KR20010082511A - 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(ｐｒｒｓｖ)의다핵산에 의해 코딩되는 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)로부터 단리된 다핵산, 이 다핵산에 의해 코딩되는 단백질 및(또는) 폴리펩티드, 돼지를 PRRSV로부터 보호하는, 이러한 단백질 또는 다핵산을 기재로 한 백신, 이러한 단백질, 폴리펩티드 및 다핵산의 제조 방법, 이러한 백신을 사용하여 돼지를 PRRS로부터 보호하는 방법, 이러한 백신의 제조 방법, PRRSV에 감염 또는 노출된 돼지를 치료하는 방법 및 PRRSV의 검출 방법에 관한 것이다.

Description

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(ＰＲＲＳＶ)의 다핵산에 의해 코딩되는 단백질 {Proteins Encoded by Polynucleic Acids of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(PRRSV)}
새롭고 심각한 돼지 질환인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)은 1987년 미국에서 최초로 보고되었고, 서부 유럽의 여러 국가에 빠르게 알려졌다[고얄(Goyal)의 문헌[J. Vet. Diagn. Invest., 1993, 5:656-664], 및 미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호에 개시됨]. 이 병은 암퇘지 및 어린 암퇘지의 번식 장애, 성장중인 어린 돼지의 폐렴 및 이유기전 사망의 증가를 특징으로 한다[웬스부르트(Wensvoort) 등의 문헌[Vet. Q., 13:121-130, 1991], 크리스챤슨(Christianson) 등의 문헌[1992, Am. J. Vet. Res. 53:485-488], 미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호].
PRRS의 원인 물질인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)는 유럽에서 최초로 확인되었고, 그 후에 미국에서 확인되었다[콜린스(Collins) 등의 문헌[1992, J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126]]. 렐리스타드 바이러스(LV)로 명명된 PRRSV의 유럽형 균주를 클로닝하고 서열분석하였다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌[1993, Virology, 192:62-72] 및 문헌[J. Gen. Virol., 74:1697-1701], 콘젤만(Conzelmann) 등의 문헌[1993, Virology, 193:329-339]].
PRRSV는 말 동맥염 바이러스(EAV), 젖산 탈수소화효소-증가 바이러스(LDV) 및 원숭이 출혈열 바이러스(SHFV)를 포함하는 아테리바이러스의 신규 바이러스과에 속하는 단일한 아테리바이러스속으로 분류되었다[플라게만(Plagemann) 및 뫼니그(Moennig)의 문헌[1992, Adv. Virus. Res., 41:99-192], 고데니(Godeny) 등의 문헌[1993, Virology, 194:585-596], 미국 특허 출원 제08/131,625호, 제08/301,435호 및 카바나우그(Cavanaugh D.)의 문헌[1997, Arch. Virol. 142:629-633]]. 이러한 군의 단일(+)쇄 RNA 바이러스는 많은 특징, 예를 들어 게놈 조직, 복제 전략, 형태 및 마크로파지 향성을 공유한다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1993), 미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호]. 또한, 무증상 감염 및 항체 생산을 수반하는 지속형(persistent) 바이러스혈증은 아테리바이러스의 특징적인 조직병리학적 특성이다.
항원, 유전자 및 병원체 변이가 PRRSV 단리체 중에서보고되었다[웬스부르트(Wensvoort) 등의 문헌[1992, J. Vet. Diagn. Invest., 4:134-138], 마르다시(Mardassi) 등의 문헌[1994, J. Gen. Virol. 75:681-685], 미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호]]. 또한, 미국형 및 유럽형 PRRSV는 두가지 독특한 유전자형을 나타낸다[미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호]. 또한, 항원 변이성은 다른 북미형 단리체 중에도 마찬가지로 존재한다[웬스부르트(Wensvoort) 등의 문헌(1992)]. 병원성의 두드러진 차이는 미국형 및 유럽형 단리체 사이에서뿐 아니라 다른 미국형 단리체 중에서도 증명되었다[미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호].
아테리바이러스의 게놈 조직은 그의 복제시에 서브게놈 mRNA(sg mRNA)의 3'공통말단부 네스티드 세트를 형성한다는 점에서 코로나바이러스 및 토로바이러스를 닮았다[첸(Chen) 등의 문헌[1993, J. Gen. Virol. 74:643-660], 덴 분(Den Boon) 등의 문헌[1990, J. Virol., 65:2910-2920], 드 브리스(De Vries) 등의 문헌[1990, Nucleic Acids Res., 18:3241-3247], 쿠오(Kuo) 등의 문헌[1991, J. Virol., 65:5118-5123], 쿠오(Kuo) 등의 문헌(1992), 미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호]. 또한, 몇몇 북미형 단리체의 서열 일부분이 결정되었다[미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호, 마르다시(Mardassi) 등의 문헌[1994, J. Gen. Virol., 75:681-685]].
PRRSV의 게놈은 폴리아데닐화되어 있고 길이가 약 15 kb이며 8개의 오픈 리딩 프레임[ORF, 뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1993), 미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호]을 포함한다. ORF la 및 lb는 바이러스 RNA 중합효소를 코딩할 것이다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1993)]. ORF 5, 6 및 7은 글리코실화 막 단백질(E), 글리코실화되지 않은 막 단백질(M) 및 뉴클레오캡시드 단백질(N)을 각각 코딩하는 것으로 밝혀졌다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1995)]. ORF 2 내지 4는 막-관련 단백질의 특징을 지닌 것으로 보인다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1993), 미국 특허 출원 제08/301,435호]. LV의 ORF 2 내지 4는 각각 GP2,, GP3및 GP4로 표시되는 비리온-관련 단백질을 코딩한다[반 뉴브스타드트(Van Nieuwstadt) 등의 문헌[1996, 70:4767-4772]].
ORF 5에 의해 코딩되는 EAV의 주요 엔벨로프 당단백질은 바이러스 부착 단백질일 수 있고, 이 단백질에 대항하여 중화 모노클로날 항체(MAb)가 만들어진다[드 브리스(de Vries)의 문헌[J. Virol.1992; 66:6294-6303], 파베르크(Faaberg)의 문헌[J. Virol.1995; 69:613-617]]. PRRSV와 밀접하게 관련된 일원인 LDV의 주요 엔벨로프 당단백질도 ORF 5에 의해 코딩되고, 몇몇 다른 중화 MAb가 ORF 5 단백질을 특이적으로 면역침강시키는 것으로 밝혀졌다[카프루니(Cafruny) 등의 문헌[Vir. Res., 1986; 5:357-375]]. 따라서, ORF 5에 의해 코딩되는 PRRSV의 주요 엔벨로프 단백질은 PRRSV에 대한 중화 항체를 유도할 수 있을 것이다.
ORF 5에 속하는 몇군데 초가변성 영역이 확인되었고 항원성인 것으로 추정되었다[미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호]. 바이러스의 항원 변이는 숙주의 면역 반응에 의한 직접적인 변이체 선택의 결과인 것으로 여겨져왔다[도밍고(Domingo) 등의 문헌[J. Gen. Virol.1993, 74:2039-2045]에 개시됨]. 따라서, 이러한 초가변성 영역은 숙주의 면역 선택 압력이 그 원인인 듯하며 이로써 PRRSV 단리체 중에 관찰되는 항원의 다양성을 설명할 수 있다.
ISU 3927을 비롯한 미국형 PRRSV 단리체의 M 및 N 단백질은 고도로 보존되어 있다[미국 특허 출원 제08/301,435호]. 이 M 및 N 단백질은 PRRSV 비리온의 구조를 유지를 위한 구성요소이고, N 단백질은 기능이 엄격히 제한될 수 있다. 따라서, (a) 이 M 및 N 단백질이 주요 항체 선택 압력을 받거나 또는 (b) M 및 N 단백질을 코딩할 수 있는 ORF 6 및 7이 바이러스 독성의 원인이거나 또는 바이러스 독성과 상호관련될 것으로 보이진 않는다. 그러나, 흥미롭게도 LDV M 단백질의 더 많은 서열 변이가 신경 독성에 차이가 있는 LDV 단리체 사이에서 관찰되었다[쿠오(Kuo) 등의 문헌[1992, Vir. Res. 23:55-72]].
ORF la 및 lb는 프레임시프팅에 의해 1개의 단백질로 번역될 것으로 생각된다. ORF 2 내지 6은 바이러스의 막 관련 단백질을 코딩할 것이다.
많은 동물 바이러스가 게놈 RNA 이외에 1종 이상의 sg mRNA를 생산함으로써 바이러스 유전자를 조절된 방식으로 발현할 수 있다. PRRSV에 감염된 세포에서, 3'공통말단부 네스티드 세트를 나타내는, 바이러스-특이적 mRNA 7종이 합성되었다(mRNA 1 내지 7, 크기가 작아지는 순으로). mRNA 1은 게놈 mRNA을 나타낸다. 각 sg mRNA은 바이러스 게놈의 5'말단에서 유래되는 리더 서열을 포함한다.
sg mRNA의 수는 아테리바이러스마다 다르고 동일한 바이러스에서도 여러 단리체들마다 다르다. 6개 sg mRNA의 네스티드 세트를 EAV에 감염된 세포 및 유럽형 PRRSV에 감염된 세포내에서 검출하였다. 그러나, 게놈 RNA 외에 6개 (LDV-C) 또는7개 (LDV-P) sg mRNA의 네스티드 세트가 LDV에 감염된 세포내에 존재한다. LDV-P의 또다른 sg mRNA 1-1은 ORF 1b의 3'말단을 포함하며 잠재적으로는 바이러스 중합효소의 C-말단부를 나타내는 단백질로 번역될 수 있다. LDV 및 EAV sg mRNA의 서열 분석 결과, 리더-mRNA 연결 모티프는 보존되어 있는 것으로 나타났다. 최근에, 유럽형 LV의 리더-mRNA 연결 서열도 공통적인 모티프인 UCAACC 또는 고도의 유사한 서열을 포함하는 것으로 밝혀졌다.
sg mRNA는 몇몇 코로나바이러스, 예를 들어 소의 코로나바이러스(BCV) 및 전염성 위장염 바이러스(TGEV)의 경우 비리온내에 패키징되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 또다른 코로나바이러스인 마우스 간염 바이러스(MHV)의 정제된 비리온에서 미소량의 sg mRNA만이 검출되었다. 또한, PRRSV와 밀접하게 관련된 일원인 LDV의 sg mRNA는 비리온내에 패키징되지 않았고, 게놈 RNA만이 정제된 LDV 비리온내에서 검출되었다.
LDV 및 EAV의 sg mRNA의 특성은 상세히 알려져 있다. 그러나, PRRSV 균주, 특히 미국형 PRRSV의 sg mRNA에 대한 정보는 매우 한정되어 있다. 따라서, 미국형 PRRSV sg mRNA의 보다 완전한 분자 특성을 밝혀낼 필요가 있다.
MHV의 패키징 신호 서열은 ORF lb의 3'말단에 위치하며, 따라서 MHV의 게놈 RNA만이 패키징된다. 그러나, 정제된 비리온에서 BCV 및 TGEV의 sg mRNA가 발견된다. BCV 및 TGEV의 패키징 신호 서열은 분석되지 않았다. 아우라 알파바이러스의 sg mRNA는 비리온내에 효율적으로 패키징되는데, 이는 아마도 패키징 신호가 sg mRNA내에 존재하기 때문일 것이다. 패키징 신호가 게놈 단편내에 위치하기때문에(sg mRNA에는 존재하지 않음) 신드비스 바이러스의 26S sg mRNA는 비리온내에 패키징되지 않는다.
sg mRNA의 생성에 여러 메카니즘이 관여한다. 코로나바이러스는 리더 RNA가 게놈 크기의 (-)쇄 주형 RNA의 3'말단으로부터 전사되고, 주형에서 분리된 다음, 하류에 있는 유전자 사이의 영역에서 주형 RNA에 재결합하여 sg mRNA의 전사를 개시하는 독특한 리더 RNA-프라이밍 전사 메카니즘을 이용하는 것으로 생각되고 있다. 이러한 모델은 5'리더 서열이 게놈내 더 하류쪽으로 각 ORF 2 내지 7보다는 앞에서 반복되는 특이적 서열을 그의 3'말단에 포함하는 것으로 생각된다. 이 리더는 리더-mRNA 연결 단편을 통해 각 sg mRNA의 본체에 연결된다.
여러가지 PRRSV 균주의 특성이 계속 밝혀지고 있다[할버(Halbur) 등의 문헌[J. Vet. Diagn. Invest. 8:11-20 (1996)], 멩(Meng) 등의 문헌[J. Vet. Diagn. Invest. 8:374-381 (1996)], 멩(Meng) 등의 문헌[J. Gen. Virol. 77:1265-1270 (1996)], 멩(Meng) 등의 문헌[J. Gen. Virol. 76:3181-3188 (1995)], 멩(Meng) 등의 문헌[Arch. Virol. 140:745-755 (1995)], 할버(Halbur) 등의 문헌[Vet. Pathol. 32:200204 (1995)], 모로초프(Morozov) 등의 문헌[Arch. Virol. 140:1313-1319 (1995)], 멩(Meng) 등의 문헌[J. Gen Virol. 75:1795-1801 (1994)], 할버(Halbur) 등의 문헌[J. Vet. Diagn. Invest. 6:254-257 (1994)]. 이들 모두 본 명세서에 그 전체가 참고문헌으로 인용된다].
PRRSV는 젖을 뗀 어린 돼지에게 폐렴을 일으키는 중요한 원인이다. PRRSV는 어린 돼지의 폐렴으로 인해 상당한 경제상의 손실을 일으킨다(정확한 손실의 정도는 충분히 알려져 있지 않음). 초기에는 상대적으로 낮은 독성의 PRRSV 균주가 우세하여 지난 몇년 동안 생식기 질환이 PRRSV 감염의 주된 임상적 결과였다. 상대적으로 높은 독성의 PRRSV 균주가 증가함에 따라, 이제 호흡기 질병이 PRRSV와 관련된 주요 문제가 되었다. 여러 PRRSV 균주에 의해 유발된 질병을 방어하는 백신을 필요로 하고 있다.
놀랍게도, 미국 및 전세계의 동물 백신 시장은 인간 백신 시장보다 더 크다. 따라서, 농장 동물을 질병으로부터 보호함으로써 생기는 실질적인 공중 보건상의 이익 이외에도, 새로운 동물용 백신 개발에는 경제적인 인센티브가 있다.
<발명의 개요>
따라서, 본 발명의 목적은 SEQ ID NO:55(ISU-12) 또는 SEQ ID NO:54(ISU-55)를 포함하는 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)를 코딩하는 DNA 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SEQ ID NO:55(ORF la)의 뉴클레오티드191내지7387, SEQ ID NO:55(ORF lb)의 뉴클레오티드7375내지11757, SEQ ID NO:55(ORF 2)의11762내지12529, SEQ ID NO:55(ORF 3)의 뉴클레오티드12385내지13116, SEQ ID NO:55(ORF 4)의 뉴클레오티드12930내지13463, SEQ ID NO:55(ORF 5)의 뉴클레오티드13477내지14076, SEQ ID NO:55(ORF 6)의 뉴클레오티드14064내지14585및 SEQ ID NO:55(ORF 7)의 뉴클레오티드14578내지14946를 포함하는 ISU-12,
또는 SEQ ID NO:54(ORF la)의 뉴클레오티드191내지7699, SEQ ID NO:54(ORF lb)의 뉴클레오티드7657내지12009, SEQ ID NO:54(ORF 2)의 뉴클레오티드12074내지12841, SEQ ID NO:54(ORF 3)의 뉴클레오티드12697내지13458, SEQ ID NO:54(ORF 4)의 뉴클레오티드13242내지13775, SEQ ID NO:54(ORF 5)의 뉴클레오티드13789내지14388, SEQ ID NO:54(ORF 6)의 뉴클레오티드14376내지14897및 SEQ ID NO:54(ORF 7)의 뉴클레오티드14890내지15258을 포함하는 ISU-55 또는 ISU-12의 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 DNA 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 ISU-12 또는 ISU-55을 코딩하는 DNA 서열 또는 한개 이상의 그의 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공하는 것이기도 하다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 ISU-12 또는 ISU-55의 한개 이상의 ORF의 DNA 서열에 의해 코딩되는 한개 이상의 폴리펩티드에 대한 항체를 유도하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 다른 목적은 상기 질병에 대해 보호해야하는 돼지에게 ISU-12 또는 ISU-55의 1가지 이상의 ORF의 DNA 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 유효량으로 투여함으로써 돼지를 돼지 생식기 및 호흡기 증후군으로부터 보호하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 (a) 두 프라이머 55F 5'-CGTACGGCGATAGGGACACC-3' 및 3RFLP 5'-GGCATATATCATCACTGGCG-3'를 사용하여 PRRSV의 DNA서열을 증폭하고,
(b) 단계 (a)의 증폭된 서열을 DraI으로 자르고,
(c) 626 bp, 187 bp 및 135 bp의 3개의 제한 단편의 존재와 PRRSV ISU-55 균주와의 상관 관계를 분석하여 PRRSV 균주 ISU-55를 다른 PRRSV 균주와 구별하는 방법을 제공하는 것이다.
하기 바람직한 실시태양의 기술에서 분명해질 상기 목적 및 다른 목적은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 아이오와 균주의 1가지 이상의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 단백질, PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 2에 의해 코딩되는 단백질과 94 % 이상, 100 % 미만으로 상동인 단백질, PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 3에 의해 코딩되는 단백질과 88 % 이상, 100 % 미만으로 상동인 단백질, PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 4와 93 % 이상 상동인 단백질, PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 5와 90 % 이상 상동인 단백질, PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 6 및 ORF 7과 97 % 이상, 100 % 미만으로 상동인 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 정제되고(되거나) 단리된 폴리펩티드, 아미노산 5개 이상의 길이이고, PRRSV 단리체로의 수반하는 항원 투여에 대해 돼지 숙주의 보호를 효과적으로 촉진하는 상기 단백질의 항원성 영역 및 그의 조합, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들을 코딩하는 단리된 핵산, 이러한 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들을 유효량으로 포함하는 백신, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 및 (i) PRRS에 대해 돼지를 효과적으로 보호하고, (ii) PRRSV에 노출된 돼지 또는 PRRS로 고통받는 돼지를 치료하고, (iii) 동일한 물질을 사용하여 PRRSV를 검출하는 방법에 의해 제공된다.
본 발명은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)로부터 단리된 다핵산, 이 다핵산에 의해 코딩되는 단백질 및(또는) 폴리펩티드, 돼지를 PRRSV로부터 보호하는, 이러한 단백질 또는 다핵산을 기재로 한 백신, 이러한 단백질, 폴리펩티드 및 다핵산의 제조 방법, 이러한 백신을 사용하여 돼지를 PRRS로부터 보호하는 방법, 이러한 백신의 제조 방법, PRRSV에 감염 또는 노출된 돼지를 치료하는 방법 및 PRRSV의 검출 방법에 관한 것이다.
도 1A, 1B, IC, 1D, 1E, IF 및 1G는 미국형 단리체 ISU 79, ISU 1894, ISU3927, ISU 22 및 ISU 55의 ORF 2 내지 5와 다른 공지의 PRRSV 단리체와의 뉴클레오티드 서열 비교를 나타내고,
도 2A, 2B, 2C 및 2D은 각각 미국형 단리체 ISU 79, ISU 1894, ISU 22, ISU 55 및 ISU 3927의 ORF 2, ORF 3, ORF 4 및 ORF 5로부터의 아미노산 서열의 배열과 다른 공지의 PRRSV 단리체로부터의 아미노산 서열의 배열을 각각 나타내고,
도 3은 독성이 다른 7가지 미국형 PRRSV 단리체의 ORF 2 내지 7의 뉴클레오티드 서열을 토대로한 계통수를 나타내고,
도 4는 ISU 3927에 감염된 CRL 11171 세포(1 레인) 및 ISU 3927(2 레인)의 정제된 비리온으로부터 단리된 RNA의 노던 블롯 분석을 나타내고,
도 5는 각각 ISU 22(1 레인), ISU 55(2 레인), ISU 79(3 레인), ISU 1894(4 레인) 및 ISU 3927(5 레인)에 감염된 CRL 11171 세포로부터 단리된 세포내 총 RNA의 노던 블롯 분석을 나타내고,
도 6A 및 6B는 다른 감염 다중도로 ISU 79에 감염된 CRL 11171 세포로부터 단리된 총 RNA(A)의 노던 혼성화 및 PRRSV 단리체 ISU 55 및 ISU 79에 감염된 세포로부터의 폴리아데닐화 RNA(B)의 노던 혼성화를 나타내고,
도 7A 및 7B는 ISU 1894(A) 및 ISU 79(B)에 감염된 CRL 11171 세포로부터 단리된 세포내 총 mRNA의 노던 블롯 분석을 나타내고,
도 8A 및 8B는 ISU 1894의 sg mRNA 3 및 4(1 레인), 및 ISU 79의 sg mRNA 3, 4 및 4-1(2 레인)의 5'말단부 서열의 RT-PCR 증폭을 나타내고(A)(여기서, L레인은 1 kb 마커임), ISU 79 및 ISU 1894의 sg mRNA 3 및 4, 및 ISU 79의 sg mRNA 4-1의리더 mRNA 연결 서열을 나타낸다(B)(여기서, 게놈내의 각 ORF의 개시 코돈에 상대적으로 나타낸 리더-mRNA 연결 서열의 위치는 ORF의 상류에 있는 뉴클레오티드는 음수로 표시하였다.
도 9A, 9B, 9C 및 9D는 ISU 1894 및 ISU 79의 ORF 2 내지 7의 서열 배열을 나타내고, 여기서 각 ORF의 개시 코돈은 +>로 표시되고, 각 ORF의 종결 코돈은 별표(*)로 표시되고, 결정된 또는 추정상의 리더-mRNA 연결 서열에는 밑줄이 그어져 있고, 각 ORF의 개시 코돈에 상대적으로 나타낸 리더-mRNA 연결 서열의 위치는 각 ORF의 상류에 있는 뉴클레오티드는 음(-)수로 표시하였다.
도 10. MAb와 PRRSV에 감염된 세포와의 면역형광 분석.
감염된 ATCC CRL 11171 세포의 하이브리도마 상등액을 IFA로 시험하였다. 이 시험에서, 단백질-특이적 MAb와의 반응으로부터 통상적인 면역형광이 나타났다. A. GP4-특이적 MAb, PP4bB3, B. E-특이적 MAb, PP5dB4, C. N-특이적 MAb, PPeF11 및 D. (-)대조군, PPAc8.
도 11. ELISA에서 MAb와, 디터전트(detergent)를 사용하여 추출한 PRRSV 항원과의 반응성.
1 % 트리톤(Triton) X-100 디터전트를 사용하여, 플레이트를 PRRSV에 감염된 세포로부터 추출한 항원으로 코팅하고 1 % BSA로 차단시켰다. (+) 및 (-) 대조군인 PPeF11 및 PPAc8로 각각 하이브리도마 상등액을 시험하였다. 항-마우스 IgG 페록시다제 복합체로 특이적인 반응을 검출하였다. ABTS 기질을 플레이트에서 20분 동안 인큐베이션하고 A405를 측정하였다. PP4bB3로부터 처음 4개의 MAb는 GP4-특이적 항체였고, PP5bH4로부터 다음 6개의 MAb는 E-특이적 항체였다.
도 12. 면역블롯팅에서 E 특이적 MAb와 PRRSV 비리온의 추출물과의 반응성. MW 기준(단위: kDa)은 도의 촤측에 나타나 있다. 1 레인: PP5dB4, 2 레인: PP5bH4, 3 레인: (-)대조군: PPAc8, 4 레인: (+)대조군: 돼지 항PRRSV 혈청, 5 레인: (-)대조군: 정상의 돼지 혈청.
도 13. 모노클로날 항체의 역가.
도 14. PRRSV에 대한 MAb를 함유한 PRRSV 단리체의 반응성 패턴. MAb의 역가는 도 13에 나타나 있다. 6개 이상의 MAb의 역가에 준해 반응성 패턴을 결정하였다. 한 단리체에 있어, 32이하는 낮은 반응성, 64 내지 128은 중간 반응성, 256 이상은 높은 반응성을 나타낸다. 상기 군에 속하지 않은 단리체는 다른 군으로 분류하였다. 시험된 단리체의 총 수는 23이었다.
도 15. 곤충 세포에서 재조합 단백질 발현의 면역형광 검출. 하이 파이브(High Five, 등록상표) 세포를 vAc-P2 (A), vAc-P3 (B), vAc-P4 (C) 및 wt AcMNPV (D)로 감염시키고, 메탄올로 고정시키고, 돼지 항-PRRSV 혈청과 반응시켰다. 플루오레스세인-표지 염소 항-돼지 IgG 복합체로 특이적 반응을 검출하였고, 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 16. 하이 파이브(등록상표) 세포에서 재조합 단백질의 세포 표면 발현. 곤충 세포에 vAc-P5 (A), vAc-M (B), vAc-N (C) 및 wt AcMNPV (D)를 접종하고, 72시간 동안 인큐베이션하고, 고정 및 투과화 없이 4 ℃에서 염색하였다. 돼지 항-PRRSV 혈청을 사용하여 세포 표면의 재조합 단백질과 반응시키고 플루오레스세인-표지 염소 항-돼지 IgG 복합체를 사용하여 임의 특이적 반응을 검출하였고, 이를 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 17. 곤충 세포에서 발현된 재조합 GP2, GP3 및 GP4 단백질의 면역형광 검출. 하이 파이브(등록상표) 세포를 ORF 2를 포함하는 재조합 바쿨로바이러스 vAc-P2(A), ORF 3을 포함하는 vAc-P3(B), ORF 4를 포함하는 vAc-P4(C) 또는 wt AcMNPV(D)로 감염시키고, 메탄올로 고정시키고, 돼지 항PRRSV 혈청과 반응시켰다. 플루오레스세인-표지 염소 항-돼지 IgG 복합체에 의해 특이적 반응을 검출하고 형광 현미경으로 관찰하였다.
도 18. 곤충 세포에서 재조합 단백질 GP5, M 및 N의 면역형광 검출. 하이 파이브(등록상표) 세포를 ORF 5를 포함하는 재조합 바쿨로바이러스 vAc-P5(A), M 유전자를 포함하는 vAc-M(B), N 유전자를 포함하는 vAc-N(C) 또는 wt AcMNPV(D)로 감염시키고, 메탄올로 고정시키고, 돼지 항-PRRSV 혈청과 반응시켰다. 면역형광은 E, M 및 N 단백질을 발현시키는 세포내 세포질에서 나타났다.
도 19. 곤충 세포에서 재조합 단백질 발현의 면역형광 검출. 전체 단백질을 15 % 겔 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 돼지 항-PRRSV 혈청을 사용하여 막을 인큐베이션하고 특이적 반응을 염소 항-돼지 IgG 페록시다제 복합체에 의해 검출하였다. MW 기준(단위: kDa)은 도의 좌측에 나타냈다. 레인: 1. wt AcMNPV에 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포, 2. vAc-P2에 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포, 3. vAc-P3에 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포, 4. vAc-P4에 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포, 5. 정제된 PRRSV 비리온, 6. 정상의 ATCCCRL 11171 세포. (B). 레인: 1. vAc-P5에 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포, 2. wt AcMNPV에 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포, 3. vAc-M에 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포, 4. vAc-N에 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포, 5. 정제된 PRRSV 바이러스, 6. 정상의 ATCC CRL 11171 세포. 화살표는 재조합 단백질의 Mr에서의 위치 또는 범위를 나타낸다. 화상을 휴렛 팩커드 스캔젯(Hewlett Packard ScanJet) 3c/T 스캐너 및 아도베 포토샵 3.0 프로그램(Adobe Photoshop 3.0, 아도베 시스템 인크(Adobe System Inc.))으로 스캐닝하였다.
도 20. 곤충 세포에서 발현된 재조합 단백질 E, M 및 N의 글리코실화 분석. (A). vAc-P2, vAc-P3, vAc-P4 또는 wt AcMNPV에 감염된 곤충 세포의 투니카마이신 처리. (B). vAc-P5, vAc-M, vAc-N 또는 wt AcMNPV에 감염된 곤충 세포의 투니카마이신 처리.
도 21. PCR로 ORF 2 내지 7 유전자를 증폭하는데 사용하는 프라이머. 각 프라이머내의 밑줄친 서열은 다음 클로닝 단계를 용이하게하기 위해 도입된 독특한 제한 효소 부위를 나타낸다.
도 22. 곤충 세포에서 발현된 PRRSV ORF 2 내지 5의 재조합 단백질. a = ORF 2 내지 5 산물의 추정상 Mr및 N-글리코실화 부위는 뉴클레오티드 서열 연구를 토대로 한다[멩(Meng) 등의 문헌(1994) 및 모로초프(Morozov) 등의 문헌(1995). b = 곤충 세포에서 발현된 산물. c = 면역블롯팅 분석에 의해 결정한 투니카마이신 처리 후의 밴드. d = 리더-결핍 코어 단백질은 투니카마이신 처리 분석을 토대로결정됨. 투니카마이신 처리 후에 재조합 생성물에 다른 밴드가 존재하는 이유는 O-연결 글리코실화, 인산화 또는 다른 번역후 변형때문일 수 있다.
도 23은 VR 2385 cDNA 라이브러리로부터 서열 분석한 20개의 중첩되는 cDNA 클론을 나타낸다.
도 24는 VR 2385 및 LV의 리더 서열의 DNA 배열을 나타낸다.
도 25는 VR 2385 및 LV의 ORF 1a의 배열을 나타낸다. 도 25A는 5'말단 배열을 나타낸다. 도 25B는 중간의 DNA 배열을 나타낸다. 도 25C는 3'말단 배열을 나타낸다.
도 26은 리더 및 ORF 특이적 프라이머를 이용하여 mRNA 4a, 5a 및 7a에 상응하는 PCR 생성물을 증폭시킨 네스티드 RT PCR의 결과를 나타낸다.
도 27은 조금 계대배양한 ISU-55 및 많이 계대배양한 ISU-55의 DNA 서열 배열을 나타낸다.
도 28은 많이 계대배양한 ISU-55 및 조금 계대배양한 균주의 ORF 지도를 나타낸다.
도 29는 많이 계대배양한 ISU-55 균주 서열내의 추가의 DraI 부위를 나타낸 제한효소 지도이다.
도 30은 ISU-55 bp, ISU-12 bp 및 ISU-12 bp 균주로부터 단리되고 프라이머 55F 및 3RFLP를 이용한 RT PCR에서 사용되는 총 RNA에 대한 RFLP 시험의 결과를 나타낸다.
도 31은 ISU-55 bp의 게놈 지도 및 ORF 목록을 나타낸다.
도 32는 ISU-55의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 33은 ISU-12(VR2385)의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
도 34은 ISU-55 및 ISU-12(VR2385)의 뉴클레오티드 서열을 배열을 나타낸다.
<바람직한 실시태양의 상세한 설명>
본 출원서에서, 저독성의 한 단리체 및 "중간"독성 및 높은 독성을 지닌 4가지 다른 아이오와 균주 PRRSV 단리체의 ORF 2 내지 5의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 여러 PRRSV 단리체의 ORF 2 내지 7의 비교를 기준으로, 독성이 가장 낮은, 공지된 미국형 단리체(ISU 3927)는 다른 미국형 단리체의 변이에 비해 ORF 2 내지 4에서 상대적으로 높은 서열 변이가 있다. 또한, ORF의 서열 분석을 기준으로, 3가지 이상의 소수 유전자형은 미국형 PRRSV의 주요 유전자형 범위내에 있다.
다른 PRRSV 단리체의 ORF 5 단백질의 서열을 분석한 결과, 보존되지 않은 아미노산 치환 영역을 포함한 3군데 초가변성 영역이 밝혀졌다. 이러한 영역은 친수성이고 컴퓨터 분석 추정으로는 항원성이기도 하다.
본 발명에 있어서, "돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스" 또는 "PRRSV"는 PRRSV의 아이오와 균주, 미국에서 발견되는 다른 PRRSV 균주(예를 들어 VR 2332), 캐나다에서 발견되는 PRRSV 균주(예를 들어 IAF-exp9l), 유럽에서 발견되는 다른 PRRSV 균주(예를 들어 렐리스타드 바이러스, PRRSV-10) 및 출현했을 수 있고 미래에 출현될 수 있는, 상기 바이러스와 밀접하게 관련된 변이체를 비롯한 질병 PRRS, PEARS, SIRS, MSD 및(또는) PIP("PIP"라는 용어는 지금은 잘 사용되지 않음)를 일으키는 바이러스를 의미한다.
