（ISA）已经引起了挪威、加拿大大西洋省区和苏格兰的大西洋鲑鱼渔业的巨大经济损失。ISA病的致死率是变化的，从10%至超过50%。该病的临床信号在大西洋鲑鱼中非常明显，但是其他的鲑鱼可以是病毒的无症状携带者。与ISA相关的病理学改变的特征在于严重的贫血、白血球减少、腹水和内部器官出血，随后发生肝细胞和肾间质细胞的坏死。传染原是一种包膜病毒（ISAV），该病毒在体内的内皮细胞中复制，并从细胞表面出芽繁殖。该病毒具有线性的、单链反义RAN基因组，由8个长度约从1.0至2.2kb的片段组成，总大小约为14.3kb。该病毒的结构、形态和生理化学特征都表明，ISAV与正粘液病毒科的成员有关（见Falk等，1997）。

通过试图清除ISA病毒来消除ISA病被证明是无效的。考虑到涉及疾病传播的许多未知因素，包括野生鱼中的病毒携带者，完全清除ISA和病毒（ISAV）似乎并不是一个能够达到的目标。

在本发明的方法中，可以检测任何ISAV核酸或多肽。例如，一个或多个PB2聚合酶、PB1、NP、P2、P3、HA、P4、P5、P6或P7基因或基因产物也可以用本发明的方法进行检测。检测来自于ISAV片段7（序列号：10）或片段8（序列号：11）的核酸的试验被Plarre等所描述（2005）。引物S7-F1（序列号：4）和S7-R1（序列号：5）可以用于扩增片段7（序列号：12）的一个81bp的区域，其可以用荧光标记的探针S7-P1（序列号：6）进行检测。引物S8-F1（序列号：7）和S8-R1（序列号：8）可以用于扩增片段8（序列号：13）的一个63bp的区域，其可以用荧光标记的探针S8-P1（序列号：9）进行检测。

传染性造血坏死性病毒

传染性造血坏死性病毒（IHNV）是一种弹状病毒，能够引起鲑鱼属鱼，例如鲑鱼、鳟鱼的疾病。能够被IHNV感染的物种包括彩虹/虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、割喉鳟（Salmoclarki）、褐鳟（Salmo trutta）、大西洋鳟鱼（Salmo salar）、太平洋鳟包括chinook（O.tshawytscha），虹鳟鱼/红大麻花鱼（O.nerka)、chum（O.keta）、樱鳟/山女鱼（O.Masou)、amago（O.rhodurus）和银大麻哈鱼（O.kisutch）。

IHNV病毒在美国的西北部是一种地方性动物病，因为曾经报道过该疾病在华盛顿、俄勒冈州和加利福尼亚州爆发。该病毒的传播超出了太平洋西北岸，在美国的其他州也报道了该疾病，例如明尼苏达州、蒙大纳州、南达科他州、阿拉斯加和西弗吉尼亚州以及加拿大省、包括不列颠哥伦比亚。而现在该病毒的范围似乎已经波及全世界，因为在法国、意大利、比利时、日本、台湾和韩国也出现了该疾病的爆发。

IHNV感染典型地引起幼鱼、鱼苗鸡或小鱼严重的致死率，据报道致死率高达80%或有严重的畸形。在暴露后一周内，受感染的鱼类就能表现出外部可见的疾病信号。暴露后4至10天出现死亡，但是典型的IHNV致死在约40至50天后便会停止。

IHNV，和其他弹状病毒一样，是反义RNA病毒，其基因组编码6个基因。IHNV的宿主是临床感染的鱼类和鱼类中不明显的携带者。IHNV在鱼类间的传播主要是平行的，即通过排泄物、尿液、性液体和外部粘液排出病毒。也发现了通过受感染的卵所进行垂直传播的情况。一旦IHNV在易感鱼群中被建立，该疾病就很难被清除，这是因为它可能在带病鱼类中也会被建立。

当前，疫苗已经在开发和检测之中。然而，还没有发现任何疫苗能够控制IHNV感染。因此，当前的疾病控制方法需要确定被感染的个体，阻止未感染的鱼类与受感染的个体或受感染的环境相接触。

