JP3128133B2 - 豚の奇病の原因体であるレリスタドエイジェント、それを含むワクチン組成物、豚の奇病の診断キット及び診断方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、豚の奇病（Mystery Swine Disease:MDS）
の原因物質の単離、特性調査および利用に関する。本発
明は、この病気の原因物質の発見およびゲノム組織とゲ
ノムヌクレオチド配列とゲノムによってコード化された
蛋白質の決定に伝染病、特にMSDの予防と診断およびワ
クチン組成物と診断器具の準備、MSDまたは他の病原菌
による病気に利用される。

技術の背景 1991年の冬と早春に、オランダの養豚業は、子を産む
雌豚の間で新しい病気の驚くべき発生に出会った。多く
の雌豚は食欲不振を示した。あるものは妊娠中（110日
の期間）に流産、死産またはミイラ化した胎児を生ん
だ。またあるものは、発熱した。時々青みがかった耳を
もった雌豚が見付かった。このため、この病気は一般に
「流産青」と名付けられた。雌豚におけるこの病気は、
しばしば呼吸困難と生んだばかりの子豚の死とを伴っ
た。そして、呼吸困難と加齢子豚と肥育豚との生育遅延
を引き起こした。

この家畜流行病の原因は知られていなかったが、症状
は1990年以後ドイツで起こった奇妙な病気に似ており、
アメリカの中西部やカナダで1987年に見られたいわゆる
MSDに似ている（Hi11,1990）。他の種々な名前がこの病
気のために用いられ、ドイツでは「豚の流行性手遅れ流
産」として知られ、北米では「豚の奇病」、「奇妙な繁
殖症候群」、「豚のやせた呼吸器症候群」として知られ
ている。北米でLoulaは1990年に一般には臨床表示次で
次のように述べている。

１）親も子も病気の家畜は食物を食べない ２）流産、死産、病弱豚、ミイラ化した胎児 ３）分娩後の呼吸の問題 ４）生殖の問題 原因物質は、まだ同定されていないが、脳心筋炎ウイ
ルス（EMCV），豚のパルボウイルス（PRV），疑似狂犬
病ウイルス（PRV），豚インフルエンザウイルス（SI
V），牛ウイルス性下痢ウイルス（BVDV），雄豚コレラ
ウイルス（HCV），豚腸内ウイルス（PEV），インフルエ
ンザ様ウイルス，クラミジア菌、レプトスピラ菌が全て
原因物質として挙げられる（Loula,1990;Mengeling and
Lagler,1990;その他）。

発明の概要 本発明は、豚の奇病（MSD）の原因体であり、 寄託番号Ｉ−1102として、フランス、パリ、パスツー
ル研究所に1991年６月５日に寄託されたレリスタドエイ
ジェントの単離株（CDI−NL−2.91）に実質的に相当
し、 接種されてから25〜33日後の豚から採取された血清抗
体で免疫反応性を有し、クロロホルムに鋭敏であり、20
0nmよりも小さいウイルスから成ることを特徴とする単
離されたレリスタドエイジェントである。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントが殺され
たことを特徴とする。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントが弱毒化
されたことを特徴とする。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに由来す
る遺伝子が組込まれたことを特徴とする組換えベクタで
ある。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに由来
し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコードされた
蛋白質の少なくとも１つに対応することを特徴とする単
離されたかまたは合成された蛋白質あるいはポリペプチ
ドである。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに由来
し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコードされた
蛋白質の少なくとも１つに対応することを特徴とする単
離されたかまたは合成された核酸である。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントのゲノム
に対応したヌクレオチド配列から成ることを特徴とする
組換え核酸である。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに由来
し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコードされた
蛋白質の少なくとも１つから選ばれたヌクレオチド配列
から成ることを特徴とする組換え核酸である。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントの蛋白質
に対応するアミノ酸配列を有し、適当な組換えDNAで、
遺伝子工学によって生産し得る細胞で製造されることを
特徴とするポリペプチドである。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに由来
し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコードされた
少なくとも１つの蛋白質に相応するアミノ酸配列を有
し、適当な組換えDNAで、遺伝子工学によって生産し得
る細胞で製造されることを特徴とするポリペプチドであ
る。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントの成分を
特異的に認識することを特徴とする単離されたかまたは
合成された抗体である。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに対応す
る蛋白質または抗原性ペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列から成る核酸を含むことを特徴とする組換えベク
タである。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに由来
し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコードされた
少なくとも１つの蛋白質または抗原性ペプチドをコード
するヌクレオチド配列から成る核酸を含むことを特徴と
する組換えベクタである。

また本発明は、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好
ましくは豚類をMSDから保護するためのワクチン組成物
であって、前記レリスタドエイジェント、および適当な
担体またはアジュバントから成ることを特徴とするワク
チン組成物である。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントが殺され
たことを特徴とする。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントが、弱毒
化されたことを特徴とする。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに由来す
る蛋白質または抗体ペプチドをコードするヌクレオチド
配列から成る核酸を含むことを特徴とする。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントの抗体部
分または成分から成ることを特徴とする。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに由来す
る蛋白質もしくは抗原性ポリペプチドから成ることを特
徴とする。

また本発明は、動物、好ましくは哺乳動物、さらに好
ましくは豚類を病原菌によって起こる病気から保護する
ためのワクチン組成物であって、 前記組換えベクタと、 病原菌に由来する蛋白質または抗原性ペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列から成る組換えベクタの核酸
と、 適当な担体またはアジュバントとから成ることを特徴
とするワクチン組成物である。

また本発明は、試料中、特に、動物、好ましくは哺乳
動物、さらに好ましくは豚類から得られた血清、喀痰、
唾液または組織などの生物試料中から前記レリスタドエ
イジェントに対応する核酸を検出するための診断キット
であって、前記レリスタドエイジェントのゲノムに対応
したヌクレオチド配列から成る核酸プローブまたはプラ
イマーと、核酸検出アッセイのための適切な検出手段と
から成ることを特徴とする診断キットである。

また本発明は、試料中、特に、動物、好ましくは哺乳
動物、さらに好ましくは豚類から得られた血清、喀痰、
唾液または組織などの生物試料中から前記レリスタドエ
イジェントに由来する抗原を検出するための診断キット
であって、レリスタドエイジェントの一部または成分を
特異的に認識する抗体と、抗体検出アッセイのための適
切な検出手段とから成ることを特徴とする診断キットで
ある。

また本発明は、試料中、特に、動物、好ましくは哺乳
動物、さらに好ましくは豚類から得られた血清、喀痰、
唾液または組織などの生物試料中から前記レリスタドエ
イジェントを特異的に認識する抗体を検出するための診
断キットであって、前記レリスタドエイジェントに対応
する抗原性部分または成分と、抗体検出アッセイのため
の適切な検出手段とから成ることを特徴とする診断キッ
トである。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントに本質的
に相応する抗原性部分または成分が、レリスタドエイジ
ェントに対応する蛋白質もしくは抗原性ポリペプチドま
たはレリスタドエイジェントの抗原性成分に類似するペ
プチドであることを特徴とする。

また本発明は、前記レリスタドエイジェントが、殺さ
れたか、生きているか、または弱毒化されたことを特徴
とする。

また本発明は、ヒトを除く動物、好ましくはヒトを除
く哺乳動物、さらに好ましくは豚類がMSDの原因体に感
染されているかどうかを検査する方法であって、動物に
由来する試料、特に血清、喀痰、唾液または組織などか
ら調整された生物試料が、前記レリスタドエイジェント
の核酸、レリスタドエイジェントの抗原またはレリスタ
ドエイジェントを特異的に認識する抗体を含むかどうか
を検査する方法である。

発明の詳細な説明 本発明は、中央獣医研究所（CVI）とオランダにおけ
る地方動物健康サービス所（RAHS）との新しいMSDの原
因を見付けるための共同研究の成果である。新しい病気
によって影響を受けた養豚家は、RAHSの獣医を訪れた。
病気の豚、その標体、急性の病気で回復期に得られた雌
豚の血清が、RAHSとCVIとにウイルスを単離するために
送られた。影響を受けた雌豚の１組の血清が、10個の知
られた豚ウイルスに対する抗体のためにテストされた。
３つの異なったウイルス、脳心臓炎ウイルス、２型豚腸
内ウイルスおよび７型豚腸内ウイルスと知られていない
LAが単離された。病気になったと思われる雌豚は、たい
ていLAに、そして他のウイルスまたはよく知られたウイ
ルス性病原菌に血清変成されていた。MSDを実験的に増
殖するために、８頭の妊娠豚が妊娠84日にLAを接種され
た。１匹の豚は、妊娠109日で７匹の子豚と４匹の非常
に弱い子豚を出産した。しかし４匹の子豚は出産後１日
で死んだ。第２の雌豚は、116日で３匹のミイラ化した
胎児と６匹の死んだ子豚と３匹の生きた子豚を出産し
た。そのうちの２匹は出産後１日以内に死んだ。第３の
雌豚は、117日で２匹のミイラ化した胎児と８匹の死ん
だ子豚と７匹の生きた子豚を出産した。他の雌豚は、11
5日で分べんしたが、繁殖損失を避けられなかった。出
産時における８匹の雌豚から出産した生きた子豚の平均
数は、7.3匹であり、死産子豚の平均数は4.6匹であっ
た。LAに対して処理された抗体は、出産後授乳前の子豚
の10〜42血清試料で検出された。LAは、出産後短時間で
死んだ３匹の子豚から単離された。これらの結果、LAが
MSDの原因となる物質であると結論された。