PRRSV의 "아이오와 균주"에는 (a) 본 발명자들에 의해 ATCC에 기탁되고(되거나) 본 출원서에 개시되고(되거나) 선행 미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호 각각에 개시된 PRRSV 단리체, (b) CRL 11171 세포에서 배양되거나 또는 계대배양될 때 6가지 이상의 sg mRNA를 생산하는 PRRS 바이러스, (c) 제왕절개로 낳은, 5주된 초유를 섭취하지 못한 새끼돼지에서 감염 후 10일째 40 % 이상의 거대한 폐 병변 또는 폐 경화를 일으키는 바이러스, (d) 하기 표 2에 기재된 PRRSV ORF와 동일성이 가장 적은 단백질을 코딩하는 게놈을 지닌 PRRSV 단리체 및(또는) (d) 이러한 바이러스의 확인 특징을 지닌 임의 PRRSV 단리체가 포함된다.
본 발명의 백신은 그가 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 의한 감염에 대해 돼지를 보호한다면 효과적인 것이다. 백신을 영향받지 않은 한 마리 이상의 돼지에게 투여한 후, 나중에 생물학적으로 순수한 바이러스 단리체(예를 들어 VR 2385, VR 2386, 또는 하기 기재된 다른 바이러스 단리체)를 항원으로 투여한 결과 보호되지 않은 유사한 피그에게서 상기 단리체 의해 통상적으로 유발되는 변화 또는 증상에 비해(즉, 적당한 대조 표준에 비해) 거대한 또는 조직병리학적 변화(예를 들어 폐의 병변)의 심도가 완화되고(되거나) 이러한 질병 증상의 심도가 완화된다면, 그 백신은 PRRSV에 의한 감염으로부터 돼지를 보호하는 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 백신을 필요로 하는 적절한 돼지 1마리 이상에게 투여함으로써 본 발명의 백신이 효과적인 것으로 보일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 백신을 필요로 하는 적합한 한마리 이상의 돼지에 투여한 다음, 적당한 기간(예를 들어 1 내지 4주) 후에 생물학적으로 순수한 PRRSV 단리체의 대량 샘플(103-7TCID50)을 항원으로 투여함으로써 효과를 확인할 수 있다. 그 다음, 약 1주 후에 항원이 투여된 돼지로부터 혈액 샘플을 채혈한 다음, 혈액 샘플로부터 바이러스를 단리한다(예를 들어 하기 VIII 실험에서 예시된 바이러스 단리 방법 참조). 바이러스의 단리는 백신이 효과적이지 않음을 나타내고 바이러스 단리의 실패는 백신이 효과적임을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 백신의 효과는 정량적으로 평가되거나(즉, 적합한 대조군에 비해 경화된 폐조직 비율의 감소(%)) 또는 정성적으로 평가될 수 있다(예를 들어 혈액으로부터 PRRSV의 단리, 이뮤노페록시다제 분석법(하기 기재됨) 등에 의해 폐, 편도선 또는 림프절 조직 샘플에서 PRRSV 항원을 검출함). 돼지 생식기 및 호흡기 증후군의 증상은 정량적으로(예를 들어 온도/열), 반정량적으로(예를 들어 호흡기 통증(하기 상세히 설명됨)) 또는 정성적으로(한가지 이상의 증상의 존재 및 부재, 또는 한가지 이상의 증상, 예를 들어 청색증, 폐렴, 심장 및(또는) 뇌 병변 등의 심도의 감소) 평가될 수 있다.
영향을 받지 않은 돼지란 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 감염 물질에 노출되지 않았거나 또는 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 감염 물질에 노출되었으나 이 질병의 증상을 보이지 않는 돼지이다. 영향을 받은 돼지는 PRRS의 증상을 보이는 돼지이고 이로부터 PRRSV를 단리할 수 있다.
PRRS의 임상 징후 또는 증상에는 혼수 상태, 호흡기 통증, "딸꾹질"(강제로숨을 내쉼), 발열, 거칠어진 모피, 재채기, 기침, 눈 부종 및 때때로 결막염이 포함될 수 있다. 병변에는 거대하고(하거나) 미소한 폐 병변, 심근염, 임파선염, 뇌염 및 비염 등이 있다. 또한, 독성이 덜하고 무독성 형태의 PRRSV 및 아이오와 균주가 발견되었는데, 이는 상기 증상 중 일부 증상을 일으킬 수 있거나 또는 어떤 증상도 일으키지 않는다. 그럼에도 불구하고, 독성이 덜하고 무독성 형태의 PRRSV를 본 발명에 따라 사용하여 돼지 생식기 및 호흡기 증후군에 대한 보호를 제공할 수 있다.
"다핵산"이라는 구는 RNA 또는 DNA뿐 아니라, 바이러스 또는 감염 물질로부터 단리된 RNA 또는 DNA에 상응하거나 또는 상보적인 mRNA 및 cDNA를 말한다. "ORF"는 오픈 리딩 프레임을 의미하거나 또는 PRRSV 게놈을 비롯한 바이러스 게놈으로부터 단리된, 폴리펩티드-코딩 단편을 의미한다. 이러한 핵산에 있어서, ORF는 일부(단편으로써) 또는 전체가 포함될 수 있고, 인접한 ORF의 5' 또는 3'서열과 중첩할 수 있다(예를 들어 하기 도 1 및 실험 1 참조). "폴리뉴클레오티드"는 다핵산과 동등하나, 독특한 한 분자 또는 분자군을 나타내기도 한다(예를 들어 일군의 다핵산의 서브세트).
하기 기재된 실험에서, (a) 저독성 미국형 PRRSV 단리체 및 (b) 독성이 변하는 두가지 다른 미국형 PRRSV 단리체 ORF 2 내지 5의 단리, 클로닝 및 서열분석하였다. 이러한 3가지 미국형 단리체의 뉴클레오티드 및 추론된 아미노산 서열을 공지된 다른 PRRSV 단리체의 상응하는 서열과 비교하였다(예를 들어 미국 특허 출원 제08/301,435호 참조). 그 결과, 상당한 유전적 변이가 미국형 PRRSV 및 유럽형PRRSV뿐 아니라, 미국형 단리체에서도 존재하는 것으로 나타났다.
연구된 7가지 미국형 PRRSV 단리체 사이의 아미노산 서열 동일성은 ORF 2에서 91 내지 99 %, ORF 3에서 86 내지 98 %, ORF 4에서 92 내지 99 % 및 ORF 5에서 88 내지 97 %였다. 독성이 가장 적은 공지의 미국형 단리체는 다른 미국형 단리체에 비해 ORF 5 내지 7에서보다 ORF 2 내지 4에서 보다 높은 서열 변이를 갖는다. 항원 잠재력을 지닌 3개의 초가변성 영역이 ORF 5에 의해 코딩되는 주요한 엔벨로프 당단백질에서 확인되었다.
ORF 2 내지 7의 서열 쌍 비교 및 계통수 분석 결과는 미국형 PRRSV의 주요 유전자형 범위내에서 3군 이상의 PRRSV 변이체(또는 소수 유전자형)의 존재를 시사한다. 독성이 가장 낮은 공지된 미국형 단리체는 다른 독성의 다른 미국형 단리체와 구별되는 부문을 형성한다. 이러한 연구 결과는 PRRSV의 분류 및 백신 발전을 포함한다.
다른 실험에서, PRRSV에 감염된 세포의 sg mRNA를 나타냈다. 이 데이타는 6개 또는 7개의 sg mRNA의 3'공통말단부 네스티드 세트를 보여준다. 그러나, 몇몇 코로나바이러스 및 알파바이러스와는 달리, PRRSV의 sg mRNA는 비리온내로 패키징되지 않으며 PRRSV의 게놈 RNA만이 정제된 비리온내에서 검출된다. 또한, 다른 독성을 지닌 다른 PRRSV 단리체 중의 sg mRNA의 개수 차이를 관찰하였다. 2가지 미국 단리체의 ORF 2 내지 7에 대한 추가의 서열분석 및 유럽형 LV와의 비교 결과, PRRSV의 리더-mRNA 연결 서열의 계통적 특징이 밝혀졌다.
하기 실험 2에서 증명된 바와 같이, 6개 또는 7개의 sg mRNA의 3'공통말단부네스티드 세트가 다른 PRRSV의 단리체에 감염된 세포에서 형성되었다. 또한, sg mRNA 네스티드 세트는 유럽형 단리체 렐리스타드 바이러스(LV)와 비슷한 미국형 PRRSV가 LDV, EAV 및 SHFV를 비롯한 새롭게 제시된 아테리바이러스 군의 일원임을 나타낸다. ORF-특이적 프로브를 사용한 노던 블롯 분석 결과는 PRRSV sg mRNA의 구조가 폴리시스트론성이고 sg mRNA 7을 제외한 sg mRNA 각각은 여러 ORF를 포함하는 것으로 나타났다. 따라서, 각 sg mRNA의 서열은 다음의 더 큰 sg mRNA의 3'부분에 포함되나, sg mRNA의 모든 5'말단이 더 작은 sg mRNA의 서열과 중첩되지는 않는다.
그러나, sg mRNA의 수 및 바이러스의 폐독성 사이에 분명한 상관 관계는 없다. 다른 종류인 sg mRNA 3-1은 그의 5'말단에 아미노산 45개의 코딩 능력을 지닌 작은 ORF(ORF 3-1)를 포함하는 것으로 밝혀졌다.
하기 실험 2에서, PRRSV의 sg mRNA은 비리온내로 패키징되지 않는 것으로 나타났다. sg mRNA가 비리온내로 패키징되는지는 sg mRNA가 패키징 신호를 포함하는지에 따라 좌우될 수 있다. PRRSV의 캡슐화 신호 서열은 PRRSV의 sg mRNA가 비리온내로 패키징되지 않기 때문에 바이러스 게놈의 독특한 영역이지만 sg mRNA에는 없는 ORF 1 영역에 편재될 수 있는 듯하다.
하기 실험 2에서, 두가지 미국형 PRRSV 단리체인 ISU 79 및 ISU 1894의 sg mRNA 3 및 4의 연결 단편(리더-mRNA 연결 서열)을 결정하였다. 리더-mRNA 연결 서열에 대한 지식은 (a) 감염성 클론 및(또는) 백신으로 사용되는 키메라 바이러스 및 (b) 1개 이상의 유전자를 적합한 감염성 숙주에 삽입하거나 또는 "수송하는" 벡터를 생산하는 방법을 효율적으로 제공한다. 이러한 키메라 바이러스, 감염성 클론 및 벡터를 설계하고 생산하는 방법은 공지되어 있다[예를 들어 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York] 참조].
상기 두 단리체의 sg mRNA 3 및 4의 리더-mRNA 연결 서열은 다르다(ISU 79의 mRNA 3-1의 경우 TTGACC이고, mRNA 3의 경우 GTAACC이고, mRNA 4의 경우 TTCACC임). 이 연결부의 뉴클레오티드 차이는 대부분 처음 3개 뉴클레오티드에 존재한다. 마지막의 뉴클레오티드 3개는 변하지 않으며, 이는 리더 서열의 sg mRNA 본체로의 결합이 리더-mRNA 연결 서열의 5'말단에서 일어남을 시사한다. LV, EAV 및 LDV의 경우 비슷한 관찰 결과가 보고되었다.
단리체 ISU 79의 또다른 sg mRNA 3-1의 생성은 새로운 리더 mRNA 연결 서열을 생성시키는 단일 염기 치환으로 인한 것이다. 이 치환은 연결 단편의 마지막 뉴클레오티드에서 일어나며, 이는 리더-mRNA 연결 모티프의 마지막 뉴클레오티드가 리더의 결합 및 전사 개시에 결정적임을 시사한다.
코로나바이러스의 리더와 유전자간 영역 사이의 서열 상동성은 염기쌍 형성이 리더-프라이밍 전사에 필수적일 것이라는 가설을 이끌었으나, sg mRNA의 전사에 있어서 염기쌍 형성이 필요요건이라는 실험적인 증거는 문헌에 개시된 바 없다. 예를 들어 융합 과정에 관여하는, 코로나바이러스 및 아테리바이러스 모두의 리더 3'말단 서열은 미지의 상태이다.
여러 방면의 증거가 코로나바이러스의 리더-프라이밍 전사 메카니즘을 입증하나, 코로나바이러스에 감염된 세포에서 (-)쇄 sg mRNA 및 sg 복제 중간체(sg RI)의 존재는 sg mRNA 합성에 관련된 메카니즘이 연결 서열을 갖는 리더 서열의 단순한 염기쌍 형성보다는 더 복잡함을 시사한다. 그러나, (-)쇄 sg mRNA는 LDV를 제외하고는 아테리바이러스에서 검출되지 않았고, sg RI는 EAV에 감염된 세포에서만 검출되었다. 따라서, 아테리바이러스, 특히 PRRSV에서 sg mRNA 합성은 코로나바이러스에서 보다 덜 복잡할 것이다.
2가지 미국형 PRRSV 단리체의 ORF 2 내지 7의 서열 분석 및 LV와의 서열 비교 결과, 리더-mRNA 연결 서열들의 이질성이 밝혀졌다. sg mRNA에 상응하지 않는 위치의 리더-mRNA 연결 모티프의 존재는 PRRSV 및 다른 아테리바이러스의 게놈의 리더 및 연결 서열에 보존된, 6개 뉴클레오티드만의 짧은 범위가 ORF 상류의 이러한 특이적 연결 부위로의 리더의 효율적인 결합에 충분한가라는 의문을 야기한다. 그러나, 외견상의 불일치를 하기 두가지 가능성으로 설명할 수 있다.
첫째, 추가의 구조적 요소, 예를 들어 2차 구조 또는 리더-mRNA 연결 단편 주위의 서열은 리더가 특정 부위로 융합(결합)하는데 관여하는 것으로 생각된다. MHV에서, 컨센서스 서열(리더-mRNA 연결 서열) UCUAAAC의 양쪽에 있는 서열은 sg DI RNA 전사의 효율에 영향을 준다는 것과 이러한 서열은 DI mRNA의 합성에 필요하기는 하나, 그 자체로 충분한 것은 아니라는 것이 밝혀졌다.
둘째, 두개의 리더-mRNA 연결 영역 사이의 거리는 sg mRNA의 전사에 영향을 줄 수 있다. 하류의 리더-mRNA 연결 영역이 상류 리더-mRNA 연결 영역으로부터의 MHV의 sg DI RNA 합성을 억제함이 증명되었다. 이 억제는 두 리더-mRNA 연결 서열사이의 거리가 뉴클레오티드 35개 미만일 때 의미가 있다. 그러나, 더 큰 sg DI RNA 합성(상류 리더-mRNA 연결 서열로부터임)의 유의한 억제는 두 리더-mRNA 연결 영역 사이의 거리가 뉴클레오티드 100개 이상일 때는 관찰되지 않는다.
상기 보고된 실험 결과는 하기 실험 2(여기서, sg mRNA 4 외에, 추가의 sg mRNA 3-1이 다소의 PRRSV 단리체에서 관찰됨)에 보고된 관찰과 일치한다. PRRSV의 아이오와 균주에서 sg mRNA 4 및 3-1의 리더-mRNA 연결 서열은 뉴클레오티드 약 226개 만큼이 떨어져 있다. 따라서, 상류의 리더-mRNA 연결 서열로부터 더 큰 sg mRNA 3-1의 합성은 하류의 리더-mRNA 4 연결 서열의 존재에 의해 억제되지 않는다.
대조적으로, 잠재적인 여러 리더-mRNA 연결 서열이 ORF 3, 5, 6 및 7의 상류의 다른 위치에도 있긴 하나, 노던 블롯 분석에서 이러한 리더-mRNA 연결 모티프에 상응하는 sg mRNA가 없었다. ORF 7을 제외하면(여기서, 잠재적인 두 리더-mRNA 연결 서열은 뉴클레오티드 114개 만큼이 떨어져 있다), 이러한 리더-mRNA 연결 서열 대부분은 하류의 리더-mRNA 연결 영역으로부터 50개 미만의 뉴클레오티드 만큼이 떨어져 있다. 그러나, 노던 블롯 분석에서 sg mRNA 7은 넓게 확산된 밴드를 나타냈다. 따라서, 상류 리더-mRNA 연결 서열로부터 더 큰 sg mRNA의 전사는 하류의 연결 서열에 의해서는 상당히 억제되지는 않으나, 노던 블롯 분석에 의해서는 그를 풍부한 sg mRNA 7과 쉽게 구별할 수 없다.
<본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드>
플라크-정제된 PRRSV 단리체 ISU-12(미국 20852 매릴랜드주 로크빌 파크론 드라이브 12301 소재의 ATCC에 1992년 10월 30일 기탁번호 VR 2385[3 x 플라크-정제됨] 및 VR 2386[플라크-정제되지 않음]로 기탁됨)의 ORF 2 내지 7, 및 PRRSV 단리체 ISU-22, ISU-55, ISU3927(ATCC에 1993년 9월 29일 각각 기탁번호 VR 2429, VR 2430 및 VR 2431로 기탁됨), ISU-79 및 ISU1894(ATCC에 1994년 8월 31일 각각 기탁번호 VR 2474 및 VR 2475로 기탁됨)의 ORF 6 내지 7은 미국 특허 출원 제08/301,435호에 상세히 개시되어 있다. 그러나, 이러한 유전자를 단리하고 클로닝하고 서열을 분석하는데 사용된 기술은 PRRSV의 게놈의 다핵산의 단리, 클로닝 및 서열분석에 응용될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 하기 실험에 기재된 특정 서열에 한정되는 것은 아니다.
예를 들어, PRRSV 게놈으로부터 얻어진 한가지 이상의 서열이 결정되어 있는 서열 정보를 토대로, 중합효소 연쇄 반응(및 원한다면, 공지된 생체내 또는 시험관내 방법에 따라 전사에 의해 RNA 및(또는) 번역에 의해 단백질을 만드는 경우)에 의해 상대적으로 많은 양의 DNA를 만드는 프라이머를 설계할 수 있다(VR 2385, VR 2429, VR 2430, VR 2431, VR 2474, ISU-1894, VR 2332 및 렐리스타드 바이러스의 ORF 2 내지 7). 80 % 이상, 바람직하게는 90 % 이상의 동일성을 지닌, 뉴클레오티드 약 15개 내지 50개 길이의 영역을 결정된 서열로부터 선택하였다. (예를 들어 뉴클레오티드 5개 이상으로 된) 서열중 하나에서 결실이 일어난 영역을 PRRSV의 한 균주 또는 유형의 다핵산을 다른 것들에 비해 선택적으로 증폭하는 선택적 프라이머를 만드는 기초로 사용할 수 있다(예를 들어, 북아메리카형 및 유럽형 균주를 다르게 진단하는 경우).
게놈 다핵산을 증폭하여 알려진 방법에 의해 적합한 숙주내에 클로닝한 후에는, 이 클론을 본 명세서에 기재된 서열 정보를 토대로 설계한 프로브를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어 2개 이상의 서열 중에(예를 들어 하기 실험 III에 기재된 PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 6 또는 7중에) 고도의 동일성(예를 들어 약 90 %)을 기준으로 약 50 내지 약 500개 뉴클레오티드 길이의 영역을 선택하고, 적당한 길이 및 서열의 폴리뉴클레오티드를 알려진 방법으로 만들 수 있다(예를 들어 자동 합성, 또는 특정 영역을 포함하는 다핵산으로부터의 적합한 단편, 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화하는 프라이머를 사용한 PCR 증폭 및 전기영동에 의한 단리). 이 폴리뉴클레오티드를 예를 들어32P(방사선측정법으로 확인하는 경우) 또는 비오틴(형광측정법으로 검출하는 경우)으로 표지할 수 있다. 그 다음, 프로브를 클론의 다핵산과 혼성화하고 알려진 방법에 따라 검출한다.
본 발명자들은 ORF 2 내지 4중 1가지 이상이 PRRSV의 독성과 관련이 있음을 밝혀냈다. 예를 들어 상대적으로 낮은 독성을 보이는 1가지 이상의 PRRSV 단리체도 ORF 4에 결실 부위가 있는 것으로 드러났다(예를 들어 미국 특허 출원 제08/301,435호의 실험 VIII 내지 XI 참조). 또한, 독성이 가장 낮은 알려진 단리체(VR 2431)는 다른 미국형 PRRSV 단리체에 비해 ORF 2 내지 4에서 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 정보 모두에서 상대적으로 고도의 변이를 보인다. 따라서, 본 발명은 한 실시태양에서 VR 2431의 ORF 2 내지 4에 관련된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 관한 것이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 수반된 PRRSV 항원 투여에 대항해 직간접적으로 면역적 보호를 제공하는 PRRSV 단리체로부터 얻어진 다핵산에 관한 것이나, 여기서 다핵산은 다핵산-함유 PRRSV를 저독성(즉, "저독성"(lv) 표현형; 미국 특허 제08/301,435호에 상응하는 설명 참조) 또는 무독성(소위 "결실 돌연변이체")이게 만드는 정도로 결실 또는 돌연변이된다. 바람직하게는, ORF 2 내지 4중 하나 이상이 PRRS 바이러스를 무독성으로 만드는 정도로 결실 또는 돌연변이된다. 그러나, (i) 항원성 및(또는) 면역보호성 펩티드 단편을 코딩하고, (ii) 다핵산-함유 PRRS 바이러스에 독성을 제공하지 않는 본 발명의 다핵산은 ORF 2 내지 4중 하나 이상의 영역을 보유하는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 본 발명에는 ORF 2 내지 4중 하나 이상이 자신을 저독성 또는 무독성이 되게 하는 정도로 결실 또는 돌연변이된 PRRSV(예를 들어 VR 2431) 자체가 포함된다. 이러한 바이러스는 적합한 숙주를 이종 유전자로 형질전환하는 백신 또는 벡터(예를 들어 MA-104, PSP 36, CRL 11171, MARC-145 또는 돼지 폐포 마크로파지 세포)로 유용하다. 본 발명의 결실 돌연변이체를 사용하여 발현될 수 있는 바람직한 이종 유전자에는 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 항원과 다른 단백질 또는 항원을 코딩하는 유전자(예를 들어 가성광견병 및(또는) 돼지 인플루엔자 바이러스 단백질 및(또는) 폴리펩티드-함유 항원, 돼지 생장호르몬 등이 있음), 또는 폴리펩티드계 보조제(백신 조성물의 경우, 예를 들어 미국 특허 출원 제08/301,435호에 개시된 것임)가 포함될 수 있다.
예를 들어 PRRSV ORF(예를 들어 200개 내지 700개 뉴클레오티드 길이)의 3'말단부 영역을 포함하는 본 발명의 다핵산의 몇가지 실시태양에서, 그의 일부는 인접 하류의 5'영역과 중첩하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, ORF의 3'말단부 영역이 인접 하류의 ORF의 5'말단부 영역과 중첩되는 경우, ORF 인접 하류와 중첩되는 ORF의 5'영역을 보유하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 PRRSV 게놈내의 ORF 5가 PRRSV에 감염된 채로 배양물을 유지할 수 있는 포유류 숙주 세포의 바이러스 복제능과 관련 있음을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명은 ORF 5가 여러 카피로 존재할 수 있는 PRRSV 게놈(소위 "과다생산 돌연변이체")으로부터 얻어진 다핵산에 관한 것이기도 하다. 예를 들어 본 발명의 다핵산은 고도-복제(hr) 표현형 PRRSV 단리체로부터 ORF를 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 10카피를 포함할 수 있다.
흥미롭게도, PRRSV 단리체 ISU-12는 ORF 5의 5'말단부 가까이에 놀랍게도 다수의 잠재적인 개시 코돈(ATG/AUG 서열)을 갖는데, 아마도 이는 이 유전자의 또다른 개시 부위일 것이다. 따라서, PRRSV 단리체의 ORF 5에 의해 코딩되는 또다른 형태의 단백질도, 다른 ORF가 실험에 의해 측정된 분자량과 비슷한 분자량을 지닌 단백질(예를 들어 약 150개 내지 약 250개 아미노산 길이)을 코딩하는 경우라면 있어도 무방하다. ISU-12의 ORF 5에 대한 가장 가능성 있는 코딩 영역은 도 1에 나타나 있다.
공지된 방법에 따라 결실 및 과다생산 돌연변이체를 만들 수 있다. 예를 들어 폴리펩티드를 코딩하는 영역의 서열내의 11개의 "사일런트" 또는 축퇴 변화를 포함하는 돌연변이체 다핵산을 만들 수 있다. 적합한 축퇴 돌연변이를 선택하고 만들어서, 공지된 제한효소에 의해 인식되는 다핵산 서열을 치환할 수 있다(예를들어 하기 실험 2 참조). 따라서, 사일런트인 축퇴 돌연변이가 ORF의 3'말단 및 하류 ORF의 5'말단 중 1군데 또는 2군데에서 만들어진다면, 1카피 또는 여러 카피의 hr ORF 5 단백질 생성물, 1카피 또는 여러 카피의 PRRSV 또는 다른 바이러스 엔벨로프 단백질 및(또는) PRRSV 단백질의 항원성 단편을 포함할 수 있는 합성 다핵산(소위 "카세트")을 삽입시킬 수 있다. "카세트"는 적합한 개시 코돈(ATG)의 앞에 위치할 수 있고, 3'말단의 종결 코돈(TAA, TAG 또는 TGA)에 의해 적절하게 종결될 수 있다. 물론, 폴리펩티드를 코딩하지 않는 올리고뉴클레오티드 서열을 삽입하거나, 또는 다른 방법으로는 카세트를 삽입하지 않을 수 있다. 이렇게 하여, 소위 결실 돌연변이체를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단리체가 갖는 저독성의 원인일 수 있는, VR 2431의 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 영역 및 위치에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 단리체 및(또는) 정제된 폴리펩티드는 PRRSV의 ORF 2, 3 및 4중 하나 이상(또는 5개 이상의 아미노산 길이인 저독성인 그의 단편)에서의 "저독성 돌연변이"에 의해 코딩될 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드인데, 여기서 ORF 2에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 위치 12 내지 14중 1군데 이상은 RGV(여기서, "R", "G" 및 "V"는 상응하는 아미노산의 1-문자 약자임)이고, 위치 44 내지 46는 LPA이고, 위치 88은 A이고, 위치 92는 R이고, 위치 141은 G이고, 위치 183은 H이고, 위치 218은 S이고, 위치 240은 S이고, 위치 252 내지 256은 PSSSW이거나 또는 임의 그의 조합이다. 추가로 상기 1군데 이상의 아미노산의 위치와 조합될 수 있는 다른 아미노산 잔기는 위치 174(I) 및 위치 235(M)의 것이 포함된다.
본 발명의 단리 및(또는) 정제된 폴리펩티드는 또한 특정 아미노산중 하나 이상이 위치 11(L), 23(V), 26 내지 28(TDA), 65 내지 66(QI), 70(N), 79(N), 93(T), 100 내지 102(KEV), 134(K), 140(N), 223 내지 227(RQRIS), 234(A) 및 235(M)에 있는 아미노산, 또는 임의 그의 조합(1군데 이상의 아미노산 위치32(F), 38(M), 96(P), 143(L), 213 내지 217(FQTS), 231(R) 및 252(A)도 추가로 사용될 수 있음)으로부터 선택될 수 있는, PRRSV의 ORF 3에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다.
본 발명의 단리되고(되거나) 정제된 폴리펩티드는 또한 특정 아미노산중 하나 이상이 위치 13(E), 43(N), 56(G), 58 내지 59(TT), 134(T), 139(1)에 있는 아미노산, 및 임의 그의 조합으로부터 선택될 수 있고, 위치 2 내지 3(AA), 51(G) 및 63(P)중 하나 이상과 추가로 조합될 수 있는 PRRSV의 ORF 4에 의해 코딩되는 폴리펩티드이다.
또한, 본 발명은 VR 2431의 ORF 2 내지 4중 임의 하나에 의해 코딩되는, 아미노산 5개 이상, 바람직하게는 아미노산 10개 이상의 폴리펩티드 서열 및 폴리펩티드 전장을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다(여기서, 상기 3개의 문단에 상술된 아미노산 위치에 상응하는 코돈의 폴리뉴클레오티드는 VR 2431의 상응하는 ORF에 의해 코딩된 단백질의 상응하는 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 대체될 수 있음).
본 발명의 다른 실시태양에서, PRRSV의 다핵산은 1가지 이상의 단백질 또는 그의 항원성 영역을 코딩한다. 바람직하게, 본 발명의 핵산은 PRRSV 막(엔벨로프) 단백질의 항원성 영역을 하나 이상 코딩한다. 보다 바람직하게, 본 발명의 다핵산은 ORF 5 PRRSV 단백질 산물의 초가변성 영역을 코딩하거나(하기 논의 참조) 또는 (b) 상응하는 단백질의 항원성 영역을 코딩하고 나중의, 예를 들어 hv 표현형 PRRSV 단리체의 침입에 대항한 방어능을 효과적으로 촉진하는, PRRSV의 독성이 높은(hv) 표현형 단리체로부터의 ORF 5 유전자 카피를 1개 이상(미국 특허 출원 제08/301,435호의 "hv 표현형"에 대한 설명 참조) 및 PRRSV 단리체의 게놈으로부터 ORF-2, ORF-3, ORF-4, ORF-5 및(또는) ORF-6중 하나 이상의 충분하게 긴 단편, 영역 또는 서열을 포함한다.
보다 더 바람직하게, PRRSV의 ORF-2, ORF-3, ORF-5 및(또는) ORF-6에 의해 코딩되는 1가지 이상의 전체 엔벨로프 단백질이 본 발명의 다핵산에 포함되고, 본 발명의 다핵산은 PRRSV의 ORF 2 내지 4중 하나의 충분하게 긴 부분을 제거하거나 또는 변형하여 그를 포함하는 PRRSV를 저독성 또는 무독성으로 만든다. 가장 바람직하게, 다핵산은 PRRSV의 아이오와 균주(예를 들어 VR 2385(3X 플라크-정제된 ISU-12), VR 2386(플라크-정제되지 않은 ISU-12), VR 2428 (ISU-51), VR 2429 (ISU-22), VR 2430(ISU-55), VR 2431(ISU-3927), VR 2474(ISU-79) 및(또는) ISU-1894)의 단리체의 게놈으로부터 단리된다.
본 발명의 다른 바람직한 실시태양에는 PRRSV, 바람직하게는 PRRSV의 아이오와 균주 ORF 5의 초가변성 영역으로부터의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 따라서, 이러한 폴리뉴클레오티드는 하기 아미노산 서열 1개 이상을 코딩한다.
이 실시태양에서, 폴리뉴클레오티드는 위치 32 내지 38, 5766 및(또는) 120 내지 128에 있는 하나 이상의 초가변성 영역이 포함되는한, PRRSV ORF 5의 다른 아미노산 서열을 추가로 코딩할 수 있다(도 3 또는 미국 특허 출원 제08/131,625호 또는 제08/301,435호에 개시된 바와 같이)(본 발명은 특히 LV 및 VR 2332의 ORF 5의 단백질 및 폴리뉴클레오티드를 배제함).
본 발명의 바람직한 다른 실시태양은 하기 식 I 또는 II의 서열을 지닌 다핵산을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되거나 또는 그로 이루어진 정제된 조제물에 관한 것이다.
<식 I>
5'-α-β-3'
<식 II>
5'-α-β-γ-3'
식 중, α는 PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터선택된 폴리뉴클레오티드 및 항원성 및(또는) 저독성 단편을 코딩하는 그의 영역에 의해 코딩되는 1종 이상의 폴리펩티드, 또는 그의 항원성 또는 저독성 단편이고, β는 PRRSV의 아이오와 균주로부터의 1카피 이상의 ORF 5 또는 항원성인 그의 단편이고(예를 들어 하나 이상의 초가변성 영역), 바람직하게는 고 복제(hr) 표현형의 전장 카피이고, γ는 PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 6 및 ORF 7, 및 항원성 단편을 코딩하는 그의 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 1종 이상의 폴리펩티드 또는 그의 항원성 단편을 코딩한다.
또는, 본 발명은 하기 식 III의 서열을 지닌 다핵산을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되거나 또는 그로 이루어질 수 있는 정제된 조제물에 관한 것이다.
