JP2011103883A - ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス(prrsv)のポリ核酸によってコードされるタンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)のアイオワ株の1個以上のオープンリーディングフレーム(ORF)によってコードされるタンパク質、これらのタンパク質の抗原性領域であって、長さが少なくとも5アミノ酸でありかつ次のPRRSV単離体によるチャレンジに対してブタ宿主を効果的に保護する抗原性領域、およびそれらの組合せであって、抗原性に対して本質的でないアミノ酸を保存的に置換することができるものからなる群から選択される少なくとも1個のポリペプチド、及びこのようなタンパク質の有効量を含んでなるワクチン、このようなタンパク質に特異的に結合する抗体。
【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明は、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)から単離されたポリ核酸、ポリ核酸によってコードされるタンパク質および/またはポリペプチド、このタンパク質またはポリ核酸を含んでなるPRRSVからブタを保護するワクチン、このタンパク質、ポリペプチドおよびポリ核酸の作成法、ワクチンを用いてPRRSからブタを保護する方法、ワクチンの製造法、PRRSVに感染したまたは暴露したブタの治療法、およびPRRSVの検出法に関する。
ブタの新規で重篤な疾病であるブタ生殖器および呼吸器症候群(PRRS)は1987年に米国で最初に報告され、多くの西欧諸国で急速に認められるに至った(Goyal, J. Vet. Diagn. Invest., 1993, 5:656-664;および米国特許出願連続番号第08/131,625号および第08/301,435号明細書に概説されている)。この疾病は成熟した雌ブタや妊娠経験のない雌ブタでの生殖器障害、若い成長期のブタの肺炎および離乳前死亡率の増加を特徴としている(Wensvoort et al., Vet. Q., 13:121-130, 1991; Christianson et al., 1992, Am. J. Vet. Res., 53: 485-488; 米国特許出願連続番号第08/131,625号および第08/301,435号明細書)。
従って、本発明の目的は、
配列番号: (ISU−12)または
配列番号: (ISU−55)を含むブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)をコードするDNA配列を提供することである。
配列番号: のヌクレオチド191〜7387(ORF1a)、
配列番号: のヌクレオチド7375〜11757(ORF1b)、
配列番号: のヌクレオチド11762〜12529(ORF2)、
配列番号: のヌクレオチド12385〜13116(ORF3)、
配列番号: のヌクレオチド12930〜13463(ORF4)、
配列番号: のヌクレオチド13477〜14076(ORF5)、
配列番号: のヌクレオチド14064〜14585(ORF6)、および
配列番号: のヌクレオチド14578〜14946(ORF7)を包含する、または
配列番号: のヌクレオチド7657〜12009(ORF1b)、
配列番号: のヌクレオチド12074〜12841(ORF2)、
配列番号: のヌクレオチド12697〜13458(ORF3)、
配列番号: のヌクレオチド13242〜13775(ORF4)、
配列番号: のヌクレオチド13789〜14388(ORF5)、
配列番号: のヌクレオチド14376〜14897(ORF6)、および
配列番号: のヌクレオチド14890〜15258(ORF7)を包含する
ISU−12のISU−55のオープンリーディングフレームをコードするDNA配列を提供することである。
(a) 下記の2種類のプライマー
55F 5′−CGTACGGCGATAGGGACACC−3′、および
3RFLP 5′−GGCATATATCATCACTGGCG−3′
を用いてPRRSVのDNA配列を増幅し、
(b) 段階(a)の増幅した配列をDraIで消化し、
(c) 626bp、187bpおよび135bpの3種類の制限断片をPRRSV ISU−55株と相関させる
ことを特徴とする、方法を提供することである。
本出願では、低ビルレンス単離体および「中」および高ビルレンスを有する4種類の他のオイオワ株PRRSV単離体のORF2〜5のヌクレオチド配列を決定した。様々なPRRSV単離体のORF2〜7の比較に基づいて、既知の最小ビルレンスの米国単離体(ISU3927)は、ORF2〜4には他の米国単離体と比較して比較的高い配列変異がある。更に、ORFの配列の分析に基づけば、米国PRRSVの主要な遺伝子型には少なくとも3種類の副遺伝子型(minor genotype)が存在する。
5′−α−β−3′ (I)
5′−α−β−γ−3′ (II)
(式中、αは、PRRSVのアイオワ株のORF2、3および4、およびこのような抗原性および/または低ビルレンス断片をコードするその領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1個のポリペプチドまたはその抗原性または低ビルレンス断片をコードし、βは、PRRSVのアイオワ株由来のORF5の少なくとも1コピーまたはその抗原性断片(例えば、1以上の超可変領域)、好ましくは高複製(hr)表現型由来の完全長コピーであり、γは、PRRSVのアイオワ株のORF6およびORF7および抗原性断片をコードするその領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも1個のポリペプチドまたはその抗原性断片をコードする)の配列を有するポリ核酸を含んでなる、から本質的になる、またはからなることができる精製製剤に関する。
5′−β−δ−γ−3′ (III)
(上記式中、
βおよびγは上記に定義されたとおりであり、δは共有結合またはポリ核酸の転写および/または翻訳に実質的に影響を及ぼさない結合性ポリ核酸である)の配列を有するポリ核酸を含んでなる、から本質的になる、またはからなることができる精製製剤に関することができる。好ましくは、βは、PRRSVのアイオワ株のORF5によってコードされたタンパク質の少なくとも1個の超可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、更に好ましくは、PRRSVのアイオワ株のORF5によってコードされる全長タンパク質をコードする。
5′−α−β−δ−γ−3′ (IV)
(上記式中、α、β、γおよびδは、上記式(I)〜(III)で定義したとおりである)の配列を有するポリ核酸を含んでなる、から本質的になる、またはからなることができる精製製剤に関することができる。
5′−ε−ζ−ι−κ−ξ−3′ (V)
(上記式中、
εは、場合によっては含まれており、ポリヌクレオチドα、β、γおよびδを操作上発現する手段を提供する5′末端ポリヌクレオチド配列であり、ζは式KTVACC(式中、KはT、GまたはUであり、VはA、GまたはCである)のポリヌクレオチドであり、ιは長さがせいぜい約130(好ましくは、せいぜい100)のポリヌクレオチドであり、κは通常のマーカーまたはレポーター遺伝子α、β、γおよびそれらの操作結合した組合せからなる群から選択される1個以上の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドであり、但し、α、βおよびγは上記の式(I)〜(IV)において定義した通りであり、ξは、場合によっては含まれており、ポリヌクレオチドα、β、γおよびδの操作発現を抑制せずかつ(例えば、プラスミド中の)εに操作結合することができる3′末端ポリヌクレオチド配列である)の配列を有するポリ核酸発現ベクターまたはプラスミドを含んでなる、から本質的になる、またはからなることができる精製製剤に関することもできる。
リシン(Lys)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)
アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)
セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、システイン(Cys)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)
システイン(Cys)、メチオニン(Met)
疎水性の芳香族アミノ酸:
フェニルアラニン(Phe)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)
グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、プロリン(Pro)
ものをコードするポリヌクレオチドも包含する。
概要
1個の低ビルレンス、1個の「中」ビルレンスおよび1個の高ビルレンス米国PRRSV単離体のORF2〜5の配列を決定して、分析した。他のPRRSV単離体の既知配列と比較すると、異なるビルレンスを有する7個の米国単離体のORF2〜5には、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルのいずれでもかなりの配列変動があることが示されている。しかしながら、これら7種の米国単離体のORF6および7は、高度に保存されている(米国特許出願連続番号第08/301,435号明細書)。欧州LVおよび米国単離体のORF2〜7にも、広汎な配列変動が見られた。既知の最小ビルレンス米国PRRSV単離体(ISU−3927)は、他の米国単離体と比較して最大の配列変動を示した。
7個の米国PRRSVたんりたい間のアミノ酸配列アイデンティティーは、ORF2では91〜99%であり、ORF4では92〜99%であり、ORF5では88〜97%であった。既知の最小ビルレント米国単離体は、他の米国単離体と比較して、ORF5〜7よりORF2〜4での配列変動が高い。抗原性を有する3個の超可変領域をORF5によってコードされる主エンベロープ糖タンパク質で同定した。
細胞およびウイルス
ATCCCRL11171細胞系を用いて、PRRSVを増殖させた。細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)および1×抗生物質(ペニシリンG10,000単位/ml、ストレプトマイシン10,000mg/mlおよびアンホテリシンB25mg/ml)を補足したDulbeccoの最小必須培地(DMEM)で成長させた。