LAは、豚の肺のマクロファージ中で細胞変成効果で生
育し、免疫パーオキシターゼ単層検索法（IPMA）中で、
傷をつけることによって、豚c829とb822の後感染血清ま
たは表５でリストされるSPF豚の他の後感染血清で、同
定され得る。LAに対する抗体は、IPMA中で間接的に傷を
つけられる処理によって同定され得る。LAは、テストさ
れた細胞組織中では生育しない。LAは一致した血清によ
って、または知られたウイルス（表３）のセットに対し
処理された血清によって無効にされない。LAは、テスト
された赤血球細胞で血球凝集しない。LAは200nmより小
さく、この大きさの孔径を有するフィルターで透過す
る。LAはクロロホルムに鋭敏である。上の結果からLA
は、あるウイルスグループまたは他の微生物に属するも
のとしてまだ同定されていない。それはフランスのパス
ツール研究所に1991年６月５日に寄託番号Ｉ−1102で寄
託された。

LAのゲノム組織ヌクレオチド配列とそれらから誘導さ
れたポリペプチドとは、ここに発見された。他のこれら
を集めたデータは、LAの分類を正常化した（以後レリス
タドウイルスをLVと呼ぶ）。これらは新しい動脈留ウイ
ルス属のメンバーである。この新しい属の原型ウイルス
として、我々は、ゲノムとゲノム組織の転写に関するデ
ータが利用できるようになった新属の最初のメンバーで
ある馬動脈留ウイルス（EAV）を提案する（de Vries et
al.,1990およびその他文献）。乳酸脱水素酵素活性化
ウイルス（LDV;Godeny et al.,1990）のためにこれを利
用することによって我々の配列データの比較の基礎とし
て、我々はLDVが動脈留ウイルス属のメンバーであるこ
とを提案する。

動脈留ウイルスのゲノム組織と転写方法が与えられ
て、この新しいウイルス属をコロナウイルスの上科にお
くことが認められた（Snijder et al.,1990a）。

動脈留ウイルスの第１の攻撃目標は、宿主のマクロフ
ァージ細胞であることは普通である。LDVの模倣物の宿
主は、マウス中のマクロファージ細胞に限定されること
が示される。マクロファージ細胞のためのこの厳格な性
質が、EAVとLVのためにまだ解決されない。

動脈留ウイルスは、直径45〜60nmの球状粒子であり、
20面体のヌクレオキャプシドを含む（Brinton−Darnell
and Plagemann,1975;Horginek et al.,1971;Hyllseth,
1973）。

動脈留ウイルスのゲノムは、約12〜13キロベース（k
b）の大きさを有する正のより合わされたポリアデリル
化されたRNA分子から成る（Brinton−Darnell and Plag
eman,1975;van der Zeijst et al.,1975）。

EVAは６個のサブゲノムｍ−RNAの３セットを介して複
製され、ソーダ配列から成る0.8〜3.6kbの大きさで、３
つの端末配列に結合されたゲノムRNAの５つの端末から
誘導されて並ぶ（de Vries et al.,1990）。

ここで我々は、ゲノム組織とLVの複製方法がEVA、す
なわちコロナウイルスとトロウイルスとに類似であるこ
とを示す。しかるに、後者のウイルスのゲノムの大きさ
がLVとEVAのサイズから完全に異なっている。

LVのゲノムは、（天然のアガローズゲルの上に見積も
られて）長さで約14.5〜15.5kbのゲノムRNA分子から構
成される。それはサブゲノムRNAの３セットを介して複
製される。サブゲノムRNAは、まだ知られていない長さ
でゲノムRNAの５つの端末から誘導され、ゲノムRNAの３
つの端末から誘導される体配列に融合されるリーダ配列
を構成する（図２）。

LVのゲノムRNAのヌクレオチド配列は、重なったｃ−D
NAクローンから決定される。15,088bpの連続配列は、LV
の完全なゲノムを近似的に覆って得られる（図１）。こ
の配列で８つの開放読取り枠は、ORF1A,ORF1BおよびORF
2〜７に同定される。

ORF1AとORF1Bは、ウイルス複製またはポリメラーゼで
コード化して予言される。ORF2〜６は、蛋白質を結合し
たウイルス団の構成をコード化して予言される。ORF7
は、ウイルス・ヌクレオキャプシド蛋白質の構成をコー
ド化して予言される。

LVのORF6とORF7の生産は、各LDVのVpXとVp1で重大な
類似点を示しているので、ORF6と７との配列はまたLVの
抗原ウイルス中で高く保存される。

図１の完全なヌクレオチド配列と、ORF1〜７によって
コード化された配列と蛋白質産物と、図１の配列中に位
置する可能性のある他のORFとは、ワクチンの製造のた
めと診断器具の製造のために適合される。すべての可能
なやり方は、当業者によく知られている。

LAすなわちMSDの原因物質を明確に同定することは可
能であるので、豚がLAで汚染されているかどうかがテス
トされ得る。このような診断テストは今まで用いられな
かった。

このテストは、マクロファージ中、またはLAが生育す
るであろう他の細胞の培養システム中でウイルス同定に
よって（伝染後の血清c829またはb822のような）LAに対
して処理される抗体で汚染された培養器に植付けて行わ
れ得る。しかし診断テストの他の型のものを製造して用
いることは実行できる。

たとえば、直接または間接に免疫組織学的汚染技術、
すなわちイソシアネイトのような蛍光化合物で、または
ホースラディシュ・パーオキシダーゼのような酵素で標
識をつけられたLAに処理された抗体を用いることは可能
である。これらの技術は、MSDを有する疑いのある豚か
ら組織断面または他の試料中にLA抗原体を支配させて用
いられ得る。このテストのために必要な抗体は、c829も
しくはb822またはLAに対し処理されるポリクロナル抗体
である。しかし、LAに対し処理されるモノクロナル抗体
もまた用いられる。

天然とLAのゲノムの組織とこのゲノムのヌクレオチド
配列とは、決定されるので、LA種のヌクレオチド配列は
同定され、オリゴヌクレオチド配列を作るために、また
異種混合と、ポリメラーゼ連鎖反応と、ヌクレオチド酸
配列とを特別に支配して製造されるその他の技術のよう
な診断技術中の試料として用いられる。

LAに対して処理された抗体のためにテストすることは
可能である。表５はLAに対する抗体を、速やかに作った
実験的に汚染された豚を示す。表４はLAに対応する強い
抗体を有する飼育の豚を示す。豚がこれまでにLAで汚染
されたかどうかを決定することがまたできる。このよう
なテストは、豚または豚の群または豚の集団またはすべ
ての地域もしくは国における豚が、LAに感染していない
かどうかを決定するのに最も重要なことである。テスト
は、前記のようにIPMAを用いて行われる。しかしLAに対
して処理された抗体の検出のために診断テストの他の型
式を用いることは可能である。

LA種の蛋白質、ポリペプチドおよびLAの抗原に類似の
ペプチドまたはペプチド配列は、このようなテストで用
いられる。このような蛋白質は、LAそれ自身から誘導さ
れるが、再結合DNAまたはペプチド合成技術によってこ
のような蛋白質を作ることはまた可能である。これらの
テストは、LAに対して処理された特別のポリクロナール
および／またはモノクロナール抗体またはLAの特別の成
分を用いることができる。また、LAで汚染された細胞組
織またはLA抗原を表す細胞組織も用いることができる。
抗体は、たとえば（LA抗原が抗体によって束縛された後
に、固体表面が抗体で覆われて）LA抗原を同定する方法
として用いられる。そしてLA抗原はテストのより高い特
性を導き、（試料中の標識を付された抗体と未知の抗体
が利用し得るLAの抗原のために比較する）比較分析計に
用いられる。

さらに上述の診断の可能性は、哺乳動物、鳥類、昆虫
類もしくは魚類のような他の動物または植物や他の生物
が、LAまたは関連のある物質で将来汚染されるか、現に
汚染されるか、過去に汚染されたかをテストするのに利
用される。

LAは今やMSDの原因物質として同定されているので、
この病気に対して豚を保護するワクチンを作ることがで
きる。このようなワクチンは、豚の肺のマクロファージ
またはLAが生育する他の細胞組織で、LAを培養すること
によって作られる。LAは、精製されまたはそのままで、
ホルマリンまたは紫外線で不活性化されるような従来技
術で殺される。不活性化LAは、フロイントの免疫助成
剤、水酸化アルミニウムなどのような免疫助成剤と結合
され、この組成物は豚に注射される。

不活性ワクチンは、また培養器で汚染されたLAから誘
導され、またはDNA再結合を介してLA蛋白質を特別に表
現した細胞組織から誘導されるLA蛋白質調整品で作られ
る。このようなLAのサブユニットは上述のように取扱わ
れ、サブユニットワクチンとして効果がある。

ポリペプチド、ペプチド、LAの抗原成分に類似したペ
プチドのような、LAのより少ない成分を用いるワクチン
は、また不活性ワクチンとして使用が有効である。

MSDに対する不活性ワクチンは、LAのゲノムまたはLA
の部分が牛痘ウイルス，ヘルペスウイルス，疑似狂犬病
ウイルス，アデノウイルス，バキュロウイルスまたは適
当な細胞組織中でLA抗原を表すことができるような他の
適当なベクタ組織中に組み入れるような再結合DNA技術
によっても作られる。これらの組織からのLA抗原は、上
述のワクチンを作るために用いられ、この製品で予防接
種された豚は、LA抗原に対して予防免疫を発揮する。

MSDに対するワクチンは、またLAの生体標本に基づ
く。子豚と妊娠した雌豚は、LAの汚染によって本気で恐
れられているように思える。より加齢した子豚または授
精したことのない雌豚のためのワクチンとして、豚の肺
のマクロファージ中で培養した弱体化しないLAを用いる
ことが可能である。この方法で雌豚は妊娠する前にMSD
に対して保護され得る。その結果流産と死産に対して、
また子豚の先天的な汚染に対して保護する。またこれら
の予防接種された雌豚が彼らの子孫に与える抗体物質
は、この病気に対しその子孫を保護する。