<식 III>
5'-β-δ-γ-3'
식 중, β및 γ는 상기 정의된 바와 같고, δ는 다핵산의 전사 및(또는) 번역에 실질적으로 영향을 주지 않는 공유 결합 또는 연결 다핵산이다. 바람직하게, β는 PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 5에 의해 코딩되는 단백질의 1군데 이상의 초가변성 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 보다 바람직하게는, PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 5에 의해 코딩되는 전장 단백질을 코딩한다.
본 발명은 또한 하기 식 IV의 서열을 지닌 다핵산을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되거나 또는 그로 이루어질 수 있는 정제된 조제물에 관한 것이다.
<식 IV>
5'-α-β-δ-γ-3'
식 중, α, β,γ 및 δ는 상기 식 I 내지 식 III 에 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 하기 식 V의 서열을 지닌 다핵산을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되거나 또는 그로 이루어질 수 있는 정제된 조제물에 관한 것이다.
<식 5>
5'-ε-ζ-ι-κ-ξ-3'
식 중, 임의로 존재하는 ε는 폴리뉴클레오티드 α, β, γ 및 δ를 작용가능하게 발현하는 수단을 제공하는 5'말단부 폴리뉴클레오티드 서열이고, ζ는 식 KTVACC(여기서 K는 T, G 또는 U이고, V는 A, G 또는 C임)의 폴리뉴클레오티드이고, ι는 기껏해야 뉴클레오티드 130(바람직하게는 기껏해야 100)개 길이의 폴리뉴클레오티드이고, κ는 통상의 마커 또는 리포터 유전자, α, β, γ 및 작용가능하게 연결된 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다(여기서, α, β및 γ는 상기 식 I 내지 IV에 정의된 바와 같고, 임의로 존재하는 ξ는 폴리뉴클레오티드 α, β, γ 및 δ의 작용성 발현을 억제하지 않으며 ε에 작용가능하게 연결될 수 있는(예컨대, 플라스미드로) 3'말단부 폴리뉴클레오티드 서열임).
적합한 마커 또는 리포터 유전자에는, 예를 들어 항생제(예를 들어, 네오마이신, 에리트로마이신 또는 클로람페니콜)에 내성을 제공하는 유전자, 공지된 검출용 효소(예를 들어, β-락타마제, DHFR, 양고추냉이 페록시다제, 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 알칼리성 포스파타제 및 미국 특허 제4,190,496호(본 명세서에 참고문헌으로 인용됨)의 컬럼 32, 라인 33 내지 컬럼 38, 라인 44에 개시된 효소등)을 코딩하는 유전자, 공지된 항체(예를 들어, 마우스 IgG, 토끼 IgG, 랫트 IgG 등) 또는 공지된 항원성 단백질(예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 우 혈청 알부민(BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 우 감마글로불린(BGG), 락트알부민, 폴리리신, 폴리글루타메이트, 렉틴 등)을 코딩하는 유전자들이 포함된다.
폴리뉴클레오티드ι는 리더 mRNA 연결 서열과 ORF 인접 하류의 개시 코돈 사이에 위치한 PRRSV 게놈 유래의 폴리뉴클레오티드 서열에 80 % 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열인 것이 바람직하다. 뉴클레오티드 "약 130"개 길이는 κ의 작용성 발현에 악영향을 미치지 않는 폴리뉴클레오티드ι의 길이를 의미한다. 예컨대, ISU 79에서 ORF 7의 발현을 억제하지 않는 리더-mRNA 연결 서열은 ORF 7의 개시 코돈으로부터 상류로 129번째 염기에 있을 수 있다(하기 실험 2 참조). 도 1 및 도 9에 도시된 서열로부터 적합한 폴리뉴클레오티드ι의 서열의 예를 추론할 수 있다.
본 발명의 다핵산은 폴리뉴클레오티드의 혼합물로서 또는 머리-대-꼬리(센스-안티센스) 또는 머리-대-머리 형태로 공유적으로 연결된 상기 서열의 조합을 포함하거나, 본질적으로 그로 구성되거나 또는 그로 이루어질 수도 있다. 본 발명은 상기 서열 및 그의 조합에 상보적인 다핵산(안티센스 다핵산)도 포함한다. 따라서, 본 발명의 다핵산은 ORF 5의 여러 또는 변형체 카피를 가지는 것 외에도, PRRSV의 아이오와 균주의 ORF 5의 항원성 또는 초가변성 영역을 비롯해 ORF 1 내지 7중 하나 이상의 여러 또는 변형체 카피를 포함할 수도 있다.
상기 기재된 방법, 및 하기 기재된 실험 및 미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호와 유사하게, 예를 들어 숙주에서 발현되는 적합한 플라스미드내에 삽입함으로써 적절하게 제조된 PRRSV 게놈의 제한 단편을 포함하는 재조합 클론의 라이브러리(예를 들어, 숙주로 대장균을 사용)를 만들 수 있다. 그 후에, 이 클론을 적합한 프로브로 스크리닝하였다(예를 들어 ORF 2 내지 3의 보존된 서열을 기준으로 함; 예를 들어 미국 특허 출원 제08/301,435호의 도 22 참조). 그 후에, 양성 클론을 선택하여 적합한 수준으로 증식시킬 수 있다. 그 후에, 공지된 방법에 따라 양성 클론으로부터 다핵산을 단리하였다. 그 후에, 상기 기재된 바와 같이 PCR에 적합한 프라이머를 설계하고 제조하여 다핵산의 목적하는 영역을 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 정제 조제물은 하기 표와 같이, VR 2385, VR 2430 및(또는) VR 2431의 ORF 5 내지 7중 하나 이상과 97 % 이상 서열이 동일한(또는 상동) 서열, VR 2385, VR 2428, VR 2429, VR 2430, VR 2431, VR 2474 및 ISU-1894의 ORF 2 내지 5중 하나 이상과 적어도 최소 서열 동일성(또는 상동성)을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 다핵산을 포함할 수도 있다.
바람직하게, 다핵산은 hv PRRSV 단리체의 ORF 2 내지 4중 하나 이상의 충분히 긴 영역 또는 부분을 제거 또는 변형시켜 단리체를 저독성 또는 무독성으로 만든다.
본 출원서에서, "상동성"은 상동성을 결정하는 통상의 방법에 따라 배열된, 2개 이상의 바이러스 서열에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율을 의미한다(예를 들어 미국 특허 출원 제08/301,435호의 실험 III에 개시된 방법에 따라 배열된 맥벡터(MACVECTOR) 또는 진웍스(GENEWORKS)컴퓨터 프로그램).
바람직하게, 본 발명의 단리된 다핵산은 항원성에 필수적이지 않은 비상동성 아미노산은 치환되어도 무방하며 아미노산 10개 이상의 길이인 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 항원성 단편이다. 단백질, 폴리펩티드 또는 그의 항원성 단편의 아미노산 잔기는 그가 하기 정의된 자신이 속한 극성기중 하나로 대체된다면 변화없이 치환된다.
염기성 아미노산:
리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His)
산성 아미노산:
아스파르트산(Asp), 글루타민산(Glu), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln)
친수성, 비이온성 아미노산:
세린(Ser), 트레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln)
황-함유 아미노산:
시스테인(Cys), 메티오닌(Met)
소수성, 방향족 아미노산:
페닐알라닌(Phe), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp)
소수성, 비방향족 아미노산:
글리신(Gly), 알라닌(Ala), 발린(Val), 루신(Leu), 이소루신(Ile), 프롤린(Pro)
보다 바람직하게, 본 발명의 다핵산은 PRRSV 단리체 VR 2385, VR 2386, VR 2428, VR 2429, VR 2430, VR 2431, VR 2474 및(또는) ISU-1894의 둘째, 셋째, 넷째, 다섯째, 여섯째 및(또는) 일곱째 오픈 리딩 프레임(ORF 2 내지 7)에 의해 코딩되는 1개 이상의 단백질을 코딩한다(예를 들어 미국 특허 출원 제 08/301,435호의 도 3 및(또는) SEQ ID NOS: 15, 17, 19, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 및 65에 나타낸 1개 이상의 서열).
ORF 6 및 7은 그의 뉴클레오티드 서열이 높은 독성(hv) 및 저독성(lv) 단리체 중에 고도로 보존되므로, PRRSV의 독성 및 복제 표현형을 억제하는 후보일 가능성은 없다(미국 특허 출원 제08/301,435호의 실험 M 참조). 그러나, 고 복제(hr) 및 저 복제(lr) 단리체 중에 PRRSV 단리체의 ORF 5는 덜 보존되는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 다핵산 중에 hr PRRSV 단리체로부터의 ORF 5의 존재는 다핵산으로부터 생산된 재조합 백신의 생산 및 발현을 강화할 것으로 생각된다.
또한, PRRSV의 ORF 5는 폴리펩티드에서 통상적으로 항원성과 관련이 있는 3군데의 친수성 초가변성 영역을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 PRRSV ORF 5의 1군데 이상의 초가변성 영역을 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게는 식 a-b-c-d-e-f-g의 폴리펩티드를 포함하는데 여기서,
a는 아미노기 1개, PRRSV ORF 5에 의해 코딩되는 단백질의 위치 1 내지 31에 상응하는 폴리(아미노산) 또는 폴리펩티드의 항원성에 영향을 주지 않는 이러한 폴리(아미노산)의 단편이고,
b는 상기 표 1의 초가변성 영역 1번에 나타낸 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고,
c는 PRRSV ORF 5에 의해 코딩되는 단백질의 위치 39 내지 56에 상응하는 아미노산이고(바람직하게는, 1개 이상의 아미노산(바람직하게는 1 내지 10)이 통상적으로 치환될 수 있는, 화학식 LQLIYNLTLCELNGTDWL의 서열),
d는 상기 표 1의 초가변성 영역 2번에 나타낸 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열이고,
e는 PRRSV ORF 5에 의해 코딩되는 단백질의 위치 67 내지 119에 상응하는 아미노산 서열이고(여기서 1개 이상(바람직하게는 1 내지 20이고, 보다 바람직하게는 1 내지 10임)의 아미노산 잔기는 변화없이(conservatively) 치환될 수 있고, 폴리펩티드의 항원성에 악영향을 미치지 않음),
f는 상기 표에서 초가변성 영역 3번에 나타낸 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고,
g는 카르복실기(화학식 -COOH인 기), PRRSV ORF 5에 의해 코딩되는 단백질의 위치129 내지 200에 상응하는 아미노산 서열 또는 이러한 폴리펩티드에 악영향을 미치지 않는 그의 단편이다.
따라서, 면역보호 목적(예를 들어 백신의 제조)을 위해 사용될 때, 본 발명의 다핵산은 높은 복제 단리체 유래의 1카피 이상의 ORF 5를 포함한다(즉, 예를 들어 CRL 11171 세포에서 106내지 107TCID50의 역가까지 증식된 단리체. 또한, 미국 특허 출원 제08/301,435호의 실험 VIII 내지 XI의 토의 참조).
한편, lv 단리체 VR 2431은 hv 단리체에 대한 결실 돌연변이체인 듯하다(미국 특허 출원 제08/301,435호의 실험 III 및 VIII 내지 XI 참조). 노던 블롯 분석을 토대로 결실은 ORF 4에 있는 듯하다. 따라서, 면역보호 목적으로 사용될 때, 본 발명의 다핵산은 바람직하게는 높은 독성의 원인인 hv 단리체로부터의 ORF 4의 영역을 포함하지 않고, 보다 바람직하게는 인접 ORF 3 및 ORF 5와 중첩되지 않는 ORF 4의 영역은 배제한다.
또한, 뉴클레오캡시드 단백질 또는 항체도 돼지 PRRSV에 대한 면역학적 방어성을 제공하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 핵산은 면역보호 목적을 위해 사용될 때, 바이러스 엔벨로프 단백질의 항원성 영역을 코딩하되 돼지에게 투여될 때 PRRS와 관련된 증상 또는 조직병리학적 변화를 초래하지는 않는 PRRSV 단리체의 ORF 2, 3, 4, 5 및 6 영역중 하나 이상의 카피를 1개 이상 포함한다. 바람직하게, 이 영역은 다른 PRRSV 단리체의 엔벨로프 단백질에 대한 항체와 면역학적으로 교차-반응성이다.
마찬가지로, 본 발명의 다핵산에 의해 코딩되는 단백질은 그 단백질을 포함하는 조성물을 투여받은 돼지에게 PRRS에 대한 방어성을 제공하고, 이 단백질에 대한 항체는 다른 PRRSV 단리체의 엔벨로프 단백질과 면역학적으로 교차-반응성이다. 보다 바람직하게, 본 발명의 다핵산은 PRRSV 단리체의 전체 엔벨로프 단백질 또는 그와 80 % 이상 상동성이며 비상동성 잔기는 변화없이 치환된 단백질 또는 98 % 이상 상동성인 단백질이다. 가장 바람직하게, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 언급된 1개 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 도 1에 나타낸 서열중 하나이다.
바이러스 게놈에서 다핵산의 상대적으로 짧은 단편(약 20 bp 또는 그 이상)을 사용하여 감염된 동물의 조직 및(또는) 생물 체액 샘플을 스크리닝 또는 확인할 수 있고, 본 명세서에 기재된 방법 및 수의학 및 바이러스 진단 및 수의학 약품 분야에서 통상의 기술인 것으로 알려진 방법에 의해 관련된 바이러스를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 측면에는 PRRSV 게놈(바람직하게는, PRRSV의 아이오와 균주) ORF 2 내지 7로부터 유래하는 15 내지 2000 bp의 단편, 바람직하게는 18 내지 1000 bp의 단편, 보다 바람직하게는 21 내지 100 bp 길이의 단편으로 본질적으로 이루어진 단리된(그리고 원한다면 정제된) 다핵산이 포함된다. 특히 바람직하게, 본 발명의 단리된 다핵산 단편은 PRRSV의 아이오와 균주의 게놈의 ORF 2 내지 7중 하나 이상의 말단으로부터 얻어지고, 가장 바람직하게는 하기 실험 1 및 2에 기재된 프라이머 및 미국 특허 출원 제08/301,435호의 SEQ ID NO:1 내지 12, 22 및 28 내지 34로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 (a) 25 내지 75 ℃에서 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 아이오와 균주 유래의 게놈 다핵산과 혼성화되는 뉴클레오티드 10 내지 50개 길이의 서열을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머, (b) 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스의 상기 아이오와 균주의 게놈 다핵산에서 발견되고 제1 프라이머가 혼성화하는 서열의 하류에 있는, 뉴클레오티드 10 내지 50개 길이의 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 (c) 증폭된 다핵산을 검출할 수 있는 시약을 포함하는, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스를 분석하는 진단 킷트에 관한 것이기도 하다. 바람직하게, 이 시약은 서열간 삽입 염료이고, 이 시약의 형광 특성은 이중쇄 DNA내에 삽입될 때 변한다.
본 발명의 단리된 다핵산은 (i) 바이러스 다핵산(에 상보적인) 상응하는 cDNA를 적당한 제한 효소 1개 이상으로 분해하거나, (ii) PCR에 의해 증폭시키거나(목적하는 ORF의 5' 및 3'말단부 영역 또는 5'말단부의 상류 영역 또는 3'말단부의 하류 영역에 상보적인 적당한 프라이머를 사용함), 또는 (iii) 시판되는 폴리뉴클레오티드 자동 합성기를 이용한 합성에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양은 PRRS 바이러스, 바람직하게는 PRRSV의 아이오와 균주 유래의 단백질 또는 항원성 단편 1종 이상에 관한 것이다. 상기 기재된 바와 같이, PRRS 바이러스(바람직하게는, PRRSV의 아이오와 균주)로부터의 단백질의 항원성 단편은 아미노산 5개 이상의 길이이고, 특히 바람직하게는 아미노산 10개 이상의 길이이며, 항원성 단편을 포함하는 조성물을 투여받은 돼지에서 면역보호 반응을 제공 또는 촉진시킨다.
단백질의 항원성 부분을 판단하는 방법은 당업자에게 알려져 있다(상기 발명의 설명 참조). 또한, 숙주 동물(예를 들어 돼지)에서 단백질 전장이 항원성임을먼저 보임으로써 단백질의 본질적인 항원성 단편을 결정할 수도 있다. 이 단백질이 그의 특정 영역 또는 서열에 특이적으로 결합하는 항체의 존재하에서도 항원성이라면, 그 후에 이 영역 또는 서열은 면역보호에 필수적이지 않을 수 있다. 반면, 이 단백질이 그의 특정 영역 또는 서열에 특이적으로 결합하는 항체의 존재하에 더이상 항원성이 아니라면, 그 후에 이 영역 또는 서열은 항원성에 필수적인 것으로 생각된다.
사용한 모든 PRRSV 단리체의 ORF 5 산물의 아미노산 서열을 비교하여 PRRSV의 ORF 5의 3군데 초가변성 영역을 확인하였다(예를 들어 도. 2D 참조). 이 3군데 영역에서의 아미노산 변화는 중요하며, 구조적으로 보존되지 않는다(도 2D). 3군데 초가변성 영역 모두 친수성 및 항원성이다. 따라서, 이러한 영역은 바이러스막에 노출되어, 숙주의 면역 선택 압력을 받을 것이다.
본 발명은 상기 정의된 1가지 이상의 다핵산에 의해, 바람직하게는 PRRSV의 1가지 이상의 ORF에 의해, 보다 바람직하게는 PRRSV, 보다 바람직하게는 PRRSV의 아이오와 균주의 1가지 이상의 ORF에 의해 코딩되는 단백질 또는 그의 항원성 단편에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 단백질 및 항원성 단편은 PRRSV에 대해 돼지를 면역화하는데 유용하고, 돼지의 PRRSV(특히 PRRSV의 아이오와 균주) 노출 또는 감염 여부를 스크리닝하는 혈청검사 시험 등에 유용하다.
예를 들어 본 발명의 단백질은 VR 2385, ISU-22(VR 2429), ISU-55(VR 2430), ISU1894, ISU-79(VR 2474) 및 ISU-3927(VR 2431)에 의해 코딩되는 단백질(예를 들어 미국 특허 출원 제08/301,435호의 도 2 및(또는) SEQ ID NO: 15, 17, 19, 43,45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 67, 69 및 71에 나타낸 한가지 이상의 서열), 이 단백질 전장보다 아미노산 5개가 적은 길이를 지닌 1가지 이상의 단백질의 항원성 영역, 상기 표 2에 나타난 PRRSV ORF에 의해 코딩되는 단백질과 상동성이 가장 낮은 폴리펩티드, 및 1가지 이상의 VR 2385, VR 2429, VR 2430, ISU-1894, ISU79 및 VR 2431(예를 들어 미국 특허 출원 제08/301,435호의 SEQ ID NO: 17, 19, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 및 61)의 ORF 6 내지 7중 하나에 의해 코딩되는 단백질과의 상동성이 97 % 이상인 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 단백질은 VR 2385, VR 2428, VR 2429, VR 2430, VR 2431, VR 2474 및 ISU-1894(예를 들어 도 2A 내지 도 2D 참조)의 ORF 2 내지 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 ORF에 의해 코딩되는 서열, 그를 투여받은 돼지에 면역학적 보호를 제공하는 그의 단편(여기서, 아미노산 서열 중에 1 내지 100(바람직하게는 1 내지 50, 보다 바람직하게는 1 내지 25)개의 결실 또는 통상의 치환이 있을 수 있음), 및 그를 투여받은 돼지에 효과적인 면역학적 보호를 제공하는, 아미노산 5개 이상, 바람직하게는 10개 이상인 그의 항원성 단편을 갖는다.
보다 바람직하게, 본 발명의 단백질 변형체 또는 단백질 단편은 천연 전장 단백질(즉, PRRSV ORF에 의해 코딩되는 단백질)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체에 대한, 상응하는 천연 전장 단백질의 결합 친화성(또는 해리 상수)이 1 % 이상, 바람직하게는 10 % 이상이다.
또한, 본 발명은 작용성인 발현계에서 본 발명의 다핵산을 발현시키는 단계, 발현된 폴리펩티드를 발현계로부터 정제하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 적합한 발현계에는 시험관내 또는 생체내 단백질 및 폴리펩티드 발현에 통상적으로 사용되는 것들, 예를 들어 시험관내 발현의 경우 토끼 망상적혈구계 및 생체내 발현의 경우 변형된 또는 키메라 PRRSV(주사용 숙주 세포 라인, 예를 들어 MA-104, CRL 11171, PSP-36, PSP-36-SAH, MARC-145 및 돼지 폐포 마크로파지를 감염시키는데 사용함), 또는 통상의 발현계(예를 들어 박테리아 플라스미드 및 상응하는 숙주 박테리아, 효모 발현계 및 상응하는 숙주 효모 등)에 사용되는 공지된 프로모터(예를 들어 티미딘 키나제 프로모터, SV40 등)의 작용가능한 조절 하에 본 발명의 다핵산을 포함하는 통상의 발현 벡터가 포함된다. 그 후에, 발현된 폴리펩티드 또는 단백질을 통상의 정제 및(또는) 단리 방법에 의해 발현계로부터 정제 또는 단리한다.
본 발명의 다른 특징은 본 발명의 예로 주어진 하기 전형적인 실시태양의 기재에서 분명해질 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
요약:
저독성, "중간" 독성 및 높은 독성의 미국형 PRRSV 단리체 하나의 ORF 2 내지 5의 서열을 결정하고 분석하였다. 다른 PRRSV 단리체의 알려진 서열과 비교한 결과, 뉴클레오티드 및 아미노산 수준 모두에서 상당한 서열 변이는 독성이 다른 7가지 미국형 단리체의 ORF 2 내지 5에 존재하였다. 그러나, 이러한 7가지 미국형 단리체의 ORF 6 및 7은 고도로 보존되어 있다(미국 특허 출원 제08/301,435호). 또한, 광범위한 서열 변이가 유럽형 LV 및 미국형 단리체 사이의 ORF 2 내지 7에서나타났다. 공지된 가장 낮은 독성의 미국형 단리체(ISU-3927)는 다른 미국형 단리체에 비해, 가장 많은 서열 변이를 나타냈다.
또한, 미국형 단리체의 계통 관계를 분석하였다. 미국형 단리체의 ORF 2 내지 7의 계통 분석 결과, 주요 미국형 PRRSV 유전자형 범위내에 3가지 군 이상의 PRRSV 변형체(또는 소수 유전자형)가 있는 것으로 나타났다. 결론적으로, 다른 지역들로부터의 많은 바이러스 단리체를 조사할수록 추가의 주요 또는 소수 유전자형이 다수 동정될 가능성이 높다.
흥미롭게도, 독성이 가장 낮은 공지된 미국형 단리체(ISU 3927)는 다른 미국형 단리체와는 분명히 다른 군을 형성한다. 또한, 뉴클레오티드 및 아미노산 분석 결과는 단리체 ISU 3927이 다른 미국형 단리체에 비해 ORF 2 내지 4에서 가장 변화가 많음을 나타냈다. 단리체 ISU 3927 중의 많은 이러한 변화는 보존되지 않은 아미노산 치환으로 나타난다. 그러나, 다른 미국형 단리체에 비해 단리체 ISU 3927 중의 보존되지 않은 변화는 특정 영역(ORF 2 내지 4를 통해 존재함)에 한정되는 것으로 보이지 않는다. 따라서, 서열 변화 및 바이러스 독성 사이의 특이적인 상호 관련성은 아직 충분히 설명되지 않는다(ORF 3에서 몇군데 위치는 독성과 관련될 가능성이 있는 것으로 보임에도(도 2B, 위치30, 48, 54 내지 56, 134, 140, 143, 147, 153, 206, 및 215 참조), 1군데 이상의 이러한 위치에 있는 아미노산은 PRRSV ORF 3에 의해 코딩되는 다른 공지된 단백질을 돌연변이화하는 토대 역할을 할 수 있음).
결과:
7가지 미국형 PRRSV 단리체 사이의 아미노산 서열 일치도는 ORF 2에서 91 내지 99 %였고, ORF 3에서 86 내지 98 %였고, ORF 4에서 92 내지 99 %였고, ORF 5에서 88 내지 97 %였다. 독성이 가장 낮은 공지된 미국형 단리체는 다른 미국형 단리체에 비해 ORF 5 내지 7에서보다 ORF 2 내지 4에서 서열 변화가 더 많았다. 항원성 잠재력을 지닌 초가변성 영역 3군데가 ORF 5에 의해 코딩되는 주요 엔벨로프 당단백질에서 확인되었다.
ORF 2 내지 7의 서열 쌍 비교 및 계통수 분석 결과는 미국형 PRRSV의 주요 유전자형 범위내에 세군 이상의 PRRSV 변형체(또는 소수 유전자형)의 존재를 시사한다. 독성이 가장 낮은 공지된 미국형 단리체는 다른 독성을 지닌 다른 미국형 단리체와 구별되는 한 군을 형성한다. 이러한 연구 결과는 PRRSV의 분류 및 백신 개발과 관련이 있다.
도 1은 미국형 단리체 ISU 3927, ISU 22 및 ISU 55의 ORF 2 내지 5와 다른 공지된 PRRSV 단리체와의 뉴클레오티드 서열 비교를 나타낸다. VR 2385의 뉴클레오티드 서열은 꼭대기에 나타나 있고, 차이만을 나타냈다. 각 ORF의 개시 코돈을 +>로 나타냈고, 각 ORF의 종결 코돈을 별표(*)로 나타냈다. 서브게놈 mRNA 3, 4 및 3-1의 리더-mRNA 연결 서열에 밑줄을 그었고, 각 ORF의 개시 코돈에 상대적인 연결 서열의 위치를 각 ORF의 상류 뉴클레오티드에 대해 음(-)수로 나타냈다. 이러한 배열에 사용된 VR 2385(미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호), VR 2332, ISU 79 및 ISU 1894(미국 특허 출원 제08/301,435호)의 서열은 이미 보고되어 있다.
재료 및 방법:
세포 및 바이러스:
ATCC CRL 11171 세포 라인을 사용하여 PRRSV를 증식시켰다. 이 세포를 10 % 우 태아 혈청(FBS) 및 1 x 항생제(페니실린 G 10,000 단위/ml, 스트렙토마이신 10,000 mg/ml 및 암포테리신 B 25 mg/ml)를 보충한 둘베코스 최소 필수 배지(DNIEM)에서 생장시켰다.
상기 연구에서 사용된, ISU 22, ISU 55 및 ISU 3927로 표시되는 PRRSV의 세가지 미국형 단리체를 PRRS 발병 중인 아이오와의 여러 농장으로부터 구하였다. 3가지 단리체 모두를 추가 실험 전에 CRL 11171 세포에서 3회 플라크-정제하였다. 상대적인 병원성 연구는 단리체 ISU 3927가 10가지 다른 미국형 PRRSV 단리체 중에서 가장 독성이 낮은 단리체임을 보여주었다. 단리체 ISU 22는 높은 독성의 단리체이고 단리체 ISU 55는 "중간" 병원성이다. 이 실험에 사용된 3가지 바이러스 단리체 모두 7회 계대배양하였다.
PRRSV 세포내 RNA의 단리:
CRL 11171 세포의 전면 배양된 단층들을 0.1의 감염다중도(m.o.i.)로 PRRSV의 3가지 미국형 단리체인 ISU 22, ISU 55 및 ISU 3927로 각각 감염시켰다. 감염 24시간 후에, 감염된 세포를 차가운 PBS 완충액으로 3회 세정하였다. 그 후에, 세포내 총 RNA를 구아니디늄 이소티오시아네이트 및 페놀-클로로포름 추출(스트라타진(Stratagene))에 의해 단리하였다. RNA 시료 중의 바이러스-특이적 RNA 종의 존재를 노던 블롯 혼성화(데이타는 나타내지 않음)에 의해 확인하였다. 세포내 총 RNA를 분광광도법으로 정량화하였다.
역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR):
먼저 쇄 상보적 (c)DNA를 상기 개시된 임의 프라이머를 사용한 역전사에 의해 세포내 전체 RNA로부터 합성하였다[멩(Meng) 등의 문헌[1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258]]. PRRSV의 3가지 단리체의 ORF 2 내지 5의 전체 단백질 코딩 영역을 증폭하는 경우, VR 2385 및 LV의 서열을 토대로 두 세트의 프라이머를 설계하였다. 프라이머 JM259(5'-GGGGATCCTTTTGTGGAGCCGT-3') 및 JM260(5'-GGGGAATTCTGGGATAGGGAATGTG-3')는 ORF 4 및 5의 서열을 증폭하였고, 프라이머 XM992(5'-GGGGGATCCTCTGTTGG-TAATAG(A)GTCTG-3' 및 XM993(5'GGTGAATTCGTTTTATTTCCCTCCGGGC-3')는 ORF 2 및 3의 서열을 증폭시켰다. 이러한 프라이머의 5'말단에서 독특한 제한 부위(EcoRI 또는 BamHl)을 도입하여 클로닝을 도왔다. 축퇴 염기인 G(A)를 프라이머 XM 992 중에 VR 2385 및 LV의 서열을 토대로 합성하였다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌[1993, 미국 특허 출원 제08/301,435호]]. PCR을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다[멩(Meng) 등의 문헌[1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258]].
클로닝 및 뉴클레오티드 서열 분석:
RT-PCR 산물을 0.8 % 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. ORF 2 및 3뿐아니라 ORF 4 및 5를 각각 나타내는 두 PCR 단편을 글래스밀크 방법에 의해 정제하였다(진클린(GENECLEAN) 킷트, BIO 101, 인크.). 정제된 단편을 BamHl 및 EcoRI으로 각각 자르고, 상기 기재된 바와 같이 벡터 pSK+내에 클로닝하였다[멩(Meng) 등의 문헌(1993)]. E. Coli DH5 α세포를 재조합 플라스미드의 형질전환에 사용하였다. 흰색 콜로니를 선택하여 암피실린 100 mg/ml를 함유하는 LB 브로쓰에서 생장시켰다. 재조합 플라스미드를 포함하는 대장균 세포를 라이소자임으로 용균한 다음, 플라스미드를 퀴아겐 컬럼(퀴아겐 인크.(QIAGEN Inc.))을 사용하여 단리하였다.
바이러스 삽입체를 포함하는 플라스미드를 자동화 DNA 서열분석기(어플라이드 바이오시스템, 인크.(Applied Biosystem, Inc.))로 서열을 분석하였다. 3가지 PRRSV 단리체 각각의 ORF 2 내지 5의 전체 서열을 나타내는 3개 이상의 cDNA 클론을 범용 역프라이머를 이용해 서열분석하였다. 또한, 몇가지 바이러스-특이적 프라이머인 XM969(5'-GATAGAGTCTGCCCTTAG-3'), XM970(5'-GGTTTCACCTAGAATGGC-3'), XM1006(5'-GCTTCTGAGATGAGTGA-3'), XMO77(5'-CAACCAGGCGTAAACACT-3') 및 XMO78(5'-CTGAGCAATTACAGAAG-3')를 사용하여 ORF 2 내지 5의 서열을 결정할 수 있었다.
서열 분석:
서열 데이타를 모아서 맥벡터(인터내셔날 바이오테크놀로지, 인크(International Biotechnologies, Inc.)) 및 진웍스(인텔리제네틱스,인크(IntelliGenetics, Inc.)) 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분석하였다. 파우프(PUAP) 소프트웨어 팩키지 버전 3.1.1(David L. Swofford, Illinois Natural History Survey, Champaign, IL)을 사용하여 계통 분석을 수행하였다. PAUP는 계통수를 작성하기 위해 최대로 간단한 알고리즘을 사용한다.
결과:
ORF 2 내지 5의 뉴클레오티드 서열 분석:
5가지 PRRSV 단리체인 ISU 79, ISU 1894, ISU 22, ISU 55 및 ISU 3927의 ORF 2 내지 5의 서열을 결정하고 VR 2385, VR 2332 및 LV를 비롯한 다른 공지된 PRRSV 단리체와 비교하였다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1993)]. 단리체 VR 2385, ISU 22, ISU 55, ISU 79, ISU 1894 및 ISU 3927의 ORF 6 및 7의 서열은 이미 보고되었다[미국 특허 출원 제08/301,435호]. 이 실험에서 사용된 단리체는 실험적으로-감염된 돼지의 폐독성에서 차이가 있는 것으로 나타났다[미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호]. ISU 3927는 10가지 다른 미국형 PRRSV 단리체 중에서 독성이 가장 낮았다[미국 특허 출원 제08/131,625호 및 미국 특허 출원 제08/301,435호].
