JPH07138186A - ブタ呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスに対して免疫応答を高めるワクチン、該ウイルスによって惹起される病気からブタを保護する方法、該ウイルスに対する免疫応答を高めるワクチンを生産する方法、及び該ウイルスから得られたｄｎａ - Google Patents

ブタ呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスに対して免疫応答を高めるワクチン、該ウイルスによって惹起される病気からブタを保護する方法、該ウイルスに対する免疫応答を高めるワクチンを生産する方法、及び該ウイルスから得られたｄｎａ

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Abstract

(57)【要約】 【構成】ブタ生殖器および呼吸器疾病を惹起するウイル
スからブタを保護するワクチン、これらのウイルスによ
って惹起される疾病からブタを保護する方法、ブタ生殖
器および呼吸器疾病を惹起するウイルスに対するワクチ
ンの製造方法が提供される。 【効果】ウイルスや他の病原体に起因するブタの生殖器
および呼吸器疾病の予防および治療を行なうことができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】［発明の背景］ ＜発明の分野＞本発明は呼吸器及び生殖器ウイルスによ
って惹起される病気からブタを保護するワクチン、呼吸
器及び生殖器疾病からブタを保護する方法、ワクチンを
生産する方法、ブタの呼吸器及び生殖器疾病を惹起する
ウイルスから得られたＤＮＡに関する。
【０００２】＜背景の論議＞近年、北アメリカ及び欧州
の家畜ブタは呼吸器及び生殖器ウイルス（A. A. S.P. 9
月／10月, 1991， 7 - 11 頁； Veterinary Record,19
92 年2 月1 日、87-89 頁; Ibid.,1991年11月30日、495
- 496 頁；Ibid.,1991年10月26日、370 頁；Ibid.,199
1年10月19日、367 - 368 頁；Ibid.,1991年8 月3 日、1
02 - 103 頁；Ibid.,1991年7 月6 日; Ibid.,1991年6
月22日、578 頁；Ibid.,1991年6 月15日、574 頁；Ibi
d.,1991年6 月 8日、536 頁；Ibid.,1991年6 月1 日、5
11 頁；Ibid.,1991年3 月 2日、213 頁参照）の新種菌
に罹患し易くなってきた。その最初に同定された新種菌
は、いわゆる謎のブタ疾病（MSD)または“青耳症候群”
に関係しているウイルスで、現在はブタ不妊症・呼吸器
症候群（SIRS) あるいはブタ呼吸器・生殖器症候群(PRR
S)として知られている。欧州では、この疾病はブタの伝
染性流産・呼吸器症候群（PEARS)、青色流産［blue abo
rtion disease ］、青耳病（英国）、青色流産（オラン
ダ）、ブタ伝染性自然流産［Seuchenhafterspatabort d
er schweine］（ドイツ）、と呼ばれ、その対応ウイル
スは“レリスタッドウイルス”［Lelystad virus］と名
付けられている。合衆国では、この疾病はワバッシュ症
候群（Wabash syndrome)、謎のブタ疾病（MPD)およびブ
タペストとも呼ばれている。PRRSに時々関連しておこる
疾病に増殖性介在性肺炎（PIP)がある。
【０００３】“青耳病”の発生は英国、ドイツ、ベルギ
−、およびオランダの家畜ブタで観察されている。英国
での発生はブタの品評会を中止に追い込んだ。PRRSの症
状には、食欲不振（食欲減退）、微熱（発熱）末端チア
ノ−ゼ（青目が特徴的）、死産、流産、影響を受けた同
産児の高死亡率、虚弱ブタの誕生、未熟児出産等があ
る。影響下の雌ブタから生きて生まれたブタの大半は４
８時間後に死亡した。PRRSウイルスの臨床的徴候には、
軽いインフルエンザ状徴候、速い呼吸（“サンピング
［thumping］”）、散在性介在性肺炎等がある。PRRSウ
イルスは被感染動物に接触してから約２週間の潜伏期間
をもつ。このウイルスはエンベロ−ブを有するＲＮＡ血
管炎ウイルス［arterivirus ］のようにみえる（Ibid.,
1992年 2月 1日参照）。このウイルスはブタ肺胞マクロ
ファ−ジ中、CL2621細胞中（Benfieldet al, J. vet.Di
agn. Invest.,4:127 - 133, 1992; Collins et al, Sw
ine Infertilityand Respiratory Syndrome/Mystery Sw
ine Disease, Proc., MinnesotaSwine Conference for
Veterinarians, pp 200 - 205, 1991) 、およびMARC細
胞（Joo,PRRS: Diagnosis, Proc., Allen D. Leman Swi
ne Conference,Veterinary Continuing Education and
Extension, University of Minnesota (1993),20:53 -
55）で生育させることができる。またSIRSを起こすウイ
ルスの培養の成功は、Wensvoort et al(Mystery Swine
Disease in the Netherlands: The Isolation of Lelys
tad Virus. Vet.Quart. 13:121 - 130, 1991) によって
報告されている。
【０００４】合衆国でのPRRSの発生は養豚畜産業に悪影
響を与えている。カナダでは、雌ブタで最高２週間継続
する食欲減退、発熱、妊娠後期での流産、死産率の増
加、虚弱児出産、激しい腹式呼吸及び下痢に始まる新生
児の死亡がPRRSの特徴とされている。PRRSを起こすウイ
ルスの単離、PRRS感染の診断、PRRSウイルスに対するワ
クチンの開発についての研究は公表されている（カナダ
特許公報第2,076,744; PCT国際出願第WO93/03760; PCT
国際出願第WO93/06211; および PCT国際出願第WO93/078
98参照) 。
【０００５】二番目のウイルス菌株は、PRRSの原因物質
探索中に発見され、増殖性壊死性肺炎（PNP)として現在
知られる疾病を引き起こす。PNP の症状及びPNP を惹起
する病因ウイルスはPRRS及びその対応ウイルスと同一の
ように思えるが、認識できる相違がある。例えば、PNP
を引き起こすウイルスはブタインフルエンザＡ型ウイル
スのうちの、代表的ではないかあるいは典型的ではない
ウイルス（aSIV) だと思われている。
【０００６】PNP の臨床的徴候は、主に発熱、呼吸困
難、及び複式呼吸である。様々な年齢のブタが罹患する
が、4 - 16週齢のブタに最も多く徴候が現れる。罹患し
たブタの肺は一様に所々肉状に赤くなっている (Collin
s, A.A.S.P., 9/10 月、1991年7 - 11頁）。対照的に、
PRRSに罹患したブタは重篤な発熱を示さず、呼吸器徴候
は散在性介在性肺炎の特徴である肺病巣を伴った新生ブ
タ( ３週齢未満）で主に観察される。
【０００７】脳心筋炎ウイルス(EMCV)は別のウイルスで
あり、重篤な介在性壊死性石灰化心筋炎を併発する重篤
な介在性肺炎を起こす。EMCVは、実験では、罹患した雌
ブタにおいて生殖能力減退を起こす。(Kim et al, J. V
et.Diagn. Invest.,1:101 -104 (1989); Links et al,
Aust. Vet. J.,63:150 - 152 (1986); love et al,Aus
t. Vet. J., 63:128 - 129(1986参照) 。
【０００８】最近、合衆国中西部で、3 - 8 週齢のブタ
において、より病原性の高い型のPRRSが発生し、しかも
その発生率は上昇している。典型的には、健康な3 - 5
週齢ブタが離乳後5 - 7 日で発病する。感染ブタの組織
における汎用ウイルス同定方法ではブタのインフルエン
ザウイルス（SIV)、シュ−ドラビ・ウイルス［pseudora
bies virus］(PRV) 、マイコプラズマ・ハイポニュ−モ
ニア［Mycoplasma hypneumoniae ］がPRRSのこの新型と
は関係ない事がわかった。
【０００９】本発明は主に、新規のより病原性の高いPR
RS型を引き起こす病原体からブタを保護するワクチン、
ワクチンを製造投与する方法、およびこの新規PRRS型を
引き起こす病原体のゲノム部分をコ−ドするＤＮＡに関
する。しかしながら、本発明開発中に得られた情報が、
いかなるおよび／または全てのブタの呼吸器及び生殖器
疾病に対してのワクチン開発において有用であり、かつ
ブタを保護する方法に有用となるであろうと信ずる。例
えば、本発明者らは、以前に公表されたPRRSウイルスの
病理と相違する少なくともひとつのPRRSウイルスの病理
を特徴付けた（下記表１参照）。それ故、本発明は、こ
のPRRS新型を惹起する、本発明者らによってPRRVウイル
スの“アイオワ株”（PRRSV)と命名された病原体に関す
るワクチン及び方法には必ずしも限定されない。
【００１０】それにもかかわらず、これらのブタのウイ
ルスに対する有効なワクチンの開発に当たって、当該技
術では悲観論及び楽観論が提示されてきた（The Veteri
naryRecord, October 26,1991参照) 。ヒトインフルエ
ンザワクチンがPRRSおよびPNP の影響に対していくばく
かの保護を与えるのではないかという信条が当該技術分
野には存在する（例えば、Ibid.,1991年7 月6 日参
照）。しかしながら食用動物へのヒトワクチンの使用は
一般的に調整管理省庁により反対されるので、このアプ
ロ−チを現実的に実行することは困難である(Ibid 参
照）。
【００１１】ブタの畜産業は、これらのブタの生殖・呼
吸器系疾病およびその別型疾病が発生することで悪影響
を受けてきており、今後も影響を受けるであろう。驚い
たことに、合衆国及び世界の動物ワクチンの市場は人間
用ワクチン市場より大きい。だから畜産用家畜を疾病か
ら保護することによって派生する実質的な公衆衛生貢献
に加えて更に、新規動物用ワクチンの開発には経済的誘
因も介在する。 ［発明の要旨］従って、本発明のひとつの目的はブタの
呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスによる感染か
らブタを保護する新規ワクチンを提供することにある。
【００１２】更に本発明の目的は、PRRSV のアイオワ株
に対しブタを保護するワクチンを提供することである。
【００１３】更に本発明の目的は、ブタにおいて呼吸器
及び生殖器疾病を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイ
オワ株に対して有効な免疫学的応答を高めるワクチンを
提供することである。
【００１４】更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生
殖器疾病を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイオワ株
による感染からブタを保護する新規方法を提供すること
である。
【００１５】更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生
殖器疾病を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイオワ株
に対して有効な免疫学的応答を高める新規方法を提供す
ることである。
【００１６】更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生
殖器疾病を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイオワ株
と免疫学的に結合する抗体を提供することである。
【００１７】更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生
殖器疾病を惹起するウイルスによる感染に対してブタを
保護するワクチンと免疫学的に結合する抗体を提供する
ことである。
【００１８】更に本発明の目的は、PRRSV のアイオワ株
による感染に対してブタを保護するワクチンと免疫学的
に結合する抗体を提供することである。
【００１９】更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生
殖器疾病、特にPRRSV のアイオワ株によって惹起される
疾病に罹患したブタを治療する方法を提供することであ
る。更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生殖器疾病
を惹起するウイルス、特にPRRSV のアイオワ株に接触し
たブタを治療する方法を提供することである。
【００２０】更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生
殖器疾病、特にPRRSV のアイオワ株によって惹起される
疾病、を惹起するウイルスを分析する診断キットを提供
することである。
【００２１】更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生
殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体のゲノム、特
にPRRSV のアイオワ株から単離されたポリヌクレオチド
を提供することである。
【００２２】更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生
殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体、特にPRRSV
のアイオワ株の一つ以上のタンパクをコ−ドしているポ
リヌクレオチドを提供することである。
【００２３】更に本発明の目的は、ブタの呼吸器及び生
殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体、特にPRRSV
のアイオワ株由来の一つ以上の抗原ペプチドをコ−ドし
ているポリヌクレオチドを提供することである。
【００２４】更に本発明の目的は、ブタの生殖器および
呼吸器ウイルスまたは病原体を適切な細胞系を使用して
培養する新規方法を提供することである。
【００２５】更に本発明の目的は、PRRSV のアイオワ株
を適切な細胞系を使用して培養する新規方法を提供する
ことである。
【００２６】これら及び下記の好ましい実施態様の記載
中で明らかになるであろう他の目的は、ブタの呼吸器及
び生殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体による感
染に対してブタを保護するワクチン、この様なブタの疾
病を惹起するウイルスまたは病原体に対して有効な免疫
学的応答を惹起する組成、この様なブタの疾病を惹起す
るウイルスまたは病原体に対して感染からブタを保護す
る方法、及び呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルス
または病原体のゲノム部分をコ−ドしているＤＮＡによ
って提供された。 ［好ましい実施態様の詳細な説明］本発明において、ブ
タの呼吸器および生殖器疾病は上述したPRRS、PNP 、お
よび EMCV に言及し、PRRSV のアイオワ株によって惹起
される疾病、およびこれらの疾病に綿密に関連し今まで
に出現したり将来出現するであろう疾病を述べる。も
し、未感染ブタにワクチン投与後、肺の病巣または疾病
の症状が現れないか、または感染しても無保護のブタの
ように重篤でなければ、そして、感染ブタにワクチンを
投与した後、肺の病巣または疾病の症状が除去され、ま
たは感染しても無保護のブタのように重篤でなければ、
ワクチンは、“ブタの呼吸器および生殖器疾病ウイルス
または病原体によって惹起される疾病に対してブタを保
護”している。未感染ブタは、ブタの呼吸器および生殖
器疾病病原体と接触していないか、ブタの呼吸器および
生殖器疾病病原体と接触していても疾病の症状を表して
いないかのどちらかのブタである。感染ブタは、疾病の
症状を示しているブタである。ブタの呼吸器および生殖
器疾病の症状は、発熱温度、または肺の病巣（感染した
肺組織のパ−セント）等で定量または評点化でき、また
は呼吸困難の重篤性等（詳細は下記に説明）で半定量で
きる。
【００２７】“ブタの呼吸器および生殖器疾病ウイルス
および病原体”は上述のようにブタの呼吸器および生殖
器疾病を惹起する。
【００２８】新規の、より病原性の高いPRRS型を惹起す
る病原体はPRRSV の“アイオワ”株と命名された。PRRS
ウイルスの“アイオワ”株単離物によって惹起された疾
病は、他のブタの呼吸器および生殖器疾病より重篤では
なく同等な症状を持つ。臨床徴候には、傾眠、呼吸困
難、サンピング（強制呼気）、発熱、毛皮の荒れ、いび
き、咳、目水腫、散発性結膜炎等がある。病巣には、肉
眼視的なおよび／または顕微鏡視的な肺の病巣および急
性間質性心筋炎等がある。病原体は単一のウイルスであ
るかまたは一つ以上の付加的病原体（他のウイルスまた
はバクテリア）と結合しているものでもよい。更に、ア
イオワ株の病原性に劣る型および非感染型が発見されて
いるが、それらは一部の上記症状を惹起するかまたはま
ったく症状を現わさないけれども、本発発明によると、
それにもかかわらず、ブタの生殖器および呼吸器疾病に
対する保護を行うために使用され得る。
【００２９】様々なブタの疾病における組織学的病巣は
違う。下記表１はブタウイルスによって惹起される多く
の疾病に関連する病巣の生理学的所見および病理を比較
してある。
【００３０】
【表１】 ここでは、“PRRS(p) ”はPRRSウイルスの公表されてい
る病理を示す。“PRRS(o) ”は本発明者らによって観察
されたPRRSの病理、“SIV ”はブタのインフルエンザＡ
ウイルスを示し、“PRCV”はブタ呼吸器コロナウイルス
を示し、“PRMV”はブタのパラミキソウイルスを示し、
“Iowa”は本発明者らによって発見されたPRRSV の新
株、“II型”はII型肺胞細胞（これは感染ブタで増殖す
る）を表わす。“inter ”は間隙を、“気道壊死”は最
終気道中の壊死を言い、記号（- ）、（ +）から（+++
+) は下記のように相対的重篤度を表現する。
【００３１】（-): 陰性（観察されず） （+): 軽度（観察閾値を超えた程度） (++): 中度 (+++): 重度 (++++): 最も重度 PRRSV のアイオワ株は合衆国中西部でPRRSと一緒に、本
発明者らによって同定された。ウイルスが天然界で発見
されたので、PRRSV のアイオワ株に関係する疾病が特定
のウイルスのために起こるのか、または一つ（以上）の
病原体との組み合せによって起こるのかどうかは明らか
ではない。しかしながら、PRRSV のアイオワ株のプラ−
ク精製サンプルでは単一特定ウイルスのように見える。
それ故、“PRRSV のアイオワ株”は、特定プラ−ク精製
ウイルスか、あるいはウイルスと一つ（以上）の病原体
との組み合わせを含む感染動物からの組織ホモジネ−ト
かのいずれかといわれ、PRRSV のアイオワ株に感染した
ブタは、上記の様にPRRSVのアイオワ株によって惹起さ
れる疾病の特徴的な症状を示す。
【００３２】PRRSV のアイオワ株は従来のPRRSを惹起す
る病原体とは相違する事が最近の事実で実証されてい
る。例えば、PRRSV のアイオワ株で惹起される疾病の症
状を示している感染ブタで観察される病巣は、従来の前
述したPRRSウイルス単独で感染させたブタで観察される
病巣より重篤であり、またアイオワ株で惹起される疾病
に罹患しているブタは、PNP に関連したウイルス等のイ
ンフルエンザに対してはセロネガテイブである。
【００３３】図１- 4 では、本発明に包含される様々な
型のワクチン調製のための手法の工程のフロ−チャ−ト
が提供される。図１- 4 のフロ−チャ−トが本発明のワ
クチンを生産する模範的な方法として提供されている
が、これによって、どのようにも本発明が制限されるも
のではない。
【００３４】図１- 4 に詳述する各々のステップで、ま
ず第一は、ブタの呼吸器および生殖器ウイルスまたは病
原体による感染に罹患しやすい細胞系を同定することで
ある（ワクチンの調製に関する論議を簡単にするため
に、“ウイルス”という言葉は、ブタの呼吸器および生
殖器疾病に関連したウイルスおよび／または病原体を意
味するものとする）。次に、罹患し易いホスト細胞のマ
スタ−細胞（MCS)ストックが調製される。罹患し易いホ
スト細胞はMCS から継続して植え継がれる。実用細胞ス
トック（WCS)がMCS およびMCS+n 間の継代細胞から調製
される。
【００３５】マスタ−種ウイルスがMCS およびMCS+n 間
の罹患し易いホスト細胞系の上で、特に実用細胞ストッ
ク上で増殖される。生のウイルスが従来技術公知の方法
で、目的ウイルスで惹起される疾病の症状に対応した疾
病の症状を示している感染ブタから採取され、適宜に好
適にホモジナイズされた組織サンプルより単離される。
適切なホスト細胞、好ましくは実用細胞ストックサンプ
ルが、ウイルスで感染され、培養される。続いて感染、
培養されたホスト細胞から従来技術公知の方法で、ワク
チンウイルスが単離され、プラ−ク精製される。ワクチ
ンを調製するために使用するウイルスは、プラ−ク精製
を３回されることが好ましい。マスタ−種ウイルス（MS
V)は、従来技術公知の方法でプラ−ク精製したウイルス
から調製される。マスタ−種ウイルス（MSV(X)は実用細
胞ストック中で、少なくとも４回のMSV(X + 1), MSV(X
+ 2), MSV(X + 3), MSV(X + 4)の継代ウイルスを通して
受け継がれる。MSV(X + 4)が実用となる種ウイルスと見
做される。本発明のブタの研究に使用される継代ウイル
スおよびワクチン生成物は５世代目の生成品、MSV(X +
5)、である。
【００３６】実用細胞ストックに関連して、プロトタイ
プのワクチン、好ましくはMSV(X +5)を調製するために
実用種ウイルスは公知の方法で十分な量培養される。本
発明のプロトタイプワクチンは、動物医薬品分野でのい
づれの使用にも適する。適切なタイプには、改変された
生または弱毒化ワクチン（図１）、不活性化細胞または
死菌ワクチン（図２）、サブユニットワクチン( 図
３）、遺伝子工学的に作製したワクチン（図４）、動物
ワクチン技術分野で認識されているその他のワクチンが
ある。死菌ワクチンは、当業者に公知の方法で化学処理
または熱等で不活性化される。
【００３７】図 1 - 4のそれぞれで概要を示した手法で
は、下記プロトタイプワクチンの調製、ブタの免疫感作
モデルの調製、臨床分析が当該技術分野において公知の
方法で行われる。例えば、現実にワクチン接種、免疫感
作研究を行う前に、防御し、治療されるべき疾病がその
症状、臨床分析結果、および状態等で規定されなければ
ならない。上述したように、PRRSV のアイオワ株に関連
した病原体はその症状および状態で規定されている。PR
RSV のアイオワ株に関連した病原体の臨床的分析は下記
の実施例に記載されている。
【００３８】疾病が十分に規定され、特定化された後、
ブタにプロトタイプワクチンを投与して、該ブタを該疾
病を惹起するウイルスまたは病原体に接触させる。これ
は当該技術でブタおよびその免疫システムへの“免疫感
作”として知られる。免疫感作したブタをウイルスまた
は病原体に接触させて反応を観察し、プロトタイプのワ
クチンのブタを保護する能力を分析した後、当該技術に
おいて公知の方法で、有効性研究が行われる。次に、可
能性分析が当該技術公知の方法によって別々の手段で開
発され、認可前のシリ−ズが生産される。
【００３９】図１に概要を示したように改変生ワクチン
の調製においては、プロトタイプワクチンが調製されて
はじめて、細胞生育条件およびウイルス生産の至適化が
計られ、生産概要が当該技術公知の方法で調製される。
生産概要が作成されると、認可前のシリ−ズが当該技術
公知の方法で引き続き調製される。認可前のシリ−ズ
は、一定の標準でシリ−ズを生産できる能力を示す可能
性の高いプロトタイプワクチンの大規模生産と表現され
る。プロトタイプ生ワクチンを調製する一つの方法はウ
イルス感染細胞（好ましくは、マスタ−種ウイルスを感
染させた細胞）を溶菌させるために、凍結解凍のサイク
ルに一回以上供することであろう。凍結解凍した感染細
胞培養物質は、貯蔵保存性を高めるために凍結乾燥（フ
リ−ズドライ）される。その後再び水和して、感染細胞
培養物質を生ワクチンとして使用する。
【００４０】不活性化ワクチン（図２）の認可前のシリ
−ズを調製する手段は基本的に改変をおこなった改変生
ワクチンの調製に使用される手段と同様である。細胞生
育条件およびウイルス生産プロトコ−ルを至適化した
後、至適生産概要を作成する前に、ウイルスの不活性化
の至適化を行なわなければならない。ウイルスの不活性
化プロトコ−ルおよびその至適化は一般的に当業者に公
知であり、研究される特定のウイルスによって、公知ま
たは予測される方法で変えられる。
【００４１】サブユニットワクチン（図３）調製は、改
変生ワクチンまたは不活性ワクチンの調製とは相違す
る。プロトタイプワクチンの調製に先立ち、ワクチンウ
イルスの防御または抗体成分が同定されなければならな
い。この様な防御または抗体成分には、あるアミノ酸部
分またはブタにおいて特に強力な防御的、免疫学的応答
を惹起するウイルスのコ−ト蛋白の（好ましくは、少な
くとも５アミノ酸の長さを持ち、特に好ましくは少なく
とも１０アミノ酸の長さを持つ）断片；単一または多種
類のウイルスコ−ト蛋白自身、それらのオリゴマ−、ウ
イルスサブ構造あるいはそのようなサブ構造の均等部分
もしくは単位を形成するウイルス被覆タンパクのより高
次の関連物質；ウイルス表面上または近辺、あるいはヌ
クレオキャプシドのようなウイルスサブ構造中に存在す
るオリゴグリコシド、糖脂質または糖蛋白；ウイルスに
関連するリポタンパクもしくは脂質基が含まれる。これ
らの構成成分は当該技術公知の方法で同定される。一度
同定されると、続いてウイルスの防御的または抗体部分
（サブユニット）は、当該技術公知の方法で精製されお
よび／またはクロ−ンされる。
【００４２】サブユニットワクチン（図３）の認可前の
シリ−ズの調製は、幾つかの改変を加えて、不活性化ワ
クチン（図２）に使用される方法と同様である。例え
ば、サブユニットが組換え遺伝子工学的技法を通して生
産されるならば、クロ−ンされたサブユニットの発現は
当該技術公知の方法で最適に行われる（たとえば、Mani
atis et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al”, Cold Spring Habor Laboratory (1989), Cold S
pring Habor, Massachusetts の関係部分参照）。一
方、サブユニットが全コ−ト蛋白等のウイルスの完全な
構造的特徴を示すならば、ウイルスからの単離が最適に
おこなわれなければならない。どちらの場合も、不活性
化手段を最適に行った後、サブユニットの精製手段が生
産概要を作成する前に、最適に行われる。
【００４３】遺伝子学的に調製されるワクチン（図４）
は、他のワクチン調製用に使用される一般的手法を改変
することから始められる。プラ−ク精製後、野生型ウイ
ルスが、当該技術公知の方法、好ましくは、PSP-36また
はマクロファ−ジ細胞をホストとして使用する通常の細
胞培養方法で適宜な組織ホモジネ−トから単離される。
【００４４】ＲＮＡは当該技術公知の方法、好ましくは
商業的入手可能なＲＮＡ単離キット（例えば、Stratage
ne, La Jolla, Californiaから入手されるキット）を使
用するグアニデイン イソシアネ−ト法によって、生物
学的に純粋なウイルスまたは病原体から抽出され、当該
技術公知の方法で、好ましくは塩化セシウム濃度勾配に
よる超遠心分離法によって精製される。ＲＮＡはオリゴ
(dT)- セルロ−スカラムクロマトグラフによって更に精
製され、濃縮される。
【００４５】ウイルスゲノムは、次に適当なホストに当
該技術公知の方法によってクロ−ンされ（上記Maniatis
et al. 参照）、分析されてウイルスの抗体部分を生じ
るのに必要不可欠なゲノム部分を決定する。その後の手
段は改変生ワクチン、不活性化ワクチン、またはサブユ
ニットワクチンのための方法と一般的には同じである。
【００４６】本発明のワクチンはブタの呼吸器および生
殖器疾病を惹起するウイルスまたは病原体に対してブタ
を保護する。好ましくは本発明のワクチンはPRRSV のア
イオワ株に関連する病原体に対してブタを保護する。し
かしながら、本発明のワクチンはPRRSV のアイオワ株に
関連する病原体に綿密に関連する変種に接触させること
による感染に対してもブタを保護すると期待される。
【００４７】比較的少数のウイルスしか生ウイルスワク
チンを生産する事ができない。生ウイルスワクチンの利
点は、全身、局部、体液または細胞介在免疫反応等のす
べての可能性のある免疫反応がワクチン受容体中で活性
化されることである。生ウイルスワクチンの欠点は、SV
40ウイルス、牛ウイルス性下痢ウイルス、牛胎児血清の
共通汚染源等の外来の生物主によって汚染される可能性
があることにある。この危険性は、生ワクチンウイルス
がその疾病分野での感染性に戻り、胎児、子供の動物お
よび他の種に対して弱毒化されないかもしれず、生ワク
チンの利点を凌駕してしまう。
【００４８】不活性化ウイルスワクチンはウイルスをホ
ルマリンまたは疎水性溶剤、酸等の不活性化剤、紫外線
またはＸ線等の照射、加熱等によって調製される。不活
性化は従来技術で理解されている方法で行われる。ウイ
ルスは感染しやすい細胞に感染することができなくなっ
たら不活性化したと考えられる。例えば、化学不活性化
では、ウイルスを含有している適切なウイルスサンプル
または血清サンプルが、十分な量と濃度の不活性化剤で
ウイルスを不活性化するに十分な高温（不活性化剤によ
っては低温）とpHで十分な時間で処理される。加熱によ
る不活性化は、ウイルスを不活性化するに十分な温度お
よび時間で行われる。照射による不活性化は、光の波長
または他のエネルギを使用して、ウイルスを不活性化す
るに十分な時間で行なわれる。ヒト使用の不活性化ワク
チンの例として、インフルエンザワクチン、灰白髄炎、
狂犬病、Ｂ型肝炎がある。ブタに使用される活性化ワク
チンの成功・有効例は、ブタのパブロウイルスのワクチ
ンである。
【００４９】サブユニットワクチンは半精製されたウイ
ルスサブユニットから、図３の論説において上述した方
法で調製される。例えば、インフルエンザより単離され
た血液凝集素、インフルエンザより単離されたノイラミ
ニダ−ゼ表面抗原が調製され、全ウイルスよりも毒性が
少ない事がわかっている。一方、サブユニットワクチン
はウイルスの高度に精製されたサブユニットからも調製
される。人間における例として、ヒトＢ型肝炎の22ｎｍ
表面抗原がある。ヒト単純ヘルペスウイルスサブユニッ
トおよび人間に使用される多くのサブユニットワクチン
が知られている。
【００５０】弱毒化ウイルスワクチンは自然にもみら
れ、自然発生の遺伝子欠損が起こっているのかもしれ
ず、また細胞培養または組織培養に何回も通すという様
々な公知方法で調製できる。ウイルスは遺伝子欠損また
は遺伝子変異によって弱毒化され得る。
【００５１】遺伝子工学的ワクチンは当該技術公知の方
法によって調製される。この様な技術には、組換えＤＮ
Ａを使用する方法、生ウイルスを使用する方法がある。
例えば、あるウイルスが、ブタにおける強度の免疫応答
または防御応答等に関係する蛋白をコ−ドしている事が
確認される可能性がある。同定されたこの様な遺伝子
は、バキュロウイルス等の蛋白発現ベクタにクロ−ニン
グすることができ、適当なホスト細胞への感染に使用で
きる（例えば O´Reilly et al.“BaculovirusExpress
ion Vector: A Lab Mannual”Freeman & Co (1992)).