对于传染性造血坏死性病毒来说，可以使用本发明的方法进行检测的核酸序列包括IHNVgp1（核蛋白壳）、IHNVgp2（聚合酶相关的蛋白）、IHNVgp3（基质蛋白）、IHNVgp4（糖蛋白）、IHNVgp5（非病毒粒子蛋白）和IHNVgp6（RNA聚合酶）基因。在可选的具体实施方式中，也可以检测IHNV基因所编码的多肽。

病毒性出血性败血病毒

在能够影响鱼类的弹状病毒（novirhabdoviruses）中，病毒性出血性败血病病毒（VHSV）是最危险的病毒之一，因为它不仅影响鲑鱼属鱼，还影响鳕鱼、大比目鱼、石首鱼、鳗鱼、海鲂和对虾。尽管做了许多努力，但是现在还是没有一种抗VHSV的商业性疫苗。

当病毒结合时，由弹状病毒引起的感染就开始了，通过pG糖蛋白结合宿主细胞外膜上的特异性受体，当病毒通过内吞作用进入细胞胞质之后，就会发生依赖于pH降低的膜融合作用。一旦进入细胞，该弹状病毒就在细胞质内复制，病毒粒子成熟，最后，从细胞表面出芽，裂解细胞。

由于VHSV感染显著的发病率，以及可提供的商业疫苗的缺乏，迫切需要鉴定出对于VHSV感染具有降低的易感性的鱼类。

能够通过本发明的方法检测出的核酸序列包括编码N蛋白（核蛋白，VHSVgp1）、P蛋白（磷酸化的蛋白；VHSVgp2）、M蛋白（基质蛋白；VHSVgp3）、G蛋白（糖蛋白；VHSVgp4）、NV蛋白（非病毒粒子蛋白；VHSVgp5）和L蛋白（大分子蛋白；VHSVgp6）的基因。可选地，也可以检测由VHSV基因所编码的多肽。

传染性胰腺坏死病毒

传染性胰腺坏死病毒（IPNV）是双核糖核酸病毒科的成员，能够引起水生动物的传染性病毒性疾病。在鱼类中，IPNV会导致病态以及彩虹鳟鱼、大西洋鲑鱼、太平洋鲑鱼、溪红点鲑和其他鲑鱼，尤其是雏鱼，两岁大的鲑鱼和稚鱼期的死亡。IPNV同样在许多水生动物物种中被分离出来，例如鲤鱼、鲈鱼、梭鱼，鳗鱼、红点鲑、软体动物和甲壳纲动物。

IPNV爆发后，存活的鱼类通常会成为病毒的携带者。病毒在带病毒的鱼类中持久的存在似乎是因为在特定器官中一小部分感染细胞不断地产生病毒。当今可用的清除带病毒的鱼类中的病毒的控制方法是杀死该鱼类。

能够通过本发明的方法检测出的IPNV核酸序列包括编码假定蛋白（IPNVsAgp1）、多聚蛋白质（IPNVsAgp1）和病毒蛋白1（IPNVsBgp2）的基因。可选地，也可以检测由IPNV基因所编码的多肽。

试剂盒

本发明还涉及用于检测病毒复制的试剂盒。该试剂盒适合于检测核酸种类，或可选地适合于检测基因产物。

对于核酸的检测来说，所述试剂盒包括第一容器，例如包含寡核苷酸探针的一个小瓶或塑料管或微量滴定板。试剂盒任选地包括第二容器，里面装有引物。探针能够与病毒DNA杂交，引物用于扩增该DNA。也可以开发出一种检测试剂盒，该试剂盒包含固定在固相支持物上的寡核苷酸探针，例如，使用阵列（参见Natrue Genetics第 21（1）期的增刊，1999）。

对于核酸的PCR扩增，核酸引物可以包括在试剂盒中，该引物与编码病毒蛋白的基因的至少一部分互补。这组引物典型地包括至少两个能特异性扩增DNA的寡核苷酸。还可以包括能够用于定量PCR鉴定的荧光标记的寡核苷酸（例如，TaqMan化学，分子信标）。还可以包括用于DNA扩增的合适的酶类。

