HU218431B - A rejtélyes sertésvészt okozó Lelystad-vírus, a vírusból származtatható polipeptidek, antigének és nukleinsavak és rejtélyes sertésvész elleni vakcinakészítmények - Google Patents

A rejtélyes sertésvészt okozó Lelystad-vírus, a vírusból származtatható polipeptidek, antigének és nukleinsavak és rejtélyes sertésvész elleni vakcinakészítmények Download PDF

Info

Publication number
HU218431B
HU218431B HU9303438A HU9303438A HU218431B HU 218431 B HU218431 B HU 218431B HU 9303438 A HU9303438 A HU 9303438A HU 9303438 A HU9303438 A HU 9303438A HU 218431 B HU218431 B HU 218431B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
virus
lelystad
nucleic acid
isolated
lelystad virus
Prior art date
Application number
HU9303438A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9303438D0 (en
HUT67060A (en
Inventor
Johanna Jacoba Maria Meulenberg
Robertus Jocobus Maria Moormann
Joannes Maria Anthonis Pol
Catharinus Terpstra
Gert Wensvoort
Original Assignee
Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26129289&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU218431(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut filed Critical Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut
Publication of HU9303438D0 publication Critical patent/HU9303438D0/hu
Publication of HUT67060A publication Critical patent/HUT67060A/hu
Publication of HU218431B publication Critical patent/HU218431B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/815—Viral vaccine for porcine species, e.g. swine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Abstract

A találmány szerinti megoldás a rejtélyes sertésvész (MSD)kórokozójának izolálásán, jellemzésén (genomi szerveződésemeghatározásán) és hasznosításán alapul. A találmány tárgyát képezi abetegséget okozó ágens (Lelystad-vírus) és annak alkalmazásavakcinakészítmények előállítására, továbbá a Lelystad-vírus izoláltrészei, a vírusból származtatható nukleotidszekvenciák és(poli)peptidek, a vírus és részei alkalmazásával előállítottvakcinakészítmények és diagnosztikai reagenskészletek, valaminteljárások ezek előállítására és MSD-fertőzés diagnosztizálására. ŕ

Description

A találmány szerinti megoldás a rejtélyes sertésvész (MSD) kórokozójának izolálásán, jellemzésén (genomi szerveződése meghatározásán) és hasznosításán alapul. A találmány tárgyát képezi a betegséget okozó ágens (Lelystad-vírus) és annak alkalmazása vakcinakészítmények előállítására, továbbá a Lelystad-vírus izolált részei, a vírusból származtatható nukleotidszekvenciák és (poli)peptidek, a vírus és részei alkalmazásával előállított vakcinakészítmények és diagnosztikai reagenskészletek, valamint eljárások ezek előállítására és MSD-fertőzés diagnosztizálására.
1991 telén és kora tavaszán a holland sertéstenyésztést egy új betegség hirtelen kitörése sújtotta a tenyészkocák között. A legtöbb koca anorexiás volt, néhányan a vemhesség késői fázisában (a 110. nap körül) abortáltak, koraszülés volt tapasztalható, vagy mumifikálódott magzatoknak adtak életet, néhánynak láza volt. Alkalmanként megkékült fülű kocákat találtak, ezért a betegséget általában „Abortus Blauw” (kék abortusz) néven említették. A betegséget a kocákban gyakran légzési problémák kísérték, valamint a fiatal malacok pusztulása, gyakran az idősebb malacok és a hizlalt disznók légzési betegségei és a növekedésük lassulása volt megfigyelhető.
Ennek a kórnak az okozója nem vált ismertté, de a tünetek hasonlóak voltak azokhoz, amelyek egy hasonló betegséggel tűntek fel Németországban 1990 végén, és hasonlítottak az úgynevezett „Mystery Swine Disease” betegség tüneteihez, amely betegség az Amerikai Egyesült Államok és Kanada közép-nyugati területein fordult elő 1987 óta [Hill H., OverView and History of Mystery Swine Disease (Swine Infertility Respiratory Syndrome), In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 1990. október 6., Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison, WI, USA]. A betegséget különböző neveken említették, Németországban „Seuchenhafter Spatabort dér Schweine” néven, Észak-Amerikában „Mystery Pig Disease”, „Mysterious Reproductive Syndrome” és „Swine Infertility and Respiratory Syndrome” néven említették. Észak-Amerikában Loula írta le az általános klinikai jeleket [Loula, T., Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets, In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 1990. október 6., Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison, WI, USA]:
1) étvágytalanság, beteg állatok minden életkorban,
2) abortuszok, koraszülések, gyenge sertések, múmiák,
3) malacozás utáni légzési problémák,
4) termékenységi problémák.
A kórokozót nem sikerült még azonosítani, de az enkefalomiokarditisz vírust (EMCV), a sertésparvovírust (PPV), a pszeudorabieszvírust (PRV), a sertésinfluenzavírust: (SIV), a szarvasmarha virális hasmenésvírust (BVDV), a sertés-koleravírust (HCV), a sertésenterovírusokat (PEV), egy influenzaszerű vírust, chlamidiákat, leptoszpirákat is megnevezték kórokozóként [Loula, T., Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets, In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 1990. október 6., Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison, WI, USA; Mangeling, W. L. and Láger, K. M„: Mystery Pig Disease: Evidence and considerations fór its etiology, In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 1990. október 6., Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison, WI, USA; egyebek mellett].
A találmány tárgya készítmény, amely izolált Lelystad-ágenst tartalmaz, amely a Mystery Swine Disease kórokozója, az említett Lelystad-ágens lényegében megfelel a Lelystad-ágens (CDI-NL-2.91) izolátumnak, amelyet 1991. június 5-én helyeztünk letétbe az Institute Pasteurnél (Párizs, Franciaország) 1-1102 letéti szám alatt, A „lényegében megfelel” kifejezés azokra a variációkra utal, amelyek a természetben előfordulnak, valamint a Lelystad-ágens mesterséges variációira, főleg azokra, amelyek lehetővé teszik az olyan kimutatási technikák alkalmazását, mint a hibridizáció, PCR és ELISA, Lelystad-specifikus anyagok, például Lelystad-specifikus DNS vagy antitestek alkalmazásával.
A készítmény tartalmazhat élő, elpusztított vagy legyengített izolált Lelystad-ágenst; a Lelystad-vírusból származó nukleotidszekvenciákat tartalmazó rekombináns vektort; a Lelystad-ágens izolált részét vagy komponensét; a Lelystad-ágensből izolált vagy szintetikus fehérjét, polipeptidet vagy nukleinsavat; lehet továbbá a Lelystad-ágens genomjából származó nukleotidszekvenciát tartalmazó rekombináns nukleinsav; egy polipeptid; amelynek aminosavszekvenciája a Lelystad-ágens egy fehéqéjéből származik, a fehérjéket olyan sejtekkel előállítva, amelyeket erre a megfelelő rekombináns DNSsel végzett génsebészeti beavatkozással alkalmassá tettünk; egy izolált vagy szintetikus antitest, amely specifikusan felismeri a Lelystad-ágens egy részét vagy komponensét; vagy egy rekombináns vektor, amely a Lelystadágensből származó fehéijét vagy antigén peptidet kódoló nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
DNS-szinten a találmány tárgya rekombináns nukleinsav, pontosabban rekombináns DNS, amely egy Lelystad-ágensspecifikus nukleotidszekvenciát tartalmaz (1. ábra). Az említett Lelystad-ágensspecifikus nukleotidszekvenciát előnyösen bármelyik ORF-ből (nyílt leolvasási keret) választhatjuk (1. ábra).
A peptid/fehérje szinten a találmány tárgya egy Lelystad-ágensspecifikus aminosavszekvenciát tartalmazó peptid (1. ábra).
A találmány tárgya továbbá egy vakcinakészítmény állatok, főleg emlősök, de leginkább sertések vakcinálására, hogy megvédjük őket a Mystery Swine Disease-zel szemben, amely Lelystad-ágenst tartalmaz, élve, elpusztítva vagy legyengítve; vagy egy rekombináns vektort, amely a Lelystad-ágensből származó fehérjét vagy antigén peptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazó nukleinsavat tartalmaz; a Lelystadágens egy antigén részét vagy komponensét; egy Lelystad-ágensből származó fehéijét vagy antigén polipeptidet, illetve egy peptidet, amely a Lelystad-ágens egy
HU 218 431 Β antigén komponensét utánozza; és egy megfelelő hordozót vagy adjuvánst.
A találmány tárgya továbbá egy állatok, főleg emlősök, de leginkább sertések vakcinálására alkalmas vakcinakészítmény, azzal a céllal, hogy a készítménnyel megvédjük az állatokat egy patogén által okozott betegséggel szemben, amely készítmény egy Lelystad-ágensből származó rekombináns vektort tartalmaz a rekombináns vektor a patogénből származó fehérjét vagy antigén peptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz, valamint egy alkalmas hordozót vagy adjuvánst.
A találmány tárgya továbbá egy diagnosztikai kit a Lelystad-ágensből származó nukleinsav kimutatására egy mintából, főleg biológiai mintából, például vérből vagy vérszérumból, köpetből, nyálból, vagy szövetből, amely egy állatból, főleg emlősből, leginkább sertésből származik, azzal jellemezve, hogy egy olyan nukleinsavpróbát vagy indítómolekulát tartalmaz, amelyben a Lelystad-ágens genomjából származó nukleotidszekvencia van, valamint alkalmas kimutatási eszközöket, amelyeket egy nukleinsavkimutatási vizsgálatban alkalmaznak.
A találmány tárgya továbbá egy diagnosztikai kit, egy Lelystad-ágensből származó antigén kimutatására egy mintából, főleg például biológiai mintából, úgymint vérből vagy vérszérumból, köpetből, nyálból, vagy szövetből, amely egy állatból, főleg emlősből, leginkább sertésből származik, azzal jellemezve, hogy egy olyan antitestet tartalmaz, amely specifikusan felismeri a Lelystad-ágens egy részét vagy komponensét, valamint megfelelő eszközöket tartalmaz egy antigénkimutatási vizsgálathoz.
A találmány tárgya továbbá egy diagnosztikai kit egy Lelystad-ágensből származó antigén kimutatására egy mintából, főleg például biológiai mintából, úgymint vérből vagy vérszérumból, köpetből, nyálból, vagy szövetből, amely egy állatból, főleg emlősből, leginkább sertésből származik, azzal jellemezve, hogy egy Lelystad-ágenst tartalmaz; a Lelystad-ágens egy antigén részét vagy komponensét; egy Lelystad-ágensből származó fehérjét vagy antigén polipeptidet; vagy egy olyan peptidet, amely a Lelystad-ágens egy antigén komponensét utánozza; valamint megfelelő kimutatási eszközöket egy antitestkimutatási vizsgálathoz.
A találmány tárgya továbbá eljárás annak diagnosztizálására, hogy egy állat, főleg emlősállat, leginkább sertés meg van-e fertőzve a Mystery Swine Disease kórokozójával, azzal jellemezve, hogy egy mintát készítünk, pontosabban egy biológiai mintát, például vér- vagy vérszérum-, köpet-, nyál- vagy szövetmintát egy állatból, majd vizsgáljuk, hogy tartalmaz-e Lelystad-ágens-nukleinsavat, Lelystad-ágens-antigént, vagy a Lelystadágenst specifikusan felismerő antitestet, amely említett Lelystad-ágens a Mystery Swine Disease kórokozója, és lényegében azonos azzal az izolált Lelystad-ágenssel (CDI-NL-2.91), amelyet 1991. június 5-én letétbe helyeztünk az Institute Pasteurnél (Párizs, Franciaország) 1-1102 letéti számon.
A találmány tárgyát képező eredmény a Central Veterinary Institute (CVI) és a Régiónál Animal Health
Service (RAHS) holland intézetek közös erőfeszítéseinek következménye, amelynek során megpróbálták az új betegség, az MSD kórokozóját megtalálni. Azokat a farmokat, amelyeken a sertéseket az új betegség sújtotta, a RAHS állatorvosai látogatták. A betegség akut és lábadozó fázisában levő beteg sertéseket, a beteg sertésekből vett mintákat és a kocák szérumait a RAHS-ba és a CVI-be küldték vírusizolálásra. Az érintett kocák szérumait tíz ismert sertésvírus antitestjeivel szemben vizsgáltuk. Három különböző vírust, az enkefalomiokarditisz vírust, a sertés 2-es típusú enterovírusát, a sertés 7-es típusú vírusát és egy ismeretlen ágenst, a Lelystad-ágenst (LA) izoláltunk. Azok a sertések, amelyeket a betegség sújtott, főleg LA-ra szerokonvertálódtak, és nagyon ritkán szerokonvertálódtak bármely más vírusizolátumra vagy az ismert virális patogénekre. Ahhoz, hogy az MSD kísérletesen reprodukálható legyen, nyolc vemhes kocát oltottunk be LA-val a vemhesség 84. napján. Egy kocának nyolc halott és négy élő, de nagyon gyenge malaca született a vemhesség 109. napján; a négy élve született malac a születés után egy nappal elpusztult. Egy másik kocának álló. napon három mumifikálódott magzata, három elpusztult malaca és három élő malaca született; az élve született malacok közül kettő egy napon belül elpusztult. Egy harmadik kocának a 117. napon két mumifikálódott magzata, nyolc elpusztult és hét élő malaca született. A többi koca a 115. nap körül ellett, és sokkal kevésbé súlyos szaporodási veszteségük volt. A nyolc kocától származó élő malacok átlagos száma születéskor 7,3, a halva született malacok átlagos száma 4,6 volt. Az LA elleni antitesteket a malacok szopás előtt vett 42 szérummintából 10-ben lehetett kimutatni. Az LA-t három olyan malacból lehetett izolálni, amelyek röviddel születésük után elpusztultak. Ezek az eredmények igazolják azt a következtetést, hogy az LA a kórokozója a Mystery Swine Disease-nek.
Az LA a sertések tüdejének makrofágjaiban szaporodik, citopatikus hatása van, és egy immunoperoxidáz egysejtréteg-vizsgálatban (IPMA) végzett festéssel lehet azonosítani a c 829 és b 822 sertések fertőzés utáni szérumaival, illetve bármely más, az 5. táblázatban felsorolt SPF malac fertőzés utáni szérumával. Az LA elleni antitestek az IPMA-vizsgálatban közvetett festéssel azonosíthatók. Az LA nem nőtt más vizsgált sejtrendszerben. Az LA-t nem semlegesítette a homológ szérum vagy egy olyan szérum, amelyet ismert vírusokból álló készlet ellen készítettünk (3. táblázat). Az LA nem hemagglutinálta a vizsgált vörösvérsejteket. Az LA kisebb 200 nm-nél, mivel az ilyen pórusméretű szűrőn átmegy. Az LA érzékeny kloroformra. A fenti eredmények azt mutatják, hogy a Lelystad-ágenst még nem azonosították egy víruscsoporthoz vagy más mikrobiológiai fajhoz tartozóként. 1991. június 5-én helyeztük letétbe az Institute Pasteurnél (Párizs, Franciaország) 1-1102 letéti szám alatt.
Az LA genomjának szerveződését, a nukleotidszekvenciákat és az ezekből származó polipeptideket azonosítottuk. Ezek az adatok, másokkal együtt (lásd alább) igazolják azt az osztályozást, hogy az LA (a to3
HU 218 431 Β vábbiakban nevezzük Lelystad-vírusnak vagy LV-nek is) egy új víruscsaládnak, az Arteriviridae-nek a tagja. Mint ennek az új családnak a prototípus vírusának, javasoljuk az Equine Arteritis Vírus (EAV) elnevezést, egy új család első tagjának, amelynek a genomjának a replikációs stratégiájáról és a genom szerveződéséről az adatok hozzáférhetők lettek [de Vries, A. A. F., de Chimside, E. D., Bredenbeek, P. J., Gravestein, L. A., Horzinek, M. C. and Spaan, W. J. M., All subgenomic mRNAs of equine arteritis vírus contain a common leader sequence, Nucleic Acids Research, 18, 3241-3247 (1990); valamint az ebben idézett publikációk], A mi szekvenciaadatainknak a Lactate Dehydrogenase-Elevating Vírus (LDV) szekvenciaadataival [Gödény, Ε. K.., Speicher, D. W. and Brinton, M. A., Map location of lactate dehydrogenase-elevating vírus (LDV) capsid protein (Vpl) gene, Virology, 177, 768-771 (1990)] való összehasonlítása alapján azt javasoljuk, hogy az LDV is az Arteriviridae család tagja.
Az Arteriviridae genomszerveződése és transzlációs stratégiája alapján valószínűnek tűnik, hogy ez az új vírus a koronavírusok szupercsaládjába tartozik [Snijder, E. J., den Boon, J. A., Bredenbeek, P. J., Horzinek, M. C., Rijnbrand, R. and Spaan, W. J. M., The carboxyterminal part of the putative Beme vírus polymerase is expressed by ribosomal frameshifting and contains sequence motifs which indicate that toro- and coronaviruses are evolutionary related, Nucleic Acids Research, 18, 4535-4542 (1990)].
Az arterivírusoknak az az általános tulajdonságuk, hogy a megfelelő gazdaszervezetekben az elsődleges célpontjuk a makrofágok. Az LDV replikációjából kimutatták, hogy a gazda szervezetében, az egerekben a makrofágokra korlátozódik, bár a makrofágokhoz való ilyen szigorú ragaszkodást eddig nem igazolták az EAV-nál és az LV-nél.
Az arterivírusok gömbölyű, burokkal rendelkező részecskék, átmérőjük 45-60 nm, és egy ikozahedrális nukleokapszidot tartalmaznak [Brinton-Damell, M. and Plagemann, P. G., Structure and chemical-physical characteristics of lactate dehydrogenase-elevating vírus and its RNA, J. Virol., 16, 420-433 (1975); Horzinek, M. C., Maess, J. and Laufs, R., Studies on the substructure of togaviruses II. Analysis of equine arteritis, rubellá, bovine viral diarrhea and hog cholera viruses, Arch. Gesamte Virusforsch., 33, 306-318 (1971); Hyllseth, B., Structural proteins of equine arteritis vírus, Arch. Gesamte Virusforsch., 40, 177-188 (1973)].