ホスト細胞を培養し、目的のワクチン蛋白を発現し、こ
れを目的量精製し、そして呼吸器および生殖器疾病から
ブタを保護するために使用する。
【００５２】遺伝子工学的に調製された蛋白は、一般
に、昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞で発現させ
る。遺伝子工学的に作製された蛋白は、通常の方法で精
製され、および／または単離され、ブタの呼吸器および
生殖器疾病に対して保護を与えるために動物に直接接種
される。ブタの呼吸器および生殖器疾病病原体またはウ
イルス由来のエンベロ−プ蛋白が、弱毒化抗体を誘発す
るためにワクチンに使用される。細胞性免疫を誘発させ
るために、ブタの呼吸器および生殖器疾病病原体または
ウイルス由来の核蛋白がワクチンに使用される。
【００５３】好ましくは、本発明は、PRRSV のアイオワ
株由来のポリ核酸を含有するトランスファベクタで昆虫
細胞系（HI-FIVE)を形質転換する。好ましくは、本発明
の転移ベクタは、直線状にしたバキュロウイルスＤＮＡ
とPRRSV のアイオワ株由来のポリ核酸を含有するプラス
ミドを具備する。組換えバキュロウイルスを作るため、
ホスト細胞系に直線状にしたバキュロウイルスＤＮＡと
プラスミドを共に形質導入する。特に好ましくは、本発
明のポリ核酸は、PRRSV のアイオワ株の蛋白を一つ以上
コ−ドしている。
【００５４】別法として、一つ以上のエンベロ−ブ蛋白
および／または核蛋白をコ−ドしているブタの呼吸器お
よび生殖器疾病病原体またはウイルス由来のＲＮＡまた
はＤＮＡをポックスウイルスまたはアデノウイルス等の
生ベクタに挿入し、ワクチンとして使用する。
【００５５】このように本発明は、呼吸器および生殖器
疾病を惹起するウイルスゲノム部分から単離されるポリ
核酸に関し、好ましくはPRRSV のアイオワ株のゲノムか
ら単離されるポリ核酸に関する。“ポリ核酸”という言
葉は、病原体由来のＲＮＡまたはＤＮＡのみならず、Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡに対応しているかまたは相補的である
ＲＮＡおよびｃＤＮＡを意味する。本発明のポリ核酸は
本発明のワクチンを生産するための手段として、被感染
動物を選別し同定する手段として、および関係するウイ
ルスおよび病原体を同定するための手段として実用的で
ある。
【００５６】本発明の一つの実施態様において、ポリ核
酸は呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルス蛋白を
一つ以上コ−ドし、好ましくはウイルス膜（エンベロ−
プ）蛋白およびキャプシド蛋白（核蛋白）の一方または
両方をコ−ドする。特に好ましくは、本発明のポリ核酸
はそのゲノムの3'末端由来の 2ｋｂの断片から採取さ
れ、PRRSV のアイオワ株のゲノムの ORF-5、ORF-6 によ
ってコ−ドされるエンベロ−プ蛋白を一つ以上および／
またはORF-7 によってコ−ドされる核蛋白をコ−ドす
る。最も好ましくは、ポリ核酸はPRRSV のアイオワ株に
関連した病原体、例えば、下記例Ｉ- III （ISU-12) に
記載した病原体のゲノムから単離され、ORF5（配列番号
13）、 ORF6 （配列番号15）、ORF7（配列番号18）およ
びISU-12ゲノム（配列番号 8）の3'末端配列の1938ｂｐ
からなる群より選ばれる。
【００５７】本発明の状況において、ウイルスまたは病
原体由来のＲＮＡおよび／またはＤＮＡによってコ−ド
される蛋白またはペプチドは、もしそのポリ核酸免疫蛋
白またはペプチドがポリ核酸免疫蛋白またはペプチドコ
−ドしているポリ核酸と90％以上の相同性をもつなら
ば、“疫学的に同等”とみなされる。本出願における
“相同性”とは病原体の二つ以上のウイルスの間の、同
一な核酸またはアミノ酸のパ−セントをいう。従って、
本発明の別の態様は、呼吸器および生殖器疾病を惹起す
るウイルスのゲノムから得られるポリ核酸と少なくとも
90% 相同性である単離したポリ核酸を、好ましくは、PR
RSV のアイオワ株に関連した病原体のゲノムから得られ
るポリ核酸を含む。
【００５８】ウイルスのゲノム中のポリ核酸の比較的短
い部分（約20ｂｐ以上）がここに記載した方法および当
業者に公知の方法によって被感染動物および／または関
連ウイルスを選別同定するために使用される。従って、
本発明の態様は、更に、呼吸器および生殖器疾病を惹起
するウイルスのゲノム部分から得られる単離された断片
から基本的になる単離された（および望ましくは精製さ
れた）ポリ核酸を包含し、好ましくはPRRSV のアイオワ
株に関連した病原体のゲノム部分（すくなくとも20ヌク
レオチドの長さ、好ましくは20から 100ヌクレオチドの
長さを持つ）から得られるポリ核酸を包含する。特に好
ましくは、本発明の単離されたポリ核酸の断片はISU-12
ゲノム（配列番号 8）1938ｂｐの3'末端配列から得ら
れ、最も好ましくは、配列番号１、２、３、４、５、
６、および７からなる群より選ばれる。
【００５９】本発明の単離されたポリ核酸断片は、ウイ
ルスポリ核酸に対応（相補）しているｃＤＮＡをひとつ
以上の適当な制限酵素の消化分解して得られるかまたは
商業的に入手可能な自動ポリヌクレオチド合成機を使用
して合成できる。
【００６０】本発明のもう一つの実施態様では、ポリ核
酸が呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルス由来の
抗原性ペプチドを一つ以上コ−ドしており、好ましくは
PRRSV のアイオワ株に関連した病原体由来の抗原性ペプ
チドを一つ以上コ−ドしている。上述したように、本発
明のポリ核酸は呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイ
ルス由来の、好ましくはPRRSV のアイオワ株に関連した
病原体由来の蛋白の少なくとも5 アミノ酸、特に少なく
とも10アミノ酸の長さの抗原性部分をコ−ドしている。
蛋白の抗原性部分を決定する方法は当業者に公知であ
る。
【００６１】本発明は、PRRSV のアイオワ株の ORFの 1
種以上によってコ−ドされるタンパク質にも関する。好
ましくは、このタンパク質は、配列番号 8、13、15、18
および19からなる群より選ばれるポリ核酸配列によって
コ−ドされる。本発明の蛋白および抗原性ペプチドは、
PRRSV 特にPRRSV のアイオワ株に接触したブタを選別す
る血清学的テストに有用である。
【００６２】本発明は更に、次の症状および臨床的徴
候：し眠、呼吸困難、強制呼気、発熱、毛皮の荒れ、い
びき、咳、目の水腫、散発結膜炎によって特長づけられ
るブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起する生物学的に
純粋なウイルスまたは病原体に関する。本発明のウイル
スまたは病原体の生物学的に純粋なサンプルは更に、次
の組織学的欠損：肉眼視的および／または顕微鏡視的欠
損、II型肺胞細胞、心筋炎、脳炎、肺滲潤、合胞体形
成、を含んだ呼吸器および生殖器疾病を惹起することが
特徴的である。“生物学的に純粋”という言葉は、すべ
て単一親から派生した子孫であるウイルスまたは病原体
のサンプルについていう。通常“生物学的に純粋な”サ
ンプルは細胞培養中で３回プラ−ク精製を行うことでな
し遂げられる。特に、本発明の生物学的に純粋なウイル
スまたは病原体はブタの生殖および呼吸症候群のアイオ
ワ株である。アイオワ株のサンプルは、ブタペスト条約
（12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,
U. S.A.) の下，アメリカンタイプカルチャ−コレクシ
ョンに受付番号ＶＲ2385およびＶＲ2386として1992年10
月28日付で寄託されている。また、他の試料も、1993年
9月29日付でＡＴＣＣに寄託されている。
【００６３】PRRSV のアイオワ株も、またそのｍＲＮＡ
のノ−ザレンブロットによって同定される。例えば、PR
RSV のアイオワ株は、欠損を含む7 または9 ｍＲＮＡの
いずれかを含む。特に、下記例に記述するように、PRRS
V のアイオワ株のｍＲＮＡは最高４つの欠損を含む。
【００６４】本発明は更に、生理学的に許容可能なキャ
リア中で生殖器および呼吸器疾病を惹起するウイルスに
対する免疫応答を高めるに有効な本発明のワクチンの量
を具備するウイルスの感染からブタを保護する構成成分
に関する。
【００６５】本発明ワクチンの有効量はブタの生殖器お
よび呼吸器疾病および関連疾病を惹起するウイルスに接
触したブタを保護するワクチンに対して免疫学的応答を
十分に高めた量である。ブタは疾病の生理学的悪症状ま
たは悪影響のひとつないしは全部に著しい減少が見られ
る程度にまで保護されることが好ましい。
【００６６】成分は、一回または繰り返し投与される。
投与量にはたとえば、ウイルス系抗原（ワクチン）を1
- 1,000 マイクログラムが含まれるが、結果として逆効
果になる程、または感染の生理学症状が出るほどのウイ
ルス系抗原の量を含むべきでない。活性な抗生剤の適切
な量を決定する方法は当該技術にて公知である。
【００６７】本発明のワクチンを含む成分は、アジュバ
ントと結合して投与される。アジュバントは本発明のワ
クチンと結合されると免疫学的反応を増加させる物質で
ある。アジュバントは、ワクチンと同時に同部分に投与
されるか、あるいは異なる時期にたとえば追加抗原量と
して投与される。アジュバントはまたワクチンが投与さ
れる方法、部位または位置とは異なる方法、部位または
位置で動物に効果的に投与される。アジュバントには、
水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、大腸
菌またはコレラ毒、そのＢサブユニットから単離された
熱生存または熱に安定なエンテロトキシン、ジフテリア
毒、破傷風毒、百日咳毒、フロイト不完全アジュバン
ト、フロイト完全アジュバント等がある。ジフテリア
毒、破傷風毒、百日咳毒等の毒系アジュバントは、例え
ばホルムアルデヒド処理で使用前に不活性化される。
【００６８】本発明はまた、ブタの呼吸器および生殖器
疾病を惹起するウイルスに対する感染からこのようなウ
イルスによる感染に対して保護を必要とするブタにこの
ようなウイルスに対して免疫学的応答を高めるワクチン
を有効量投与することを具備するブタを保護する方法に
関する。ブタの呼吸器および生殖器疾病をウイルスおよ
び病原体に対して“感染よりブタを保護”することは、
本発明のワクチンをブタに投与後、対照（感染ブタ）に
比較して、ブタの対応する疾病に付随する臨床的疾病の
症状（発熱等）が減少（重篤度が減少する）するかなく
なることことを意味する。臨床的症状は定量化され（例
えば、発熱、抗体計数、および／または灰の病巣）ある
いは半定量化される（呼吸困難の重篤性等）。
【００６９】本発明においては、感染ブタにおける呼吸
困難を測定するシステムが開発された。本発明の臨床的
呼吸評価システムは下記のような基準で感染ブタの呼吸
困難を評価する。
【００７０】０＝無疾病、正常呼吸 １＝ブタにストレスを与えた時（大量に呼吸を強いた時
および／または呼吸回数を高めた時）、軽い呼吸異常、
および多呼吸を示す ２＝ブタが休息状態の時、軽い呼吸異常、および多呼吸
を示す。
【００７１】３＝ブタがストレス状態の時、中程度の呼
吸異常、および多呼吸を示す。
【００７２】４＝ブタが休息状態の時、中程度の呼吸異
常、および多呼吸を示す。
【００７３】５＝ブタがストレス状態の時、重篤な呼吸
異常、および多呼吸を示す。
【００７４】６＝ブタが休息状態の時、重篤な呼吸異
常、および多呼吸を示す。
【００７５】本発明の臨床的呼吸得点システムにおい
て、評点“０”は正常で、ブタの呼吸器および生殖器疾
病に感染していないことを示す。評点“３”は中程度の
呼吸器疾病を示し、評点“６”は、重篤な呼吸器疾病を
示す。もしワクチンまたは成分を与えられた免疫感作ブ
タ群がワクチンまたは成分を与えられていない免疫感作
ブタ群より低い平均臨床的呼吸評点を示したとすれば、
本発明のワクチンまたは成分が有効であったと見なされ
る。（ブタは非ワクチン接種ブタにおいて疾病を惹起す
るに十分な濃度の病原体に接触させた時、ブタは免疫感
作されたと見なす）。
【００７６】本発明のワクチン成分は、呼吸器および生
殖器疾病を惹起するウイルスにまだ接触させないブタに
直接投与されることが好ましい。本発明のワクチンは経
口的にまたは非経口的に投与される。非経口的投与経路
には、皮膚内、筋肉内、静脈下、腹膜内、皮下、鼻腔内
投与経路がある。
【００７７】溶液として投与する場合、本発明のワクチ
ンは、シロップ、エリキシル、チンキ剤等の水溶液の形
で調製され得る。これらの組成は当該技術にて公知であ
り、抗原および他の添加剤を適切な溶媒系に溶解させて
調製する。このような溶媒には、水、生理食塩水、エタ
ノ−ル、エチレングリコ−ル、グリセロ−ル、Ａ１液体
等がある。当該技術公知の適切な添加剤には、認可染
料、香料、甘味剤、チメロサル［thimerosal］（ソデイ
ウム マ−キュリ−チオサリチレ−ト［Sodium ethylme
rcurithiodslicylate ］）等の抗菌保存剤がある。これ
らの溶液は、例えば、部分的に過水分解されたゼラチ
ン、ソルビト−ル、または細胞培養培地の添加により安
定化され、当該技術にて公知の方法で、リン酸水素ナト
リウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウ
ム、および／またはリン酸二水素カリウム等の当該技術
にて公知の試薬を用いて、緩衝化する。
【００７８】液体の組成には、懸濁液およびエマルジョ
ンがある。例えば、コロイドミルを使用する懸濁液の調
製、および例えばホモジナイザを使用してのエマルジョ
ンの調製は当該技術にて公知である。
【００７９】体液系に注入するよう考案された非経口投
与形態は、ブタの体液と対応する濃度の適切な等張性、
ｐＨ緩衝性が必要とされる。非経口投与組成は使用前に
殺菌しなければならない。
【００８０】等張性は塩化ナトリウムおよび必要に応じ
て他の塩で調節される。エタノ−ルまたはプロピレング
リコ−ル等の他の溶剤は構成物成分の溶解性を増し、溶
液の安定性増すために使用される。本発明の組成中に使
用され得る他の添加物には、デキストロ−ス、汎用の抗
酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレ
−ト剤がある。
【００８１】本発明は、 （Ａ）ブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイル
スまたは病原体を採集し、 （Ｂ）（i)ウイルスまたは病原体をプラ−ク精製し、
（ii) ウイルスまたは病原体を不活性化するに十分な温
度および時間でウイルスまたは病原体を加熱し、(iii)
ウイルスまたは病原体を不活性化させるに十分な量の不
活性化化学剤にウイルスまたは病原体を接触させるかま
たは混合し、(iv)ウイルスまたは病原体を対応するサブ
ユニットに分解し、少なくとも一つのサブユニットを単
離し、(V)ウイルスまたは病原体の表面蛋白をコ−ドし
ているポリ核酸を合成または単離し、適切なホスト細胞
にそのポリ核酸を感染させ、そのホスト細胞を培養し、
培養物から表面蛋白を単離することからなる群より選ば
れる方法で、ウイルスまたは病原体を処理するというス
テップを具備する本発明のワクチンを生産する方法に関
する。
【００８２】好ましくは、(i) 感染させたホスト細胞を
沈殿させ、(ii)沈殿細胞を溶菌し、(iii) 次の処理工程
の前に、ウイルスまたは病原体を遠心分離するという工
程で、ウイルスまたは病原体は培養培地より採集され
る。特に好ましくは、ウイルスまたは病原体を感染させ
たホスト細胞を採集の前に、適切な培地で培養する。
【００８３】好ましくは、感染ホスト細胞を培養した
後、感染ホスト細胞を汎用のポリエチレングリコ−ル
（ＰＥＧ）溶液を、感染細胞を沈殿させるに十分な量培
地に添加して沈殿させる。沈殿した感染細胞は遠心分離
により更に精製する。沈殿細胞は次に当該技術公知の方
法で溶菌する。好ましくは、細胞は凍結解凍の繰り返し
（３回の凍結解凍が特に好ましい）で溶かされる。沈殿
細胞の溶解によってウイルスが放出され、ウイルスは好
ましくは遠心分離によって採集される。ウイルスは単離
され、セシウムクロライド濃度勾配遠心分離によって精
製され、セシウムクロライド濃度勾配から適切なウイル
ス含有バンドを回収する。
【００８４】別法として、感染細胞培養物を、細胞を溶
菌させるため凍結解凍する。凍結解凍細胞培養物質は、
生ワクチンとして直接使用する。しかし、凍結解凍細胞
培養物質は（貯蔵用に）凍結乾燥し、ワクチンとしての
使用には再水和することが好ましい。
【００８５】培養培地は緩衝生理食塩水、必須栄養素
類、当該技術にて公知の適切な炭素および窒素源をウイ
ルス感染細胞が生育するに十分な濃度で含む。
【００８６】適切な培養培地はダルベッコ最小必須培地
（DMEM) 、イ−グル最小必須培地(MEM) 、ハム培地、メ
デアム199 、ウシ［bovine］胎児血清、ウシ［calf］胎
児血清、ウイルス感染細胞の生育を助成する他の同様な
培地がある。培養培地には、牛［bovine］胎児血清（10
% 以下）、および／またはＬ−グルタミン（2 mM以
下）、または汎用の生育補助剤、および／または抗生物
質等の適切な添加剤が供給される。好ましい培地はDMEM
である。
【００８７】本発明のワクチンは、適切な細胞系で培養
されたウイルスまたは病原体から調製されることが好ま
しい。その細胞系には、PSP-36, およびウイルスが感染
でき、培養することができるPSP-36均等細胞系が好まし
い。PSP-36均等細胞系の例として、PSP-36-SAHがあり、
これはブタペスト条約（12301 Parklawn Drive, Rockvi
lle, Maryland 20852, U. S.A.) の下，アメリカンタイ
プカルチャ−コレクションに受託番号CR11171 で寄託さ
れている。その他の均等細胞系はMA-104で、Whittaker
Bioproducts,Inc.(Walkersville, Maryland)から商業的
入手可能である。PRRSV のアイオワ株に関連している病