MSDに対する弱体化されたワクチン（弱毒性ワクチ
ン）は、豚の肺のマクロファージ中で、または他の細胞
組織中で、または兎のような他の動物中で連続的に変化
させることで製造される。

MSDに対する生ワクチンは、LAのゲノムまたはLAの部
分が牛痘ウイルス，ヘルペスウイルス，疑似狂犬病ウイ
ルス，アデノウイルスまたは適当な細胞組織中でLA抗原
を表すことができるような他の適当なベクタ組織中に組
み入れるような再結合DNA技術によって作られる。この
ような生ワクチン組織で予防接種された豚は、LAに対し
て予防免疫を発揮する。

LAはそれ自身、生ワクチン用ベクタ組織として用いる
ことが特に適している。外国の遺伝子は、LAのゲノムの
中に挿入され、マクロファージの汚染の間に対応する蛋
白質を表すことができる。抗原が存在する細胞は、外国
の抗原を加工処理し、適当な免疫反応で応答するＢ−リ
ンパ球とＴ−リンパ球にそれを変える。

LAは非常に特殊な細胞で、また非常に特殊な種である
のでこのベクタ組織は非常に安全な組織であり、他の細
胞または種に害を与えることはない。

図面の簡単な説明 図１は、LVゲノムのヌクレオチド配列を示す。同定さ
れたORFの推論されるアミノ酸配列を示す。（推定され
る）ATGの出発位置によってコード化されたメチオニン
を太字で示し、推定上のＮ−グリコシド化の位置は下線
が付されている。異なったｃ−DNAクローンを配列する
ことによって同定されるようにヌクレオチドとアミノ酸
配列中に相違が示される。雑種の表現（図２と結果の項
とを参照）で用いられるプライマ25のヌクレオチド配列
もまた下線が付されている。

図２は、LVゲノムの組織を示している。ヌクレオチド
配列の決定に用いられるｃ−DNAクローンは、図の上の
部分で示される。配列されたクローンの部分は、黒く示
される。図の下の部分で、ヌクレオチド配列で同定され
たORFとこれらのORFをコード化したｍ−RNAのサブゲノ
ムセットとが示される。ORF中のダッシュは、これらのO
RFの種々の最初の位置を示す。ゲノムまたはサブゲノム
RNAのリーダ配列は、黒四角で示される。

図３は、LA成長の下記の特性を示す。

白四角は、細胞フリーのウイルス 黒四角は、細胞と結合したウイルス 実線は、細胞変成効果（CPE）の百分率 物質と方法 試料収集 試料となる豚は、MSDに感染した群が存在すると思わ
れる養豚場から収集される。MSDで汚染されている養豚
場を選択するための重要な基準は、雌豚が餌を食べな
い、流産と死産が生じている弱い子孫、呼吸器病、そし
て生まれたばかりの子豚の死である。豚の４グループか
らの試料は、次のように調整される。

（１）野性の汚染された子豚からの組織試料と口のまわ
りを拭き取った唾液（表1A） （２）野性の汚染された雌豚からの血液試料と口のまわ
りを拭き取った唾液（表1Bと４） （３）組織試料、鼻を拭き取った鼻水および血液試料と
原野で汚染された雌豚と接触することによって実験的に
汚染された元来は、病原菌を持っていない（SPF）豚か
ら集めた組織試料、鼻を拭き取った鼻水および血液試料
（表２と５） （４）原野で汚染された雌豚の血液試料を接種すること
によって実験的に汚染された元来は病原菌を持っていな
い（SPF）豚から集めた組織試料、鼻を拭き取った鼻水
および血液試料（表２と５） 試料標本 ウイルス同定のための試料は、MSDを持っていること
が憶測される実験地の子豚と雌豚とから、および実験的
に汚染されたSPF豚と雌豚およびその子豚とから得られ
る。

組織試料は、クリオスタット，ミクロトームの上で切
断し、種々の豚の病原菌に対して処理された処理物で直
接免疫蛍光テスト（IFT）のためにその断面が提供され
る。

組織試料の10％懸濁液は、抗生物質を補われたHank's
BSS中へ入れられる。また口と鼻を拭き取った唾液と鼻
水のは、抗生物質を補われたHank's BSSに浸される。室
温で１時間放置した後、懸濁物は、10分間6000Gで遠心
分離され、表面に浮かんだものは、さらに先で用いるた
めに−70℃で貯蔵される。白血球分離物はEDTAで単離さ
れ、ペパリン血は、従来に記されているように（Wensvo
ort and Terpstra,1988）分離され、そして−70℃で貯
蔵される。血漿とウイルスを単離するための血清はまた
−70℃で貯蔵される。

血清免疫のための血清は、MSDの激しい病状にあると
憶測される雌豚から得られる。一対の血清は３〜９週間
後に取出される。さらに血清は、実験的に汚染されたSP
Fから一定の間隔で取出され、乳汁と血清は実験的に汚
染された雌豚とその子豚から取出される。血清は、血清
学のために−20℃で貯蔵される。

細胞 豚の肺のマクロファージは、５〜６週のSPF豚の肺か
らまたは中央獣医学研究所自身の家畜群から成長したSP
F雌豚の肺から得られる。肺は、５〜８回、塩で緩衝さ
れたリン酸（PBS）で洗浄される。洗浄液の各部分は、
集められ、10分間300Gで遠心分離される。この結果でき
た細胞のペレットは、再度PBSで洗浄され、細胞培養（2
0mlの2.95％トリプトーズリン酸、20mlの牛の胎児の血
清（FBS）と4.5mlの1.4％炭酸ナトリウムから成る溶媒1
99の160mg）中で４×10⁷細胞/mlの濃度で再度懸濁させ
られる。細胞懸濁液は、DMS0混合物（上記媒体の6.7ml,
1.3mlのFBS,97％のデメチルスルホキシドの2ml）の同容
積とゆっくりと混ぜられ、2mlのアンプル中に分割さ
れ、液体窒素中で貯蔵される。

１つのアンプルからのマクロファージは、Earle's ME
M中で２回洗浄することで細胞培養に準備され、30mlの
培養液（10％のFBS,200単位/mlのペニシリン,0.2mg/ml
のストレプトマイシン,100単位/mlのマイコスタチンお
よび0.3mg/mlのグルタミンを懸濁させたEarle's MEM）
中で再懸濁させる。PK−15細胞（アメリカ型培養集団CC
L33）とSK−６細胞（Kasga et al.,1972）は、Wensvoor
t et al.,によって記述されているように培養される（W
ensvoort et al.,1989）、第２の豚の腎臓（PK2）細胞
は、Earle's MEM中で培養され、10％FBSと上記抗生物質
とで懸濁化される。すべての細胞は、37℃と５％CO₂雰
囲気の細胞培養器中で培養される。

ウイルス単離の手順 ウイルス単離は、PK2,PK−15およびSK−６細胞と豚の
肺のマクロファージを用いてすでに確立されている技術
に従って行われる。前者の３種の細胞は、25mlのフラス
コ中で培養され（Greiner）単分子層が70〜80％の密集
成長に達すれば、テスト試料を植え付ける。マクロファ
ージは、96−ミクロタイタ−プレート中に100μｌづつ
分取して（Greiner）、または適当なフラスコ中でより
大容量に培養され、培養後１時間以内にテスト試料を植
え付ける。培養器は、細胞変成効果（CPE）のために毎
日観察され、50〜70％CPEが達せられ、または培養の５
〜10日後まで−70℃に冷凍する。さらに継代物は、継代
２および３またはそれ以上の冷凍を融解した物質で作ら
れる。試料はまた９〜12日の雛化鶏卵中に植え付けられ
る。尿嚢液は、３日の培養間隔で２回定期的に植え付け
され、第３の継代の収穫は、雛鶏の赤血球を用いて４℃
で血球凝集反応によってまたインフルエンザＡウイルス
の核蛋白を特別に検出するELSAによって試験される（De
Boer et al.,1990）。

血清学 血清は、脳炎ウイルス（HEV）とMasurelの処方に従っ
た豚インフルエンザウイルスH1N1,H3N3との血球凝集に
対する抗体の製造を研究するための血球凝集阻止反応
（HAI）テスト中にテストされた（1970）。HAI中の血清
の最初の希釈は、1:9であり、その後２倍に希釈され
る。

血清は、疑似狂犬病ウイルス（PRV;Van Oirschot et
al.,1988）、豚のポルボウイルス（PPV;Westenbrink et
al.,1989）、牛のウイルス性下痢ウイルス（BVDV;West
enbrink et al.,1986）および雌豚コレラウイルス（HC
V;Wensvoort et al.,1988）の糖蛋白質に対する抗体の
ための確立された酵素結合イムノソルベント検定法（EL
ISA）中でテストされた。ELISA中の最初の希釈は、1:5
であり、その後血清は２倍に希釈された。

血清は、Terpstra（1978）の処方に従って脳心筋ウイ
ルス（EMCV）、豚の腸内ウイルス（PEV）およびLAの30
〜300TCID₅₀に対する抗体を中和するためにテストされ
た。血清中和テスト（SNT）中の血清の最初の希釈は1:5
であり、その後血清は２倍に希釈された。