Az Anteriviridae genomja egy pozitív szálú poliadenilezett RNS-molekulából áll, amelynek a mérete körülbelül 12-13 kb [Brinton-Damell, M. and Plagemann, P. G., Structure and chemical-physical characteristics of lactate dehydrogenase-elevating vírus and its RNA, J. Virol., 16, 420-433 (1975); Zeijst, Β. A. M. van dér, Horzinek, M. C. and Moennig, V., The genome of equine arteritis vírus, Virology, 68, 418-425 (1975)]. Az EAV hat szubgenomiális mRNS 3’-hálós csoportjával replikálódik, amelynek a mérete 0,8-3,6 kb között változik, és amely tartalmaz egy leaderszekvenciát, amely a genomiális RNS 5’-végéből származik, és amely a 3’-terminális testszekvenciákhoz van kapcsolva [de Vries, A. A. F, de Chimside, E. D., Bredenbeek, Ρ. I, Gravestein, L. A., Horzinek, M. C. and Spaan, W. J. M., All subgenomic mRNAs of equine arteritis vírus contain a common leader sequence, Nucleic Acids Research, 18, 3241-3247 (1990)].
Itt azt mutatjuk be, hogy az LV genom szerveződése és replikációs stratégiája hasonlít az EAV-éhez, a koronavírusokéhoz és a torovírusokéhoz, míg az utóbbi vírusok genomjának mérete teljesen eltér az LV és az EAV genomjának méretétől.
Az LV genomja egy különösen 14,5-15,5 kb méretű genomiális RNS-molekulát tartalmaz (a becslés semleges agarózgélen végzett mérés alapján történt), amely szubgenomiális RNS-ek 3’-hálózatos csoportjával replikálódik. A szubgenomiális RNS egy leaderszekvenciát tartalmaz, amelynek hossza még ismeretlen, amely a genomiális RNS 5’-végéből származik, és a genomiális RNS 3’-végéhez van fúzionáltatva (2. ábra).
Az LV genomiális RNS nukleotidszekvenciáját átfedő cDNS-klónok alapján határozzuk meg. Egy 15088 bp méretű konszekutív szekvenciát kapunk, amely LV-nek majdnem a teljes genomját lefedi (1. ábra). Ebben a szekvenciában 8 nyitott leolvasási keretet (ORF) azonosítottunk ORF 1 A, ORF IB és a 2-7-es ORF-ek.
Az ORF ΙΑ-ról és az ORF ΙΒ-ről megállapítottuk, hogy feltehetően a virális replikázt vagy polimerázt kódolja, míg 2-6-os ORF-okról megállapítottuk, hogy feltehetőleg szerkezeti virális membránhoz (burok) kötődő fehérjéket kódolnak. Az ORF 7 feltehetőleg a szerkezeti virális nukleokapszid fehéijét kódolja.
Mivel az LV ORF 6 és ORF 7 termékei jelentős mértékű hasonlóságot mutatnak az LDV VpX-ével és Vpl-ével, ezért az a feltételezésünk, hogy az ORF 6 és az ORF 7 is erősen konzerválódik az LV antigénvariánsai között.
Az 1. ábrán látható komplett nukleotidszekvencia, az 1-7-es ORF-ek által kódolt összes fehérje és fehérje-termék, valamint az 1. ábrán látható szekvencia lehetséges összes ORF-jei különösen alkalmasak vakcinafejlesztésre, minden szempontból, valamint diagnosztikai eszközök fejlesztésére, minden szempontból. A szakterületen jártas szakember számára minden lehetséges mód ismert.
Mivel az most már lehetséges, hogy az LA-t, az MSD kórokozóját egyértelműen azonosítsuk, most már vizsgálható, hogy a sertéseket megfertőzte-e az LA vagy sem. Az ilyen diagnosztikai tesztek mostanáig nem voltak hozzáférhetők.
A vizsgálatot végrehajthatjuk úgy, hogy vírust izolálunk makrofágokból vagy egyéb sejttenyésztő rendszerekből, amelyekben az LA szaporodni képes, és a fertőzött tenyészeteket LA elleni antitestekkel festjük (azaz a c 829 vagy b 822 fertőzés utáni szérummal), de az is lehetséges, hogy egyéb típusú diagnosztikai teszteket fejlesszünk ki és alkalmazzunk.
Lehetséges például közvetlen vagy közvetett immunhisztológiai festési technikák alkalmazása, azaz fluoreszcens vegyületekkel, például izotiocianáttal, vagy enzimekkel, például torma-peroxidázzal jelzett LA elleni an4
HU 218 431 Β titestek alkalmazása. Ezek a technikák alkalmazhatók LA antigén kimutatására szöveti szekciókban vagy egyéb mintákban, amelyek feltehetően MSD-fertőzésben szenvedő sertésekből származnak. Az ilyen vizsgálatokhoz szükséges antitest lehet c 829 vagy b 822 vagy egyéb, LA elleni poliklonális antitest, de LA elleni monoklonális antitestek is használhatók.
Emellett, mivel az LA természete és szerveződése, valamint ennek a genomnak a nukleotidszekvenciája már meg van határozva, ezért az LA-specifikus nukleotidszekvenciákat azonosítani lehet, és arra lehet használni, hogy olyan oligonukleotidszekvenciákat fejlesszünk ki, amelyek próbaként vagy indítómolekulaként használhatók diagnosztikai technikákban, például hibridizációban, polimeráz-láncreakcióban vagy bármely más olyan technikában, amelyet arra fejlesztettek ki, hogy velük nukleotidszekvenciákat mutassunk ki specifikusan.
Az is lehetséges, hogy LA elleni antitestekre vizsgáljunk. Az 5. táblázatból látható, hogy a kísérletesen megfertőzött sertések gyorsan antitesteket hoznak létre az LA ellen, és a 4. táblázat azt mutatja, hogy a tenyésztésben levő sertésekben is erős LA elleni antitestválaszok alakulnak ki. Most már tehát meghatározható, hogy a sertések régebben megfertőződtek-e LA-val. Az ilyen vizsgálat igen fontos annak meghatározásánál, hogy a sertések vagy sertéscsoportok, vagy egy egész régió, illetve ország sertései mentesek-e az LA-tól. A vizsgálatot az előzőkben leírt módon, IPMA felhasználásával lehet végezni, de az is lehetséges, hogy egyéb típusú diagnosztikai teszteket fejlesszünk ki és alkalmazzunk az LA elleni antitestek kimutatására.
Az LA-specifikus fehéijék, polipeptidek és peptidek vagy olyan peptidszekvenciák, amelyek az LA antigénkomponenseit utánozzák, használhatók az ilyen vizsgálatokban. Az ilyen fehéijék származhatnak az LA-ból magából, de az is lehetséges, hogy ilyen fehérjéket rekombináns DNS- vagy peptidszintézis-technikákkal állítsunk elő. Ezekben a tesztekben LA elleni, vagy az LA-specifikus komponensei elleni specifikus poliklonális és/vagy monoklonális antitestek használhatók, és/vagy olyan sejtrendszerek, amelyek LA-val vannak fertőzve, vagy LA-antigént expresszálnak. Az antitestek használhatók például az LA-antigén rögzítésének eszközeként (egy szilárd felszínt borítunk az antitesttel, majd az LA-antigént az antitestek megkötik), amely a teszt nagyobb specifitását eredményezheti, vagy használható egy kompetitív vizsgálatban (a mintában levő jelzett és ismeretlen antitest verseng a hozzáférhető LA-antigénért).
Továbbá, az előzőkben ismertetett diagnosztikai lehetőségek használhatók annak vizsgálatára, hogy más állatok, például emlősök, madarak, rovarok vagy halak, vagy növények, vagy bármely egyéb élőlény fertőzhető-e vagy már megfertőződött az LA-val vagy rokon ágenssel.
Mivel az LA-t azonosítottuk mint az MSD-kórokozóját, ezért lehetséges, hogy vakcinát készítsünk, amellyel a sertéseket ez ellen a betegség ellen meg lehet védeni. Egy ilyen vakcina egyszerűen úgy állítható elő, hogy az LA-t sertéstüdő-makrofág tenyészetben, vagy más olyan sejtrendszerben szaporítjuk, amelyben az LA megél. Az LA-t azután vagy tisztítjuk, vagy nem, és jól ismert módszerekkel elpusztítjuk, például formáimnál vagy UV-besugárzással. Az inaktivált LA-t azután adjuvánsokkal kombinálhatjuk, például Freund-féle adjuvánssal vagy alumínium-hidroxiddal vagy másokkal, és ezt a készítményt injekciózhatjuk sertésekbe.
Elő LA-t nem tartalmazó vakcinák is készíthetők LA-vel fertőzött tenyészetekből származó LA-fehéijekészítményekből, vagy olyan sejtrendszerekből, amelyek rekombináns DNS-technikákkal LA-fehérjéket expresszálnak. Az LA ilyen alegységeit azután az előzőkben ismertetett módon kezeljük, ennek eredménye lehet egy alegységvakcina.
Az LA-nak ennél kisebb komponenseit, azaz polipeptideket, peptideket, vagy az LA antigénkomponenseit utánozó peptideket tartalmazó vakcinák is alkalmasak élő LA-t nem tartalmazó vakcinák előállítására.
MSD elleni, élő LA-t nem tartalmazó vakcinák készíthetők rekombináns DNS-technikákkal is, amely során az LA genomját, vagy annak részeit vektorrendszerekbe építjük be, például vakcíniavírusba, herpeszvírusba, pszeudorabieszvírusba, adenovírusba, bakulovírusba vagy más alkalmas vektorrendszerbe, amely képes LA-antigént expresszálni megfelelő sejtrendszerekben. Az ilyen rendszerből származó LA-antigén használható az előzőkben ismertetett vakcina kifejlesztésére, és az ilyen termékkel vakcináit sertések protektív immunválaszt fejlesztenek ki magukban az LA ellen.
Az MSD elleni vakcinák alapulhatnak élő LA-készítményeken is. Mivel a fiatal malacok és a vemhes kocák láthatóan nagyon érzékenyek az LA-fertőzésre, ezért lehetséges, hogy attenuálatlan LA-t, amely sertéstüdőmakrofágokban nő, használjunk idősebb malacok vagy tenyészállatok vakcinálására. Ily módon a kocák megvédhetők az MSD-fertőzéssel szemben, mielőtt vemhesek lennének, aminek eredménye az, hogy védve vannak az abortálás és a koraszülés ellen, valamint a malacok veleszületett fertőzésével szemben. Emellett az az anyai antitest, amelyet ezek a vakcináit kocák adnak át az utódaiknak, megvédi őket a betegséggel szemben.
Az MSD elleni attenuált vakcinák (módosított élő vakcinák) előállíthatok úgy, hogy az LA-t sorozatosan átoltjuk sertéstüdő-makrofágokon, tüdőmakrofágokon vagy egyéb sejteken, vagy más sejtrendszereken, vagy más állatokon, például nyulakon, egészen addig, amíg patogenicitásukat elveszítik.
Az MSD elleni élő vakcinákat rekombináns DNStechnikákkal is előállíthatjuk, amely során az LA genomját, vagy annak részeit egy vektorrendszerbe építjük be, például vakcíniavírusba, herpeszvírusba, pszeudorabieszvírusba, adenovírusba vagy más alkalmas vektorrendszerbe, amely képes így LA-antigént expresszálni. Az ilyen vektorrendszerrel vakcináit sertések azután védő immunválaszt fejlesztenek ki magukban LA ellen.
A Lelystad-ágens önmagában specifikusan alkalmas élő vektorrendszerként való alkalmazásra. Idegen gének építhetők be az LA genomjába, és expresszálhatják a megfelelő fehérjét a makrofágok megfertőzése során. Az
HU 218 431 Β ilyen sejt, amely egy antigént bemutató sejt, termeli az idegen antigént, és bemutatja a B-limfocitáknak, valamint a T-limfocitáknak, amelyek azután a megfelelő immunválaszt adják.
Mivel az LA nagyon sejtspecifikusnak tűnik és valószínűleg nagyon faj specifikus is, ezért ez a vektorrendszer egy nagyon biztonságos rendszer lehet, amely nem veszélyeztet más sejteket vagy fajokat.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékletben megadott ábrákat.
Az 1. ábrán az LV genom nukleotidszekvenciája látható. Az azonosított ORF-ek kikövetkeztetett aminosavszekvenciáját is bemutatjuk. A (feltételezett) ATG starthelyek által kódolt metioninokat vastagítva jelezzük, a feltételezett N-glikozilezési helyeket aláhúzzuk. A nukleotid- és az aminosavszekvenciákban levő különbségeket, amelyeket különböző cDNS-klónok szekvenálásával kaptunk, jelezzük. A 25-ös indítómolekula szekvenciáját, amelyet a hibridizációs kísérletekben használtunk (lásd 2. ábra és az „Eredmények” rész), aláhúztuk.
A 2. ábrán az LV genom szerveződése látható. A cDNS-klónokat, amelyeket a nukleotidszekvencia meghatározásában használtunk, az ábra felső részében jelezzük. A kiónoknak azt a részét, amelyeket szekvenáltunk, feketével jelöljük. Az ábra alsó részén az ORFek a nukleotidszekvenciákban jelezve vannak, és az mRNS-ek szubgenomiális csoportját, amelyek ezeket az ORF-eket kódolják, szintén jelezzük. Az ORF-eknél látható szaggatott vonalak alternatív iniciációs helyeket (ATG-k) jelentenek ezekben az ORF-ekben. A genomiális és szubgenomiális RNS-ek leaderszekvenciáját folytonos vonalú négszöggel jelezzük.
A 3. ábrán az LA szaporodási jellemzői láthatók:
- üres négyzetek - a sejtmentes vírus titere,
- tele négyzetek - a sejthez kötött vírus titere,
- folyamatos vonal - a citopátiás hatás (CPE) százaléka.
Anyagok és módszerek
Mintagyűjtés
A mintákat és a sertéseket olyan farmokról gyűjtjük, ahol a tenyészet valószínűleg MSD-vel fertőzött. Azoknak a farmoknak a kiválasztásában, amelyeken MSDfertőzés fordul elő, lényeges kritérium: étvágytalan kocák, koraszülés és abortálás előfordulása, gyenge utódok, légzési betegségek és pusztulás a fiatal malacok között. A fiatal malacok négy csoportjából származó mintákat vizsgáltunk:
(1) szövetminták és szájkenetek az érintett malacokból a tenyészetből (1A. táblázat), (2) vérminták és szájkenetek az érintett kocákból a tenyészetből (1B. és 4-es táblázat), (3) szövetminták, orrkenetek és vérminták, specifikus patogénmentes (SPF) malacokból gyűjtve, amelyek kísérletesen fertőztünk a tenyészetből származó, érintett kocákkal, vagy (4) szövetminták, orrkenetek és vérminták, specifikus patogénmentes (SPF) sertésekből gyűjtve, amelyeket kísérletesen fertőztünk a tenyészetből származó, érintett kocák vérmintáival való beoltás után (2-es és 5-ös táblázat).
Minta-előkészítés
A vírus izolálásához a mintákat olyan malacokból és kocákból nyerjük, amelyekről a klinikai tünetek alapján feltételezhető, hogy MSD-ben szenvednek, valamint kísérletesen fertőzött SPF sertésekből, kocákból és malacaikból.
A szövetmintákat egy kriosztát mikrotommal szeleteljük, és a szekciókat direkt immunfluoreszcencia-vizsgálatnak (IFT) vetjük alá, különböző sertéspatogének elleni konjugátumokkal.
A szövetmintákból 10%-os szuszpenziókat készítünk Hank-féle BSS-ben, amelyet antibiotikumokkal, majd száj- és orrkeneteket mártunk a Hank-féle BSSbe, amely antibiotikumokkal van kiegészítve. Egy óra hosszat szobahőmérsékleten tartjuk, majd a szuszpenziókat 10 percig 6000 x g-vel centrifugálva tisztítjuk, és a felülúszót -70 °C-on tároljuk a további felhasználásig. Leukocitaffakciókat izolálunk EDTA-val vagy heparinnal kezelt vérből, a korábbi leírások szerint [Wensvoort, G., Terpstra, C. and Kluyver, E. P. de, Characterization of porcine and somé ruminant pestiviruses by crossneutralization, Vet. Microbiol., 20, 291-306 (1989)], majd -70 °C-on tároljuk. A vírusizoláláshoz használt plazmát és szérumot -70 °C-on tartjuk.
A szerológiai vizsgálathoz használt szérumot olyan kocáktól vesszük, amelyekről feltételezhető, hogy az MSD akut fázisában szenvednek, majd egy párhuzamos szérummintát veszünk 3-9 héttel később. Emellett szérummintákat veszünk kísérletesen fertőzött SPF sertésekből, szabályos időközönként, majd anyatej- és szérummintát veszünk kísérletesen fertőzött kocákból és malacaikból. A szerológiai vizsgálathoz használt szérummintákat -20 °C-on tároljuk.
Sejtek
Sertéstüdő-makrofágokat 5-6 hetes SPF sertésekből, illetve felnőtt SPF kocákból nyerünk, amelyek a Central Veterinary Institute saját kondájából valók. A tüdőket 5-8 alkalommal mossuk foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS). A mosófolyadék mindegyik alikvot részét összegyűjtjük, majd 10 percig 300 χ g-vel centrifugáljuk. A kapott sejtüledéket ismét mossuk PBS-ben, majd tenyésztő táptalajban szuszpendáljuk (160 ml 199-es táptalaj, 20 ml 2,95%-os triptóz-foszfáttal, 20 ml boíjúmagzat-szérummal (FBS) és 4,5 ml 1,4%-os nátrium-bikarbonáttal kiegészítve) 4xl07 sejt/ml koncentrációban. A sejtszuszpenziót ezután lassan elkeverjük azonos térfogatú DMSO-keverékkel (6,7 ml fenti összetételű táptalaj, 1,3 ml FBS, 2 ml 97%-os DMSO), 2 ml-es alikvot részek formájában folyékony nitrogénben tároljuk.