原体はブタの螺旋系細胞［turbiinate cells］で培養で
きることが予備結果で示された。プラ−ク精製後、PRRS
V のアイオワ株に関連している病原体は、表Ｉの見出し
“アイオワ”で特徴づけされ、図5 - 8 にも示されてい
る病巣を生成する。
【００８８】従って、本発明はまたウイルスまたは病原
体を、好ましくはウイルスが感染でき、培養することが
できるPSP-36およびその均等細胞系からなる群から選ば
れる細胞系中で培養する方法に関する。本発明によるウ
イルスまたは病原体を培養する方法は、感染細胞系PSP-
36またはブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイ
ルスおよび病原体で感染させる事ができるPSP-36および
その均等細胞系を具備し、その感染細胞系を適切な培地
で培養することを具備する。
【００８９】好ましくは、ウイルスまたは病原体はPRRS
V のアイオワ株であり、PRRS、PNP、および関連疾病か
らなる群から選ばれた疾病を惹起する。本発明のワクチ
ンは、特に好ましくはPRRSV のアイオワ株から調製さ
れ、PSP-36細胞で培養される。細胞系MA-104はサルの腎
臓細胞から得られ、上皮細胞状である。MA-104は、ダル
ベッコ最小必須培地および10％ FBS（牛胎児血清）を含
む培養フラスコ中に、集密単層を形成する。単層が形成
されると、細胞は、感染ブタ中における適宜な組織（肺
および／または心臓）から採取され、10％のホモジナイ
ズされた組織サンプルと共に接種される。ウイルスおよ
びホスト細胞の成長を許容し、ホスト細胞（バクテリア
または酵母）以外の細胞の成育および／または生存性を
抑制するために適宜な抗生物質が使用されることが好ま
しい。
【００９０】PSP-36細胞もMA-104細胞も両方ともPRRSウ
イルスのある単離物を（107 TCID50／ｍｌ超) 高タイタ
−で育成する。PSP-36細胞およびMA-104細胞はまたPRRS
V のアイオワ株に関連した病原体を育成する。MA-104細
胞は、またロタウイルス、ポリオウイルス、および他の
ウイルスを育成する。
【００９１】CL2621細胞はブタ起源ではないと信じられ
ており、上皮細胞状であり、および特許独占である(Boe
hringer-mannheim) 。PSP-36細胞およびMA-104細胞とは
対称的に、PRRSを惹起するウイルスのサンプルのCL2621
細胞での培養は成功しなかった（Bautista et al. Amer
ican Association of Swine Practitioners Newslette
r, 4:32, 1992) 。
【００９２】CL2621細胞は、ブタ起源ではなく、上皮細
胞状でありMEM 培地で成育されることが主な特徴であ
る。しかしBenfield et al. ( J. Vet. Diagn. Inves
t., 1992; 4:127-133)はCL2621細胞はPRRSウイルスを増
殖させるために使用されるが、MA-104細胞はポリオウイ
ルスの増殖を制御するために使用されると報告して、CL
2621細胞はMA-104細胞と同様ではなく、同一細胞で両ウ
イルスは増殖されない事を示唆している。
【００９３】PRRSV のアイオワ株に関連した病原体はPS
P-36, PSP-36-SAHおよびMA-104以外の細胞系では通常生
育できない。しかしながら、PSP-36およびMA-104または
CL2621細胞でPRRSウイルスのある菌株は生育しないけれ
ども、上述したようにPRRSを惹起するあるウイルスがCL
2621細胞および原始ブタ肺胞マクロファ−ジ中の両方で
生育すると報告されている。
【００９４】本発明のワクチンは、ウイルスおよび病原
体に接触する患者（この場合はブタ）に免疫的抵抗性を
付与できる抗体を調製するために使用され得る。本発明
に包含される抗体は、(1) 呼吸器および生殖器疾病を惹
起するウイルスおよび病原体に対してブタを保護するワ
クチンか、あるは (2)ブタの呼吸器および生殖器疾病ウ
イルスおよび病原体自身のいずれかに免疫学的に結合す
る。本発明の抗体はまた、ブタが呼吸器および生殖器病
ウイルスまたは病原体に接触したことがあるか否かを決
定する診断剤として、および本発明のワクチンの調製に
利用できる。抗体は免疫親和性カラムを調製するために
使用でき、免疫親和性カラムはウイルスまたは病原体、
または蛋白自身を単離するため使用される。
【００９５】この様なワクチンまたはウイルスに対する
抗体を育てるために、マウス、ウサギまたは他の動物等
の接種用の適切なホスト動物を、ワクチンを調製するた
めに使用される蛋白で免疫化しなければならない。そこ
でホスト動物は上述したタイプのワクチンのうち一つで
免疫化（注入され）され、任意に、上述されたような免
疫賦活剤（アジュバント）が投与される。ホスト動物は
好ましくは１−４週間、最も好ましくは２週間毎のある
一定期間をおいて１から５回続けて免疫化される。そし
てホスト動物は屠殺され、その血液が採取される。血清
が全血液から公知の技術で分離される。その血清はワク
チンに対する抗体を含んでいる。抗体はまたイムノグロ
ブリン( IgG ）抗体を付与するため公知の方法で精製さ
れる。
【００９６】本発明はまた本発明のワクチンおよび／ま
たはウイルスに対するモノクロ−ナル抗体を包含する。
モノクロ−ナル抗体はKohler et al(Nature, vol. 256
(1975)、pages 495 - 497)の方法で生成される。基本的
には、免疫化されたホスト動物（上述した）の脾蔵の全
細胞調製物から得られた免疫細胞と、ハイブリド−マを
生成するための汎用手法により骨髄細胞と融合される。
ハイブリド−マは培養され、結果として得られる培養液
で、病原体（ウイルスまたはワクチン）を保持している
液体または接種細胞に対しての選別がおこなわれる。ホ
スト動物の腹膜にハイブリド−マを導入し、ハイブリド
−マを腹膜内で成長させる。ホスト動物の腹水を採集す
ると、ハイブリド−マによって生成される病原体に対す
るモノクロ−ナル抗体のサンプルが提供される。又、ハ
イブリド−マ細胞培養からの上澄液は、当業者に公知の
方法によって単離され、モノクロ−ナル抗体の源として
使用される。本発明の抗体はイムノグロブリンのIgG ま
たはIgM 型であることが好ましい。
【００９７】本発明は、ブタの呼吸器および生殖器疾病
を惹起するウイルス、またはブタの呼吸器および生殖器
疾病を惹起するウイルスによる感染に対してブタを保護
するワクチンと免疫学的に結合する抗体を、必要に応じ
て生理学的に許容できるキャリアで有効量、ブタに投与
する事を具備している呼吸器および生殖器疾病に罹患し
ているブタを治療する方法に関する。
【００９８】本発明の方法は、ブタの呼吸器および生殖
器疾病を惹起するウイルスの分析用診断キットに関する
かまたはブタの呼吸器疾病および生殖器疾病に関し、上
述した本発明の抗体および該抗体と陽性の免疫学的反応
を示す診断用剤を具備している。
【００９９】本発明の診断キットは公知の免疫蛍光アッ
セイ( IFA ）、免疫パ−オキシダ−ゼアッセイ(IPA) 、
および酵素連結免疫吸着アッセイの手法を改変したもの
を基本としていることが好ましい。
【０１００】IFA では、感染細胞はアセトンおよびメタ
ノ−ル溶液で固定され、感染したブタの回復期血清に対
する抗体は感染細胞と共に、好ましくは摂氏37度で30分
培養される。陽性の免疫学的反応は抗体がウイルス感染
細胞と結合する反応で、次の洗浄工程( 通常PBS 緩衝液
で３回）においても洗い流されない。次に、蛍光試薬(
FITC) で標識した第二の抗体を添加し好ましくはもう30
分培養する。陽性の免疫学的反応の結果、第二抗体が最
初の洗浄後も保持されている抗体に結合し、その結果、
蛍光の信号となり、信号が検出され、半定量できる。陰
性の免疫学的反応は、感染細胞に抗体が少ししか結合し
ないか全く結合しないかの結果になる。従って、第二
の、蛍光標識の抗体が結合しなければ、蛍光標識は洗い
流され、適切な陽性対照に比べて蛍光は少ししか検出さ
れないか全く検出されない。
【０１０１】IPA およびELISA キットは、第二抗体が蛍
光試薬の代わりに特異的酵素で標識されている以外はIF
A キットと同様である。この様に、第二抗体に結合して
いる酵素の基質が添加されるとその結果色付生成物が生
成され、そしてこれが検出され、例えば色素計で定量さ
れる。
【０１０２】本発明の他の特徴は、以下の例示実施態様
の説明の過程において明らかになるであろう。この例示
実施態様は、本発明を説明するために提供されるもので
あって、それらに限定することを意図するものではな
い。 例 １ 例１では、５〜８週齢のブタにおける特定の地方に限定
された肺炎のケースを考察した。ブタで観察されたPRRS
V のアイオワ株に関する顕微鏡視的な病変は、ウィルス
の感染が原因であることを裏づける。（それ故、以後は
議論を簡単にするために、ここでは“ウィルス”及び
“ウィルス性”と言う用語は、上述の意味に於けるウィ
ルスもしくは感染性の病原体またはそれ自体の特性につ
いて使うこととする。）0.22μｍのフィルターでろ過し
た、感染ブタ由来の肺のホモジネートを用いて、この病
気を通常のノトバイオートブタに実験的に伝染させた。
ブタのウィルス性の呼吸器系の一般的な病原体は示され
なかった。２つのタイプのウィルスの粒子が電子顕微鏡
によって細胞培養液で観察された。１つのタイプは、直
径70ｎｍで外膜に覆われ、短い表面スピクルを有してい
た。もう１つのタイプは外膜に覆われ、細長く、多態性
で、大きさは80×320 ｎｍであり、抗体によりコートさ
れていた。 （Ｉ）材料と方法 （Ａ）自然発生肺炎に感染したブタ由来の材料 南西アイオワで子をはらんでない肥育用家畜メスブタ90
0 頭の一集団から 6週齢の感染した 3頭のブタ由来の組
織を収集し、研究に用いた。この集団に関する事前の観
察によると離乳後 5〜 7日で、同様に感染したブタの50
〜70％が食欲不振となり、ラフ- ヘアード［rough-hair
ed］となり、無気力、咳、発熱及び“サンピング”を示
した。感染したブタの10〜25％は結膜炎を患っていた。
感染したブタのほとんどは、7 〜10日間で回復したが、
10〜15％のブタは２次的な細菌の感染により重い発育阻
害が生じ、食用ブタとして販売できなかった。死産、ミ
イラ化した胎児、不妊症を含むブタの生殖減退は、この
集団での病気の最初の発生と同時に起こった。しかし、
それは後に時間がたつと共に減退した。この授乳期［nu
rsery stage ］での呼吸器系の病気は継続していた。
【０１０３】肺の病変は、 4頭の異なる 6週齢のブタの
ホルマリン固定化組織において増殖性細気管支炎や肺胞
炎が認められたことにより特徴づけられた。SIV 、シュ
ードラビーズウィルス（PRV ）や脳心筋炎ウィルス（EM
CV）を単離する試みは成功しなかった。ブタのインフル
エンザウィルス、シュードラビーズウィルス（PRV ）や
Mycoplasma hyopneumoniaeについての肺の凍結切片を用
いた免疫蛍光検査は、陰性だった。Pasteurella multoc
ida タイプＤが鼻腔から単離され、Haemophilus parasu
is が肺から単離された。
【０１０４】10日間乳を飲ませなかった 5〜 6週齢の急
性発病した 5頭のブタが引き続いてこの集団から得られ
た。全てのブタの体温は少なくとも40.5℃だった。この
ブタを解剖した。そして、ウィルス性肺炎に最も典型的
な肉眼視的病変をもつブタから肺組織サンプルを集めて
調製し、通常の特殊な無菌ブタ（SPF ）に直ちに接種し
た。 5〜 6週齢の急性発病した 5頭のブタ全てからの、
肺、肝臓、腎臓、脾臓、脳および心臓の組織サンプル
を、通常の細菌性及びウィルス性病原体について培養し
た。同じ組織の切片を組織病理学的考察のために集め、
10％の中性ホルマリン緩衝液で固定した。
【０１０５】（Ｂ）通常のブタにおける実験的な伝染 (1)実験用ブタ 16頭の 5週齢のブタが、マイコプラズマ、PRV 、ブタ呼
吸器系コロナウィルス（PRCV）、伝染性の胃腸炎ウィル
ス（TGEV）に感染していない一集団から得られた。コン
クリートフロアーの自動換気された２つの独立した 4×
5ｍの部屋の各々にブタを 8頭ずつ入れた。このブタは
蛋白（含量）が18％のトウモロコシ- 大豆の食料と任意
に水を与えられた。
【０１０６】(2)実験のデザイン 自然発生肺炎によるブタを剖検した後直ちに、ダルベッ
コ改良イーグル最少必須培地中に10％の肺ホモジネート
を調製して1000×ｇで10分間清澄化し、続いて10,000×
ｇで10分間遠心分離を行なった。清澄化した上澄みを、
0.22μｍのフィルターでろ過した。 8頭のブタに、ろ過
した肺ホモジネート 5ｍｌを鼻腔内に接種した。 8頭の
コントロールには、通常の感染していないノトバイオー
トブタから上記の通り調製し、ろ過した肺ホモジネート
5ｍｌを鼻腔内に接種した。
【０１０７】臨床的な兆候と体温がモニターされ、毎日
記録された。各々のグループから１頭のブタを接種後
（DPI ） 5、 7、10および15日目に安楽死させ、剖検し
た。好気的かつ嫌気的細菌単離法、マイコプラズマ単
離、Mycoplasma hypopneumoniaeSIV 、PRV 、パライン
フルエンザウィルス（BRSV）のための抗原検出、さらに
ウィルス単離のために、剖検の際に組織を収集した。組
織は組織病理学的な検査のために、10％中性ホルマリン
緩衝液で固定した。肺は剖検の際に、ホルマリンを用い
て膨張させることにより固定した。
【０１０８】（Ｃ）ノトバイオートブタでの実験的な伝
染 (1)実験用ブタ 初乳を与えられていない帝王切開由来で（CDCD）、雑種
の、生後一日のノトバイオートブタ 8頭をランダムに２
つのグループに分けた。( 各々のグループは 4頭) 。ブ
タは鉄が添加されかつ滅菌された缶詰の牛乳代替物を与
えられた。(SPF-LAC,Pet-Ag Inc . Elgin, Illinois.) (2)実験のデザイン 生後３日齢の４頭の本試験用［principle ］ブタに、肺
ホモジネートろ過物（0.22μｍ）を鼻腔内に（ 3ｍｌ）
および経口的に（ 1ｍｌ）接種した。このろ過物は、感
染後(post -infection) ７日目に集められた実験的に感
染させた通常のブタの肺から調製された。もう１つの４
頭のコントロールのブタニは、通常のノトバイオ−トブ
タから調製された肺ホノジネートを接種した。
【０１０９】各々のグループから１頭が接種後5 、9 、
28そして35日目で殺された。肺、肝臓、腎臓、脳、脾
臓、胸線、鼻甲介［nasal turbinates］、心臓そして腸
を組織病理学的な検査のために10％中性緩衝ホルマリン
で固定した。肺、脳、脾臓、心臓は、ウィルスの単離の
ために収集された。肺、肝臓、脾臓は、細菌学的な単離
のために収集された。肺は、マイコプラズマ単離のため
にフリース［Friis ］培地に即座に収集されるか、-70
℃で凍結された。
【０１１０】（Ｄ）微生物学的な分析 (1)ウィルス単離 1000×ｇで清澄化した組織懸濁液（10％ W/V）を細胞単
層に接種し、細胞病理学的な影響を観察した。ブタ胎児
の一次腎臓（細胞）培養物、ブタの肺胞の一次マクロフ
ァージ培養物、PK15の継代細胞株、ウシ甲介［turbinat
e ］、授乳期のハムスターの腎臓（BHK ）、ベロ［Ver
o］、ブタ精巣（ST）がウィルス単離を試みるために用
いられた。気管支- 肺胞直接洗浄物培養物を、感染並び
に対照ノトバイオートブタから調製した。ウィルスを検
出する試みは間接的な免疫蛍光法によりなされた。それ
は、ブタのパーボウィルス（PPV ）、SIV 、ウシウィル
ス性下痢ウィルス、血球凝集性脳心筋炎ウィルス（HEV
）、TGEV、EMCVに対するノトバイオートの高度免疫ブ
タ血清もしくは回復期ブタ血清をレファレンスに用い
た。10日目の胚を含有する鶏卵の尿膜内へ濾液を接種す
ることにより盲目的な継代を 3回行ない、各継代の後に
血球凝集活性について尿膜液を試験した。
【０１１１】(2)マイコプラズマの単離 肺懸濁液を、マイコプラズマブロス培地フリース（Ferr
is(1975), Acta Vet,Scand., 27,337）、BHI-TS, D-TS
（Ross et al (1971), Journal of Bacterioplogy, 10
3,707）および BHL（Yamamoto et al (1982), Proc.In
t. Pig Vet. Society Congress, P.94）に接種した。培
養物を、明らかに生育した時、または 3、7、14、21日
目に継代し、落射免疫蛍光法［epiimunofluorescence］
により同定した（Del Giudice et al (1967), Journal
of Bacteriology, 93,1205）。
【０１１２】(3)細菌の単離 鼻甲介から綿棒で集めた標本を、マッコンキー［MacCon
key ］、テルギトール-7［tergitol-7］、PMD （P. mul
tocida単離用）寒天培地の他に、２つの血液寒天平板培
地に接種した。１つの血液寒天平板培地は、ＣＯ2 とＨ
2 ガスによる嫌気的な環境下で、37℃で培養した。もう
１つのプレートはStaphylococcus epidermidisの培養コ
ロニーを用いて交差画線培養を行い、他のプレートとと
もに37℃で好気培養を行った。
【０１１３】肺を、鼻甲介から綿棒で集めた標本のよう
に正確に塗布した。肝臓と脾臓は２つの血液寒天培地
（嫌気的なものと好気的なもの）とテルギトール-7培地
で培養した。全ての細菌の単離体は、標準的な方法によ
って同定した（Biberstein (1990), In: Diagnostic Pr
ocedures in Veterinary Bacteriology and Mycology,e
d. Carter et al, 5th ed., pp.129-142, Academic Pre
ss Inc., San Diego Cal.; and Carter(1990) In: Diag
nostic procedures inVeterinary Bacteriologyand Myc
ology, ed. Carter G.R. and Cole J.R., 5th ed., pp.