为了对比或验证，试剂盒中还可以包括对照核酸。所述对照可以是RNA，也可以是DNA，这些核酸从没有与病毒培养过或已知不含有病毒的组织样品中分离出来。

对于蛋白的检测，最典型地，抗体可以作为试剂盒的组分。然而，能够与目的病毒多肽特异性结合的任何试剂都可以用于本发明的这个方面。试剂盒的其他组分典型地包括标记、二抗、底物（如果基因是酶类）、抑制剂、辅因子以及允许使用者定量表达水平和/或用于确定该诊断实验是否准确运转的对照基因产物。酶联免疫吸附检测（ELISA）和竞争性ELISA检测是特别合适的试验，本领域技术人员利用试剂盒组分能够容易地实施该实验。

繁殖

家畜动物的育种计划典型地是将优势特征，例如疾病抗性，通过繁殖进入到商业品系中。因此，本发明的方法能够有利地鉴定和选择对特定疾病具有抗性或降低的易感性的动物。

在一个具体实施方式中，本发明提供了一种鉴定对病毒具有降低的易感性的动物的方法，该方法包括：

（i）实施本发明的方法，和

（ii）确定对病毒具有降低的易感性的动物。

一旦对病毒具有降低的易感性的动物被鉴定出来，就能与异性动物进行杂交，异性动物可具有或不具有对该病毒的降低的易感性。获得的后代可具有与亲代动物相似的对病毒的低易感性，或者后代对病毒的易感性介于亲代动物的易感性之间。

因此，本发明提供了一种育种的方法，该方法包括：

（i）实施本发明的方法；

（ii）选择对病毒具有低易感性的动物；

（iii）由该动物繁殖；

在一个具体实施方式中，该方法包括：

（i）选择对病毒具有低易感性的第一性别的第一动物；

（ii）选择对病毒具有低易感性的异性的第二动物；

（iii）将第一动物和第二动物杂交以产生后代。

具体实施例

实施例1 组织样品的制备

从12日龄的小鸡中取鸡的皮肤（从翅膀下的胸脯区域）、拇指（小翼羽）和羽毛囊，室温下将其置于补充添加有青霉素（100U/ml）和链霉素（100μg/ml）的PBSA中。样品在从鸡中取下后1.5小时之内进行处理，用甲型流感病毒RP8品系进行感染。皮肤样品切为约2mm的小块，羽毛囊切为1cm的小块，榨出里面的髓质，囊泡中的髓质与皮肤组织块差不多大小。个体组织块置于含有200μlPBSA的96孔板中。

实施例2 病毒试验

用病毒生长培养基（VGM），含有0.3%牛血清白蛋白（BSA），10mM Hepes，2mM谷氨酸，补充添加有青霉素（100U/ml）、链霉素（100μg/ml）、两性霉素B（0.005μg/ml）和5μg/ml胰岛素的Earls改良Eagle培养基将甲型流感病毒PR8品种的病毒（储藏于10日龄鸡受孕的鸡卵的尿囊液中）连续稀释10倍至10^-5（1000TCID50感染剂量）。除去PBSA，在每个孔中加入200μl病毒，于37℃，含有5%CO₂的湿润气氛下培养1小时，之后移去病毒，加入200μl含有5μg/ml胰岛素的VGM，于37℃，含有5%CO₂的湿润气氛下继续培养1小时或48小时。

移去病毒上清液，用200μl PBSA洗涤组织，旋转通过QIAshredder柱后，根据Qiagen RNeasy试剂盒的说明进行RNA的分离。使用扩增甲型流感病毒M基因的特异性引物进行实时PCR扩增（Heine等，2007）从而分析RNA。样品在ABI7700序列检测系统（Applied Biosystems）中进行分析。所有实验条件均设置3个重复，然后在3个重复中分析了实时PCR。实时PCR的结果示出甲型流感病毒M基因的mRNA持续性和显著的上升，与感染后1小时相比，感染后的48小时上升了5个对数单位（见图1）。这表明，病毒可以在不同类型的细胞中成功复制。