Az egyik ampullában levő makrofágokat sejttenyésztéshez készítjük elő oly módon, hogy kétszer mossuk Earle-féle MÉM táptalajjal, majd 30 ml tenyésztő táptalajban szuszpendáljuk (Earle féle MÉM, kiegészítve 10% FBS-sel, 200 E/ml penicillinnel, 0,2 mg/ml sztreptomicinnel, 100 E/ml mikosztatinnal és 0,3 mg/ml glutaminnal). PK-15 sejteket (American Type Culture Collection, CCL33) és SK.-6 sejteket [Kasza, L., Shadduck, J. A. and Christoffinis, G. J., Establishment, viral susceptibility and biological characteristics
HU 218 431 Β of a swine kidney cell line, SK-6, Rés. Vet. Sci., 13, 46-51 (1972)], majd Wensvoort leírása szerint [Wensvoort, G., Terpstra, C. and Kluyver, E. P. de, Characterization of porcine and somé ruminant pestiviruses by cross-neutralization, Vet. Microbiol., 20, 291-306 (1989)] tenyésztjük őket. Másodlagos sertéssejteket (PK2) növesztünk Earle-féle MÉM táptalajban, amelyet 10% FBS-sel és a fenti antibiotikumokkal egészítünk ki. Mindegyik sejtet 37 °C-ra és 5% CO2-tartalomra állított sejttenyésztő inkubátorban szaporítjuk.
Vírusizolálási eljárások
A vírus izolálását beállított technikák alapján végezzük, PK2, PK-15 és SK-6 sejtek és sertéstüdő-makrofágok alkalmazásával. Az előbbi három sejtet 25 mles lombikokban (Greiner) szaporítjuk, majd beoltjuk a tesztmintával, amikor az egysejtréteg 70-80%-os egybeolvadást ér el. A makrofágokat 100 μΐ-es alikvot részekben 96 lukas mikrotiterlemezekre (Greiner) visszük, vagy nagyobb térfogatokban megfelelő lombikokba, és a tesztmintával az átoltás után egy órán belül beoltjuk. A tenyészeteknél naponta vizsgáljuk a citopátiás hatásokat (CPE), majd -70 °C-ra lefagyasztjuk, amikor 50-70%-os CPE-szintet elértünk, illetve öt-tíz napi tenyésztés után. A további átoltásokat az 1. vagy 2., vagy későbbi átoltásból származó, fagyasztás után felolvasztott anyaggal végezzük. Néhány mintát kilenc-tizenkét napos megtermékenyített tyúktojásba is beoltunk. Allantoinfolyadékot kétszer inokuláljuk még, háromnapos inkubálási periódust alkalmazva, majd a harmadik átoltás termékét hemagglutinációval vizsgáljuk 4 °C-on, csirke-vörösvérsejtek felhasználásával, majd ELISA-val, amely specifikusan kimutatja az influenza A vírus nukleoproteinjét [Boer, G. F. de, Back, W. and Ostemaus, A. D. Μ. E., Antibiotikum ELISA fór detection of antibodies against influenza A nucleoprotein in humán and various animal species, Arch. Virol., 115,47-61 (1990)].
Szerológia
A szérumokat hemagglutinációt gátló vizsgálatokkal (HAI) elemezzük, hogy tanulmányozzuk a hemagglutináló enkefalitiszvírus (HÉV), valamint a H1N1 és H3N2 sertés-influenzavírusok elleni antitest kifejlődését, Masurei leírása szerint [Masurel, N., Swine influenza vírus and the recycling of influenza A viruses in mán, Láncét, ii, 224-247 (1976)]. A szérumok induló hígítása haemophilus iníluenzae-ban 1:9, miután a szérumokat kétszeresre hígítjuk.
A szérumokat beállított enzimhez kötött immunadszorpciós vizsgálatokkal (ELISA) vizsgáljuk az alábbi vírus glikoproteinjei elleni antitestekre: pszeudorabieszvírus [PRV; Oirschot, J. T. van, Houwers, D. J., Rziha, H. J. and Moonen, P. J. L. M., Development of antibiotikum ELISA fór detection of antibodies to glycoprotein I of Aujeszky’s disease vírus: a method fór the serological differentiation between infected and vaccinated pigs, J. Virol. Meth., 22, 191-206 (1988)], sertés-parvovírus [PPV, Westenbrink, F., Veldhuis, M. A. and Brinkhof, J. M. A., An enzyme-linked immunosorbent assay fór detection of antibodies to porcine parvo vírus, J. Virol. Meth., 23, 169-178 (1989)], sertés virális hasmenésvírus [Westenbrink, F., Middel, W. G. J., Straver, P. and Leeuw, P. W. de, A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) fór bovine vírus diarrhoea vírus serology, J. Vet. Med. B33, 354-361 (1986), és a sertés-koleravírus [Wensvoort, G., Terpstra, C. and Bloemraad, M., An enzyme immunassay, employing monoclonal antibodies and detecting specifically antibodies against classical swine fever vírus, Vet. Microbiol., 17, 129-140 (1988)]. Az ELISA-k induló hígítása 1:5, majd ezután a szérumokat kétszeresre hígítjuk.
A szérumokat vizsgáljuk a semlegesítő antitestek szempontjából 30-300 TCID50 enkefalomiokarditiszvírusok (EMCV), sertés-enterovírusok (PEV) és Lelystadágens (LA) ellen, Terpstra előírásai szerint [Terpstra,
C. , Detection of Bordér disease antigén in tissues of affected sheep and in cell cultures by immunofluorescence, Rés. Vet. Sci., 25, 350-355 (1978)]. A szérumsemlegesítési vizsgálatokban (SNT) a szérumok induló hígítása 1:5, azután a szérumokat kétszeresre hígítjuk.
A szérumokat vizsgáljuk, hogy kötődik-e az LA-hoz egy immunperoxidáz egysejtréteg-vizsgálatban (IPMA). Lelystad-ágenst (LA; kód: CDI-NL-2.91) oltunk mikrotiterlemezekre, oly módon, hogy 50 ml növesztő táptalajt, amely 100 TCID50 LA-t tartalmaz, adunk egy mikrotiterlemez lukaiba, amely frissen felvitt tüdőmakrofágokat tartalmaz. A sejteket két napig növesztjük, majd a leírások szerint fixáljuk [Wensvoort, G., Terpstra, C., Boonsta, 1, Bloemrad, M. and Zaane,
D. van, Production of monoclonal antibodies against swine fever vírus and their use in laboratory diagnosis, Vet. Microbiol., 12, 101-108 (1986)]. A szérumok hígítása 1:10 0,15 mol/1 NaCl, 0,05 Tween 80,4% lószérum összetételű oldatban, illetve tovább hígítjuk négyszeres lépésekben, a lukakhoz adjuk, majd egy óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on. Birka antisertés immunglobulin (Ig)-t (torma-peroxidázhoz (HRPO), (DAKO) konjugálva) ugyanabban a pufferben hígítjuk, és egy második inkubálásban alkalmazzuk egy óra hosszat 37 °C-on, miután a lemezeket a leírások szerint festjük [Wensvoort, G., Terpstra, C., Boonsta, 1, Bloemrad, M. and Zaane, D. van, Production of monoclonal antibodies against swine fever vírus and their use in laboratory diagnosis, Vet. Microbiol., 12, 101-108 (1986)]. A fertőzött makrofágok intenzív vörös festődése jelzi, hogy a szérum kötődik az LA-hoz.
Vírusazonosítási eljárások
A citopátiás izolátumok azonosságát CsCl-ban való sűrűségmeghatározással végezzük oly módon, hogy megbecsüljük a részecskeméretet negatívan festett készítményekben elektronmikroszkópiával oly módon, hogy meghatározzuk az izolátum kloroformérzékenységét és az izolátum CPE-jét semlegesítve ismert specifitású szérumokkal (3. táblázat). Amikor egy izolátumot specifikusan semlegesítünk egy ismert vírus elleni szérummal, akkor az izolátumot ennek az ismert vírusnak a képviselőjének tekintjük.
A makrofágtenyészeteken CPE-t mutató izolátumokat tanulmányozzuk IPMA-ban való festéssel is, c 829 vagy b 822 sertések fertőzés utáni szérumával.
HU 218 431 Β
Az izolátumokat újra leoltjuk makrofágtenyészetekre, és két nappal az oltás után fixáljuk, mielőtt az izolátum CPE-t mutat. Amikor egy izolátum reaktivitást mutat IPMA-ban a c 829 vagy b 822 sertések fertőzés utáni szérumával, akkor az izolátumokat Lelystad-ágensnek minősítjük. A többi izolátum képviselőit, amelyek makrofágokon szaporodnak, vagy a fertőzetlen makrofágokat is megfestjük ezekkel a szérumokkal, hogy a szérumok specifitását vizsgáljuk.
A Lelystad-ágens további azonosítása
A Lelystad-ágenst tovább tanulmányozzuk hemagglutinációval 4 °C-on és 37 °C-on csirke-, aranyhörcsög-, sertés-, birka- vagy humán 0-ás vörösvérsejtekkel. A hemagglutinációs vizsgálatokban pozitív kontrollként SIV-et (H3N2 altípus) használunk.
A pszeudorabieszvírus (PRV), az átadható gasztroenteritiszvírus (TGE), a sertés járványos hasmenésvírus (HÉV), afrikai sertéslázvírus (ASFV), sertés-koleravírus (HCV) és sertés H1N1, valamint H3N2 típusú influenzavírus elleni specifikus sertés antiszérumok kötődése, a szarvasmarha 1-es és 4-es típusú herpeszvírus (BHV 1 és 4), a rosszindulatú hurutos láz (MCF), a 3-as parainfluenzavírus (PI3), a szarvasmarha légzési szincíciumvírus (BRSV) és a szarvasmarha-leukémiavírus (BLV) elleni specifikus szarvasmarha-antiszérumok kötődése, a madár leukémiavírus (ALV) és a fertőző bronchitisvírus (IBV) elleni specifikus madárantiszérumok kötődését faj-Ig-specifikus HRPO-konjugátumokkal tanulmányozzuk egy IPMA-ban LA-val fertőzött, illetve nem fertőzött sertéstüdő-makrofágokban, az előzőkben leírt módon.
IPM-ben vizsgáltunk különböző antiszérumfajtákat, amelyek mumpszvírus, Sendai-vírus, kutya-szopornyicavírus, marhavészvírus, kanyaróvírus, egér-tüdőgyulladásvírus, szarvasmarha légzési szincíciumvírus, veszettségvírus, habos vírus, maedi-visna vírus, szarvasmarha- és rágcsáló-leukémiavírus, humán, macska- és majom-immundeficienciavírus, koriomeningitiszvírus, macska fertőző peritonitiszvírus, egér-hepatitiszvírus, Breda-vírus, Hantaan-vírus, Nairobi birkabetegség-vírus, keleti, nyugati és venezuelai ló-agyvelőgyulladás vírus, rubeolavírus, lóarteritiszvírus, laktát-dehidrogenázvírus, sárgalázvírus, kullanccsal terjesztett agyvelőgyulladás-vírus és hepatitisz C vírus ellen irányulnak.
Az LA-t vakon átoltjuk PK2, PK-15 és SK-6 sejtekben, valamint megtermékenyített tyúktojásban. Két átoltás után az anyagot ismét átoltjuk sertéstüdő-makrofág tenyészetekbe, hogy az LA-t újra izoláljuk.
Az LA-t sertésmakrofágokban titráljuk, mielőtt és miután egy 0,2 mikronos szűrőn nyomjuk keresztül (Schleicher and Schüll). Az LA-t IPMA-ban és CPE-ja révén mutatjuk ki. A titereket Reed és Muench szerint számítjuk ki [Reed, L. J. and Muench, H., A simple method of estimating fifty percent endpoints, Am. J. Hyg., 27, 493-497 (1938)].
A továbbiakban előállítottunk LA elleni sertés antiszérumokat. Két SPF sertést (21-es és 23-as) fertőzünk intranazálisan 105 TCID50, az ötödik átoltásból származó LA-val. Két másik SPF sertést (25-ös és 29es) intranazálisan fertőzzünk egy LA-val fertőzött SPF malac tüdejéből készített friss szuszpenzióval, amely
105 TCID50 LA-t tartalmaz. A fertőzés után 0,14,28 és nappal vérmintákat veszünk (dpi).
Emellett az LA-t sertés alveoláris makrofágokban szaporítjuk, hogy meghatározzuk növekedésének időbeli mintázatát. A sertés alveoláris makrofágokat F25 lombikokba (Greiner) oltjuk, LA-val fertőzzük 0,01 TCID50 per sejt fertőzési multiplicitással. 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56 és 64 órával a fertőzés után egy lombikot vizsgálunk, és meghatározzuk a CPE százalékát egy fertőzetlen kontrolltenyészethez viszonyítva. A tenyésztő táptalajt azután kinyerjük, és azonos térfogatú foszfáttal puffereit sóoldattal helyettesítjük. A táptalajt és a lombikot 70 °Con tároljuk. Miután az összes tenyészetet begyűjtöttük, az LA-titereket meghatározzuk és lóg TCID5o mb1 formában expresszáljuk.
Az LA morfológiáját elektronmikroszkópiával tanulmányozzuk. Az LA-t az előzőkben leírt módon szaporítjuk. 48 óra elteltével a tenyészeteket lefagyasztjuk, majd felolvasztjuk, és 10 percig centrifügáljuk 6000xg-vei. 30 ml felülúszót ezután 0,3 ml LA-specifikus sertésszérummal keverünk össze, majd 1,5 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on. 30 percig centrifugáljuk 125 OOOxg-vel, majd a kapott üledéket 1%-os Seakem agarózmegfelelőben szuszpendáljuk, amely foszfáttal puffereit sóoldatban készült 40 °C-on. Koagulálás után az agarózblokkot, 0,8%os glutáraldehidet és 0,8% ozmium-tetroxidot tartalmazó veronál/acetát pufferbe (pH=7,4, 230 mOsm/kg H2O) merítjük és [Hirsch, J. G. and Fedorko, Μ. E., Ultrastructure of humán leukocytes affér simultaneous fixation with glutaraldehyde and osmium-tetroxide and postfixation in uranilacetate, Journal of Cellular Biology, 38, 615 (1968)], majd mikrohullámos besugárzással rögzítjük. Ezt az eljárást megismételjük egy friss rögzítőszerrel. A mintát vízzel mossuk, 1%-os uranil-acetátba merítjük, majd mikrohullámos besugárzással festjük. Az összes lépés során a mintát 0 °C-on tartjuk, és a mikrohullámú sütőt (Samsung RE211D) olvasztó állásba tesszük 5 percre. Vékony metszeteket készítünk standard módszerekkel, ólom-citráttal festjük [Venable, J. H. and Coggeshall, R., A simplified lead citrate stain fór use in electronmicroscopy, Journal of Cellular Biology, 25, 407 (1965)], majd egy Philips CM10 elektronmikroszkóppal vizsgáljuk.
Tovább folytattuk az LA-izolálást MSD-ben szenvedő sertések szérumából. A szérumminták Hollandiából (Hollandia 2 tenyésztési eset), Németországból (Németország 1 és Németország 2 tenyésztési eset; Dr. Bemer, München, és Dr. Nienhoff, Münster szívességéből), és az Amerikai Egyesült Államokból származtak [amerikai egyesült államokbeli 1-es kísérleti eset (a kísérleteket az ATCC VR-2332-vel végezték, Dr. Collins, St. Paul és Dr. Chladek, St. Joseph szívességéből); valamint az amerikai egyesült államokbeli 2-es és az amerikai egyesült államokbeli 3-as tenyésztési esetek, Dr. van Alstine, West Lafayette és Dr. Slife, Galesburg szívességéből]. Mindegyik mintát a „Centraal Diergeneeskundig Instituut, Lelystad”-ba küldtük az LA-diagnózis céljából. Mindegyik mintából vírust izoláltunk, az előzőkben
HU 218 431 Β leírt módon sertés alveoláris makrofágokon. A citopatikus izolátumokat háromszor átoltjuk, majd LA-ként azonosítjuk specifikus immunfestéssel b 822 és c 829 anti-LA-fertőzés utáni szérumokkal.
Vizsgáltuk az NL1 (az első LA-izolátum; kódja CDI-NL-2.91), az NL2, GE1, GE2, US1, US2 és US3 izolátumok antigén viszonyát. Az izolátumokat makrofágokban szaporítjuk az előzőkben leírt módon, majd IPMA-ban vizsgáljuk egy sorozat tenyésztésből származó szérummal és két kísérleti szérummal. A szérumokat IPMA-ban is vizsgáljuk fertőzetlen makrofágokkal.
A tenyészetekből származó szérumok: két LV-re pozitív szérum (TH-187 és TO-36) szérumot választottunk ki egy csoport LA-pozitív holland tenyészetből származó szérumból. Huszonegy szérumot választottunk ki külföldről szerológiai diagnózis céljára Lelystadba küldött, tenyészetekből származó szérumokból. A szérumok eredete Németország (BE-352, BE-392 és NI-Í2; Dr. Bemer, München, és Dr. Nienhoff, Münster szívességéből), Nagy-Britannia (PA-141615, PA-141617 és PA-142440; Dr. Paton Weybridge szívességéből), Belgium (PE-1960; Prof. Pensaert, Gént szívességéből), Franciaország (EA-2975 és EA-2985; Dr. Albina, Ploufragan szívességéből), az Amerikai Egyesült Államok (SL-441, SL-451, AL-RP9577, AL-P10814/33, AL-4994A, AL-7525, JCMN41, JC-MN44 és JC-MN45; Dr. Slife, Galesburg, Dr. van Alstine, West Lafayette és Dr. Collins, St. Paul szívességéből) és Kanada (RB-16, RB-19, RB-22 és RB-23; Dr. Robinson, Québec szívességéből).