129-142, Academic Press Inc., San Diego, Cal. ） (4)血清学 PRV 、TGEVまたはEMCVに対する血清抗体のテストには、
血清中和テストを用いた。EMCVまたはHEV に対する血清
抗体テストには、血球凝集阻害テストを用いた。BRSV、
PI-3、SIV またはTGEVに対する血清抗体検出には、間接
免疫蛍光テストを用いた。ノトバイオート血清を、PRRS
V に対する抗体についてテストした。PRRSV 抗体の検出
のために、CL2621細胞系を用いた間接免疫蛍光分析を用
いた。 （II）結果 （Ａ）自然発生肺炎 急性罹患ブタ由来の肺は、虚脱していなかった。肉眼視
的には、この肺は、中度の小葉間の浮腫、およびあらゆ
る肺葉を通じて多病巣性ないし線状に癒着した領域をも
つ拡張不全肺となっていた。上部と中部の肺葉に 5 - 1
5 ％の頭腹部［cranioventral ］硬化がみられた。組織
病理学的試験により、中度の、急性び慢性増殖性細気管
支炎および肺炎が認められた。軽度の多病巣性リンパ形
質［lymphoplasmacytic ］心筋炎がみられた。他の器官
での病変はみられなかった。
【０１１４】アデノウィルス、PRV 、SIV 、HEV 、ブタ
呼吸器系コロナウィルス（PRCV）、ブタパーボウィルス
（PPV ）、EMCV、およびエンテロウィルスに対するウィ
ルス単離の試みは、この集団から後に得られた急性罹患
ブタからのものと同様に元々の場合の感染でも認められ
なかった。
【０１１５】凍結肺切片の免疫蛍光法検査では、Mycopl
asma hyponeumoniae、SIV 、ウシ呼吸器系多核性［sync
ytial ］ウィルス, パラインフルエンザウィルス-3（PI
-3）、PRV やTGEV抗体を明らかにできなかった。
【０１１６】上記(I)(A)項の 5頭の通常の SPFブタ由来
の１つの血清からは、間接的な免疫蛍光法により、PRRS
V の1:20の希釈で陽性のイムノグロブリン反応を得た。
このブタの鼻甲介や肺からはそれぞれ Pasteurella mul
tocida Ｄ型と Haemophlilus parasuisが単離された。
ホモジネートおよび接種のために選ばれた急性罹患ブタ
の肺からは、好気的または嫌気的な細菌は単離されなか
った（上記(C)(2)項の材料と方法参照）。
【０１１７】（Ｂ）通常のブタの研究 7 DPIで、本試験用のブタは全て体温が40〜41.1℃であ
り、中度の呼吸器系障害を呈した。このブタは、食欲不
振で無気力であった。15 DPIで、これらのブタは回復し
た。
【０１１８】肺内での顕微鏡視的な変化は、虚脱がない
ことや軽度な肺葉内の浮腫そして肺の 20 - 40％を散在
的に占める無気肺の黄褐色の線状領域によって特徴づけ
られる。
【０１１９】7 DPIの肺の顕微鏡検査により、II型肺細
胞［pneumocyte］増殖、肺胞内腔における混合炎症細胞
および壊死細胞残渣の蓄積、および肺胞隔膜におけるマ
クロファージおよびリンパ球の浸潤によって特徴付けら
れるパッチ状間質性肺炎が明かとなった。肺胞の内腔は
蛋白性の液を含んでいる。時折、肺胞内の内腔や隔膜壁
にシンシチウム様の細胞が見られた。
【０１２０】図５は、ヘマトキシリンーエオシン染料で
染色された、10 DPIの通常のブタの肺由来の組織学的な
切片を示している。拡張しているII型肺細胞増殖（矢
印）や肺胞間隔内に壊死細胞残骸（矢印先）がある。10
日目に観察された病変の状態と様子は、 7日目のものと
同様であった。
【０１２１】図６は、ヘマトキシリンーエオシン染料を
用いて染色した、10 DPIの通常のブタの肺からの別の組
織学的な切片を示している。シンシチウム様の細胞（矢
印）が肺胞の間隔に存在する。 7日目よりも10日目の方
が、明白なII型肺炎の増殖とより多くのシンシチウアが
観察された。
【０１２２】15 DPIでは、病変は依然としてやや激しい
ものであったが、ブタは臨床上は正常のようにみえた。
細菌、マイコプラズマも肺から単離されなかった。EMC
V、PRV 、PRCV、アデノウィルスまたはSIV のウィルス
を単離する試みは、ネガティブであった。凍結肺切片の
免疫蛍光検査では、BRSV、PI-3ウィルス、PRV 、SIV 、
TGEVまたは Mycoplasma hyopneumoniae 抗原は示されな
かった。
【０１２３】コントロールのブタにおいては、肉眼視的
もしくは顕微鏡視的な病変は見られなかった。
【０１２４】（Ｃ）ノトバイオートブタの研究 本試験用の全ての接種されたブタは、5 DPI までに重い
呼吸器系障害や“サンピング”を経験した。体温は40.5
℃またはそれ以上で、食欲不振、無気力を呈した。この
ブタは 8 DPIまでに臨床上回復し、15 DPIまでには臨床
上正常にみえるようになった。どのブタも死ななかっ
た。正常な肺ホモジネートろ過物を接種されたコントロ
ールブタは、臨床上正常なままだった。
【０１２５】5 DPI までの顕微鏡視的な病変は、虚脱し
ていない肺、軽度の多病巣性の赤褐色の［tan-red ］拡
張不全肺および軽い小葉間浮腫により特徴づけられた。
顕微鏡視的には、肺の複数領域での肺胞隔膜の単核細胞
浸潤および中度のII型肺細胞増殖を伴う軽い広汎性の間
質性肺炎があった。肺胞内腔内に炎症細胞、壊そした細
胞残骸と蛋白性の液の蓄積があった。他の器官には病変
は見られなかった。
【０１２６】9 DPI までに、肺は虚脱せず、中度の小葉
間浮腫、および多病巣性の硬い赤褐色の拡張不全肺の 1
- 3ｃｍの領域があった。図７は、ヘマトキシリン- エ
オシン染料を用いて染色した、9 DPI までのノトバイオ
ートブタの肺由来の組織学的な切片を示す。中度のII型
肺細胞増殖（矢印頭）、そしてシンシチア様の細胞の形
成（矢印）があった。顕微鏡的には、II型肺細胞増殖が
更に広がっていることを除くと、病変は 5 DPIで観察さ
れたものと同様であり、内腔内で肺胞隔膜に沿ってシン
シチア様の細胞が少数あった。腎臓には膨張した腎細管
があり、そのいくつかにはリンパ形質の滲出と細胞残骸
が見られた。
【０１２７】28 DPIまでに、先端及び中肺葉で20％の頭
腹部両側の拡張不全肺があった。同時に他の肺葉内では
1 - 2ｃｍの病巣領域を有する拡張不全肺が認められ
た。顕微鏡学的には、肺の病変は、9 DPI までに観察さ
れたものと同様であったが、それに加えて細気管支周辺
［peribronchiolar ］や動脈周辺［periarteriolar］に
軽度のリンパ形質蓄積があった。軽度ないし中度のリン
パ球および形質細胞の浸潤が、多病巣的に、脈絡膜の網
状構造、髄膜、心筋炎, 鼻甲介において見られた。
【０１２８】図８は、35 DPIで、肺の病変は弱まった
が、多病巣性リンパ形質性の心筋炎が明かとなったこと
を示している。PRV 、SIV 、アデノウィルス、EMCV、HE
V 、PPV 、エンテロウィルス、PRCVのウィルス単離の試
みは成功しなかった。細胞変性効果は、ブタの肺胞のマ
クロファージ内で観察され、細胞の丸まり［roundin
g］、細胞溶菌、細胞死により特徴付けられた。気管支-
肺胞洗浄物の直接培養物が広がったシンシチアを発現
することを図９に示す。ここではコントロールブタから
調製された同様の培養物での観察は示されていない。こ
れらの培養物のネガティブ染色免疫電子顕微鏡法による
試験から、２つのタイプのウィルス様粒子が明かとなっ
た。１つのタイプは図10で示すように、直径約70ｎｍで
外膜に覆われ、短い表面のスピクルを持っていた。もう
一方のタイプは、図11で示されるように外膜で覆われ、
多態性で、大きさ約80×320 ｎｍで、抗体によりコート
されていた。細菌は、肺、肝臓、脾臓、脳からは単離さ
れなかった。
【０１２９】28 DPIおよび35 DPIで集められた血清で
は、SIV 、EMCV、TGEV、BRSV、HEV,またはPI-3ウイルス
への抗体価は得られなかった。これらの血清は、PRRSウ
イルスの抗体に対し陽性（1:1280）であった。
【０１３０】コントロールのブタは、研究を通じて正常
であり、著しい顕微鏡的な病変はどの組織にも見られな
かった。コントロールのブタからは、細菌もしくはウィ
ルスは単離されなかった。 （III ）論考 実験的に接種された通常およびノトバイオ−トブタにお
いて、自然発生の特定の地方に限定された肺炎にかかっ
ているブタ由来の肺ろ過物は、肺や心臓に病変をもたら
した。自然発症または実験的な感染でも観察されたこの
病変は、ウィルス性要因からなる。
【０１３１】一般的に同定されたブタのウイルス性呼吸
器系病原体は以前には単離されていない。細胞変性効果
が観察され、本試験用のブタの肺胞のマクロファージ培
養細胞の溶菌により特徴づけられた。これは、Yoonら(J
ournal of Veterinary Diagnostic Investigation, vo
l. 4 (1992), p . 139)によるPRRSウィルス感染の報告
と一致する。しかしながら、この研究でみられた直接的
な気管支- 肺胞洗浄培物培養での多数のシンシチアは、
PRRSでの以前の報告では見られなかった。
【０１３２】感染細胞の培養物の電子顕微鏡観察では、
２つのウィルス様粒子が示された。表面上に短いスピク
ロを有する70ｎｍ径の外膜に覆われたウィルス様粒子の
外見は、Benfieldら(Journal of Veterinary Diagnosti
c Investigation, vol. 4 (1992), p. 117) により報告
されたPRRSウイルスと一致する。しかし、もう一方のウ
ィルス様粒子は異なっているように思われる。SIV 、PR
V 、TGEV (PRCV) およびEMCVに対する抗体価はどのブタ
も発現していなかった。
【０１３３】例Ｉにおいて再現された臨床上の疾患は、
5 DPI 以内に、あらゆる接種されたノトバイオートおよ
び通常のブタにおいて、重い呼吸器系の障害を和らげる
ことにより特徴づけられた。この実験における病気は、
以前の実験で観察されたよりさらに重症であった(Colli
n et al a nd Yoon et al supra)。
【０１３４】Morin らによって最近同定されたSIV A 型
変異体(Canadian Veterinary Journal, Vol. 31 (199
0),p.837 )について記述された、末端の器官上皮細胞の
壊死や増殖は、例Ｉでは観察されなかった。aSIV（Mori
n et al, and Girard et al,上述）と関連のある肺胞に
沿った繊維素の沈澱や硝子質の膜は観察されなかった。
例Ｉにおいて、15 DPIを越えて生存したブタで観察され
た重い非化膿性の心筋炎はaSIV（Morin et al, and Gir
ard et al,上述）とは関連がない。ブタはSIVに対し血
清変換しなかった。そしてSIV は胚を有する鶏卵での継
代では検出されなかった。
【０１３５】PRRS発生および実験的な接種において圧倒
的に見出だされる肺の病変では、単核細胞による間質性
の浸潤が顕著にみられた（Collins et al, Pol et al,
supra ）。例Ｉの感染したブタにおいて観察されたII型
肺細胞増殖、シンシチア細胞形成および心筋炎は、他で
は観察されなかった。例Ｉのろ過性病原体で一貫して再
現される病変は、この研究で示された病気、そしてそれ
は我々がPRRSV のアイオワ株と名付けた物であるが、本
病気は独特なウィルス源もしくは別の病原体とPRRSV ウ
ィルスとの組み合わせにより引き起こされることを示唆
している。 例 II （Ｉ）材料と方法 （Ａ）野外における供試材料と罹病経過 持続的な重い授乳期の肺炎を伴うPRRSの発生をうけ、も
との42頭の生まれた子供うちわずか20頭しか生きている
ブタが残っていない一集団から一頭のブタが得られた。
このブタを解体し、肺組織のサンプルを集め、標準的な
無菌ホモジネーション技術を用いてホモジネートした。
イーグル最少必須培地（MEM ）にて調製した肺ホモジネ
ート（10％ W/V）および0.22μｍのフィルターでろ過し
たものを接種源として用いた。
【０１３６】（Ｂ）細胞 PSP-36と名付られた継代細胞系は、Whittaker Bioprodu
cts,Inc.（Walkersville, Maryland）から購入したMA-1
04細胞由来のものである。PSP-36細胞のサンプルを別々
に繁殖させ、この細胞系をPSP-36-SAHと名付た。ブタ肺
胞のマクロファージ、および例を下記表IIに示す約90の
他の細胞系をウィルスの単離に用いた。
【０１３７】
【表２】 （Ｃ）ウイルス単離 上述のように調製された肺ホモジネート物を、2,000 ×
ｇもしくは 3,000ｒｐｍで、 4℃、15分間清澄化した。
上清を0.22μｍのフィルターでろ過した。ろ過物を、上
記（Ｂ）項に示した細胞系の各々に接種した。培養物
は、引き続き 0-4％のウシ胎児血清（FBS ）および抗生
物質を含む適当な培地に維持された。細胞系は、細胞病
理学的効果（CPE ）について毎日モニターした。CPE が
8〜 9日内で観察されなかい場合には、培養物を 2-3回
盲目的に継代した。わずかなCPE が観察された場合に
は、培養物をISU-12に対する回復期ブタ抗血清を用いて
間接免疫蛍光分析法（IFA ）で検査した。
【０１３８】（Ｄ）ウィルス力価 ISU-12単離体の一連の10倍希釈溶液を、 2％のFBS と 1
×抗生物質を加えたダルベッコ最少必須培地(DEM) で調
製した。各々の希釈溶液（ 0.2ｍｌ）を、PSP-36細胞お
よびLab-Tek チャンバー内で播種されたブタの肺胞マク
ロファージ培養細胞の各々の入ったウェルのそれぞれに
同様にして接種した。接種後（DPI ） 3日目に、このチ
ャンバーを、冷80％アセトンおよび20％メタノール溶液
を用いて、 4℃で15分間固定した。その後、このチャン
バーを、IFA において回復期のISU-12抗血清と抗-PRRS
ウイルス血清を用いて染色した。
【０１３９】（Ｅ）間接的な免疫蛍光分析法（IFA ） PSP-36細胞とブタ肺胞マクロファージ培養物をISU-12単
離体に感染させた。感染から20および48時間後、培養物
を冷80％アセトンおよび20％メタノール溶液を用いて4
℃で15分間固定した。IFA は、ISU-12回復期血清並びに
South Dakota State University, Brookings, South Da
kotaから購入した抗PRRSV 血清および抗PRRSV モノクロ
ーナル抗体を用いて行われた。コントロールとして非感
染PSP-36細胞とマクロファージ培養物が用いられた。
【０１４０】（Ｆ）放射性免疫沈降分析（RIP ） ISU-12単離体と偽感染 PSP-36 細胞を、35Ｓ- メチオニ
ンおよび35Ｓ- システインでラベルした。25ｃｍ3 フラ
スコ内で、 3日齢のPSP-36細胞を、104 TCID50のISU-12
ウィルス 0.5ｍｌで感染させた。感染から24時間後、こ
の培地をメチオニンとシステインがはいっていないDMEM
培地と置き換え、37℃で 1時間インキュベートした。そ
の後、この培地を、100 μci/ml の35Ｓ- メチオニン（
35Met ）と35Ｓシステイン（35Cys ）を加えた新しいメ
チオニンとシステインがはいっていないDMEM培地に置き
換えた。35Met と35Cys の添加の 5時間後、細胞を冷リ
ン酸緩衝液（PBS ）、ｐＨ 7.2で３度洗浄した。その
後、フラスコから回収し、1,000 ×ｇ、 410分間の遠心
分離によりペレットにした。このラベルされたウィルス
蛋白と偽感染細胞を含んだペレットを、溶菌緩衝液で破
壊した後、細胞残渣をZhu らの方法（Am. J. Vet. Re
s., 51:232-238 (1990) ）に従う遠心分離により清澄化
した。次いで、溶解物を、冷した正常なPSP-36細胞溶解
物に予備吸収された［preabsorbed ］ISU-12回復期血清
および抗-PRRS ウィルス血清と共に 4℃で一晩インキュ
ベートした。セファロース- プロテインＡビーズ（Sigm
a ChemicalCo., ST. Louis, Missouri から購入）を添
加し、 2時間室温に放置することにより免疫複合体を集
めた。その後、このセファロース- プロテインＡビーズ
と免疫複合体の混合物を、溶菌緩衝液で 3度、滅菌水で
3度洗浄した。この混合物を50μｌのサンプル緩衝液に
再懸濁し、前述のZhu らによって示されたようにSDS-PA
GEゲルで電気泳動した。
【０１４１】（Ｇ）電子顕微鏡（EM） PSP-36細胞を、25ｃｍ3 フラスコ内でISU-12ウィルス
に感染させた。感染から48時間後、この感染した細胞を
3％グルタルアルデヒド（ｐＨ 7.2）を用いて4℃で 2
時間固定した。その後、この細胞をフラスコから回収
し、遠心分離によりペレットにした。この細胞ペレット
を加工し、プラスチックに埋め込んだ。このプラスチッ
クに埋め込んだ細胞ペレットを薄い切片にして染色し、
Paulらによって示されたように（Am. J. Vet. Res.,38:
311-315(1976) ）、透過型電子顕微鏡にて観察した。 (II)ブタの生殖器および呼吸器疾患の実験的再現 （Ａ）実験 92.1 SPF 上記のISU-12由来の肺ろ過物を、 5週齢の特殊な無菌(S
PF) ブタ 6頭の鼻腔内に接種した。このブタを、接種後
3、 5、10、28および43日めに殺した。
【０１４２】（Ｂ）実験 92.3 SPF 6頭のSPF 雑種のブタに、 5週齢で、鼻腔内にISU-12肺
ろ過物と感染したブタ肺胞マクロファージ材料を接種し
た。このISU-12に感染したブタは、接種後10および28日
目に壊体された。
【０１４３】（Ｃ）実験 92.10 SPF 3頭の 5週齢のブタに、105 TCID50／ｍｌのウイルスを
含んだPSP-36で増殖したISU-12を鼻腔内に 3ｍｌ接種し
た。本試験用のブタは、接種後 5、10および28日目に解
体した。コントロールブタは、接種後 5、10日目に壊体
された。
【０１４４】（Ｄ）実験 92.12SPF 5週齢のブタ22頭を 6つのグループに分けた。グループ
Ｉでは、 6頭のブタ（本試験用）に、105 TCID50／ｍｌ
のウィルス含むPSP-36で増殖させた、プラーク精製 ISU
-12 （プラークNo.1）ウィルスを鼻腔内に 3ｍｌ接種し
た。グループIIでは、 6頭のブタに、コントロール細胞
培養液を接種した。グループIII （プラークNo.2）およ
びグループIV（プラークNo.3）の各々では、 2頭のブタ
にプラーク精製ISU-12を接種した。グループＶでは、 3
頭のブタに精製されていないプラークのISU-12を接種し
た。グループVIでは、 3頭のブタにISU-12組織ろ過物を
接種した。
【０１４５】接種後 5、10および25日目でグループＩと
IIの各々から、 2頭の本試験用のブタと２頭のコントロ
ールのブタを剖検した。プラークNo.2と 3を接種された
2頭のブタは、各々接種後10日目に剖検した。グループ
ＶとIVのそれぞれ１頭のブタを、接種後 5、10および25
日目に剖検した。
【０１４６】（Ｅ）顕微鏡視的考察 剖検後、肺、脳、心臓そして脾臓を集め、10％の中性ホ
ルマリン緩衝液で固定してパラフィンに埋め込み、そし
てヘマトキシンとエオシンで染色した。 （III ）結果 （Ａ）ウイルスの培養 (1)ブタ肺胞マクロファージ培養物より単離されたISU-1
2の培養 ISU-12肺ろ過物に感染したブタ肺胞マクロファージ培養
内において、細胞病理学的効果が接種後 2-3日目に始ま
るのが観察された。細胞病理学的効果は、マクロファー
ジと溶菌細胞の凝集により特徴づけられる。ISU-12に感
染した培養中のマクロファージ培養物の約90％が接種後
4-5日目で細胞病理学的効果を示した。図12(A) は、細
胞病理学的効果は非感染マクロファージ培養液では観察
されないことを示している。第３継代のマクロファージ
培養液中におけるISU-21ウイルス価は104 - 105 TCID50
／ｍｌであった。
【０１４７】図12(C) で示したように、ノトバイオ−ト
ブタ由来ISU-12回復期血清を用いることにより、ISU-12
感染ブタ肺胞マクロファージ培養物の細胞質内で、間接
的な免疫蛍光分析(IFA) によりウイルス抗源が検出され
た。免疫蛍光は接種していないマクロファージ培養物で
は検出されなかった。
【０１４８】(2)継代細胞系上でのISU-12単離体の培養 テストした約90の細胞系のうち（上記の“材料と方法”
の（Ｂ）項参照）、ウイルスの複製の証拠が以下に示す
6株の細胞に認められた。それは、PSP-36、PSP-36-SA
H、MA-104、滑膜細胞、肺胞のマクロファージ細胞、ブ
タ鼻甲介細胞である。
【０１４９】図13(B) は、接種後 2日目で細胞病理学的
変化が始まり、それが変性、細胞の丸め込み［roundin
g］および凝集によって特徴づけらることを示してい
る。接種後 3-4日目、丸め込まれた細胞の凝集が増加
し、いくつかの凝集は融合した。丸め込まれた細胞の多
くは細胞単層から分離し、引き続いて単層の分解を引き
起こした。接種後 5日め、細胞病理学的効果はかなり激
しくなり、典型的には単層の95％をこえるものが関与し
た。図13(A) で示されるように、コントロールPSP-36細
胞には細胞病理学的効果は観察されなかった。このISU-
12単離体は、PSP-36細胞において高いウィルス価に生育
し、11回の細胞継代培養で約106 - 107 TCID50／ｍｌで
あった。
【０１５０】ウィルス性抗原は、ISU-12肺ろ過物を実験
的に感染させたノトバイオ−トブタ由来回復期血清と感
染した細胞の細胞質で検出された（図14(B) 参照）。蛍
光はコントロールPSP-36細胞からは検出されなかった
（図14(A) ）。 （III ）ウィルスの特性 （Ａ）PRRSウィルスに対するISU-12の抗原類縁性 免疫蛍光分析法（IFA ）における明るい細胞質の蛍光
（図14(C) 参照）により立証されるように、PRRSウィル
ス単離体 VR-2332 に対するモノクロール抗体（Dr. Be
nfield, South Dakota State Univesity, Brookings, s
outh Dakota から購入）と抗-PRRSV血清（USDA Nationa
l Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowaから取
得）はISU-12感染PSP-36細胞と反応したが、非感染PSP-
36細胞とは反応しなかった。
【０１５１】（Ｂ）ウィルスの蛋白 抗ISU-12回復期血清と抗PRRSウィルス血清を、ウィルス
蛋白を分析するために用いた。 2つの血清は少なくとも
4つの蛋白を認識し、各々分子量は19、24、32および61
ｋＤであった（図15）。図15では、偽感染（レーン 2と
3）及びISU-12感染（レーン 4-7）が、抗ISU-12血清
（レーン 2と 5）、抗PRRSV 血清（レーン3と 4）、抗P
RRSV モノクローナル抗体（レーン 6）またはウサギ抗P
RRSV 血清（Dr. Benfield, South Dakota state Univer
sity, Brookings, south Dakotaより取得）と免疫沈降
した。レーン 1と 8は分子量マーカーを流した。これら
の蛋白は偽感染PSP-36細胞においては明らかではなかっ
た。
【０１５２】（Ｃ）ウィルスの構造 55-85ｎｍの範囲の典型的なウィルス粒子がISU-12が感
染したPSP-36細胞内で観察された。このウィルス粒子は
外膜に覆われ、球状で、ISU-12が感染したPSP-36細胞の
細胞質小胞内に存在した。 （IV）実験的な病気の再現 （Ａ）実験 92.1 SPF 上述のISU-12由来肺ろ過物を、 5週齢の特殊な無菌ブタ
（SPF ） 6頭の鼻腔内に接種した。ブタを、接種後（DP
I ） 3、 5、10、28および43日目に殺した。接種後 3日
めに、ISU-12感染ブタは、重い呼吸器系の障害と発熱を
呈した。これらの兆候は 10-14日間持続した。肉眼視的
な肺の病変は、肺の60％が重い多病巣性の黄褐色硬化し
ていることにより特徴付けられた。また、中度の心臓肥
大と腹水の蓄積がみられた。顕微鏡視的な変化は、II型
肺細胞増殖を伴う重症な間質性肺炎増殖、シンシチア細
胞の形成、肺胞の滲出、単核細胞による軽度の間質性濃
厚化により特徴づけられた。軽度の非化膿性［nonsuppu
rative］心筋炎、重い脳炎および中度のリンパ形質の腎
炎があった。10および28日目に剖検したISU-12実験ブタ
は、NVSLによって確認されたようにPRRS剤に血清変換さ
れていた。
【０１５３】（Ｂ）実験 92.3 SPF あらゆるISU-12接種SPF ブタは、 3日以内にひどい呼吸
器系の障害を示し、これは14日を越えて持続した。肉眼
視的病変は、肺のうっ血、浮腫、顕著な多病巣性び慢性
肝変により特徴付けられた。顕微鏡視的には、重い増殖
性間質性肺炎、中度の腎炎、中度の心筋炎および軽度の
脳炎が観察された。接種後10および28日目に解体された
ISU-12感染ブタは、NVSLにより確認されたようにPRRSへ
血清変換されていた。
【０１５４】（Ｃ）実験 92.10 SPF 接種されたブタの臨床上の兆候には、接種後 5-22 日目
で観察された、ひどいし眠、発熱、中度の食欲不振およ
び中度のもしくはひどい呼吸器系の障害が含まれる。中
度の涙目［tearing ］は実験の間ずっとこれらのブタで
見られた。顕微鏡視的な病変には、接種後 5日目で軽度
の増殖性間質性肺炎、ひどいネクロプルレント［nercro
purulent］扁桃炎が含まれた。接種後10日目では、II型
増殖を伴う中度の多病巣性PIP 、肺胞の滲出、多核巨大
細胞、シンシチア様細胞形成が観察された。また、接種
後10日目では、血管周囲の筋腱袖および神経膠症を伴う
中度の多病巣性脳炎が観察された。接種後10日目では、
軽度の門脈周囲のリンパマクロファージ肝炎、軽度な非
化膿性心筋炎および鼻炎が検出された。接種後26日目で
は、単核細胞による顕著な多病巣性間質性濃厚化、中度
の多病巣性II型肺細胞増殖、少量の混合した肺胞の滲
出、リンパ球とマクロファージの細気管支周囲の筋腱袖