다른 미국형 PRRSV 단리체와 마찬가지로, 3가지 단리체의 ORF 2 내지 4는 서로 중첩되었다(도 1). 그러나, LV와는 달리, 미국형 단리체의 ORF 4 및 5는 뉴클레오티드 10개 만큼 이격되었다(도 1). LV의 ORF 4 및 5는 뉴클레오티드 1개가 중첩되었다. 미국형 단리체에서 LV의 ORF 5의 개시 코돈중 아데닌을 티민으로 단일염기 치환(SNT) 결과, 미국형 단리체의 ORF 5의 개시 코돈은 ORF 4 종결 코돈의 뉴클레오티드 10개 만큼 하류에 위치하였다. 따라서, 서열을 코딩하지 않는 뉴클레오티드 10개는 공지된 미국형 단리체의 ORF 4 및 5사이에 있는 듯이 보인다(도 1).
ISU 79의 ORF 2는 다른 미국형 단리체보다 뉴클레오티드 3개 만큼 짧다. ORF 2의 종결 코돈 직전의 TGG로부터 TAG로의 단일 염기 치환은 ISU 79에서 새로운 종결 코돈을 생성시켰다(도 1). 다른 미국형 단리체에 비해 ISU 3927의 ORF 5에서 뉴클레오티드 3개 결실이 나타나기도 했다(도 1). 다른 ORF보다 뉴클레오티드 3개가 더 짧은 ISU 79의 ORF 2 및 ISU 3927의 ORF 5(도 1)를 제외한다면 모든 미국형 단리체의 ORF 2 내지 5의 크기는 동일하다.
도 1에 나타낸 7가지 미국형 PRRSV 단리체의 ORF 2 내지 5의 서열 비교는 미국형 단리체 ORF 2 내지 5에서 상당한 뉴클레오티드 서열 변화가 있음을 나타낸다(도 1). 뉴클레오티드 서열 일치도는 VR 2385, VR 2332, ISU 22, ISU 55, ISU 79 및 ISU 1894사이의 ORF 2에서는 96 내지 98 %였고, ORF에서는 92 내지 98 %였고, ORF 4에서는 92 내지 99 %였고, ORF 5에서는 90 내지 98 %였다(표 3).
독성이 가장 낮은 단리체인 ISU 3927은 7가지 미국형 단리체 중에서 가장 변화가 많다(도 1 및 표 3). ISU 3927 및 다른 미국형 단리체 사이의 뉴클레오티드 서열 일치도는 ORF 2에서는 93 내지 94 %였고, ORF 3에서는 89 내지 90 %였고, ORF 4에서는 91 내지 93 %였다(표 3). ORF 6 및 7(미국 특허 출원 제08/301,435호)과 마찬가지로, ISU 3927의 ORF 5는 3개의 뉴클레오티드 결실을 제외한다면 유의한 변화는 없다(도 1). ISU 3927의 ORF 5는 다른 미국형 단리체의 ORF 5와 뉴클레오티드 서열 일치도는 91 내지 93 %이다(표 3).
그러나, 광범위한 서열 변화가 LV 및 미국형 단리체의 ORF 2 내지 5에서 나타났다(도 1 및 표 3). LV 및 미국형 단리체 사이의 뉴클레오티드 서열 일치도는 ORF 2에서는 65 내지 67 %였고, ORF 3에서는 61 내지 64 %였고, ORF 4에서는 63 내지 66 %였고, ORF 5에서는 61 내지 63 %였다(표 3). LV 및 미국형 PRRSV 사이의 ORF 6 및 7에서의 광범위한 유전적 변화가 존재할 수도 있다(미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호). 이러한 결과는 독성이 가장 낮은 단리체인 ISU 3927가 미국형 단리체와 가장 뚜렷히 관계가 있고, 유전적 변화는 대부분 ORF 2 내지 4에서 일어남을 나타낸다.
ISU 79에서 관찰된 ORF 2에서 종결 코돈 앞에서 TGG의 TAG로의 단일 염기 치환은 단리체 ISU 55 및 ISU 3927(이들 모두 7가지 sg mRNA을 생산함)에서는 나타나나, 단리체 ISU 22, ISU 1894 또는 VR 2385(이들 각각은 6가지 sg mRNA만을 합성함)에서는 나타나지 않는다(미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호). 이 결과는 ISU 55 및 ISU 3927의 리더-mRNA 3-1 연결 서열이 ISU 79와 동일할 가능성이 매우 높음을 나타낸다(도 1).
ISU 79 및 ISU 1894의 sg mRNA 3 및 4의 리더-mRNA 연결 서열은 sg mRNA 3의 경우, ORF 3의 상류의 89개 뉴클레오티드에 있는 GUAACC이고, sg mRNA 4의 경우, ORF 4의 상류의 10개 뉴클레오티드에 있는 UUCACC인 것으로 결정되었다(미국 특허 출원 제08/301,435호. 또한 하기 실험 2 참조). 단리체 ISU 22, ISU 55 및 ISU 3927과 단리체 VR 2385, ISU 79 및 ISU 1894와의 서열 비교 결과는 sg mRNA 3 및 4의 경우, 리더-mRNA 연결 서열은 미국형 단리체 중에 보존됨을 나타낸다(도 1).
ORF 2 내지 5에 의해 코딩되는 아미노산 서열의 분석:
도 2는 다른 공지된 PRRSV 단리체와 미국형 단리체 ISU 22, ISU 55 및 ISU 3927의 ORF 2(A), ORF 3(B), ORF 4(C) 및 ORF 5(D)의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. VR 2385이 서열은 맨위에 나타나 있고, 차이만을 표시하였다. 결실은 (-)로 표시하였다. LV(D)의 ORF 5에 있는 추정상의 신호 서열에는 밑줄을 그었다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1995)]. ORF 5에서 항원성 잠재력을 지닌 3군데의 초가변성 영역(D)은 별표(*)로 표시하였다. 이러한 배열에서 사용되는 공개된 서열은 LV[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌 (1993)], VR 2385[미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호], VR 2332, ISU 79 및 ISU 1894[미국 특허 출원 제08/301,435호]였다.
그의 높은 염기성 아미노산 함량 및 그의 소수성 성질을 토대로, ORF 7의 번역 산물은 뉴클레오캡시드 단백질일 것으로 생각된다[미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호, 뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1993), 콘젤만(Conzelmann) 등의 문헌(1993), 마르다시(Mardassi) 등의 문헌(1994)]. ORF 6 산물은 잠재적인 아미노-말단부 신호 서열이 결핍되어 있고, 잠재적인 막관통 단편을 나타낼 수 있는 몇개의 소수성 영역을 포함한다. 따라서, ORF 6 산물은 M 단백질일 것으로 생각된다[미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호, 뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1993), 콘젤만(Conzelmann) 등의 문헌(1993)].
컴퓨터 분석 결과, 미국형 단리체의 ORF 2 내지 5에 의해 코딩되는 산물은 모두 막결합 단백질을 암시하는 하이드로패씨 특징을 갖는 것으로 나타났다. ORF 2 내지 5의 번역 산물은 각각 소수성 아미노 말단부를 포함한다. N-말단부 소수성 서열은 상기 ORF 각각에 대한 신호 서열로 작용할 수 있고, 그는 ORF 2 내지 5의 감염된 세포의 소포체로의 운반에 관여할 것이다. ORF 2 내지 5 각각에서 1개 이상의 추가의 소수성 도메인이 카르복시 말단에 있었다. 이러한 추가의 소수성 도메인은 막 앵커로 작용할 것이다.
조사된 7가지 미국형 단리체의 ORF 2 내지 5의 연역적 아미노산 서열도 상당하게 변하였고(도 2), 이는 도 1에서 관찰되는 뉴클레오티드 차이의 대부분은 사일런트 돌연변이가 아님을 나타낸다. VR 2385, VR 2332, ISU 22, ISU 55, ISU 79 및 ISU 1894 사이의 아미노산 일치도는 ORF 2에서는 95 내지 99 %였고 , ORF 3에서는 90 내지 98 %였고, ORF 4에서는 94 내지 98 %였고, ORF 5에서는 88 내지 97 %였다(표 3).
또한, 독성이 가장 낮은 단리체 ISU 3927는 ORF 5 내지 7에서보다는 ORF 2 내지 4에서 다른 미국형 단리체와 더 많은 변화를 나타냈다(도 2 및 표 3)(미국 특허 출원 제08/301,435호 및 표 3). LV의 ORF 2 내지 5는 미국형 단리체의 ORF와 각각 57 내지 61 %, 55 내지 56 %, 65 내지 67 % 및 51 내지 55 %의 아미노산 서열 일치도만을 공유하였다(표 3). 결실 또는 삽입은 유럽형 LV 및 미국형 단리체에서 ORF 2 내지 5를 통해 나타났다. 결실 또는 삽입은 유럽형 LV와 미국형 단리체를 비교하는데 있어서 ORF 2 내지 5를 통해 발견되었다(도 2).
ORF 5 산물의 서열 비교 결과, ORF 5의 N-말단부 영역은 (a) 미국형 단리체와 LV 사이 및 (b) 여러 미국형 단리체사이에서 모두 매우 가변성이었다. LV에서, ORF 5의 처음 32 내지 33개의 아미노산 잔기는 신호 서열을 나타낼 수 있다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌(1995), 도 2D). 따라서, 모든 PRRSV 단리체의 ORF 5의 잠재적인 신호 서열은 매우 이질적이다. 이 이질성은 신호 서열이 쪼개져서 성숙한 비리온에서는 나타나지 않을 것이므로, 임의 숙주의 면역 선택 압력으로 인한 것이다.
또한, 3군데 추가의 초가변성 영역을 입수할 수 있는 모든 PRRSV 단리체의 ORF 5의 아미노산 서열을 비교하여 확인하였다(도 2D). 이 3군데 영역의 아미노산 변화는 중요하고, 구조적으로 보존되지 않는다(도 2D). 컴퓨터 분석 결과, 3군데 초가변성 영역 모두 친수성이고 항원성인것으로 밝혀졌다. 따라서, 이 영역은 바이러스막에 노출되고 숙주의 면역 선택 압력 하에 있을 가능성이 있다. 그러나, 이러한 초가변성 영역의 특정 기능을 ORF 5 엔벨로프 단백질의 항원 결정자로 확증하는 데는 추가 실험이 필요할 수 있다.
PRRSV의 미국형 단리체 사이의 계통 관계:
M 및 N 유전자 분석을 토대로, 미국 형 PRRSV 및 유럽형 PRRSV는 2가지 다른 유전자형을 나타내는 것으로 밝혀졌다(미국 특허 출원 제08/301,435호). 미국형 PRRSV 단리체의 계통수를 결정하기 위해, 도 1 및 2에 나타낸 7가지 미국형 PRRSV 단리체의 ORF 2 내지 7을 먼저 진웍스 프로그램(인텔리제네틱스, 인크.)으로 배열하였다. 그 후에, 파우프 프로그램(David L. Swofford, Illinois Natural HistorySurvey, Champaign, IL)을 사용하여 PRRSV의 미국형 단리체사이의 관계를 설명하는 계통수를 작성하였다.
파우프 소프트웨어 팩키지 버전 3.1.1의 도움으로 최대의 간단한 방법에 의해 도 3의 계통수를 작성하였다. 철저한 조사 선택을 이용하여 길이가 가장 짧은 브랜치(가장 간단한)을 찾아냈다. 부분 길이(치환 아미노산의 수)는 각 부문 상부에 나타나 있다. 이 분석에 사용된 서열은 LV, VR 2385, VR 2332, ISU 79 및 ISU 1894의 것이다.
계통수는 3군 이상의 변이체(또는 소수 유전자형)가 주요 미국형 PRRSV 유전자형의 범위내에 존재하는 것임을 나타낸다. 독성이 가장 낮은 미국형 PRRSV 단리체 ISU 3927는 다른 미국형 단리체와는 다른 브랜치를 형성한다(도 3). 단리체 ISU 22, ISU 79, ISU 1894 및 VR 2332는 다른 브랜치를 형성하고, 제2 소수 유전자형을 타나낸다. 3번째 소수 유전자형은 단리체 ISU 79 및 VR 2385에 의해 나타난다(도 3). 매우 유사한 계통수를 도 1에 나타낸 7가지 미국형 단리체의 ORF 1b의 마지막 60개의 뉴클레오티드를 분석하여 얻을 수도 있었다(데이타는 나타내지 않음). 동일한 계통수 형태를 진웍스 프로그램을 사용하는 비가중평균결합(UPGMA)으로 산술 평균하여 만들어낼 수도 있었다(데이타는 나타내지 않음).
요컨대, PRRSV의 다른 유전자형을 확인하여 추가로 설명하였다. ORF 2 내지 7의 서열 분석을 토대로 미국형 PRRSV의 주요 유전자형 범위내의 3가지 이상의 소수 유전자형을 확인하였다. 또한, 유럽형 PRRSV 및 미국형 PRRSV뿐 아니라 미국형 PRRSV 단리체사이의 유전적 변화를 추가로 확인하였고, 이는 PRRSV의 이질적 특징을 나타낸다. 독성이 가장 낮은 미국형 PRRSV 단리체 ISU 3927는 다른 미국형 단리체에 비해, ORF 2 내지 4에서 예상치 못한 높은 서열 변화를 갖는다.
<실시예 2>
PRRSV 복제 중에, 게놈 RNA 외에 6가지 서브게놈 mRNA(sg mRNA)가 합성되었다. 이러한 sg mRNA는 이 실험의 특징을 이룬다.
PRRSV의 sg mRNA는 PRRSV에 감염된 세포에서 3'-공통말단부 네스티드 세트를 형성한다. 이러한 각각의 sg mRNA는 폴리시스트론성이며, sg mRNA 7의 경우를 제외하면 여러 오픈 리딩 프레임을 포함한다(ORF-특이적 프로브를 사용하는 노던 블롯 분석에 의해 나타남). sg mRNA는 비리온내로 패키징되지 않았고 게놈 RNA만이 정제된 비리온에서 검출되었으며, 이는 PRRSV의 캡슐화 신호가 ORF 1 영역내에 국한될 가능성이 있음을 시사한다.
PRRSV에 감염된 세포의 sg mRNA의 수는 다른 독성의 PRRSV 단리체사이에서 변한다. 일부 PRRSV 단리체 sg mRNA의 다른 종류는 ORF 4의 상류 서열로부터 유래하는 것으로 실험 1에 나타나 있고, sg mRNA 3-1로 표시하였다.
단리체 ISU 79 및 ISU 1894뿐 아니라 단리체 ISU 79의 의 sg mRNA 3 및 4의 리더-mRNA 연결 서열은 공통의 뉴클레오티드 6개의 서열 모티프인 T(G)TA(G/C)ACC를 포함한다. 이러한 2가지 미국형 단리체의 게놈 RNA 서열 분석 및 렐리스타드 바이러스(LV)와의 비교 결과, PRRSV 단리체사이의 리더-mRNA 연결 서열의 이질성(heterogeneity)이 밝혀졌다. 리더-mRNA 연결 영역의 수, 위치 및 서열은 미국형 단리체 및 LV뿐 아니라 미국형 단리체사이에서도 달랐다. 리더-mRNA 연결 서열의 마지막 3개 뉴클레오티드인 ACC는 변하지 않는다. 변화는 처음의 뉴클레오티드 3개에서 나타났다. sg mRNA 3-1의 5'말단부 서열을 ISU 79 및 ISU 1894의 게놈 서열과 비교함으로써, ISU 1894에서는 T 내지 ISU 79에서는 C의 단일 염기 치환이 ISU 79의 새로운 리더-mRNA 연결 서열, 따라서 sg mRNA의 다른 종류(sg mRNA 3-1)를 초래함이 밝혀졌다. 아미노산 45개를 코딩하는 능력을 지닌, ORF 3-1로 표시되는 작은 ORF는 sg mRNA 3-1의 5'말단에서 확인되었다.
재료 및 방법
바이러스 및 세포. 사용된 PRRSV 단리체(ISU 22, ISU 55, ISU 79, ISU 1894 및 ISU-1927)는 아이오와의 다른 농장으로부터 구입한 돼지의 폐로부터 단리하였다. 바이러스를 단리하고 생장(배양)시키는데 지속적인 세포 라인인 ATCC CRL 11171을 사용하였다. 3회의 플라크 정제에 의해 이러한 PRRSV 단리체를 생물학적으로 클로닝하고 CRL 11171 세포에서 생장시켰다. 이 연구에 사용된 모든 바이러스 단리체는 계대배양을 7회 한 것이었다.
ISU 22 및 ISU 79은 고도의 병원성이고 접종 10일 후 부검된 실험적으로-감염된 5주된 제왕절개수술하여 초유를 섭취하지 못한 돼지의 폐조직에서 50 % 내지80 %의 경화물을 생성한다. 대조적으로, ISU 55, ISU 1894 및 ISU 3927은 병원성이 낮고, 동일한 실험의 폐조직에서 10 % 내지 25 %의 경화물을 생성한다(미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호).
바이러스-특이적 세포내 총 RNA, 폴리(A) + RNA 및 비리온 RNA의 생산.
CRL 11171 세포의 전면 배양된 단층들을 7회 계대배양한 여러 PRRSV 단리체로 0.1의 감염다중도(m.o.i.)로 감염시켰다. PRRSV-특이적 세포내 총 RNA를 통상의 구아니디늄 이소티오시아네이트 방법(스트라타진)에 의해 PRRSV에 감염된 세포로부터 단리하였다. 폴리 (A)+RNA를 올리고(dT)-셀룰로스 컬럼 크로마토그래피(인비트로젠)에 의해 세포내 총 RNA로부터 증가되었다.
PRRSV 비리온 RNA를 단리하기 위해, 전면 배양된 CRL 11171 세포를 0.1의 감염다중도에서 PRRSV의 단리체 ISU 3927로 감염시켰다. 감염된 세포의 70 % 이상이 세포상해 효과를 나타낼 때, 배양물을 3회 동결 및 해동시켰고, 배양 배지를 4 ℃에서 20분 동안 1200 x g에서 정제하였다. 그 후에, 바이러스를 폴리에틸렌 글리콜로 침전시킨 다음, 미국 특허 출원 제08/131,625호에 개시된 바와 같이 염화세슘 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 정제된 바이러스를 37 ℃에서 90분 동안 최종 농도 20 μ/ml에서 RNase A로 처리하였다. 그 후에, 바이러스를 펠릿화하고 비리온 RNA를 통상의 구아니디늄 이소티오시아테이트 방법으로 단리하였다.
cDNA 합성 및 중합효소 연쇄 반응.상기 기재된 바와 같이, 임의 프라이머를 사용한 역전사에 의해 세포내 총 RNA로부터 cDNA를 합성하고 중합효소 연쇄 반응으로 증폭시켰다(RT-PCR)[멩(Meng) 등의 문헌[1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258)].
노던 블롯 분석.포름알데히드-아가로스 겔에서 레인마다 바이러스에 감염된 세포 및 위-감염된 세포로부터 세포내 총 RNA 10 ㎍을 사용하였다. 폴리 (A)+RNA 및 비리온 RNA를 분리하기 위해, 레인마다 비리온 RNA 15 ng 및 폴리(A)+RNA 0.2 ㎍을 로딩하였다. 이 RNA를 통상적인 방법에 따라 포름알데히드로 변성(denature)시켰다[샘브룩(Sambrook) 등의 문헌["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]]. RNA의 전기영동 분리, RNA 블롯팅 및 혼성화를 미국 특허 출원 제08/131,625호에 개시된 바와 같이 수행하였다. 일부 실험에서, 글리옥살-DMSO 아가로스 겔을 미국 특허 출원 제08/131,625호에 개시된 바와 같이 수행하였다.
프로브를 제조하기 위해, 각각의 ORF 1b 내지 7로부터의 특이적 cDNA 단편을 ORF-특이적 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 생성시켰다. 이러한 프라이머는 각 프라이머 쌍이 주어진 ORF에 특이적 단편만을 증폭시키고, 중첩되는 인접 ORF는 임의 주어진 cDNA 프로브내에 포함되지 않는 방식으로 설계되었다. ORF 1b 내지 7을 나타내는 cDNA 프로브를 생성시키는 프라이머 쌍은 ORF 1b의 경우 IM729/IM782이고, ORF 2의 경우 IM312/IM313이고, ORF 3의 경우 XM1022/IM258이고, ORF 4의 경우 XM1024/XMI023이고, ORF 5의 경우 PP287/PP286이고, ORF 6의 경우 PP289/XM780이고, ORF 7의 경우 PP285/PP284이다(표 4).
클로닝, 서열 분석 및 뉴클레오티드 서열 분석.PRRSV 단리체 VR 2385 서열을 토대로 PRRSV 단리체 ISU 79 및 ISU 1894의 ORF 2 내지 5의 전체 단백질 코딩 영역을 증폭시키는 RT-PCR의 프라이머를 설계하였다. 프라이머 JM259 및 JM260는 ORF 4 및 5를 증폭하는 경우 사용하였고, XM992 및 XM993는 ORF 2 및 3을 증폭하는 경우 사용하였다(표 4). 이 PCR 산물의 말단부에 유일한 제한 부위(EcoRI 및 BamHI)를 도입하였고, 이로써 카세트가 상기 ORF를 대체할 수 있게 되었다.
ISU 79 및 ISU 1984의 ORF 2 내지 3 및 ORF 4-5의 PCR 산물을 상기 기재된 바와 같이 EcoRI 및 BamHI로 각각 자른 다음, 정제하고 벡터 pSK+내로 클로닝하였다[멩(Meng) 등의 문헌[1993, J. V6t. Diagn. Invest., 5:254-258]]. 바이러스 주입체를 포함하는 플라스미드를 통상의 자동화 DNA 서열분석기(어플라이드 바이오시스템, 인크.)로 서열을 분석하였다. 각 바이러스 단리체의 ORF 2 내지 5의 전체 서열을 나타내는 3가지 이상의 cDNA 클론을 보편적인 역 프라이머, 및 다른 바이러스-특이적 프라이머로 서열을 분석하였다(XM969, XM970, XM1006, XMO78 및 XMO77, 표 4참조).
sg mRNA 3, 4 및 3-1의 리더-mRNA 연결 서열을 결정하기 위해, 프라이머 쌍 IM755 및 DP586 (표 4)를 상응하는 5'말단부 서열을 증폭하는 RT-PCR에 사용하였다. 생성된 PCR 산물을 정제하고 바이러스 특이적 프라이머 XMD77 및 XMI41(표 4)를 사용하는 직접적 PCR 서열분석에의해 서열을 분석하였다. 이 서열들을 모아서 맥벡터(인터내셔날 바이오테크놀로지, 인크.) 및 진웍스(인텔리제네틱스, 인크.)컴퓨터 소프트웨어 프로그램으로 분석하였다.
올리고뉴클레오티드.이 연구에 사용된 합성 올리고뉴클레오티드는 표 4에 요약되어 있다. 자동화 DNA 합성기(어플라이드 바이오시스템)를 사용하여 이러한 올리고뉴클레오티드를 단일쇄 DNA로 합성하고 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다.
결과
Sg mRNA는 PRRSV 비리온내로 패키징되지 않는다.PRRSV의 sg mRNA가 패키징되었는지를 결정하기 위해, PPMV 단리체 ISU 3927의 비리온을 CsCl 구배에 의해 정제하였다. 비리온을 펠릿화하고 RNA를 추출하기 전에, 정제된 비리온을 RNase A로 처리하여 비리온 표면에 부착되었을 수도 있는 임의 RNA 종류를 제거하였다. PRRSV-감염된 세포의 단리체 ISU 3927의 세포내 총 RNA와 함께 RNase A-처리된 비리온의 RNA를 포름알데히드 겔에서 분리하고 프라이머 PP284 및 PP285을 사용한 PCR에 의해 바이러스 게놈의 3'말단부 서열로부터 생성된 프로브와 혼성화하였다(미국 특허 출원 제08/131,625호, 표 4).
게놈 RNA만이 PRRSV 단리체 ISU 3927의 정제된 비리온에서 검출되었고(도 4), 노출 3주 후에도 정제된 비리온에서 검출가능한 양의 sg mRNA는 관찰되지 않았다. 대조적으로, 게놈 RNA 외에 7가지 종류의 sg mRNA가 ISU 3927에 감염된 세포에서 검출되었다(도 4). 마찬가지 결과가 두가지 다른 미국형 단리체인 ISU 55 및 ISU 79에서 관찰되었다.
독성이 다른 미국형 PRRSV 단리체사이의 sg mRNA의 수에서의 변화.미국형 PRRSV 및 유럽형 PRRSV을 비롯한 본 발명 이전에 알려진 모든 아테리바이러스는 7가지 sg mRNA를 합성하는 세가지 LDV 변형체(LDV-P, LDV-A 및 LDV-v)을 제외하면 6가지 sg mRNA를 생산하는 것으로 나타났다. 그러나, 6가지 sg mRNA의 네스티드 세트는 LDV-C 균주에서 생산된다.
미국형 PRRSV 단리체사이에 임의 변화가 있는지를 비교하기 위해, CRL 11171 세포의 전면 배양된 단층을 0.1의 감염다중도에서 독성이 다른 5가지 다른 미국형 PRRSV 단리체로 감염시켰다. 감염 24시간 후에, 세포내 총 RNA를 바이러스에 감염된 세포로부터 단리하였다. cDNA 단편을 프라이머 PP284 및 PP285을 사용한 PCR에 의해 바이러스 게놈의 맨끝 3'말단으로부터 생성하였다(표 4). 이 cDNA 단편을 임의 프라이머 연장 방법에 의해32P-dCTP로 표지하고, 세포내 총 RNA와 혼성화하였다(포름알데히드 겔에서 분리함).
RNA 분석 결과, 게놈 RNA 외에 6가지 이상 sg mRNA의 네스티드 세트를 독성이 다른 미국형 PRRSV의 5가지 단리체 중 하나로 감염시켰다(도 5). 세포내 총 RNA를 그리옥살-DMSO 아가로스 겔 상에 분리하였을 때, 마찬가지 결과가 얻어졌다. PRRSV 단리체 ISU 55, ISU 79 및 ISU 3927는 쉽게 구별되는 7가지 sg mRNA를 생산하였으나, 단리체 ISU 22 및 ISU 1894는 6가지 sg mRNA를 생산하였다(도 5). 미국형 PRRSV 단리체 VR 2385도 6가지 sg mRNA를 생산하였다(미국 특허 출원 제08/131,625호). sg mRNA의 다른 한 종류는 sg mRNA 3 및 4사이에 위치하였고,sg mRNA 3-1로 표시되었다. 차이가 있다면, 이 sg mRNA는 PRRSV의 5가지 단리체(도 5)사이에서 크기가 약간 달랐다. 그러나, 이러한 5가지 단리체에서 관찰된 폐독성 및 sg mRNA의 수 사이에 상호관련성은 없는 것으로 보인다.
Sg mRNA 3-1은 흠결 간섭성 RNA이며 프로브의 리보좀 RNA로의 비특이적 결합의 결과는 아니다.MEV가 높은 감염다중도로 조직 배양물내에서 단계적으로 계대배양되었을 때 코로나바이러스에서 크기가 다른 다양한 흠결 간섭성(DI RNA) RNA가 생성되는 것으로 나타났다. 또한, DI RNA는 무희석 계대배양 중에 토로바이러스에 감염된 세포에서 관찰되었다. 따라서, PRRSV의 mRNA 3-1이 DI RNA일 가능성을 조사하였다.
이러한 가능성을 배제하기 위해, PRRSV 단리체 ISU 79의 원래 바이러스 모주(stock)를 다른 종류의 sg mRNA 3-1을 생산하는 CRL 11171 세포에서 각각 0.1, 0.01 및 0.001의 다른 감염다중도에서 4회 계대배양하였다. 대조 실험에서, ISU 79의 원래 바이러스 모주를 희석하지 않고 계대배양을 4회 수행하였다. 4회 계대배양한 다음, 세포내 총 RNA를 바이러스에 감염된 세포로부터 단리하고, 바이러스 게놈의 3'말단 맨끝으로부터 생성된 동일한 프로브를 사용하여 노던 블롯 분석을 수행하였다.
sg mRNA 분석 결과, 다른 종류의 sg mRNA 3-1가 다른 감염다중도로 모든 RNA 시료에서뿐 아니라, 무희석 계대배양물의 RNA 시료에서 존재하는 것으로 나타났다(표 6A). 또한, 일반적으로 DI RNA의 경우에서와 같이, sg mRNA 3-1의 존재하에 다른 sg mRNA의 합성에서 간섭이나 감소는 없었다.
2번의 고 희석율 계대배양 후에, MHV의 DI RNA는 사라지는 것이 증명되었다. 따라서, ISU 79의 원래 바이러스 모주가 DI RNA에 포함된다면, 그 후에 DI RNA는 4번의 고 희석율 계대배양 후에 사라질 것이다. 상기의 실험적인 데이타는 sg mRNA 3-1의 복제가 DI RNA와는 달리 표준 바이러스의 양과는 무관함을 시사한다. 따라서, sg mRNA 3-1는 DI RNA가 아니다.
세포내 총 RNA의 노던 블롯 분석에서, 프로브는 세포질 총 RNA 시료내에 풍부한 18S 및 28S 리보좀 RNA에 비특이적으로 결합할 수 있다. 또는, 이 풍부한 리보좀 RNA는 겔에서 리보좀 RNA와 함께 움직일 수 있는 바이러스-특이적 sg mRNA의 지연을 일으킬 수 있다.
프로브의 리보좀 RNA로의 비특이적 결합으로 인한 두가지 다른 밴드를 LV에 감염된 세포 및 LDV에 감염된 세포에서 관찰하였다. 따라서, PRRSV의 sg mRNA 3-1는 프로브의 리보좀 RNA로의 비특이적 결합으로 인한 것일 가능성이 있다.
이러한 가능성을 배제하기 위해, 폴리아데닐화 RNA를 두가지 PRRSV 단리체인 ISU 55 및 ISU 79 각각으로 감염된 CRL 11171 세포의 세포내 총 RNA로부터 단리하였다. ISU 55 및 ISU 79 모두 다른 종류의 sg mRNA 3-1을 생산한다(도 5). 이 폴리아데닐화 RNA의 노던 블롯 분석 결과, 이러한 두가지 단리체 각각으로 감염된 세포에서 또한 다른 종류의 sg mRNA 3-1가 존재하는 것으로 나타났고(도 6B), 이는 sg mRNA 3-1은 프로브의 리보좀 RNA로의 비특이적 결합으로 인한 것은 아님을 나타낸다.
sg mRNA은 3'공통말단부 네스티드 세트를 나타내고, sg mRNA 3-1는 ORF 4의상류 서열로부터 유래함을 나타낸다. 바이러스 게놈의 3'말단 맨끝으로부터 cDNA 프로브를 사용하여 게놈 RNA 외에 6가지 sg mRNA를 VR 2385에 감염된 세포에서 검출하였다(미국 특허 출원 제08/131,625호). 따라서, 베르네 바이러스(Berne virus, BEV), LDV, EAV, 코로나바이러스 및 LV와 마찬가지로, 미국형 PRRSV의 복제도 sg mRNA의 3'공통말단부 네스티드 세트의 합성을 필요로 한다(미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호).
이러한 sg mRNA을 보다 상세히 분석하기 위해, ORF 1b 내지 7 각각에 특이적인 7가지 cDNA 단편을 PCR로 증폭하였다. PCR용 프라이머의 설계는 VR 2385의 서열을 토대로 한다. 이 프라이머, ORF lb의 경우 IM729 및 IM782, ORF 2의 경우 IM312 및 IM313, ORF 3의 경우 XM1022 및 IM258, ORF 4의 경우 XM1024 및 XM1023, ORF 5의 경우 PP286 및 PP287, ORF 6의 경우 PP289 및 XM780, ORF 7의 경우 PP284 및 PP285, 및 3'의 비코딩 영역(NCR)은 표 4에 나타나 있다. 이러한 프라이머는 각 프라이머의 세트가 특정 ORF의 단편만을 증폭시킬 것이고, 인접 ORF 사이의 중첩 서열은 임의 주어진 단편내에 포함되지 않는 식으로 설계되었다. 따라서, 이러한 7가지 DNA 단편의 각각은 단편 7을 제외하고는 ORF 7 및 3'-NCR 모두를 나타내는 특정 ORF 하나만을 나타낸다.
이러한 7가지 DNA 단편을32P-dCTP로 표지하고, 두가지 미국형 PRRSV 단리체인 ISU 1894 및 ISU 79 각각으로 감염된 세포로부터 추출된 세포내 총 RNA와 노던 블롯으로 혼성화하였다. 위-감염된 CRL 11171 세포의 세포내 총 RNA는 대조군으로써 포함되었다.