血清は、免疫パーオキシターゼ単層検定法（IPMA）で
LAと結合するためのテストがされる。LA（コードCDI−N
L−2.91）は、新たに植え付けられた肺マクロファージ
を含むミクロタイタープレートの穴に100TCID₅₀LAを含
む培養液50mlを加えることによってミクロタイタープレ
ート中に植え付けられる。細胞は２日間培養されその
後、述べたように（Wensvoort,1986）同定される。テス
ト血清は、0.15M NaCl、0.05％トゥイーン界面活性
剤、80.4％馬血清中で1:10に希釈され、さらに４倍に希
釈され、穴に加え、37℃で１時間恒温にされる。羊対豚
の免疫グロブリン（Ig）は、ホースラディッシュパーオ
キシダーゼ（HRPO,DAKO）に接合され、同じ緩衝液中で
希釈され、37℃で１時間恒温にして用いられ、その後プ
レートは記述された（Wensvoort et al.,1986）ように
染色される。汚染されたマクロファージの細胞質の強い
着色赤は、LAに血清が結合したことを示す。

ウイルス同定の手順 単離された細胞変成の同定は、CsCl中で浮揚性比重を
定めることによって電子顕微鏡検査で負に荷電された調
整物中で判断することによって、クロロホルムに鋭敏に
分離するものを定量することで、また知られた特性（表
３）で血清を分離するCPEの中和によって研究された。
単離物は、いつでも知られたウイルスに対して処理され
た血清によって特別に中和され、単離物はこの知られた
ウイルスの呈示量であると考えられる。

マクロファージ培養上のCPEを示す単離物は、また豚c
829かb822の後汚染された血清でIPMA中で染色されるこ
とによって研究される。単離物は、マクロファージ培養
上で再接種され、接種後同定物がCPEを示す前に１日同
定される。単離物は、いつでも豚c829とb822の後汚染血
清でIPMA中で再活性を示し、LAの典型であると考えられ
る。マクロファージ中で培養された他の単離物の典型ま
たは汚染されていないマクロファージは、また血清の特
性を調べるためにこれらの血清で染色される。

LAの同定 UAはさらに雛鶏，モルモット，豚，羊，人のＯ型赤血
球で４℃と37℃で血球凝縮反応によって研究された。SI
V,サブタイプH3N2は、血球凝縮反応の研究中に正の制御
剤として用いられた。

疑似狂犬病ウイルス（PRV）、透過性腸内ウイルス（T
GE），豚流行性下痢ウイルス（PED），血球凝集反応性
脳炎ウイルス（HEV），アフリカ豚熱ウイルス（ASF
V），雄豚コレラウイルス（HCV）および豚インフルエン
ザウイルス（SIV）のH1N1とH3N2に対して特に処理され
る豚の抗血清と、１型と４型の牛疱疹ウイルス（BHV1,
4）悪性カタル熱（MCF）、パラインフルエンザウイルス
３（PI3）、牛呼吸シンシチアルウイルス（BRSV）およ
び牛白血病ウイルス（BLV）に対して特別に処理される
牛抗血清と、鳥白血病ウイルス（ALV）および伝染性気
管支炎ウイルス（IBV）に対して特別に処理される鳥抗
血清とが、上述のような豚の肺のマクロファージで汚染
されまたは汚染されないLA上にIPMA中でIg種の特別なHR
PO接合するものとして研究された。

我々は、またIPMA中で流行性耳下腺炎ウイルス、セン
ダイウイルス、犬ディステンパウイルス、牛疫ウイル
ス、麻疹ウイルス、マウスの肺炎ウイルス、牛呼吸シン
シチアルウイルス、狂犬病ウイルス、泡沫ウイルス、メ
ディビスナウイルス、牛とマウスの白血病ウイルス、
人、猫、猿の免疫不全ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎
ウイルス、猫感染性腹膜炎ウイルス、マウス肝炎ウイル
ス、ブレダウイルス、ハンターンウイルス、ナイロビ羊
病ウイルス、東西ベネズエラ馬脊椎膜炎ウイルス、風疹
ウイルス、馬動脈炎ウイルス、乳ヒドロゲナーゼウイル
ス、黄熱病ウイルス、先天性脳炎ウイルスおよび肝炎Ｃ
ウイルスに対して処理された各種の抗血清をテストし
た。

LAは、PK2,PK−15およびSK−６細胞中でならびに雛化
した鶏卵中で自由に変化する。２つの変化の後に、再単
離のために豚の肺マクロファージ培養器に再度接種され
る。

LAは、0.2ミクロンの過に先だってまたは後で、豚
の肺マクロファージ中で滴定される（Schleicher and S
chuell）。LAはIPMA中でそのCPEによって検出される。
滴定はReedおよびMuenchに従って計算される（1938）。

我々は、さらにLAに対して処理された豚の抗血清を準
備した。２つのSPF豚（21および23）は、第５の細胞培
養継代の10⁵TCID₅₀で鼻の周辺に感染される。２つの他
の豚（25および29）は、10⁵TCID₅₀LAを含むLAで汚染さ
れたSPF子豚の肺の新鮮な懸濁物で鼻の周辺に感染され
る。血液試料は、0,14,28および42日の後感染（dpi）で
得られる。

我々は、豚肺胞マクロファージ中でLAの時間による培
養パターンを決定するために、LAを培養した。豚の肺胞
マクロファージは、F25フラスコ中で植え付けられ（Gre
iner）、１細胞当り、0.01TCID₅₀の感染増殖をもつLAで
汚染された。汚染後8,16,24,32,40,48,56および64時間
で、１つのフラスコは試験され、非感染制御培養に関し
てCPEの百分率が決定される。培養液は、収穫され、同
容積のリン酸緩衝塩で置換される。培養液とフラスコと
は、−70℃で貯蔵される。すべての培養器の収穫が終わ
った後、LAの力価はTCID₅₀ml^-1の対数として決定され表
現される。

LAの形態は、電子顕微鏡によって研究された。LAは、
上述のように培養され48時間後、培養器は凍結融解さ
れ、6000Gで10分間遠心分離された。30mlの上澄液は、
0.3mlのLA種豚血清と混ぜられ、37℃で1.5時間定温に保
たれた。30分間125,000Gで遠心分離後、生じたペレット
を１％シーケンアガロースのME中へ40℃でリン酸緩衝塩
中で懸濁された。凝固後、アガロース塊を0.8％グルタ
ルアルデヒドと0.8％オスミウムテトラオキサイド中でp
H7.4のペロナール／アセテート緩衝液（230mOsm/KgH
₂O）中へ浸し、そしてマイクロウェーブを照射して固化
した。この手順は新しい同定液でもう一度繰り返した。
試料は水で洗浄され、１％ラウニルアセテート中へ浸さ
れ、マイクロウェーブ照射によってしみをつけられた。
すべてのステップ中、試料は０℃に保たれ、マイクロウ
ェーブ（Samsung RE211D）は、５分間溶融してセットさ
れる。薄膜は標準技術で準備され、クエン酸鉛でしみを
付け（Venable et al.,1965）、Philips CM10電子顕微
鏡で試験される。

我々は、さらにMSDの原因の源となる豚の血清からLA
を単離することを続けた。オランダ（野性、オランダ
２）、ドイツ（野性、ドイツ１およびドイツ2;courtesy
Drs,Berner,Mnchen and Nienhoff,Mnsten），およ
び米国〔実験US1（ATCC VR−2332で前もって行われた
実験;courtesy Drs,Collins,St・Paul and Chladek,St.
Joseph），および野性US2とUS3（courtesy Drs.van Als
tins,West Lafayette and Slife,Galesburg）〕のすべ
ての試料は、中央獣医学研究所のLA研究部門へLAの診断
のために送られた。すべての試料は、上記のように豚の
肺胞マクロファージでウイルスの単離のために用いられ
た。細胞変成単離物は、３代に継代され、後感染血清b8
22とc829の抗LAで特別に免疫汚染することによってLAと
して同定された。

我々はまた、NL1（最初の単離LA;コードCDI−NL−2.9
1）,NL2,GE1,GE2,US1,US2およびUS3の単離の抗原関係を
研究した。単離物は上述のようにマクロファージ中で培
養され、IPMA中で野性の血清のセットと実験的な血清の
２つのセットとをテストされた。血清はまたIPMA中で非
感染マクロファージでテストされた。

野性の血清、すなわちLVのための正の２つの血清（TH
−487とTO−36）は、LA陽性のオランダの野性血清のセ
ットから選択された。２つの血清は、血清学的診断のた
めのLA部門に海外から送られた野性血清から選択され
た。ドイツ（BE−352,BE−392およびNI−f2;courtesy D
r.Berner,Mnchen and Dr.Nienhoff,Mnster）、英国
（PA−141615,PA−141617およびPA−142440;courtesy D
r.Paton,Weybridge），ベルギー（PE−1960;courtesy P
rof.Pensaert,Geut）フランス（EA−2975およびEA−298
5;courtesy,Dr.Albina,Ploufragan），アメリカ（SL−4
41,SL−451,AL−RP9577,AL−P10814133,AL−4994A,AL−
7525,JC−MN41,JC−MN44およびJC−MN45;courtesy Dr.S
life,Galesburg,Dr.van Alstine,West Lafayette and D
r.Collins,St.Panl）およびカナダ（RB−16,RB−19,RB
−22およびRB−23;courtesy Dr.Robinson,Quebec）から
22の血清が送られた。

実験血清は、dpi0,14,28および42で得られた豚21,23,
25および29の血清の上述のセットである。（Drs.chlade
k,St.JosephおよびCollins,St.Paulの承認によって得ら
れた）実験血清のセットは、単離ATCC VR−2332の10
^5.1TCID₅₀で鼻水に抗体試験された生後６ケ月の４匹の
未妊娠豚から採取された。血液試料は、0,20,36および6
3dpiで2Bの未妊娠豚と、0,30,44および68dpiで9Gの未妊
娠豚と、0.25,40および64dpiで16Wの未妊娠豚と、0.36
および64dpiで16Yの未妊娠豚とから得られた。