の緩みにより特徴付けられる重度の間質性肺炎が見られ
る。また、中度の多病巣性心筋炎、軽度の肝炎、軽度の
腎炎、扁桃炎がみられた。 2頭のISU-12感染ブタは接種
後10日目でPRRSへ血清変換した。
【０１５５】コントロールブタは、実験継続中臨床的に
正常であり、肉眼視的および顕微鏡視的な病変は示され
なかった。このブタは、PRRSに対して血清反応陰性であ
った。
【０１５６】（Ｄ）実験 92.12 SPF 生物学的にクローン化されていないISU-12は、SPF ブタ
に対し病原性があり、上述の実験 92.10 SPFで示される
ように、間質性肺炎、心筋炎、脳炎を引き起こす。ISU-
12の 3つの生物学的クローン（プラークNo.1、 2および
3）を接種されたブタは、軽度の間質性肺炎を引き起こ
した。しかしII型肺細胞増殖、肺胞の滲出、心筋炎、お
よび／または脳炎の証拠はこれらのブタからは検出され
なかった。クローン化され、もしくはクローン化されて
ないISU-12を接種された全てのブタは、接種後10日目で
PRRSへ血清変換した。コントロールブタは、ウィルス感
染と病気から免れていた。 （Ｖ）要約 重い肺炎が、自然に発病したブタ（ISU-12）の肺および
心臓ろ過物（0.22μｍ）を用いて、 5週齢のSPF ブタで
実験的に再現された。PRRSV （ISU-12）のアイオワ株に
より惹起された肺炎は、間質性肺炎、II型肺細胞増殖、
シンシチア様細胞形成により特徴付けられる。発病した
ブタからは心筋炎と脳炎が観察された。ISU-12は、ブタ
肺胞マクロファージ培養物および継代細胞系、PSP-36に
おいて細胞病理学的効果(CPE) を引き起こした。ウィル
ス性抗原は、間接免疫蛍光法によってISU-12感染培養物
において検出されたが、非感染細胞では検出されなかっ
た。ISU-12は、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗
体を用いる間接免疫蛍光法により、PRRSウィルス株VR-2
332 に抗原的に関連付けられる。しかしながら、非プラ
ーク精製 ISU-12 に感染したブタの顕微鏡視的な病変に
おいて相違が観察された。そしてこれは、他のウィルス
もしくは病原体がPSP-36で生育することが可能であり、
かつこの他のウィルスもしくは病原体が、PRRSV のアイ
オワ株によって惹起される病変が、文献でこのウィルス
について報告されているものとは異なりそれより激しい
ことの原因である可能性を示している。クローン化さ
れ、もしくはクローン化されてないISU-12を接種された
全てのブタは、接種後10日目でPRRSへ血清変換した。コ
ントロールブタは、ウィルス感染と病気から免れてい
た。 例 III アイオワ株ブタの呼吸器および生殖器症候群に関与する
病原体の3'末端領域の分子クローニングおよび核酸配列
決定 （Ｉ）材料および方法 （Ａ）ウイルスの増殖および精製 後述の考察を簡単にするために、単語“ウイルス”およ
び“ウイルスの”は、ウイルスあるいは本出願で上述し
た意味を持つ病原体を示すか、あるいはウイルスもしく
は病原体の性質を示している。
【０１５７】継代細胞系ＰＳＰ-36 は、アイオワ株ＰＲ
ＲＳＶに関与したＩＳＵ-12 を単離および増殖させるた
めに使われた。ＩＳＵ-12 ウイルスはＰＳＰ-36 細胞で
3回プラーク精製した。その後、ＰＳＰ-36 細胞をプラ
ーク精製したウイルスに感染させた。感染した細胞の70
％以上が細胞変性の変化を示した時、細胞を 3回凍結お
よび融解した。それから培養液を、 4℃にて5000ｇで15
分間の低速遠心によって清澄にした。それからウイルス
を 7％ＰＥＧ-8000 および 2.3％ＮａＣｌで 4℃にて一
晩中撹拌することによって沈降させ、沈降物を遠心によ
ってペレット化した。それからウイルスの沈殿物をトリ
ス−ＥＤＴＡバッファー 2ｍｌで再溶解し、ＣｓＣｌ勾
配（1.1245 - 1.2858 ）の最上部に上層した。20℃で約
8時間28,000ｒｐｍで遠心した後、1.15 - 1.18 ｇ／ｍ
ｌの密度を持つ透明なバンドを検出して集めた。このバ
ンドの感染力価はＩＦＡにより決定され、106 ＴＣＩＤ
50／ｍｌになる事が見出された。典型的なウイルス粒子
もネガティヴ染色電子顕微鏡法（ＥＭ）によって観察さ
れた。
【０１５８】（Ｂ）ウイルスＲＮＡの単離 全ＲＮＡは、市販のＲＮＡ単離キット（ストラタジーン
社から入手）を用い、ＣｓＣｌ勾配中のウイルス含有バ
ンドから単離した。その後、ポリ（Ａ）ＲＮＡをカラム
メーカー（インビトロージェン）によって指示された方
法に従ってオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマトグ
ラフィーによって濃縮した。
【０１５９】（Ｃ）ＩＳＵ-12 ｃＤＮＡλライブラリー
の構築 ＩＳＵ-12 ｃＤＮＡλライブラリー構築の一般的に図式
化した方法を図１６に示す。ｍＲＮＡからの第一鎖ｃＤ
ＮＡ合成は、ＸｈｏＩ制限部位を持つオリゴ（ｄＴ）プ
ライマーを使用した逆転写によって行なった。ヌクレオ
チド混合物は、正常のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰお
よび続いて行われるクローニングステップで使用される
制限酵素からｃＤＮＡを保護する類似体５−メチルｄＣ
ＴＰを含んでいた。
【０１６０】次いで、第二鎖ｃＤＮＡ合成はＲＮａｓｅ
およびＤＮＡポリメラーゼＩで行なった。ｃＤＮＡ末端
はＴ4 ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し（平滑末端）、Ｔ
4 ＤＮＡリガーゼでＥｃｏＲＩアダプターに結合し、続
いてＴ4 ポリヌクレオチドリン酸化酵素でリン酸化し
た。ｃＤＮＡをＸｈｏＩで切断し、切断されたｃＤＮＡ
の大きさをアガロースゲルで選択した。大きさが 1ｋｂ
よりも大きく切断されたｃＤＮＡを選択し、市販のＤＮ
Ａ精製キット（ジーンクリーン、ＢＩＯ 101から入手、
ラジョーラ社、カルフォルニア）により精製した。
【０１６１】精製したｃＤＮＡは、その後λファージベ
クターのアームに結合し、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩの
粘着末端で処理した。結合したベクターはラムダ抽出液
で感染性のあるラムダファージにパッケージングした。
形質導入にはＥ．ｃｏｌｉ細胞のＳＵＲＥ株（ストラタ
ジーン社から入手）を用い、ラムダライブラリーを増幅
し、ＸＬ-1ブルー細胞株で力価測定した。
【０１６２】（Ｄ）差別化ハイブリダイゼイションによ
るλライブラリーのスクリーニング 差別化ハイブリダイゼイションによるＰＩＰウイルスＩ
ＳＵ-12 種の本物のクローンを同定するための一般的な
図式化した方法が図１７に示されており、さらに以下に
記載される。λライブラリーをＫＬ-1ブルー細胞に播種
し、プラークを2回ずつナイロン膜上に拾い上げて、通
常の方法論により 0.5ＮＮａＯＨで変性した。ウイルス
感染ＰＳＰ-36 細胞および非感染ＰＳＰ-36 細胞両方か
らのメッセンジャーＲＮＡをカラムのメーカー（インビ
トロゲン）によって記載された通りにオリゴ（ｄＴ）セ
ルロースカラムクロマトグラフィーによって単離した。
【０１６３】相補的なＤＮＡプローブを、メーカー（ア
マシャム）によって記載された方法に従い、32Ｐ−ｄＣ
ＴＰの存在下、ランダムプライマーを用いてウイルス感
染ＰＳＰ-36 細胞及び正常ＰＳＰ-36 細胞から単離され
たｍＲＮＡから合成した。二つのプローブ（一方はウイ
ルス感染ＰＳＰ-36 細胞から合成されて、他方は正常な
非感染ＰＳＰ-36 細胞から合成された）は、それから独
立してセファデックスＧ−５０カラムクロマトグラフィ
ーによって精製した。これらのプローブを50％ホルマリ
ン中において、42℃で二重ナイロン膜とハイブリダイズ
させた。ウイルス感染細胞から調製したプローブとハイ
ブリダイズし、正常細胞から調製したプローブとハイブ
リダイズしなかったプラークを単離した。ウイルスｃＤ
ＮＡインサートを含むファージミドは、インビトロでＧ
408ヘルパーファージの助けをかりて切断によってレス
キューした。次いで、レスキューしたファージミドを、
ＫＬ-1ブルー細胞で増幅した。ウイルスｃＤＮＡインサ
ートを含むファージミドをＱｉａｇｅｎカラムクロマト
グラフィーによって単離し、引き続いて配列決定した。
【０１６４】（Ｅ）塩基配列決定および配列分析 ウイルスｃＤＮＡインサートを含むプラスミドをＱｉａ
ｇｅｎカラムクロマトグラフィーによって精製し、種々
の内部オリゴヌクレオチドプライマーと同様に、ユニヴ
ァーサルおよびリバーサルプライマーを用いるザンガー
ダイデオキシ法によって配列決定した。配列は少なくと
も３つの分離したクローンから得られた。不明瞭な配列
結果が得られたときは、さらなるクローンあるいは領域
の配列決定を行なった。塩基配列結果を集め、２種類の
コンピューターソフトプログラム、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ
（インテリゲネティクス社、マウンテンビュー、カルホ
ルニア）およびＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（インターナルバイ
オテクノロジー社、ニューハーベン、コネチカット）を
用いて独立に分析した。
【０１６５】（Ｆ）オリゴヌクレオチドプライマー オリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡシンセサイザー（アプ
ライドバイオケミストリー）を用いて１本鎖ＤＮＡとし
て合成し、ＨＰＬＣによって精製した。オリゴヌクレオ
チドＰＰ284 （ 5'-CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT-3' ；配
列番号 1）およびＰＰ285 （ 5'-CCCCATTTCC CTCTAGCGA
C TG-3' ；配列番号 2）をＰＣＲ増幅のために合成し
た。ノーザンブロット分析のために、ＤＮＡプローブを
ウイルスゲノムの3'末端からこれら 2つのプライマーと
共に合成した（下記論考参照）。オリゴヌクレオチドＰ
Ｐ286 （ 5'-GCCGCGGAAC CATCAAGCAC-3'；配列番号 3）
およびＰＰ287 （5'-CAACTTGACG CTATGTGAGC-3' ；配列
番号 4）をＰＣＲ増幅のために合成した。これら２つの
プライマーによって生成したＤＮＡプローブはさらにλ
ライブラリーをスクリーニングするために使用した。オ
リゴヌクレオチドＰＰ288 （5'-GCGGTCTGGA TTGACGACAG
-3' ；配列番号 5）、ＰＰ289 （5'-GACTGCTAGG GCTTCT
GCAC-3' ；配列番号 6）、ＰＰ386 （5'-GCCATTCAGC TC
ACATAGCG-3' ；配列番号 7）、ＰＰ286 およびＰＰ287
は内部配列を得るために配列決定プライマーとして使用
した。
【０１６６】（Ｇ）ノーザンブロット分析 ＩＳＵ-12 ｃＤＮＡクローンの3'末端からの特異的ＤＮ
Ａ断片は、プライマーＰＰ284 およびＰＰ285 を使用し
たＰＣＲによって増幅した。ＤＮＡ断片は、市販のＤＮ
Ａ精製キット（ジーンクリーン、バイオ101 から得た）
を使用したアガロースゲルから切出し、ランダムプライ
マー伸張によって32Ｐ−ｄＣＴＰでラベルした（アマシ
ャムから入手したキットを使用）。全ＲＮＡは、メーカ
ー（ストラタジーン社）によって指示された方法に従
い、全ＲＮＡを単離するための市販のキットを使用し
て、36時間ポスト感染したＩＳＵ-12 感染ＰＳＰ-36 細
胞から単離した。ＩＳＵ-12 サブゲノムｍＲＮＡ種は 6
ＭグリオキザールおよびＤＭＳＯで変性し、 1％アガロ
ースゲルで分離した。（ 1.5％アガロースゲルに置き換
えた同様な方法の結果は、以下の例VIIIに記載され、図
32に示される。）分離したサブゲノムｍＲＮＡを、それ
からＰＯＳＩＢＬＯＴTM圧力ブロッター（ストラタジー
ン）を使用してナイロン膜上に転送した。ハイブリダイ
ゼイションを、ローラーボトラーを備えたハイブリダイ
ゼイションオーブン内において、42℃で50％ホルムアミ
ドで行なった。 結 果 （Ａ）ＩＳＵ-12 3'末端ゲノムのクローニング、同定お
よび配列決定 オリゴ（ｄＴ）プライムド［primed］ｃＤＮＡλライブ
ラリーを、ＩＳＵ-12感染ＰＳＰ-36 細胞から得られ
た、部分的に精製されたウイルスから構築した。問題点
は、レリスタッドウイルス配列に基づくプローブを用い
てｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする点であっ
た。３つの組み合わせのプライマーが準備された。第１
の組み合わせ（ＰＰ105 およびＰＰ106 ；配列番号 21-
22）はレリスタッドゲノム配列の 14577ないし 14596お
よび 14977ないし 14995の位置に相当し、ヌクレオカプ
シド遺伝子領域に局在した。第２の組み合わせ（ＰＰ10
6 およびＰＰ107 ；配列番号 22-23）はレリスタッドゲ
ノム配列の 14977ないし 14995および 14054ないし 140
72の位置に相当し、ＯＲＦ-6および-7の側面を固めてい
る。第３の組み合わせ（ＰＭ541 およびＰＭ542 ；配列
番号 24-25）は、レリスタッドゲノム配列の 11718ない
し 11737および 11394ないし 11413の位置に相当し、Ｏ
ＲＦ-1b 領域に局在する。
【０１６７】 ＰＰ105 ：5'-CTCGTCAAGT ATGGCCGGT-3'（配列番号21） ＰＰ106 ：5'-GCCATTCGCC TGACTGTCA-3'（配列番号22） ＰＰ107 ：5'-TTGACGAGGA CTTCGGCTG-3'（配列番号23） ＰＭ541 ：5'-GCTCTACCTG CAATTCTGTG-3' （配列番号2
4） ＰＭ542 ：5'-GTGTATAGGA CCGGCAACCG-3' （配列番号2
5） これらの 3組のプライマーを使用し、ＩＳＵ-12 病原体
からＰＣＲによってプローブを生成する試みは全て成功
しなかった。しかしながら、差別化ハイブリダイゼイシ
ョン技術を使用した幾つか試験の後、ＩＳＵ-12 特異的
ｃＤＮＡを代表する本物のプラークが、ＩＳＵ-12 感染
ＰＳＰ-36 細胞及び正常ＰＳＰ-36 細胞から調製された
プローブを使用して単離された。差別化ハイブリダイゼ
イションに関する方法は、図17に記載され説明されてい
る。
【０１６８】3種のポジティブプラーク（λ-4、λ-75
およびλ-91 ）を最初に同定した。λファージ中に挿入
したウイルスｃＤＮＡインサートを含むファージミド
は、インビトロでＧ408 ヘルパーファージの助けで切断
することによってレスキューされた。ポジティブクロー
ンのインサートを、制限酵素切断および末端配列分析に
よって分析した。ｃＤＮＡクローンの特異性は、更にア
イオワ株ＰＲＲＳＶにより感染されたＰＳＰ-36 細胞か
らのＲＮＡとハイブリダイズさせることによって確定し
た。それからＤＮＡプローブを、プライマーＰＰ286 お
よびＰＰ287 を用いるＰＣＲによってクローンλ-75 の
5'末端から合成した。更にポジティブプラーク（λ-22
9、λ-268、λ-275、λ-281、λ-323およびλ-345）
を、このプローブを使用する事によって同定した。3'末
端ヌクレオチド配列を得るために使用された全てのλｃ
ＤＮＡクローンを図18に示す。間違いを打ち消すため
に、少なくとも３つの別々のクローンについて配列決定
を行なった。不明瞭な配列データである場合には、さら
なるクローンおよび内部プライマー（ＰＰ288 、ＰＰ28
9 、ＰＰ286 、ＰＰ287 およびＰＰ386 ）を配列を決定
するために使用した。1938ｂｐの3'末端配列（配列番号
8）を図19に示し、推定アミノ酸配列（配列番号 9 -1
2）を図20に示す。
【０１６９】（Ｂ）サブゲノムｍＲＮＡの入れ子式セッ
ト ウイルス感染ＰＳＰ-36 細胞からの全ＲＮＡを、 1％グ
リオキサール／ＤＭＳＯアガロースゲルで分離し、ナイ
ロン膜上にブロットした。ｃＤＮＡプローブは、ウイル
スゲノムの 3'-末端領域の横に位置するプライマーの組
み合わせ（ＰＰ284 およびＰＰ285 ）を用いたＰＣＲに
よって生成した。プローブは 3'-非翻訳配列およびＯＲ
Ｆ-7配列の大部分を含んでいる。アイオワ株ＰＲＲＳＶ
で感染されたＰＳＰ-36 細胞のｍＲＮＡ種のパターンを
示すノーザンブロットハイブリダイゼイションの結果
は、ウイルスの複製にサブゲノムｍＲＮＡの形成を必要
とするレリスタッドウイルス（ＬＶ）、ウマウイルス性
動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸脱水素酵素−上昇ウイ
ルス［lactate dehydrogenase-elevating virus ］（Ｌ
ＤＶ）およびコロナウイルスのｍＲＮＡ種のパターンと
非常に類似していた。ノーザンブロットプローブは 3'
末端配列のみを提示したので、その結果は、ＩＳＵ-12
特異的サブゲノムｍＲＮＡがｍＲＮＡの 3'-入れ子式セ
ット［3'-nested set ］を表わすことも示している。Ｉ
ＳＵ-12 ウイルスゲノムＲＮＡ（14ｋｂ）および 6つの
サブゲノムｍＲＮＡ（ＲＮＡ 2（ 3.0ｋｂ）、ＲＮＡ 3
（ 2.5ｋｂ）、ＲＮＡ 4（ 2.2ｋｂ）、ＲＮＡ 5（ 1.8
ｋｂ）、ＲＮＡ 6（ 1.3ｋｂ）およびＲＮＡ 7（0.98ｋ
ｂ））のサイズは、両方のゲノムおよびサブゲノムＲＮ
Ａ種において異なるけれども、ＬＶのサイズに類似して
いる。違いはサブゲノムｍＲＮＡの相対的な量において
も観察され、ＲＮＡ 7が最も優勢なサブゲノムｍＲＮＡ
である。
【０１７０】（Ｃ）サブゲノムＲＮＡにコードされたオ
ープンリーディングフレームの分析 ３つの大きなＯＲＦが、配列番号 8：ＯＲＦ-5（ｎｔ 2
39 - 901；配列番号13）、ＯＲＦ-6（ｎｔ 889 - 1403
；配列番号15）およびＯＲＦ-7（ｎｔ 1403 -1771；配
列番号18）で見出されている。結果として得られた配列
の5'末端に位置するＯＲＦ-4は、配列番号 8の1938ｂｐ
3'末端配列が不完全である。ＯＲＦ-5、-6および-7
は、各々、 100アミノ酸より多くコード出来る能力を持
っている。ＯＲＦ-5とＯＲＦ-6は互いに10ｂｐ重なり合
っており、ＯＲＦ-6とＯＲＦ-7は互いに 5ｂｐ重なり合
っている。ＯＲＦ-7中にもっぱら位置する 2つの小さな
ＯＲＦも発見されており、各々37ａａおよび43ａａのみ
をコードしている。他の 2つの短いＯＲＦは完全にＯＲ
Ｆ-5と重なり合っている。これらの 2つの短いＯＲＦの
コード出来る能力は、各々29ａａおよび44ａａのみであ
る。ノーザンブロット分析によると、これらの小さなＯ
ＲＦと相互関係を有する特異的サブゲノムｍＲＮＡはな
かった。ＯＲＦ-6およびＯＲＦ-7は各々ウイルス膜タン
パクおよびカプシッドタンパクをコードすると思われ
る。 （Ｄ）リーダージャンクションに対するコンセンサス配
列 配列分析は、サブゲノムｍＲＮＡにおいてリーダーが転
写の際に結合する部位として働くかもしれない短い配列
モチーフ、AACCを示している。各々、ＯＲＦ-6の結合部
位はATG 開始コドンから21ｂｐ上流で発見され、ＯＲＦ
-7の結合部位はATG 開始コドンから13ｂｐ上流で発見さ
れている。AACCコンセンサス配列は、ＬＶのＯＲＦ-5で
は発見されているけれども、ＯＲＦ-5中では同定されて
いない。同様の結合配列はＬＤＶおよびＥＡＶでは発見
されてる。
【０１７１】（Ｅ） 3'-非翻訳配列およびポリ（Ａ）テ
イル ＯＲＦ-7の停止コドンの次に続く 150ヌクレオチドの長
さを持つ（ 150ｎｔ）非翻訳配列がＩＳＵ-12 ウイルス
のゲノム中で同定されており、ＬＶ中の 114ｎｔ、ＬＤ
Ｖ中の80ｎｔおよびＥＡＶ中の59ｎｔと比較されてい
る。ポリ（Ａ）テイルの長さは少なくとも13ヌクレオチ
ドである。ＰＩＰウイルスＩＳＵ-12 、ＬＶおよびＬＤ
Ｖにおいて、ポリ（Ａ）テイルに隣接した領域に、コン
センサス配列、CCGG／ AAATT−ポリ（Ａ）がある。
【０１７２】（Ｆ）ＯＲＦ-5、-6および-7の間並びに非
翻訳配列の間でのＩＳＵ-12 およびＬＶゲノムの配列の
比較 ＩＳＵ-12 とレリスタッドウイルスのゲノムのＯＲＦ-5
領域の比較が図21に示されている。ＯＲＦ-6領域、ＯＲ
Ｆ-7領域、および非翻訳配列は各々に対応する比較が、
図22、23および24に示されている。
【０１７３】比較の結果が下記表III に記載されてい
る。上記した事と一致するが、免疫原ウイルスと90％以
上の相同性を有する場合には、ウイルスは免疫学的に等
価であると見なされる。ＬＶおよびＩＳＵ-12 の間で、
ＯＲＦ-5、ＯＲＦ-6、ＯＲＦ-7および非翻訳配列のヌク
レオチド配列相同性は、各々、60％、68％、60％、58％
である。従って、ＬＶおよびＩＳＵ-12 は免疫的に等価
ではない。
【０１７４】ＬＶ中のＯＲＦ-5および-6の大きさはＩＳ
Ｕ-12 中のＯＲＦ-5および-6よりも各々61ｎｔおよび 3
ｎｔ小さい。対称的に、ＬＶ中のＯＲＦ-7の大きさはＩ
ＳＵ-12 中のそれよりも15ｎｔ大きい。3'末端非翻訳配
列も長さが異なる（ＩＳＵ-12 では 150ｎｔであるが、
ＬＶではわずか 114ｎｔである）。ＬＶのように、ジャ
ンクション配列AACCは、ＯＲＦ-5を除いて、アイオワ株
ＰＲＲＳウイルス単離ＩＳＵ-12 のゲノム中でも同定さ
れている。ＩＳＵ-12 中のＯＲＦ-6のジャンクション配
列は ATG開始コドンから21ｎｔ上流にあり、しかしなが
ら、ＬＶ中のＯＲＦ-6のジャンクション配列は ATGから
28ｎｔ上流にある。
【表３】 例 IV 昆虫細胞におけるアイオワ株病原体遺伝子の発現 (A) 組換えバキュロウイルスの作製 ＯＲＦ-5、ＯＲＦ-6およびＯＲＦ-7配列を、ＩＳＵ-12
ゲノムヌクレオチド配列に基づくプライマーを用いるＰ
ＣＲによって個々に増幅した。ＯＲＦ-5は下記プライマ
ーを用いて増幅した： 5'-GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC-3' （配列番号26） 3'-GGGAATTCGC CAAGAGCACC TTTTGTGG-5' （配列番号27） ＯＲＦ-6は下記プライマーを用いて増幅した： 5'-GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G-3' （配列番号28） 3'-GGGAATTCTG GCACAGCTGA TTGAC-5' （配列番号29） ＯＲＦ-7は下記プライマーを用いて増幅した： 5'-GGGGATCCTT GTTAAATATG CC-3' （配列番号30） 3'-GGGAATTCAC CACGCATTC-5' （配列番号31） 増幅したＤＮＡ断片を、バキュロウイルス転移ベクター
ｐＶＬ1393（Invitrogenより入手）中にクローニングし
た。線状にしたバキュロウイルスＡｃＭＮＰＶＤＮＡ
（Pharmingen, San Diego, California より購入） 1μ
ｇおよびＰＣＲ増幅クローン化ｃＤＮＡ含有ベクター構
築物 2μｇをリポフェクチン（Gibco ）50μｌと混合
し、22℃で15分間インキュベートしてトランスフェクシ
ョン混合物を調製した。
【０１７５】ＨＩ−ＦＩＶＥ細胞播種の 1時間後、培地
を新鮮なエクセル 400昆虫細胞培養培地［Excell 400 i
nsect cell culture medium ］（JR Scientific Co. よ
り入手）と取換え、トランスフェクション混合物を滴下
により添加した。得られた混合物を28℃で 6時間インキ
ュベートした。その後、トランスフェクション培地を除
去し、新鮮なエクセル 400昆虫細胞培養培地を添加し
た。次いで、得られた混合物を28℃でインキュベートし
た。
【０１７６】トランスフェクションの 5日後、培養培地
を集め精製した。上清の10倍希釈液をＨＩ−ＦＩＶＥ細
胞に接種し、室温で60分間インキュベートした。接種物
を廃棄した後、細胞上に1.25％寒天のオーバーレイを塗
布した。28℃で 4日間インキュベーションを行なった。
然る後、透明なプラークを選定し、無菌のパスツールピ
ペットを用いて取り出した。各プラークをグレースの昆
虫培地［Grace's insect medium ］ 1ｍｌと混合して 5
ｍｌスナップキャップチューブに入れ、冷蔵庫内に一晩
放置して寒天からウイルスを解放した。これらのチュー
ブを2000×ｇで30分間遠心して寒天を分離し、その上清
を新しい無菌チューブに移した。プラーク精製工程を 3
回繰り返し、可能性のある野生型ウイルス汚染を避け
た。精製組換えクローンを、さらなる調査のために、 -
80℃で保存した。 (B) 組換えアイオワ株病原体タンパクの発現 発現の評価には、間接免疫蛍光測定法および放射標識免
疫沈降法［radioimmunoprecipitation］を用いた。
【０１７７】間接免疫蛍光測定法：図25に示す、24ウェ
ル細胞培養クラスタープレート中のＨＩ−ＦＩＶＥ昆虫
細胞に、野生型バキュロウイルスもしくは組換えバキュ
ロウイルスを感染させるか、あるいは偽感染させた。72
時間後、細胞を固定し、ブタ抗ＩＳＵ-12 ポリクローナ
ル抗体の適当な希釈液、次いでフルオロセインイソチオ
シアネート標識（ＦＩＴＣ標識）抗ブタＩｇＧで染色し
た。図26−29に示すように、組換えウイルスに感染した
細胞においては免疫蛍光が検出されたが、偽感染細胞も
しくは野生型バキュロウイルスを接種した細胞では検出
されなかった。例えば、図26は、細胞変性効果を発現す
る、ＩＳＵ-12 ＯＲＦ-6遺伝子（Baculo.PRRSV.6）を含
む組換えバキュロウイルスに感染したＨＩ−ＦＩＶＥ細
胞を示す。図27は、同様に細胞変性効果を発現する、Ｉ
ＳＵ-12 ＯＲＦ-7遺伝子（Baculo.PRRSV.7）を含む他の
組換えバキュロウイルスに感染したＨＩ−ＦＩＶＥ細胞
を示す。ＯＲＦ-5（Baculo.PRRSV.5、データは示さず）
を含む組換えバキュロウイルスを用いても同様の結果が