实施例3 在鸡胚模型中确定病毒易感性

用RCAS病毒注射4日龄的无特异病原体（SPF）胚胎，RCAS病毒表达EGFP&shRNA，其中shRNA靶向甲型流感病毒的PB1基因（PB1-2257-5’gatctgttccaccattgaa3’（序列号：3）。在蛋的钝端打一个小孔，暴露出气囊膜，胚胎和血管系统。使用微毛细管从血管中移出几微升血液，接着将1-2μl RCAS病毒（滴定度约为10⁸/ml）从另外一条血管注射进去。使用两小条石蜡膜双层密封蛋体，石蜡膜放置于开孔处，使用微微加热的解剖刀刀片将石蜡膜与蛋表面密封。蛋继续培养至第9天。

从蛋中移除胚胎，使用解剖显微镜通过荧光检测EGFP。选择含有最高密度EGFP表达的胚胎，从这些胚胎中收集鸡胚胎成纤维细胞（CEFs）。通过移除头部，肢干和内脏产生CEFs，切碎胚胎的剩余部分，在0.25%胰岛素中，37℃下持续搅拌处理30分钟。大块的组织经过70μm过滤器进行过滤，将剩余的细胞沉淀，并在接种到组织培养瓶之前用生长培养基重悬。在融合之后，将CEFs从瓶中胰蛋白酶化，重新接种到24孔板并培养几天以使其生长融合。

在用高致病性禽流感病毒（HPAI）-H5N1以0.01、0.001和0.001进行多次感染之前，在荧光显微镜下测定这些培养物，确保它们都表达了EGFP。细胞与病毒在37℃下共培养1小时，移除病毒，加入新鲜培养基。将培养物置于37℃下继续培养48小时。移去每个孔中的上清液，通过血细胞凝集反应试验分析病毒装载量。将50μl上清液用PBSA连续稀释2倍，在每个孔中加入50μl预洗涤的压紧血细胞容积为0.5%的鸡红细胞，室温培养45分钟。红细胞的凝集指示了病毒的存在。被表达shRNA PB1-2257的RCAS病毒所感染的CEFs与对照CEFs相对比，对照CEFs被缺乏发夹的RCAS病毒所感染，而发夹是病毒复制HPAI-H5N1的能力所需要的。与对照CEF细胞相比，包含PB1-2257的CEFs具有增高的抗性水平。

实施例4 大西洋鲑鱼外植体中的病毒试验

两个大西洋鲑鱼被麻醉，尾部采血样。将血液收集到Alsevers溶液中（4ml血加入到10ml Alsevers）。血液用含有抗生素（1×庆大霉素，2×青霉素和链霉素以及1×两性霉素B）的洗涤培养基PBS-ABC洗涤4次。洗涤中，500g离心10分钟以沉淀细胞。然后，3.3ml血沉棕黄层和痕量的红细胞也使用在该实验中，如下所述。

一旦鱼类被放血，就从鱼中分离出腮，将其置于洗涤培养基（如上所述）中，室温放置1小时。接着移去培养基。加入新鲜培养基，试管于室温放置30分钟。重复上述步骤。最后一次洗涤液倒出后，加入1ml SHK-1生长培养基。

在6只2ml的Sarstedt管子中加入1ml SHK-1生长培养基。其中的3管加入100μl血沉棕黄层。其他的3管中的每一个中插入鱼腮片段。鱼鳃管或血沉棕黄层中的一管中用3个传染性鲑鱼贫血病毒（ISAV FRS 13299）剂量中的一个剂量给药。接种于试管的ISAV的3个剂量率为1000、5000或25000TCID₅₀。