放射性免疫沈降試験管（RIP;de Magancourt et al.,1
986）による汚染豚の肺胞マクロファージ中のLAの蛋白
質の研究について、我々は³⁵S−システインを含む標識
を付された媒体の存在中で16時間LAで汚染され、または
汚染されないマクロファージを培養した。標識を付され
た細胞は、豚b822と豚23の42dpi後汚染血清と、単離ATC
C VR−2332で汚染した豚の26日後の血清MN8とで標準の
方法に従って沈澱された（coutesy Dr.Collins,St.Pan
l）。沈澱した蛋白質は、12％SDS−PAGEゲル中で電気泳
動によって、分析され、蛍光光度法によって可視化され
た。

LAゲノムの特性を明らかにするために、我々はLAで汚
染され、24時間培養されたマクロファージまたは汚染さ
れないマクロファージ培養器からの核DNAと細胞質RNAと
を抽出した。細胞培養液は、不要なものを捨てられ、細
胞はリン酸緩衝塩で２回洗浄される。DNAは、上述のよ
うに抽出される（Strauss,1987）。細胞質RNAは、上述
のように抽出され（Favaloro et al.,1980）、5.7M Cs
Clをクッションとして遠心分離で精製され、（Setzer e
t al.,1980）、RNアーゼを含まないDNアーゼで処理され
（Phaimacia）、そして0.8％中性アガロースゲル中で分
析される（Moormann and Hulst,1988）。

クローニングと配列決定 LV RNAを増殖するために、LVで汚染された豚の肺胞
マクロファージの細胞内RNA（10μｇ）は、室内で10分
間10mM水酸化メチル水銀で培養された。変成されたRNA
は、50mMのトリス塩酸（pH7.8）と10mM MgCl₂,70mM K
Cl,0.5mM dATP,dCTP,dGTPおよびdTTP,0.6μｇの子牛の
胸線オリゴヌクレオチド・プライマpd（Ｎ）６で増殖さ
れ（Pharmacia）、マウスのモロニー白血病ウイルスの3
00単位が100μｌの全容積中で転写酵素で変化させられ
た（Bethesda Research Laboratories）。20mM EDTAは
１時間後に加えられ、反応混合物はフエノール／クロロ
ホルムで抽出され、セファデックスG50カラムを通して
過されエタノールで沈澱させられた。

第２のｃ−DNA鎖の合成のために、DNA逆転写酵素Ｉ
（Boehringer）およびRN−アーゼＨ（Pharmacia）が使
われた（Ｇbler and Hoffman,1983）。端末における
平滑末端を作るために２重螺旋ｃ−DNAは、T4DNA逆転写
酵素（Pharmacia）によって0.05mMデオキシヌクレオチ
ド３リン酸を含む反応混合物中で増殖された。次いでｃ
−DNAは、0.8％アガロースゲル中で分別された（Moorma
nn and Hulst,1988）。１〜4kbの断片は、電気溶出さ
れ、pGEN−4Z（Promega）のSma I位置へ結合され、変形
DH5αに大腸菌を変質するために用いられる（Hanahan,1
985）。コロニー過は、³²pで標識を付けられた単鎖ｃ
−DNAプローブで雑種化された。プローブは、中性のア
ガローゼゲル中で分割されたLV RNAから逆転写された
（Moormann and Hulst,1988）。単鎖DNAを用いる前にプ
ローブは、細胞質RNAで模倣汚染肺胞マクロファージか
ら増殖された。

LV ｃ−DNAクローン間の関係は、制限酵素分析によ
ってまたニックトランスレーションｃ−DNAプローブを
有する消化されたDNAのサウザンブロットの雑種化によ
って定量される（Sambrook et al.,1989）。

ウイルスのゲノムの３′端末を得るために、我々はオ
リゴ（dT）_12-18と第１の鎖反応中のプライマとしての
負鎖ウイルスゲノムに補充する３′LV種のオリゴヌクレ
オチドを使って第２のｃ−DNAライブラリーを構成し
た。第１および第２鎖合成のための反応条件は、上に述
べたものと同一である。このライブラリーは、３′端末
オリゴヌクレオチドプローブのウイルス種で覆われた。

ｃ−DNA配列の大部分（95％以上）は、Pharmacia LK1
3によって自動化されたレーザ蛍光DNA配列決定装置（A.
L.F商標）で決定される。配列決定された蛍光オリゴヌ
クレオチドプライマは、自動読取配列決定器具（AutoRe
ad商標:Pharmacia）の説明書に記述された手続ＣとＤと
に本質的に従う自動読取配列決定装置を使って貫膜DNA
上に作られる。蛍光を発するプライマは、蛍光プライマ
装置（Pharmacia）で作られる。配列の残存する部分
は、配列決定に基づくT⁷逆転写酵素（Pharmacia）とα
−³²S−dATP（Amersham）とを結合したオリゴヌクレオ
チドを使って貫膜螺旋DNA配列を介して決定される。配
列データは、PCGENE（Intelligenetics,Inc,Mountain V
iew,USA）およびFASTA（Pearson and Lipman,1988）の
配列分析プログラムを使って分析される。

MSDの実験的再生産 妊娠後10〜11週を経た14群の飼育された雌豚は、IPMA
中でLAに対する抗体のためにテストされた。全ては陰性
であった。４匹の豚の２群が形成されCVIに買われた。
妊娠後12週間でこれらの豚は、2ml LA（継代水準３、
力価10^4.8TCID₅₀/ml）を鼻孔内に接種した。血清とEDTA
血清試料は接種後10日して採取された。食物摂取量、体
温、その他の臨床上の徴候は毎日観察された。分娩に際
し、出産日と雌豚当りの産まれた子豚の生死が記録さ
れ、試料はウイルスの分離と血清のために採取された。

結果 免疫蛍光法 MSDを持った豚の組織の断面は、IFT中でアフリカ豚熱
ウイルス、雄豚コレラウイルス、疑似狂犬病ウイルス、
豚パルボウイルス、豚インフルエンザウイルス、脳心筋
ウイルスおよびオウム病クラミジアに対して処理された
FITC接種物で感染された。感染された断面は蛍光顕微鏡
検査によって調べられ、陰性であった。

養豚場でMSDの影響を受けた子豚からのウイルス単離 細胞変成の単離物は、MSDで影響を受けた生後２〜10
日の子豚の組織試料で接種されたマクロファージ培養中
で検出された。５箇所の異なった養豚場を起源とする19
匹の子豚からの16匹が陽性であった（表1A）。これらの
すべての単離物は、IPMA中で豚c829の後汚染血清と反応
した。非汚染制御培養器は、反応しなかった。したがっ
て単離物は、LAの典型であった。組織変成単離物は、第
６の養豚場（farm VE）からの子豚の口のまわりを拭っ
て得た懸濁物で接種されたSK−６細胞培養中で検出され
た（表14）。この単離物は、ピコルナ類ウイルスの性状
を示し、PEV2種の血清によって中和された。したがって
単離物はPEV2として同定された（表３）。PK2,PK−15細
胞と鶏卵は陰性を残し、このグループからの試料で接種
された。

養豚場でMSDによって影響を受けた雌豚からのウイルス
単離 細胞変成の単離物は、MSDによって影響を受けた豚の
試料で接種されたマクロファージ培養器中で検出され
た。11の養豚場起源の41〜63匹の豚は、陽性であった
（表1B）。これらのすべての単離物は、IPMA中で豚b822
の後汚染血清と反応し、LAの存在を示した。必要なとき
に細胞変成の単離物は、養豚場HUからの豚の白血球を分
離した懸濁物で接種されたPK2細胞中で検出された（表1
B）。この単離物は、ピコルナ類のウイルスの性状を示
し、EMCV種の血清によって中和された。したがって単離
物は、EMCVとして同定された（表３）。SK−6,PK−16細
胞と鶏卵は陰性を残し、このグループからの試料で接種
された。

MSDで影響を受けた雌豚と接触を保ったSPF豚からのウイ
ルスの単離 細胞変成の単離物は、MSDで影響を受けた雌豚と接触
を保ったSPF豚の試料で接種されたマクロファージ培養
中で検出された。12匹の豚中４匹は陽性であった（表
２）。これらのすべての単離物は、IPMA中で豚c829と豚
b822の後汚染血清と反応し、LAの存在を示した。細胞変
成の単離物は、またこれらのSPF豚の試料で接種されたP
K2,PK−15 SK−６細胞培養中で検出された。また12匹
の豚中７匹が陽性で（表２）、これらの単離物はすべて
PEV7に対して処理された血清によって中和された。これ
らの７個の単離物の１つはさらに研究され、他の特性が
またPEV7として同定された（表３）。

MSDで影響を受けた雌豚の血液で接種されたSPF豚からの
ウイルスの単離 細胞変成の単離物は、MSDで影響を受けた雌豚の血液
で接種されたSPF豚の試料で接種されたマクロファージ
培養器中で検出された。８匹の豚中２匹は、陽性であっ
た（表２）。これらの単離物は、すべてIPMA中で豚c829
と豚b822の後汚染血清と反応し、LAの存在を示した。こ
のグループからの試料で接種されたPK2,SK−６およびPK
−15細胞が陰性のまま残った。

MSDと関連することのできる物質の存在を確認するため
にテストされた豚の４つのグループの概要 第１のグループでは、子豚に影響を与えるMSD中でLA
が16〜20匹の子豚からPEV2として単離された。

第２のグループでは、雌豚に影響を与えるMSD中でLA
が、41〜63匹の雌豚からEMCVとして単離された。さらに
123〜165匹のMSDで影響を受けた雌豚は、LAに血清変成
したことがIPMA中でテストされた。このような大量の血
清変成は、テストされた他のウイルス性病原体のいずれ
に対しても実証されなかった。

第３のグループでは、MSDの影響を受けた雌豚と接触
を保ったSPF豚中で、LAは４〜12匹の豚から単離され、P
EV7は７匹の豚から単離された。すべての豚は、LAとPEV
7に血清変成した。