노던 블롯 분석결과, ORF 1b로부터 생성된 프로브 1은 오직 게놈 RNA과 혼성화되었다. 프로브 2 내지 7 각각은 게놈 RNA 외에도 1가지 이상의 다른 종류의 RNA와 혼성화되었다(도 7). 이 결과는 6가지(ISU 1894) 또는 그 이상의(ISU 79) sg mRNA의 3'-공통말단부 네스티드 세트가 PRRSV에 감염된 세포에서 형성되고(도 7A 및 7B), 가장 작은 3'-말단부 RNA(sg mRNA 7)는 ORF 7을 코딩한다. 미국형 PRRSV의 sg mRNA는 모두 게놈 RNA의 3'말단을 포함하나, 주어진 sg mRNA의 길이에 따라 게놈의 5'말단 쪽으로 여러 길이로 연장된다.
PRRSV 단리체 ISU 79의 sg mRNA 3-1은 프로브 4 내지 7과 혼성화되나, 프로브 1, 2 및 3과는 혼성화되지 않으며(도 7B), 이는 이러한 mRNA 3-1가 ORF 4 내지 7뿐 아니라 3'-NCR도 포함함을 시사한다. 따라서, sg mRNA 3-1은 ORF 4의 상류 서열로부터 생성된다.
단일 염기 치환은 다른 종류의 sg mRNA 3-1의 획득을 초래한다.노던 블롯 혼성화 데이타는 sg mRNA 3-1가 ORF 4의 상류 서열로부터 유래함을 보여준다(도 7B). sg mRNA 3-1의 정확한 위치 및 리더-mRNA 연결 서열을 결정하기 위해, 프라이머 한 세트인 IM755 및 DP586을 설계하였다(표 4). 정방향 프라이머 IM755는 VR 2385의 리더 서열의 3'말단을 토대로 한 것이고, 역방향 프라이머 DP586는 ORF 4에 위치하고 있다(표 4).
ISU 1894 또는 ISU 79 각각으로 감염된 세포로부터 단리된 세포내 총 RNA를 사용하여 프라이머 IM755 및 DP586로 RT-PCR을 수행하였다. ISU 79는 sg mRNA 3-1을 생산하나, ISU 1894는 이를 생산하지 않는다(도 5). 30초 늘어난 PCR 시간을 적용하여 sg mRNA 3, 4 및 3-1의 5'말단부 서열을 나타내는 짧은 단편을 선택적으로 증폭하였다.
RT-PCR 산물 분석 결과, 약 1.1 kb 및 0.45 kb 크기를 지닌 두가지 단편이 ISU 1894 바이러스에 감염된 세포의 총 RNA로부터 증폭되는 것으로 나타났다(도 8A). 이러한 두가지 단편은 sg mRNA 3 및 4의 5'부분을 각각 나타낸다. ISU 1894 단리체에서 관찰되는 두가지 단편 외에, sg mRNA 3-1의 5'부분을 나타내는 약 0.6 kb의 제3의 단편도 ISU 79에 감염된 세포의 총 RNA로부터 증폭되었다(도 8A).
sg mRNA 3, 4 및 3-1의 리더-mRNA 연결 서열을 결정하기 위해, 진클린 킷트(바이오 101, 인크.)를 사용하여 ISU 79 및 ISU 1894의 RT-PCR 산물을 아가로스 겔로부터 정제하고, 자동화 DNA 서열분석기(어플라이드 바이오시스템)로 직접 서열을 분석하였다. ISU 79 및 ISU 1894(도 9)의 게놈 서열을 토대로, RT-PCR 산물의 5'말단의 서열을 분석하는데 사용된 프라이머(XM141 및 XMO77, 표 4)를 설계하였다. 이러한 두가지 단리체의 sg mRNA 및 게놈 RNA의 5'말단의 서열(도 8B)을 비교하여 두가지 미국형 PRRSV 단리체의 sg mRNA 3, 4 및 3-1의 리더-mRNA 연결 서열(여기서, 리더는 sg mRNA의 합성 동안 mRNA 본체와 결합함)을 결정하였다.
ISU 1894 및 ISU 79의 sg mRNA 3 및 4의 리더-mRNA 연결 서열은 동일하였다. sg mRNA 3의 경우, 리더-연결 서열(GUAACC)은 ORF 3의 상류의 뉴클레오티드 89개에 위치한다. sg mRNA 4의 경우, UUCACC는 ORF 4의 상류의 뉴클레오티드 10개에 위치한다(도 8B 및 도 9). ISU 79 sg mRNA 3-1의 리더-mRNA 연결 서열은 ORF 4 상류의236번째 뉴클레오티드에 위치한 UUGACC이다(도 8B 및 9).
ISU 79 및 ISU 1894의 게놈 서열의 서열 배열은 ISU 1894에서 T 내지 ISU 79에서 C의 단일 염기 치환이 ISU 79에서 다른 리더-mRNA 연결 서열인 UUGACC(도 8B 및 9)의 획득을 초래함을 보여준다. 따라서, 다른 종류의 sg mRNA(3-1)가 형성된다(도 5). sg mRNA 4 범위내에 포함된 ORF 4 내지 7외에, sg mRNA 3-1은 5'말단에서 아미노산 45개의 코딩 능력을 지닌 다른 작은 ORF(ORF 3-1)(도 9)를 포함한다. 이러한 작은 ORF는 ORF 4의 개시 코돈 앞의 첫번째 뉴클레오티드에서 종결된다.
두가지 미국형 단리체의 ORF 2 내지 7의 서열 분석 결과, 리더-mRNA 연결 서열의 이질성이 밝혀졌다.ISU 79 및 ISU 1894의 ORF 2 내지 5를 클로닝하고 서열을 분석하였다(상기 실험 I 참조). ISU 79는 쉽게 구별되는 7가지 sg mRNA을 생산하였으나, ISU 1894는 구별되는 6가지 sg mRNA를 생산하였다(도 5 및 도 7). 각 바이러스 단리체의 경우, 정방향 및 역방향 프라이머뿐 아니라 바이러스-특이적 프라이머 XM969, XM970, XM1006, XMO78 및 XMO77을 사용하여(표 4) ORF 2 내지 5의 임의 주어진 영역에서 3가지 이상의 cDNA 클론의 서열을 분석하였다. ISU 1894 및 ISU 79의 ORF 6 및 7의 서열은 미국 특허 출원 제08/301,435호에 개시되어 있다.
서열 분석 결과, ISU 79 및 ISU 1894의 ORF 2 내지 7은 ORF 4 및 ORF 5사이의 뉴클레오티드 10개의 코딩되지 않는 영역 외에는 서로 중첩하는 것으로 나타났다. VR 2385의 경우에도 동일한 관찰 결과가 나타났다(미국 특허 출원 제08/301,435호). LV를 비롯해 제안된 아테리바이러스과의 모든 요소는 중첩 ORF를 포함하기 때문에 이 결과는 매우 특이적인 것이다. 그러나, 코로나바이러스의ORF는 유전자사이의 코딩되지 않는 서열에 의해 이격된다. 따라서, 미국형 PRRSV는 ORF 4 및 5의 연결 영역의 게놈 조직의 면에서 코로나바이러스에 다소 유사한 것으로 보인다.
ISU 1894의 ORF 2는 ISU 79의 ORF 2보다 아미노산 1개가 더 길었다(도 9). ORF 2의 종결 코돈인 TAG는 ISU 1894에서 TGG로 변했고 그 다음에 ISU 1894의 새로운 종결 코돈(TGA)이 위치했다(도 9). ISU 79 및 ISU 1894의 다른 ORF의 크기는 동일하였다(도 9). 이러한 단리체의 ORF 2 내지 7에서 결실 또는 삽입은 없었다. 그러나, 다수의 치환이 ISU 79 및 ISU 1894사이의 ORF 2 내지 7의 전체 서열을 통해 나타났다(도 9).
결정 및 예상된 리더-mRNA 연결 서열의 수 및 위치는 ISU 1894 및 ISU 79사이에서 변했다(도 9). 정해진 리더-mRNA 4 연결 서열인, ORF 4로부터 뉴클레오티드 10개 상류의 TTCACC외에, ISU 79의 ORF 4로부터 뉴클레오티드 236개 상류에 위치한 다른 리더-mRNA 3-1 연결 서열(TTGACC)이 있었다(도 9). sg mRNA 4 및 3-1의 리더-mRNA 연결 서열은 뉴클레오티드 226개에 의해 이격되었고, 이는 노던 블롯 분석(도 5) 및 RT-PCR 증폭(도 8A)에서 관찰된 sg mRNA 4 및 3-1의 예상된 크기와 관련이 있었다.
리더-mRNA 3 연결 서열은 ORF 3 상류의 뉴클레오티드 89개에 위치한 GTAACC로 ISU 1894 및 ISU 79사이에서 동일하였다. ISU 1894 및 ISU 79 sg mRNA 2 및 6의 예상된 리더-mRNA 연결 서열도 동일하였다(도 9).
그러나, ISU 1894 및 ISU 79의 예상된 리더-mRNA 5 연결 서열은 상이했다(도9). ISU 79의 경우, 잠재적인 3가지 리더-mRNA 5 연결 서열이 있었다(ORF 5 상류의 뉴클레오티드 55, 75 및 105개에 각각 위치한 GCAACC, GAGACC및 TCGACC임). 잠재적인 두가지 리더-mRNA 5 연결 서열도 ISU 1894에서 발견되었다(ORF 5 상류의 70 및 105번째 뉴클레오티드에 각각 위치한 GAAACC 및 TCGACC임)(도 9). 이러한 차이는 3가지 단리체의 예상된 리더-mRNA 5 연결 서열에서 2개의 뉴클레오티드 치환으로 인한 것이었다(도 9).
ORF 7 상류의 뉴클레오티드 15개에 위치한 리더-mRNA 7 연결 서열 외에, 이러한 2가지 단리체 각각의 ORF 7 상류의 뉴클레오티드 129개에 위치한 다른 리더-mRNA 7 연결 서열(ATAACC)이 발견되었다(도 9). 그러나, 이러한 다른 리더-mRNA 7 연결 서열에 상응하는 sg mRNA는 노던 블롯에서 넓게 확산된 밴드를 생성하는 풍부한 sg mRNA 7과 분명하게 구별되지는 않는다(도 5, 6 및 7).
또한, LV의 리더-mRNA 연결 서열과 두가지 미국형 단리체인 ISU 1894 및 ISU 79의 연결 서열을 비교함으로써, 이 실험에서 분석된 LV 및 두가지 미국형 단리체 사이의 리더-mRNA 연결 서열의 수 및 위치의 변화가 발견되었다. 합쳐서 생각하면, 이러한 데이타는 PRRSV의 sg mRNA가 다형성이고, sg mRNA의 수 및 정확한 크기는 분석된 특정 PRRSV 단리체에 따라 좌우된다. 그러나, 6가지 sg mRNA의 네스티드 세트는 표준 아테리바이러스 게놈 조직 및 전사를 반영할 가능성이 높다.
a. 본 출원 및 미국 특허 출원 제08/131,625호 및 제08/301,435호에 나타난 서열 데이타를 토대로 올리고뉴클레오티드를 설계하였다.
b. (-) 게놈 RNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드는 (-) 극성을 가진다.
<실시예 3>
세포 라인 ATCC CRL 11171을 사용하여 PRRSV 단리체를 증식시켰다. 세포 라인의 유지 및 바이러스의 단리는 상기 기재된 바와 같았다[멩(Meng) 등의 문헌[J. Gen. Virol. 75:1795-1801 (1994), 멩(Meng) 등의 문헌[J. of Veterinary Diagnostic Investigation 8:374-381 (1996)]]. 형질세포종 세포 라인 SP2/0을 MAb 시료에서 세포 융합에 사용하였다. PRRSV ATCC VR 2385를 PRRSV 특이적 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 스크리닝하는데 항원으로 사용하였다.
간접적 면역형광 분석(IFA).ATCC CRL 11171 세포의 단층을 0.1의 감염다중도에서 PRRSV VR 2385로 접종하고 48시간 동안 인큐베이션하고 메탄올로 고정하였다. 하이브리도마 상등액을 37 ℃에서 30분 동안 고정된-세포 단층 상에 인큐베이션하였다. 플루오레스세인-표지된 염소 항-마우스 IgG (H+L) 복합체를 사용하여 특이적 반응을 검출하였다. 한 PRRSV N (ORF 7 산물) 특이적 모노클로날 항체인 PP7eFl1을 (+) 대조군으로 사용하였고 비-PRRSV 특이적 MAb로부터 세포 배양물 상등액인 PPAc8를 (-) 대조군으로 사용하였다.
MAb 시료.PRRSV ORF 4 및 5의 재조합 바쿨로바이러스에 감염된 곤충 세포의 전체 세포 용해물을 면역원으로 사용하여 마우스를 면역시켰다. PRRSV ORF 4 및 5를 포함하는 재조합 바쿨로바이러스의 작제를 상기 기재된 전략으로 수행하였다[브레암(Bream) 등의 문헌[J. Virol. 67:2665-2663 (1993)]]. 요컨대, PRRSV ORF 4 및 5 유전자를 BamHI 및 EcoRI 제한 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 pPSP.PRRSV2-7 플라스미드의 주형으로부터 분리하여 PCR 증폭시켰다[모로초프(Morozov) 등의 문헌[Archives of Virology 140:1313-1319 (1995)]]. 이렇게 증폭된 단편을 상기 지시된 제한 효소로 자르고 벡터 PVLI393(인비트로젠)내에 라이게이션하였다. 삽입된 유전자는 폴리헤드린 유전자 프로모터의 조절하에 있었고[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌[Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, paces 107-234, 2" Edition, New York: W.H. Freeman and Company (1992)]], 제한 효소 절단 및 PCR 증폭으로 확인하였다. 그후에, 재조합 벡터 DNA 및 선형화된 오토그라파 캘리포니아 다핵 폴리헤드로시스 바이러스 DNA(linearized Autographa Califomia multinuclear polyhedrosis virus DNA)(인비트로젠)을 지시 안내서에 기재된 바와 같이 Sf9 세포내에 공동 형질감염시켰다. 재조합 바쿨로바이러스에서 삽입된 유전자를 혼성화 및 PCR 증폭으로 확인하였다[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌(1992)]. 재조합 바이러스를 사용하여 곤충 세포를 접종시켰고, 세포 용해물을 사용하여 마우스를 면역화하였다. 2주 간격으로 복강내 주사를 3 내지 5회 하여 면역화를 수행하였다. 비장세포를 앞서 개시된 바와 같이 SP2/0 골수종 세포와 혼성화하였다[브라운(Brown) 및 링(Ling)의 문헌["Murine Moncolonal Antibodies,' In Antibodies: a practical approach, pp. 81-104, Edited by Catty D. Zoxford, Washing, D.C. IRL Press (1988)]]. PRRSV 특이적 항체를 분비하는 하이브리도마를 스크리닝하여 IFA로 PRRSV ATCC VR 2385와의 반응성을 검출하였다. (+) 하이브리도마를 선택하여 3회 클로닝하였다. 4가지 MAb를 GP4 및 단백질에 대한 6가지 Mab로 개발하였다. Mab는 단일항원(MonoAb) ID 킷트(지메드 래버러토리즈 인크, Zymed Laboratories Inc)와 동일한 말이다.
효소-결합 면역흡착법(ELISA).ELISA는 널리 알려져있다[할로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 문헌[Antibodies: A laboratory manual, pp. 471-612, Cold Spring Harbor Laboratory New York (1988)], 아우수벨(Ausubel) 등의 문헌[Short protocols in molecular biology, pp. 11.5-11.7, 2 nd Edition, New York, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992)]]. 코팅 항원을 1 % 트리톤(Triton) X-100을 사용하여 PRRSV VR 2385에 감염된 세포로부터 추출하였다.ELISA에서 MAb와 플레이트에 결합한 항원과의 결합 활성을 시험하였다. 정상 세포의 추출물, 및 비-PRRSV 특이적 MAb인 PPAc8의 세포 배양 배지를 (-) 항원 및 (+) 항체 대조군으로 각각 포함시켰다. PRRSV N-특이적 MAb인 PP7eFl1를 (+) 대조군으로 사용하였다. 염소 항-마우스 IgG (H + L) 페록시다제 복합체로 검출하자 기질인 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)(ABTS)와의 특이적 반응이 나타났다. 그 후에, 광학 밀도를 405 nm(A450)에서 측정하였다.
고정화-세포 ELISA를 앞서 보고된 바와 같이 수행하여[반 뉴브스타드트(van Nieuwstadt) 등의 문헌[J. Virol. 70:4767-4772 (1991)] MAb와 PRRSV 분야 단리체와의 반응성을 시험하였다. 요컨대, ATCC CRL 11171 세포의 단층을 0.001의 감염다중도에서 PRRSV 분야 단리체로 접종시키고 48시간 동안 인큐베이션하고 메탄올로 고정하였다. 그 후에, 세포를 실온에서 1시간 동안 1 % BSA로 차단하였다. MAb의 세포 배양물 상등액을 2배 연속하여 희석하고 고정화-세포 플레이트에 첨가하였다. PP7eFl1 및 PPAc8을 (+) 및 (-) 대조군으로 각각 사용하였다. 특이적 반응을 상기 기재된 바와 같이 검출하였다.
면역블롯팅.웨스턴 면역블롯 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다[할로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 문헌[Antibodies. A laboratory manual, pp. 471-612, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)]]. 단백질 샘플을 겔에서 분리하기 전에 다른 조건하에 처리하였다. 상태를 변성시키기 위해, 샘플을 100 ℃에서 3분 동안 2 % SDS 및 5 % 2-머캡토에탄올을 포함하는 래믈리(Laemmli) 샘플완충액 중에 처리하고 SDS-PAGE에서 진행시켰다. 비-변성 조건 하에서는, 샘플을 40 ℃에서 20분 동안 1 % 트리톤 X-100을 포함하는 샘플 완충액 중에 처리하고 PAGE에서 진행시켰다. 그 후에, 분리된 단백질을 전기영동에 의해 니트로셀룰로스 막으로 전달하였다. 이 니트로셀룰로스 막을 3 % BSA로 차단하였다. 다중-스크리닝 기기를 사용하여 막에서 MAb와 항원과의 반응성을 스크리닝하였다. 돼지 항-PRRSV 혈청을 (+) 대조군으로 사용하고 PPAc8로부터의 세포 배양물 상등액을 (-) 대조군으로 사용하였다. 결합된 항체를 염소 항-마우스 IgG+IgA+IgM 페록시다제 복합체 또는 염소 항-돼지 IgG 페록시다제 복합체와 인큐베이션하여 검출한 다음, 4-클로로-l-나프톨 기질로 발색시켰다.
바이러스 중화(VN) 시험.MAb의 바이러스 중화 활성을 상기 기재된 바를 다소 변형하여 시험하였다[메캄(Mecham) 등의 문헌[Viral Immunol. 3:161-170 (1990)] 및 화이트(White) 등의 문헌[J. Gen. Virol. 71:4767-4772 (1990)]]. 하이브리도마 상등액을 30 내지 70 플라크 형성 단위를 포함하는 같은 부피의 PRRSV 희석물과 혼합하고, 이를 10 % 기니 피그 보체를 포함하는 DMEM으로 희석하였다. 이 바이러스 항체 혼합물을 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, ATCC CRL 11171 세포로 옮기고 6-웰 플레이트 중에 37 ℃에서 1시간 더 인큐베이션하였다. 그 후에, 아가로스-배지 혼합물을 단층으로 덮었다. 인큐베이션 3일 후에 37 ℃에서, 단층을 아가로스에서 0. 05 % 중성 레드로 염색하였다. 돼지 항-PRRSV 혈청을 (+) 대조군으로 사용항고 비-PRRSV 특이적 MAb로부터의 하이브리도마 세포 배양 배지를 (-) 대조군으로 포함시켰다.
IFA로 확인된 PRRSV 특이적 Mab.PRRSV VR 2385에 감염된 ATCC CRL 11171 세포 상에서 IFA로 하이브리도마를 스크리닝하였다. IFA (+) 하이브리도마를 선택, 증폭 및 클로닝하였다. PRRSV E 단백질에 대해 6가지 MAb 및 GP4에 대해 4가지 MAb를 개발하였다. 이들 모두 강도에서 약간 차이가 있는 강렬한 핵주위 형광을 나타냈고, 이는 PRRSV N 단백질 특이적 MAb의 세포질 염색과는 달랐다(도 10). 이 결과는 올리고사카라이드의 당단백질로의 전달이 일반적으로 특정 구획, 예를 들어 세포체 및 골지체에서 진행되기 때문에, GP4 및 E 당단백질이 PRRSV에 감염된 세포의 세포내 구획에서 합성되고 축적됨을 나타냈다[프페퍼(Pfeffer) 등의 문헌[Ann. Rev. Biochem. 56:829-852 (1987)]]. GP4 및 E는 막결합 당단백질로 예상되었다[멩(Meng) 등의 문헌(1994) 및 모로초프(Morozov) 등의 문헌[Archives of Virology 140:1313-1319 (1995)]]. 대조적으로, PRRSV N 단백질은 고도로 염기성 및 친수성이고, PRRSV에 감염된 세포의 세포질에서 합성되고, 이를 N-특이적 MAb 염색을 사용한 IFA에서 형광의 세포질 분포를 관찰하여 나타냈다. 모든 MAb를 서브타입 IgM으로 확인하였다.
ELISA에서 PRRSV 항원과의 반응성.세정제 처리에 대한 에피톱의 감응성을 결정하기 위해, ELISA를 수행하여 MAb와 1 % 트리톤 X-100 추출된 PRRSV 항원과의 반응성을 시험하였다. E 단백질에 대한 MAb 중에서, PP5bH4만이 PRRSV 항원에 대한 강렬한 반응성을 나타냈다(도 11). 나머지 E-특이적 MAb 및 PRRSV 항원사이에 분명한 반응은 검출되지 않았다. GP4에 대한 MAb중에서, PP4bB3만이 PPRSV 항원과의 약한 반응을 나타냈다. GP4에 대한 다른 3가지 MAb는 임의 반응성을 나타내지않았다. (-) 대조군은 ELISA에서 반응성을 나타내지 않았다.
10가지 MAb로부터, PP5bH4 및 PP4bB3만이 세정제 추출된 PRRSV 항원을 사용한 ELISA에서 반응성을 나타냈다. 이 결과는 PP5bH4에 의해 인식된 에피톱이 트리톤 X-100 처리에 저항하고 PP4bB3의 에피톱은 세정제에 부분적으로 저항함을 나타낸다. 다른 8가지 MAb에 의해 인식된 에피톱은 이러한 처리에 민감하며, 구조적으로 의존할 수 있다. 트리톤 X-100은 일반적으로 그의 비변성 특성때문에 선택되며 세엔벨로프을 파열시키나[도이취어(Deutscheir)의 문헌["Guide to protein purification," Methods in Enzymology, Vol. 182, San diego, CA, Academic Press, Inc. (1990)]], 이 시험에서는 MAb 결합에 의해 모니터링된 바와 같이, PRRSV 단백질의 에피톱이 추출 과정 동안 다소 변형된다.
면역블롯팅 분석.웨스턴-블롯팅을 수행하여 MAb와 PRRSV 항원과의 반응성을 결정하고 MAb는 형태적으로 의존성의 에피톱이 아니라는 고찰을 확인하였다. SDS-PAGE에서 변성된 상태 하에, PP5bH4만이 돼지 항-PRRSV 혈청으로 검출된 추정의 E와 일치하는 26 kDa 위치의 정제된 PRRSV 비리온의 밴드를 인식하였다 (도 12). 그 후에, 비-변성된 PAGE로 면역블롯팅을 수행하여 이 에피톱이 비변성 상태 하에 보존되었는지를 시험하였다. E에 대한 6가지 MAb 중에서, PP5bH4만이 PRRSV 항원과의 반응성을 나타냈다. GP4에 대한 MAb중에서, 어떤 것도 이 시험의 각 조건 하에 정제된 비리온 또는 감염된 세포내에 PRRSV 항원을 인식하지 못했다(결과는 나타내지 않음).
PP5bH4를 제외한 MAb는 면역블롯에서 PRRSV 항원을 인식하지 못했고, 이는이러한 MAb에 의해 인식된 에피톱이 지속적인 구조로부터 유래하지 않음을 나타냈다. MAb PP5bH4는 26 kDa의 위치에서 PRRSV와 반응했고, 이는 E의 분자 질량에 대한 보고를 확고히 하였다[뮬렌베르크(Meulenberg) 등의 문헌[Virology 192:62-72 (1995)]]. 이러한 결과는 다른 9가지 MAb에 의해 인식된 에피톱이 세정제 처리에 민감하고 ELISA의 결과와 일치함을 보여주었다. 또한, 이러한 결과는 에피톱이 형태적으로 의존성임을 나타냈다. PP4bB3는 웨스턴-블롯에서 PRRSV 항원과의 임의 반응을 나타내지 않았고, 이는 PAGE 및 전달하는 동안 에피톱 상실 및 변형으로 인한 것일 수 있었다.
바이러스 중화 활성.플라크-감소 분석을 수행하여 E 및 GP4 단백질에 대한 MAb중에 바이러스 중화 활성이 있는지를 시험하였다. 1가지 E-특이적 MAb인 PP5dB4만이 VR 2385 단리체에 대해 동일한 중화 활성을 나타냈다. 다른 모든 MAb는 이러한 단리체에 대한 어떤 중화 활성도 나타내지 않았다. (+) 대조군인 돼지 항-PRRSV 혈청도 바이러스 중화 활성을 나타냈다.
GP4 및 E에 대한 10가지 MAb중에서, 적어도 PP5dB4는 PRRSV VR 2385에 대해 동일한 바이러스 중화 활성을 나타냈다. PP5dB4는 ELISA 및 웨스턴-블롯에서 PRRSV 항원을 인식하지 못하기 때문에 중화 에피톱은 형태적으로 의존적이다. 또한, PP5dB4의 중화 활성은 적어도 에피톱의 일부가 비리온 표면 상에 위치하고 MAb에 의해 접근가능함을 나타낸다. PP5dB4의 중화 활성 메카니즘은 분명하지 않다. 이는 세포내로 바이러스의 결합 또는 침입의 차단으로 인한 것이다.
다른 PRRSV 단리체와의 반응성.PRRSV계 단리체를 증식시켜 고정화-세포ELISA에서 MAb의 교차-반응성을 시험하고 다른 PRRSV 단리체의 에피톱 존재를 결정하였다(표 5). 이러한 MAb의 대부분은 형태적으로 의존성인 에피톱을 인식하며 이러한 에피톱은 고정화 세포에서 보존될 수 있기 때문에 고정화-세포 ELISA를 사용하였다. 모든 MAb는 모든 단리체와 반응하나 다른 역가와도 반응한다. 이 결과는 MAb에 의해 인식되는 에피톱이 시험된 단리체 중에서 보존되었음을 나타낸다. 그러나, 시험된 단리체 사이에는 항원성 차이가 있었다. 반응 강도를 임의로 역가가 256과 같거나 그 이상이면 높은 것으로, 역가가 64 내지 128이면 중간으로, 역가가 32와 같거나 그 이하이면 낮은 것으로 정의하였다. 시험된 23가지 단리체 중에서, PRRSV VR 2385만이 10가지 MAb 중에 7가지가 높은 반응성을 가졌다. 5가지 단리체는 10가지 MAb 중에서 6가지 이상에서 낮은 반응성을 가졌고, 12가지 단리체는 10가지 MAb 중에서 6가지 이상에서 중간 정도의 반응성을 가졌고, 다른 5가지 단리체는 MAb의 절반 정도에서 낮은 반응성을 가졌다. MAb PP4dG6 및 PP5bH4는 다른 MAb 이외의 단리체와 더 낮은 반응성을 나타냈다. PP4bB3는 GP4 및 E 단백질에 대한 모든 MAb 중에서 가장 강렬한 반응성을 나타냈다. 역가 차이는 다른 단리체의 한 MAb, 예를 들어 PRRSV RP 10 및 RP 12, 16 및 1024와 각각 반응하는 MAb인 PP4cB11의 역가 반응의 64배 만큼 높았다. 반면, MAb와 한 단리체와의 역가 차이는 예를 들어 PRRSV RP11, 1024 및 8와 반응하는 MAb PP4bB3 및 PP4bC5의 역가 보다 각각 128배 만큼 높았다. 이 결과는 다른 MAb에 의해 인식되는 에피톱은 상이함을 나타냈다. (+) MAb 대조군은 ISU-51을 제외하면 모든 단리체와 강한 반응성을 나타냈다. MAb와 PRRSV 단리체와의 반응성 차이는 VR 2385, ISU22, ISU55 및RP45의 아미노산 서열 일치가 ORF 4에서는 94 내지 98 %였고, ORF 5에서는 88 내지 97 %였다는 보고와 일치하였다[멩(Meng) 등의 문헌[J. Gen. Virol. 140:745-755 (1995)]].
요컨대, PRRSV E 단백질에 대한 6가지 MAb 및 GP4에 대한 4가지 MAb를 개발하였다. PP5bH4를 제외하고는 이들 모두 ELISA 및 면역블롯팅에 의해 결정된 바와 같이 형태적으로 의존성인 에피톱에 대한 것이었다. MAb PP5dB4는 VR 2385에 대한 바이러스 중화 활성을 나타냈다. MAb와 PRRSV계 단리체와의 반응성 패턴은 PRRSV GP4 및 E에서 항원성 차이가 있음을 나타냈고, 이는 PRRSV N 및 ORF 3 산물에 대한 MAb에 관한 기존의 보고를 확고히 하였다[넬슨(Nelson) 등의 문헌[J. Clinical Microbiology 31:3184-3189 (1993)], 드류(Drew) 등의 문헌[J. General Virol. 76:1361-1369 (1995)], 비크조렉-크로머(Wieczorek-Krohmer) 등의 문헌[Veterinary Microbiology 51:257-266 (1996)]].
<실시예 4>
세포 및 바이러스. ATCC CRL1 1171 세포를 사용하여 PRRSV를 증식시키고 상기 기재된 바와 같이 PRRSV 정제를 수행하였다[멩(Meng) 등의 문헌[J. Gen. Virol., 75:1795-1801 (1994)], 멩(Meng) 등의 문헌[J. Vet. Diag. Invest. 8:374-381 (1996)], 할버(Halbur) 등의 문헌[Vet. Pathol. 32:648-660, (1995)]]. PRRSV 단리체 ATCC VR 2385[멩(Meng) 등의 문헌(1994) 및 모로초프(Morozov) 등의 문헌(1995)]를 사용하여 ORF 2 내지 4 유전자를 PCR 증폭시켰다.
스포돕테라 프루지퍼다(Spodoptera frugiperda) 클론 9(Sf9) 및 하이파이브(등록상표, 인비트로젠) 곤충 세포를 바쿨로바이러스의 증식을 위해 배양하였다. 바쿨로바이러스 균주인 오토그라파 캘리포니아 다핵 폴리헤드로시스 바이러스(ACMNPV)를 재조합 바이러스 작제에 있어 모 바이러스로 사용하였다.
ACMNPV 재조합 전달 벡터의 작제.PRRSV ORF 2, 3 및 4를 포함하는 바쿨로바이러스 전달 벡터의 작제를 각각 상기 기재된 바와 같은 전략으로 수행하였다[브레암(Bream) 등의 문헌[J. Virol. 67:2655-2663(1993)]]. 요컨대, PRRSV ORF 2 내지 4 유전자를 ORF 2 및 3의 유전자의 경우 BamHI 및 PstI의 제한 부위, ORF 4의 경우 BamHl 및 EcoRl의 제한 부위를 포함하는 프라이머로 pPSP.PRRSV2-7 플라스미드의 주형으로부터 분리하여 PCR 증폭시켰다.