A kísérleti szérumok az alábbiak voltak: az előzőkben leírt sertésszérumcsoport, amely a 21-es, 23-as, 25ös és 29-es sertésekből származik, dpi 0, 14, 28 és 42nél levéve. Egy sorozat, négy hat hónapos emse malacból származó kísérleti szérumot (Dr. Chladek, St. Joseph és Dr. Collins, St. Paul szívességéből) oltunk be intranazálisan 105-1 TCID50 ATTC VR-2332 izolátummal. A vérmintákat a 2B emse malacból 0, 20, 36 és dpi-nél vesszük; a 9G emse malacból 0, 30, 44 és 68 dpi-nél vesszük, a 16W emse malacból 0, 25, 40 és dpi-nél vesszük; a 16Y emse malacból 0, 36 és 64 dpi-nél vesszük.
Ahhoz, hogy radioimmunprecipitációs vizsgálattal [RIP; Mazancourt, A. de, Waxham, Μ. N., Nicholas, J. C. and Wolinsky, J. S., Antibody response to the rubellá vírus structural proteins in infants with the congenital rubellá syndrome, J. Med. Virol., 19, 111-122 (1986)] tanulmányozzuk a fertőzött alveoláris makrofágokban levő LA-fehérjéket, az LA-val fertőzött és a feartőzetlen makrofágokat 16 óra hosszat szaporítjuk 35S-ciszteint tartalmazó jelző táptalajban. Azután a jelzett sejteket standard módszerekkel kicsapjuk a b 822 sertés és a 23-as sertés 42 dpi fertőzés utáni szérumával, valamint az MN8 szérummal, amelyet a koca ATCC VR-2332-vel való megfertőzése után (Dr. Collins, St. Paul szívességéből) 26 nappal kapunk. A kicsapott fehérjéket elektroforézissel elemezzük 12%-os SDS-poliakrilamid-gélen, majd fluorográfiával tesszük láthatóvá.
Az LA genomjának jellemzésére kivontuk a sejtmag-DNS-t és a citoplazmatikus RNA-t az LA-vel fertőzött és 24 óra hosszat növesztett, illetve fertőzetlenül hagyott makrofágtenyészetekből. A sejtek táptalaját elöntjük, majd a sejteket kétszer mossuk foszfáttal puffereit sóoldattal. A DNS-t a leírás szerint vonjuk ki [Favaloro, J., Treisman, R. and Kamen, R., In: Methods in Enzymology, 65, 718-749 (eds. Grossman, L., Moldave K.) Acedemic Press, New York (1980)], 5,7 mol/1 CaCl-pámán keresztül való centrifugálással tisztítjuk [Setzer, D. R., McGrogan, M., Nunberg, J. H. and Schimke, R. T., Size heterogenecity in the 3’ end of the dehydrofolate reductase messenger RNA’s in mouse cells, Cell, 22, 361-370 (1980;], RN-áz mentes DN-ázzal kezeljük (Pharmacia), majd 0,8%-os semleges agarózgélen elemezzük [Moorman, R. J. M. and Hulst, Μ. M., Hog cholera vírus: identification and characterization of the viral RNA and virus-specifíc RNA synthesized in infected swine kidney cells, Vírus Rés., 11, 281-291 (1988)].
Klónozás és szekvenálás
Az LV RNS klónozása céljából LV-fel fertőzött sertéstüdő alveoláris makrofágjainak intracelluláris RNS-ét (10 pg) inkubáljuk 10 mmol/1 metil-higany-hidroxiddal 10 percig szobahőmérsékleten. A denaturált RNS-t 42 °C-on inkubáljuk 50 mmol/1 TRIS-HCI pH=7,8, 10 mmol/1 MgCl2, 70 mmol/1 KC1, 0,5 mmol/1 dATP, dCTP, dGTP és dTTP, 0,6 pg boíjútímusz oligonukleotid indítómolekulák pd(N)6 (Pharmacia), és 300 egység Moloney-leukémiavírus reverz transzkriptáz (Bethesda Research Laboratories) összetételű pufferben, 100 pl végtérfogatban. 1 óra elteltével 20 mmol/1 EDTA-t adunk hozzá; a reakcióelegyet azután fenol: kloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, és Sephadex G50 oszlopon engedjük át, majd etanollal kicsapjuk.
A második cDNS-lánc szintéziséhez DNS-polimeráz I-et (Boehringer) és RN-áz H-t (Pharmacia) használunk [Gübler, U. and Hoffman, B. J., A simple and very efficient method fór generating cDNA libraries, Gene, 25, 263-269 (1983)]. Ahhoz, hogy tompa végeket hozzunk létre, a kétszálú cDNS-t T4 DNS-polimerázzal (Pharmacia) inkubáljuk egy olyan reakcióelegyben, amely 0,05 mmol/1 koncentrációban tartalmaz dezoxinukleotid-trifoszfátokat. Ezt követően a cDNS-t egy 0,8%-os semleges agarózgélen frakcionáljuk [Moorman, R. J. M. and Hulst, Μ. M., Hog cholera vírus: identification and characterization of the viral RNA and virus-specifíc RNA synthesized in infected swine kidney cells, Vírus Rés., 11, 281-291 (1988)]. Az 1-4 kb méretű fragmenteket elektroeluáljuk, a pGEM-4Z (Promega) Smal hasítási helyére ligáljuk, majd Escherichia coli DH5a törzs [Hanahan, D., In: DNA cloning I; A Practical Approach, Chapter 6, 109-135 (1985)]. A telepfiltereket 32P-vel jelzett egyszálú cDNS-próbával hibridizáljuk. A próbát LV RNSből készítjük reverz transzkripcióval, amely RNS-t semleges agarózgélben frakcionálunk [Moorman, R. J. M. and Hulst, Μ. M., Hog cholera vírus: identification and characterization of the viral RNA and virus-specifíc RNA synthesized in infected swine kidney cells, Vírus
HU 218 431 Β
Rés., 11, 281-291 (1988)]. Mielőtt az egyszálú DNSpróbát használnánk, látszatfertőzött tüdő alveoláris sejtekből származó citoplazmatikus RNS-sel inkubáljuk.
Az LV cDNS-klónok közötti kapcsolatot restrikciós enzimes elemzéssel és az emésztett DNS-nick-transzlációnak alávetett cDNS-próbával végzett Southern biot hibridizálásával határozzuk meg [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].
A virális genom 3’-végének előállítása céljából egy második cDNS-könyvtárat készítünk, oligo (dT)i2_18 és egy 3’-LV-specifikus oligonukleotid mint indítómolekula felhasználásával, amely a mínusz szálas virális genommal komplementer az első szálreakcióban. Az első és a második szál szintézisének reakciókörülményei azonosak az előzőkben említettekkel. Ezt a könyvtárat vizsgáljuk át vírusspecifikus 3’- és oligonukleotidpróbákkal.
A cDNS-szekvencia legnagyobb részét (>95%) Automatizált Lézer Fluoreszcencia A. L. F.™ DNS-szekvenátorral határozzuk meg (Pharmacia). A fluoreszcens oligonukleotid indítómolekulával vezérelt szekvenálást kétszálú DNS-en végezzük, az AutoRead™ szekvenálókit alkalmazásával (Pharmacia), lényegében az Autoread™ szekvenálókit leírásában található C és D eljárások alkalmazásával. A fluoreszcens indítómolekulákat FluorePrime™-mel (Pharmacia) készítjük. A szekvencia megmaradó részét kétszálú DNS-szekvenálással határozzuk meg, a T7 polimerázalapú szekvenálókitben (Pharmacia) levő oligonukleotid indítómolekulákkal és a-32S-dATP-vel (Amersham). A szekvenciaadatokat a PCGENE (Intelligenetics, Inc., Mountain View, USA) és a FASTA szekvenciaanalízis-programmal elemezzük [Pearson, W. R., Lipman, D. J., Improved tools fór biological sequence comparison, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 2444-2448 (1988)].
Az MSD kísérleti reprodukciója
Tizennégy szokványos módon tenyésztett vemhes kocát, amelyek 10-11 hete vemhesek, megvizsgáltunk LA elleni antitestek szempontjából az IPMA-ban. Mindegyik negatívnak bizonyult. Ezután négy-négy kocából két csoportot képeztünk és CVI-re vittünk. A gesztáció 12. hetében ezeket a kocákat intranazálisan inokuláljuk 2 ml LA-val (3-as passzázsszint, titere 104’8 TCID50/ml). Szérum- és EDTA-vérmintákat veszünk 10 nappal az inokulálás után. Naponta megfigyeljük az elfogyasztott táplálék mennyiségét, a végbél hőmérsékletét és más klinikai tüneteket. A malacozáskor feljegyezzük a halva és élve született malacok számát kocánként, majd mintákat veszünk a vírusizoláláshoz és a szerológiához.
Eredmények
Immunfluoreszcencia
MSD-ben szenvedő malacok szöveti metszeteit IFT-ben festjük afrikai sertéslázvírus, sertés-koleravírus, pszeudorabieszvírus, sertésparvovírus, sertésinfluenzavírus, enkefalomiokarditiszvírus és Chlamydia psittaci elleni FITC-konjugátumokkal. A metszeteket megfestjük, fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáljuk; mindegyik negatívnak bizonyult.
Vírusizolálás MSD-vel sújtott farmokról származó malacokból
Citopatikus izolátumokat detektálunk MSD-vel sújtott, két-tíz napos malacokból származó szövetmintákkal fertőzött makrofágtenyészetekből. Az öt különböző farmról származó 19 malac közül 16 pozitív volt (IA. táblázat). Mindegyik ilyen izolátum reagált IPMA-ban a c 829 malac fertőzés utáni szérumával, míg a be nem oltott kontrolltenyészetek nem reagáltak. Tehát az izolátumok az LA reaprezentánsai voltak. Egy alkalommal egy citopatikus izolátumot lehetett kimutatni egy olyan SK-6 sejttenyészetből, amelyet egy hatodik farmról (VE farm, IA. táblázat) származó malac szájkenetéből készített szuszpenzióval oltottunk be. Ez az izolátum a picoma viridae jellemzőit mutatta, és a PEV 2re specifikus szérummal lehetett semlegesíteni, ennélfogva az izolátumot PEV 2-ként azonosítottuk (3. táblázat). A PK2, PK-15 sejtek és a tyúktojások az ebből a csoportból származó mintákkal fertőzve negatívak maradtak.
Vírusizolálás MSD-vel sújtott farmok kocáiból
Citopatikus izolátumokat detektáltunk MSD-vel fertőzött kocákból vett mintákkal oltott makrofágtenyészetekből. All farmról származó 63 kocából 41 volt pozitív (IB. táblázat). Mindegyik ilyen izolátum reagált IPMA-ban a b 822 sertés fertőzés utáni szérumával, ennélfogva LA-reprezentánsoknak tekintettük őket. Egy ilyen alkalommal egy citopatikus izolátumot detektáltunk egy poliklonális sejttenyészetben, amelyet egy HU farmról származó koca leukocitafrakciójából készített szuszpenzióval beoltott PK2 sejttenyészetben (IB. táblázat). Ez az izolátum a picoma viridae jellemzőit mutatta, és az EMCV-re specifikus szérum semlegesítette, ennélfogva az izolátumot EMCV-nek azonosítottuk (3. táblázat). Az SK-6, PK-15 sejtek és a tyúktojások, amelyeket az ebből a csoportból származó mintákkal oltottunk be, negatívak maradtak.
Vírusizolálás olyan SPF malacokból, amelyeket MSD-vel fertőzött kocákkal hagyunk érintkezni
Citopatikus izolátumokat lehet kimutatni MSD-vel fertőzött kocákkal érintkezésben hagyott SPF sertésekből származó mintákkal beoltott makrofágtenyészetekből 12 malac közül 4 volt pozitív (2. táblázat). Mindegyik ilyen izolátum reagált IPMA-ban a c 829 és a b 822 malac fertőzés utáni szérumával, és ennélfogva az LA reprezentánsai voltak. Citopatikus izolátumokat ki lehetett mutatni PK2, PK-15 és SK-6 sejttenyészetekben is, amelyeket az ezekből az SPF sertésekből származó mintákkal oltottunk be. A 12 sertés közül hét volt pozitív (2. táblázat), ezek az izolátumok mind semlegesíthetők PEV 7 elleni szérummal. Ezen hét izolátum közül egyet tovább tanulmányoztunk, és más jellemzők is megerősítik, hogy az izolátum PEV 7 (3. táblázat).
Vírusizolálás MSD-vel fertőzött kocák vérével beoltott SPF malacokból
Citopatikus izolátumokat lehetett kimutatni MSDvel fertőzött kocák vérével beoltott SPF sertésekből
HU 218 431 Β származó mintákkal beoltott makrofágtenyészetekből. A nyolc sertés közül kettő pozitív volt (2. táblázat). Mindegyik ilyen izolátum reagált IPMA-ban a c 829 és a b 822 sertés fertőzés utáni szérumával, és ennélfogva az LA reprezentánsai voltak. PK2, SK-6 és PK-15 sejtek az ebből a csoportból származó mintákkal beoltva negatívak maradtak.
Összefoglalva, négy sertéscsoportot vizsgáltunk meg a rejtélyes sertésvészhez (MSD) kapcsolható ágensek jelenléte szempontjából.
Az első csoportban, az MSD-vel sújtott malacok csoportjában 20 malac közül 16-ból a Lelystad-ágens (LA) volt izolálható; egy esetben PEV 2 volt izolálható.
A második csoportban, az MSD-vel sújtott kocák csoportjában a 63 koca közül 41-ből volt a Lelystadágens izolálható; egyszer MCV-t izoláltunk. Emellett 165 MSD-vel sújtott malac közül 123 szerokonvertált Lelystad-ágensre, IPMA-ban vizsgálva. Ilyen tömeges szerokonverziót nem mutattunk ki más vizsgált virális patogének esetében.
A harmadik csoportban, az MSD-vel sújtott kocákkal érintkezésben tartott sertések esetében 12 sertés közül négyből lehetett LA-t izolálni; PEV 7-et hét sertésből izoláltunk. Mind a 12 sertés szerokonvertált LA-ra és PEV 7-re.
A negyedik csoportban, az MSD-vel fertőzött kocák vérével beoltott SPF sertések csoportjában két sertésből izoláltunk LA-t. Mind a nyolc sertés szerokonvertált LA-ra.
MSD-vel sújtott farmokról származó kocák szerológiája
MSD-vel sújtott kocák párhuzamos szérumait vizsgáljuk számos különböző virális patogénnel szemben, valamint a jelen vizsgálat során kapott izolátumokkal szemben (4. táblázat). Túlnyomó többségben LA elleni antitestválasz volt mérhető IPMA-ban (a kocák 75%-a szerokonvertált, a 26 farm közül 23-ban szerokonverzió volt megfigyelhető), míg egyetlen más virális patogénnel sem figyelhető meg a szerokonverzió világos mintázata. LA elleni semlegesítő antitestek nem voltak kimutathatók.
MSD-vel fertőzött kocákkal érintkezésben tartott SPF sertések szerológiája
Mind a nyolc SPF sertés antitestválaszt adott az IPMA-ban LA ellen (5. táblázat). Ezek közül a szérumok közül egyik sem volt pozitív a fertőzetlen makrofágokkal végzett IPMA-ban. Ezek közül a szérumok közül egyik sem volt pozitív SNT-ben LA-ra. Az érintkezés után két héttel vett mindegyik szérumban magas antitesttiter volt mérhető (>1280) PEV 7-tel szemben, amíg a fertőzés előtti szérumok negatívak voltak (>10), jelezve, hogy mindegyik sertés még PEV 7-tel is fertőzve volt.
Az MSD-vel fertőzött kocák vérével beoltott SPF sertések szerológiája
Mind a nyolc sertés IPMA-ban LA elleni antitestválaszt adott (5. táblázat). Ezek közül a szérumok közül egyik sem volt pozitív fertőzetlen makrofágokon végzett IPMA-ban. A szérumok közül egyik sem volt pozitív LA-ra SNT-ben. A beoltás előtti és beoltás utáni szérumok mind negatívak voltak (<10) PEV 7-tel szemben.
A Lelystad-ágens további azonosítása
Az LA nem hemagglutinálja a csirke-, tengerimalac-, sertés-, birka- vagy a humán nullás vörösvérsejteket.
Az LA IPMA-ban nem reagált PRV, TGE, PED, ASFV stb. elleni szérumokkal.
Két vak passzálás után az LA nem szaporodik PK2, PK15 vagy SK-6 sejteken, vagy embrionált tyúktojásokon, amelyeket a burkon keresztül oltunk be.
Az LA fertőzőképes marad azután is, hogy egy 0,2 mikronos szűrőn szűrjük át, a titerek szűrés előtt, illetve szűrés után 105·05, illetve 1O5·3 TCID50, IPMA-val kimutatva.
Az LA növekedési görbéje (lásd 3. ábra). A sejtmentes vírus maximális titere körülbelül 1O5·5 TCID ml·1 az oltás után 32-48 órával. Ennek az időnek az elteltével a makrofágokat az LA citopatikus hatása elpusztítja.
Elektronmikroszkópia. Gömbszerű LA-részecskék csoportjait találtuk. A részecskék átmérője 45-55 nm, és egy 30-35 nm átmérőjű nukleokapszidot tartalmaznak, amelyet egy kétréteges lipidmembrán vesz körül. Nem találtunk LA-részecskéket olyan fertőzött tenyészetekben, amelyeket negatív szérummal vagy negatív kontrollkészítményekkel fertőztünk.