CRL11171細胞の集密的単層をそれぞれISU22、ISU55およびISU3927であるPRRSVの3種類の米国単離体を0.1の感染多重度(m.o.i.)で感染させた。感染から24時間後、感染細胞を冷PBS緩衝液で3回洗浄した。次に、総細胞内RNAを、グアニジニウムイソチオシアネートおよびフェノール−クロロホルム抽出(Stratagene)によって単離した。RNA製剤中におけるウイルス特異的RNA種の存在は、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって確かめた(データーは示さなかった)。総細胞内RNAは、分光光度法によって定量した。
第一の鎖の相補性(c)DNAは、以前に報告したようにランダムプライマーを用いる逆転写によって総細胞内RNAから合成した(Meng et al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258)。PRRSVの3種類の単離体のORF2〜5の総タンパク質コード領域を増幅するため、2組のプライマーをVR2385およびLVの配列に基づいて設計した。プライマーJM259(5′−GGGGATCCTTTTGTGGAGCCGT−3′)およびJM260(5′−GGGGAATTCGGGATAGGGAATGTG−3′)はORF4および5の配列を増幅し、プライマーXM992(5′−GGGGGATCCTGTTGG−TAATAG(A)GTCTG−31およびXM993(5′−GGTGAATTCGTTTTATTTCCCTCCGGGC−3′)はORF2および3の配列を増幅した。これらのプライマーの5′末端にユニーク制限部位(EcoRIまたはBamHI)を導入して、クローニングを促進した。縮重塩基G(A)を、VR2385およびLVの配列に基づいてプライマーXM992において合成した(Meulenberg et al., 1993; 米国特許出願連続番号第08/301,435号明細書)。PCRは、以前に報告した方法で行った(Meng et al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258)。
RT−PCR生成物を、0.8%アガロースゲル電気泳動によって分析した。それぞれORF2および3並びにORF4および5を表す2種類のPCR断片を、グラスミルク法(glassmilk procedure; GENECLEAN, BIO 101, Inc.)によって精製した。精製断片をそれぞれBamHIおよびEcoRIで消化し、以前に報告した方法でベクターpSK+にクローニングした(Meng et al., 1993)。E. coli DH 5α細胞を、組換えプラスミドの形質転換に用いた。白色コロニーを選択し、100mg/mlアンピシリンを含むLBブロスで成長させた。組換えプラスミドを含むE. coli細胞をリゾチームで溶解し、次にプラスミドをQiagenカラム(QIAGEN Inc.)を用いて単離した。
配列データーを組合わせて、Mac Vector (International Biotechnologies, Inc.)およびGene Workds (IntelliGenetics, Inc.)コンピューターソフトウェアプログラムを用いて分析した。系統発生分析は、PAUPソフトウェアパッケージ第3.1.1版(David L. Swofford, Illinois Natural HIstory Survey, シャンペン, イリノイ)を用いて行った。PAUPは、最大倹約アルゴリズムを用いて、系統樹を構築する。
ORF2〜5のヌクレオチド配列分析
5種類のPRRSV単離体ISU79、ISU1894、ISU22、ISU55およびISU3927のORF2〜5の配列を決定し、VR2385、VR2332およびLVなどの他の既知のPRRSV単離体と比較した(Meulenberg et al., 1993)。単離体VR2385、ISU22、ISU55、ISU79、ISU1894およびISU3927のORF6および7の配列は、以前に報告されていた(米国特許出願連続番号第08/301,435号明細書)。この実験に用いた単離体は、実験的に感染したブタにおける肺ビルレンスが異なることが示されている(米国特許出願連続番号第08/131,625号および第08/301,435号明細書)。ISU3927は、10種類の異なる米国PRRSV単離体の中で最小ビルレンスの単離体である(米国特許出願連続番号第08/131,625号明細書および米国特許出願連続番号第08/301,435号明細書)。
図2は、米国単離体ISU22、ISU55およびISU3927と他の既知のPRRSV単離体とのORF2(A)、ORF3(B)、ORF4(C)およびORF5(D)の推定アミノ酸配列の整列を示す。VR2385の配列を最上部に示し、差だけを示す。欠失は(−)によって示す。LV(D)のORF5における提案シグナルペプチド配列には、下線を施す(Meulenberg et al., 1995)。ORF5(D)における抗原性を有する3種類の超可変領域は、星印(*)によって示した。この整列に用いた公表配列は、LV(Meulenberg et al., 1993)、VR2385(米国特許出願連続番号第08/131,625号および第08/301,435号明細書)、VR2332、ISU79およびISU1894(米国特許出願連続番号第08/301,435号明細書)であった。
米国PRRSVと欧州PRRSVはMおよびN遺伝子の分析に基づいて2種類の異なる遺伝子型を表すことは以前に示されている(米国特許出願連続番号第08/301,435号明細書)。米国PRRSV単離体の系統発生的関連性を決定するため、図1および2に示した7種類の米国PRRSV単離体のORF2〜7を最初にGeneWorks プログラム(Intelligenetics, Inc.)を用いて整列した。次に、PAUPプログラム(David L. Swofford, Illinois Natural History Survey, シャンペン, イリノイ)を用いて、PRRSVの米国単離体中の関連性を示す系統樹を構築した。
PRRSVの複製中に、ゲノムRNAの他に6個のサブゲノムmRNA(sgmRNA)を合成する。これらのsgmRNAを、この実験で特性決定した。
ウイルスおよび細胞
用いたPRRSV単離体(ISU22、ISU55、ISU79、ISU1894およびISU3927)は、アイオワ州の様々な農場から得たブタ肺から単離した。連続的細胞系ATCCCRL11171を用いて、ウイルスを単離し、成長させた。これらのPRRSV単離体を3回のプラーク精製によって生物学的にクローニングし、CRL11171細胞上で成長させた。この研究に用いたウイルス単離体の総ては、第7代であった。
CRL11171細胞の集密的単層を、第7代目のPRRSVの様々な単離体を0.1の感染多重度(m.o.i.)で感染させた。PRRSV特異的総細胞内RNAを、通常のグアニジニウムイソチオシアネート法(Stratagene)によってPRRSV感染細胞から単離した。ポリ(A)+RNAを、オリゴ(dT)−セルロースカラムクロマトグラフィー(Invitrogen)によって総細胞内RNAから濃縮した。
cDNAは、以前に報告したようにランダムプライマーを用いる逆転写によって総細胞内RNAから合成し、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した(Meng et al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258)。
ウイルス感染細胞および擬似感染細胞由来の総細胞内RNA10μgを、ホルムアルデヒド−アガロースゲル中でレーン当たりに用いた。ポリ(A)+RNAおよびビリオンRNAを分離するため、ビリオンRNA15ngおよびポリ(A)+RNA0.2μgを、レーン当たりに加えた。RNAは、通常の方法に従ってホルムアルデヒドで変性した(Sambrook et al., 「分子クローニング:実験室便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, コールド・スプリング・ハーバー,ニューヨーク)。RNAの電気泳動分離、RNAブロッティングおよびハイブリダイゼーションは、米国特許出願連続番号第08/131,625号明細書に記載の方法で行った。幾つかの実験では、グリオキサール−DMSOアガロースゲルも米国特許出願連続番号第08/131,625号明細書に記載の方法で行った。
RT−PCRのプライマーは、PRRSV単離体ISU79およびISU1894のORF2〜5の全タンパク質コード領域を増幅するPRRSV単離体VR2385の配列に基づいて設計した。プライマーJM259およびJM260は0RF4および5の増幅に用い、XM992およびXM993はORF2および3の増幅に用いた(表4)。PCR生成物の末端にユニーク制限部位(EcoRIおよびBamHI)を導入することによって、これらのORFの置換に対するカセット法が可能となった。
この研究に用いた合成オリゴヌクレオチドを、表4にまとめた。これらのオリゴヌクレオチドは、自動DNA合成装置(Applied Biosystem)を用いて一本鎖DNAとして合成し、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)によって精製した。
sgmRNAはPRRSVビリオンにパッケージされない。
PRRSVのsgmRNAがパッケージされるかどうかを決定するため、PRRSV単離体ISU3927のビリオンをCsClグラディエントによって精製した。精製ビリオンをRNアーゼで処理した後、ビリオンをペレット化して、RNAを抽出し、ビリオン表面に付着した総てのRNA種を除去した。PRRSV感染細胞の単離体ISU3927からの総細胞内RNAと共にRNアーゼAで処理したビリオンからのRNAをホルムアルデヒドゲル中で分離し、プライマーPP284およびPP285を用いるPCRによってウイルスゲノムの3′末端配列から生成したプローブを用いてハイブリダイゼーションした(米国特許出願連続番号第08/131,625号明細書;表4)。
米国PRRSVおよび欧州PRRSVなどの本発明前に既知の総てのアルテリウイルスは、7つのsgmRNAを合成する3種類のLDV変異体(LDV−P、LDV−aおよびLDV−v)を除き6個のsgmRNAを産生することが示された。しかしながら、6個のsgmRNAのネステドセットがLDV−C株で産生される。
コロナウイルスでは、MHVを高m.o.i.で組織培養で連続的に継代するときに、様々な大きさの様々な欠陥のある干渉性RNA(DIRNA)が生成した。DIRNAは、未希釈継代の際のトロウイルスに感染した細胞でも観察された。従って、PRRSVのsgmRNA3−1がDIRNAとなる可能性を検討した。
ISU79およびISU1894のORF2〜5をクローニングし、配列決定した(上記の実験1参照)。ISU79は7個の容易に識別可能なsgmRNAを生成するが、ISU1894は6個の識別可能なsgmRNAを生成する(図5および7)。ORF2〜5の任意の所定の領域における少なくとも3個のcDNAクローンを、普遍および逆プライマー並びにウイルス特異的プライマーXM969、XM970、XM1006、XM078およびXM077を用いてそれぞれのウイルス単離体について配列決定した(表4)。ISU1894およびISU79のORF6および7の配列は、米国特許出願連続番号第08/301,435号明細書に開示されている。