ORF 2에 관한 정방향 프라이머는
5'GCACGGATCCGAATTAACATGAAATGGGGT3' 였고, 역방향 프라이머는
5'CCACCTGCAGATTCACCGTGAGTTCGAAAG3'였다. ORF 3에 관한 정방향 프라이머는
5'CGTCGGATCCTCCTACAATGGCTAATAGCT3'였고 역방향 프라이머는
5'CGCGCTGCAGTGTCCCTATCGACGTGCGGC3'였다. ORF 4에 관한 정방향 프라이머는
5'GTATGGATCCGCAATTGGTTTCACCTATAA 3'였고 역방향 프라이머는
5'ATAGGAATTCAACAAGACGGCACGATACAC3'였다. 이렇게 증폭된 단편을 상기 기재된 바와 같이 제한 효소로 자르고 ORF 2 및 3 단편의 경우 벡터 pFastBACI(GIBCO BRL)내로, ORF 4 단편의 경우 벡터 PVL1393(인비트로젠)내로 라이게이션하였다. 삽입된 유전자는 폴리헤드린 유전자 프로모터의 조절 하에 있었고[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌[Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman &Co., NY (1992)]], 제한효소 절단 및 PCR 증폭으로 확인하였다. 그 후에, ORF 2 내지 4 유전자를 따로 포함하는 재조합 벡터를 단리하고 ORF 2 전달 벡터의 경우 pPSP.Ac-p2로 표시하고, ORF 3의 경우 pPSP.Ac-p3로 표시하고 ORF 4 전달 벡터의 경우 pPSP.Ac-p4로 표시하였다. pPSP.Ac-p2 및 pPSP.Ac-p3의 경우, 그들의 DNA를 단리하고 바크미드(Bacmid)라 불리는 바쿨로바이러스의 전체 게놈을 포함하는 컴피턴트 DH1OBAC 대장균 세포(GIBCO BRL)내에 형질감염시켰다.
재조합 바이러스의 형질감염 및 선택.ORF 2 및 3의 경우, 재조합 바이러스를 BAC-TO-BAC(등록상표) 발현계를 사용하여 생성시켰다(GIBCO BRL). 단리된 재조합 바크미드 DNA를 Sf9 곤충 세포내로 형질감염시킨 다음, 세포 배양 배지를 바이러스 모주로 수득하였다. ORF 4의 경우, 재조합 바이러스 작제물인 pPSP.Ac-p4 DNA 및 선형화된 AcMNPV DNA(인비트로젠)를 지시 안내서에 기재된 바와 같이 Sf9 세포내로 공동 형질감염시켰다. 오클루젼 바디(occlusion body)-(-)플라크 정제를 3회한 다음 추정의 재조합 바쿨로바이러스를 선택하였다. 재조합 바이러스내에 삽입된 유전자를 혼성화 및 PCR 증폭으로 확인하였다[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌 (1992)]]. 재조합 바쿨로바이러스의 3가지 균주 각각에 대해 4가지 재조합체를 선택하였다. 돼지 항-PRRSV 혈청으로의 간접적인 면역형광 분석은 각 균주의 4가지 재조합체가 유사한 수준으로 단백질을 발현시킴을 보여주었다. 추가 연구를 위해 각 균주에 대해 한가지를 선택하여 ORF 2의 재조합 바이러스의 경우 vAc-P2로, ORF 3의 재조합 바이러스의 경우 vAc-P3로, ORF 4의 재조합 바이러스의 경우 vAc-P4로 표시하였다.
간접 면역형광 분석(IFA). IFA는 널리 알려져 있다[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌(1992)]. 요컨대, 하이파이브(등록상표) 세포의 단층을 야생형(wt) AcMNPV 또는 vAc-P2, vAc-P3 및 vAc-P4의 재조합 바이러스로 각각 0.1의 감염다중도에서 감염시키고 72시간 동안 인큐베이션하였다. 돼지 항-PRRSV 혈청을 사용하여 곤충 세포에서 발현되는 특이적 단백질을 검출하였다. 총 발현 단백질을 고정된 감염 세포에서 검출하고 염색하여 형광 현미경으로 관찰하였다. 세포 표면 발현을 4 ℃에서 1시간 동안 돼지 항-PRRSV 혈청과 인큐베이션한 비고정 및 불투과 세포로 검출하고, 4 ℃에서 1시간 동안 플루오레스세인-표지 염소 항-돼지 IgG 복합체로 염색한 다음, 형광 현미경으로 관찰하였다.
면역블롯팅.웨스턴 면역블롯팅을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다[할로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]]. 재조합 바이러스 또는 wt ACMNPV에 감염된 곤충 세포의 세포 추출물을 상기 분석에 사용하였다. 이 단백질을 전기영동에 의해 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 막에 전달하였다. 막을 돼지 항-PRRSV 혈청과 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 염소 항-돼지 IgG 페록시다제 복합체로 특이적 반응을 검출한 다음 4-클로로-l-나프톨 기질로 발색시켰다.
투니카마이신 처리.하이파이브(등록상표) 세포를 vAc-P2, vAc-P3, vAc-P4 또는 wt ACMNPV에 감염시키고 감염 0 내지 72시간 동안 세포-배양 배지에서 투니카마이신 5 ㎍/ml과 인큐베이션하였다. 비-처리 곤충 세포를 동시에 대조군으로 감염시켰다. SDS-PAGE로 및 면역블롯팅으로 세포 용해물을수획하였다[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌(1992)].
재조합 단백질의 면역원성.vAc-P2, vAc-P3 및 vAc-P4에 감염된 곤충 세포의 세포 용해물을 사용하여 토끼에서 재조합 단백질의 면역원성을 시험하였다. 이러한 각각의 재조합 단백질을 12주된 토끼 두마리에 근육내 및 피하적으로 주사하였다. 두번째 예방주사하고 10일 후에 채혈하였다. 항체를 간접 ELISA로 시험하였다[아우수벨(Ausubel) 등의 문헌[Short Protocols in Molecular Biology, pp. 11.5-11.7, 2nd Edition, N.Y. Green Publishing Associates and John Wiley and Sons (1992)]]. 정제된 PRRSV 비리온을 초음파처리하고 사용하여 96-웰 플레이트를 코팅하였고, 염소 항-PRRSV 항체를 사용하여 토끼 혈청 샘플에서 항-PRRSV 항체를 검출하였다. 미리 면역된 토끼 혈청을 (-) 대조군으로 사용하였다. 기질인 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)(ABTS)을 사용하여 특이적 반응을 나타냈다.
결과
재조합 바이러스의 작제 및 확인.세부 작제 전략은 "방법"에서 언급된다. ORF 2 및 3의 경우, 재조합 바쿨로바이러스를 재조합 바크미드를 포함하는 대장균으로부터 선택한 다음, Sf9 곤충 세포의 형질감염으로부터 수획하였다. 또한, 이 재조합 바이러스를 DNA 혼성화 및 PCR 증폭으로 확인하였다. ORF 2 내지 4의 PRRSV 유전자 유래의 특이적 프로브로 세포를 감염시키는 DNA 혼성화 및 PCR 증폭 모두 이 재조합 바쿨로바이러스가 클로닝된 정확한 유전자를 가짐을 나타냈다(데이타는 나타내지 않음).
재조합 바이러스 vAc-P2, vAc-P3 및 vAc-P-4의 표면 면역 형광.돼지 항-PRRSV 혈청을 사용한 IFA에 의해 총 단백질 발현을 조사하기 위해, 하이 파이브(등록상표) 세포를 vAc-P2, vAc-P3, vAc-P4, 또는 wt AcMNPV로 감염시키고, 72시간 동안 인큐베이션하고, 메탄올로 고정시켰다. 비고정 및 비투과성 곤충 세포를 4 ℃에서 염색하여 IFA에 의해 세포 표면 면역형광을 검출하였다. vAc-P2에 감염된 세포에서 약한 세포질 형광이 있었고, vAc-P3 또는 vAc-P4에 감염된 세포에서 강한 면역 형광이 있었고, wt AcMNPV에 감염된 세포에서 특이적 형광은 없었다(도 17). 4 ℃에서 고정화 및 투과화 없이 염색된 vAc-P2, vAc-P3 및 vAc-P4에 감염된 세포에서 뚜렷한 세포 표면 면역형광은 나타나지 않았다(도 15). 세포 표면 염색은 wt AcMNPV에 감염된 곤충 세포에서 검출되지 않았다. 또한, 항체의 부재 하에 재조합 바이러스에 감염딘 곤충 세포는 임의 형광을 나타내지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
발현된 재조합 단백질의 분석.하이 파이브(등록상표) 세포의 단층을 0.1의 감염다중도에서 vAc-P2, vAc-P3, vAc-P4 또는 wt AcMNPV로 감염시키고 72시간 동안 인큐베이션하였다. 전체 세포 추출물로 곤충 세포에서 재조합 단백질의 발현을 분석하였다. 총 단백질 샘플을 SDS-PAGE 상에서 전기영동하고, 웨스턴 블롯에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 돼지 항-PRRSV 혈청으로 검출하였다(도 19A). 정제된 PRRS 비리온을 첨가하고 동일한 겔에서 분석하였다. 곤충 세포에서 발현된 ORF 2 산물을 MI에서 27 및 29 kDa 밴드로 검출하였다. ORF 3 산물을 22, 25, 27내지 31 및 35-43 kDa 다중-밴드 종류로 검출하였다. 27 내지 31 및 35 내지 43 kDa의 Mr 신호는 1개의 밴드로 구별하기 어려웠고, 차별적 글리코실화 및 부분적 단백질가수분해로 인한 것일 수 있다. ORF 4 산물은 15, 18, 22, 24, 28 및 30 kDa 다중-밴드 종류인 것으로 나타났다. 이러한 특이적 밴드는 wt AcMNPV에 감염된 곤충 세포에서는 검출되지 않았다. 정제된 PRRSV 샘플에서는 적어도 4개의 밴드(K에서 15, 19, 27 내지 31 및 45 kDa)가 있었다. 정제된 PRRS 비리온에서 검출된 특이적 밴드는 정상의 세포 대조군에서는 관찰되지 않았다(도 19A).
재조합 단백질은 클리코실화되었다.재조합 바쿨로바이러스 또는 wt AcMNPV에 감염된 곤충 세포의 투니카마이신 처리를 수행하여 투니카마이신이 N-연결 글리코실화를 억제할 때 재조합 단백질이 N-글리코실화되는지를 시험하였다. 처리 후에, ORF 2 재조합 단백질의 29 kDa 밴드는 사라졌고, 25 kDa 밴드가 나타났으며, 27 kDa 단백질종은 변하지 않았다(도 20A). ORF 3 재조합 단백질의 경우, 27 내지 31 및 35 내지 43 kDa의 단백질종은 사라졌고, 22 내지 27 kDa 밴드는 변하지 않았다. ORF 3 재조합 단백질의 27 kDa 단백질종은 투니카마이신 처리 후에 두꺼워졌다. N-글리코실화 억제 후에, ORF 4 재조합 단백질은 15 및 18 kDa 단백질종에서만 나타났고, 22 내지 30 kDa의 밴드는 사라졌다. 15 및 18 kDa 밴드는 투니카마이신 처리 후에 더 가늘어지고 어두워졌다. wt AcMNPV에 감염된 곤충 세포의 추출물에서는 어떤 신호도 검출되지 않았다.
재조합 단백질의 면역원성.토끼를 vAc-P2, vAc-P3 및 vAc-P4에 감염된 곤충 세포 용해물로 면역화하여 ORF 2 내지 4 산물의 재조합 단백질의 면역원성을 시험하였다. 토끼 혈청 샘플에서 항-PRRSV 항체의 존재를 ELISA에 의해 검출하였다. 면역화된 토끼의 평균 역가는 vAc-P2, vAc-P3 및 vAc-P4 세포 용해물 군의 경우 각각 192, 128 및 382였다(표 6).
토의
PRRSV의 ORF 2 내지 4의 유전자를 BEVS내에 클로닝하고 재조합 단백질을 곤충 세포에서 발현시켰다. 재조합 바쿨로바이러스의 선택 과정이 Sf9 세포 상에 오클루젼 바디-(-)플라크를 선택하는 대신 대장균에서 수행되었을 때 ORF 2 및 3의 클로닝 전략은 ORF 4의 전략보다 훨씬 빨랐다. 바쿨로바이러스 증식에 Sf9 세포를 사용하였고, 하이 파이브(등록상표) 세포의 단백질 수율이 Sf9 세포의 단백질 수율보다 더 높은 것으로 고려되었기 때문에, 단배질 발현에는 하이 파이브(등록상표) 세포를 사용하였다[비캄(Wickham) 등의 문헌[Biotechnology Progress 8:391-396 (1992)], 데이비스(Davis) 등의 문헌[In Vitro Cell and Developmental Biology 29A: 388-390 (1993)]]. 하이 파이브(등록상표) 세포를 장래의 단백질 정제에 이로운 혈청 없는 배지에 적응시켰고, 대규모 산업 생산에 적합한 현탁 배양물에 적응시킬 수 있다.
재조합 단백질을 IFA에 의해 나타내 vAc-P2, vAc-P3 및 vAc-P4 재조합 바이러스에 감염된 곤충 세포에서 발현시켰다. vAc-P2에 감염된 세포에서는 약한 세포질 형광이 있었고, vAc-P3 및 vAcP4에 감염된 세포에서는 강한 세포질 형광이 있었다. vAc-P2에 감염된 세포에서 약한 형광에 대한 이유는 알려져 있지 않으며 메탄올로의 고정 후에, 에피톱의 변화로 인한 것일 수 있다. 비고정 및 비투과 곤충 세포를 4 ℃에서 염색하여 돼지 항-PRRSV 항체가 단지 세포 표면 단백질과 반응하고 세포질로 진입하지 않음을 확인하였다. vAc-P2, vAc-P3 또는 vAc-P4에 감염된 곤충 세포에서 뚜렷한 세포 표면 면역 형광이 있었고, 이는 재조합 단백질이 효율적으로 프로세싱되고 세포 표면으로 운반됨을 나타낸다. 이러한 결과는 ORF 2 내지 4 산물이 막결합 단백질임을 나타내고, 이는 서열 연구의 예상과 일치한다[모로초프(Morozov) 등의 문헌[Archives of Virology 140:1313-1319 (1995)]]. 그러나, 이러한 산물도 PRRSV에 감염된 포유류 세포의 세포 표면으로 운반되는지 또는 표면 단백질로써 비리온으로 조립되는지는 분명하지 않다. 최근의 연구 결과, ORF 3 및 4 산물은 바이러스 구조 단백질임이 밝혀졌다[반 뉴브스타드트(VAN Nieuwstadt) 등의 문헌[J. Virot. 70:4767-4772 (1996)]]. 이러한 단백질의 운명을 조사하기 위해서는 추가실험을 해야한다.
면역블롯팅 결과, 재조합 단백질이 곤충 세포에서 효율적으로 발현되는 것으로 나타났다. ORF 2 산물은 M의 27 및 29 kDa 단백질종인 것으로 검출되었다. 투니카마이신 처리는 29 kDa 밴드를 제거하였고 27 kDa는 변하지 않은채 25 kDa 단백질종을 도입하였으며, 이는 29 kDa가 N-글리코실화되었음을 나타냈다. PRRSV VR 2385 ORF 2의 예상된 M은 두군데 잠재적인 글리코실화 부위를 지닌 29.5 kDa였다[모로초프(Morozov) 등의 문헌(1995)]. 37 내지 38 신호 서열[뮬렌베라(Meulenbera) 등의 문헌[Virology 192:62-72 (1995)]]이 성숙한 단백질에서 제거된다면, 25 kDa 단백질종은 핵단백질일 수 있다. 글리코실 잔기가 약2 내지 3 kDa의 K를 가지기 때문에, 29 및 25 kDa 밴드 사이의 4 kDa 차이는 탄수화물 구조로인한 것일 수 있다[트림블(Trimble) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 250:2562-2567 (1983)]]. 27 kDa 단백질종은 투니카마이신 처리에 감응성이 없으며 0-연결 글리코실화 또는 다른 전사후 변형에 의해 변형될 수 있다.
곤충 세포의 ORF 3 산물은 면역 블롯팅에 의해 검출되는 23 내지 43 kDa 다중-밴드 단백질종인 것으로 나타났다. 28 내지 43 kDa 단백질종을 vAc-P3에 감염된 곤충 세포를 투니카마이신 처리하여 제거하였고, 이는 그들이 N-연결 당단백질이라는 것과 다중-밴드는 차별적 글리코실화로 인한 것임을 나타냈다. PRRSV VR 2385 ORF 3 산물의 예상된 Mr는 7군데의 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위를 지닌 28.7 kDa(LV의 대응물보다 약 2 kDa 적음)이다[모로초프(Morozov) 등의 문헌(1995)]. ORF 3 재조합 단백질의 27 kDa 단백질종은 그가 정제된 PRRSV 비리온을 엔도글리코시다제 F 처리한 다음 투니카 마이신 처리후 풍부해지고(도 20A) 27 kDa 밴드가 나타나고 45 kDa 밴드가 사라졌기 때문에 코어 단백질일 수 있다(데이타는 나타내지 않음). 27 kDa보다 더 작은 단백질종은 잘려진 단백질 또는 단백질가수분해 산물일 수 있다. 비처리 샘플에서 27-43 kDa 밴드는 각 밴드로 구별하기 어렵고, 이는 오버로딩 또는 부분적 단백질가수분해로 인한 것일 수 있다. 7 N-연결 글리코실화 부위가 있고 약 2 내지 3 kDa의 각 글리코실 잔기를 계수해보면, 43 kDa 단백질종은 완전히 글리코실화된 산물일 수 있다[트림블(Trimble) 등의 문헌 (1983)]. 최근의 보고는 LV의 ORF 3이 45 내지 50 kDa 구조 단백질을 코딩하고 곤충 세포 ORF 3의 재조합 단백질은 방사성 면역 침전에 의해 M에서 28 내지 44 kDa로 검출되었음을 나타냈다[반 뉴브스타드트(VAN Nieuwstadt) 등의 문헌 (1996)]]. 28 kDa 단백질종은 LV ORF 3 산물의 코어 단백질인 것으로 밝혀졌다. 미국형 PRRSV 및 LV의 ORF 3 유래의 재조합 단백질의 Mr에는 차이가 있는 것으로 보이며, 이는 사용된 다른 발현계 또는 두가지 단리체 사이의 이러한 유전자에서의 차이로 인한 것일 수 있다. 다른 보고는 바쿨로바이러스에서 발현되는 LV ORF 3의 카르복실말단부의 아미노산 199개의 재조합 융합 단백질이 N-글리코실화되지 않음을 나타냈고[캇쯔(Katz) 등의 문헌[Vet. Microbiol. 44:65-76 (1995)]], 이는 동일한 유전자의 발현 산물의 다양성을 증명한다.
곤충 세포에서 ORF 4 산물은 15 내지 30 kDa 다중-밴드 단백질종인 것으로 검출되었다. 투니카마이신 처리 후에, 22 내지 30 kDa 밴드는 제거되었고 15, 18 kDa 밴드는 변하지 않았으며, 이는 22 내지 30 kDa 단백질종이 다양한 정도로 N 글리코실화됨을 나타냈다. PRRSV VR 2385의 ORF 4는 4군데 잠재적인 N 글리코실화 부위를 지닌 19.5 kDa 단백질을 코딩하는 것으로 생각된다[모로초프(Morozov) 등의 문헌 (1995)]. ORF 4 산물의 15 kDa 단백질종은 코어 단백질일 수 있고 18 kDa 밴드는 코어 단백질 + 0-연결 글리코실 잔기 또는 다른 변형일 수 있다. LV ORF 4는 31 내지 35 kDa 구조 단백질을 코딩하며 곤충 세포에서 발현되는 ORF 4의 재조합 단백질은 17 kDa 코어 단백질을 지닌 20 내지 29 kDa 단백질종으로 검출되는 것으로 보고되었다[반 뉴브스타드트(VAN Nieuwstadt) 등의 문헌 (1996)]. 또한, Mr의차이에 관한 이유는 클로닝된 유전자의 차이 및 다른 발현계로 인한 것일 수 있다. 다른 보고는 ORF 4가 잘 보존된 영역이 아님을 밝힘으로써 이러한 차이를 증명하였다[광(Kwang) 등의 문헌[J. Vet. Diag. Invest. 6:293-296 (1994)]].
재조합 단백질로의 토끼의 면역화는 그들이 항-PRRSV 항체를 유도함을 보여주었다. 이러한 결과는 이 재조합 단백질이 PRRSV에 감염된 포유류 세포의 대응물처럼 유사한 면역원성을 가질 수 있음을 나타낸다.
상기 연구는 PRRSV VR 2385의 ORF 2 내지 4가 BEVS에서 발현되었고 곤충 세포의 세포질 및 세포 표면 모두에서 검출되었음을 보여주었다. ORF 2 내지 4의 재조합 단백질은 차별적 글리코실화된 N-연결 당단백질이었다. 정제된 PRRSV 비리온은 동시에 분석되었고 면역블롯팅에서 밴드 4개를 나타냈다. 그러나, 올리고클로날 또는 모노클로날 항체의 부족으로 인해, 임의 ORF 2 내지 4 산물이 정제된 비리온에서 검출되는지를 말하기는 어렵다. 돼지 항-PRRSV 혈청과 재조합 단백질과의반응은 이러한 SV 항체 단백질의 본래의 대응물이 본래 숙주의 면역 반응을 유도했는지를 나타냈다. 토끼에서 항-PRR의 유도는 이러한 재조합 단백질이 PRRSV에 감염된 본래 숙주의 본래 ORF 2 내지 4와 같이 유사한 면역원성을 가졌음을 나타냈다.
<실시예 5>
세포 및 바이러스.ATCC CRLI 1171 세포를 사용하여 PRRSV를 증폭시켰다[멩(Meng) 등의 문헌(1994) 및 문헌(1996), 할버(Halbur) 등의 문헌(1995)]. 스포돕테라 프루지퍼다 클론 9(Sf9) 및 하이 파이브(등록상표, 인비트로젠) 곤충 세포를 사용하여 바쿨로바이러스를 증폭시켰다. PRRSV 단리체 VR 2385[멩(Meng) 등의 문헌(1994) 및 (1996)]를 사용하여 유전자를 증폭시켰고 BEVS내에 클로닝하였다. PRRSV 비리온을 상기 기재된 바와 같이 정제하였다[멩(Meng) 등의 문헌 (1994)]. 바쿨로바이러스 균주 오토그라프 캘리포니아 다핵 폴리헤드로시스 바이러스(ACMNPV)를 재조합 바이러스 작제의 모 바이러스로 사용하였다.
ACMNPV 재조합 전달 벡터의 작제.PRRSV VR 2385의 ORF 5 내지 7의 핵산 서열은 기존에 기재된 바와 같다[멩(Meng) 등의 문헌(1994)]. 기존에 개시된 전략으로 PRRSV ORF 5 내지 7을 따로 포함하는 바쿨로바이러스 전달 벡터의 작제를 수행하였다[브레암(Bream) 등의 문헌(1993)]. 요컨대, BamHI 및 EcoRI의 제한 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 PRRSV ORF 5 내지 7 유전자를 주형 pPSP.PRRSV2-7 플라스미드로부터 따로 PCR 증폭시켰다.
ORF5의 정방향 프라이머는
5'TGCCAGGATCCGTGTTTAAATATGTTGGGG3' 였고 역방향 프라이머는
5'CGTGGAATTCATAGAAAACGCCAAGAGCAC3'였다. ORF 6의 정방향 프라이머는
5'GGGGATCCAGAGTTTCAGCGG3'였고 역방향 프라이머는
5'GGGAATTCTGGCACAGCTGATTGAC3'였다. ORF 7의 정방향 프라이머는
5,GGGGATCCTTGTTAAATATGCC3'였고 역방향 프라이머는
5'GGGAATTCACCACGCATTC3'였다. 이렇게 증폭된 단편을 BamHl 및 EcoRl로 자르고, 단리하고 또한 정확한 방향결정을 보장하기 위해 BamHI 및 EcoRI으로 자른 벡터 PVL1393(인비트로젠)내에 라이게이션하였다. 삽입된 유전자는 폴리헤드린 유전자 프로모터의 조절하에 있었고[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌 (1992)], 제한효소 절단 및 PCR 증폭으로 확인하였다. 이러한 ORF 5 내지 7을 포함하는 재조합 벡터, 즉 ORF5 의 경우 pPSP.Ac-E, ORF 6의 경우 pPSP.Ac-M 및 ORF 7 전달 벡터의 경우 pPSP-Acp N을 따로 단리하였다.
재조합바이러스의 형질감염 및 선택.Sf9 곤충 세포를 제작자의 지시에 따라 선형화 ACMNPV DNA(인비트로젠), 및 pPSP.Ac-E, pPSP.Ac-M 및 pPSP.Ac-N의 재조합 플라스미드 DNA와 각각 공동형질감염시켰다. 오클루젼-(-)플라크를 3회 정제한 다음, 추정의 재조합 바이러스를 선택하였다. 재조합 바이러스내에 삽입된 유전자를 혼성화 및 PCR 증폭으로 확인하였다[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌 (1992)]. 4가지 재조합체가 재조합 바이러스의 3가지 균주 각각에 대해 선택되었고 돼지 항-PRRSV 혈청을 사용한 면역형광 분석에서 비슷한 것으로 나타났다. 한 재조합 바이러스를 각 균주로부터 임의로 선택하였고, ORF 5를 포함하는 재조합 바이러스의 경우 vAc-El, ORF 6을 포함하는 경우 vAc-M 1, ORF 7을 포함하는 경우 vAc-N 1로 표시하였다.
면역블롯팅.기존에 개시된 바와 같이 웨스턴 면역블롯팅을 수행하였다[할로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 문헌(1988)]. 감염된 곤충 세포의 전체 단백질, 정제된 PRRSV 또는 정상 세포를 샘플로 사용하였다. 단백질을 전기영동에 의해 SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이 니트로셀룰로스 막을 3 % BSA로 차단하고 실온에서 1시간 동안 돼지 항-PRRSV 혈청과 반응시켰다. 결합된 항체를 염소 항-돼지 IgG 페록시다제 복합체와 인큐베이션하여 검출한 다음, 4-클로로-l-나프톨 기질로 발색시켰다.
투니카마이신 처리.감염된 하이 파이브(등록상표) 세포를 세포-배양 배지에서 감염 후 0 내지 72시간 동안 투니카마이신 5 ㎕/ml와 인큐베이션하고 SDS-PAGE로 수획하였다[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌(1992)].
글리코시다제로 절단.제작자의 지시에 따라 재조합 단백질 또는 정제된 PRRSV의 경우에 엔도글리코시다제 F/N-글리코시다제 F 혼합물(PNGase F) 및 엔도글리코시다제 H(베링거-만하임 바이오케미칼스)를 사용하여 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포의 용해물을 처리하였다(0. 1 PFU/세포, 감염 후 72 시간). 요컨대, 세포 105개를 세정 완충액 30 ㎍으로 용균시켰다. 그 후에, 세포 용해물 10 ㎍을 PNGase F, 엔도글리코시다제 H로 자르거나 또는 처리하지 않고 유지시켜 비-처리 대조군으로 사용하였다. SDS-PAGE 분석에 앞서, 샘플을 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
방사성면역침전(RIP).하이 파이브(등록상표) 세포를 재조합 바쿨로바이러스 또는 야생형(wt) AcMNPV로 감염시키고 감염되지 않은 하이 파이브(등록상표) 세포를 메티오닌-결핍 배지로 1회 세척하고 감염 48시간 후에 1시간 동안 영양을 공급하지 않았다. 그 후에, 메티오닌-결핍 배지 중 트랜스35S-표지(메티오닌 및 시스테인)(아머샴 라이프 사이언스 인크., Amersham Life Science Inc.) 50 ci/ml을 감염된 세포에 첨가하였다. 3시간 후에, 이 세포를 PBS로 세정하고 RIPA 세정 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA; 150 mM NaCl; 1 % NP40; 1 % 소듐 데옥시콜레이트; 0.1 % SDS)내에 가미하였다. 면역침강 및 겔 전기영동을 기존에 개시된 바와 같이 수행하였다[허친슨(Hutchinson) 등의 문헌[J. Virol. 66:2240-2250 (1992)].
간접 면역형광 분석(IFA).IFA를 기존에 개시된 바와 같이 수행하였다[오레일리(O'Reilly) 등의 문헌(1992)]. 하이 파이브(등록상표) 세포의 단층을 wt AcMNPV 또는 재조합 바쿨로바이러스로 접종시키고 72시간 동안 인큐베이션하고 고정시켜 모든 재조합 단백질 발현을 돼지 항-PRRSV 혈청으로 검출하였다. 또한, 접종된 곤충 세포의 표면 단백질의 존재를 조사하였다. 비고정 및 비투과 세포를 4℃에서 1시간 동안 돼지 항혈청으로 반응시키고 4 ℃에서 1시간 더 플루오레스세인-표지 염소 항-돼지 IgG 복합체와 인큐베이션한 다음, 형광 현미경으로 관찰하였다.
재조합 단백질의 면역원성.12주된 토끼에 vAc-El, vAcMI 및 vAc-NI에 감염된 곤충 세포의 용해물을 근육내 및 피하적으로 주사하였다. 두마리 토끼를 E, M 및 N 재조합 단백질로 면역화하였다. 두번째 예방 주사 2번을 3주 간격으로 주사하였다. 주사 투여량은 곤충 세포 2 x 106마리의 세포 용해물이었다. 두번째 예방 주사한 다음 10일째 채혈하였다. 항체를 간접 ELISA로 시험하였다. 정제된 PRRSV 비리온을 초음파처리 및 사용하여 96-웰 플레이트를 코팅하였고, 염소 항-토끼 IgG 페록시다제 복합체를 사용하여 토끼 혈청 샘플의 항-PRRSV 항체를 검출하였다. 면역전 토끼 혈청을 (-) 대조군으로 사용하였다. 기질인 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)(ABTS)을 사용하여 특이적 반응을 나타냈다.
결과
재조합 바쿨로바이러스에서 PRRSV 유전자 존재의 확인.
혼성화 및 PCR 증폭을 수행하여 재조합 바쿨로바이러스내에 클로닝된 유전자의 존재를 확인하였다. PRRSV 유전자 유래 프로브와 재조합 바쿨로바이러스와의 혼성화는 PRRSV 유전자가 재조합 바쿨로바이러스내에 존재함을 나타냈다. PRRSV 유전자 유래 특이적 프라이머로의 PCR 증폭은 재조합 바이러스의 밴드 1개를 나타냈고, wt AcMNPV의 밴드는 나타나지 않았다(결과는 나타내지 않음). 이 시험으로 재조합 바쿨로바이러스가 PRRSV 유전자 ORF 5 내지 7을 포함함을 확인하였다.재조합 바이러스 vAc-El 및 vAc-MI의 표면 면역 형광, 그러나 vAcNl은 아님.vAc-El, vAc-Ml, vAc-Nl 및 wt AcMNPV에 감염된 하이 파이브(등록상표) 세포의 발현된 총 단백질 및 세포 표면 발현을 조사하였다. vAc-El 및 vAc-Ml에 감염된 세포에서 약한 세포질 형광이 나타났다. 대조적으로, vAc-NI-에 감염된 세포에서는 강렬한 세포질 형광이 나타났고 wt AcMNPV에 감염된 세포에서는 형광이 나타나지 않았다(도 18). 뚜렷한 세포 표면 면역형광이 vAc-El 및 vAc-Ml에 감염된 곤충 세포에서 검출되었다(도 16). 그러나, vAc-NI 또는 wt AcMNPV에 감염된 세포에서는 표면 면역형광이 없었다. 또한, 항체의 부재하에 재조합 바이러스에 감염된 곤충 세포는 임의 형광을 나타내지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
곤충 세포에서 발현된 ORF 5 내지 7 산물의 분석.곤충 세포에서 예상된 단백질의 발현을 분석하기 위해, 하이 파이브(등록상표) 세포의 단층을 합하여 0.1 PFU/세포의 감염다중도에서 vAc-E 1, vAc-M 1 및 vAc-N 1로 각각 감염시키고 72시간 동안 인큐베이셔하였다. 총 단백질 샘플을 SDS-PAGE에서 전기영동하고 돼지 항-PRRSV 혈청을 사용하는 웨스턴-블롯팅으로 분석하였다(도 19A). 곤충 세포에서 발현되는 재조합 단백질 E를 16,18, 20, 24, 및 26 kDa의 여러 단백질종의 밴드로 검출하였다. 곤충 세포에서 발현된 E는 정제된 PRRSV에서 원래의 E인 26 kDa 단백질종에 비해 더 많은 다양성을 나타냈고 K는 더 적은 다양성을 나타냈다(도 19A). 곤충 세포에서 발현된 M는 19 kDa 밴드로 검출되었고, 이는 정제된 PRRSV에서 본래의 M과 상응한다. 곤충 세포에서 발현된 N은 15 kDa 밴드로 검출되었고, 이는 또한 정제된 PRRSV에서 본래의 N에 상응한다. 이러한 특이적 밴드는 정상 곤충 세포 및 wt AcMNPV에 감염된 것들에서는 검출되지 않았다(결과는 나타내지 않음). 정제된 PRRS 비리온을 같은 겔에서 분석하였다. 적어도 5가지 밴드 15, 19, 24, 26 내지 30 및 45 kDa가 있었다. 정제된 PRRS 비리온내에 검출된 특이적 밴드는 정상 포유류 세포 대조군에서는 관찰되지 않았다.