得られた。図28および29は、それぞれＩＳＵ-12 ＯＲＦ
-6遺伝子およびＩＳＵ-12 ＯＲＦ-7遺伝子を含む組換え
バキュロウイルスに感染し、ＩＳＵ-12 に対するブタ抗
血清、次いでフルオロセイン結合抗ブタＩｇＧで染色さ
れたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す。ここでは、この昆虫細
胞は組換えアイオワ株病原体タンパクを産生している。
ＯＲＦ-5を含む組換えバキュロウイルスでも同様の結果
が得られた。
【０１７８】放射標識免疫沈降法：組換えタンパクの抗
原性および信頼性をさらに決定するために、各組換えウ
イルス（Baculo.PRRSV.5、Baculo.PRRSV.6およびBacul
o.PRRSV.7）を用いて放射標識免疫沈降を行なった。Ｈ
Ｉ−ＦＩＶＥ昆虫細胞を偽感染し、あるいは代わりに、
組換えバキュロウイルスのそれぞれに感染させた。感染
の 2日後、メチオニン非含有培地を添加した。各混合物
を 2時間インキュベートした後、35Ｓ- メチオニン（Am
ersham）で標識したタンパクを添加し、その混合物を28
℃でさらに 4時間インキュベートした。凍結および解凍
を 3サイクル行なうことにより放射標識した細胞溶解質
を調製し、この細胞溶解質を予備免疫もしくは免疫抗Ｉ
ＳＵ-12 抗血清と共にインキュベートした。この免疫複
合体をプロテインＡアガロースで沈殿させ、煮沸した後
ＳＤＳ- ＰＡＧＥで解析した。このゲルに対して -80℃
でＸ線フィルムを露光し、現像した。ＯＲＦ-6（図30）
およびＯＲＦ-7（図31）生成物で予期されるサイズのバ
ンドを検出した。 例 Ｖ 下記表４に記載される他の PRRSVの試料を 3回プラーク
精製した。プラーク精製は、ＰＳＰ-36-ＳＡＨ細胞の清
澄化組織ホモジネートを培養し、 1つのプラークは単一
のウイルスによって生成されると仮定して、単一のプラ
ークを選択することにより行なった。次いで、選択した
プラークを培養し、再び単一のプラークを選択して 3回
目の培養を行なった。South Dakota State University,
Brookings, South Dakotaより購入した抗 PRRSVモノク
ローナル抗体を用いてＩＦＡを行なった。
【０１７９】さらなる研究のために選択された幾つかの
単離試料を下記表５に示し、それらの病原性およびｍＲ
ＮＡの数により特徴付けた。
【０１８０】
【表４】
【０１８１】
【表５】 ＊＝幾つかのｍＲＮＡは欠失していた。 非プラーク精製ＩＳＵ-12 およびプラーク精製ＩＳＵ-1
2 の各々の試料は、ブタペスト条約の条件の下、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣ
Ｃ）、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20
852, U.S.A. に、それぞれ受付番号ＶＲ2385およびＶＲ
2386として1992年10月28日付で寄託されている。また、
ＩＳＵ-22 、ＩＳＵ-51 、ＩＳＵ-55 およびＩＳＵ-392
7 の各々の試料は、1993年 9月29日付でＡＴＣＣに寄託
されている。
【０１８２】ＩＳＵ-3927 のｍＲＮＡは、 7つのｍＲＮ
Ａのうち 4つが欠失していた。ＩＳＵ-3927 のｍＲＮＡ
4、 5、 6および 7は、ＩＳＵ-12 のものよりも早く移
動し、したがってＩＳＵ-12 のものよりも小さい。この
特徴は、ＩＳＵ-3927 の低毒性に関係している可能性が
ある。
【０１８３】6種の単離体の病原性を 5週齢ＣＤＣＤブ
タにおいて比較した。15匹のブタに105 ＴＣＩＤ50のウ
イルスを接種した。10匹のブタを10ＤＰＩで解剖し、 5
匹のブタを28ＤＰＩで解剖した。ウイルス単離体ＩＳＵ
-12 、ＩＳＵ-51 およびＩＳＵ-55 の病原性が低かった
のに対して、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ-28 は最も病原性
が高かった。先の研究においては、 5週齢のブタに対し
ては、唯一ＩＳＵ-3927 が穏やかな病原性であった。
【０１８４】ＩＳＵ-22 および非プラーク精製（すなわ
ち、プラーク精製されていない単離病原体）ＩＳＵ-12
により惹起された病変は、プラーク精製ウイルスによっ
て惹起された病変よりも長い期間残った。プラーク精製
単離体は、軽度のな心筋梗塞および脳炎を惹起した。非
プラーク精製単離体は、対応するプラーク精製単離体よ
りもさらに幾つかの疾患を惹起した。
【０１８５】子ＣＤＣＤブタは、病原性の評価およびカ
ンジダワクチンの有効性の優れたモデルを提供する。単
離体ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ-984は同様の
病変を生じ、肉眼視的および顕微鏡視的病変の試験に基
づいて、ワクチンの有効性の評価に用いることができ
る。ＩＳＵ-3927 はより毒性が低いが、PRRSV の病原株
に対するワクチンの評価に適している。
【０１８６】プラーク精製ＩＳＵ-12 を感染させたブタ
は、28日間で、（未感染ＰＳＰ-36細胞を抗原投与し
た）対照ブタよりも体重が平均 9.9ポンド減少した。予
備試験の結果は、 2−10ＤＰＩで、リンパ球減少および
好中球増加が現われることを示している。
【０１８７】非プラーク精製ＩＳＵ-12 を感染させたブ
タのみが重篤な脳炎を発病した。生物学的クローン化
（プラーク精製）アイオワ株単離体を抗原投与したブタ
のいずれにも、鼻炎は観察されなかった。対称的に、組
織濾液（非プラーク精製単離体）を接種物として用いた
場合には、鼻炎が重かった。
【０１８８】非プラーク精製ＩＳＵ-12 、プラーク精製
ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 、ＩＳＵ-984、ＩＳＵ-3927 お
よび未感染ＰＳＰ-36 細胞を感染させたＣＤＣＤブタの
病理学および組織学を下記表 6−12にまとめる。これら
の表において、肉眼視的肺病変評点は、肺の硬化の割合
（すなわち、肺炎に罹患し病変を示す灰組織の割合）を
表わす。評点は、 0ないし 100％硬化のスケールに基づ
く。「ＮＤ」は、肉眼視的肺病変評点を決定していない
ことを意味する。、
【０１８９】
【表６】 上記表６において、「unpl. 」は非プラーク精製を、
「uninoc. 」は未接種を意味する。
【０１９０】上記表６における結果は、ＩＳＵ-12 およ
びＩＳＵ-22 が他の単離体より長く残る病変を生じるこ
とを示している。ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ
-984によって生じる病変の重篤性は同様である。ＩＳＵ
-3927 によって生じる病変は大変軽く、他の単離体によ
って引き起こされる病変よりも早く治まる。全ての肉眼
視的病変は、36ＤＰＩまでに治まった。
【０１９１】下記表 7−12に示される病理学的な結果
は、上記表１に示した重篤性と同じスケールに基づくも
のである。下記表 7−12において、「Int. thick. 」は
組織間腔肥大を、「alv. exud.」は肺胞滲出を、および
「encephal. 」は脳炎を意味する。
【０１９２】
【表７】
【０１９３】
【表８】
【０１９４】
【表９】
【０１９５】
【表１０】
【０１９６】
【表１１】
【０１９７】
【表１２】 7ＤＰＩでは、ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 およびＩＳＵ-98
4によって引き起こされる病変は重篤であり、その程度
は互いに似ている。ＩＳＵ-3927 によって引き起こされ
る病変は、 7ＤＰＩで、軽度もしくは中度のもののみで
あった。
【０１９８】10ＤＰＩでは、ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 お
よびＩＳＵ-984によって引き起こされる肺病変は、 7Ｄ
ＰＩでのものと同様ではあるが、若干重篤性を増してい
る。非プラーク精製ＩＳＵ-12 を感染させたブタのみが
軽い脳炎および心筋炎を発病している。10ＤＰＩでは、
ＩＳＵ-3927 によって引き起こされた病変はほぼ治まっ
ている。
【０１９９】21ＤＰＩでは、ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 お
よびＩＳＵ-984によって引き起こされる心筋炎が軽いも
のであるのに対して、非プラーク精製ＩＳＵ-12 によっ
て引き起こされる心筋炎は重篤である。非プラーク精製
ＩＳＵ-12 を感染させたブタのみが21ＤＰＩで軽い脳炎
を発病する。
【０２００】28ＤＰＩでは、非プラーク精製ＩＳＵ-12
およびＩＳＵ-22 を感染させたブタにおいては、肺の病
変は依然として軽度である。これらの単離体はまた、28
ＤＰＩで重篤な心筋炎を引き起こす。しかしながら、Ｉ
ＳＵ-12 、ＩＳＵ-984およびＩＳＵ-3927 によって生じ
る肺の病変は、28ＤＰＩではほぼ治まっている。
【０２０１】36ＤＰＩでは、全ての病変は本質的に治ま
っている。36ＤＰＩに、 1群当り 1匹のブタを試験し
た。 例 VI イン・ビボでの交差中和［cross-neutralization］研究
を行なった。最初に、ＣＤＣＤブタの鼻腔内にＩＳＵ-1
2 、ＩＳＵ-22 、ＩＳＵ-984およびＩＳＵ-3927 から選
択される単離体を接種し、 4週間後、これらのブタにＩ
ＳＵ-12 を抗原投与した。ＩＳＵ-12 を用いる抗原投与
の 8ＤＰＩ後、肺病変および他の疾患の症状を検査し
た。対照ブタはＩＳＵ-12 を抗原投与したのみである。
結果を下記表13に示す。
【０２０２】下記表13に示す病理結果は、上記表１に示
した重篤性と同一のスケールに基づくものである。下記
表13において、「Int. thick. 」は組織間腔肥大を、
「alt.exud.」は肺胞滲出を、並びに「encephal. 」は
脳炎を意味する。
【０２０３】
【表１３】 上記表13中のデータは、ＩＳＵ-12 が、ＩＳＵ-12 によ
って惹起される疾患の症状のほとんどからブタを守るこ
とを示している。ＩＳＵ-984は、公知の PRRSVウイルス
の最も毒性の高い株の中の 1種であるＩＳＵ-12 によっ
て惹起される PRRS の幾つかの症状および臨床的徴候に
対する保護を与える。
【０２０４】しかしながら、PRRSウイルスのアイオワ株
の穏やかな病原変種であるＩＳＵ-3927 は、生ワクチン
として調べられた単離体のうちで、続くＩＳＵ-12 での
抗原投与に対する最も高い保護を与える。したがって、
ＩＳＵ-3927 は、生ワクチンとしての使用に商業的な見
込みがある。 例 VII ＣＤＣＤブタ10匹の群を、下記表14に列挙される PRRSV
のアイオワ株の単離体で、もしくは対照としての未感染
ＰＳＰ-36 細胞で感染させた。下記表14に列挙される各
ウイルス単離体の105 ＴＣＩＤ50を鼻腔内に抗原投与し
たときには、これらのブタは 5週齢であった。平均肉眼
視的肺病変評点の統計的有意性の指標として、標準偏差
（ＳＤ）が与えられる。
【０２０５】
【表１４】 肉眼視的肺病変評点の統計的な比較は、下記表15に示し
た。
【０２０６】
【表１５】 加えて、ブタの各群を、上述の臨床呼吸器評価システム
（下記表16の「臨床学的評価手段」を参照）によって、
呼吸困難について試験した。「肉眼視評点」は上述の肉
眼視的肺病変評点を述べている。「脳炎」、「心筋炎」
および「鼻炎」は、それぞれ、各群において、脳炎、心
筋炎および鼻炎の病変を示すブタの数を述べている。
「顕微鏡視的評点」は、以下のスケールに基づき、肺組
織における組織間腔肺炎の顕微鏡視的病変の評価および
比較に用いられる評点を述べている。
【０２０７】0 ＝疾患なし；正常肺組織 1 ＝軽度の多病巣性顕微鏡視的病変 2 ＝軽度のび慢性顕微鏡視的病変 3 ＝中度の多病巣性顕微鏡視的病変 4 ＝中度のび慢性顕微鏡視的病変 5 ＝重度の多病巣性顕微鏡視的病変 6 ＝重度のび慢性顕微鏡視的病変 顕微鏡視的病変は、肉眼視的病変を示さない組織におい
て観察されることがある。このため、「顕微鏡視的評
点」は、肉眼視的病変、呼吸困難、熱等に加えて、これ
らの単離体の病原性の評価および比較のさらなる手段を
提供する。
【０２０８】
【表１６】 例 VIII ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-22 、ＩＳＵ-55 、ＩＳＵ-79 、Ｉ
ＳＵ-1894 およびＩＳＵ-3927 の各々を感染させたＰＳ
Ｐ-36 細胞からのｍＲＮＡを単離し、 1.5％アガロース
ゲル上で分離してサブゲノムｍＲＮＡをさらに分離し
た。 2群の移動パターンを観測した。
【０２０９】群Ｉには、単離体ＩＳＵ-12 、ＩＳＵ-189
4 、ＩＳＵ-3927 および、恐らく、ＩＳＵ-51 が含まれ
る。ＩＳＵ-12 のノーザンブロットを図32に、またＩＳ
Ｕ-1894 、ＩＳＵ-3927 およびＩＳＵ-51 のノーザンブ
ロットを図33に示す。レリースタッド［Lelystad］ウイ
ルスのように、それらの単離体の各々に（図32および33
において、 1− 7と名付けられている） 7種のサブゲノ
ムｍＲＮＡが見出された。サブゲノムｍＲＮＡ（ＳｇＲ
ＮＡ）のサイズは、レリースタッドウイルスのものと同
様である。
【０２１０】群IIには、単離体ＩＳＵ-22 、ＩＳＵ-55
およびＩＳＵ-79 が含まれる。これらの単離体の各々
は、 7種の代わりに、 9種のＳｇＲＮＡを有している。
群IIのＳｇＲＮＡ 1、 2、 3、 6および 7は群Ｉのもの
と同一であるが、群ＩのＳｇＲＮＡ 3および 6の間に、
図33において矢印で示される 2種のさらなるＳｇＲＮＡ
が見出された。
【０２１１】予備試験の結果は、恐らくＰＳＰ-36 中の
ＩＳＵ-12 は除いて、群IIのウイルスは群Ｉの単離体よ
りも増殖し得るであろうことを示している。しかしなが
ら、群IIの単離体と比較して、ＩＳＵ-12 の増殖が劣る
場合もあり得る。 例 VIII ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）
変性生ワクチンの有効性の研究を、 3週齢 PRRSV血清陰
性［PRRSV-seronegative］ＳＰＦブタにおいて行なっ
た。このワクチンは、 2ｍｌ投与量当りプラーク精製Ｐ
ＲＲＳＶ ＩＳＵ-12 （アイオワ株）105.8 ＴＣＩＤ50
からなる。 9匹のブタには鼻腔内投与（ＩＮ）により単
一ワクチン投与量を与え、7 匹のブタには筋肉内投与に
より単一ワクチン投与量を与え、 9匹のブタを非ワクチ
ン接種抗原投与対照（ＮＶ／ＣＨＡＬＬ）として用い
た。ワクチン接種後35日目に、ワクチン接種および対照
に抗原投与し、抗原投与後10日目に肉眼視的肺病変（冒
された肺の割合）を評価した。ブタの各群に対する平均
肉眼視的肺病変は、図34における各柱の上部の数字によ
って示される。両ワクチン接種群は、非ワクチン接種対
照よりも有意に低い（ｐ＜0.01）肉眼視的肺病変評点を
示した。ワクチン接種群の間には、評点に有意の差は見
出されなかった。ＩＳＵ-12 ＰＲＲＳＶワクチンは、10
5.8 ＴＣＩＤ50投与量で、 3週齢ブタにおいて有効であ
ることが立証された。 他の観察 ＩＳＵ-12 ウイルスは、クロロホルム処理に感受性を有
するが、エンベロープで覆われている。ＩＳＵ-12 の複
製は、5-ブロモデオキシウリジン処理に耐える。したが
って、ＩＳＵ-12 はＤＮＡウイルスではない。ＩＳＵ-1
2 は血球凝集活性を欠損している。
【０２１２】上述の教示に照らして、この発明の多くの
変形および変種が可能であることは明らかである。した
がって、特許請求の範囲内において、この発明がここに
特定して記載されているものとは別の方法で実施し得る
ことは理解されるべきである。
【０２１３】
【配列表】配列番号：1 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 CGGCCGTGTG GTTCTCGCCA AT 22 配列番号：2 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 CCCCATTTCC CTCTAGCGAC TG 22 配列番号：3 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 GCCGCGGAAC CATCAAGCAC 20 配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 CAACTTGACG CTATGTGAGC 20 配列番号：5 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 GCGGTCTGGA TTGACGACAG 20 配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 GACTGCTAGG GCTTCTGCAC 20 配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 GCCATTCAGC TCACATAGCG 20 配列番号：8 配列の長さ：1938 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列の特徴 1 - 255 CDS 239 - 901 CDS 1403 - 1771 CDS 889 - 1410 CDS 配列 ＧＧＣ ＡＣＧ ＡＧＣ ＴＴＴ ＧＣＴ ＧＴＣ ＣＴＣ ＣＡＡ ＧＡＣ
ＡＴＣ ＡＧＴ ＴＧＣ ＣＴＴ ＡＧＧ ＣＡＴ ＣＧＣ ４８ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｒｇ １ ５
１０ １５ ＡＡＣ ＴＣＧ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＣＧ ＡＴＴ ＣＧＣ ＡＡＡ
ＧＴＣ ＣＣＴ ＣＡＧ ＴＧＣ ＣＧＣ ＡＣＧ ＧＣＧ ９６ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｌａ ２０ ２５
３０ ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＣＡ ＣＣＣ ＧＴＧ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＴＣ
ＡＣＡ ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＴＴ ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＡＧ １４４ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｕ ３５ ４０
４５ ＡＡＴ ＴＡＴ ＴＴＧ ＣＡＴ ＴＣＣ ＴＣＴ ＧＡＴ ＣＴＴ ＣＴＣ
ＡＴＧ ＣＴＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＴＧＣ ＣＴＴ ＴＴＣ １９２ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ５０ ５５
６０ ＴＡＴ ＧＣＴ ＴＣＴ ＧＡＧ ＡＴＧ ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＡＧ ＧＧＡ
ＴＴＴ ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＴＡ ＴＴＴ ＧＧＣ ＡＡＴ ２４０ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ ６５ ７０
７５ ８０ ＧＴＧ ＴＣＡ ＧＧＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴ ＴＴＴＴＧ
ＣＧＡＴＴ ＣＴＧＴＴＧＧＣＡＡ ＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴ ２９５ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈｅ
８５
ＴＴＡＡＧＴＡＴＧＴ ＴＧＧＧＧＡＡＡＴＧ ＣＴＴＧＡＣＣＧＣＧ ＧＧＣ
ＴＧＴＴＧＣＴ ＣＧＣＡＡＴＴＧＣＴ ＴＴＴＴＴＴＧＴＧＧ ３５５ ＴＧＴＡＴＣＧＴＧＣ ＣＧＴＣＴＴＧＴＴＴ ＴＧＴＴＧＣＧＣＴＣ ＧＴＣ
ＡＧＣＧＣＣＡ ＡＣＧＧＧＡＡＣＡＧ ＣＧＧＣＴＣＡＡＡＴ ４１５ ＴＴＡＣＡＧＣＴＧＡ ＴＴＴＡＣＡＡＣＴＴ ＧＡＣＧＣＴＡＴＧＴ ＧＡＧ
ＣＴＧＡＡＴＧ ＧＣＡＣＡＧＡＴＴＧ ＧＣＴＡＧＣＴＡＡＴ ４７５ ＡＡＡＴＴＴＧＡＣＴ ＧＧＧＣＡＧＴＧＧＡ ＧＴＧＴＴＴＴＧＴＣ ＡＴＴ
ＴＴＴＣＣＴＧ ＴＧＴＴＧＡＣＴＣＡ ＣＡＴＴＧＴＣＴＣＴ ５３５ ＴＡＴＧＧＴＧＣＣＣ ＴＣＡＣＴＡＣＴＡＧ ＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴ ＧＡＣ
ＡＣＡＧＴＣＧ ＧＴＣＴＧＧＴＣＡＣ ＴＧＴＧＴＣＴＡＣＣ ５９５ ＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧ ＴＴＣＡＣＧＧＧＣＧ ＧＴＡＴＧＴＴＣＴＧ ＡＧＴ
ＡＧＣＡＴＧＴ ＡＣＧＣＧＧＴＣＴＧ ＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴ ６５５ ＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴ ＧＣＴＴＣＧＴＣＡＴ ＴＡＧＧＣＴＴＧＣＧ ＡＡＧ
ＡＡＴＴＧＣＡ ＴＧＴＣＣＴＧＧＣＧ ＣＴＡＣＴＣＡＴＧＴ ７１５ ＡＣＣＡＧＡＴＡＴＡ ＣＣＡＡＣＴＴＴＣＴ ＴＣＴＧＧＡＣＡＣＴ ＡＡＧ
ＧＧＣＡＧＡＣ ＴＣＴＡＴＣＧＴＴＧ ＧＣＧＧＴＣＧＣＣＴ ７７５ ＧＴＣＡＴＣＡＴＡＧ ＡＧＡＡＡＡＧＧＧＧ ＣＡＡＡＧＴＴＧＡＧ ＧＴＣ
ＧＡＡＧＧＴＣ ＡＣＣＴＧＡＴＣＧＡ ＣＣＴＣＡＡＡＡＧＡ ８３５ ＧＴＴＧＴＧＣＴＴＧ ＡＴＧＧＴＴＣＣＧＣ ＧＧＣＴＡＣＣＣＣＴ ＧＴＡ
ＡＣＣＡＧＡＧ ＴＴＴＣＡＧＣＧＧＡ ＡＣＡ ＡＴＧ ８９１
■■滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔氓■■罷滔滔■滔滔滔滔滔
滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔滔■■
１ ＧＡＧ ＴＣＧ ＴＣＣ ＴＴＡ ＧＡＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＡＴ
ＧＡＴ ＡＧＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＣＣＡ ＣＡＡ ＡＡＧ ９３９ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｙｓ ５ １０
１５ ＧＴＧ ＣＴＣ ＴＴＧ ＧＣＧ ＴＴＴ ＴＣＴ ＡＴＴ ＡＣＣ ＴＡＣ
ＡＣＧ ＣＣＡ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＡＴ ＧＣＣ ９８７ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ
Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｌａ ２０ ２５
３０ ＣＴＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＡＧＴ ＣＧＣ ＧＧＣ ＣＧＡ ＣＴＧ ＣＴＡ
ＧＧＧ ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＡＣ ＣＴＴ ＴＴＧ ＧＴＣ １０３５ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ ３５ ４０
４５ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＧＴ ＧＣＴ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＧＧＧ
ＴＡＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＴＴＣ ＧＴＧ ＣＡＣ ＴＴＴ １０８３ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｐｈｅ ５０ ５５
６０ ６５ ＣＡＧ ＡＧＴ ＡＣＡ ＡＡＴ ＡＡＧ ＧＴＣ ＧＣＧ ＣＴＣ ＡＣＴ
ＡＴＧ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＴＡ ＧＴＴ ＧＣＡ ＣＴＣ １１３１ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ ７０
７５ ８０ ＣＴＴ ＴＧＧ ＧＧＧ ＧＴＧ ＴＡＣ ＴＣＡ ＧＣＣ ＡＴＡ ＧＡＡ
ＡＣＣ ＴＧＧ ＡＡＡ ＴＴＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＴＣＣ １１７９ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ ８５ ９０
９５ ＡＧＡ ＴＧＣ ＣＧＴ ＴＴＧ ＴＧＣ ＴＴＧ ＣＴＡ ＧＧＣ ＣＧＣ
ＡＡＧ ＴＡＣ ＡＴＴ ＣＴＧ ＧＣＣ ＣＣＴ ＧＣＣ １２２７ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ
Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ １００ １０５
１１０ ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＴＴ ＧＡＡ ＡＧＴ ＧＣＣ ＧＣＡ ＧＧＣ ＴＴＴ
ＣＡＴ ＣＣＧ ＡＴＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＡＡＴ ＧＡＴ １２７５ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ａｓｐ １１５ １２０