細胞系ATCCCRL11171を用いて、PRRSV単離体を増殖させた。細胞系の保持およびウイルスの単離は、以前に記載したのと同じであった(Meng et al., J. Gen. Virol., 75:1795-1801 (1994); Meng et al., J. of Veterinary Diagnostic Investigation, 8:374-381 (1996))。形質細胞腫細胞系SP2/Oを用いて、MAb調製における細胞融合を行った。PRRSVATCCVR2385を、PRRSVに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニングの抗原として用いた。
ATCCCRL11171細胞の単層に、PRRSVVR2385を0.1の感染多重度で接種し、48時間インキュベーションし、メタノールで固定した。ハイブリドーマ上清を、固定した細胞単層上で37℃にて30分間インキュベーションした。フルオレセイン標識したヤギ抗−マウスIgG(H+L)接合体を用いて、特異反応を検出した。1個のPRRSVN(ORF7生成物)特異的モノクローナル抗体PP7eF11を正のコントロールとして用い、非PRRSV特異的MAbからの細胞培養上清PPAc8を負のコントロールとして用いた。
PRRSVORF4および5の組換えバキュロウイルスを感染した昆虫細胞からの全細胞溶解生成物を免疫源として用いて、マウスを免役した。PRRSVORF4および5を含む組換えバキュロウイルスの構築は、以前に報告したとおりの方法で行った(Bream et al., J. Virol., 67:2665-2663 (1993))。簡単に説明すれば、PRRSVORF4および5遺伝子を、個別にBamHIおよびEcoRIの制限部位を含むプライマーを用いて、pPSP・PRRSV2〜7の鋳型からPCR増幅した(Morozov et al., Archives of Virology, 140:1313-1319 (1995))。増幅した断片を上記の制限酵素で切断し、ベクターPVL1393(Invitrogen)に連結した。挿入した遺伝子はポリヒドリン遺伝子プロモーターの制御下にあり(O'Reilly et al., バキュロウイルス発現ウイルス: 実験室便覧(Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual), 107〜234頁,第2版,ニューヨーク:W.H. Freeman and Company (1992))、制限酵素消化およびPCR増幅によって確かめた。次に、組換えベクターDNAおよび線形化したAutographa Califomia multinuclear polyhedrosis virus DNA (Invitrogen)を説明書に記載の方法でSf9細胞に同時トランスフェクションした。組換えバキュロウイルス中の挿入遺伝子は、ハイブリダイゼーションおよびPCR増幅によって確かめた(O'Reilly et al., 1992)。組換えウイルスを用いて、昆虫細胞に接種し、細胞溶解生成物をマウスの免疫に用いた。免疫は、2週間間隔で3〜5回の腹腔内注射によって行った。脾臓細胞を以前に報告されている方法でSP2/O 骨髄腫細胞とハイブリダイゼーションした(Brown & Ling, 「ネズミモノクローナル抗体(Murine Monoclonal Antibodies)」/抗体:実際的方法(Antibodies: a practical approach), 81〜104頁,Catty D. Zoxford監修,Washing,
D.C., IRL Press (1988))。ハイブリドーマを、IFAを用いてPRRSV特異抗体の分泌についてスクリーニングし、PRRSVATCCVR2385との反応を検出した。正のハイブリドーマを選択して、3回クローニングした。4個のMAbをGP4に対して展開し、6個のMabをタンパク質に対して展開した。Mabを、MonoAb IDキット(Zymed Laboratories Inc.)でイソタイプとした。
ELISAは、詳細に記載されている(Harlow & Lane, 抗体:実験室便覧(Antibodies: A laboratory manual),471〜612頁,Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク(1988); Ausubel et al., 分子生物学の簡単な方法(Short protocols in molecular biology),11.5〜11.7頁,第2版,ニューヨーク,Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992))。コーティング抗原を、PRRSVVR2385感染細胞から1%Triton X-100で抽出した。MAbを、プレートに結合する抗原を用いてELISAでの結合活性について試験した。正常細胞からの抽出物および非PRRSV特異的MAbからの細胞培養液PPAc8を、それぞれ負の抗原および負のコントロールとして用いた。PRRSVN特異的MAbであるPP7eF11を、正のコントロールとして用いた。特異的反応を、ヤギ抗−マウスIgG(H+L)ペルオキシダーゼ接合体を用いて検出し、基質2,2′−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)を用いて確かめた。次に、光学密度を405nm(A405)で測定した。
ウェスタンイムノブロット分析は、以前に報告されている通りに行った(Harlow & Lane, 抗体:実験室便覧(Antibodies: A laboratory manual),471〜612頁,Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク(1988))。タンパク質試料を様々な条件下で処理した後、ゲルで分離した。変性条件については、試料を2%SDSおよび5%2−メルカプトエタノールを含むLaemmli試料中100℃で3分間処理し、SDS−PAGEにかけた。非変性条件下では、試料を1%Triton X-100を含む試料緩衝液中で40℃にて20分間処理し、PAGEにかけた。次に、分離したタンパク質を、電気泳動によってニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を、3%BSAでブロックした。MAbを、マルチスクリーニング装置を用いて膜上での抗原との反応性についてスクリーニングした。ブタ抗PRRSV血清を正のコントロールとして用いて、PPAc8由来の細胞培養物上清を負のコントロールとして用いた。結合した抗体は、ヤギ抗マウスIgG+IgA+IgMペルオキシダーゼ接合体またはヤギ抗ブタIgGペルオキシダーゼ接合体とインキュベーションした後、4−クロロ−1−ナフトール基質で発色することによって検出した。
MAbのウイルス中和活性は、以前に報告された方法を幾つか改良を行って試験した(Mecham et al., Viral Immunol., 3:161-170 (1990); White et al., J. Gen. Virol., 71:4767-4772 (1990))。ハイブリドーマ上清を、30〜70プラーク形成単位を含む同容積のPRRSVと混合し、これを10%モルモット補体を含むDMEMで希釈した。ウイルス−抗体混合物を37℃で1時間インキュベーションした後、6ウェルプレートでATCCCRL11171細胞の単層に移し、37℃で更に1時間インキュベーションした。次に、アガロース培地混合物で、単層を被覆した。37℃で3日間インキュベーションした後、単層を0.05%ニュートラルレッド/アガロースで染色した。ブタ抗PRRSV血清を正のコントロールとして用い、非PRRSV特異的MAb由来のハイブリドーマ細胞培地を負のコントロールとして用いた。
ハイブリドーマを、PRRSVVR2385に感染したATCCCRL11171細胞上でIFAでスクリーニングした。IFA陽性のハイブリドーマを選択して、増幅し、クローニングした。6個のMAbをPRRSVEタンパク質に対して展開し、4個をGP4に対して展開した。それらの総ては、強度には若干差があるが強い核周囲蛍光を示し、これはPRRSVNタンパク質特異的MAbの細胞質染色とは異なっていた(図10)。この結果は、オリゴ糖の糖タンパク質への移行は一般に小胞体およびゴルジ体のような特定の区画で行われるので、GP4およびE糖タンパク質はPRRSV感染細胞の非細胞区画で合成され、蓄積されることを示していた(Pfeffer et al., Ann. Rev. Biochem., 56:829-852 (1987))。GP4およびEは、膜関連糖タンパク質と予想された(Meng et al., 1994, & Morozov et al., Archives of Virology, 140:1313-1319 (1995))。対照的に、PRRSVNタンパク質は塩基性および親水性が高く、PRRSV感染細胞の細胞質で合成され、これはN−特異的MAb染色によりIFAでの蛍光の細胞質ゾル分布の観察によって示された。総てのMAbは、サブタイプIgMとして同定した。
洗剤処理に対するエピトープの感受性を測定するため、ELISAを行い、MAbの1%Triton X-100で抽出したPRRSV抗原との反応性を試験した。Eタンパク質に対するMAbの中では、PP5bH4のみがPRRSV抗原に対して強い反応性を示した(図11)。E特異的MAbの残部とPRRSV抗原との間には、明瞭な反応は見られなかった。GP4に対するMAbの中では、PP4bB3のみがPRRSV抗原と穏和な反応性を示した。GP4に対するMAbの他の3個は、反応性は全く示されなかった。負のコントロールは、ELISAでは反応を示さなかった。
ウェスタンブロッティングを行い、MAbとPRRSV抗原との反応性を測定して、MAbが配座依存性エピトープに対するものであるという推論を確かめた。SDS−PAGEでの変性条件下では、PP5bH4のみが、ブタ抗PRRSV血清を用いて検出した推定物Eと一致する26kDaの位置における精製PRRSVビリオンのバンドを認識した(図12)。次に、イムノブロッティングを非変性PAGEで行い、エピトープが非変性条件下で保存されるかどうかを試験した。6個のMAb〜Eの中で、PP5bH4のみがPRRSV抗原と反応を示した。MAb〜GP4の中、いずれもこの試験における条件下では精製ビリオンまたは感染細胞中のPRRSV抗原を認識しなかった(結果は示されていない)。
プラーク減少分析を行って、EおよびGP4タンパク質に対するMAbの中には、ウイルス中和活性があるかどうかを試験した。1個のみのE特異的MAb、すなわちPP5dB4が、VR2385単離体に対し相同的中和の能力を示した。正のコントロールであるブタ抗PRRSV血清も、ウイルス中和活性を示した。