바쿨로바이러스 발현 E, M 및 N의 글리코실화 분석.곤충 세포에서 발현된 E, M 및 N이 N-글리코실화를 수행하는지를 결정하기 위해, 재조합 바쿨로바이러스에 감염된 곤충 세포를 투니카마이신으로 처리하여 N-연결 글리코실화를 억제하였다. 투니카마이신을 처리한 다음, 20 내지 26 kDa 단백질종은 vAc-El에 감염된 세포에서는 검출되지 않았으나(도 20B), 16 및 18 kDa 밴드는 더 두꺼워졌다. vAc-Ml 및 vAc-N1에 감염된 세포에서, 투니카마이신 처리 후에 M 및 N 단백질의 Mr에서의 변화는 검출되지 않았다(도 20B).
재조합 단백질의 면역원성.토끼를 vAc-El, vAc-Ml 및 vAc-NI에 감염된 곤충 세포의 용해물로 면역화하여 재조합 단백질 E, M 및 N의 면역원성을 시험하였다. 그 후에, ELISA를 수행하여 토끼 혈청 샘플에서 항-PRRSV의 존재를 시험하였다. 토끼를 면역화하는 E, M 및 N의 평균 역가는 각각 384, 320 및 2,056였다(표 7).
토의
PRRSV의 유전자 E, M 및 N를 포함하는 재조합 바쿨로바이러스를 작제하여 곤충 세포에서 E, M 및 N을 발현시켰다. Sf9 세포를 사용하여 바쿨로바이러스를 증식시켰고, 하이 파이브(등록상표) 세포의 단백질 수율이 Sf9 세포의 단배질 수율보다 더 높다고 생각되었기 때문에 하이 파이브(등록상표) 세포를 사용하여 단백질을 발현시켰다[바캄(Wickham) 등의 문헌(1992) 및 데이비스(Davis) 등의 문헌(1993)].
면역형광 분석 결과, E, M 및 N은 이들 유전자를 포함하는 재조합 바이러스에 감염된 곤충 세포에서 발현되는 것으로 나타났고, E 및 M은 곤충 세포의 세포 표면으로 운반되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 곤충세포에서 발현되는 E 및 M이 막결합 단백질이고 전사후 변형에서 효율적으로 프로세싱되는 것으로 나타낸다. 곤충 세포에서 낮은 세포질 면역형광 강도의 이유는 분명하지 않다. 이는 감염된 곤충 세포의 고정화 후에 에피톱 상실 또는 변형으로인한 것일 수 있다. vAcNI에 감염된 곤충 세포에서, 강렬한 세포질 면역형광만이 관찰되었고 표면 형광은 검출되지 않았다. 이러한 결과는 바쿨로바이러스 발현 N이 세포 표면으로 운반되는 것이 아니라 세포질에 위치함을 나타냈다. 이러한 특징은 서열 연구로부터 예상된 바와 같이 매우 친수성인 뉴클레오캡시드 단백질로서의 그의 특성과 일치한다[멩(Meng) 등의 문헌 (1994)].
재조합 E 단백질은 면역블롯팅에서 여러 밴드를 나타냈고, 26 kDa보다 더 적은 Mr을 지닌 밴드는 정제된 PRRSV에서는 나타나지 않았다. 곤충 세포에서 발현된 E는 정제된 PRRSV에서 본래의 E인 26 kDa 단백질종에 비해 더 많은 다양성을 나타냈고 K에 비해 더적은 다양성을 나타냈다(도 19). 이러한 여러 밴드는 전사후 변형 동안에 곤충 세포에서의 차별적 글리코실화로 인한 것이다. 투니카마이신 처리는 20 내지 26 kDa 밴드를 제거하였고 16 kDa 밴드의 강도를 증가시켰다. 처리 후 18 kDa 밴드의 존재는 O-연결 글리코실화, 인산화 또는 다른 전사후 변형으로 인한 것일 수 있었다. 20 내지 26 밴드는 감염된 세포에서 차별적 N-글리코실화된 종류의 E를 나타낸다. 16 kDa 밴드는 비-글리코실화된 리더-결핍 코어 단백질일 수 있다. 재조합 단백질 E의 PNGase F 및 엔도클리코시다제 H 처리에 대한 예비 연구 결과, 그가 복합한 글리코실화를 수행하는 것으로 나타났다. 투니카마이신, 및 PNGase F및 엔도글리코시다제 H 처리가 모두 19 및 15 kDa 밴드의 이동성을 바꾸지 않았기 때문에 이러한 재조합 M 및 N은 N-연결 글리코실화를 수행하지 않은 것이었다. 이러한 결과는 20 내지 26 kDa의 재조합단백질 E가 N-글리코실화되고, 곤충 세포에서 발현되는 재조합 M 및 N 단백질은 N-글리코실화되지 않음을 나타낸다. 투니카마이신 처리 후에 이동성의 변화는 서열 연구로부터 결정된 바와 같이 E 폴리펩티드에서 두군데 N-연결 글리코실화 부위의 존재와 일치하였다[멩(Meng) 등의 문헌 (1994)]. 그러나, 서열 연구는 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위가 M 및 N 폴리펩티드에 각각 2군데 및 1군데가 있음을 나타냈다. 바쿨로바이러스 발현 M 및 N에서, N-연결 글리코실화는 검출되지 않았다. 본래 대응물에 비해, 곤충 세포의 재조합 단백질의 밴드는 면역블롯에서 관찰되는 바와 같이 훨씬 더 두꺼웠다(재조합 단백질의 로딩 양은 도 19의 PRRSV 레인에서 약 1 %였다). 그러나, 올리고클로날 또는 모노클로날 항체 없이 이러한 차이를 측정하기는 어렵다.
정제된 PRRSV의 경우, 적어도 5가지 밴드 15, 19, 24, 26 내지 30 및 45 kDa가 있다. 이러한 결과는 PRRSV 비리온내에 3가지 이상의 구조 단백질이 있다는 기존의 보고와 일치한다[콘젤만(Conzelmann) 등의 문헌[Virology 193:329-339 (1993)], 넬슨(Nelson) 등의 문헌[J. Clin. Microbiol. 31:3184-3189 (1994)] 및 마르다시(Mardassi) 등의 문헌[Arch. Virol. 140:1405-1418 (1994)]]. 정제된 PRRSV의 45 kDa 밴드는 보고된 바와 같이 ORF3 산물일 수 있다[카퍼(Kapur) 등의 문헌[J. Gen. Virol. 77:1271-1276 (1996)]]. 24, 27 내지 30 kDa 단배질종은 이해될 수 없다. PNGase F 및 엔도글리코시다제 H 처리 후에, PRRSV 샘플의 밴드 패턴은 변하였다. PNGase F 처리된 PRRSV에서, 16-kDa 밴드는 글리코실화되지 않은 리더-제거된 코어 단백질 E를 나타낼 수 있고, 27-kDa 밴드는 E, M 및 N 외의 PRRSV의 다른 구조 단백질을 나타낼 수 있다. 그러나, 올리고클로날 또는 모노클로날 항체로 이러한 밴드의 특징을 결정해야 한다.
토끼 면역화 시험으로부터의 이러한 결과, 재조합 단백질로 토끼를 면역화하여 생성된 항체는 본래의 PRRSV 바이러스 항원을 인식할 수 있는 것으로 나타났다. 이 재조합 단백질은 PRRSV에 감염된 포유류 세포에서 그의 본래 대응물, 특히 E 및 M보다 토끼에서 더 높은 항체 역가를 유도한 재조합 N과 동일한 항원성을 나타냈다.
<실시예 6>
돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV), 즉 변형된 생체 바이러스 백신을 동결건조된 바이러스 케이크로 제조하고 무균수로 녹여 피하(SC) 또는 근육내(IM) 경로에 의해 투여하였다. 이 연구의 목적은 2 ml 투여량을 근육내 또는 피하적으로 백신접종하여 3주된 돼지에서 PRRSV 백신의 면역원성을 확인하는 것이었다. 또한, PRRSV 백신이 안전한지와 효능이 있는지를 독성 PRRSV 균주 ISU-12를 항원으로 투여한 것에 맞서 돼지를 보호하는데 있어서 투여량 2 ml로 근육내 또는 피하적으로 백신접종한 3주된 돼지에서 결정하였다.
동물 선택
이종교배된 PRRSV 혈청검사결과 음성인 돼지를(0.4 미만의 양성 비율에 대한 IDEXX ELISA 샘플) 미네소타주 모리스 소재의 에버그린 파트너사(Evergreen Partners, Morris, MN)에서 구입하여 상기 연구에 사용하였다. 백신 접종시에 모든 돼지는 3주된 것이었다.
백신 조성물
바이러스 균주 ISU-55를 비롯한 PRRSV 백신을 바이러스 계대배양 수준 X+5에서 제조하였다. 사용하기 전에 이 백신을 2 내지 7 사이에서 보관하였다. 이 백신을 5번 반복하여 적정하였다.
백신 접종 일정 - 효능 시험
동결건조된 바이러스 분획을 무균수로 녹여 원료 백신을 제조하였다. 이 원료 백신을 배양 배지 중에 최저 보호 투여량 수준(투여량 당 약 104TCID50)으로 희석하였다. 이렇게 제조된 백신의 전형적인 일정 부분을 바이러스 항원의 정량화를 위해 -70 ℃에서 계속 유지하였다. 이 연구에서 사용된, PRRSV 혈청검사결과 허용된 돼지 70마리를 하기와 같이 4가지 처리 군 및 백신접종 군으로 랜덤하게 분류하였다.
주사 부위는 경부 우측(정맥내 투여) 또는 복부 우측 주름(피하 투여)이었다. 대조군 돼지(C 및 D 군)를 임의 백신 또는 플라시보 백신을 접종하지 않았다.
백신접종하기 전에, 백신접종 전 혈청검사를 위해 모든 돼지를 채혈하였다.대조군 동물의 PRRSV에 대한 혈청검사결과가 음성(IDEXX ELISA S/P 비율 0.4미만)인지를 확인하기 위해 항원 투여에 앞서 대조군 동물을 채혈하였다.
항원 투여 및 관찰 방법
백신을 접종하고 36일 후에, 통상의 단리실에서 A, B 및 C군의 돼지 20마리 각각을 뒤섞고 독성 PRRSV를 항원으로 투여하였다. D군 동물은 비항원 투여 대조군으로 방치하였다. 독성 ISU-12 PRRSV 항원 투여 바이러스는 아이오와주 에임스 소재의 아이오와 주립 대학에서 구입하였다. PSP36 세포에서 확장한 다음, 독성 ISU-12 PRRSV 항원 바이러스를 동결(-70 ℃) 모주로 유지하였다. 각 돼지의 비강내에 항원 바이러스 2 ml를 투여하였다. PRRSV 항원 모주를 해동시키고 항원을 투여하기에 앞서 2 ml당 104TCID50으로 희석하였다. 이 항원 바이러스를 투여하는 동안 얼음에서 유지하였다. PSP36 세포에서의 다음 적정을 위해 항원 바이러스 시료의 일정 부분을 보유하여 -70 ℃에서 유지하였다. 이 동물들을 항원 투여일(DPC) 전일 및 당일 관찰하여 각종 임상 징후에 관한 기준 및 1 내지 10 DPC를 정하였다.
임상 관찰
항원 투여후의 임상 징후, 예를 들어 식욕 부진, 무기력, 기능 저하, 설사, 신경학적 증상, 호흡곤란, 청색증 및 사망을 평가하였다.
폐 병변 점수
감염 10일 후에 부검할 때, 각 돼지 개체의 폐의 거대 병변을 검사하였다. 거대 폐 병변을 기록하는 사람은 각 돼지가 속하는 처리군의 신원을 알지 못하였다. 요컨대, PRRSV-유사 병변(색 및 감촉)을 나타내는 폐엽의 백분율을 측정하여 각 폐엽의 병변의 점수를 기록하고 이를 폐엽에 대해 가능한 점수와 곱하였다. 폐엽이 차지하는 폐의 총 부피의 상대적인 백분율을 결정하여 각 폐엽의 최고 점수를 결정하였다. 그 후에, 모든 폐엽의 등 및 복부 면에 대한 점수를 더하여 각 돼지의 총 점수를 구하였다. 각 돼지에 대해 가능한 최고 총점은 100이었다.
통계 분석
분산 분석(일반적인 선형 모델)을 이용하여 백신접종군 및 대조군에 대한 임상 징후 및 거대 폐 병변 점수를 비교하였다. 등급을 매기지 않은 거대 폐 병변 점수를 이용한 분산 분석 모델의 사용도 점수가 정규 확률 분포 범위내에 적합하면 무방하였다. 파라메타 분석 오차를 비교한 결과, 그들은 정규 분포하는 것으로 나타났고, 이는 분산 분석의 주요 가정을 입증한다. 따라서, 등급을 매긴 거대 폐 병변 점수를 이용한 데이타 분석이 필수적은 것은 아니었다. 모든 통계적 분석은 SAS 소프트웨어를 사용하여 IBM 컴퓨터로 수행하였다.
결과 및 토의
VS 코드 백신의 PRRSV 항원 역가.
PRRSV 백신 항원 적정 결과는 표 8에 나타나 있다. 5회의 반복 적정으로부터의 백신 투여랑 당 평균 PRRSV 적정 투여량은 103.92TCID50이었다.
임상 관찰
백신 접종 후에, 백신을 접종한 돼지중 어떤 돼지에서도 임상 징후는 관찰되지 않았다. 독성 PRRSV ISU-12 p6을 항원 투여한 다음, 항원 투여 후 10일의 관찰 기간 동안, 백신을 접종한 돼지 및 대조군 돼지는 호흡기 또는 신경 질환에 대한 임상 징후를 보이지 않았다.
거대 폐 병변 병리학
거대 폐 병변의 기록 결과는 표 9에 주어져 있다. PRRSV를 항원으로 투여한 다음, 거대 폐 병변 점수는 정맥내로 백신을 접종한 돼지(A 군)에서 평균 점수가 14.15인 0 내지 29의 범위였고, 피하로 백신을 접종한 돼지에서는 평균 점수가 11.20인 1 내지 27의 범위였고, 백신을 접종하지 않고 항원을 투여한 대조군 돼지(C 군)에서는 평균 점수 25 내지 80인 7 내지 57의 범위였고, 백신을 접종하지 않고 항원을 투여하지 않은 대조군 돼지(D 군)에서는 평균 점수 10.90인 1 내지 28의 범위였다. 정맥내 및 피하로 백신을 접종한 돼지는 모두 백신을 접종하지 않고 항원을 투여한 대조군 돼지보다 폐 병변이 상당히 적었다(p < 0.05). 백신을 접종한 돼지는 백신을 접종하지 않고 항원을 투여하지 않은 돼지의 거대 폐 병변 점수보다 상당히 다른 거대 폐 병변 점수를 나타냈다(p < 0.05). 백신을 접종하지 않고 항원을 투여한 대조군 돼지는 백신을 접종하지 않고 항원을 투여한 대조군 돼지보다 상당히 더 높은 거대 폐 병변 점수를 나타냈다(p < 0.05).
결론
이 연구 결과는 변형된 생체 바이러스 백신인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스가 3주 이상된 돼지에서 독성 PRRSV를 항원으로 투여하여 유발된 호흡기 질환의 예방에서 보조제 용도로 효능이 있음을 증명한다. 변형된 생체 백신을 백신 접종한 3주 된 돼지의 100 %가 백신 접종 후에 어떠한 국소 및 전신 임상적 역효과를 나타내지 않았다. 이 돼지들은 백신 접종 후 36일의 관찰기간 내내 건강했고 활동적이었다. 백신을 103.92TCID50의 투여량으로 근육내 또는 피하적으로 접종한 돼지는 이형적인 독성 PRRSV 항원 균주인 ISU-12를 항원 투여한 후에 백신을 접종하지 않고 항원을 투여한 대조군 돼지에 비해 거대 폐 병변 발생에서 상당한 감소(p < 0.05)를 나타냈다. 백신을 접종한 돼지에서 항원 투여 후의 거대 폐 병변 점수는 백신을 접종하지 않고 항원을 투여한 대조군의 것과 통계적으로는 구별되지 않았다(p > 0.05). 파라메타 분산 분석의 오차 분석 결과, 그가 정규분포하는 것으로 나타났고, 이는 분산 분석의 주요 가정을 입증하였다. 백신을 접종한 돼지의 100%는 감염후의 기간 동안 임상 징후가 없었다.
<실시예 7>
PRRSV 단리체 VR 2385의 완전한 서열
재료 및 방법.
바이러스 및 세포.이 연구에서는 7회 계대배양한 PRRSV 단리체 VR2355를 사용하였다. 바이러스를 생장시키고 바이러스에 감염된 세포 라인 유래의 바이러스 RNA 및 총 RNA를 단리하는데 지속적인 세포 라인 ATCC CRL 11171을 사용하였다.
cDNA 클로닝 및 PCR 증폭.VR2385 게놈의 ORF 1 영역을 기술하기 위해, Uni-Zap cDNA 클로닝 킷트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 랜덤 cDNA λ라이브러리를 구성하였다. 요컨대, CRLL 11171 세포를 0.1의 감염다중도에서 VR2385 바이러스로 감염시키고 감염된 세포의 총 RNA를 구아니디늄 티오시아네이트법을 이용하여 감염 24시간 후에 단리하였다. 먼저, ORF 2의 5'말단에 특이적인 프로브를 사용하여 랜덤 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 이 프로브와 혼성화하는 플라크를 단리하고 정제하였다. 바이러스 cDNA 삽입체를 포함하는 파지미드를 ExAssist 헬퍼 파지 및 대장균 SOLR 세포(Stratagene, LaJolla, CA)를 사용하여 시험관내 절단에 의해 수획하였다. ORF 1-특이적 중첩 단편과 혼성화한 다음, 2 내지 6 kb 크기의 바이러스 특이적 cDNA 삽입체를 지닌 몇몇 재조합 파지미드를 선택하였다. 바이러스 cDNA 삽입체를 지닌 이러한 플라스미드를 정제한 다음, 자동화 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 상거(Sanger) 디데옥시뉴클레오티드 연쇄 종결법에 의해 서열을 분석하였다. 정방향, 역방향 및 PRRSV-특이적 내부 프라이머를 사용하여 이 서열을 결정하였다. ORF 1a 및 1b의 서열을 나타내는 2가지 이상의 독립적 cDNA 클론의 서열을 분석하였다. 라이브러리(뉴클레오티드 1950 내지 2050)에 나타나지 않은 한 영역을 교정 태그 익스텐더(스트라타진)를 첨가한 태그 DNA 중합효소를 사용하여 프라이머 IM687(5'-CCCCATTGTTGGACCTGTCC-3') 및 IM2500(5'-GTCACAACAGGGACCGAGC-3')로 PCR 증폭시켰다. 멕벡터(인터내셔날 바이오테크놀로지, 인크., 코네티컷주) 및진웍스(인텔리제네틱스, 캘리포니아주) 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 분석 데이타를 모아 분석하였다.
프라이머 연장 실험 및 RNA 서열 분석.제1쇄 cDNA(Gibco BRL) 합성을 위해 슈어스크립트 프리암플리케이션 시스템(SureScript Prcamplication System)을 사용하여 프라이머 연장 실험을 수행하였다.32P-표지 올리고뉴클레오티드 RNS(5'-CCAAGCTCCCCTGAAGGAGGCTGTCAC-3'을 VR2385 바이러스 RNA 0.54 g과 총 부피 12 ㎕로 혼합하고 RNA를 900 ℃에서 10분 동안 변성시켰다. 이 샘플을 제1 쇄 cDNA 완충액으로 총 부피 19 ㎕로 조정하고 프라이머를 가열 냉각하기 위해 42 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 수퍼스크립트(SuperScript)II 역전사효소를 이 반응에 첨가하고 반응 혼합물을 42 ℃내지 50 ℃에서 몇분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 40 % 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. 리더 서열 일부분을 포함하는 pPR59 클론의 서열 분석 반응 후에 프라이머 연장 생성물을 러닝하였다. 올리고뉴클레오티드 RNS는 서열 분석 반응을 위한 프라이머 역할을 한다.
γ32P-표지 올리고뉴클레오티드 RNS(5'-CCAAGCTCCCCTGAAGGAGGCTGTCAC-3') 및 151Ext(5'-AGCATCCCAGACATGGTTAAAGGGG-3')를 사용한 RT RNA 서열 분석 킷트(USB, Cleveland, Ohio)를 사용하여 정제된 바이러스 RNA의 직접적인 서열 분석을 수행하였다. 서열 분석 반응마다 정제된 바이러스 RNA 0.5 ㎍을 사용하여 제작자의 지시에 따라 서열 분석을 수행하였다.
결과
PRRSV VR2385의 리더 서열. 이미, λZap 벡터 중 PRRSV VR2385의 올리고 dT 및 랜덤 cDNA 라이브러리, 및 여기서 구성된 ORF 1b의 일부 및 완전한 ORF 2 내지 7의 서열이 결정되었다. VR2385의 리더 서열의 일부분인 ORF 1의 ATG 개시 코돈 상류의 뉴클레오티드 161개를 클론 pRP59로부터 얻었다. LDV의 리더 서열은 뉴클레오티드 156개이고, LV(PRRSV의 유럽형 단리체)는 뉴클레오티드 221개이다. 미국형 PRRSV의 완전한 리더 서열을 결정하기 위해, 프라이머 연장 실험을 수행하였다. 한 실험에서, 수퍼스크립트II 역전사효소를 사용하여 42 내지 50 ℃에서 cDNA를 합성하였다. 다른 실험에서, 60 ℃에서 cDNA를 합성하는 동안 Mn의 존재 하에 rTth DNA 중합효소를 사용하여 cDNA를 합성하는 동안의 리더 RNA의 잠재적인 2차 구조를 최소화하였다. 모든 실험에서, 생성된 cDNA 단편의 길이는 뉴클레오티드 약 190개로 동일했다. PRRSV VR2385의 완전한 리더 서열을 탐지하기 위해, 바이러스 RNA의 직접적인 서열분석을 수행하였다. 직접적인 RNA 서열분석 반응에서 수크로스 구배를 통해 정제된 바이러스로부터 단리된 비리온 RNA를 사용하였다. ORF 1a의 AUG 개시 코돈 상류의 10번째 및 67번째 뉴클레오티드 사이 위치의 리더 서열에 상보적인 프라이머로 직접적인 RNA 서열분석을 수행하였다. 리더 특이적 프로브를 사용한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 이미 탐지된 뉴클레오티드 161개의 리더 서열뿐 아니라, 다른 뉴클레오티드 27개의 리더 서열을 확인하였다. 리더의 5'말단 맨끝의 뉴클레오티드 2개는 서열분석 겔의 레인 4개 모두에서 관찰된 강렬한 밴드로 인해 확인할 수 없었다. 직접적 RNA 서열 분석에 의해 결정된 리더의크기는 프라이머 연장 실험의 결과와 상관 관계가 있었다. 직접적 RNA 서열 분석에 의해 얻어진 데이타를 추가로 확인하기 위해, 리더의 5'말단 맨끝에 상응하는 16 bp 프라이머 및 리더의 3'말단에서 뉴클레오티드 10개 상류에 위치한 안티센스 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 직접적인 RNA 서열 분석에 의해 얻어진 결과와 일치하는 예상된 180 bp PCR 단편을 증폭하였다. 따라서, PRRSV VR2385 리더의 추정 크기는 뉴클레오티드 190개였고, 이는 LV(221 nt), EAV(212 nt) 및 SHFV(208 nt)에 대해 보고된 것보다는 더 작았으나, LDV(156 nt)에 대해 보고된 리더 서열보다는 더 컸다. 리더 3'말단의 연결 영역의 서열은 TTTAACC였다. ORF 1a의 ATG 개시 코돈은 이 서열 하류에 인접하여 위치한다. 마찬가지 결과가 LV, LDV 및 SHFV에 대해서도 보고되었고, 여기서 ORF la의 개시 코돈도 연결 서열 하류에 위치한다. 그러나, EAV 리더 연결 서열의 게놈은 ORF 1a의 개시 코돈에서 뉴클레오티드 13개 상류에 존재하는 것으로 보고되었다. VR2385의 리더 서열 및 LV, LDV 및 SHFV의 리더 서열사이의 뉴클레오티드 서열 일치 백분율은 각각 55 %, 47 % 및 38 %였다. 놀랍게도, VR2385 리더의 3'말단의 뉴클레오티드 44개만이 LV 리더 서열과 유의한 상동성을 지닌다(이 영역에서 86 % 일치함). 또한, 상대적으로 높은 상동성이 VR2385와 LDV (64 %) 및 SHFV(63 %)사이의 뉴클레오티드 44개 영역에서 나타났다. VR2385 및 EAV의 리더 서열 사이에서 유의한 상동성은 나타나지 않았다.
PRRSV 게놈의 클로닝 및 서열 분석.PRRSV VR 2385의 ORF 1을 분석하기 위해, 바이러스에 감염된 세포의 전체 RNA로부터 λZap 벡터 중 랜덤 프라이밍된cDNA 라이브러리를 작성하였다. cDNA 라이브러리로부터 20개 이상의 중첩 cDNA 클론을 선택하여 서열을 분석하였다(도 2). 대부분의 영역의 경우, 2개 이상의 독립적인 클론으로부터 이 서열을 결정하였다. 뉴클레오티드 1900 내지 2050에 상응하는 영역은 이 cDNA 라이브러리내에 나타나지 않았고, 이 게놈 영역을 PCR 증폭하고 서열을 분석하였다. 서열 분석 결과, PRRSV 게놈 RNA(미국형단리체 VR2385)는 폴리A 서열을 제외하고 뉴클레오티드 15100개 길이인 것으로 나타났다.
ORF la/lb의 기능성 도메인 및 관련된 바이러스와의 상동성.ORF 1a의 예상 크기는 뉴클레오티드 7197개이다. 그는 191번째 및 7387번째 뉴클레오티드에 걸쳐 있고(종결 코돈 TAG는 제외함) 아미노산 2399개의 폴리단백질을 코딩한다. 리더-게놈 연결 영역은 LV의 것과 비슷하고, ATG 개시 코돈은 리더의 TTTAACC 서열 다음에 인접하여 위치한다. LV 및 VR2385의 ORF 1 서열을 비교하여 차이를 확인하였다. LV의 ORF la는 뉴클레오티드 7188개 길이이고, 이는 VR 2385의 것보다 아미노산 3개만이 짧다. VR2385 및 LV의 뉴클레오티드 서열 쌍 비교 결과, ORF 1a의 5'말단은 3'말단보다 더 다양한 것으로 나타났다. VR2385 및 LV사이의 뉴클레오티드 서열의 55 % 일치는 ORF 1a의 3'말단에서는 61 %이고, (뉴클레오티드 3050 내지 7387) ORF la의 처음 뉴클레오티드 1500개에서는 55 %이고, 뉴클레오티드 1500 내지 2500사이 영역에서는 46 %이다. ORF la내의 가장 변하기 쉬운 영역은 2500번째 및 3000번쩨 뉴클레오티드 사이에 위치했고, 여기서 VR2385 및 LV 사이에 유의한 상동성은 없었다. 아미노산 일치는 1번째 내지 530번째 아미노산의 영역에 대해서는 49 % 였고, 1100번째 내지 2399번째 아미노산 영역에 대해서는 55 % 였고, 530번째 내지 1100번째 아미노산에 걸쳐 있는 영역에서의 유의한 상동성은 없었다. VR2385 및 LDV의 ORF 1a 서열 비교 결과, ORF 1a의 처음의 뉴클레오티드 2000개에서는 상동성이 52 %이고 마지막 뉴클레오티드 3800개에서는 상동성이 55 %인 것으로 밝혀졌다(VR2385에서는 3400번째 내지 7197번째 뉴클레오티드 및 LDV에서는 2850번째 내지 6678번째 뉴클레오티드에 상응함). VR2385의 2000번째 내지 3400번째 뉴클레오티드 사이의 영역 및 LDV의 2500번째 내지 2850번째 뉴클레오티드 사이의 영역은 LDV 게놈에서 500개 이상의 뉴클레오티드 결실이 있는 고도의 가변성이다. 예상된 아미노산 서열을 비교한 결과, 아미노산 1개 내지 500개가 연장된 영역에서는 상동성이 36 %이고, 예상된 단백질의 마지막 1300개 아미노산을 포함하는 영역에서는 39 %인 것으로 나타났다(VR2385에서는 1120번째 내지 2353번째 아미노산 및 LDV에서는 940번째 내지 2226번째 아미노산).
VR2385의 ORF 1a에 의해 코딩되는 예상된 단백질의 분석 결과, 다른 아테리바이러스 및 코로나바이러스에 대해 기재된 것과 유사한 파파인-유사 시스테인 프로테아제 도메인(63번째 내지 165번째 아미노산 및 261번째 내지 347번째 아미노산) 2개의 존재 및 3C-유사 세린 프로테아제 도메인(1542번째 내지 1644번째 아미노산)의 존재가 밝혀졌다. VR2385의 ORF 1a 단백질의 소수성 프로필은 LV 및 LDV의 것과 유사하다. 이 단백질의 5'절반(VR2385에서 처음의 아미노산 1100개)은 주로 친수성이었고, 3'말단 맨끝(VR2385에서는 2230번째 내지 2399번째 아미노산)은 친수성 이었고, 이 단백질의 3'절반은 소수성 영역을 포함한다(VR2385의 1129번째 내지 1207번째 아미노산, 1240번째 내지 1286번째 아미노산, 1478번째 내지 1643번째 아미노산 및 1856번째 내지 2076번째 아미노산 영역).
VR2385 ORF 1b는 뉴클레오티드 4389개 길이이고 이는 7369번째 뉴클레오티드 내지 11757번째 뉴클레오티드로에 걸쳐있으며(종결 코돈 TGA를 제외함), 아미노산 1463개 짜리 단백질을 코딩한다. VR2385 ORF 1b와 LV, LDV 및 EAV의 ORF 1b의 뉴클레오티드 및 예상되는 아미노산 서열의 비교 결과, ORF 1b는 ORF 1a보다 더 보존적임을 확인하였다. VR2385 및 LV 사이의 뉴클레오티드 및 아미노산 상동성은 각각 ORF 1b에서는 64 내지 67 %였고, ORF 1a에서는 58 내지 53 %였다. VR2385 및 EAV의 예상된 단백질을 비교한 결과, 상동성은 36 %였다. VR2385의 예상된 ORF 1b 단백질은 추정의 중합효소 도메인(아미노산 373 내지 576), 추정의 아연 핑거 도메인(아미노산 647 내지 689), 및 LV, LDV, EAV 및 코로나바이러스에 대해 개시된 것들에 유사한 RNA 헬리카제 도메인(아미노산 793 내지 1015)을 포함한다.
코로나바이러스 및 아테리바이러스의 ORF 1 영역의 분자적 특성화는 ORF 1 폴리단백질이 2가지 중첩하는 ORF, ORF 1a 및 ORF 1b를 통해 발현되는 것으로 나타났다. -1 프레임에서 ORF 1a와 중첩하는 ORF 1b의 발현은 리보좀이 ORF 1a 종결 코돈을 지나 ORF 1b-코딩된 단백질을 번역하게 하는 소위 리보좀의 프레임시프팅 메카니즘을 통해 일어난다. 이 프레임시프팅 영역은 위매듭 구조 앞쪽의 "미끄러운 서열(slippery sequence)"로 이루어진다. VR2385의 ORF1a/ORF1b 연결 영역의 분석 결과, 이 잠재적인 미끄러운 서열(5'-UUUAAAC-3')은 ORF 1a의 종결 코돈 상류의 3번째 뉴클레오티드 및 제안된 위매듭 구조에 위치하는 것으로 나타났다. 이 영역은 코로나바이러스 및 아테리바이러스에서 잘 보존되어 있고 VR2385 및 LV사이의 이 영역의 뉴클레오티드 서열 상동성은 86 %이다.