Hollandiából, Németországból és az Amerikai Egyesült Államokból származó izolátumok. Mind a hét izolátumot sertés alveoláris makrofágokban izoláltuk, és 3-5 alkalommal passzáltuk. Mindegyik izolátum citopátiás hatással volt a makrofágokra, és specifikus immunfestéssel festhető volt, b 822 és a 42 dpi-s 23-as anti-LA szérummal. Az izolátumok elnevezése NL2, CE1,GE2, US1.US2 és US3.
Az NL1, GE1, GE2, US1, US2 és US3 izolátumok közötti antigenikus kapcsolat. Egyik tenyészetből származó szérum sem reagált fertőzetlen makrofágokkal IPMA-ban, de mindegyik szérum tartalmazott olyan antitesteket, amelyek a hét izolátum közül eggyel vagy többel reagáltak (7. táblázat). A kísérleti szérumok közül egyik sem reagált IPMA-ban fertőzetlen makrofágokkal, és a 0 dpi-s kísérleti szérumok közül egyik sem reagált a hét izolátum közül egyikkel sem IPMA-ban (8. táblázat). Mind a hét LA-izolátum reagált az összes, vagy a legtöbb olyan szérummal, amely a 21-es, 23-as, 25-ös és 29-es kísérleti sertésekből származik, 0 dpi után levéve. Csak az US1, US2 és US3 izolátumok reagáltak az összes, vagy legtöbb olyan szérummal, amelyet a 2B, 9G, 16W és 16Y kísérleti sertésekből vettük 0 dpi-nél.
Radioimmunprecipitációs vizsgálatok. Hét LA-specifikus fehérjét mutattunk ki LA-val fertőzött makrofágokban, de a fertőzetlen makrofágokban nem oly módon, hogy a b 822-es és a 23-as sertések 42 dpi-s szérumával végeztünk kicsapási kísérleteket. A fehérjék becsült molekulasúlya 65, 39, 35, 26, 19, 16 és 15 kilodalton. Ezek közül az LA-specifikus fehérjék közül csak kettő, a 15 és 16 kilodaltonos csapható ki az MN8 26 dpi-s szérumával.
HU 218 431 Β
Az LV genom szekvenciája és szerveződése
Az LV genom természetét úgy határozzuk meg, hogy elemezzük a fertőzött sertés alveoláris makrofágokból származó DNS-t és RNS-t. LV-specifikus DNS nem mutatható ki. Kimutatható azonban LV-specifikus RNS. 0,8%-os semleges agarózgélben az LV-RNS kicsit lassabban vándorol mint a sertés-koleravírus 12,3 kb méretű RNS-e [Moormann, R. J. M., Warmerdam, P. A. M., van dér Meer, B., Schaaper, W. Μ. M., Wensvoort, G. and Hulst, Μ. M., Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera vírus stran Brescia and mapping of the genomic region encoding envelope protein El, Virology, 777, 184-198 (1990)]. Jóllehet pontos méretmeghatározás nem végezhető semleges agarózgélekben, a becslések szerint az LV-specifikus RNS mérete körülbelül 14,5-15,5 kb.
Az LV-specifikus RNS-ek fertőzött sejtekben való komplexitásának meghatározására, valamint az LVgenom nukleotidszekvenciájának meghatározására cDNS-t készítünk LV-vel fertőzött sertéstüdő alveoláris makro fágjainak RNS-éről, és az LV-specifikus kiónokat kiválasztjuk, majd térképezzük, az Anyagok és módszerek fejezetben leírt módon. A cDNS-klónok specifitását oly módon erősítjük meg, hogy specifikus kiónokat, amelyek az átfedő cDNS-szekvencia mentén helyezkednek el, olyan Northern biotokhoz hibridizáljuk, amelyek az LV-vel fertőzött, illetve nem fertőzött makrofágok RNS-éről készültek. Jellemző módon néhány cDNS-klón hibridizált a csak a fertőzött makrofágokban kimutatható 14,5-15,5 kb méretű RNS-sel, míg mások hibridizáltak a 14,5-15,5 kb méretű RNSsel, valamint 4-5 alacsonyabb molekulasúlyú RNS-sel (becsült méretük 1-4 kb). Az utóbbi kiónok a cDNStérkép egyik végénél csoportosultak, és a DNS-ből körülbelül 4 kb-t fedtek le. Ezek az adatok azt sugallják, hogy az LV genomjának szerveződése hasonló lehet a koronavírusokéhoz [Spaan, W. J. M., Cavanagh, D. and Horzinek, M. C., Coronaviruses: structure and genome expression, Journal of General Virology, 69, 2939-2952 (1988)]; a Beme-víruséhoz [BEV; Snijder, E. J., Horzinek, M. C. and Spaan, W. J. M., A 3’coterminal nested set of independently transcribed messenger RNAs is generated during Beme vírus replication, J. Virology, 64, 355-363 (1990)]; a torovíruséhoz és az EAV-éhoz [de Vries, A. A. F, de Chimside, E. D., Bredenbeek, P. J., Gravestein, L. A., Horzinek, M. C. and Spaan, W. J. M., AH subgenomic mRNAs of equine arteritis vírus contain a common leader sequence, Nucleic Acids Research, 18, 3241-3247 (1990)], azaz a genomiális RNS mellett vannak szubgenomiális mRNS-ek is, amelyek egy hálózatos csoportot alkotnak, amely a genom 3’-végén helyezkedik el. Ezt a feltételezést akkor erősítettük meg, amikor a cDNSklónok szekvenciája hozzáférhetővé lett, és specifikus indítómolekulákat lehetett választani, amelyeket a biottokhoz lehetett hibridizálni. A cDNS-klónokkal és a specifikus indítómolekulálákkal kapott hibridizációs adatok összerakásával, amely indítómolekulák az LVvel fertőzött, illetve nem fertőzött makrofágokból származó RNS-t hordozó Northern biotokhoz hibridizáltak, a 2. ábrán mutatjuk be. A 12-es és 20-as kiónok, amelyek az 5’-részen találhatók, valamint a szekvencia közepe, csak az LV-vel fertőzött sejtekben kimutatott 14,5-15,5 kb méretű genomiális RNS-hez hibridizálódnak. A 41-es és 39-es kiónok azonban felismerik a 14,5-15,5 kb méretű genomiális RNS-t, és egy sor (4-5) alacsonyabb molekulasúlyú RNS-t is. A legtöbb információt nyújtó, és a legtöbb következtetés levonására alkalmas hibridizációs mintázatot azonban akkor kaptuk, amikor a 25-ös indítómolekulát használtuk, amely az LV-szekvencia 5’-végének legszélén helyezkedik el (lásd 1. ábra). A 25-ös indítómolekula egy sor (7) RNShez hibridizálódik, becsült molekulasúlyuk 0,7 és 3,3 kb között változik (szubgenomiális mRNS-ek), valamint a genomiális RNS-hez. A 25-ös indítómolekula hibridizációs mintázatának legvalószínűbb magyarázata az, hogy az 5’ genomiális szekvenciák, amelyeknek hossza nem ismert, fuzionálnak azokkal az mRNS-ekkel, amelyek a genom 3’-végéről íródnak át. Valóban, a 25-ös indítómolekulával kapott hibridizációs mintázat azt sugallja, hogy az 5’ genomiális szekvenciák a szubgenomiális mRNS-ekben úgynevezett „leaderszekvenciaként” működnek. Az ilyen transzkripciós mintázat a koronavírusok [Spaan, W. J. M., Cavanagh, D. and Horzinek, M. C., Coronaviruses: structure and genome expression, Journal of General Virology, 69, 2939-2952 (1988)] és az EAV [de Vries, A. A. F, de Chimside, E. D., Bredenbeek, P. J., Gravestein, L. A., Horzinek, M. C. and Spaan, W. J. M., All subgenomic mRNAs of equine arteritis vírus contain a common leader sequence, Nucleic Acids Research, 18, 3241-3247 (1990)] replikációjának jellemzői.
Az egyetlen jellemző különbség az LA és az EAV között, amelyet a fenti adatokból ki lehet következtemi, az az, hogy az LV genomja körülbelül két és félszer nagyobb, mint az EAV genomja.
Az átfedő cDNS-klónok konszenzus nukleotidszekvenciája látható az 1. ábrán. A szekvencia hossza 15 088 bázispár, ami jó egyezésben van a genomiális LV RNS becsült méretével.
Mivel az LV cDNS-könyvtárat a reverz transzkriptáz-reakció random indításával végeztük, boqútimusz pd(N)6 indítómolekulák alkalmazásával, nem kaptunk olyan cDNS-klónt, amely a 3’-végén egy poli-A résszel indult volna. A virális genom 3’-végének klónozása céljából egy második cDNS-könyvtárat készítettünk, a reverz transzkriptáz reakcióban oligo(dT)-t és a 39U183R indítómolekulát alkalmazva. A 39U183R indítómolekula komplementer az LV mínusz szálú RNSével, ami feltehetően az LV-vel fertőzött sejtekből izolált RNS-ben megtalálható. Ezt a könyvtárat vizsgáltuk át próbákkal (nick-transzlációba vitt 119-es cDNS-klón és a 119R64R oligonukleotid), ennek eredménye öt további cDNS-klón izolálása (például a 151-es cDNS-klón,
2. ábra). Ezeknek a cDNS-klónoknak a szekvenálása kiderítette, hogy az LV egy 3’ poli(A) farkat tartalmaz. A poli(A) farok hossza változott a különböző cDNSklónok között, de maximális hossza húsz nukleotid volt. A 25-ös és 155-ös kiónok mellett (2. ábra) négy további cDNS-klónt izoláltunk a genom 5’-végéről, amelyek
HU 218 431 Β csak két-három nukleotiddal voltak rövidebbek, mint az
I. ábrán bemutatott végső 5’-nukleotid. Ennek a felfedezésnek az alapján, valamint a cDNS-szintézis módja alapján feltételezzük, hogy nagyon közel állunk az LV genomiális RNS-szekvenciájának 5’-végéhez.
Az LV genomiális szekvenciájának majdnem 75%-a az ORF 1 A-t és az ORF ΙΒ-t kódolja. Az ORF 1A feltehetően az LV-szekvencia első AUG triplettjénél indul (212-es nukleotidpozíció, 1. ábra). Az ORF 1A C-terminálisa egy kis szakaszon átfed a feltételezett ORF IB N-terminálisával (16 nukleotid). Ebből az látszik, hogy az ORF IB transzlációja riboszomális kereteltolódás révén játszódik le, ami a koronavírusok polimeráz- vagy replikázgénje transzlációjának jellemzője [Boursnell, Μ. E. G., Brown, T. D. K., Foulds, 1.1, Green, P. F., Tomley, F. M. and Binns, Μ. M., Completion of the sequence of the genome of the coronavirus avian infectious bronchitis virus, Journal of General Virology, 68, 5Ί-ΊΊ (1987); Bredenbeek, P. J., Pachuk, C.
J. , Noten, J. H. F., Charité, J., Luytjes, W., Weiss, S. R. and Spaan, W. J. M., The primary structure and expression of the second open reading iramé of the polimerase gene of coronavirus MHV-A59, Nucleic Acids Research, 18, 1825-1832 (1990)], valamint a BEV torovírusé [Snijder, E. J., den Boon, J. A., Bredenbeek, P. J., Horzinek, M. C., Rijnbrand, R. and Spaan, W. J. M., The carboxy-terminal part of the putative Beme virus polymerase is expressed by ribosomal frameshifting and contains sequence motifs which indicate that toro- and coronaviruses are evolutionary related, Nucleic Acids Research, 18, 4535-4542 (1990)]. Az RNS jellemző pszeudocsomóstruktúráját, amelynek képződését a riboszomális kereteltolódásnál tételezik fel, szintén megtaláltuk az LV-szekvenciának ebben a pontjában (nem közölt eredmények).
Az ORF IB egy közel 1400 aminosavból álló szekvenciát kódol, amely sokkal kisebb, mint az MHV és az IBV ORF ΙΒ-je által kódolt [körülbelül 3700 aminosav, Bredenbeek, P. J., Pachuk, C. J., Noten, J. H. F., Charité, J., Luytjes, W., Weiss, S. R. and Spaan, W. J. M., The primary structure and expression of the second open reading frame of the polimerase gene of coronavirus MHV-A59, Nucleic Acids Research, 18, 1825-1832 (1990); Boursnell, Μ. E. G., Brown, T. D. K.., Foulds, I. J., Green, P. F., Tomley, F. M. and Binns, M. M., Completion of the sequence of the genome of the coronavirus avian infectious bronchitis virus, Journal of General Virology, 68, 57-77 (1987)], valamint a BEV ORF ΙΒ-je által kódolt [Snijder, E. J., den Boon, J. A., Bredenbeek, P. J., Horzinek, M. C., Rijnbrand, R. and Spaan, W. J. M., The carboxy-terminal part of the putative Berne virus polymerase is expressed by ribosomal frameshifting and contains sequence motifs which indicate that toro- and coronaviruses are evolutionary related, Nucleic Acids Research, 18, 4535-4542 (1990)]. A koronavírusok szupercsaládja tagjaiban levő ORF IB termék jellemző tulajdonságai, mint például a replikáz motívum és a cinkujj dómén szintén megtalálható az LV ORF ΙΒ-jében (nem közölt eredmények).
Jóllehet az ORF 1A és az ORF IB a virális polimerázt kódolják, és ennélfogva úgy tekinthetők, hogy egy nem szerkezeti virális fehérjét kódolnak, az ORF 2-7ről az a vélemény alakult ki, hogy virális szerkezeti fehérjéket kódolnak.
A 2-6-os ORF-ek termékei a membránhoz (burokhoz) kapcsolódó fehérjékre emlékeztető tulajdonságokkal rendelkeznek. Az ORF 2 egy 249 aminosavból álló fehérjét kódol, amely két feltételezett N-kapcsolt glikozilezési helyet tartalmaz (9. táblázat). Az N-terminálisnál egy hidrofób szekvenciát tartalmaz, amely úgynevezett szignálszekvenciaként azonosítható. A C-terminális szintén egy hidrofób szekvenciában végződik, amely ebben az esetben transzmembrán régióként működik, amely az ORF 2 terméket a virális burokmembránba rögzíti.
Az ORF 3 a 12394-es nukleotidpozícióban levő AUG kodonnál kezdődhet, vagy a 12556 nukleotid pozíciónál levő AUG kodonnál, és 265, illetve 211 aminosavból álló fehérjéket kódol. A 265 aminosavból álló fehérje hét feltételezett N-kapcsolt glikozilezési helyet tartalmaz, míg a 221 aminosavból álló fehérjében négy van (9. táblázat). A 265 aminosavból álló fehérje N-terminálisánál egy hidrofób szekvenciát lehet azonosítani.
A hidrofobicitási elemzés alapján az ORF 4 által kódolt fehérje topológiája hasonlít az ORF 2 által kódolt fehérje topológiájához, ha az ORF 4 terméke a 12396os nukleotidpozícióban levő AUG kodonnál inficiálódik. Az ORF 4 azonban infrciálódhat két másik AUG kodonnál is (lásd 1. és 2. ábra), amelyek a 12981-es, illetve a 13068-as szekvenciapozíciónál kezdődnek. A mai napig nem világos, hogy melyik startkodont használja a vírus. A használt startkodontól függően, az ORF 4 kódolhat 183 aminosavból álló fehérjét, amely négy feltételezett N-kapcsolt glikozilezési helyet tartalmaz, kódolhat egy 168 aminosavból álló fehérjét, amely négy feltételezett N-kapcsolt glikozilezési helyet tartalmaz, vagy egyl39 aminosavból álló fehérjét, amely három feltételezett N-kapcsolt glikozilezési helyet tartalmaz (9. táblázat).
Az ORF 5-ről megjósolható, hogy egy 201 aminosavból álló fehérjét kódol, amely két feltételezett Nkapcsolt glikozilezési helyet tartalmaz (9. táblázat). Az ORF 5 termékjellemzője a belső hidrofób szekvencia a 108-132-es aminosavak között.
Az ORF 6 terméke membránon átterjedő szakaszának és hidrofrlitásának elemzése azt mutatja, hogy három, membránon átjutó szakaszt tartalmaz szekvenciája 90 N-terminális aminosavában. Ez a jellegzetes tulajdonság szintén jellemző számos koronavírus, például a fertőző bronchitisvírus [IBV; Boursnell, Μ. E. G., Brown, T. D. K., Foulds, I. J., Green, P. F., Tomley, F. M, and Binns, Μ. M., Completion of the sequence of the genome of the coronavirus avian infectious bronchitis virus, Journal of General Virology, 68, 57-77 (1987)], és az egér-hepatitiszvírus [MHV; Rottier, P. J. M., Welling, G. W., Welling-Wester, S., Niesters, H. G. M., Lenstra, J. M. and van dér Zeijst, B. A. M., Predicted membráné topology of the coronavirus protein El, Biochemistry, 25, 1335-1339 (1986)]. Ennek következté13
HU 218 431 Β ben az ORF 6 által kódolt fehérjének feltételezhetően analóg a topológiája a koronavírusok M vagy El fehérjéivel [Rottier, P. J. M., Welling, G. W., Welling-Wester, S., Niesters, H. G. M., Lenstra, J. M. and van dér Zeijst, B. A. M., Predicted membráné topology of the coronavírus protein El, Biochemistry, 25, 1335-1339 (1986)]. Az M vagy El fehérjék második jellemzője egy úgynevezett felszíni hélix, amely közvetlenül a harmadik feltételezett transzmembrán régió mellett található. Ez a körülbelül 25 aminosavból álló szekvencia nagyon jól konzerválódott a koronavírusok között, és felismerhető, habár sokkal degeneráltabb formában az LV-ben is. Ezt is figyelembe véve, az a véleményünk, hogy az LV ORF 6 terméke a koronavírus M vagy El fehérjéjével analóg, membránhoz kapcsolódó funkcióval rendelkezik. Továbbá, az ORF 6 által kódolt fehérje nagyon erős hasonlóságot mutat (53% azonos aminosav) a VpX-szel [Gödény, Ε. K., Speicher, D. W. and Brinton, M. A., Map location of lactate dehydrogenase-elevating virus (LDV) capsid protein (Vpl) gene, Virology, 777, 768-771 (1990)] az LDV-vel.