PRRSVの農場での単離体を増殖させ、固定細胞ELISAでのMAbの交差反応性を試験し、他のPRRSV単離体でのエピトープの存在を測定した(表5)。固定細胞ELISAを用いたが、これらのMAbのほとんどが配座依存性エピトープを認識しかつこれらのエピトープを固定細胞に保存することができるからである。総てのMAbは総ての単離体と反応するが、異なる力価で反応する。この結果は、MAbによって認識されたエピトープが、試験した単離体中に保存されることを示唆している。しかしながら、試験を行った単離体には抗原性の差がある。力価が256以上である場合には、反応性強度は高として任意に定義され、力価が64〜128である場合には中として、また力価が32以下である場合には低として定義された。試験を行った23個の単離体の中、PRRSVVR2385のみが10個のMAbの中7個と高い反応性を有した。5個の単離体は、10個のMAbの中少なくとも6個と低い反応性を有し、12個の単離体は10個のMAbの中少なくとも6個と中程度の反応性を有し、他の5個の単離体は半数のMAbと低反応性を有した。MAb PP4dG6およびPP5bH4は、ほとんどの単離体と他のMAbより低い反応性を示した。PP4bB3は、総てのMAbの中で、GP4およびEタンパク質に対して最も強い反応性を示した。力価の差は、1個のMAbと異なる単離体との反応については64倍程度であり、例えばPRRSVRP10およびRP12と反応するMAbPP4cBl1の力価は、それぞれ16および1024であった。一方、1個の単離体とのMAbの力価の差は128倍程度であり、例えばPRRSVRP11と反応するMAbPP4bB3およびPP4bC5の力価はそれぞれ1024および8であった。この結果は、異なるMAbによって認識されるエピトープは異なっていることを示唆した。正のMAbコントロールは、ISU−51を除き総ての単離体と強い反応性を示す。MAbとPRRSV単離体との反応性の差は、VR2385、ISU22、ISU55およびRP45のアミノ酸配列アイデンティティーがORF4では94〜98%であり、ORF5では88〜97%であるという報告と一致した(Meng et al., J. Gen. Virol., 140:745-755 (1995))。
細胞およびウイルス
ATCCCRL11171細胞を用いてPRRSVを増殖させ、PRRSV精製は以前に報告された方法で行った(Meng et al., J. Gen.Virol., 75:1795-1801 (1994); Meng et al., J. Vet. Diag. Invest., 8:374-381 (1996); Halbur et al., Vet. Pathol, 32:648-660 (1995))。PRRSV単離体ATCCVR2385(Meng et al., 1994 & Morozov et al., 1995)は、ORF2〜4遺伝子のPCR増幅に用いた。
PRRSVORF2、3および4を別個に含むバキュロウイルス伝達ベクターの構築を、以前に報告された方法で行った(Bream et al., J. Virol., 67:2655-2663 (1993))。簡単に説明すれば、PRRSVORF2〜4遺伝子は、ORF2および3の遺伝子についてはBamHIおよびPstI、ORF4についてはBamHIおよびEcoRIの制限部位を含むプライマーで、pPSP・PRRSV2〜7プラスミドの鋳型から別個にPCR増幅した。
ORF2および3について、組換えウイルスをBAC−TO−BACTM発現系(GIBCO BRL)を用いて生成した。単離した組換えBacmidDNAをSf9昆虫細胞にトランスフェクションした後、細胞培地をウイルス保存物として回収した。ORF4組換えウイルス構築のため、pPSP・Ac−p4DNAおよび線形化AcMNPVDNA(Invitrogen)を説明書に記載されているようにSf9細胞に同時トランスフェクションした。推定的組換えバキュロウイルスを、3回の閉塞体が負のプラーク精製(occlusion body-negative plaque purification)の後に選択した。組換えウイルスに挿入された遺伝子は、ハイブリダイゼーションおよびPCR増幅によって確かめた(O'Reilly et al., 1992)。4個の組換え体を組み換えバキュロウイルスの3株のそれぞれについて選択した。ブタ抗PRRSV血清を用いる間接免疫蛍光法は、それぞれの株についての4個の組換え体が同様なタンパク質発現レベルを有することを示した。更に検討を行うため、それぞれの株から1個をORF2の組換えウイルスについてはvAc−P2、ORF3の組換えウイルスについてはvAc−P3、およびORF4の組換えウイルスについてはvAc−P4と命名した。
IFAは、至る所で詳細に記載されていた(O'Reilly et al., 1992)。簡単に説明すれば、High FiveTM細胞の単層に、野生型(wt)のAcMNPVまたはそれぞれvAc−P2、vAc−P3およびvAc−P4の組換えウイルスを0.1の感染多重度で感染させ、72時間インキュベーションした。ブタ抗PRRSV血清を用いて、昆虫細胞で発現される特異タンパク質を検出した。総タンパク質発現を、固定した感染細胞で検出し、染色して、蛍光顕微鏡下で観察した。細胞表面発現を、ブタ抗PRRSV血清で4℃にて1時間インキュベーションした未固定および未透過性化細胞上で検出し、フルオレセインで標識したヤギ抗ブタIgG接合体で4℃にて1時間染色した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
ウェスタンイムノブロッティングを、以前に報告された方法で行った(Harlow & Lane, 抗体:実験室便覧(Antibodies: A laboratory manual),Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク(1988))。組換えウイルスまたはwtAcMNPVで感染させた昆虫細胞からの細胞抽出物を、この分析に用いた。タンパク質をSDS−PAGEで分離し、電気泳動によってニトロセルロース膜に移した。膜を、ブタノール抗PRRSV血清と共に室温にて1時間インキュベーションした。特異反応をヤギ抗ブタIgGペルオキシダーゼ接合体で検出した後、4−クロロ−1−ナフトール基質中で発色した。
High FiveTM細胞に、vAc−P2、vAc−P3、vAc−P4またはwtAcMNPVを感染させ、細胞−培地中5μg/mlツニカマイシンと共に感染後0〜72時間インキュベーションした。未処理の昆虫細胞を、同時にコントロールとして感染させた。細胞溶解生成物を回収して、SDS−PAGEおよびイムノブロッティングを行った(O'Reilly et al., 1992)。
vAc−P2、vAc−P3およびvAc−P4に感染した昆虫細胞の細胞溶解生成物を用いて、ウサギでの組換えタンパク質の免疫原性を試験した。2匹の12週齢のウサギに、これらの組換えタンパク質をそれぞれ筋肉内および皮下注射した。2回の追加免疫注射の10日後に、血液を採取した。抗体を間接ELISAで試験した(Ausubel et al., 分子生物学の簡単な方法(Short protocols in molecular biology),11.5〜11.7頁,第2版,ニューヨーク,Green Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992))。精製したPRRSVビリオンを超音波処理し、96ウェルのプレートのコーティングに用い、ヤギ抗ウサギIgGへペルオキシダーゼ接合体を用いて、ウサギ血清試料中の抗PRRSV抗体を検出した。免疫前ウサギ血清を、負のコントロールとして用いた。基質2,2−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)を用いて、特異反応を確かめた。
組換えウイルスの構築および確認
構築法の詳細を、方法において説明する。ORF2および3については、組換えバキュロウイルスを組み換えBacmidを含むE. coliから選択した後、Sf9昆虫細胞のトランスフェクションから集めた。組換えウイルスを、更にDNAハイブリダイゼーションおよびPCR増幅によって確かめた。感染細胞由来のDNAとORF2〜4のPRRSV遺伝子由来の特異的プローブとのハイブリダイゼーション、およびPCR増幅のいずれも、組換えバキュロウイルスはクローニングした正しい遺伝子を有することを示していた(データーは示されていない)。
High FiveTM細胞にvAc−P2、vAc−P3、vAc−P4またはwtAcMNPVを感染させ、72時間インキュベーションし、メタノールで固定して、ブタ抗PRRSV血清を用いるIFAによって総タンパク質発現を検討した。未固定および未透過性化昆虫細胞を4℃で染色し、IFAによって細胞表面の免疫蛍光を検出した。vAc−P2に感染した細胞では、弱い細胞質蛍光があり、vAc−P3またはvAc−P4に感染した昆虫細胞では強い細胞質蛍光があり、wtAcMNPVに感染した細胞では特異蛍光は見られなかった(図17)。vAc−P2、vAc−P3およびvAc−P4に感染し、4℃で染色し、固定および透過性化を行わなかった昆虫細胞には、明瞭な細胞表面免疫蛍光が見られた(図15)。細胞表面染色は、wtAcMNPVに感染した昆虫細胞では見られなかった。また、抗体の非存在下において組換えウイルスに感染した昆虫細胞は、蛍光を全く示さなかった(データーは示さない)。
High FiveTM細胞の単層にvAc−P2、vAc−P3、vAc−P4またはwtAcMNPVを0.1の感染多重度で感染させ、72時間インキュベーションした。昆虫細胞における組換えタンパク質の発現を、全細胞抽出物を用いて分析した。総タンパク質試料をSDS−PAGEにかけ、ウェスタンブロッティングによってニトロセルロース膜に移し、ブタ抗PRRSV血清で検出した(図19A)。精製したPRRSビリオンを加え、同じゲルで分析した。昆虫細胞で発現したORF2生成物は、Mrにおいて27および29kDaの種として検出された。ORF3生成物は、22、25、27〜31および35〜43kDaの多バンド種として検出された。27〜31および35〜43kDaのMrにおけるシグナルは、識別して単一バンドとすることは困難であり、特異なグリコシル化または部分タンパク質分解による可能性がある。ORF4生成物は、15、18、22、24、28および30kDaの多バンド種として見出された。これらの特異的バンドは、wtAcMNPVに感染した昆虫細胞では見られなかった。精製したPRRSV試料では、Mrで少なくとも4つのバンド:15、19、27〜31および45kDaがあった。精製したPRRSビリオンで検出された特異的バンドは、正常細胞コントロールでは見られなかった(図19A)。