第４のグループでは、MSDで影響を受けた雌豚の血清
を接種されたSPF豚中で、LAは２匹の豚から単離反され
た。すべての８匹の豚はLAに血清変成した。

MSDで影響を受けた養豚場からの雌豚の血清学 MSDで影響を受けた雌豚からの対の血清は、種々なウ
イルス性病原菌とこの研究の期間中に得られた単離物と
に対するテストが行われた（表４）。LAに対して処理さ
れた過剰抗体応答は、IPMA（23〜26の養豚場で見付かっ
た血清変成された雌豚の75％）中で測定され、血清変成
の明確なパターンは、他のウイルス性病原菌で１つも見
付からなかった。LAに対して処理された中性抗体は、検
出されなかった。

MSDで影響を受けた雌豚と接触を保ったSPF豚の血清学 ８匹すべてのSPF豚は、IPMA中でLAに対して抗体応答
を示した（表５）。非汚染マクロファージで実行された
IPMA中で、これらの血清は１つも陽性でなかった。また
LAのためのSNT中でも陽性でなかった。接触後２週間で
採取された血清は、PEV7に対して高い中性抗体力価（＞
1280）を有し、前汚染血清は陰性（＜10）であった。こ
れはすべての豚がPEV7で汚染されていることを示す。

MSDで影響を受けた雌豚の血液を接種したSPF豚の血清学 すべての８匹のSPF豚は、IPMA中でLAに対して抗体応
答を示した（表５）。非汚染マクロファージで実行され
たIPMA中で、これらの血清は１つも陽性ではなかった。
またLAのためのSNT中でも陽性でなかった。前および２
週間後の接種血清は、PEV7に対して陰性（＜10）であっ
た。

LAの同定 LAは、雛鶏、モルモット、豚、羊または人のＯ型赤血
球細胞で血球凝集反応を起こさなかった。

LAはIPMA中でPRV,TGE,PED,ASFVなどに対して処理され
た血清と反応しなかった。

２継代後、LAは、PK2,PK−15もしくはSK−６細胞中ま
たはアラントイック経路を通って接種された雛化鶏卵中
では、生育しなかった。

LAは、0.2ミクロンフィルタを通して過された後で
も感染し得て、力価は過の前後でIPMAで検出されるよ
うに、それぞれ10^5.05と10^5.3TCID₅₀であった。

LAの生育曲線（図３を見よ）。細胞のないウイルスの
最大力価は、接種後32〜48時間で約10^5.5TCID₅₀ml^-1で
ある。この時間の後マクロファージは、LAの細胞変成効
果によって殺される。

電子顕微鏡検査。球型のLA粒子の房が見られる。粒子
は直径45〜55nmと測定され、脂質の２層膜で覆われた30
〜35nmのヌクレオキャプシドを含んでいた。LA粒子は、
陰性の血清で処理された培養器または陰性に制御された
調整器中では見付からなかった。

オランダ、ドイツ、アメリカ合衆国からの単離物。７
つの全単離物は、豚の肺胞マクロファージ中で３〜４継
代を経て単離された。すべての単離物は、マクロファー
ジ中で細胞変成効果を起し、抗LA血清b822と42dpi血清2
3で特別に免疫感染されることができた。単離物は、NL
1,NL2,GE1,GE2,US1,US2およびUS3と名付けられた。

単離物NL1,NL2,GE1,GE2,US1,US2およびUS3の抗原関
係。IPMA中で非汚染マクロファージと１つの野性種の血
清も反応しなかったが、すべての血清は７つの単離物の
１つより多くに対して処理された抗体を含んでいた（表
７）。IPMA中で非汚染マクロファージと実験種の血清も
１つも反応しなかった。そして0dpi実験血清は、IPMA中
で７つの単離物の１つとも反応しなかった（表８）。LA
単離物の７つの全ては、0dpi後に採取された豚21,23,25
および29の実験血清のセットからの血清のほとんどすべ
てと反応した。単離物US1,US2およびUS3のみが、0dpi後
に採取した未妊娠の豚2B,9G,16Wおよび16Yの実験血清の
セットからの血清のほとんどすべてと反応した。

放射線免疫沈澱の研究。７つのLA種蛋白質は、LA汚染
マクロファージ中で検出されたが、豚b822および23の42
dpi血清で沈澱された非汚染マクロファージ中では検出
されなかった。この蛋白質は、65,39,35,26,16および15
キロダルトンの分子量であると概算された。これらのLA
種蛋白質の15と16キロダルトンの２つは、26dpi血清MN8
によってまた沈澱した。

LVゲノムの配列と体制 LVゲノムの性質は、汚染された豚の肺胞マクロファー
ジからのDNAとRNAとを分析することによって決定され
た。LV種DNAは、検出されなかったが、LV種RNAを検出し
た。0.8％中性アガロースゲル中でLV RNAは、雄豚コレ
ラウイルスの12.3kbの長さのRNAが泳動するよりも僅か
にゆっくりと泳動した（Moormann et al.,1990）。正確
な大きさの決定は、中性アガロースゲル中ではできない
が、LV種RNAは約14.5〜15.5kbの長さであることが概算
された。

汚染細胞中でLV種RNAの複雑度を決定するためとLVゲ
ノムのヌクレオチド配列を確立するためとに、我々は、
LVで汚染された豚の肺胞マクロファージのRNAからのｃ
−DNAを準備し、物質と方法の項で記したように、LV種
ｃ−DNAクローンを選びマッピングした。ｃ−DNAクロー
ンの特性は、種クローンの雑種化によって再限定され、
LV汚染および非汚染のRNAを担うノーザンブロットに重
複ｃ−DNA配列の至る処に位置した。注目すべきは、ｃ
−DNAクローンのあるものは、汚染されたマクロファー
ジ中で検出される14.5〜15.5kbのRNAと雑種化し、他の
ものは（概算大きさ１〜4kbの）より低い分子量の４ま
たは5RNAのパネルと同様に14.5〜15.5kbのRNAと雑種化
した。後者のクローンは、ｃ−DNAマップの一端にすべ
て固化された。これらのデータは、LVのゲノム体制がコ
ロナウイルス科（Spaan et al.,1988），ベルンウイル
ス（BEV;Snijder et al.,1990b），トロウイルスとEAV
（de Vries et al.,1990）のそれに似ている。すなわち
さらにゲノムの３′端末に位置する巣作りされたセット
を形作るサブゲノムｍ−RNAであるゲノムRNAに似てい
る。この仮定は、ｃ−DNAクローンの配列が役立ち特別
のプライマがしみを持ったプローブに選ばれるときに確
かなものになる。雑種化データの編集は、ｃ−DNAクロ
ーンで得られ、LV汚染と非汚染マクロファージのRNAを
担うノーザンブロットによって雑種化された特別のプラ
イマは、図２に示される。５′部に位置するクローン12
と20および配列の中央は、LA汚染細胞中で検出される1
4.5〜15.5kbゲノムRNAに各々雑種化した。しかしクロー
ン41と39とは、14.5〜15.5kbのゲノムRNAとより低い分
子量の４と５とのRNAのセットとをそれぞれ認めた。し
かし最も有効な確定的な雑種化パターンは、LV配列中で
決定的な５′端末に位置するプライマ25で得られた（図
１と比較せよ）。プライマ25は、7RNAのパネルにゲノム
RNAと同様に0.7〜3.3kbの大きさに相当する分子量でも
って雑種化された（サブゲノムｍ−RNA）。プライマ25
の雑種化パターンのための最も好ましい説明は、まだ知
られていない長さの５′端末ゲノム配列が、ゲノムの
３′端末から転写されたｍ−RNAの本体に融合すること
でなされた。実際にプライマ25で得られた雑種化パター
ンは、５′端末ゲノム配列がいわゆる「リーダ配列」と
してサブゲノムｍ−RNAとして存在することを暗示し
た。このような転写パターンは、コロナ科ウイルス（Sp
aan et al.,1988）およびEAV（de Vries et al.,1990）
の複製のホールマークである。

上のデータから抽出し得るLVとEAVとの間の注目すべ
き相違点は、LVのゲノムサイズか約2.5kbの長さでEAVの
長さより長いことである。

重複したｃ−DNAクローンの合意できるヌクレオチド
配列は、図１に示される。配列の長さは、15,088の塩基
対からなるその塩基対は、ゲノムLV RNAの概要サイズ
とよく一致する。

LVのｃ−DNAライブラリは、子豚の胸線pd（Ｎ）６プ
ライマで逆転写反応のランダムプライマで作られるの
で、ｃ−DNAクローンは、いずれもそれらの３′端末で
ポリ（Ａ）（ポリアデニル酸）を引き伸ばして得られな
かった。ウイルスゲノムの３′端末を作るために、我々
は、オリゴ（dT）と逆転写反応で得るプライマ39U183R
を用いて、第２のｃ−DNAライブラリを組み立てた。プ
ライマ39U183Rは、LV汚染細胞から単離されたRNA調整物
中に好ましくは存在するLVマイナス鎖RNAを補充した。
このライブラリは、ウイルス特異性プローブ（ニックト
ランレーションされたｃ−DNAクローン119とオリゴヌク
レオチド119R64R）で選り分けられ、その結果５つの添
加ｃ−DNAクローン（たとえばｃ−DNAクローン151,図
２）の単離物が得られる。これらのｃ−DNAクローンの
配列は、LAが３′ポリ（Ａ）端末を含むということを知
らせた。ポリ（Ａ）端末の長さは、種々のｃ−DNAクロ
ーンの間で変化するが、その最大長さは、20ヌクレオチ
ドであった。さらにクローン25と155（図２）と、４つ
の添加ｃ−DNAクローンとは、ゲノムの５′端末で単離
された。そのゲノムは、図１に示される５′端末ヌクレ
オチドよりも短い２〜３ヌクレオチドであった。この発
見とｃ−DNAが合成される方法が与えられれば、我々
は、LVゲノムRNAの配列の５′端末に非常に類似すると
仮定する。