试管在15℃下培养90分钟。血沉棕黄层管离心沉淀细胞，移去所有培养基。用新鲜的生长培养基重悬细胞，接着在15℃下培养10天。在第3天和第10天提取样品，用定量PCR（qPCR）对ISAV的生长进行分析。所有的样品制备3个重复。

qPCR是TaqMan试验。引物是ISAV S7-F1 (5'-TGG GAT CAT GTG TTT CCT GCT A-3' (序列号4))和ISAV S7-R1 (5'-GAA AAT CCA TGT TCT CAG ATG CAA-3' (序列号5))。使用的TaqMan探针是ISAV S7-探针 (5'-6FAM CAC ATG ACC CCT CGT C MGBNFQ-3' (序列号6))。qPCR的方法之前已经被描述过（Plarre等，2005）。

qPCR的结果如图3所示。ISAV能够在腮外植体样品中生长，但是不能在血沉棕黄层样品中生长。在腮外植体样品中，在第3天和第10天都检测到了如前的所有3种剂量的病毒的生长。第10天在腮外植体样品中检测到了最大病毒生长量，使用剂量为25000 TCID₅₀。在这个剂量下，和第0天相比，第10天的ISAV RNA几乎提高了10倍。

本领域技术人员熟知本发明所示的这些特定实施方式的大量变体和/或修改，而并不偏离本发明的精神或范围。因此，这些实施方式被看做是解释说明而不能认为是对本发明的限制。

这里所讨论的和/或参考的所有公开文献全部纳入本发明中。

本申请要求申请日为2009年6月19日的US61/218742的优先权，它的全部内容通过引用纳入本文。

引入到这里作为参考文献测定这些培养物，保证小。个体组织碎片置于包    本说明书所包括的任何文献、技术、材料、设备、文章等仅用于为本发明提供背景。而并不承认任何或者全部的这些事项可以构成现有技术的部分或成为本发明的相关领域的公知常识，这是因为它们存在与本申请所有权利要求的优先权日之前。

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                         序列表

 

<110>  迈特马耳他高级技术有限公司

       联邦科学与工业研究机构

 

<120>  病毒试验

 

<130>  509421

 

<150>  US 61/218,742

<151>  2009-06-19

 

<160>  13   

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  1027

<212>  DNA

<213>  甲型流感病毒

 

<400>  1

agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgtact       60

 

ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt      120

 

tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct      180

 

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catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc      360

 

caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata      420

 

caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga      480

 

acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaatccact      540

 

aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat      600

 

ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctagacaaat      660

 

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tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa      780

 

gtgatcctct cactattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgaca ttgtggattc      840

 

ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc      900

 

cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg      960

 

ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt     1020

 

ttctact                                                               1027

 

 

<210>  2

<211>  101

<212>  DNA

<213>  人造的

 

<220>

<223>  M 基因扩增子

 

<400>  2

agatgagtct tctaaccgag gtcgaaacgt acgtactctc tatcatcccg tcaggccccc       60

 

tcaaagccga gatcgcacag agacttgaag atgtctttgc a                          101

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人造的序列

 

<220>

<223>   shRNA靶向的PB1序列

 

<400>  3

gatctgttcc accattgaa                                                    19

 

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人造的序列

 

<220>

<223>  寡核苷酸引物

 

<400>  4

tgggatcatg tgtttcctgc ta                                                22

 

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人造的序列

 

<220>

<223>  寡核苷酸引物

 

<400>  5

gaaaatccat gttctcagat gcaa                                              24

 

 

<210>  6

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人造的序列

 

<220>

<223>  荧光探针

 

 

<220>

<221>  FAM

<222>  (1)..(1)

<223>  5' FAM 染料

 

<220>

<221>  MGBNFQ

<222>  (16)..(16)

<223>  3' MGBNFQ

 

<400>  6

cacatgaccc ctcgtc                                                       16

 

 

<210>  7

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人造的序列

 

<220>

<223>  寡核苷酸引物

 

<400>  7

cgacgatgac tctctactgt gtgat                                             25

 

 

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人造的序列

 

<220>

<223>  寡核苷酸引物

 

<400>  8

tcatcagtgt cgccatgctt                                                   20

 

 

<210>  9

<211>  14

<212>  DNA

<213>  人造的序列

 

<220>

<223>  荧光探针

 