組換えバキュロウイルスまたはwtAcMNPVに感染した昆虫細胞のツニカマイシン処理を行い、ツニカマイシンがN−結合グリコシル化を阻害するので組換えタンパク質がN−グリコシル化されるかどうかを試験した。処理の後、ORF2組換えタンパク質の29kDaのバンドが消失し、25kDaが出現し、27kDaの種には変化がなかった(図20A)。ORF3の組換えタンパク質については、27〜31および35〜43kDaの種が消失し、22〜27kDaのバンドには変化がなかった。ORF3の組換えタンパク質の27kDaの種は、ツニカマイシン処理の後には更に多くなった。N−グリコシル化阻害の後、ORF4の組換えタンパク質は、15および18kDaの種のみとして示され、22〜30kDaのバンドは消失した。15および18kDaのバンドは、ツニカマイシン処理の後には更に鮮明かつ濃くなった。wtAcMNPVに感染した昆虫細胞からの抽出物では、シグナルは全く検出されなかった。
ORF2〜4生成物の組換えタンパク質の免疫原性について、vAc−P2、vAc−P3およびvAc−P4に感染した昆虫細胞の溶解生成物でウサギを免役することによって試験した。ウサギ血清試料中の抗PRRSV抗体の存在は、ELISAによって検出した。免役したウサギの平均力価は、vAc−P2、vAc−P3およびvAc−P4細胞溶解生成物の群についてそれぞれ192、128および382であった(表6)。
PRRSVのORF2〜4の遺伝子をBEVSにクローニングし、組換えタンパク質を昆虫細胞で発現させた。Sf9細胞で閉塞体が負のプラーク(occlusion body-negative plaque)を選択する代わりにE. coliで組換えバキュロウイルスの選択工程を行ったので、ORF2および3のクローニング法はORF4よりもずっと速やかであった。High FiveTM細胞でのタンパク質収率はSf9細胞より高いと考えられているので、Sf9細胞をバキュロウイルスの増殖に用い、High FiveTM細胞をタンパク質発現に用いた(Wickham et al., Biotechnology Progress, 8:391-396 (1992) & Davis et al., In Vitro Cell and Developmental Biology, 29A:388-390 (1993))。High FiveTM細胞は無血清培地に適合させ、将来のタンパク質精製に役立つようにしてあり、また大規模な工業的生産に適する懸濁培養に適合させることもできる。
l., 44:65-76 (1995))、これは同一遺伝子からの発現生成物の多様性が説明されることを示していた。
細胞およびウイルス
ATCC CRL11171細胞を用いて、PRRSVを増殖させた(Meng et al., 1994 and 1996; Halbur et al., 1995)。Spodoptera frugiperda clone 9 (Sf9)およびHigh FiveTM (Invitrogen)昆虫細胞を用いて、バキュロウイルスを増殖させた。PRRSV単離体VR2385(Meng et al., 1994 and 1996)を用いて、遺伝子増幅を行い、BEVSにクローニングした。PRRSVビリオンは、以前に報告されている方法で精製した(Meng et al., 1994)。バキュロウイルスのAutographa california multinuclear polyhedrosis virus(ACMNPV)株を親ウイルスとして用いて、組換えウイルスを構築した。
PRRSV VR2385のORF5〜7の核酸配列は、以前に報告されていた(Meng et al., 1994)。PRRSV ORF5〜7を個別に含むバキュロウイルス転移ベクターの構築は、以前に報告されている方法を用いて行った(Bream et al., 1993)。簡単に説明すれば、PRRSV ORF5〜7遺伝子を、BamHIおよびEcoRIの制限部位を含むプライマーで鋳型pPSP・PRRSV2−7プラスミド個別にPCR増幅した。ORF5の前進プライマーは5′TGCCAGGATCCGTGTTTAAATATGTTGGGG3′であり、復帰プライマーは5′CGTGGAATTCATAGAAAACGCCAAGAGCAC3′であった。ORF6についての前進プライマーは5′GGGGATCCAGAGTTTCAGCGG3′であり、復帰プライマーは5′GGGAATTCTGGCACAGCTCATTGAC3′であった。ORF7についての前進プライマーは5′GGGGATCCTTGTTAAATATGCC3′であり、復帰プライマーは5′GGGAATTCACCACGCATTC3′であった。増幅した断片をBamHIおよびEcoRIで切断し、単離して、ベクターPVL1393(Invitrogen)に連結し、これをまたBamHIおよびEcoRIで切断して正確な配向を確保した。挿入遺伝子はポリヘドリン遺伝子プロモーターの制御下にあり(O'Reilly et al., 1992)、制限酵素消化およびPCR増幅で確認した。ORF5〜7遺伝子を個別に含んでいる組換えベクターを単離した:ORF5にはpPSP.Ac−E、ORF65にはpPSP.Ac−M、およびORF7にはpPSP.Ac−N転移ベクター。
Sf9昆虫細胞を、線形化AcMNPVDNA(Invitrogen)およびそれぞれpPSP.Ac−E、pPSP.Ac−MおよびpPSP.Ac−Nの組換えプラスミドDNAを用いて、製造業者の指示に従って同時トランスフェクションした。推定的組換えウイルスを、3回の閉塞体が負のプラーク(occlusion-negative plaque)の精製後に選択した。組換えウイルスに挿入された遺伝子は、ハイブリダイゼーションおよびPCR増幅によって確かめた(O'Reilly et al., 1992)。4個の組換え体を組み換えウイルスの3株のそれぞれについて選択し、ブタ抗PRRSV血清を用いる免疫蛍光分析法と同様であることを見出した。それぞれの株から1個の組換えウイルスを任意に選択し、ORF5を含む組換えウイルスについてはvAc−E1、ORF6を含む組換えウイルスについてはvAc−M1、およびORF7を含む組換えウイルスについてはvAc−N1と命名した。
ウェスタン免疫ブロット分析は、以前に報告されている方法に従って行った(Harlow and Lane, 1988)。感染した昆虫細胞、精製PRRSVまたは正常細胞からの全タンパク質を、試料として用いた。タンパク質をSDS−PAGEで分離し、電気泳動によりニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を3%BSAでブロックし、ブタ抗PRRSV血清と室温にて1時間反応させた。結合抗体は、ヤギ抗ブタIgGペルオキシダーゼ接合体とインキュベーションした後、4−クロロ−1−ナフトール基質と発色させることによって検出した。
感染したHigh FiveTM細胞を5μg/mlツニカマイシンと共に細胞−培地中で感染後0〜72時間インキュベーションし、回収してSDS−PAGEを行った(O'Reilly et al., 1992)。
組換えタンパク質または精製PRRSVの場合には、エンドグリコシダーゼF/N−グリコシダーゼF混合物(PNGアーゼF)およびエンドグリコシダーゼH(Boehringer-Mannheim Biochemicals)を用いて、製造業者の指示通りに感染High FiveTM細胞(0.1PFU/細胞;感染後72時間)からの溶解生成物を処理した。簡単に説明すれば、105個の細胞を、30μgのリーシス緩衝液で溶解した。次に、細胞溶解生成物10μgをPNGアーゼF、エンドグリコシダーゼHで消化し、または未処理のマーカー保持し、未処理コントロールとして用いた。試料を37℃で24時間インキュベーションした後、SDS−PAGE上で分析した。
組換えバキュロウイルスまたは野生型(wt)AcMNPVに感染したHigh FiveTM細胞および未感染High FiveTM細胞をメチオニン不含培地で1回洗浄し、感染から48時間後に1時間飢餓状態にした。次に、50ci/mlのTrans35S標識(メチオニンおよびシスチン)(Amersham Life Science Inc.)/メチオニン不含培地を、感染細胞に加えた。3時間後に、細胞をPBSで洗浄し、RIPAリーシス緩衝液(10mMTris−HCl,pH8.0;1mM EDTA;150mM NaCl;1%NP40;1%デオキシコール酸ナトリウム;0.1%SDS)に加えた。免疫沈澱およびゲル電気泳動は、以前に記載されている方法で行った(Hutchinson et al., J. Virol., 66:2240-2250 (1992))。
IFAは、以前に報告されている方法で行った(O'Reilly et al., 1992)。High FiveTM細胞の単層にwtAcMNPVまたは組換えバキュロウイルスを接種し、72時間インキュベーションし、固定して、総ての組換えタンパク質発現をブタ抗PRRSV血清で検出した。接種を行った昆虫細胞は、細胞表面タンパク質の存在についても検討した。未固定で未透過性化細胞をブタ抗血清と4℃で1時間反応させ、フルオレセインを標識したヤギ抗ブタIgG接合体と共に4℃で更に1時間インキュベーションした後、蛍光顕微鏡下で観察した。
vAc−E1、vAc−M1、およびvAc−N1に感染した昆虫細胞の溶解生成物を、12週齢のウサギに筋肉内および皮下注射した。2匹のウサギを、E、MおよびN組換えタンパク質のそれぞれについて免役した。3週間の間隔を置いて、2回の追加接種を行った。注射投与量は、2×106個の昆虫細胞由来の細胞溶解生成物であった。2回目の追加接種の10日後に、血液を採取した。抗体は、間接ELISAで試験した。精製PRRSVビリオンを超音波処理し、96ウェルのプレートのコーティングに用い、ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼ接合体を用いて、ウサギ血清試料中の抗PRRSV抗体を検出した。免疫前ウサギ血清を、負のコントロールとして用いた。基質2,2′−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)を用いて、特異的反応を明らかにした。
組換えバキュロウイルスにおけるPRRSVの存在の確認
ハイブリダイゼーションおよびPCR増幅を行い、組換えバキュロウイルスにクローニングされた遺伝子が含まれていることを確認した。PRRSV遺伝子からのプローブと組換えバキュロウイルスのハイブリダイゼーションにより、PRRSV遺伝子が組み換えバキュロウイルスに含まれていることが示された。PRRSV遺伝子からの特異的プライマーによるPCR増幅では、組換えウイルスからでありかつwtAcMNPVにはない単一バンドが示された(結果は示されていない)。これらの試験により、組換えバキュロウイルスがPRRSV遺伝子ORF5〜7を含むことを確かめた。