VR2385 및 LV의 리더 서열을 비교한 결과, 두 바이러스는 점 돌연변이 및 가능하게는 재조합을 통해 서로 다른 것으로 나타났다. 이러한 두 바이러스의 리더 서열에서 광범위한 서열 차이는 PRRSV의 서열이 보존되지 않고 광범위한 돌연변이성 변화하기 쉬운 리더를 나타냈다. 이 리더에서 가장 보존된 영역은 3'말단의 마지막 뉴클레오티드 44개였는데, 여기서 뉴클레오티드 서열산 일치는 VR2385 및 LV사이에서는 86 %였고, VR2385 및 LDV사이에서는 68 %였다. VR2385의 추정의 리더 서열은 뉴클레오티드 190개 였고, 이는 LV의 것보다는 뉴클레오티드 31개가 짧고, LDV의 것보다는 뉴클레오티드 35개가 더 길다. 도 24에 나타낸 바와 같이, LV의 리더 서열에 비해 VR2385 리더(뉴클레오티드 145개 다음에 위치함)에서는 뉴클레오티드 20개 결손이 있다. VR2385 및 LDV의 리더 서열의 비교 결과, 가장 높은 상동성 점수는 뉴클레오티드 20개 차이가 LDV의 리더 서열의 상응하는 영역(도 24)에 도입될 때 얻어졌음을 나타낸다. 마찬가지로, 가장 높은 상동성 점수는 LV 및 LDV 리더 서열을 배열하는 동안 뉴클레오티드 50개 틈이 LDV 리더내로 도입될 때 얻어진다. 이러한 결과는 이러한 리더 영역이 바이러스 복제에 중요하지 않고 결실은 바이러스 진화동안 리더 영역에서 일어날 수 있음을 시사한다. 또한, 이러한 관찰 결과는 VR2385, LV 및 LDV사이의 리더 서열 길이에서의 관찰된 차이를 설명한다.
<실시예 8>
PRRSV VR 2385의 서브게놈 mRNA의 리더 서열 및 리더-본체 연결 서열이 특성화
PRRSV VR2385의 완전한 리더 서열을 결정하기 위해, 리더-특이적 32P-표지 PCR 프로브를 사용한 올리고 dT cDNA 라이브러리의 스크리닝, T4 RNA 리가제를 사용한 바이러스 RNA의 RNA 라이게이션(RNA의 환형화) 후 ORF 7 및 리더 특이적 프라이머를 사용한 RT-PCR, 및 바이러스 RNA의 5'말단의 직접적인 서열 분석을 비롯한 몇몇 방법을 이용하였다(실시예 7). 먼저, 리더 서열의 100 bp 단편을 프로브로 사용하여 올리고 dT λ라이브러리 유래의 리더 서열을 포함하는 cDNA 클론을 검출하였다. cDNA 클론 8개를 분석 및 서열분석하였고, 이 클론은 mRNA 7 (클론 5개), 6 (클론 2개) 및 2 (클론 1개)의 리더 서열을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 리더 서열의 크기는 클론 7개중 6개에서 뉴클레오티드 160개 내지 163개의 차이가 있었다. mRNA 6을 나타내는 클론중 하나에서, 리더 특이적 서열은 뉴클레오티드 172개였다. 바이러스의 리더내의 유력한 2차 구조는 λZap 라이브러리를 구성하는 동안 리더 RNA의 완전한 cDNA 합성을 방해했을 가능성이 있다. 제2 실험에서, 바이러스 RNA의 3' 및 5'말단을 T4 RNA 리가제를 사용하여 머리-대-꼬리로 라이게이션하였다. 페놀 클로로포름 추출 및 침전 후에, 라이게이션된 RNA는 프라이머 IM1003(리더 서열의 3'마단에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드) 및 IM1004(폴리(A) 꼬리 상류 100개의 뉴클레오티드인 게놈의 3'코딩하지 않는 영역의 단편에 상응하는 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 쉽게 RT-PCR 반응하였다. 뉴클레오티드 250개 내지 350개 범위의 크기를 지닌 PCR 생성물의 넓은 밴드를 아가로스 겔로부터 정제하고 pSK+ 벡터내에 클로닝하였다. 7가지 독립적인 클론의 서열을 분석하였다. 서열분석 결과, 클론 7개 모두에서 함께 게놈 3'말단의 폴리(A) 서열 및 게놈 5'말단의 리더 서열을 라이게이션하였으나, 리더 서열의 3'말단의 뉴클레오티드 95 내지 96개만이 바이러스 게놈의 3'말단과 라이게이션되었다. 배열된 클론의 폴리A의 크기는 각 클론에서 뉴클레오티드 9개 내지 42개 범위에서 변하였는데, 이는 배열된 클론이 서로 독립적임을 나타낸다. 수크로스 구배에서 정제된 바이러스로부터 단리된 비리온 RNA의 5'말단의 직접적 RNA 서열분석에 의해 VR2385의 추정의 전장 리더 서열을 결정하였다(실시예 7).
VR2385 게놈내의 리더 mRNA 연결 서열 및 유전자사이 영역.VR2385 균주의 sg RNA의 리더 본체 연결 영역을 특성화하기 위해, 각 sg mRNA에 특이적인 리더 특이적 프라이머 및 프라이머들을 사용한 RT-PCR을 수행하였다. 감염 20시간 후(h.p.i.)에 단리된 총 RNA를 RT-PCR에 사용하였다. 두드러진 밴드를 아가로스 겔로부터 단리하고 클로닝하고 서열분석하였다. PCR 생성물의 직접적인 서열분석을 수행하였다. PRRSV 게놈내의 리더 본체 연결 영역을 확인하기 위해, 리더 특이적32P-표지 프로브를 사용하여 바이러스 RNA로부터 생성된 랜덤 cDNA 라이브러리 및 리더-ORF 1a 연결 영역을 포함하는 몇몇 클론을 단리하고 서열을 분석하였다. sg mRNA 2 내지 7의 리더 본체 연결 영역을 특성화하였다.
표 10은 모든 sg mRNA의 리더-본체 연결 영역 및 바이러스 게놈에서 그의 상응하는 영역의 요약이다. sg mRNA 2, 3 및 6에 대해서는 1군데 연결 부위만이 탐지되었으나, sg mRNA 4, 5 및 7에 대해서는 4a, 4b, 5a, 5b 및 7a, 7b로 표시되는2군데 부위가 탐지되었다. VR2385의 리더 게놈 연결 영역을 CCACCCCTTTAACC와 비슷한 서열로 나타냈다.
리더 본체 mRNA 연결 영역은 sg mRNA 3, 4, 5b, 6 및 7a에서 변하였다. 표 11은 VR2385, LV, LDV 및 EAV 게놈의 유전자사이 영역의 비교이다. VR2385, LV 및 LDV의 유전자사이 영역은 매우 비슷하다. 변이 대부분이 이 영역의 처음의 뉴클레오티드 3개에서 발견되나, 마지막 뉴클레오티드 4개는 보존되고 대부분의 영역에서 서열 AACC로 나타낸다. 변이는 이러한 연결 서열의 처음의 뉴클레오티드 2개에서도 발견되었다(VR2385의 ORF 4의 유전자 사이의 영역에서 GACC 및 CACC, VR2385의 ORF 5b의 유전자사이 영역에서 AGCC, LV의 ORF 3의 유전자사이 영역에서 GACC 및 LDV의 ORF 2의 유전자사이 영역에서 ACC). VR2385의 sg mRNA에 대한 유전자사이 영역은 GUCAACU이고, 이는 EAV의 것과 비슷하다.
상응하는 ORF의 개시 코돈의 상류 유전자사이 부위의 위치는 뉴클레오티드 4개 내지 231개의 차이가 있다. 표 12는 VR2385 및 LV 게놈에서 유전자사이 부위의 위치에 대한 비교이다(수는 상응하는 ORF의 유전자사이 부위 및 AUG 개시 코돈 사이의 뉴클레오티드의 거리를 나타냄). VR2385 및 LV 게놈에서 이러한 부위의 위치는 sg mRNA 3, 4, 5 및 6에서 다르다. 또한, VR2385 게놈의 sg mRNA 4, 5 및 7의합성에서 3가지 선택적인 유전자사이 부위를 확인하였다. 앞서, VR2385에 감염된 세포에서 노던 블롯 혼성화 분석에 의해 sg mRNA의 6가지 밴드만이 검출되었다. VR2385의 복제 중에 추가의 sg mRNA가 실제로 합성되는지를 확인하기 위해, 리더 및 ORF 특이적 프라이머를 사용하여 네스티드 RT-PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물은 다른 mRNA 4a, 5a 및 7a(도 26)에 상응하는 크기로 유사하였다. 이러한 결과는 상응하는 ORF의 개시 코돈에 더 가까이 위치한, sg mRNA 4 및 5의 유전자사이 부위 4b 및 5b가 sg mRNA 합성에 자주 사용됨을 나타냈다. sg mRNA 4 및 5는 유전자사이 부위 4b 및 5b로부터 주로 생성되나, 소수 집단만이 선택적인 부위 4a 및 5a를 사용하여 생성된다. sg mRNA 7의 경우, ORF 7의 개시 코돈 상류 123번째 뉴클레오티드에 위치한 유전자사이 부위 7a는 자주 사용되나 ORF 7의 개시 코돈의 상류 9번째 뉴클레오티드에 위치한 부위 7b는 sg mRNA 7 합성에과 관련이 적다.
리더 게놈 연결 서열을 sg mRNA의 유전자사이 영역의 서열 및 리더 본체 연결 영역의 서열과 비교한 결과, 리더의 마지막 뉴클레오티드 7개(TTTAACC)만이VR2385 게놈내의 유전자사이 영역의 서열과 상동성을 가지는 것으로 나타났다. 전체적인 상동성은 뉴클레오티드 5개 내지 7개가 차이가 있고, 유일한 예외는 유전자사이 영역의 뉴클레오티드 12개중 11개가 리더 서열의 3'말단과 유사한 sg mRNA 6이었다. sg mRNA의 리더 본체 연결 영역에서, CCACCCC 서열은 보존되어 있고 리더로부터 생성된다. 그러나, CCACCCC 서열은 다른 sg mRNA와는 차이가 있으나, 리더의 3'말단에서 TTTAACC와 높은 수준의 상동성을 지닌다. 다른 sg mRNA에 대해 탐지된 리더 본체 연결 서열의 변이는 리더 본체 연결이 부정확함을 나타낸다. 리더 3'말단 사이의 뉴클레오티드 서열 비교 결과, sg mRNA의 리더 본체 연결 영역 및 VR2385의 게놈내 유전자사이 영역은 sg mRNA의 리더 및 본체사이의 실제 연결 영역(표 2, 밑줄)의 검출을 가능케 하였다.
결론.PRRSV 미국형 단리체의 서브게놈 mRNA 합성의 메카니즘은 LV, LDV 및 EAV의 것과 유사하다. VR2385에서 탐지된 유전자사이 영역은 LV에 비교했을 때 보다 가변성이었고 다른 부위에 위치하였다. 리더 본체 연결 서열의 변이는 리더 본체 연결이 부정확함을 나타낸다. sg mRNA의 실제 리더 본체 연결 부위의 위치는 리더 프라이밍 이외의 메카니즘이 sg mRNA의 합성에 관련될 수 있음을 시사한다. PRRSV 미국형 단리체 게놈의 다른 리더-본체 연결 부위는 PRRSV 다른 균주사이의 sg mRNA의 수에서의 변이로 나타날 수 있다.
<실시예 9>
하기에는 PRRSV계 단리체 유래의 많이 계대배양한 PRRSV의 ISU55 균주의 확인 및 분화에 대한 확실한 시험이 제공된다. 상기 연구에서, 조금 계대배양한 ISU55 균주(계대배양 7회)의 서열을 결정하였고, 이 서열을 사용하여 ISU55 hp 균주의 분화에 대한 RFLP 시험을 개발하였다. 제1 단계로, ISU55 p-7의 서열을 분석하고 독특한 제한 부위를 포함하는 가변성 영역을 확인하였다. 컴퓨터 서열 분석 및 다른 PRRSV 균주의 서열을 비교한 다음, 2군데 독특한 제한 부위를 포함하는 특이적 영역을 ORF 4의 3'말단에서 확인하였다. 이러한 2군데 제한 부위는 ISU55(p-7) 서열에서 ORF 2의 ATG 개시 코돈의 상류 위치에 상대적인 위치 1510에서 DraI(TTT/AAA)였고, 위치 1697에서 BalI(MscI)(TGG/CCA)였다. 이러한 2군데 제한 부위는 ISU55 균주의 상응하는 영역에서만 존재하였으나, 다른 PRRSV 균주에서는 나타나지 않았다.
컴퓨터 분석 결과를 확인하기 위해, 많이 계대배양한 ISU55 균주의 서열을 결정하였다. ORF 3 내지 7(2696 bp)를 포함하는 게놈 영역을 PCR로 증폭하고 서열을 분석하였다. 많이 계대배양한 ISU55의 서열을 7회 계대배양한 ISU55의 서열과 비교하였다. 이 비교 결과는 도 27(cDNA 배열), 도 28(ORF 지도) 및 도 29(제한 효소 DraI 및 BalI를 사용한 제한 패턴)에 나타나 있다. 조금 계대배양한 PRRSV ISU55 및 많이 계대배양한 PRRSV ISU55의 서열은 매우 보존되어 있었다. 많이 계대배양한 ISU55 균주에서는 뉴클레오티드 15개의 치환만이 있었다. ORF 3 내지 7의 크기 및 상대적인 위치는 동일하였다. 많이 계대배양한 바이러스의 뉴클레오티드 1개 변화는 조금 계대배양한 ISU55에 비해 많이 계대배양한 바이러스의 서열에서 추가의 DraI 부위를 생성하였다(도 29). 이러한 연구 결과로 많이 계대배양한바이러스를 조금 계대배양한 ISU55 바이러스와 구별하는 기회가 주어지게 된다. 블라스트(BLAST) 조사를 수행하여 많이 계대배양한 ISU55 균주의 특이적 영역을 젠뱅크(GenBank) 데이터베이스에서 이용할 수 있는 다른 PRRSV 서열과 비교하였다. 많이 계대배양한 ISU55 균주의 독특한 제한 부위(위치966 및 위치1159의 2군데 DraI 부위 및 위치1157에서 BalI 부위, ISU55 hp.의 제한 지도)를 포함하는 237 bp 단편을 비교를 위한 주형으로 사용하였다. 블라스트 조사 결과, 이러한 부위는 많이 계대배양한 ISU55 균주에서 독특하고 데이터베이스에서 이용할 수 있는 다른 24가지 PRRSV 단리체에서는 존재하지 않는 것으로 나타났다.
또한, 많이 계대배양한 ISU55 균주의 ORF 5(603 bp)를 다른 PRRSV 균주의 ORF 5와 비교하였다. 예상된 바와 같이, 7회 계대배양한 ISU55 균주는 가장 높은 상동성 점수를 가지며 3개의 뉴클레오티드 치환만이 있다. 2번째로 높은 상동성 점수를 지닌 균주는 ISU55 hp 균주의 ORF 5에 비해 ORF 5에서 33개의 뉴클레오티드 치환을 가지는 NADC8였다. 블라스트 조사에서 비교된 나머지 PRRSV 균주는 ORF 5에서 더 많은 변이(63개 이하의 뉴클레오티드 변이)를 나타냈다. 이러한 데이타는 ISU55 PRRSV 균주는 지금까지 특성화된 다른 모든 PRRSV 균주와 상이함을 뚜렷히 나타낸다.
PCR-RFLP을 개발하여 ISU55 lp 바이러스 및 다른 PRRSV 균주로부터 많이 계대배양한 ISU55 균주를 분화시켰다. RFLP 시험을 위해 2가지 프라이머를 합성하였다. 정방향 프라이머 55F 5'-CGTACGGCGATAGGGACACC-3'(위치823) 및 역방향 프라이머 3RFLP 5'-GGCATATATCATCACTGGCG-3'(위치1838) (많이 계대배양한 ISU55 균주의2696 bp 배열된 단편의 5'말단 위치). PCR-RFLP 시험에 대한 역방향 프라이머는 이러한 프라이머가 다수의 PRRSV 단리체의 PCR-RFLP에 사용되고 특이적인 것으로 나타났으므로, MLV ResPRRSV 백신 균주를 분화시키는 PCR-RFLP 시험에 사용된 것과 동일하였다[웨슬레이(Wesley) 등의 문헌[J. Vet. Diagn. Invest. 10: 140-144 (1998)], 웨슬레이(Wesley) 등의 문헌[Amer. Assoc. Of Swine Practitioners, pp. 141-143 (1996)], 앤드레이예프(Andreyev) 등의 문헌[Arch. Virol. 142:993-1001 (1997)], 멩겔링(Mengeling) 등의 문헌(1997), 이들 모두 본 명세서에 그의 전체가 참고문헌으로 인용되어 있음]. 이러한 2가지 프라이머는 많이 계대배양한 PRRSV ISU55 균주의 1026 bp cDNA 단편을 증폭한다. 제한 효소 DraI로 자른 다음, 3가지 단편(626 bp, 187 bp 및 135 bp)이 생성될 것이다. BalI으로 자른 다음, 626 및 322 bp 크기의 2가지 단편이 형성될 것이다. 다른 PRRSV 균주를 PCR 및 제한 효소로 자른 다음, 컴퓨터 데이터 분석에 따라 1026 bp 단편이 형성될 것이다. PCR-RFLP 시험을 확인하기 위해, 전체 RNA를 ISU55 hp, ISU12 lp, ISU12 hp 균주로부터 단리하고 프라이머 55F 및 3RFLP를 사용한 RT-PCR을 수행하였다. 모든 단리체로부터 1026 bp 단편을 증폭하였다. 이러한 단편을 정제하고 제한 효소 DraI 및 BalI로 잘랐다. 생성된 산물을 1.5 % 아가로스 겔에서 분석하였다. 도 30은 이 시험의 결과를 나타낸다. 라인 1은 ISU55 hp 균주의 처리하지 않은 1026 bp PCR 단편을 나타낸다. 라인 2 및 5는 DraI (라인 2) 및 BalI(라인 5)을 사용하여 잘린 ISU55 hp의 PCR 생성물을 나타낸다. DraI으로 자른 다음 626 bp, 187 bp 및 135 bp 단편이 형성되었고, BalI으로 자른 다음 626 및 322 bp 단편이 형성되었다. 라인 3, 4, 6 및 7은 ISU12 lp(라인 3 및 6) 및 ISU12 hp(라인 4 및 7) 균주의 PCR 생성물을 DraI 절단(라인 3 및 4) 및 BalI 절단(라인 6 및 7)한 결과를 나타낸다. ISU12 lp 및 hp 균주와의 모든 반응에서, 1026 bp의 PCR 단편을 검출하였다. 이러한 데이터는 ISU55 hp 균주의 PCR-RFLP 분화 시험에 대한 예상과 상관 관계가 있다.
분명히, 상기 기재 내용의 견지에서 본 발명에 대한 많은 변형 및 변화가 가능하다. 따라서, 본 발명은 부가된 청구항의 범위내에서 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과는 다르게 수행될 수 있음을 이해해야 한다.
<실시예 10>
약독화된 PRRSV 백신 균주(ISU55 p49) 게놈의 서열 분석.
VR2385 균주의 서열을 결정한 다음, 생성된 서열 분석 정보를 사용하여 약독화된 백신 PRRSV 균주(백신 균주)의 서열을 결정하였다. 백신 균주의 전체 개놈을 중첩하는 단편 21개에서 증폭하고 서열을 분석하였다. 서열 분석 데이터를 모았을 때, 게놈의 전체 크기는 뉴클레오티드 15,142개 였고, 이는 VR2385 균주 게놈의 길이에 비해 뉴클레오티드 309개가 더 긴 것이다. ORF 지도 및 그의 위치는 도 31에 나타나 있다. 백신 균주 및 VR2385 균주의 게놈 비교 결과, ORF 1b 내지 ORF 7의 동일한 크기 및 상대적인 위치가 나타났다. ORF la는 가장 변하기 쉬웠고 백신 균주의 서열에 비해 뉴클레오티드 309개의 결실이 VR2385의 게놈에서 발견되었다. 이러한 결실은 프레임내에 있었고 VR2385 PRRSV 게놈의 5'말단으로부터 3242번째뉴클레오티드 위치에서 ORF 1a의 영역에 위치하였다. 다른 뉴클레오티드 3개는 이 영역에서 결실되었고, 아미노산 1개의 결실을 유발하는 게놈의 2504 내지 2515 뉴클레오티드는 백신 균주의 게놈에 필적한다. 백신 균주 및 VR2385 균주의 다른 ORF의 게놈을 비교한 결과는 표 13에 요약되어 있다. 이들 균주사이의 전체적인 DNA 상동성은 두 균주에서 뉴클레오티드 14094개가 동일한 91 %였다. 뉴클레오티드 309개 결실을 포함하지 않으면 DNA 상동성은 93 %였다. 바이러스 RNA의 직접적인 서열 분석에 의해 VR2385 균주의 리더 서열만을 결정하였고, VR2385의 리더 5'말단에 특이적인 17 bp 프라이머를 사용하여 백신 균주 리더의 뉴클레오티드 170개를 증폭하였다. 이러한 서열의 비교는 두 균주 모두에서 뉴클레오티드 1개의 결실인 94 %의 전체적인 상동성을 나타냈다. VR2385 리더의 뉴클레오티드 A(위치75) 및 G(위치119)는 백신 균주의 리더에서는 상실되고, 백신 균주 리더의 뉴클레오티드 A(위치87) 및 G (위치124)는 VR2385 균주 리더에서 상실된다.
백신 균주의 ORF la는 뉴클레오티드 191 내지 7699에 걸쳐있고 VR2385 균주의 ORF 1a 단백질에 비해 아미노산 103개 더 긴, 아미노산 2503개의 단백질을 코딩한다. 백신 균주 및 VR2385의 ORF 1a 예상된 단백질사이의 전체적인 아미노산 일치는 88 %(VR2385에서 결실을 포함하지 않으면 92%임)였다. LV의 ORF 1a 단백질 비교는 약 47 %의 전체적인 아미노산 일치를 나타내나, 다른 단백질 유사성을 지닌 몇몇 영역을 확인할 수 있다. 상대적으로 보존적인 5'말단(백신 균주에서 아미노산 1 내지 529 및 LV에서 아미노산 1 내지 521, 50 % 아미노산 일치), 상대적으로 보존적인 3'말단(백신 균주에서 아미노산 1232 내지 2503 및 LV에서 아미노산 1115내지 2396, 58 % 아미노산 일치), 및 이들 사이의 초가역성 영역(HVR)(백신 균주에서 아미노산 530 내지 1231 및 LV에서 아미노산 522 내지 1114, 아미노산 일치 40 %미만). HVR에서의 상동성을 보다 상세히 연구했을 때, 백신 균주 및 LV사이의 아미노산 상동성이 50 %인 1군데의 짧은 영역(아미노산 94개)을 탐지할 수 있었다. 이 영역은 백신 균주에서는 아미노산 1015 내지 1108 및 LV에서는 아미노산 929 내지 1021에 걸쳐있다. 흥미롭게도, 처음의 아미노산 4개(ITRK)를 제외하고 이 영역은 VR2385 균주에서 결실되어 있다. 요약하면, ORF la 예상 단백질의 상동성은 하기와 같이 나타낼 수 있다. 보존적인 영역 I(백신 균주/VR2385 균주에서 아미노산 1 내지 529, LV에서 아미노산 1 내지 521, 백신 균주 및 VR 2385사이의 90 % 일치, 백신/VR2385 균주 및 LV사이의 50 % 아미노산 일치), 초가역성 영역(HVR)(백신 균주에서 아미노산 530 내지 1231, VR2385 균주에서 아미노산 520 내지 1127, LV에서 아미노산 522 내지 1232, 백신 균주 및 VR2385사이의 84 % 아미노산 일치, VR2385의 ORF 1a 단백질에서 아미노산 103개 결실, 백신/VR2385 균주 및 LV사이의 40 % 미만의 아미노산 일치), 및 보존적인 영역 2(백신 균주에서 아미노산 1232 내지 2503, VR2385 균주에서 아미노산 1128 내지 2399, LV에서 아미노산 1128 내지 2396, 백신 균주사이의 96 % 아미노산 일치 및 백신/VR2385 균주 및 LV사이의 57 % 아미노산 일치). 백신 균주의 HVR에서 아미노산 94개의 단편(아미노산 929 내지 1021)은 LV와 50 %의 아미노산 상동성을 지니며, 이 영역은 VR2385 균주에서 결실되어 있다.
백신 균주의 ORF lb는 뉴클레오티드 7687 내지 12069에 걸쳐 있고 VR2385의것과 비슷한 크기의 아미노산 1461개의 단백질을 코딩한다. 뉴클레오티드 및 아미노산의 비교는 ORF 1b가 ORF 1a에 비해 훨씬 보존적임을 나타냈다. 백신 균주 및 VR2388사이의 뉴클레오티드 상동성은 93 %였고, 다른 예상된 단백질에 대해 97 % 상동성을 지녔다. LV의 ORF 1b(1462 아미노산)의 67 %의 아미노산 일치도를 보였다. LV에 비해 ORF 1b(아미노산 1367 내지 1461)의 3'말단에서 가변성 영역 1군데를 탐지하였다.
백신 균주의 ORF 2 내지 ORF 7 영역은 ORF의 유사한 크기 및 상대적인 위치를 가짐으로써 VR2385의 게놈 조직과 유사한 게놈 조직을 나타냈다. 백신 균주 및 VR2385사이의 상동성 비교에 대한 데이터는 표 13에 나타나 있고, 백신 균주와 LV의 뉴클레오티드(아미노산) 일치는 ORF 2의 경우 66 %(61 %), ORF 3의 경우 61 %(55 %), ORF 4의 경우 66 %(67 %), ORF 5의 경우 63 %(51 %), ORF 6의 경우 68 %(79 %), 및 ORF 7의 경우 60 %(58 %)였다.
<실시예 11>
VR 2385 단리체의 결실 분석.
VR 2385 PRRSV로부터 증폭된 PCR 생성물이 ORF 1a에서 445 bp 결실의 존재를 나타냈다. 상기 언급된 445 bp 결실뿐 아니라, 309 bp 결실은 프레임내에서 중첩되고 독립적인 기원이 있는 것으로 보였다. 플라크 정제 후의 이러한 결실 돌연변이체는 VR2385의 집단내에 속하며 뉴클레오티드 445개 결실을 지닌 변이체는 바이러스 모주에서 우세한 것으로 생각되었다. 이러한 변이체는 조금 계대배양한 바이러스, 많이 계대배양한 바이러스 및 돼지를 통해 2회 전달한 바이러스로부터 단리된 RNA에 대한 PCR 연구를 토대로 안정한 것으로 보인다. 309 bp 결실 변이체는 소수인 것으로 보였고, 특이적 프라이머를 사용한 네스티드 PCR에 의해 몇몇 바이러스 모주로부터 증폭될 수 있었다.
<실시예 12>
단계적으로 계대배양한 PRRSV의 특징.
약독화가 세포 배양물의 계대배양으로 인해 일어나는지를 결정하기 위해, 7회 계대배양한(p85) VR2385를 사용하여 3주된 돼지를 감염시켰다. 감염 10일 후에, 평가된 거대 폐 병변 및 임상 호흡기 점수는 보다 조금 계대배양한 바이러스에 감염된 돼지에서 상당히 높았다. 게놈의 ORF 2 내지 7 영역의 서열을 분석하고 비교하였다. 2회 계대배양한 VR2385에 대한 유전자 분석 결과, ORF 6은 아미노산 수준에서 100 %의 상동성을 지녀 가장 보존되어 있었다. 나머지 ORF는 95 내지 98 %의 아미노산 상동성을 보였고, VR2385 p85의 ORF 2는 추정의 아미노산 10개 절단으로 나타난 종결 코돈을 포함하였다.

Claims (20)

  1. SEQ ID NO:55(ISU-12)로 이루어진 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스(PRRSV)를 코딩하는 DNA 서열.
  2. 제1항에 있어서, SEQ ID NO:55(ORF la)의 뉴클레오티드 191 내지 7387, SEQ ID NO:55(ORF lb)의 뉴클레오티드 7375 내지 11757, SEQ ID NO:55(ORF 2)의 뉴클레오티드 11762 내지 12529, SEQ ID NO:55(ORF 3)의 뉴클레오티드 12385 내지 13116, SEQ ID NO:55(ORF 4)의 뉴클레오티드 12930 내지 13463, SEQ ID NO:55(ORF 5)의 뉴클레오티드 13477 내지 14076, SEQ ID NO:55(ORF 6)의 뉴클레오티드 14064 내지 14585 및 SEQ ID NO:55(ORF 7)의 뉴클레오티드 14578 내지 14946로 이루어진 군으로부터 선택된 PRRSV의 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 DNA 서열.
  3. 제2항의 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드.
  4. 제2항의 DNA 서열에 의해 코딩된 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는, PRRSV에 대한 항체를 유도하는 조성물.
  5. SEQ ID NO:54(ISU-55)로 이루어진 PRRSV를 코딩하는 DNA 서열.
  6. 제5항에 있어서, SEQ ID NO:54(ORF la)의 뉴클레오티드 191 내지 7699, SEQ ID NO:54(ORF lb)의 뉴클레오티드 7687 내지 12069, SEQ ID NO:54(ORF 2)의 뉴클레오티드 12074 내지 12841, SEQ ID NO:54(ORF 3)의 뉴클레오티드 12692 내지 13458, SEQ ID NO:54(ORF 4)의 뉴클레오티드 13212 내지 13775, SEQ ID NO:54(ORF 5)의 뉴클레오티드 13789 내지 14388, SEQ ID NO:54(ORF 6)의 뉴클레오티드 14376 내지 14592 및 SEQ ID NO:54(ORF 7)의 뉴클레오티드 14890 내지 15258로 이루어진 군으로부터 선택된 PRRSV의 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 DNA 서열.
  7. 제6항의 DNA 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드.
  8. 돼지에서 PRRSV에 대한 항체를 유도하는 유효량의 SEQ ID NO:54(ISU-55)에 의해 코딩된 PRRSV 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 PRRSV 항체 유도용 조성물.
  9. 제6항의 DNA에 의해 코딩되는 1종 이상의 폴리펩티드를 포함하는 PRRSV 항체 유도용 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 5주 된 제왕절개수술하여 초유를 섭취하지 못한 돼지의 폐 병변이 비접종 5주 된 제왕절개수술하여 초유를 섭취하지 못한 돼지의 폐 병변에 비해 통계적으로 유의한 양(여기서, p값은 0.01 미만임)만큼 줄어든 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 5주 된 제왕절개수술하여 초유를 섭취하지 못한 돼지의 폐 병변이 비접종 5주 된 제왕절개수술하여 초유를 섭취하지 못한 돼지의 폐 병변에 비해 통계적으로 유의한 양(여기서, p값은 0.01 미만임)만큼 줄어든 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 보조제를 추가로 포함하는 조성물.
  14. 돼지 생식기 및 호흡기 질병에 대해 보호해야하는 돼지에게 제8항의 조성물을 유효량 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병으로부터 돼지를 보호하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 백신이 경구적 또는 비경구적으로 투여되는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 백신이 근육내, 피부내, 정맥내, 복강내, 피하 또는 비강내로 투여되는 방법.
  17. 돼지 생식기 및 호흡기 질병에 대해 보호해야하는 돼지에게 제9항의 조성물을 유효량 투여하는 것을 포함하는, 상기 질병으로부터 돼지를 보호하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 백신이 경구적 또는 비경구적으로 투여되는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 백신이 근육내, 피부내, 정맥내, 복강내, 피하 또는 비강내로 투여되는 방법.
  20. (a) 2가지 프라이머 55F 5'-CGTACGGCGATAGGGACACC-3' 및 3RFLP 5'-GGCATATATCATCACTGGCG-3'를 사용하여 PRRSV의 DNA 서열을 증폭하는 단계,
    (b) 단계 (a)의 증폭된 서열을 DraI으로 자르는 단계, 및
    (c) 626 bp, 187bp 및 135 bp의 3가지 제한 단편의 존재와 PRRSV ISU-55 균주와의 상관 관계를 분석하는 단계를 포함하는, PRRSV 균주 ISU-55를 다른 PRRSV 균주와 구별하는 방법.
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