 

<220>

<221>  FAM

<222>  (1)..(1)

<223>  5' FAM染料

 

<220>

<221>  MGBNFQ

<222>  (14)..(14)

<223>  3' MGBNFQ

 

<400>  9

acggtggatc tttc                                                         14

 

 

<210>  10

<211>  966

<212>  DNA

<213>  传染性的鲑鱼贫血病毒

 

<400>  10

tacaaagaaa atgttcagaa catgtctgga tttaacttcg aggtaatggt gccggaacaa       60

 

ggaggaaaag tggtcttcag ccttactgaa acggggtcat gtgtctcgtt ttacggagat      120

 

gatgaaccag gtgaagggtc ctgcgaactt gcctctgaaa acatggattt tccaagttgt      180

 

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cacacttgcc cagacgagta caagttcagt gacaaggacg agatgcaggg atactatgag      420

 

gaatgtctag aggcttctac tgacattttc cttgatgaac ttgctactgt tgttacaggt      480

 

ggcttctttc ctgtcggact caaaggttcc tggggaggat ggtacctcaa gtacgtcagg      540

 

tatgctggac ctcttgcggg atcaagtgga ttcattgtca atcaacgatt ctacgacaga      600

 

gcccaaaaca agactggatc cagggttgta tccatggttg aaatggacgg agacggctta      660

 

tcgttcatct acgagaagcc tagcgtctac catagtgatg ggtgcactgg ttcagcagcg      720

 

aggttctgga aacgggatca caatgagaga gctggagttg agcttagggc tggacttcac      780

 

ttcagaatgt gattggttga aaacttgtta tgtaaacaag aattttgtgt ttttgtcaga      840

 

aaaagaaatt gctgtaaaca tggaagttga aaaattcatt tgtaatgaga actaaagatg      900

 

tctttgtgtt caaattttaa ctaatgacaa tatatgaaat atgtcgtaca tggtgttgat      960

 

gataat                                                                 966

 

 

<210>  11

<211>  736

<212>  DNA

<213>  传染性的鲑鱼贫血病毒

 

<400>  11

tgcaaagatt ggctatctac catgcatgag agaagcaaac ccaaaaccac gggagctgat       60

 

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ggcaatggtg tatggtatga tttcacccga catggcagag gagaagacga tgctgaagga      420

 

gctgaaaaca atgctacaca gcaggatgca gatgtatgct ctgggtgcaa gttcgaaagc      480

 

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caataaaatc actagt                                                      736

 

 

<210>  12

<211>  81

<212>  DNA

<213>  传染性的鲑鱼贫血病毒

 

<400>  12

tgggatcatg tgtttcctgc tacggggacg acgaacctga cgaggggtca tgtgaacttg       60

 

catctgagaa catggatttt c                                                 81

 

 

<210>  13

<211>  63

<212>  DNA

<213>  传染性的鲑鱼贫血病毒

 

<400>  13

cgacgatgac tctctactgt gtgatgaaag atccaccgtc tggaagcatg gcgacactga       60

 

tga                                                                     63

 

 

Claims (49)

1.一种用于测定受试者对于病毒的敏感性的方法，所述方法包含：将从受试者中获得的组织样品与病毒接触，培养所述组织样品足够的时间用于病毒复制，和检测在组织样品中是否存在病毒。

2.一种用于检测在源自受试者的组织样品中的病毒复制的方法，所述方法包含：将从受试者中获得的组织样品与病毒接触，培养组织样品足够的时间用于病毒复制，和检测在组织样品中是否存在病毒。

3.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包含在培养样品足够时间用于病毒复制之前，去除没有附着于在所述组织样品中细胞的病毒。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中病毒的存在表明对于病毒的敏感性。

5.如在前权利要求中任一项所述的方法，其进一步包含将样品中的病毒复制的水平与对照样品比较。

6.如权利要求5所述的方法，其中与对照样品相比，在组织样品中的病毒的水平减小表明对于所述病毒的降低的敏感性。

7.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是鸟类。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述受试者是家禽。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述受试者是鸡。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述组织样品包含皮肤、羽髓、垂肉、鸡冠或者血液。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述样品包含皮肤。