vAc−E1、vAc−M1、vAc−N1およびwtAcMNPVに感染したHigh FiveTM細胞を、総発現タンパク質および細胞表面発現の存在について検討した。vAc−E1およびvAc−M1に感染した細胞には、弱い細胞質傾向が見られた。対照的に、vAc−N1に感染した昆虫細胞には、強い細胞質蛍光が見られ、wtAcMNPVに感染した細胞には、蛍光は見られなかった(図18)。vAc−E1およびvAc−M1に感染した細胞には、明瞭な細胞表面免疫蛍光が見られた(図16)。しかしながら、vAc−N1およびwtAcMNPVに感染した昆虫細胞には、表面免疫蛍光は見られなかった。また、組換えウイルスに感染した抗体昆虫細胞の非存在下では、蛍光は全く見られなかった(データーは示されない)。
昆虫細胞での予想タンパク質の発現を分析するため、High FiveTM細胞の集密単層に、0.1PFU/細胞の感染多重度で、それぞれvAc−E1、vAc−M1およびvAc−N1を感染させ、72時間インキュベーションした。総タンパク質試料にSDS−PAGE処理を行い、ブタ抗PRRSV血清を用いてウェスタンブロット法によって分析した(図19A)。昆虫細胞で発現した組換えタンパク質Eは、16、18、20、24および26kDaの多バンド種として検出された。昆虫細胞で発現したEは、精製PRRSVにおける26kDaの種である天然のEと比較して多様性が大きくかつMrが低かった。昆虫細胞で発現したMは、19kDaのバンドとして検出され、精製PRRSVでの天然Mに相当した。昆虫細胞で発現したNは、15kDaのバンドとして検出され、これも精製PRRSVでの天然Nに相当した。これらの特異的バンドは、正常な昆虫細胞(結果は示されていない)およびwtAcMNPVに感染したものでは検出されなかった。精製PRRSビリオンは、同じゲルで分析した。少なくとも5個のバンド15、19、24,26〜30および45kDaが見られた。精製PRRSビリオンで検出された特異的バンドは、正常な哺乳類細胞コントロールでは見られなかった。
昆虫細胞で発現したE、MおよびNがN−グリコシル化を行うかどうかを決定するため、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞をツニカマイシンで処理し、N−結合グリコシル化を阻害した。ツニカマイシン処理の後には、20〜26kDaの種はvAc−E1に感染した昆虫細胞では検出されなかったが、16および18kDaのバンドが更に多くなった。vAc−M1およびvAc−N1に感染した細胞では、MおよびNタンパク質のMrにはツニカマイシン処理の後には変化が見られなかった(図20B)。
組換えタンパク質E、MおよびNを、vAc−E1、vAc−M1およびvAc−N1に感染した昆虫細胞の溶解生成物でウサギを免役することによって、免疫原性について試験した。次に、ELISAを行い、ウサギ血清試料における抗PRRSV抗体の存在について試験した。E、MおよびNで免役したウサギの平均力価は、それぞれ384、320および2,056であった(表7)。
PRRSVの遺伝子E、MおよびNを含む組換えバキュロウイルスを構築し、昆虫細胞でE、MおよびNを発現させた。High FiveTM細胞のタンパク質収率はSf9細胞より高いと考えられるので、Sf9細胞をバキュロウイルスの増殖に用い、High FiveTM細胞をタンパク質発現に用いた(Wickman et al., 1992 and Davis et al., 1993)。
ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の改質生ウイルスワクチンを凍結乾燥ウイルスケーキとして調製し、滅菌水で再構成し、皮下(SC)または筋肉内(IM)経路で投与した。この研究の目的は、3週齢のブタでのPRRSVワクチンの免疫原性を1回の2ml用量をIMまたはSCでワクチン接種することによって確認することであった。また、PRRSVワクチンが、ビルレントPRRSVかぶISU−12によるチャレンジからブタの保護において、2ml用量をIMまたはSCで1回ワクチン接種した3週齢のブタで安全でありかつ有効であるかどうかも決定した。
70頭の雑種PRRSV血清反応陰性のブタ(陽性比<0.4に対するIDEXX ELISA試料)をEvergreen Partners( モーリス,ミネソタ)から購入し、この研究に用いた。総てのブタは、ワクチン接種の時点で3週齢であった。
ウイルス株ISU−55を含んでなるPRRSVワクチンを、ウイルス継代レベルX+5で生産した。ワクチンは、使用前に2°〜7℃で保存した。ワクチンは、5個を力価測定した。
保存ワクチンを、凍結乾燥ウイルスの一部を滅菌水で再構成することによって調製した。保存ワクチンを、培地で最小保護用量レベル(用量当たり約104TCID50)にまで希釈した。調製したワクチンの典型的な分量を、ウイルス抗原の定量の目的で−70℃に保持した。この研究に用いた70頭のPRRSV血清反応陰性の感受性の強いブタを、無作為に4つの処理群に分け、下記のようにしてわく接種した。
ワクチン接種から36日後、群A、BおよびCの20頭のブタのそれぞれを共通隔離室(common isolation room)で混合し(commingled)、ビルレントPRRSVでチャレンジした。群Dの動物は、非チャレンジコントロールとして残した。ビルレントISU−12PRRSVチャレンジウイルスは、アイオワ州立大学(エイムス、アイオワ)から入手した。ビルレントISU−12PRRSVチャレンジウイルスを、PSP36細胞で膨張させた後、凍結(−70℃)保存物として保持した。それぞれのブタノールに、チャレンジウイルス2mlを鼻内投与した。PRRSVチャレンジ保存物を融解し、104TCID50/2mlに希釈した後、投与した。チャレンジウイルスは、チャレンジの際には氷に固定した。チャレンジウイルス製剤の分量を−70℃に保持して固定した後、PSP36細胞上で力価測定した。動物を、−1および0のチャレンジ後日数(DPC)に観察して、各種臨床症状にについてベースラインおよび1〜10DPCを確立した。
ブタを、食欲不振、嗜眠、下痢、神経学的症状、呼吸困難、チアノーゼおよび死亡のようなチャレンジ後の臨床症状について毎日評価を行った。
個々のブタの肺を、チャレンジから10日後の剖検時に全体的病巣について検討した。全体的肺病巣の採点者は、それぞれのブタがどの処理群に属しているのか知らされていなかった。簡単に説明すれば、それぞれの肺葉での肺病巣についての得点は、PRRSV様病巣(色および組織に基づく)を示す肺葉の比率を計算して記録し、その肺葉について可能な点数を掛けた。各肺葉についての最大得点は、肺葉によって占められる全肺容積の相対比によって決定された。次に、総ての肺葉の背側および腹側の外観からの得点を加えて、各ブタについての総得点を得た。各動物についての可能な最大総得点は、100であった。
ワクチン接種体(vaccinates)およびコントロールについての臨床的症状および全体的病巣の得点を、変動分析を用いて比較した(一般的線形モデル)。非階層化全体的病巣得点を用いる分散モデルの分析の使用は、正規確率分布内の得点を当てはめることによって正当化された。パラメーター分析の誤差の比較は、それらが正規分布していることを示唆し、分散分析についての主要な仮定を実証していた。従って、階層化した全体的肺病巣得点を用いるデーター分析は、必要なかった。総ての統計分析は、SASソフトウェアを用いてIBMコンピューターで行った。
VSコードワクチンでのPRRSV抗原力価
PRRSVワクチン抗原力価測定の結果を、表8に示す。5回の力価測定からのワクチンの用量当たりの平均PRRSV力価は、103.92TCID50であった。
ワクチン接種の後、ワクチン接種したブタのいずれにも、臨床的症状は見られなかった。ビルレントPRRSVISU−12p6を投与した後、ワクチン接種体およびコントロールブタは、チャレンジ後の10日間の観察期間中に呼吸器または神経学的疾患の有意な臨床的徴候は見られなかった。
全体的肺病巣の採点の結果を、表9に示す。PRRSV投与の後、全体的肺表層の得点は、IMワクチン接種したブタ(群A)では0〜29であり、平均得点は14.15であり、SCワクチン接種したブタ(群B)では1〜27であり、平均得点は11.20であり、ワクチン接種していないチャレンジコントロールブタ(群C)では7〜57であり、平均得点は25.80であり、ワクチン接種していない非チャレンジコントロールブタ(群D)では1〜28であり、平均得点は10.90であった。IMおよびSCワクチン接種したブタのいずれも、ワクチン接種していないチャレンジコントロールブタより肺病巣は有意に少ない(p<0.05)。ワクチン接種したブタは、ワクチン接種していない非チャレンジブタの全体的肺病巣の得点と比較して、全体的肺病巣得点に有意差はなかった(P>0.05)。ワクチン接種していないチャレンジコントロールブタは、ワクチン接種していない非チャレンジコントロールブタより有意に高い全体的肺病巣を有していた(P<0.05)。
この研究の結果は、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルスの改質生ウイルスワクチンが、ビルレントPRRSVチャレンジによって引起される呼吸器疾患の予防における補助として3週齢以上の健康なブタに使用するのに有効であることを示している。改質生ワクチンを接種した3週齢ブタの100%は、ワクチン接種の後に局部的または全身的臨床上の悪影響を受けなかった。これらのブタは、ワクチン接種後の36日の全観察期間中健康かつ活動的であった。ワクチンを103.92TCID50の用量で筋肉内または皮下投与したブタは、外来性のビルレントPRRSVチャレンジ株ISU−12を投与した後は、ワクチン接種していないチャレンジコントロールブタと比較して全体的肺病巣の発現が有意に減少した(p<0.05)。ワクチン接種したブタのチャレンジ後の全体的肺病巣得点は、ワクチン接種していない非チャレンジコントロールと統計学的に識別できなかった(p>0.05)。分散のパラメーター分析の誤差の分析では、それらが正規分布していることを示唆し、分散分析についての主要な仮定を実証していた。ワクチン接種したブタは、いずれもチャレンジ後の期間中に臨床的徴候を示さなかった。
PRRSV単離体VR2385の完全配列
材料および方法
ウイルスおよび細胞
PRRSV単離体VR2355、継代7を、この研究に用いた。連続細胞系ATCCCRL11171を、ウイルスの成長およびウイルス感染細胞培養からのウイルスRNAおよび総RNAの単離に用いた。