Az ORF 7 által kódolt fehéije 128 aminosavból áll (9. táblázat), amely 13 aminosavval hosszabb, mint az LDV Vpl fehérjéje [Gödény, Ε. K., Speicher, D. W. and Brinton, M. A., Map location of lactate dehydrogenase-elevating vírus (LDV) capsid protein (Vpl) gene, Virology, 777, 768-771 (1990)]. Mégis jelentős hasonlóság (43% azonos aminosav) figyelhető meg az ORF 7 és a Vpl által kódolt fehérjék között. Egy másik közös jellemzője az ORF 7 és a Vpl termékének a bázikus csoportok (Arg, Lys, His) nagy koncentrációja a fehérje N-terminális végében. Az 55-ös aminosavig az LV-szekvencia 26% Arg, Lys, His aminosavat tartalmaz. Ez a felfedezés teljesen összhangban van az ORF 7 termék vagy a Vpl javasolt funkciójával [Gödény, Ε. K., Speicher, D. W. and Brinton, M. A., Map location of lactate dehydrogenase-elevating vírus (LDV) capsid protein (Vpl) gene, Virology, 777, 768-771 (1990)], nevezetesen a virális genomiális RNS burokba zárásával. A fenti adatok alapján az a véleményünk, hogy az LV ORF 7 terméke a vírus N nukleokapszid fehérjéje.
Az LV-genom szerveződésének sematikus ábrája a
2. ábrán látható. Az átfedő kiónok térképét használjuk az LV szekvenciájának meghatározására, amit a felső panelen mutatunk be. Ennek a térképnek egy lineáris összedolgozása, amely mutatja az LV-nukleotidszekvencia 5’- és 3’-végét (lásd 1. ábra), jelzi a cDNSklónok térképe alatt a szekvencia kilobázisokra való osztását, és lehetővé teszi ezeknek a kiónoknak a szekvenciában való elhelyezését. Az LV-genomban azonosított ORF-ek pozícióját az LV-szekvencia alul bemutatott lineáris térképén jelezzük. Az alsó panel a szubgenomiális mRNS-ek hálós csoportját mutatja, valamint ezeknek a RNS-eknek az LV-szekvenciához viszonyított elhelyezkedését.
A koronavírus, torovírus és arterivírus szubgenomiális mRNS-ek transzlációs stratégiájával összhangban az a javaslatunk, hogy az 1-6-os ORF-ek a genomiális vagy mRNS-ük egyedi 5’-végéről transzlálódnak. A mRNS-eknek ez az egyedi része tekinthető az RNS azon részének, amelyet akkor kapunk, amikor egy alacsonyabb molekulasúlyú RNS-t „kivonunk” a magasabb molekulasúlyú RNS-ből, amely a sorban következik. Jóllehet a 7-es RNS az összes egyéb genomiális és szubgenomiális RNS-ek 3’-végét képezi, és ennek következtében nincs egyedi régiója, mégis az a véleményünk, hogy az ORF 7 csak erről a legkisebb méretű mRNS-ről transzlálódik. A szubgenomiális RNS-ek 5’végén levő „leaderszekvenciát” egy besötétített négyzet jelzi. Ennek a szekvenciának a hossza körülbelül 200 bázis, de a genomiális RNS-sel való fúzió pontos helyét még meg kell határozni.
Az MSD kísérletes reprodukciója
Nyolc vemhes kocát oltunk be LA-val, és az MSD klinikai tüneteit, azaz az étvágytalanságot és a szaporodási veszteségeket reprodukáljuk ezekben a kocákban. Az inokulálás utáni (p. i.) negyedik és tíz-tizenkettedik napon mindegyik koca csak vonakodva evett. Egyik kocának sem volt magas testhőmérséklete. Két kocának kékült meg a füle a beoltás utáni 9. és 10. napon. A 6. táblázatban a szülés napját és kocánként az élve, illetve halva született malacok számát adjuk meg. A megszületett malacok közül 13-ból lehetett LA-t izolálni.
7. táblázat
A tenyészetmintákból izolált vírusok leírása és eredményei A minták: Feltehetően MSD-vel fertőzött malacokból származó minták
Farm Malacok száma Kor (nap) Használt anyag Eredmények*
RB 5 2 tüdő, mirigy és agyak 5xLA
DV 4 3 tüdő, agyak 5xLA
egyesített vese és lép 3xLA
TH 3 3-5 tüdő, egyesített vesék, mirigy 3xLA
DO 3 10 tüdő, mirigy 2xLA
ZA 4 1 tüdő, mirigy 3xLA
VE 1 ? szájkenet lxPEV2
ÖSSZES 20 16xLA lxPEV2
HU 218 431 Β
1. táblázat (folytatás)
B minták: Feltehetően MSD-vel fertőzött kocákból származó minták
Farm Kocák száma Használt anyag Eredmények
TH 2 plazma és leukociták lxLA
HU 5 plazma és leukociták 2xLA, lxEMCV
TS 10 plazma és leukociták 6xLA
HK 5 plazma és leukociták 2xLA
LA 6 plazma és leukociták 2xLA
VL 6 plazma és leukociták 5xLA
TA 15 szérum llxLA
LO 4 plazma és leukociták 2xLA
JA 8 plazma és leukociták 8xLA
VD 1 plazma és leukociták 1 xLA
VW 1 szérum lxLA
ÖSSZES 63 41xLA, lxEMCV
* Az eredményeket azoknak a sertéseknek a számában adjuk meg, amelyekből az izolálást végeztük. Néha az izolátumokat sertésenként egynél több mintában tudtuk kimutatni.
LA=Lclystad-ágcns
PEV 2=sertés 2-es típusú cnterovírus
EMCV=enkcfalomiokarditisz vírus
2. táblázat
Kísérletesen indukált fertőzéssel rendelkező sertésekből származó mintákból vírus izolálása, leírása és eredményei
Koca Sertés Használt anyag Eredmények*
A (LO)# c 835 c 836 c 837 tüdő, mirigy orrkenet orrkenet 2xLA 2xPEV7 2xPEV7
A (JA) c 825 c 821 c 823 tüdő, mirigy orrkenet orrkenet lxPEV7 4xPEV7
A (JA) c 833 c 832 c 829 tüdő, mirigy orrkenet orrkenet, plazma és leukociták lxLA, lxPEV7 2xPEV7 3xLA,2xPEV7
A(VD) c 816 c 813 c 815 tüdő, mirigy orrkenet orrkenet lxLA lxPEV
Az érintkező sertésekből származó összes izolátum 7xLA, 13xPEV7
A b 809 b 817 orrkenet orrkenet
B b 818 b 820 orrkenet, plazma és leukociták orrkenet lxLA
C b 822 b826 b 830 b 834 orrkenet orrkenet orrkenet orrkenet lxLA
Összes izolátum a vérrel inokulált sertésekből 2xLA
* Az eredményeket a sertés/izolátum számában adjuk meg.
LA=Lelystad-ágcns
PEV 7=scrtés 7-es típusú enterovirus # A zárójelben levő kezdőbetűk azoknak a farmoknak a kezdőbetűi, amelyekből a kocák származnak.
HU 218 431 Β
Az SPF sertéseket vagy (c) érintkezésben tartottuk olyan kocával, amelyről feltételezhető hogy MSD-vel fertőzött, vagy (b) az említett kocából származó 10 ml EDTA-s vért adtunk be nekik a kísérlet 0. napján. Egy kocából és három SPF sertésből álló csoportokat (c) tar- 5 tottunk egy ketrecben, és mind a négy csoportot egy istállóban tartottuk. A 6. napon mindegyik csoportból egy SPF sertést levágtunk, majd a mirigyét és a tüdejét használtuk vírus izolálására. A vénei inokulált SPF sertések (b) négy csoportját négy másik ketrecben tartottuk, egy másik istállóban. Az SPF sertésekből orrkenetet vettünk a kísérlet 2., 5., 7. és 9. napján, majd EDTAs vért vettünk ahhoz, hogy a plazmából vírust izoláljunk, és leukocitákat vettünk, valahányszor a sertésnek láza volt.
3. táblázat
A vírusizolátumok azonosítása
Eredet és sejttenyészet Egyensúlyi sűrűség CsCl-bcn1 Részecskeméret FM-ben2 (nm) Érzékenység kloroformra3 Mi elleni szérum semlegesíti4 (titer)
Leukociták, kocafarm HU, PK-15, PK2, SK6 1,33 g/ml 28-30 nem érz. EMCV(1280)
Szájkenet, malacfarm VE, SK6 NA 28-30 nem érz. PEV2(>1280)
Önkénét, mirigy, SPF sertések CVI, PK-15, PK2, SK6 NA 28-30 nem érz. PEV7(>1230)
Különböző minták, különböző farmok, sertéstüdő-makrofágok 1,19 g/ml pleomorf érzékeny semmi (mind<5)
1 Az egyensúlyi sűrűség meghatározást lineáris PBS-ben készült lineáris CsCl-gradiensben végezzük, a standard technikák szerint [Brakke, Μ. K., In: Methods in Virology, Volume II, 93 -117 (Edited by K. Maramorosch and H. Koprowski), New York, Academic Press (1967)]. Azt a sűrűségértéket adjuk meg, ahol a maximális fertőzési csúcs található.
2 A vizsgált izolátum fertőzött és nem fertőzött sejttcnycszctcit lefagyasztottuk-felolvasztottuk. A scjtlizátumokat centrifugáljuk (30 perc, 130 000 χ g), a kapott üledéket negatívan festjük standard módszerek alkalmazásával [Brcnner, S., Home, R. W., A negative staining method fór high resolution electron microscopy of viruses, Biochimica et Biophysica Acta, 34, 103-110 (1959)], majd Philips CM 10 elektronmikroszkóppal tanulmányozzuk. Az adatok a fertőzött tenyészetekben meglevő, de a nem fertőzött tenyészetekben nem található részecskék méretei mutatják.
3 A kloroformérzékenységet standard módszerekkel határozzuk meg [Grist, N. R., Ross, C. A. and Bell, E. J., In: Diagnostic Methods ín Clinical Virology, 120, Oxford, Blackwell Scientific Publications (1974)].
4 Több száz 300 TCID50 izolátumot keverünk össze különböző hígítású specifikus antiszérummal, és a megfelelő sejtrendszerben szaporítjuk, ameddig teljes CPE-t figyelhetünk meg. Az 5-nél magasabb titerű szérumokat újravizsgáljuk, és azokat a szérumokat, amelyek magas titerrel blokkolják a CPE-t, az izolátumra specifikusnak tekintjük. A kloroformra nem érzékeny izolátumokat specifikusan sertésenterovirusok (PEV 1 -il; Dr. Knowles, Pirbright, szívességéből), enkefalomiokardítiszvírus (EMCV; Dr. Ahl, Tübingen, Németország, szívességéből), sertésparvovírus és sertés vezikuláris betegség elleni szérumokkal vizsgáljuk.
A kloroformra érzékeny izolátumot (kód: CDINL-2.91) olyan antiszérumokkal vizsgáljuk, amelyek specifikusan pszeudorabieszvírus, szarvasmarha-herpeszvírus 1, szarvasmarha-herpeszvírus 4, rosszindulatú hurutosláz-vírus, szarvasmarha virális hasmenésvírus, sertés-koleravírus, sertés-influenzavírus H1N1 és H3N2, parainfluenza 3 vírus, szarvasmarha légzési szincíciumvirus, átvihető gasztroenteritiszvírus, sertés járványos hasmenésvírus, hemagglutináló enkefalitiszvírus, fertőző bronchitisvírus, szarvasmarha-leukémiavírus, madár-leukémiavírus, maedi-visna vírus ellen irányulnak, valamint az SPF sertésekből kapott kísérleti szérumok ellen (lásd 5. táblázat).
4. táblázat
Feltételezhetően MSD-ben szenvedő kocáktól vett párhuzamos szérumok szerológiájának eredményei. A szérumokat a betegség akut fázisában vesszük, valamint 3-9 héttel később. A számok azoknak a kocáknak a számát mutatják, amelyek négyszeresre vagy magasabbra emelkedett titert mutatnak, per a vizsgált kocák száma.
Farm Intervallum hetekben1 HAI ELISA
HÉV H1N1 H3N2 PRV PPV BVDV HCV
TH 3 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/5 0/6
RB 5 0/13 1/13 0/13 1/9 0/7 0/6 0/9
HU 4 0/5 0/5 3/5 0/5 0/5 0/5 0/5
TS 3 1/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/4 0/10
VL 3 0/5 0/5 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5
JA 3 0/11 1/11 3/11 0/11 2/11 0/11 0/11
HU 218 431 Β
4. táblázat (folytatás)
Farm Intervallum hetekben1 HAI ELISA
HÉV H1N1 H3N2 PRV PPV BVDV HCV
WE 4 1/6 1/6 1/6 3/7 3/7 0/7 0/7
GI 3 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4
SE 5 0/8 0/8 0/8 0/8 0/6 0/3 0/8
KA 5 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 NA 0/1
HO 3 1/6 0/5 1/6 0/6 0/6 0/5 0/6
NY 4 0/5 1/5 1/5 0/3 0/4 0/2 0/4
JN 3 0/10 5/10 0/10 0/10 1/10 0/10 0/10
KOf 3 1/10 0/10 0/10 0/10 2/10 0/10 0/10
OE 9 NA NA NA 0/6 0/6 0/5 0/6
LO 6 NA NA NA 0/3 0/3 0/2 0/3
Wl 4 NA NA NA 0/1 1/1 0/1 0/3
RR 3 NA NA NA 1/8 0/8 0/8 0/8
RY 4 NA NA NA 0/3 0/4 0/3 0/4
BE 5 NA NA NA 0/10 0/10 0/10 0/10
BU 3 NA NA NA 1/6 0/6 0/6 0/6
KR 3 NA NA NA 1/4 0/4 0/4 0/4
KW 5 NA NA NA 0/10 0/10 0/10 0/10
VR 5 NA NA NA 1/6 0/6 0/6 0/6
HU 4 NA NA NA 1/4 0/3 0/3 0/4
ME 3 NA NA NA 0/5 1/5 0/5 0/5
Összes negatív 19 41 29 97 16 140 165
Összes pozitívP 77 48 62 55 131 1 0
összes szerokonvertálts 4 10 9 9 11 0 0
összes vizsgált 100 99 100 161 158 141 165
A szérumokat hemagglutinálást gátló (HAI) tesztekben vizsgáljuk meg, hogy van-e bennük hemagglutináló enkefalitiszvírus (HÉV), sertésinfluenza H1N1 és H3N2 elleni antitest, enzimhez kapcsolt immunszor- 40 bens vizsgálatokkal (ELISA) mutatjuk ki a pszeudorabieszvírus (PRV) gl glikoprotein, a sertésparvovírus (PPV), szarvasmarha virális hasmenés (BVDV) és sertés-koleravírus (HCV) elleni antitesteket.
4. táblázat (folytatás)
Farm Intervallum hetekben1 SNT IPMA
EMCV EMCV1 PEV2 PEV21 PEV7 PEV71 LAV LA
TH 3 0/6 0/6 0/5 0/5 0/6 0/5 0/h 6/6
RB 5 1/7 1/9 0/6 2/6 1/8 0/6 0/13 7/9
HU 4 NA 0/5 0/5 0/5 NA 0/5 0/5 5/5
TS 3 0/10 0/10 0/7 0/4 0/10 0/7 NA 10/10
VL 3 NA NA 1/5 0/5 NA 0/5 NA 5/5
JA 3 0/11 0/11 0/11 0/11 1/11 2/11 0/5 8/11
WE 4 1/7 1/6 1/6 1/7 1/7 1/7 0/7 m
GI 4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4
SE 5 0/8 0/8 0/6 1/8 0/8 1/5 0/8 6/8
KA 5 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1
HU 218 431 Β
4. táblázat (folytatás)
Farm Intervallum hetekben' SNT IPMA
EMCV EMCV' PEV2 PEV2' PEV7 PEV7' LAV LA
NY 4 0/4 0/4 0/2 0/2 0/4 0/3 0/4 4/4
JN 3 0/10 0/10 1/10 0/9 0/10 0/10 0/10 5/10
KOf 3 0/10 0/10 2/1 2/10 1/10 3/10 NA 8/10
OE 9 0/6 0/6 1/6 1/5 NA 1/6 NA 4/6
LO 6 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 NA 3/3
WI 4 NA NA 0/1 0/1 NA 0/1 NA 0/3
RR 3 0/8 1/8 0/8 0/8 0/8 0/8 NA 8/8
RY 4 0/4 NA 0/4 0/1 NA 1/4 NA 1/4
BE 5 NA NA 0/10 0/10 NA 1/10 NA 0/10
BU 3 NA NA 0/6 0/6 NA 0/6 NA 6/6
KR 3 NA NA 0/4 0/4 NA 0/4 NA 1/4
KW 5 NA NA 0/10 0/10 NA 1/10 NA 10/10
VR 5 NA NA 0/6 1/6 NA 0/6 NA 6/6
HU 4 NA NA 0/3 0/4 NA 0/3 NA 3/4
ME 3 NA NA 0/5 0/5 NA 0/5 NA 2/5
Összes negatív 15 29 0 0 2 1 69 15
Összes pozitívP 88 74 144 138 90 136 0 27
Összes szerokonvertálts 2 3 6 8 4 10 0 123
összes vizsgálat 105 107 150 146 96 147 69 165
1 Hízásba fogott sertések.
' Az első és a második minta levétele között eltelt idő.