12.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述受试者是鱼。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述受试者是鲑鱼属鱼。

14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述样品包含鳍、鳃或者皮肤。

15.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中检测在组织样品中是否存在病毒包含从组织样品中分离核酸。

16.如权利要求15所述的方法，其进一步包含试图扩增来自所述分离核酸的病毒核酸。

17.如权利要求15或16所述的方法，其中所述核酸是RNA。

18.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒选自流感病毒、新城疫病病毒、鸡贫血病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、口蹄疫病毒、猪生殖和呼吸综合症病毒、猪瘟病毒、蓝舌病病毒、阿卡斑病毒、传染性的鲑鱼贫血病毒、传染性造血坏死病病毒、病毒出血性败血病病毒和传染性胰脏坏死病病毒。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述甲型流感病毒是甲型禽流感病毒。

22.如权利要求19至21中任一项所述的方法，其中扩增的所述病毒核酸是流感病毒的M基因的区域。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述病毒核酸包含序列号1的至少15个连续的核苷酸。

24.如权利要求23所述的方法，其中所述病毒核酸包含序列号2。

25.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中所述病毒是与组织样品接触大约15分钟至大约2小时。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述病毒是与组织样品接触大约1小时。

27.如在前权利要求任一项中所述的方法，其中所述方法包含培养组织样品大约1小时至大约48小时。

28.如权利要求27所述的方法，其中培养所述样品大约48小时。

29.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中培养是在大约37℃下进行。

30.如权利要求18所述的方法，其中所述病毒是传染性的鲑鱼贫血病毒。

31.如权利要求30所述的方法，其中扩增的病毒核酸是传染性的鲑鱼贫血病毒的片段7或片段8的区域。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述病毒核酸包含序列号10或序列号11的至少15个连续的核苷酸。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述病毒核酸包含序列号12或序列号13。

34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述病毒是与组织样品接触大约15分钟至大约3小时。

35.如权利要求25所述的方法，其中所述病毒是与组织样品接触大约1.5小时。

36.如权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述方法包含培养所述组织样品大约1天至大约10天。

37.如权利要求27所述的方法，其中所述方法包含培养所述组织样品在大约3天至大约10天。

38.如权利要求30至37中任一项所述的方法，其中培养在大约15℃下进行。

39.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中从所述受试者获得的组织样品与所述病毒接触，和/或培养所述组织样品足够时间用于病毒复制是在包含大约5％的CO₂的湿润气氛下进行。

40.如在前权利要求中任一项所述的方法，其中组织样品包含转基因细胞。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述转基因细胞包括编码dsRNA分子的转基因。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述dsRNA分子是shRNA分子。

42.如权利要求41或者42所述的方法，其中所述dsRNA分子包含病毒核酸序列。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述病毒核酸序列是甲型流感核酸序列。

44.一种用于鉴定动物的方法，所述动物具有对于病毒的降低的敏感性，所述方法包含

(i)进行权利要求1至43中任一项所述的方法，和

(ii)鉴定具有对于病毒降低的敏感性的动物。

45.一种用于繁殖动物的方法，所述方法包含

(i)进行权利要求1至44中任一项所述的方法；

(ii)选择具有对于病毒降低的敏感性的动物；和

(iii)由所述动物繁殖。

45.如权利要求44所述的方法，其进一步包含

(i)选择具有对于病毒降低的敏感性的第一性别的第一种动物；和

(ii)选择具有对于病毒降低的敏感性的相反性别的第二种动物；和

(iii)使第一和第二种动物交配以产生后代。

46.一种用于进行权利要求1至43中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测所述病毒的工具。

47.如权利要求46所述的试剂盒，其包含至少一种核酸分子，所述核酸分子在严格条件下与病毒核酸杂交。

48.如权利要求47所述的试剂盒，其中所述至少一种核酸分子是用于扩增病毒核酸的引物。

49.如权利要求46至48中任一项所述的试剂盒，其进一步包含病毒的样品。

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