VR2385のゲノムのORF1領域を特性決定するため、ランダムcDNAλライブラリーをUni-Zap cDNAクローニングキット(Stratagene, ラヨラ, カリフォルニア)を用いて構築した。簡単に説明すれば、CRL11171細胞にVR2385ウイルスを0.1のM.O.I.で感染させ、感染細胞からの総RNAを感染から24時間後にグアニジニウムチオシアネート法を用いて単離した。最初に、ORF2の5′末端に特異的なプローブを用いて、ランダムcDNAライブラリーをスクリーニングした。このプローブとハイブリダイズしたプラークを単離して、精製した。ウイルスcDNAインサートを含むファージミド(phagemids)を、ExAssistヘルパーファージおよびE. coli SOLR細胞(Stratagene, ラヨラ, カリフォルニア)を用いるイン・ビトロ切除によって回収した。ORF1に特異的な重複断片とハイブリダイゼーションした後に、大きさが2〜6kbの範囲のウイルス特異的cDNAインサートを有する数個の組換えファージミドを選択した。次に、ウイルスcDNAインサートを含むプラスミドを精製し、自動DNAシークエンサー(Applied Biosystems, フォスターシティー, カリフォルニア)を用いてサンガーのジデオキシヌクレオチド連鎖停止法によって配列決定した。普遍、逆およびPRRSV特異的内部プライマーを用いて、配列を決定した。ORF1aおよび1bの配列を表す少なくとも2個の独立したcDNAクローンを配列決定した。ライブラリーで表されない1つの領域(nt1950〜2050)を、プルーフリーディングTag Extender (Stratagene)のTagDNAポリメラーゼを用いて、プライマーIM687(5−CCCCATTGTTGGACCTGTCC−3′)およびIM2500(5′−GTCACAACAGGGACCGAGC−3′)でPCR増幅した。配列決定データーを集めて、Mac Vector (Ingternational Biotechnologies, Inc., コネチカット)およびGene Works (IntelliGenetics, カリフォルニア)コンピュータープログラムを用いて分析した。
プライマー伸張実験は、SureScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (Gibco BRL)を用いて行った。32PひょうしきしたオリゴヌクレオチドRNS(5′−CCAAGCTCCCCTGAAGGAGGCTGTCAC−3′)を、総容積が12μlのVR2385のウイルスRNA0.5μgと混合し、RNAを90℃で10分間変性した。試料を、第一鎖cDNA緩衝液(first strand cDNA buffer)で19μlの総量に調整し、42℃で5分間インキュベーションし、プライマーのアニーリングを行った。次に、Super Script II逆転写酵素を反応に加えて、反応混合物を42℃または50℃で 分間インキュベーションした。試料を40%ポリアクリルアミドゲル中で分析した。リーダーの部分配列を含むプライマー伸張生成物をpPR59クローンの配列決定反応に続いて泳動した。オリゴヌクレオチドRNSは、配列決定反応のプライマーとして作用した。
PRRSVVR2385のリーダー配列
以前は、λZapベクターにおけるPRRSVVR2385のオリゴdTおよびランダムcDNAライブラリーを、そして今回はORF1bの部分の配列を構築し、完全ORF2〜7を決定した。ORF1のATG開始コドンの161ヌクレオチド上流のVR2385の部分リーダー配列は、クローンpPR59から得た。LDVのリーダー配列は156ヌクレオチドであり、LV(PRRSVの欧州単離体)のリーダー配列は221ヌクレオチドであることは、以前に示されている。米国PRRSVの完全リーダー配列を決定するため、プライマー伸張実験を行った。1つの実験では、SuperScript II逆転写酵素を用いて42節し及び50℃で、cDNAを合成した。もう一つの実験では、Mnの存在下でrTth DNAポリメラーゼを60℃でのcDNA合成に用い、cDNA合成中のリーダーRNAにおける二次構造のポテンシャルを最小限にした。総ての実験において、生成したcDNA断片の長さは同一であり、約190ヌクレオチド出会った。PRRSVVR2385の完全リーダー配列を検出するため、ウイルスRNAの直接配列決定を行った。スクロースグラディエントによって精製したウイルスから単離したビリオンRNAを、直接RNA配列決定反応に用いた。直接RNA配列決定は、ORF1aのAUG開始コドンの10〜67nt上流の位置におけるリーダー配列に相補性のプライマーを用いて行った。リーダー特異的プローブを用いるcDNAライブラリーのスクリーニングによって以前に検出された161ntのリーダー配列の他に、追加の27ヌクレオチドのリーダー配列を同定した。リーダーの究極5′末端における2個のヌクレオチドは、配列決定ゲル中の4個のレーン総てで強いバンドが観察されたため、同定することができなかった。直接RNA配列決定によって決定されたリーダーの大きさは、プライマー伸張実験の結果と相関した。直接RNA配列決定によって得られたデーターを更に確かめるため、RT−PCRを、リーダーの究極5′末端に相当する16b.p.のプライマーおよびリーダーの3′末端の10nt上流に位置したアンチセンスプライマーを用いて行った。直接RNA配列決定によって得られた結果と一致する予想された180b.p.のPCR断片を増幅した。従って、PRRSVVR2385のリーダーの推定的大きさは190ntであり、LV(221nt)、EAV(212nt)およびSHFV(208nt)について報告されたものより小さいが、LDV(156nt)について報告されたリーダー配列より大きかった。リーダーの3′末端の接合領域の配列は、TTTAACCであった。ORF1aのATG開始コドンは、この配列の直ぐ下流に位置している。同様な結果は、LV、LDVおよびSHFVについても報告されており、ORF1aの開始コドンは接合配列の後にも位置している。しかしながら、EAVリーダー接合配列のゲノムは、ORF1aの開始コドンの13nt上流に報告されていた。VR2385のリーダー配列とLV、LDVおよびSHFVのリーダー配列の間のヌクレオチド配列アイデンティティーの割合は、それぞれ55%、47%および38%であった。意外なことには、VR2385のリーダーの3′末端の最後の44ヌクレオチドのみが、LVのリーダー配列と有意な相同性を有している(この領域では86%アイデンティティー)。VR2385とLDV(64%)およびSHFV(63%)との間では、この44nt領域では、比較的高い相同性も見られた。VR2385とEAVのリーダー配列の間には、有意な相同性は見られなかった。
PRRSVVR2385のORF1を分析するため、λZapベクターにおけるランダムプライムドcDNAライブラリーを、ウイルス感染細胞の総RNAから構築した。cDNAライブラリーからの20を超過する重複cDNAクローンを選択して、配列決定した(図23)。ほとんどの領域について、配列は、少なくとも2個の独立したクローンから決定した。ヌクレオチド1900〜2050に相当する領域はcDNAライブラリーでは表されず、このゲノム領域をPCR増幅し、配列決定した。配列分析は、ポリA配列を除くPRRSV(米国単離体VR2385)のゲノムRNAは長さが15100ヌクレオチドであった。
ORF1aの大きさの予想は、7179ヌクレオチドである。これは、ヌクレオチド191から7387までに及んでおり(停止コドンTAGを除外)、2399アミノ酸のポリタンパク質をコードする。リーダーゲノム接合領域はLVのそれに類似しており、ATG開始コドンは、リーダーのTTTAACCは胃列の直後に位置している。LVおよびVR2385のORF1配列を比較したとき、差を同定した。LVにおけるORF1aは、長さが7188ヌクレオチドであり、VR2385より3アミノ酸だけ短い2396アミノ酸をコードする。VR2385およびLVのヌクレオチド配列を対にして比較したところ、ORF1aの5′末端は3′末端より発散性であることを示唆していた。VR2385およびLVの間のヌクレオチド配列55%アイデンティティーは、ORF1aの3′末端では61%であり、(ヌクレオチド3050〜7387)、ORF1aの最初の1500ヌクレオチドでは55%、ヌクレオチド1500〜2500の涼気では46%である。ORF1a中の最可変領域は、ヌクレオチド2500〜3000の間に位置し、VR2385とLVとの間には有意な相同性はなかった。アミノ酸アイデンティティーは1〜530アミノ酸の領域については49%であり、1100〜2399アミノ酸の領域については55%であり、アミノ酸530〜1100に及ぶ領域では有意な相同性は見られなかった。VR2385とLDVのORF1aの配列を比較したところ、最初の2000ヌクレオチドには52%の相同性があり、ORF1aの最後の3800ヌクレオチドでは55%の相同性があった(VR2385における3400〜7197ntおよびLDVにおける2850〜6678ntに相当)。VR2385の2000〜3400ntおよびLDVの2500〜2850ntの領域は高可変性であり、LDVゲノムには500ntを上回る欠失がある。予想アミノ酸配列の比較では、アミノ酸1〜500の領域についての相同性は36%であり、予想タンパク質の最後の1300アミノ酸を含む領域(VR2385では1120〜2353aaについては39%であり、LDVでは940−2226aa)については39%であった。
PRRSVVR2385のサブゲノムmRNAにおけるリーダー配列およびリーダー−本体接合部位の特性決定
PRRSVVR2385の完全なリーダー配列を決定するため、リーダー特異的32P標識PCRプローブを用いるオリゴdTcDNAライブラリーのスクリーニング、T4RNAリガーゼを用いるウイルスRNAのRNA連結(RNA円形化)の後、ORF7およびリーダー特異的プライマーを用いるRT−PCR、およびウイルスRNAの5′末端の直接配列決定(例7)などの幾つかの方法を用いた。第一に、リーダー配列の100b.p.断片をプローブとして用いて、オリゴdTλライブラリーからリーダー配列を含むcDNAクローンを検出した。8個のcDNAクローンを分析して配列決定し、これらのクローンがmRNA7(5クローン)、6(2クローン)、および2(1クローン)のリーダー配列を表すことを見出した。リーダー配列の大きさは、7クローンの6つで160から163ヌクレオチドまで変化した。mRNA6を表すクローンの1つでは、リーダー特異的配列は172ヌクレオチドであった。ウイルスのリーダー内の強力な二次構造がλZapライブラリーの構築の際にリーダーRNAの完全cDNA合成を妨げた可能性がある。第二の実験では、ウイルスRNAの3′および5′末端をT4RNAリガーゼを用いて頭−尾方式で連結した。フェノールクロロホルム抽出および沈澱の後、連結RNAにプライマーIM1003(アンチオリゴヌクレオチド、リーダー配列の3′末端相補性)およびIM1004(オリゴヌクレオチド、ゲノム3′非コード領域のセグメントに相当、ポリ(A)尾の100ヌクレオチド上流)を用いてRT−PCR反応を行った。大きさが250〜350ヌクレオチドのPCR生成物の拡散バンドをアガロースゲルから精製し、pSK+ベクターにクローニングした。7個の独立したクローンを配列決定した。配列分析では、ゲノム3′末端におけるポリA配列およびゲノムの5′末端におけるリーダー配列を全7クローンで互いに連結したが、リーダー配列の3′末端からの95〜96ヌクレオチドのみがウイルスゲノムの3′末端と連結した。ポリAで配列決定したクローンの大きさは、各クローンで9から42ヌクレオチドまで変化し、配列決定されたクローンは独立していることを示唆していた。VR2385の推定的な完全長のリーダー配列は、スクロースグラディエント精製したウイルスから単離したビリオンRNAの5′末端の直接RNA配列決定によって決定した。