LVのゲノム配列の約75％は、ORFIAとORFIBをコード化
する。ORFIAは、LV配列中で出会った第1AUG（ヌクレオ
チド212の位置、図１）で開始する。ORFIAのＣ−端末
は、16個のヌクレオチドの小さい距離を超えて、ORFIB
の推定上のＮ−端末と重なる。ORFIBの転位は、リボソ
ームのフレームシフト，ポリメラーゼの転位の様式のホ
ールマーク、またはコロナウイルスのレプリカーゼ（Bo
ursnell et al.,1987;Bredenbeek et al.,1990）および
トロウイルスBEV（Snigjder et al.,1990a）を経て進
む。リボソームのフレームシフトの位置で形作られるこ
とを予言される特性RNA擬結節構造は、LAの配列中のこ
の位置にまた見付けられる（結果は示されない）。

ORFIBは、コロナウイルス類のMHVおよびIBV（約3,700
のアミノ酸残基;Bredenbeek et al.,1990;Boursnell et
al.,1987）およびBEV（約2,300のアミノ酸残基;Snijde
r et al.,1990a）のORFIBよりずっと小さい約1400のア
ミノ酸配列の残基でコード化される。レプリカーゼに似
たコロナウイルス上科のメンバーのORFIB産物の特性、
および亜鉛フィンガー領域は、またLVのORF IB中で見
付けられる（結果は示されない）。

ORFIAとORFIBとは、ポリメラーゼウイルスをコード化
し、したがって非構造性ウイルス蛋白質をコード化する
ために考えられ、ORF2〜７は非構造性ウイルス蛋白質を
コード化すると信じられる。

ORF2〜６の産物は、すべて蛋白質を構成する膜を想像
する特性を示す。ORF2では、２つの予言されたＮ−リン
クされた糖鎖形成位置を含んだ249アミノ酸の蛋白質を
コード化する（表９）。疎水性の配列のＮ−端末におい
て、その配列は、いわゆるシグナル配列の機能をし、同
定される。Ｃ−端末は疎水配列の端末を形成し、この場
合に貫膜領域として機能をし、ウイルスを含む膜中にOR
Fで産物を固くつなぎ止める。

ORF3は、ヌクレオチド位置12394で出発するAUGまたは
ヌクレオチド位置12556で出発するAUGで開始する。そし
て265と211アミノ酸の蛋白質をそれぞれコード化する。
265残基の蛋白質は、７つの想像上のＮ−リンクされた
糖鎖形成位置を含む。したがって、211残基の蛋白質は
４つを含む（表９）。265残基の蛋白質のＮ−端末で疎
水配列は同定される。

もしもORF4の産物がヌクレオチド位置12936で出発す
るAUGで開始されるならば、そして疎水分析によって判
断されるならば、ORF4によってコード化された蛋白質の
トポロジーは、ORF2によってコード化されたそれに類似
である。しかしORF4は、また配列中でそれぞれ12981と1
3068の位置で出発する他のAUGコードで開始し得る（図
１と図２との比較）。現在までどの出発コードが用いら
れるのかは明白でない。用いられる出発コードによっ
て、ORF4は、４つの想像上のＮ−リンクされた糖鎖形成
位置を含む183アミノ酸、４つの想像上のＮ−リンクさ
れた糖鎖形成位置を含む168アミノ酸または３つの想像
上のＮ−リンクされた糖鎖形成位置を含む139アミノ酸
の蛋白質をコード化できる（表９）。

ORF5は、２つの想像上のＮ−リンクされた糖鎖形成位
置を有する201アミノ酸の蛋白質をコード化するために
予言される（表９）。ORF5産物の特性は、アミノ酸108
〜アミノ酸132間の疎水配列の内部にある。

セグメントを測る膜とORF6の産物の疎水性のための分
析は、その配列のＮ−端末90アミノ酸でセグメントを測
る３つの貫膜を含むことを示す。この注目すべき特性
は、またいくつかのコロナウイルス類すなわち伝染性気
管支炎ウイルス（IBV;Boursnell et al.,1984）とマウ
ス肝炎ウイルス（MHV;Rottier et al.,1986）の小さく
包まれた糖蛋白質のＭまたはE1の特質である。ORF6によ
ってコード化された蛋白質は、コロナウイルス類のＭま
たはE1のそれにトポロジー類似の膜を有する（Rottier
et al.,1986）。ＭまたはE1蛋白質の第２の特性は、推
定された第３の貫膜領域に、たしかに近似して位置する
いわゆる螺旋である。コロナウイルス類中で非常によく
保存された約25のアミノ酸のこの配列は、LV中でより多
く退化しているが認められる。また我々は、コロナウイ
ルスＭまたはE1蛋白質のような機能を有する類似の膜を
有するLV ORF6の産物を予言している。さらにORF6によ
ってコード化された蛋白質は、LVのVpX（Godeny et a
l.,1990）と非常によく似た特性（53％の一致したアミ
ノ酸）を示す。

ORF7によってコード化された蛋白質は、LDVのVp1より
長い13個アミノ酸がある128個のアミノ酸残基（表９）
を有する（Godeny et al.,1990）。すでに重要な類似物
（43％の一致したアミノ酸）は、ORF7とVp1とによって
コード化された蛋白質の間で観測された。ORF7とVp1と
の生産物の間のもう１つの共有された特性は、蛋白質の
Ｎ−端末の半分の中にアルカリ残基（Arg,LysおよびHi
s）の高濃度があることである。アミノ酸55までにLV配
列はArg,LysおよびHisの26％を含む。この発見は、ORF7
の生産物またはVp1の提案された機能すなわちウイルス
ゲノムRNAの包膜で一致して満たされている（Godeny et
al.,1990）。上述のデータに基づいて、我々はウイル
スのヌクレオキャプシド蛋白質ＮであるLV ORF7生産物
を提案する。

LVゲノムの組織の図表による表現は、図２で示され
る。LVの配列を決定するために用いられる重複したクロ
ーンのマップは、最上段のパネルで示される。LVのヌク
レオチド配列の５′と３′との端末を示すこのマップの
直線状編集物は、図１の中で示され、キロベースでの分
割を含み、ｃ−DNAのマップの下部に示され、配列中の
これらのクローンの位置決めをする。LVゲノム中で同定
されたORFの位置は、LV配列の直線状マップの下部を示
す。パネル最低部は、サブゲノムｍ−RNAの巣状セット
を示し、これらのRNAの位置は、LV配列に関係する。

コロナウイルス、トロウイルスおよび動脈留ウイルス
のサブゲノムｍ−RNAの転写戦略に従って、ORF1〜６は
それらのゲノムまたはｍ−RNAの特異な５′端末から転
写される。ｍ−RNAのこの特異な部分は、線中で次にあ
るより高い分子量のRNAから、より低い分子量のRNAが差
し引かれるときに、得られるRNAのその部分であるべき
と考えられる。RNA7は、他のゲノムとサブゲノムRNAの
すべての３′端末を形成し、特異な領域を有していな
い。ORF7は、この最小サイズのｍ−RNAからのみ転写さ
れると信じられている。サブゲノムRNAの５′端末で
「リーダ配列」は、固形ボックスで示される。この配列
の長さは、約200ベースであるか、ゲノムRNAスチルの本
体の溶解物の正確な位置は、決定された。

MSDの実験的再生 ８匹の妊娠豚は、LAを接種され、食欲不振と繁殖力の
欠如のようなMSDの臨床上の徴候がこれらの豚で表現さ
れた。接種後（p.i.）４日から10〜12日の間ですべての
豚は、食欲不振を示した。どの豚も体温の上昇はなかっ
た。２匹の豚は、９〜10p.i.で青味を帯びた耳となっ
た。表６中で出産日における１匹の豚当りの生きた子豚
と死んだ子豚の数が与えられる。LAは、生まれた子豚の
13匹から単離された。

１）PBS中でCsClの前もって作られた直線状勾配におけ
る浮遊比重は、基準の技術に従って決められる（Brakk
e;1967）。与えられたものは、伝染性のピークを見付け
る比重である。

２）研究下で感染されまたは感染されない細胞培養の単
離物は、凍結−融解処理された。溶菌液は、30分間130,
000Gで遠心分離され、その結果生じたペレットは、基準
技術（Brenner and Horne;1959）に従ってマイナス感染
され、Philips CM10電子顕微鏡で研究された。与えられ
たものは感染培養器に存在し、非感染培養器には存在し
ない粒子の大きさである。

３）クロロホルムに対する鋭敏性は、基準技術（Grist,
Ross and Bell;1974）に従って決定された。

４）単離物の100〜300 TCID₅₀は、特異抗血清の種々な
稀釈物で混合され、完全CPEが観測されるまで適当な細
胞システム中で培養される。５以上の力価をもつ血清は
再テストされ、高い力価でCPEを妨害する血清は、単離
のために特別であると考えられる。クロロホルムに鋭敏
でない単離物は、豚腸内ウイルス（PEV）１〜10に対し
て（courtesy Dr.Knowles,Pirbright,UK）、脳内心筋ウ
イルスに対して（EMCV;courtesy Dr.Ahl,Tbingen,Ger
many），豚パルボウイルスに対して、および豚肺胞病に
対して特別に処理された血清でテストされる。