１２５ ＡＡＣ ＣＡＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＣ ＣＧＧ ＣＧＴ ＣＣＣ
ＧＧＣ ＴＣＣ ＡＣＴ ＡＣＧ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＧＣ １３２３ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｙ １３０ １３５
１４０ １４５ ＡＣＡ ＴＴＧ ＧＴＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＴＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＣＴＣ
ＧＴＧ ＴＴＧ ＧＧＴ ＧＧＣ ＡＧＡ ＡＡＡ ＧＣＴ １３７１ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｌａ １５０
１５５ １６０ ＧＴＴ ＡＡＡ ＣＡＧ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＡＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ
ＡＡＡ ＴＡＴ ＧＣＣ ＡＡＡ ＴＡＡＣＡＣＣＧＧＣ １４２０ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｌｙｓ １６５ １７０
ＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡ ＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡ ＧＧＧＧＧＡＴＧＧＣ ＣＡＧ
ＣＣＡＧＴＣＡ ＡＴＣＡＧＣＴＧＴＧ ＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧ １４８０ ＧＧＴＡＡＧＡＴＣＡ ＴＣＧＣＴＣＡＣＣＡ ＡＡＡＣＣＡＧＴＣＣ ＡＧＡ
ＧＧＣＡＡＧＧ ＧＡＣＣＧＧＧＡＡＡ ＧＡＡＡＡＡＴＡＡＧ １５４０ ＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣ ＣＧＧＡＧＡＡＧＣＣ ＣＣＡＴＴＴＣＣＣＴ ＣＴＡ
ＧＣＧＡＣＴＧ ＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴ ＣＡＧＡＣＡＴＣＡＣ １６００ ＴＴＴＡＣＣＣＣＴＡ ＧＴＧＡＧＣＧＴＣＡ ＡＴＴＧＴＧＴＣＴＧ ＴＣＧ
ＴＣＡＡＴＣＣ ＡＧＡＣＣＧＣＣＴＴ ＴＡＡＴＣＡＡＧＧＣ １６６０ ＧＣＴＧＧＧＡＣＴＴ ＧＣＡＣＣＣＴＧＴＣ ＡＧＡＴＴＣＡＧＧＧ ＡＧＧ
ＡＴＡＡＧＴＴ ＡＣＡＣＴＧＴＧＧＡ ＧＴＴＴＡＧＴＴＴＧ １７２０ ＣＣＴＡＣＧＣＡＴＣ ＡＴＡＣＴＧＴＧＣＧ ＣＣＴＧＡＴＣＣＧＣ ＧＴＣ
ＡＣＡＧＣＡＴ ＣＡＣＣＣＴＣＡＧＣ ＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴ １７８０ ＧＧＣＡＴＴＣＴＴＧ ＡＧＧＣＡＴＣＣＣＡ ＧＴＧＴＴＴＧＡＡＴ ＴＧＧ
ＡＡＧＡＡＴＧ ＣＧＴＧＧＴＧＡＡＴ ＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴ １８４０ ＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣ ＣＴＣＴＡＡＧＴＣＡ ＣＣＴＡＴＴＣＡＡＴ ＴＡＧ
ＧＧＣＧＡＣＣ ＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴ ＡＡＧＡＴＴＴＡＡＴ １９００ ＴＧＧＣＧＡＧＡＡＣ ＣＡＣＡＣＧＧＣＣＧ ＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡ ＡＡＡ
ＡＡＡＡＡ １９３８ 配列番号：9 配列の長さ：85 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Gly Thr Ser Phe Ala Val Leu Gln Asp Ile Ser Cys Leu Arg His Arg 1 5 10 15 Asn Ser Ala Ser Glu Ala Ile Arg Lys Val Pro Gln Cys Arg Thr Ala 20 25 30 Ile Gly Thr Pro Val Tyr Ile Thr Val Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu 35 40 45 Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe 20 25 30 Ile Gly Thr Pro Val Tyr Ile Thr Val Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu 35 40 45 Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe 50 55 60 Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn 65 70 75 80 Val Ser Gly Ile Phe 85 配列番号：10 配列の長さ：221 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Cys Gln Ala Ser Phe Ser Leu Ser Phe Cys Asp Ser Val Gly Asn 1 5 10 15 Leu Asn Val Leu Ser Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys 20 25 30 Ser Gln Leu Leu Phe Leu Trp Cys Ile Val Pro Ser Cys Phe Val Ala 35 40 45 Leu Val Ser Ala Asn Gly Asn Ser Gly Ser Asn Leu Gln Leu Ile Tyr 50 55 60 Asn Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys 65 70 75 80 Phe Asp Trp Ala Val Glu Cys Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His 85 90 95 Ile Val Ser Tyr Gly Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val 100 105 110 Gly Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val 115 120 125 Leu Ser Ser Met Tyr Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe 130 135 140 Val Ile Arg Leu Ala Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr 145 150 155 160 Arg Tyr Thr Asn Phe Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp 165 170 175 Arg Ser Pro Val Ile Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly 180 185 190 His Leu Ile Asp Leu Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr 195 200 205 Pro Val Thr Arg Val Ser Ala Glu Gln Trp Ser Arg Pro 210 215 220 配列番号：11 配列の長さ：174 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Glu Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gln 1 5 10 15 Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile Tyr 20 25 30 Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu 35 40 45 Val Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Val His 50 55 60 Phe Gln Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala 65 70 75 80 Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr 85 90 95 Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro 100 105 110 Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Gly Phe His Pro Ile Ala Ala Asn 115 120 125 Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn 130 135 140 Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys 145 150 155 160 Ala Val Lys Gln Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys 165 170 配列番号：12 配列の長さ：123 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Pro Asn Asn Thr Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala His 20 25 30 Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys 35 40 45 Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg 50 55 60 His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln 65 70 75 80 Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly 85 90 95 Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val 100 105 110 Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala 115 120 配列番号：13 配列の長さ：667 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 AATGTGTCAG GCATCTTTTA GCCTGTCTTT TTGCGATTCT GTTGGCAATT TGAATGTTTT 60 AAGTATGTTG GGGAAATGCT TGACCGCGGG CTGTTGCTCG CAATTGCTTT TTTTGTGGTG 120 TATCGTGCCG TCTTGTTTTG TTGCGCTCGT CAGCGCCAAC GGGAACAGCG GCTCAAATTT 180 ACAGCTGATT TACAACTTGA CGCTATGTGA GCTGAATGGC ACAGATTGGC TAGCTAATAA 240 ATTTGACTGG GCAGTGGAGT GTTTTGTCAT TTTTCCTGTG TTGACTCACA TTGTCTCTTA 300 TGGTGCCCTC ACTACTAGCC ATTTCCTTGA CACAGTCGGT CTGGTCACTG TGTCTACCGC 360 TGGGTTTGTT CACGGGCGGT ATGTTCTGAG TAGCATGTAC GCGGTCTGTG CCCTGGCTGC 420 GTTGATTTGC TTCGTCATTA GGCTTGCGAA GAATTGCATG TCCTGGCGCT ACTCATGTAC 480 CAGATATACC AACTTTCTTC TGGACACTAA GGGCAGACTC TATCGTTGGC GGTCGCCTGT 540 CATCATAGAG AAAAGGGGCA AAGTTGAGGT CGAAGGTCAC CTGATCGACC TCAAAAGAGT 600 TGTGCTTGAT GGTTCCGCGG CTACCCCTGT AACCAGAGTT TCAGCGGAAC AATGGAGTCG 660 TCCTTAG 667 配列番号：14 配列の長さ：605 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：レリスタッド 配列 ATGAGATGTT CTCACAAATT GGGGCGTTTC TTGACTCCGC ACTCTTGCTT CTGGTGGCTT 60 TTTTGCTGTG TACCGGCTTG TCCTGGTCCT TTGCCGATGG CAACGGCGAC AGCTCGACAT 120 ACCAATACAT ATATAACTTG ACGATATGCG AGCTGAATGG GACCGACTGG TTGTCCAGCC 180 ATTTTGGTTG GGCAGTCGAG ACCTTTGTGC TTTACCCGGT TGCCACTCAT ATCCTCTCAC 240 TGGGTTTTCT CACAACAAGC CATTTTTTTG ACGCGCTCGG TCTCGGCGCT GTATCCACTG 300 CAGGATTTGT TGGCGGGCGG TACGTACTCT GCAGCGTCTA CGGCGCTTGT GCTTTCGCAG 360 CGTTCGTATG TTTTGTCATC CGTGCTGCTA AAAATTGCAT GGCCTGCCGC TATGCCCGTA 420 CCCGGTTTAC CAACTTCATT GTGGACGACC GGGGGAGAGT TCATCGATGG AAGTCTCCAA 480 TAGTGGTAGA AAAATTGGGC AAAGCCGAAG TCGATGGCAA CCTCGTCACC ATCAAACATG 540 TCGTCCTCGA AGGGGTTAAA GCTCAACCCT TGACGAGGAC TTCGGCTGAG CAATGGGAGG 600 CCTAG 605 配列番号：15 配列の長さ：526 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 AATGGAGTCG TCCTTAGATG ACTTCTGTCA TGATAGCACG GCTCCACAAA AGGTGCTCTT 60 GGCGTTTTCT ATTACCTACA CGCCAGTGAT GATATATGCC CTAAAGGTGA GTCGCGGCCG 120 ACTGCTAGGG CTTCTGCACC TTTTGGTCTT CCTGAATTGT GCTTTCACCT TCGGGTACAT 180 GACATTCGTG CACTTTCAGA GTACAAATAA GGTCGCGCTC ACTATGGGAG CAGTAGTTGC 240 ACTCCTTTGG GGGGTGTACT CAGCCATAGA AACCTGGAAA TTCATCACCT CCAGATGCCG 300 TTTGTGCTTG CTAGGCCGCA AGTACATTCT GGCCCCTGCC CACCACGTTG AAAGTGCCGC 360 AGGCTTTCAT CCGATTGCGG CAAATGATAA CCACGCATTT GTCGTCCGGC GTCCCGGCTC 420 CACTACGGTC AACGGCACAT TGGTGCCCGG GTTAAAAAGC CTCGTGTTGG GTGGCAGAAA 480 AGCTGTTAAA CAGGGAGTGG TAAACCTTGT TAAATATGCC AAATAA 526 配列番号：16 配列の長さ：522 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：レリスタッド 配列 ATGGGAGGCC TAGACGATTT TTGCAACGAT CCTATCGCCG CACAAAAGCT CGTGCTAGCC 60 TTTAGCATCA CATACACACC TATAATGATA TACGCCCTTA AGGTGTCACG CGGCCGACTC 120 CTGGGGCTGT TGCACATCCT AATATTTCTG AACTGTTCCT TTACATTCGG ATACATGACA 180 TATGTGCATT TTCAATCCAC CAACCGTGTC GCACTTACCC TGGGGGCTGT TGTCGCCCTT 240 CTGTGGGGTG TTTACAGCTT CACAGAGTCA TGGAAGTTTA TCACTTCCAG ATGCAGATTG 300 TGTTGCCTTG GCCGGCGATA CATTCTGGCC CCTGCCCATC ACGTAGAAAG TGCTGCAGGT 360 CTCCATTCAA TCTCAGCGTC TGGTAACCGA GCATACGCTG TGAGAAAGCC CGGACTAACA 420 TCAGTGAACG GCACTCTAGT ACCAGGACTT CGGAGCCTCG TGCTGGGCGG CAAACGAGCT 480 GTTAAACGAG GAGTGGTTAA CCTCGTCAAG TATGGCCGGT AA 522 配列番号：17 配列の長さ：372 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：レリスタッド 配列 ATGCCAAATA ACACCGGCAA GCAGCAGAAG AGAAAGAAGG GGGATGGCCA GCCAGTCAAT 60 CAGCTGTGCC AGATGCTGGG TAAGATCATC GCTCACCAAA ACCAGTCCAG AGGCAAGGGA 120 CCGGGAAAGA AAAATAAGAA GAAAAACCCG GAGAAGCCCC ATTTCCCTCT AGCGACTGAA 180 GATGATGTCA GACATCACTT TACCCCTAGT GAGCGTCAAT TGTGTCTGTC GTCAATCCAG 240 ACCGCCTTTA ATCAAGGCGC TGGGACTTGC ACCCTGTCAG ATTCAGGGAG GATAAGTTAC 300 ACTGTGGAGT TTAGTTTGCC TACGCATCAT ACTGTGCGCC TGATCCGCGT CACAGCATCA 360 CCCTCAGCAT GA 372 配列番号：18 配列の長さ：387 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 ATGGCCGGTA AAAACCAGAG CCAGAAGAAA AAGAAAAGTA CAGCTCCGAT GGGGAATGGC 60 CAGCCAGTCA ATCAACTGTG CCAGTTGCTG GGTGCAATGA TAAAGTCCCA GCGCCAGCAA 120 CCTAGGGGAG GACAGGCCAA AAAGAAAAAG CCTGAGAAGC CACATTTTCC CCTGGCTGCT 180 CAGCCAGTCA ATCAACTGTG CCAGTTGCTG GGTGCAATGA TAAAGTCCCA GCGCCAGCAA 120 CCTAGGGGAG GACAGGCCAA AAAGAAAAAG CCTGAGAAGC CACATTTTCC CCTGGCTGCT 180 GAAGATGACA TCCGGCACCA CCTCACCCAG ACTGAACGCT CCCTCTGCTT GCAATCGATC 240 CAGACGGCTT TCAATCAAGG CGCAGGAACT GCGTCGCTTT CATCCAGCGG GAAGGTCAGT 300 TTTCAGGTTG AGTTTATGCT GCCGGTTGCT CATACAGTGC GCCTGATTCG CGTGACTTCT 360 ACATCCGCCA GTCAGGGTGC AAGTTAA 387 配列番号：19 配列の長さ：164 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 TGGGCTGGCA TTCTTGAGGC ATCCCAGTGT TTGAATTGGA AGAATGCGTG GTGAATGGCA 60 CTGATTGACA TTGTGCCTCT AAGTCACCTA TTCAATTAGG GCGACCGTGT GGGGGTAAGA 120 TTTAATTGGC GAGAACCACA CGGCCGAAAT TAAAAAAAAA AAAA 164 配列番号：20 配列の長さ：127 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：cDNA 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：レリスタッド 配列 TTTGACAGTC AGGTGAATGG CCGCGATTGG CGTGTGGCCT CTGAGTCACC TATTCAATTA 60 GGGCGATCAC ATGGGGGTCA TACTTAATCA GGCAGGAACC ATGTGACCGA AATTAAAAAA 120 AAAAAAA 127 配列番号：21 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：レリスタッド 配列 CTCGTCAAGT ATGGCCGGT 19 配列番号：22 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 配列 GCCATTCGCC TGACTGTCA 19 配列番号：23 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 配列 TTGACGAGGA CTTCGGCTG 19 配列番号：24 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 配列 GCTCTACCTG CAATTCTGTG 20 配列番号：25 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 配列 GTGTATAGGA CCGGCAACAG 20 配列番号：26 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 GGGGATCCGG TATTTGGCAA TGTGTC 26 配列番号：27 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 GGTGTTTTCC ACGAGAACCG CTTAAGGG 28 配列番号：28 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 GGGGATCCAG AGTTTCAGCG G 21 配列番号：29 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 CAGTTAGTCG ACACGGTCTT AAGGG 25 配列番号：30 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 GGGGATCCTT GTTAAATATG CC 22 配列番号：31 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：DNA （合成） 起源 生物名：ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス 株名：アイオワ 個体名：ISU-12 配列 CTTACGCACC ACTTAAGGG 19
【図面の簡単な説明】
【図１】改変生ワクチン生産フロ−チャ−ト。
【図２】不活性化ワクチン生産工程のフロ−チャ−ト。
【図３】サブユニットワクチン生産工程の概要を表わす
フロ−チャ−ト。
【図４】遺伝子工学ワクチン生産工程の概要を表わすフ
ロ−チャ−ト。
【図５】PRRSV のアイオワ株に感染したブタから単離さ
れた病原体のサンプルによって感染させた通常ブタの、
感染後10日の肺の組織学的切片を示す写真。
【図６】PRRSV のアイオワ株に感染したブタから単離さ
れた病原体のサンプルによって感染させた通常ブタの、
感染後10日の肺の組織学的切片を示す写真。
【図７】PRRSV のアイオワ株に感染したブタから単離さ
れた病原体のサンプルによって感染させたノトバイオ−
トブタの、感染後 9日の肺の組織学的切片を示す写真。
【図８】PRRSV のアイオワ株に感染したブタから単離さ
れた病原体のサンプルによって感染させたノトバイオ−
トブタの、感染後35日の心臓病巣の組織学的切片を示す
写真。
【図９】PRRSV のアイオワ株に感染したブタから単離さ
れた病原体（肺の濾過サンプル）に感染させてから 9日
後のノトバイオ−トブタから調製された大規模な合胞体
があらわれている気官支ー肺胞洗浄培養を示す写真（IS
U-12; 例１、セクション（II）（c)、参照）。
【図１０】PRRSV のアイオワ株に関連した病原体で感染
させたブタの肺胞マクロファ−ジ培養中に見られる、短
い表面スピクラを持った直径約70ｎｍのエンベロ−プウ
イルス粒子の電子顕微鏡写真。
【図１１】PRRSV のアイオワ株に感染したブタの肺胞マ