Azoknak a sertéseknek az össz-száma, amelyeknek az első széruma negatív volt a vizsgált tesztben, és amelyeknek a második széruma is negatív, illetve négyszeresnél kisebb titeremelkedést mutat.
P Azoknak a sertéseknek az össz-száma, amelyeknek az első széruma pozitív volt a vizsgált tesztben, és amelyeknek a második széruma négyszeresnél kisebb titeremelkedést mutat.
s Azoknak a sertéseknek az össz-száma, amelyeknél a második szérum négyszeresnél magasabb titeremelkedést mutat az első szérumhoz viszonyítva az adott vizsgálatban.
NA Nincs adat.
A szérumokat szérumneutralizációs tesztekben vizsgáljuk, hogy a semlegesítő antitesteket kimutassuk enkefalomiokarditiszvírus (EMCV), az izolált (i) EMCV, a sertésenterovírusok (PEV) 2 és 7, valamint a
PEV-izolátumok (i), és a Lelystad-ágens (LA) ellen, és egy immunperoxidáz egysejtréteg-vizsgálatban (IPMA) vizsgáljuk, hogy kimutassuk a Lelystad-ágens (LA) elleni antitesteket.
5. táblázat
Lelystad-ágens elleni antitestkifejlődés IPMA-val mérve
A Érintkező sertések Szérumtiterek IPMA-ban
Hetek az érintkezés után 0 2 3 4 5
Sertés
c 836 0 10 640 640 640
c 837 0 10 640 640 640
c 821 0 640 640 640 640
c 823 0 160 2560 640 640
HU 218 431 Β
5. táblázat (folytatás)
A Érintkező sertések Szérumtiterck IPMA-ban
Hetek az érintkezés után 0 2 3 4 5
Sertés
c 829 0 160 640 10 240 10 240
c 832 0 160 640 640 2560
c 813 0 640 2560 2560 2560
c815 0 160 640 640 640
B Vérrel inokulált sertések Szérumtiterek IPMA-ban
Hetek az érintkezés után 0 2 3 4 5
Sertés
b 809 0 640 2560 2560 2560
b 817 0 160 640 640 640
b 818 0 160 640 640 640
b 820 0 160 640 640 640
b 822 0 640 2560 2560 10 240
b 826 0 640 640 640 10 240
b830 0 640 640 640 2560
b 834 0 160 640 2560 640
A kísérlet leírásához lásd a 2. táblázatot. Mindegyik vizsgálatban (IPMA) vizsgáljuk, hogy kimutassuk a sertéstől szabályos időközönként veszünk vért, és mind- Lelystad-ágens (LA) elleni antitesteket, egyik szérumot egy immunperoxidáz egysejtréteg- 35
6. táblázat
Az MSD kísérleti reprodukálása
Koca Terhesség hossza Malacok száma születéskor Pusztulások száma az 1. Héten LA1 malacokban
halva az 1. héten elpusztult
élő halott
(Ab póz szám)2
52 113 12(5) 3(2) 6 2 4
965 116 3(0) 9(3) 2 4
997 114 9(0) 1(0) 0
1305 116 7(0) 2(0) 1
134 109 4(4) 7(4) 4 3
941 117 7 10
1056 113 7(1) 3(0) 4
1065 115 9 2
1 Az LA-t tüdőből, májból, lcpböl, veséből vagy aszciteszfolyadékból izoláljuk.
2 Az LA elleni antitesteket olyan szérummintákból mutattuk ki, amelyeket azelőtt vettünk, mielőtt a malacok szoptak, illetve halva született malacok aszciteszfolyadékából.
HU 218 431 Β
7. táblázat
Egy sorozat tenyésztésből (Európa, Észak-Amerika) származó szérum reaktivitása IPMA-ban Hollandiából (NL1 és NL2), Németországból (GE1 és GE2), valamint az Amerikai Egyesült Államokból (US1, US2, US3) származó LA-izolátumokkal
Izolátumok NL1 NL2 GE1 GE2 US1 US2 USA3
Szérumok
Hollandiából
TH-187 3,5' 3,5 2,5 3,5 - - -
TO-36 3,5 3,0 2,5 3,0 - l,o -
Németországból
BE-352 4,0 3,5 2,5 3,0 - 1,5 -
BE-392 3,5 3,5 2,5 2,5 1,5 1,5 0,5
NI-f2 2,5 1,5 2,0 2,5 - - -
Naqy-Britanniából
ΡΛ141615 4,0 3,0 3,0 3,5 - - -
PA-141617 4,0 3,5 3,0 3,5 - 2,5 2,0
PA-142440 3,5 3,0 2,5 3,5 - 2,0 2,5
Belgiumból
PE-1960 4,5 4,5 3,0 4,0 1,5 - -
Franciaországból
EA-2975 4,0 3,5 3,0 3,0 2,0 - -
EA-2985 3,5 3,0 3,0 2,5 - - -
Amerikai Egyesült Államokból
SL-441 3,5 1,5 2,5 2,5 3,5 3,5 3,0
SL-451 3,0 2,0 2,5 2,5 3,5 4,5 4,0
AL-P10814/33 0,5 2,5 - - 2,5 3,5 3,0
AL-4094A - - - - 1,0 2,0 0,5
AL-7525 - - - - - 1,0 -
JC-MN41 - - - - 1,0 3,5 1,0
JC-MN44 - - - - 2,0 3,5 2,0
JC-MN45 - - - - 2,0 3,5 2,5
Kanadából
RB-16 2,5 - 3,0 2,0 3,0 3,5 -
RB-19 1,0 - 1,0 - 2,5 1,5 -
RB-22 1,5 - 2,0 2,5 2,5 3,5 -
RB-23 - - - - - 3,0 -
t =a titer negatív logaritmus formájában kifejezve - = negatív
8. táblázat
Egy sorozat, LA és SIRSV ellen készített kísérleti szérum reaktivitása IPMA-ban Hollandiából (NL1 és NL2), Németországból (GE1 és GE2), valamint az Amerikai Egyesült Államokból származó LA-izolátumokkal (US1,US2, US3) vizsgálva
Izolátumok NL1 NL2 GE1 GE2 US1 US2 US3
Szérumok anti-LA
21 14 dpi 2,5· 2,0 2,5 3,0 1,5 2,0 1,5
28 dpi 4,0 3,5 3,5 4,0 - 2,5 1,5
42 dpi 4,0 3,5 3,0 3,5 1,5 2,5 2,0
HU 218 431 Β
8. táblázat (folytatás)
Izolátumok NL1 NL2 GE1 GE2 US1 US2 US3
23 14 dpi 3,0 2,0 2,5 3,0 1,0 2,0 1,0
28 dpi 3,5 3,5 3,5 4,0 1,5 2,0 2,0
42 dpi 4,0 4,0 3,0 4,0 - 2,5 2,5
25 14 dpi 2,5 2,0 2,5 3,0 1,5 2,0 1,0
28 dpi 4,0 3,5 4,0 3,5 - 1,5 2,0
42 dpi 3,5 4,0 3,5 3,5 1,5 2,0 2,0
29 14 dpi 3,5 3,5 3,0 3,5 - 2,0 1,5
28 dpi 3,5 3,5 3,0 3,5 - 2,5 2,0
42 dpi 4,0 3,5 3,5 4,0 1,5 2,5 2,5
anti-SISRV
2B 20 dpi - - - - 2,0 2,0 -
36 dpi - - - - 1,5 2,0 -
63 dpi - - - - 1,0 1,0 -
9G 30 dpi - - - 2,5 3,0 -
44 dpi - - - - 2,5 3,5 -
68 dpi - - - - 2,0 3,5 1,5
16W 25 dpi - - - - 2,0 3,0 -
40 dpi - - - 2,0 3,0 -
64 dpi - - - - 2,5 2,5 1,5
16Y 36 dpi - - - 1,0 3,0 1,0
64 dpi - - - - 2,5 3,0 -
t = titer negatív logaritmusban kifejezve - = negatív
9. táblázat
A Lelystad-vírus ORF-jeinek jellemzői
ORF Nukleotidok (első-utolsó) Aminosavak száma A módosítatlan peptid számított mérete (kDa) Glikozilezési helyek száma
ORF1A 212-7399 2396 260,0 3
ORF1B 7384-11 772 1463 161,8 3
ORF2 11 786-12 532 249 28,4 2
ORF3 12 394-13 188 265 30,6 7
12 556-13 188 211 24,5 4
ORF4 12 936-13 484 183 20,0 4
12 981-13 484 168 18,4 4
13 068-13 484 139 15,4 3
ORF5 13 484-14 086 201 22,4 2
ORF6 14 077-14 595 173 18,9 2
ORF7 14 588-14 971 128 13,8 1
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (35)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Izolált, fertőzőképes vagy elölt vagy attenuált Lelystad-vírus, azzal jellemezve, hogy a rejtélyes sertés- 55 vész kórokozója, és lényegében megfelel annak a Lelystad-ágens izolátumnak (CDI-NL-2.91), amelyet az „Institute Pasteur”-nél helyeztünk letétbe (Párizs, Franciaország) 1991. június 5-én, 1-1102 letéti számon. 60
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy fertőzőképes izolált Lelystad-vírus.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy elölt izolált Lelystad-vírus.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti vírus, azzal jellemezve, hogy attenuált izolált Lelystad-vírus.
  5. 5. Lelystad-vírus izolált része vagy összetevője, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti Lelystad-vírusból lett izolálva.
    HU 218 431 Β
  6. 6. Izolált vagy szintetikus fehérje, peptid vagy polipeptid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája 1. igénypont szerinti Lelystad-vírusból származtatható.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti fehérje, peptid vagy polipeptid, azzal jellemezve, hogy a fehéijét, peptidet vagy polipeptidet kódoló szekvenciát funkcionálisan expressziós szabályozószekvenciákhoz kapcsoltan tartalmazó rekombináns vektorral transzformált gazdasejttel lett termeltetve.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti peptid vagy polipeptid, azzal jellemezve, hogy 1. ábrán bemutatott Lelystad-vírusspecifikus aminosav-sorrendet tartalmaz.
  9. 9. Izolált vagy szintetikus antitest, azzal jellemezve, hogy képes specifikusan felismerni az 1. igénypont szerinti Lelystad-vírus egy részét vagy összetevőjét.
  10. 10. Izolált vagy szintetikus nukleinsav, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti Lelystad-vírusból származtatható szekvenciát tartalmaz.
  11. 11. Rekombináns nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy 10. igénypont szerinti szekvenciájú nukleinsavat tartalmaz.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti rekombináns nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy 1. ábrán bemutatott, Lelystad-vírus-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmaz.
  13. 13. A 11. igénypont szerinti rekombináns nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy az 1. ábrán bemutatott nyitott leolvasási fázisokból származtatható, Lelystad-vírus-specifikus nukleotidszekvenciát tartalmaz.
  14. 14. A 11. igénypont szerinti rekombináns nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy rekombináns vektor.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti rekombináns vektor, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti Lelystad-vírusból származtatható szekvenciájú fehéijét, antigén hatású polipeptidet vagy peptidet kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz.
  16. 16. Vakcinakészítmény állatok, főleg emlősök, elsősorban sertések vakcinálására rejtélyes sertésvésszel szemben, azzal jellemezve, hogy 1. igénypont szerinti Lelystad-vírust, annak izolált részét, vagy abból származtatható szekvenciájú nukleinsavat, fehéijét, peptidet vagy polipeptidet, valamint alkalmas hordozót és/vagy adjuvánst tartalmaz.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy 2. igénypont szerinti fertőzőképes Lelystad-vírust, valamint alkalmas hordozót és/vagy adjuvánst tartalmaz.
  18. 18. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy 3. igénypont szerinti elölt Lelystad-vírust, valamint alkalmas hordozót és/vagy adjuvánst tartalmaz.
  19. 19. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy 4. igénypont szerinti attenuált Lelystad-vírust, valamint alkalmas hordozót és/vagy adjuvánst tartalmaz.
  20. 20. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy 15. igénypont szerinti rekombináns vektort, valamint alkalmas hordozót és/vagy adjuvánst tartalmaz.
  21. 21. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a Lelystad-vírus 5. igénypont szerinti, antigén sajátságú részét vagy összetevőjét, valamint alkalmas hordozót és/vagy adjuvánst tartalmaz.
  22. 22. A 16. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a Lelystad-vírusból származtatható 6. igénypont szerinti fehéijét, antigén sajátságú polipeptidet, peptidet vagy ezek immunológiai ekvivalensét, valamint alkalmas hordozót és/vagy adjuvánst tartalmaz.
  23. 23. A 16. igénypont szerinti, egy további patogén elleni vakcinálásra is alkalmas kombinált vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a patogénből származtatható fehérjét vagy antigén hatású peptidet kódoló nukleotidszekvenciát is tartalmazó 15. igénypont szerinti rekombináns vektort, valamint alkalmas hordozót és/vagy adjuvánst tartalmaz.
  24. 24. Diagnosztikai reagenskészlet az 1. igénypont szerinti Lelystad-vírusból származtatható nukleinsav és antigén, valamint az 1. igénypont szerinti Lelystad-vírusra specifikus antitest kimutatására állatból, főleg emlősből, elsősorban sertésből származó vizsgálati mintából, például vérből, vérszérumból, köpetből, nyálból vagy szövetből, azzal jellemezve, hogy
    a) nukleinsavhibridizációs próbaként vagy láncindító molekulaként 10. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát,
    b) antitestként 9. igénypont szerinti antitestet, vagy
    c) antigénként az 1. igénypont szerinti Lelystad-vírus egy 6., 7. vagy 8. igénypont szerinti, antigén sajátságú részét, valamint nukleinsav-, antigén- vagy antitestkimutatási eljárásokban használható, alkalmas kimutatási eszközöket tartalmaz.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet nukleinsav kimutatására, azzal jellemezve, hogy nukleinsavhibridizációs próbaként vagy láncindító molekulaként 10. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát, valamint nukleinsavkimutatási eljárásokban használható, alkalmas kimutatási eszközöket tartalmaz.
  26. 26. A 24. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet antigén kimutatására, azzal jellemezve, hogy 9. igénypont szerinti antitestet, valamint antigénkimutatási eljárásokban használható alkalmas kimutatási eszközöket tartalmaz.
  27. 27. A 24. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet antitest kimutatására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti Lelystad-vírus egy antigén sajátságú részét vagy komponensét, valamint antitestkimutatási eljárásokban használható alkalmas kimutatási eszközöket tartalmaz.
  28. 28. A 24. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet antitest kimutatására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti Lelystad-vírusból származtatható fehérjét vagy antigén sajátságú polipeptidet, vagy az 1. igénypont szerinti Lelystad-vírus egy antigénjének immunológiai ekvivalensét, valamint antitestkimutatási eljárásokban használható alkalmas kimutatási eszközöket tartalmaz.
  29. 29. A 24. igénypont szerinti diagnosztikai reagenskészlet antitest kimutatására, azzal jellemezve, hogy
    HU 218 431 Β
    1. igénypont szerinti Lelystad-vírust, valamint antitestkimutatási eljárásokban használható alkalmas kimutatási eszközöket tartalmaz.
  30. 30. In vitro diagnosztikai eljárás egy állat, főleg emlős, elsősorban sertés rejtélyes sertésvész kórokozójával való esetleges fertőzöttségének kimutatására, azzal jellemezve, hogy vizsgálati mintát készítünk az állatból, például a belőle származó vérből, vérszérumból, köpetból, nyálból vagy szövetből, és a
    24-29. igénypontok szerinti egy vagy több diagnosztikai reagenskészlet alkalmazásával kimutatjuk, hogy a minta tartalmaz-e 1. igénypont szerinti Lelystadvírusból származtatható nukleinsavat, Lelystad-vírus eredetű antigént vagy Lelystad-vírust specifikusan felismerő antitestet.
  31. 31. A rejtélyes sertésvészt okozó, „Institute Pasteur”-nél (Párizs, Franciaország) - 1991. június 5-én, 1-1102 letéti számon - letétbe helyezett Lelystadágens izolátumnak (CDI-NL-2.91) lényegében megfelelő izolált, fertőzőképes vagy elölt vagy attenuált Lelystad-vírus, a vírus valamely izolált részlete vagy ezek immunológiai ekvivalense alkalmazása, azzal jellemezve, hogy a vírust, részletét vagy ekvivalensét rejtélyes sertésvész elleni vakcinakészítmény előállítására alkalmazzuk.
  32. 32. Eljárás a rejtélyes sertésvész kórokozóját vagy annak izolált részletét specifikusan felismerő antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy alkalmas állatot az „Institute Pasteur”-nél (Párizs, Franciaország) - 1991. június 5-én, 1-1102 letéti számon letétbe helyezett Lelystad-ágens izolátumnak (CDI-NL-2.91) lényegében megfelelő fertőzőképes vagy elölt vagy attenuált Lelystad-vírussal vagy annak izolált részletével immunizálunk, a keletkezett specifikus antitesteket izoláljuk, és/vagy a keletkezett specifikus ellenanyag antigénkötésért felelős részét kódoló nukleinsavmolekulát vagy annak funkcionális ekvivalensét izoláljuk, alkalmas expreszsziós rendszerben expresszáltatjuk és az expresszálódott specifikus antitesteket izoláljuk.