クロロホルムに対して鋭敏な単離物（コード;CDI−NL
−2.91）は、疑似狂犬病ウイルス、１型牛ヘルペスウイ
ルス、千型牛ペルペルウイルス４、悪性カタル性ウイル
ス、牛ウイルス性下痢ウイルス、豚コレラウイルス、豚
インフルエンザウイルスH1N1、豚インフルエンザウイル
スH3N2、３型パラインフルエンザ３ウイルス、牛呼吸器
シンシティアルウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、豚流
行性下痢ウイルス、血球凝集性脳炎ウイルス、感染性気
管支炎ウイルス、牛白血病ウイルス、鳥白血病ウイルス
およびメディビィスナウイルスに対して特別に処理され
た抗血清ならびにSPF豚から得られた実験室的血清でテ
ストされた（表５を見よ）。

血清は、血球凝集性脳炎ウイルス（HEV）、豚インフ
ルエンザウイルスH1N1および同H3N2に対する抗体の検出
のために、血球凝集抑制（HAI）法が用いられ、疑似狂
犬病ウイルス（PRV）、豚パルボウイルス（PPV）、牛ウ
イルス性下痢ウイルス（BVDV）、および雄豚コレラウイ
ルス（HCV）に対する抗体の検出のために酸素結合イム
ノソルベント検定法（ELISA）が用いられた。

血清は、脳内心筋ウイルス（EMCV）、単離された
（ｉ）EMCV、（EMCVi）、豚腸内ウイルス２（PEV2）、
同７（PEV7）、単離されたPEV（PEVi）およびレリスタ
ドエイジェント（LA）に対して処理された抗体の中和の
検出のために、血清中和法（SNT）が用いられ、またレ
リスタドエイジェント（LA）に対し処理された抗体の検
出のために免疫パーオキシダーゼ単層検定法（IPMA）が
用いられた。

ｆは肥育豚を、ｉは第１と第２の血清の採取間隔を、
ｎは第１血清が本研究のテストで陰性であり、第２血清
がまた陰性であるか力価が４倍以下を示す豚の全数を、
ｐは第１血清が陽性で第２血清が力価で４倍以下を示す
豚の全数を、ｓは第２血清が本研究のテストで第１血清
よりも４倍以上高い力価を有する豚の全数をそれぞれ示
す。NDは検出されないものである。

実験の記述は表２を見よ。すべての豚は、一定の間隔
で採血され、すべての血清は、LAに対して処理された抗
体の検出のためにIPMAでテストされた。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 早期審査対象出願 (72)発明者 ポール，ヨアネス マリア アントニス オランダ国 8243 ハーアー レリシュ タット ヨル 30−05 (72)発明者 ムールマン，ロベルトゥス ヤコブス マリア オランダ国 8252 エーハー ドロンテ ン デ テルガング 12 (72)発明者 ミューレンベルク，ヨハンナ ヤコバ マリア オランダ国 1053 イクスペー アムス テルダム ポトギエテルシュトラート 17 ▲ＩＩ▼ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A61K 39/00 - 39/44 A61P 1/00 - 43/00 C07K 14/00 - 16/46 C12N 7/00 - 7/08 C12P 21/00 - 21/08 G01N 33/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (26)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】豚の奇病（MSD）の原因体であり、 寄託番号Ｉ−1102として、フランス、パリ、パスツール
   研究所に1991年６月５日に寄託されたレリスタドエイジ
   ェントの単離株（CDI−NL−2.91）に実質的に相当し、 接種されてから25〜33日後の豚から採取された血清抗体
   で免疫反応性を有し、クロロホルムに鋭敏であり、200n
   mよりも小さいウイルスから成ることを特徴とする単離
   されたレリスタドエイジェント。
2. 【請求項２】殺されたことを特徴とする請求項１記載の
   レリスタドエイジェント。
3. 【請求項３】弱毒化されたことを特徴とする請求項１記
   載のレリスタドエイジェント。
4. 【請求項４】請求項１記載のレリスタドエイジェントに
   由来する遺伝子が組込まれたことを特徴とする組換えベ
   クタ。
5. 【請求項５】請求項１記載のレリスタドエイジェントに
   由来し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコードさ
   れた蛋白質の少なくとも１つに対応することを特徴とす
   る単離されたかまたは合成された蛋白質あるいはポリペ
   プチド。
6. 【請求項６】請求項１記載のレリスタドエイジェントに
   由来し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコードさ
   れた蛋白質の少なくとも１つに対応することを特徴とす
   る単離されたかまたは合成された核酸。
7. 【請求項７】請求項１記載のレリスタドエイジェントの
   ゲノムに対応したヌクレオチド配列から成ることを特徴
   とする組換え核酸。
8. 【請求項８】請求項１記載のレリスタドエイジェントに
   由来し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコードさ
   れた蛋白質の少なくとも１つから選ばれたヌクレオチド
   配列から成ることを特徴とする組換え核酸。
9. 【請求項９】請求項１記載のレリスタドエイジェントの
   蛋白質に対応するアミノ酸配列を有し、適当な組換えDN
   Aで、遺伝子工学によって生産し得る細胞で製造される
   ことを特徴とするポリペプチド。
10. 【請求項１０】請求項１記載のレリスタドエイジェント
    に由来し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコード
    された少なくとも１つの蛋白質に相応するアミノ酸配列
    を有し、適当な組換えDNAで、遺伝子工学によって生産
    し得る細胞で製造されることを特徴とするポリペプチ
    ド。
11. 【請求項１１】請求項１記載のレリスタドエイジェント
    の成分を特異的に認識することを特徴とする単離された
    かまたは合成された抗体。
12. 【請求項１２】請求項１記載のレリスタドエイジェント
    に対応する蛋白質または抗原性ペプチドをコードするヌ
    クレオチド配列から成る核酸を含むことを特徴とする組
    換えベクタ。
13. 【請求項１３】請求項１記載のレリスタドエイジェント
    に由来し、図１のORF 1A,1B,2〜７によってエンコード
    された少なくとも１つの蛋白質または抗原性ペプチドを
    コードするヌクレオチド配列から成る核酸を含むことを
    特徴とする組換えベクタ。
14. 【請求項１４】動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ま
    しくは豚類をMSDから保護するためのワクチン組成物で
    あって、請求項１記載のレリスタドエイジェント、およ
    び適当な担体またはアジュバントから成ることを特徴と
    するワクチン組成物。
15. 【請求項１５】前記レリスタドエイジェントが殺された
    ことを特徴とする請求項14記載のワクチン組成物。
16. 【請求項１６】前記レリスタドエイジェントが、弱毒化
    されたことを特徴とする請求項14記載のワクチン組成
    物。
17. 【請求項１７】前記レリスタドエイジェントに由来する
    蛋白質または抗体ペプチドをコードするヌクレオチド配
    列から成る核酸を含むことを特徴とする請求項14記載の
    ワクチン組成物。
18. 【請求項１８】前記レリスタドエイジェントの抗体部分
    または成分から成ることを特徴とする請求項14記載のワ
    クチン組成物。
19. 【請求項１９】前記レリスタドエイジェントに由来する
    蛋白質もしくは抗原性ポリペプチドから成ることを特徴
    とする請求項14記載のワクチン組成物。
20. 【請求項２０】動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ま
    しくは豚類を病原菌によって起こる病気から保護するた
    めのワクチン組成物であって、 請求項４記載の組換えベクタと、 病原菌に由来する蛋白質または抗原性ペプチドをコード
    するヌクレオチド配列から成る組換えベクタの核酸と、 適当な担体またはアジュバントとから成ることを特徴と
    するワクチン組成物。
21. 【請求項２１】試料中、特に、動物、好ましくは哺乳動
    物、さらに好ましくは豚類から得られた血清、喀痰、唾
    液または組織などの生物試料中から請求項１記載のレリ
    スタドエイジェントに対応する核酸を検出するための診
    断キットであって、前記レリスタドエイジェントのゲノ
    ムに対応したヌクレオチド配列から成る核酸プローブま
    たはプライマーと、核酸検出アッセイのための適切な検
    出手段とから成ることを特徴とする診断キット。
22. 【請求項２２】試料中、特に、動物、好ましくは哺乳動
    物、さらに好ましくは豚類から得られた血清、喀痰、唾
    液または組織などの生物試料中から請求項１記載のレリ
    スタドエイジェントに由来する抗原を検出するための診
    断キットであって、レリスタドエイジェントの一部また
    は成分を特異的に認識する抗体と、抗体検出アッセイの
    ための適切な検出手段とから成ることを特徴とする診断
    キット。
23. 【請求項２３】試料中、特に、動物、好ましくは哺乳動
    物、さらに好ましくは豚類から得られた血清、喀痰、唾
    液または組織などの生物試料中から請求項１記載のレリ
    スタドエイジェントを特異的に認識する抗体を検出する
    ための診断キットであって、前記レリスタドエイジェン
    トに対応する抗原性部分または成分と、抗体検出アッセ
    イのための適切な検出手段とから成ることを特徴とする
    診断キット。
24. 【請求項２４】前記レリスタドエイジェントに本質的に
    相応する抗原性部分または成分が、レリスタドエイジェ
    ントに対応する蛋白質もしくは抗原性ポリペプチドまた
    はレリスタドエイジェントの抗原性成分に類似するペプ
    チドであることを特徴とする請求項23記載の診断キッ
    ト。
25. 【請求項２５】前記レリスタドエイジェントが、殺され
    たか、生きているか、または弱毒化されたことを特徴と
    する請求項23記載の診断キット。
26. 【請求項２６】ヒトを除く動物、好ましくはヒトを除く
    哺乳動物、さらに好ましくは豚類がMSDの原因体に感染
    されているかどうかを検査する方法であって、動物に由
    来する試料、特に血清、喀痰、唾液または組織などから
    調整された生物試料が、請求項１に記載されたレリスタ
    ドエイジェントの核酸、レリスタドエイジェントの抗原
    またはレリスタドエイジェントを特異的に認識する抗体
    を含むかどうかを検査する方法。