クロファ−ジ培養中に見られる、抗体で被覆された約80
- 320ｎｍのサイズの多形エンベロ−ブウイルス粒子の
電子顕微鏡写真。
【図１２】（Ａ）は未感染のブタ肺胞マクロファ−ジ
（SAM)培養物、（Ｂ）は ISU-12 に感染した SAM培養物
中の CPE、および（Ｃ）は ISU-12 に感染した SAM培養
物中のIFA を示す写真（例II参照）。
【図１３】（Ａ）は未感染のPSP-36の細胞培養物、
（Ｂ）は ISU-12 で感染させた細胞中のCPE （4 DPI
）、（Ｃ）はISU-12で感染させた細胞中の CPE（5 DPI
）および（Ｄ）は ISU-984（PRRSV のアイオワ株を表
わす第２のウイルス単離体）で感染させた細胞中の CPE
を示す写真。
【図１４】（Ａ）は未感染の PSP-36 細胞、（Ｂ）は I
SU-12 で感染させ、回復期血清で染色した細胞中の IFA
（2.5 DPI ）、（Ｃ）は ISU-12 で感染させ、抗 PRRSV
ポリクローナル抗体で染色した細胞中の IFA（2.5 DPI
）および（Ｄ）は ISU-12で感染させ、抗 PRRSVモノク
ローナル抗体で染色した細胞中の IFAを示す写真。
【図１５】PSP-36細胞で繁殖させたISU-12のタンパク
の、放射性免疫沈殿（RIP ）によって測定したプロフイ
−ルであって、レーン 1および 2は抗 PRRSVポリクロー
ナル血清 (1)および回復期血清 (2)で免疫沈殿させた偽
感染 PSP-36 細胞；レーン 3および 4は抗 PRRSVポリク
ローナル血清 (3)および回復期血清 (4)で免疫沈殿させ
たウイルス感染 PSP-36 細胞を示す写真。
【図１６】PRRSを惹起する病原体のcDNAλライブラリ構
築の一般的手法を示すフローチャート。
【図１７】PRRSV (ISU-12)のアイオワ株に関連した病原
体の真性 cDNA クロ−ンを差別化ハイブリゼ−ションに
よって同定するための一般的手法を示すフローチャー
ト。
【図１８】（Ａ）は ISU-12 のヌクレオチド配列におけ
るオープンリーディングフレーム（ORF ）を示し、
（Ｂ）はサブゲノム mRNA であって、囲み Lはリーダー
配列を、および (A)n はゲノムの3'末端でのポリ（Ａ）
テイルをそれぞれ示し、並びに（Ｃ）は ISU-12 の3'末
端ヌクレオチド配列を得るために用いられるλ cDNA ク
ローンであって、配列が決定された領域を黒塗りのバー
で、配列が決定されていない領域を斜線でそれぞれ示す
図。
【図１９Ａ】PRRSV のアイオワ株に関連した病原体のゲ
ノムの1938ｂｐの3'末端配列を示す図。
【図１９Ｂ】図19Ａに続いて、 PRRSVのアイオワ株に関
連した病原体のゲノムの1938ｂｐの3'末端配列を示す
図。
【図１９Ｃ】図19Ｂに続いて、 PRRSVのアイオワ株に関
連した病原体のゲノムの1938ｂｐの3'末端配列を示す
図。
【図１９Ｄ】図19Ｃに続いて、 PRRSVのアイオワ株に関
連した病原体のゲノムの1938ｂｐの3'末端配列を示す
図。
【図２０Ａ】図１９の、ヌクレオチド配列の下に示され
るＤＮＡ配列によってコ−ドされている演繹アミノ酸配
列を示す図。
【図２０Ｂ】図20Ａに続いて、図１９のヌクレオチド配
列の下に示されるＤＮＡ配列によってコ−ドされている
演繹アミノ酸配列を示す図。
【図２１】オ−プンリ−デイングフレ−ム-5 (ORF-5)に
ついて、PRRSV （ISU-12) のアイオワ株に関連した病原
体とレリスタッドウイルスのヌクレオチド配列を比較す
る図。
【図２２】レリスタッドウイルスのORF-6 とISU-12ウイ
ルスのORF-6 ヌクレオチド配列を比較する図。
【図２３】レリスタッドウイルスのORF-7 とISU-12ウイ
ルスのORF-7 ヌクレオチド配列を比較する図。
【図２４】レリスタッドウイルスとISU-12ウイルスの3'
非翻訳ヌクレオチド配列を比較する図。
【図２５】未感染のTrichoplusian 卵細胞ホモジネ−ト
（HI-FIVE 細胞、Invitrogen, San Diego,California)
を示す写真。
【図２６】図２６は、細胞毒性効果を示しているISU-12
ORF-6遺伝子を含む組換えバキュロウイルスで感染させ
たHI-FIVE 細胞を示す写真。
【図２７】細胞毒性効果を示しているISU-12 ORF-7遺伝
子を含む組換えバキュロウイルスで感染させたHI-FIVE
細胞を示す写真。
【図２８】ISU-12に対するブタの抗血清で染め、その後
蛍光体結合抗ブタIgG で染めたISU-12 ORF-6遺伝子を含
む組換えバキュロウイルスで感染させたHI-FIVE 細胞を
示す写真（ここで、その昆虫細胞はISU-12 ORF-6遺伝子
でコ−ドされた組換え蛋白を生成している）。
【図２９】ISU-12に対するブタの抗血清で染め、その後
蛍光体結合抗ブタIgG で染めたISU-12 ORF-7遺伝子を含
む組換えバキュロウイルスで感染させたHI-FIVE 細胞を
示す写真（ここで、その昆虫細胞はISU-12 ORF-7遺伝子
でコ−ドされた組換え蛋白を生成している）。
【図３０】ISU-12特異プライマを使用したORF-5 （レ−
ンＥ）、ORF-6 （レ−ンＭ）、ORF-7 （レ−ンＮＰ）の
PCR 増幅の結果を示す写真（ここで、レ−ンSMは分子量
標準を含む）。
【図３１】BamHI, EcoRI制限酵素でプラスミドＤＮＡを
切断した後、ISU-12のゲノムのORF-5 （レ−ンＥ）、OR
F-6 （レ−ンＭ）、ORF-7 （レ−ンＮＰ）を含んでいる
組換えバキュロウイルス形質転換用ベクタ−pVL1393 の
発現結果を示す写真（レ−ンSMは分子量標準を含む）。
【図３２】ISU-12のｍＲＮＡのノ−ザレンブロットを示
す写真。
【図３３】ＡおよびＢは、PRRSV の他のアイオワ株（IS
U-22、ISU-55, ISU-79、ISU-1894, ISU-3927) 単離物か
ら採集したｍＲＮＡのノ−ザレンブロットを示す写真。
【図３４】本発明ワクチンの一つの具体例を鼻腔下（I
N) 、筋肉下(IM)、に投与した3-週齢、PRRSV セロネガ
チブ、特定病原性の無いブタ群（SRF ）および対照ブタ
群(NV/CHALL)の平均全肺病巣評点（病気に冒された肺の
パ−セント）の棒グラフ。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年５月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】改変生ワクチン生産フローチャート。
【図２】不活性化ワクチン生産工程のフローチャート。
【図３】サブユニットワクチン生産工程の概要を表わす
フローチャート。
【図４】遺伝子工学ワクチン生産工程の概要を表わすフ
ローチャート。
【図５】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単
離された病原体のサンプルによって感染させた通常ブタ
の、感染後１０日の肺の組織学的切片を示す顕微鏡写
真。
【図６】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単
離された病原体のサンプルによって感染させた通常ブタ
の、感染後１０日の肺の組織学的切片を示す顕微鏡写
真。
【図７】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単
離された病原体のサンプルによって感染させたノトバイ
オートブタの、感染後９日の肺の組織学的切片を示す顕
微鏡写真。
【図８】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単
離された病原体のサンプルによって感染させたノトバイ
オートブタの、感染後３５日の心臓病巣の組織学的切片
を示す顕微鏡写真。
【図９】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタから単
離された病原体（肺の▲ろ▼過サンプル）に感染させて
から９日後のノトバイオートブタから調製された大規模
な合胞体があらわれている気官支−肺胞洗浄培養を示す
顕微鏡写真（ＩＳＵ−１２；例１、セクション（ＩＩ）
（ｃ）、参照）。
【図１０】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に関連した病原体で
感染させたブタの肺胞マクロファージ培養中に見られ
る、短い表面スピクラを持った直径約７０ｎｍのエンベ
ロープウイルス粒子の電子顕微鏡写真。
【図１１】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に感染したブタの肺
胞マクロファージ培養中に見られる、抗体で被覆された
約８０−３２０ｎｍのサイズの多形エンベローブウイル
ス粒子の電子顕微鏡写真。
【図１２】（Ａ）は未感染のブタ肺胞マクロファージ
（ＳＡＭ）培養物、（Ｂ）はＩＳＵ−１２に感染したＳ
ＡＭ培養物中のＣＰＥ、および（Ｃ）はＩＳＵ−１２に
感染したＳＡＭ培養物中のＩＦＡを示す顕微鏡写真（例
ＩＩ参照）。
【図１３】（Ａ）は未感染のＰＳＰ−３６の細胞培養
物、（Ｂ）はＩＳＵ−１２で感染させた細胞中のＣＰＥ
（４ＤＰＩ）、（Ｃ）はＩＳＵ−１２で感染させた細胞
中のＣＰＥ（５ＤＰＩ）および（Ｄ）はＩＳＵ−９８４
（ＰＲＲＳＶのアイオワ株を表わす第２のウイルス単離
体）で感染させた細胞中のＣＰＥを示す顕微鏡写真。
【図１４】（Ａ）は未感染のＰＳＰ−３６細胞、（Ｂ）
はＩＳＵ−１２で感染させ、回復期血清で染色した細胞
中のＩＦＡ（２．５ＤＰＩ）、（Ｃ）はＩＳＵ−１２で
感染させ、抗ＰＲＲＳＶポリクローナル抗体で染色した
細胞中のＩＦＡ（２．５ＤＰＩ）および（Ｄ）はＩＳＵ
−１２で感染させ、抗ＰＲＲＳＶモノクローナル抗体で
染色した細胞中のＩＦＡを示す顕微鏡写真。
【図１５】ＰＳＰ−３６細胞で繁殖させたＩＳＵ−１２
のタンパクの、放射性免疫沈殿（ＲＩＰ）によって測定
したプロフイールであって、レーン１および２は抗ＰＲ
ＲＳＶポリクローナル血清（１）および回復期血清
（２）で免疫沈殿させた偽感染ＰＳＰ−３６細胞；レー
ン３および４は抗ＰＲＲＳＶポリクローナル血清（３）
および回復期血清（４）で免疫沈殿させたウイルス感染
ＰＳＰ−３６細胞を示す顕微鏡写真。
【図１６】ＰＲＲＳを惹起する病原体のｃＤＮＡλライ
ブラリ構築の一般的手法を示すフローチャート。
【図１７】ＰＲＲＳＶ（ＩＳＵ−１２）のアイオワ株に
関連した病原体の真性ｃＤＮＡクローンを差別化ハイブ
リゼーションによって同定するための一般的手法を示す
フローチャート。
【図１８】（Ａ）はＩＳＵ−１２のヌクレオチド配列に
おけるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示
し、（Ｂ）はサブゲノムｍＲＮＡであって、囲みＬはリ
ーダー配列を、および（Ａ）ｎはゲノムの３’末端での
ポリ（Ａ）テイルをそれぞれ示し、並びに（Ｃ）はＩＳ
Ｕ−１２の３’末端ヌクレオチド配列を得るために用い
られるλｃＤＮＡクローンであって、配列が決定された
領域を黒塗りのバーで、配列が決定されていない領域を
斜線でそれぞれ示す図。
【図１９Ａ】ＰＲＲＳＶのアイオワ株に関連した病原体
のゲノムの１９３８ｂＰの３’末端配列を示す図。
【図１９Ｂ】図１９Ａに続いて、ＰＲＲＳＶのアイオワ
株に関連した病原体のゲノムの１９３８ｂｐの３’末端
配列を示す図。
【図１９Ｃ】図１９Ｂに続いて、ＰＲＲＳＶのアイオワ
株に関連した病原体のゲノムの１９３８ｂｐの３’末端
配列を示す図。
【図１９Ｄ】図１９Ｃに続いて、ＰＲＲＳＶのアイオワ
株に関連した病原体のゲノムの１９３８ｂｐの３’末端
配列を示す図。
【図２０Ａ】図１９の、ヌクレオチド配列の下に示され
るＤＮＡ配列によってコードされている演繹アミノ酸配
列を示す図。
【図２０Ｂ】図２０Ａに続いて、図１９のヌクレオチド
配列の下に示されるＤＮＡ配列によってコードされてい
る演繹アミノ酸配列を示す図。
【図２１】オープンリーデイングフレーム−５（ＯＲＦ
−５）について、ＰＲＲＳＶ（ＩＳＵ−１２）のアイオ
ワ株に関連した病原体とレリスタッドウイルスのヌクレ
オチド配列を比較する図。
【図２２】レリスタッドウイルスのＯＲＦ−６とＩＳＵ
−１２ウイルスのＯＲＦ−６ヌクレオチド配列を比較す
る図。
【図２３】レリスタッドウイルスのＯＲＦ−７とＩＳＵ
−１２ウイルスのＯＲＦ−７ヌクレオチド配列を比較す
る図。
【図２４】レリスタッドウイルスとＩＳＵ−１２ウイル
スの３’非翻訳ヌクレオチド配列を比較する図。
【図２５】未感染のＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎ卵細胞
ホモジネート（ＨＩ−ＦＩＶＥ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を
示す顕微鏡写真。
【図２６】図２６は、細胞毒性効果を示しているＩＳＵ
−１２ ＯＲＦ−６遺伝子を含む組換えバキュロウイル
スで感染させたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す顕微鏡写真。
【図２７】細胞毒性効果を示しているＩＳＵ−１２ Ｏ
ＲＦ−７遺伝子を含む組換えバキュロウイルスで感染さ
せたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す顕微鏡写真。
【図２８】ＩＳＵ−１２に対するブタの抗血清で染め、
その後蛍光体結合抗ブタＩｇＧで染めたＩＳＵ−１２
ＯＲＦ−６遺伝子を含む組換えバキュロウイルスで感染
させたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す顕微鏡写真（ここで、
その昆虫細胞はＩＳＵ−１２ ＯＲＦ−６遺伝子でコー
ドされた組換え蛋白を生成している）。
【図２９】ＩＳＵ−１２に対するブタの抗血清で染め、
その後蛍光体結合抗ブタＩｇＧで染めたＩＳＵ−１２
ＯＲＦ−７遺伝子を含む組換えバキュロウイルスで感染
させたＨＩ−ＦＩＶＥ細胞を示す顕微鏡写真（ここで、
その昆虫細胞はＩＳＵ−１２ ＯＲＦ−７遺伝子でコー
ドされた組換え蛋白を生成している）。
【図３０】ＩＳＵ−１２特異プライマを使用したＯＲＦ
−５（レーンＥ）、ＯＲＦ−６（レーンＭ）、ＯＲＦ−
７（レーンＮＰ）のＰＣＲ増幅の結果を表わす電気泳動
を示す写真（ここで、レーンＳＭは分子量標準を含
む）。
【図３１】ＢａｍＨＩ，ＥｃｏＲＩ制限酵素でプラスミ
ドＤＮＡを切断した後、ＩＳＵ−１２のゲノムのＯＲＦ
−５（レーンＥ）、ＯＲＦ−６（レーンＭ）、ＯＲＦ−
７（レーンＮＰ）を含んでいる組換えバキュロウイルス
形質転換用ベクターｐＶＬ１３９３の発現結果を表わす
電気泳動を示す写真（レーンＳＭは分子量標準を含
む）。
【図３２】ＩＳＵ−１２のｍＲＮＡのノーザンブロット
を表わす電気泳動を示す写真。
【図３３】ＡおよびＢは、ＰＲＲＳＶの他のアイオワ株
（ＩＳＵ−２２、ＩＳＵ−５５，ＩＳＵ−７９、ＩＳＵ
−１８９４，ＩＳＵ−３９２７）単離物から採集したｍ
ＲＮＡのノーザンブロットを表わす電気泳動を示す写
真。
【図３４】本発明ワクチンの一つの具体例を鼻腔下（Ｉ
Ｎ）、筋肉下（ＩＭ）、に投与した３−週齢、ＰＲＲＳ
Ｖセロネガチブ、特定病原性の無いブタ群（ＳＲＦ）お
よび対照ブタ群（ＮＶ／ＣＨＡＬＬ）の平均全肺病巣評
点（病気に冒された肺のパーセント）の棒グラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｙ 33/569 Ｌ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ (71)出願人 593214903 ソルベイ・アニマル・ヘルス・インコーポ レーテッド ＳＯＬＶＡＹ ＡＮＩＭＡＬ ＨＥＡＬＴ Ｈ， ＩＮＣ. アメリカ合衆国、ミネソタ州 55120− 1148、メンドータ・ハイツ、ノースラン ド・ドライブ 1201 (72)発明者 プレム・サガー・ポール アメリカ合衆国、アイオワ州 50014、エ イムズ、アリゾナ・サークル 4206 (72)発明者 パトリック・ジェラルド・ハルバー アメリカ合衆国、アイオワ州 50014、エ イムズ、キングマン・ロード 3211 (72)発明者 シャン − ジン・メン アメリカ合衆国、アイオワ州 50014、エ イムズ、パメル・コート 725 (72)発明者 メリサ・アン・ラム アメリカ合衆国、ミネソタ州 55120、メ ンドータ・ハイツ、ノースランド・ドライ ブ 1201 (72)発明者 ヤング・エス・リョー アメリカ合衆国、アイオワ州 50014、エ イムズ、イー・ビレッジ 159 (54)【発明の名称】 ブタ呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスに対して免疫応答を高めるワクチン、該ウイルス によって惹起される病気からブタを保護する方法、該ウイルスに対する免疫応答を高めるワクチ ンを生産する方法、及び該ウイルスから得られたＤＮＡ

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ブタ生殖器および呼吸器疾病を惹起する
    ウイルスへの暴露に対して、ブタ体内において、有効な
    免疫応答を高めるワクチン。
  2. 【請求項２】 前記ウイルスが、II型肺細胞形成、心筋
    炎、脳炎、肺胞滲出形成およびシンシチア形成の各症状
    もしくは徴候によって特徴付けられる疾病を惹起する請
    求項１記載のワクチン。
  3. 【請求項３】 前記ウイルスが、し眠、呼吸困難、強制
    呼気、発熱、毛皮の荒れ、いびき、咳および軽度の間質
    肥大の各症状もしくは徴候によってさらに特徴付けられ
    る請求項２記載のワクチン。
  4. 【請求項４】 前記疾病が、ブタ生殖器および呼吸器症
    候群ウイルスのアイオワ株によって惹起される請求項３
    記載のワクチン。
  5. 【請求項５】 前記ワクチンが、ＰＳＰ-36 、ＰＳＰ-3
    6-ＳＡＨおよびＭＡ-104からなる群より選ばれる細胞系
    において培養されるウイルスから調製される請求項１記
    載のワクチン。
  6. 【請求項６】 II型肺細胞形成、心筋炎、脳炎、肺胞滲
    出形成およびシンシチア形成の各症状および徴候によっ
    て特徴付けられるブタ生殖器および呼吸器疾病を惹起す
    るウイルスまたは病原体の生物学的に純粋な試料。
  7. 【請求項７】 し眠、呼吸困難、強制呼気、発熱、毛皮
    の荒れ、いびき、咳および軽度の間質肥大の各症状もし
    くは徴候によってさらに特徴付けられる請求項６記載の
    生物学的に純粋なウイルスまたは病原体。
  8. 【請求項８】 前記生物学的に純粋な試料が、ブタ生殖
    器および呼吸器症候群のアイオワ株に関連し、アメリカ
    ン・タイプ・カルチャー・コレクションに1992年10月28
    日付けで受付番号 VR 2385および VR 2386として寄託さ
    れた試料と、1993年 9月29日付けで寄託された試料とを
    含む請求項７記載の生物学的に純粋なウイルス。
  9. 【請求項９】 ブタをウイルス性感染から保護するため
    の組成物であって、生理学的に許容し得る担体中に、ブ
    タ生殖器および呼吸器疾病を惹起するウイルスに対する
    免疫応答を高めるに有効な量の請求項１記載のワクチン
    を含有する組成物。
  10. 【請求項１０】 ブタ生殖器および呼吸器疾病を惹起す
    るウイルスの感染からブタを保護する方法であって、該
    ウイルスによる感染に対して保護する必要のあるブタに
    請求項１記載のワクチンの有効量を投与することを具備
    する方法。
  11. 【請求項１１】 前記ワクチンが経口もしくは非経口的
    に投与される請求項10記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ワクチンが、筋肉、皮内、静脈
    内、腹膜内、皮下、または鼻腔内投与される請求項11記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ワクチンを、前記ウイルスによる
    感染から保護する必要があるブタに投与する請求項10記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載のワクチンを製造する
    方法であって、 （Ａ）ブタの呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイル
    スまたは病原体の十分な量の試料を収集する工程、およ
    び、 （Ｂ）（i)ウイルスまたは病原体をプラーク精製する、
    （ii) ウイルスまたは病原体を不活性化するに十分な温
    度および時間でウイルスまたは病原体を加熱する、(ii
    i) ウイルスまたは病原体を不活性化させるに十分な量
    の不活性化化学剤にウイルスまたは病原体を暴露するか
    または混合する、(iv)ウイルスまたは病原体を対応する
    サブユニットに分解し、少なくとも一つのサブユニット
    を単離する、および (V)ウイルスまたは病原体の表面蛋
    白をコ−ドしているポリ核酸を合成または単離し、該ポ
    リ核酸を適切なホスト細胞に感染させ、該ホスト細胞を
    培養し、該培養物から表面蛋白を単離する、ことからな
    る群より選ばれる方法でウイルスまたは病原体を処理す
    る工程、を具備する方法。
  15. 【請求項１５】 前記ウイルスまたは病原体を、培養培
    地、該ウイルスまたは病原体に感染した細胞、並びに培
    養培地およびウイルスまたは病原体に感染した細胞の両
    者からなる群より選ばれる源から収集する請求項14記載
    の方法。
  16. 【請求項１６】 前記収集工程に先立って、適切な培地
    において前記ウイルスまたは病原体を培養する工程をさ
    らに具備する請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１のワクチンに免疫学的に結合
    する抗体。
  18. 【請求項１８】 呼吸器および生殖器疾病を患うブタの
    治療方法であって、生理学的に許容し得る担体に含ませ
    た、有効量の請求項17に記載の抗体を、それらを必要と
    するブタに投与することを具備する方法。
  19. 【請求項１９】 ブタ呼吸器疾病、ブタ生殖器疾病、ま
    たはブタ生殖器および呼吸器疾病を惹起するウイルスを
    検定するための診断キットであって、請求項17の抗体お
    よび該抗体と陽性免疫反応を示す診断薬を具備するキッ
    ト。
  20. 【請求項２０】 ブタ呼吸器および生殖器疾病を惹起す
    るウイルスまたは病原体のゲノムの一部から得られるポ
    リヌクレオチドと少なくとも90％の相同性を有する単離
    ポリヌクオチド。
  21. 【請求項２１】 前記ウイルスまたは病原体がブタ生殖
    器および呼吸器症候群ウイルスのアイオワ株に関連する
    請求項20記載の単離ポリヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 配列番号 8、配列番号13、配列番号1
    5、配列番号18および配列番号19からなる群より選ばれ
    る配列から実質的になる、請求項21記載の単離ポリヌク
    レオチド。
  23. 【請求項２３】 請求項22記載の単離ポリヌクレオチド
    によってコ−ドされるタンパク質。
  24. 【請求項２４】 ブタ呼吸器および生殖器疾病を惹起す
    るウイルスまたは病原体のゲノムから得られるポリヌク
    レオチド断片から実質的になり、該断片が 20 ないし 1
    00ヌクレオチドの長さである単離ポリ核酸。
  25. 【請求項２５】 前記ウイルスまたは病原体が、ブタ生
    殖器および呼吸器症候群ウイルスのアイオワ株である請
    求項24記載の単離ポリヌクレオチド。
  26. 【請求項２６】 配列番号 1、配列番号 2、配列番号
    3、配列番号 4、配列番号 5、配列番号 6および配列番
    号 7からなる群より選ばれる配列から実質的になる、請
    求項24記載の単離ポリヌクレオチド断片。
  27. 【請求項２７】 ＰＳＰ-36 、ＰＳＰ-36-ＳＡＨ、ＭＡ
    -104、およびウイルスに感染し、培養することが可能な
    それらと同等の細胞系からなる群より選ばれる細胞系を
    感染させ、該感染細胞系を適切な培地で培養することを
    具備するウイルスの培養方法であって、該ウイルスがブ
    タ呼吸器および生殖器疾病を惹起するウイルスである方
    法。
  28. 【請求項２８】 前記適切な細胞系が、ＰＳＰ-36 、Ｐ
    ＳＰ-36-ＳＡＨおよびＭＡ-104からなる群より選ばれる
    請求項27記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記ウイルスが、ブタ呼吸器および生
    殖器症候群ウイルスのアイオワ株であるか、またはブタ
    呼吸器および生殖器症候群、増殖性および壊死性肺炎、
    および非定型ブタインフルエンザからなる群より選ばれ
    る疾病を惹起する請求項27記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記ウイルスがブタ呼吸器および生殖
    器症候群ウイルスのアイオワ株である請求項29記載の方
    法。
JP29608593A 1992-10-30 1993-11-01 ブタ呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスに対して免疫応答を高めるワクチン、該ウイルスによって惹起される病気からブタを保護する方法、該ウイルスに対する免疫応答を高めるワクチンを生産する方法、及び該ウイルスから得られたｄｎａ Expired - Lifetime JP4125385B2 (ja)

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