VR2385株のsgRNAのリーダー本体接合領域を特性決定するため、リーダー特異的プライマー、およびそれぞれのsgmRNAに特異的なプライマーを用いてRT−PCRを行った。20感染後時間(h.p.i.)に単離した総RNAを用いて、RT−PCRを行った。主要なバンドをアガロースゲルから単離して、クローニングし、配列決定した。PCR生成物の直接配列決定も行った。PRRSVのゲノムにおけるリーダー本体接合領域を同定するため、リーダー特異的32P標識プローブを用いて、ウイルスRNAから生成したランダムcDNAライブラリーをスクリーニングし、リーダー−ORF1a接合領域を含む幾つかのクローンを単離して、配列決定した。sgmRNA2〜7のリーダー本体接合領域を特性決定した。
PRRSVの米国単離体のサブゲノムmRNAの合成の機構は、LV、LDVおよびEAVの機構と類似している。VR2385で検出された遺伝子間領域は一層可変であり、LVと比較すると、様々な部位に位置した。リーダー本体接合配列の変動は、リーダー本体接合が不正確であることを示している。sgmRNAにおける実際のリーダー本体接合部位の位置は、リーダープライミング以外の(複数の)機構がsgmRNAの合成に関与している可能性があることを暗示している。PRRSVの米国単離体のゲノムにおける代替リーダー−本体接合部位は、PRRSVの様々な株の中のsgmRNAの数の変動を生じることができる。
PRRSVの農場単離体からのPRRSVの高継代ISU55株の同定および識別についての信頼性のある試験を、下記に示す。以前の研究では、低継代ISU55株(継代7)の配列を決定し、この配列を用いてISU55hp株の識別のためのRFLP試験を開発した。第一段階として、ISU55p−7の配列を分析して、ユニーク制限部位を含む可変領域を同定した。コンピューターによる配列分析および異なるPRRSV株の配列との比較の後、2つのユニーク制限部位を含む特異的領域をORF4の3′末端で同定した。これらの2つの制限部位は、ISU55(p−7)配列におけるORF2のATG開始コドンの上流位置に対して、1510位のDraI(TTT/AAA)および1697位のBalI(MscI)(TGG/CCA)であった。これらの2つの制限部位は、ISU55株の相当する領域にのみ存在したが、他のPRRSV株には存在しなかった。
弱毒化PRRSVワクチン株(ISU55p49)のゲノムの配列決定
VR2385株の配列を決定した後、得られた配列決定情報を用いて、弱毒化PRRSV株(ワクチン株)の配列を決定した。ワクチン株の全ゲノムを、21の重複断片で増幅し、配列決定した。配列決定データーを組合わせると、ゲノムの全体の大きさは15,412ヌクレオチドであり、VR2385株のゲノムの長さと比較して309nt長かった。ORFマップおよびそれらの位置を、図31に示す。ワクチン株とVR2385株のゲノムを比較したところ、ORF1b−ORF7の大きさと相対的位置は同じであった。ORF1aは最も可変であり、1個の309ヌクレオチド欠失が、ワクチン株の配列と比較してVR2385のゲノムに見出された。この欠失はフレームにあり、VR2385PRRSVのゲノムの5′末端から3242ヌクレオチドの位置のORF1aの領域に配置された。もう一つの3ヌクレオチドは、ワクチン株のゲノムに比較して1aa欠失を引起すゲノムの領域2504〜2515ntで欠失した。ワクチン株およびVR2385株の異なるORFのゲノムの比較の結果を、表13にまとめる。これらの株の間の全般的DNAの相同性は約91%であり、両株で14094ヌクレオチドが同一であった。309ntの欠失を除けば、DNA相同性は93%であった。リーダー配列は、VR2385株についてだけ、ウイルスRNAの直接配列決定によって決定し、VR2385のリーダーの5′末端に特異的な17bpプライマーを用いて、ワクチン株のリーダーの170nt部分を増幅した。これらの配列を比較すると、総体的相同性は94%であり、両株には単一のヌクレオチド欠失があり、VR2385リーダーのヌクレオチドA(75位)およびG(119位)は、ワクチン株のリーダーではなくなっており、ワクチン株リーダーのヌクレオチドA(87位)およびG(124位)はVR2385株のリーダーではなくなっている。
VR2385単離体における欠失の分析
VR2385PRRSVから増幅したPCR生成物は、ORF1aに445bpの欠失が存在することを示していた。上記の445bpの欠失並びに309bpの欠失はフレームにあり、重複しており、独立した起源のものであると思われた。プラーク精製の後、これらの欠失変異体はVR2385の固体に現われ、445ntの欠失を有する変異体はウイルス保存物で主成分となった。この変異体は、低継代ウイルス、高継代ウイルスおよびブタで2回継代したウイルスから単離したRNAのPCR検討に基づけば安定であると考えられる。309bp欠失変異体は少量であると思われ、ネステドPCRによってのみ特異的プライマーを用いて幾つかのウイルス保存物から増幅することができた。
連続継代PRRSVの特性決定
細胞培養の継代によって弱毒化が起こるかどうかを決定するため、VR2385継代7(p7)およびVR2385継代85(p85)を用いて3週齢のブタに感染させた。感染から10日後に、推定の全体的肺病巣および臨床的呼吸器得点は、低継代ウイルスに感染したブタでは有意に高かった。ゲノムのORF2〜7領域を配列決定し、比較した。VR2385の2つの継代の遺伝子分析では、ORF6は最も保存され、アミノ酸レベルで100%相同であることを示している。残りのORFは、アミノ酸相同性が95〜98%であり、未熟な停止コドンを含むVR2385p85のORF2では、推定10個のアミノ酸の切捨てを生じた。
Claims (20)
- 配列番号: (ISU−12)からなるブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)をコードするDNA配列。
- 配列番号: のヌクレオチド191〜7387(ORF1a)、
配列番号: のヌクレオチド7375〜11757(ORF1b)、
配列番号: のヌクレオチド11762〜12529(ORF2)、
配列番号: のヌクレオチド12385〜13116(ORF3)、
配列番号: のヌクレオチド12930〜13463(ORF4)、
配列番号: のヌクレオチド13477〜14076(ORF5)、
配列番号: のヌクレオチド14064〜14585(ORF6)、および
配列番号: のヌクレオチド14578〜14946(ORF7)からなる群から選択される請求項1に記載のPRRSVのオープンリーディングフレームをコードするDNA配列。 - 請求項2に記載のDNA配列によってコードされるポリペプチド。
- 請求項2に記載のDNA配列によってコードされる1個以上のポリペプチドを含んでなるPRRSVに対する抗体を誘導するための組成物。
- 配列番号: (ISU−55)からなるPRRSVをコードするDNA配列。
- 配列番号: のヌクレオチド191〜7699(ORF1a)、
配列番号: のヌクレオチド7687〜12069(ORF1b)、
配列番号: のヌクレオチド12074〜12841(ORF2)、
配列番号: のヌクレオチド12692〜13458(ORF3)、
配列番号: のヌクレオチド13212〜13775ORF4)、
配列番号: のヌクレオチド13789〜14388(ORF5)、
配列番号: のヌクレオチド14376〜14592(ORF6)、および
配列番号: のヌクレオチド14890〜15258(ORF7)からなる群から選択される請求項5に記載のPRRSVのオープンリーディングフレームをコードするDNA配列。 - 請求項6に記載のDNA配列によってコードされるポリペプチド。
- ブタにおいて抗体を誘導するのに有効な配列番号: (ISU−55)によってコードされるPRRSVの一定量および生理学的に許容可能なキャリヤーを含んでなる、PRRSVに対する抗体を誘導するための組成物。
- 請求項6に記載のDNA配列によってコードされる1個以上のポリペプチドを含んでなる、PRRSVに対する抗体を誘発するための組成物。
- 上記の5週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変を統計学的に有意な量だけ減少させ、この量が接種していない5週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変と比較して有意であり、すなわちp値が0.01未満である、請求項8に記載の組成物。
- 上記の5週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変を統計学的に有意な量だけ減少させ、この量が接種していない5週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変と比較して有意であり、すなわちp値が0.01未満である、請求項9に記載の組成物。
- 更にアジュバントを含んでなる、請求項8に記載の組成物。
- 更にアジュバントを含んでなる、請求項9に記載の組成物。
- ブタ生殖器および呼吸器疾患からブタを保護する方法であって、請求項8に記載の組成物の有効量をこの疾患から保護する必要があるブタに投与することを含んでなる、方法。
- 上記ワクチンを経口または非経口投与する、請求項14に記載の方法。
- 上記ワクチンを筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、皮下または鼻内投与する、請求項14に記載の方法。
- ブタ生殖器および呼吸器疾患からブタを保護する方法であって、請求項9に記載の組成物の有効量をこの疾患から保護する必要があるブタに投与することを含んでなる、方法。
- 上記ワクチンを経口または非経口投与する、請求項14に記載の方法。
- 上記ワクチンを筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、皮下または鼻内投与する、請求項17に記載の方法。
- PRRSV ISU−55株をPRRSVの他の株から識別する方法であって、
(a) 下記の2種類のプライマー
55F 5′−CGTACGGCGATAGGGACACC−3′、および
3RFLP 5′−GGCATATATCATCACTGGCG−3′
を用いてPRRSVのDNA配列を増幅し、
(b) 段階(a)の増幅した配列をDraIで消化し、
(c) 626bp、187bpおよび135bpの3種類の制限断片をPRRSV ISU−55株と相関させる
ことを特徴とする、方法。
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