  33. 33. Eljárás a rejtélyes sertésvész kórokozójából származtatható szekvenciát tartalmazó rekombináns nukleinsavmolekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az „Institute Pasteurénél (Párizs, Franciaország) - 1991. június 5-én, 1-1102 letéti számon - letétbe helyezett Lelystad-ágens izolátumnak (CDI-NL-2.91) lényegében megfelelő Lelystad-vírusból nukleinsavat izolálunk és az izolált nukleinsavrészletet önmagában ismert rekombináns eljárás alkalmazásával valamely olyan nukleinsavrészlettel építjük össze, amellyel természetben előforduló állapotában nem szomszédos, és/vagy az izolált nukleinsav szekvenciáját meghatározzuk, majd a meghatározott szekvenciával azonos vagy homológ szekvenciájú nukleinsavmolekulát szintetizálunk és azt önmagában ismert rekombináns eljárás alkalmazásával egy másik nukleinsavmolekulával építjük össze.
  34. 34. Eljárás vakcinakészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a rejtélyes sertésvészt okozó, „Institute Pasteur”-nél (Párizs, Franciaország) - 1991. június 5-én, 1-1102 letéti számon - letétbe helyezett Lelystad-ágens izolátumnak (CDI-NL-2.91) lényegében megfelelő izolált, fertőzőképes vagy elölt vagy attenuált Lelystad-vírust, a vírus valamely izolált antigén sajátságú részletét, ezek immunológiai ekvivalensét vagy a felsoroltak bármelyikét kódoló nukleinsavat alkalmas hordozóval és/vagy adjuvánssal elegyítünk.
  35. 35. Eljárás a rejtélyes sertésvész kórokozójának kimutatására alkalmas diagnosztikai reagenskészlet előállítására, azzal jellemezve, hogy a 30. igénypont szerinti eljárás végrehajtásához szükséges reagenseket, kitanítást és - kívánt esetben - reakcióedényeket együttes forgalmazásra alkalmas formában kiszereljük.
HU9303438A 1991-06-06 1992-06-05 A rejtélyes sertésvészt okozó Lelystad-vírus, a vírusból származtatható polipeptidek, antigének és nukleinsavak és rejtélyes sertésvész elleni vakcinakészítmények HU218431B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91201398 1991-06-06
EP92200781 1992-03-18

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9303438D0 HU9303438D0 (en) 1994-04-28
HUT67060A HUT67060A (en) 1995-01-30
HU218431B true HU218431B (hu) 2000-08-28

Family

ID=26129289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303438A HU218431B (hu) 1991-06-06 1992-06-05 A rejtélyes sertésvészt okozó Lelystad-vírus, a vírusból származtatható polipeptidek, antigének és nukleinsavak és rejtélyes sertésvész elleni vakcinakészítmények

Country Status (15)

Country Link
US (7) US5620691A (hu)
EP (1) EP0587780B2 (hu)
JP (1) JP3128133B2 (hu)
KR (1) KR0176265B1 (hu)
AT (1) ATE118352T1 (hu)
AU (1) AU2196592A (hu)
CA (2) CA2290906C (hu)
DE (1) DE69201441T3 (hu)
DK (1) DK0587780T4 (hu)
ES (1) ES2069435T4 (hu)
GR (1) GR3015118T3 (hu)
HU (1) HU218431B (hu)
MX (1) MX9202724A (hu)
UA (1) UA27788C2 (hu)
WO (1) WO1992021375A1 (hu)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA27788C2 (uk) * 1991-06-06 2000-10-16 Стіхтінг Сентрал Діргенескюндіг Інстітют Композиція, що містить виділений фактор лелістада, вакцинна композиція для вакцинації тварин (варіанти), діагностичний набір для виявлення антитіла
ES2065303T5 (es) * 1991-08-26 2001-05-01 Univ Minnesota Procedimiento de diagnosis y vacuna especifica.
US6080570A (en) * 1991-08-26 2000-06-27 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of producing a vaccine for Swine Infertility and Respiratory Syndrome
US5846805A (en) 1991-08-26 1998-12-08 Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
US6982160B2 (en) 1991-08-26 2006-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions that include SIRS virus
AU2684792A (en) * 1991-10-14 1993-05-21 Akzo Nobel N.V. Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
US6251397B1 (en) * 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
AU734320B2 (en) * 1992-10-30 2001-06-07 Iowa State University Research Foundation Inc. Vaccines inducing an immune response against viruses causing porcine respiratory and reproductive diseases
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US6380376B1 (en) 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6773908B1 (en) * 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US5695766A (en) 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
KR100374295B1 (ko) * 1993-02-08 2003-12-24 바이엘 코포레이션 돼지생식및호흡증후군바이러스의생육방법과백신에서그의용도
ES2074950B1 (es) * 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
DE69522984T2 (de) * 1994-04-11 2002-04-25 Akzo Nobel Nv Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins
DK53595A (da) * 1994-05-13 1995-11-14 Iberica Cyanamid Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner
ES2078187B1 (es) * 1994-05-13 1996-07-16 Cynamid Iberica S A Proteinas recombinantes de prrs, kits de diagnostico y vacunas que contienen dichas proteinas recombinantes.
MX9700817A (es) * 1994-08-05 1997-05-31 Univ Minnesota Secuencia viral de nucleotidos de "vr-2332" y metodos de uso.
ES2102971B1 (es) * 1996-01-25 1998-03-01 Hipra Lab Sa Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion.
US6015663A (en) * 1996-03-01 2000-01-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Restriction enzyme screen for differentiating porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains
US5976537A (en) * 1996-07-02 1999-11-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
SK286063B6 (sk) * 1997-05-06 2008-02-05 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Peptid vyvolávajúci tvorbu protilátok, protilátkareaktívna s týmto peptidom a diagnostická súpravaobsahujúca peptid a protilátku
US6174667B1 (en) 1997-09-23 2001-01-16 Cornell Research Foundation, Inc. Bovine viral diarrhea virus serum antigen capture
US7691389B2 (en) 1998-12-22 2010-04-06 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7132106B2 (en) 1998-12-22 2006-11-07 Pfizer Inc. Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
US7618797B2 (en) 1998-12-22 2009-11-17 Pfizer Inc Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and uses thereof
NZ501264A (en) 1998-12-22 2001-09-28 Pfizer Prod Inc Polynucleotide DNA sequence encoding an infectious RNA molecule encoding a North American PRRS
CA2293057C (en) * 1998-12-30 2008-04-01 Depuy Orthopaedics, Inc. Suture locking device
AU3198200A (en) * 1999-03-08 2000-09-28 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. Prrsv vaccines
ATE474041T1 (de) 1999-04-22 2010-07-15 Us Agriculture Auf dem isolat ja-142 basierender impfstoff gegen das reproduktive-und-respiratorische syndrom beim schwein
US7041443B2 (en) 2000-02-08 2006-05-09 Regents Of The University Of Minnesota Porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of use
SK11282003A3 (sk) * 2001-03-09 2004-02-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Oslabený európsky PRRS vírus, nukleotidová sekvencia kódujúca vírus, spôsob generovania infekčného živého oslabeného PRRS vírusu, bunková línia a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie
AU2002356520A1 (en) * 2001-08-09 2003-03-18 Cornell Research Foundation, Inc. Detection of bovine viral diarrhea virus in tissue samples
EP1432813B1 (en) * 2001-08-09 2009-03-18 Idexx Laboratories, Inc. Detection of bovine viral diarrhea virus in hair samples
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
US7437633B1 (en) 2002-09-26 2008-10-14 Xilinx, Inc. Duty cycle characterization and adjustment
WO2004110370A2 (en) * 2003-06-03 2004-12-23 Iowa State University Research Foundation, Inc. Etiologic agnet for sow infertility syndrome
KR20070028547A (ko) 2004-06-18 2007-03-12 리전츠 오브 더 유니버스티 오브 미네소타 바이러스에 감염되고 백신접종된 생물의 동정
US7632636B2 (en) 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
US20060068364A1 (en) * 2004-09-29 2006-03-30 Struck James T Methods and devices for the prevention and treatment of gingival recession
KR20070096019A (ko) 2005-01-13 2007-10-01 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 향상된 ｐｒｒｓ 백신
PL1856534T3 (pl) * 2005-02-25 2017-08-31 Idexx Laboratories, Inc. Peptydy do wykrywania przeciwciała wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń
CA2894069C (en) 2005-06-24 2019-02-26 Regents Of The University Of Minnesota Prrs viruses, infectious clones, mutants thereof, and methods of use
US20100227339A1 (en) 2005-12-02 2010-09-09 Iowa State University Research Foundation, Inc. Differential immunoassay for prrs vaccine antibody
US8202717B2 (en) * 2007-01-12 2012-06-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Non-simian cells for growth of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus
US8709730B2 (en) 2007-04-05 2014-04-29 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of preventing and treating viral infections by inhibiting the deISGylation activity of OTU domain-containing viral proteins
US8420373B2 (en) * 2007-07-27 2013-04-16 Universiteit Gent Permissive cells and uses thereof
RU2561595C2 (ru) * 2008-08-25 2015-08-27 Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs)
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
WO2011128415A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Universiteit Gent Cross-protecting vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome virus
UA108902C2 (uk) 2010-11-10 2015-06-25 Вірус північноамериканського репродуктивного та респіраторного синдрому свиней (prrs) та його застосування
US8765142B2 (en) 2011-02-17 2014-07-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh European PRRSV strain
BR112013020966B1 (pt) 2011-02-17 2020-05-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Processo em escala comercial para produção do prrsv
WO2013017570A1 (en) * 2011-07-29 2013-02-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Novel prrs virus inducing type i interferon in susceptible cells
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
UA114504C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
UA114503C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
JP6386999B2 (ja) 2012-05-17 2018-09-05 ゾエティス・エルエルシー ブタ生殖および呼吸症候群（ｐｒｒｓ）ウイルスに対する離乳前の効果的なワクチン接種
EP2929018A4 (en) 2012-12-07 2016-07-13 Univ Illinois PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS COMPOSITION AND USES THEREOF
CN105073130A (zh) 2013-03-15 2015-11-18 勃林格殷格翰动物保健公司 猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法
MX2016007737A (es) 2013-12-20 2016-09-07 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Variante del virus prrs, clon de adnc del virus europeo y sus usos.
US9920302B2 (en) 2015-08-31 2018-03-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Pestivirus vaccines for congenital tremors
US10188725B2 (en) 2015-12-14 2019-01-29 Elanco Us Inc. Hybrid core feline vaccines
BR112019012158A2 (pt) 2016-12-14 2019-11-12 Zoetis Services Llc vacinação eficaz contra cepas europeias de vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (prrs) antes do desmame
CN109884296B (zh) * 2019-02-26 2022-02-18 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 一种利用纳米金直接标记引物的快速检测非洲猪瘟的试剂盒
CN114222579A (zh) 2019-04-04 2022-03-22 勃林格殷格翰动物保健美国有限公司 猪圆环病毒3型（pcv3）疫苗及其生产和用途
JP2023535066A (ja) 2020-07-24 2023-08-15 ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド 組合せブタワクチン
CN112285347B (zh) * 2020-09-30 2023-12-22 西北农林科技大学 一种猪血清样中病原抗体elisa检测试剂盒
CN112964871A (zh) * 2021-02-07 2021-06-15 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种猪脑心肌炎间接elisa诊断试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4468346A (en) * 1983-10-27 1984-08-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Monoclonal antibodies to porcine immunoglobulins
US5213759A (en) * 1988-05-05 1993-05-25 Elopak Systems A.G. Sterilization
UA27788C2 (uk) * 1991-06-06 2000-10-16 Стіхтінг Сентрал Діргенескюндіг Інстітют Композиція, що містить виділений фактор лелістада, вакцинна композиція для вакцинації тварин (варіанти), діагностичний набір для виявлення антитіла
SE504682C2 (sv) * 1991-07-04 1997-04-07 Saab Marine Electronics Anordning för mätning av nivån av ett i en behållare befintligt medium
ES2065303T5 (es) * 1991-08-26 2001-05-01 Univ Minnesota Procedimiento de diagnosis y vacuna especifica.
MX9204885A (es) 1991-08-26 1994-05-31 Boehringer Animal Health Inc Composicion de vacuna que comprende virus del sindrome de infertilidad y respiratorio de los cerdos.
US6042830A (en) * 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
US5846805A (en) * 1991-08-26 1998-12-08 Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
WO1993006211A1 (en) 1991-09-16 1993-04-01 Collins James E Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof
AU2684792A (en) * 1991-10-14 1993-05-21 Akzo Nobel N.V. Porcine reproductive respiratory syndrome vaccine and diagnostic
FR2686097B1 (fr) * 1992-01-14 1994-12-30 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
TW289731B (hu) * 1992-07-09 1996-11-01 Akzo Nv
US6251397B1 (en) 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
US5695766A (en) * 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6380376B1 (en) * 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US5419907A (en) * 1992-11-10 1995-05-30 Iowa State University Research Foundation, Inc. Pathogenic porcine respiratory coronavirus
KR100374295B1 (ko) 1993-02-08 2003-12-24 바이엘 코포레이션 돼지생식및호흡증후군바이러스의생육방법과백신에서그의용도
ES2074950B1 (es) * 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
EP0659885A1 (en) * 1993-12-21 1995-06-28 Akzo Nobel N.V. Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity
DE4407489A1 (de) * 1994-03-07 1995-09-14 Bayer Ag Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines
DE69522984T2 (de) * 1994-04-11 2002-04-25 Akzo Nobel Nv Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Schweins
DK53595A (da) 1994-05-13 1995-11-14 Iberica Cyanamid Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner
MX9700817A (es) * 1994-08-05 1997-05-31 Univ Minnesota Secuencia viral de nucleotidos de "vr-2332" y metodos de uso.
DE69632658T2 (de) * 1995-03-14 2005-06-09 Akzo Nobel N.V. Expression in der selben Zelle von Polypeptide vom schweinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom
US5690940A (en) 1995-06-21 1997-11-25 Regents Of The University Of Minnesota Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof
ES2102971B1 (es) * 1996-01-25 1998-03-01 Hipra Lab Sa Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion.
US6015663A (en) * 1996-03-01 2000-01-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Restriction enzyme screen for differentiating porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains
US5866401A (en) * 1996-03-01 1999-02-02 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
US5976537A (en) * 1996-07-02 1999-11-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
DE69704011T2 (de) * 1996-10-09 2001-06-07 Akzo Nobel Nv Europäische Vakzinstämme des Fortplanzungs-Atmungs-Syndromsvirus des Sweins (PRRSV)

Also Published As

Publication number Publication date
US20050058655A1 (en) 2005-03-17
HU9303438D0 (en) 1994-04-28
DE69201441D1 (de) 1995-03-23
JPH06508131A (ja) 1994-09-14
US20040132014A1 (en) 2004-07-08
AU2196592A (en) 1993-01-08
US20080108107A1 (en) 2008-05-08
US7897343B2 (en) 2011-03-01
HUT67060A (en) 1995-01-30
DE69201441T3 (de) 2008-12-04
CA2103460C (en) 2000-09-26
EP0587780B1 (en) 1995-02-15
MX9202724A (es) 1992-12-31
CA2290906C (en) 2003-04-01
ATE118352T1 (de) 1995-03-15
DE69201441T2 (de) 1995-06-01
ES2069435T4 (es) 1997-06-16
DK0587780T4 (da) 2008-10-13
WO1992021375A1 (en) 1992-12-10
US6197310B1 (en) 2001-03-06
GR3015118T3 (en) 1995-05-31
CA2290906A1 (en) 1992-12-07
KR0176265B1 (en) 1999-03-20
US7335473B2 (en) 2008-02-26
US6455245B1 (en) 2002-09-24
UA27788C2 (uk) 2000-10-16
EP0587780A1 (en) 1994-03-23
JP3128133B2 (ja) 2001-01-29
US20030118608A1 (en) 2003-06-26
EP0587780B2 (en) 2008-08-20
CA2103460A1 (en) 1992-12-07
US6806086B2 (en) 2004-10-19
US5620691A (en) 1997-04-15
ES2069435T3 (es) 1995-05-01
DK0587780T3 (da) 1995-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7897343B2 (en) Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits
US5698203A (en) European vaccine strains of the Porcine Reproductive Respiratory Syndrome virus (PRRSV)
Madsen et al. Sequence analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the American type collected from Danish swine herds
Plagemann et al. The primary neutralization epitope of porcine respiratory and reproductive syndrome virus strain VR-2332 is located in the middle of the GP5 ectodomain
US6592873B1 (en) Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
JPH07138186A (ja) ブタ呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスに対して免疫応答を高めるワクチン、該ウイルスによって惹起される病気からブタを保護する方法、該ウイルスに対する免疫応答を高めるワクチンを生産する方法、及び該ウイルスから得られたｄｎａ
WO1996006619A9 (en) Polynucleic acids and proteins from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses thereof
CN1240481A (zh) Rna病毒的感染性克隆及其衍生的疫苗及诊断分析
Bøtner et al. Heterologous challenge with porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) vaccine virus: no evidence of reactivation of previous European-type PRRS virus infection
US6468538B1 (en) Recombinant proteins for the fusion of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its use in diagnosis
US6410031B1 (en) Attentuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain and method of use
RU2124051C1 (ru) Композиция на основе фактора лелистада (варианты), вакцина (варианты), диагностический набор (варианты) и способ диагностики
WO1991000352A1 (en) Pestivirus nucleotide sequences and polypeptides
RU2765658C2 (ru) Выделение нового пестивируса, вызывающего врожденный тремор а
RU2765658C9 (ru) Выделение нового пестивируса, вызывающего врожденный тремор а
Porntippa Nawagitgul Characterization of a variant of transmissible gastroenteritis virus (TGEV)
Zhang Molecular comparison and antigenic differentiation of the structural proteins of virulent and attenuated strains of equine arteritis virus
Hedges et al. EXPRESSION OF EQUINE ARTERITIS VIRUS ORFS 2-4 AND 7 FROM RECOMBINANT
None Characterization of a variant of transmissible gastroenteritis virus (TGEV)
Warg The development of a reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for diagnosis of porcine epidemic diarrhea virus
WO1999002184A1 (en) Causative agent of sow abortion and mortality syndrome (sams), vaccine compositions, antibodies and method

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GMBH, DE