JP2002504317A - ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）のポリ核酸によってコードされるタンパク質 - Google Patents

ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）のポリ核酸によってコードされるタンパク質

Info

Publication number
JP2002504317A
JP2002504317A JP2000530103A JP2000530103A JP2002504317A JP 2002504317 A JP2002504317 A JP 2002504317A JP 2000530103 A JP2000530103 A JP 2000530103A JP 2000530103 A JP2000530103 A JP 2000530103A JP 2002504317 A JP2002504317 A JP 2002504317A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
prrsv
nucleotides
sequence
seq
mrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000530103A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2002504317A5 (ja
Inventor
プレム、エス．ポール
ヤンジン、ツァン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Iowa State University Research Foundation ISURF
Original Assignee
Iowa State University Research Foundation ISURF
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iowa State University Research Foundation ISURF filed Critical Iowa State University Research Foundation ISURF
Publication of JP2002504317A publication Critical patent/JP2002504317A/ja
Publication of JP2002504317A5 publication Critical patent/JP2002504317A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のアイオワ株の１個以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされるタンパク質、これらのタンパク質の抗原性領域であって、長さが少なくとも５アミノ酸でありかつ次のＰＲＲＳＶ単離体によるチャレンジに対してブタ宿主を効果的に保護する抗原性領域、およびそれらの組合せであって、抗原性に対して本質的でないアミノ酸を保存的に置換することができるものからなる群から選択される少なくとも１個のポリペプチドを含む精製製剤を提供する。本発明は、このようなタンパク質の有効量を含んでなるワクチン、このようなタンパク質に特異的に結合する抗体、これらのものの製造法、ブタをＰＲＲＳＶから保護し、ＰＲＲＳＶに感染したブタを治療し、ブタにおいてＰＲＲＳＶを検出する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 発明の分野 本発明は、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）から単離さ
れたポリ核酸、ポリ核酸によってコードされるタンパク質および／またはポリペ
プチド、このタンパク質またはポリ核酸を含んでなるＰＲＲＳＶからブタを保護
するワクチン、このタンパク質、ポリペプチドおよびポリ核酸の作成法、ワクチ
ンを用いてＰＲＲＳからブタを保護する方法、ワクチンの製造法、ＰＲＲＳＶに
感染したまたは暴露したブタの治療法、およびＰＲＲＳＶの検出法に関する。
【０００２】 背景の説明 ブタの新規で重篤な疾病であるブタ生殖器および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は
１９８７年に米国で最初に報告され、多くの西欧諸国で急速に認められるに至っ
た（Goyal, J. Vet. Diagn. Invest., 1993, 5:656-664;および米国特許出願連 続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書に概説
されている）。この疾病は成熟した雌ブタや妊娠経験のない雌ブタでの生殖器障
害、若い成長期のブタの肺炎および離乳前死亡率の増加を特徴としている（Wens
voort et al., Vet. Q., 13:121-130, 1991; Christianson et al., 1992, Am.
J. Vet. Res., 53: 485-488; 米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号 および第０８／３０１，４３５号明細書）。
【０００３】 ＰＲＲＳの原因物質であるブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳ
Ｖ）は、欧州で最初に同定され、次いで米国で同定された(Collins et al., 199
2, J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126)。レリスタッドウイルス（ＬＶ）と呼 ばれるＰＲＲＳＶの欧州株は、クローニングされ、配列決定されている（Meulen
berg et al., 1993, Virology, 192:62-72およびJ. Gen. Virol., 74:1697-1701
; Conzelmann et al., 1993, Virology, 193:329-339）。
【０００４】 ＰＲＲＳＶはArteriviridaeの新規なウイルスの科における単一属アルテリウ イルスに分類され、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ増強
ウイルス（ＬＤＶ）およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）が挙げられる（Plag
emann & Moennig, 1992, Adv. Virus. Res., 41:99-192; Godeny et al., 1993,
Virology, 194:585-596; 米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号およ
び第０８／３０１，４３５号明細書、およびCavanaugh D., 1997, Arch. Virol.
, 142:629-633）。この群の一本（＋）鎖ＲＮＡウイルスは、ゲノム構成、複製 法、形態学およびマクロファージ向性のような多くの特徴を共有している（Meul
enberg et al., 1993; 米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および 第０８／３０１，４３５号明細書）。無症状感染、および抗体産生が併存する持
続性ウイルス血症も、アルテリウイルスの独特な組織病理学的特性である。
【０００５】 抗原、遺伝子および病原変体は、ＰＲＲＳＶ単離体中に報告されている（Wens
voort et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest., 4:134-138; Mardassi et al.,
1994, J. Gen. Virol., 75: 681-685; 米国特許出願連続番号第０８／１３１， ６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。更に、米国および欧州のＰ
ＲＲＳＶは、２種類の異なる遺伝子型を有する（米国特許出願連続番号第０８／
１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。抗原変異性も、同
様に様々な北米単離体に存在している(Wensvoort et al., 1992)。顕著な病原性
の差は、米国と欧州の単離体の間だけでなく、異なる米国単離体中でも見られて
いる（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，
４３５号明細書）。
【０００６】 アルテリウイルスのゲノム構成は、複製がサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇｍＲＮＡ
）の３′−共末端ネステドセット(3'-coterminal nested set)の形成を伴う点に
おいてコロナウイルスおよびトロウイルスに類似している（Chen et al., 1993,
J. Gen. Virol., 74:643-660; Den Boon et al., 1990, J. Virol., 65:2910-2
920; De Vries et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18:3241-3247; Kuo et al.
, 1991, J. Virol., 65:5118-5123; Kuo et al., 1992; 米国特許出願連続番号 第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。幾つかの
北米単離体の部分配列も決定されている（米国特許出願連続番号第０８／１３１
，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書; Mardassi et al., 1994, J
. Gen. Virol., 75:681-685）。
【０００７】 ＰＲＲＳＶのゲノムはポリアデニル化されており、長さが約１５ｋｂであり、
８個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ; Meulenberg et al., 1993; 米 国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号
明細書）を含む。ＯＲＦ１ａおよび１ｂは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼをコー
ドするものと考えられる(Meulenberg et al., 1993)。ＯＲＦ５、６および７は 、それぞれグリコシル化膜タンパク質（Ｅ）、未グリコシル化膜タンパク質（Ｍ
）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）をコードすることが見出された(Meu
lenberg et al., 1995)。ＯＲＦ２〜４は、膜関連タンパク質の特徴を有すると 思われる（Meulenberg et al., 1993; 米国特許出願連続番号第０８／３０１， ４３５号明細書）。ＬＶのＯＲＦ２〜４は、それぞれＧＰ２、ＧＰ３およびＧＰ ４ と呼ばれるビリオン関連タンパク質をコードする(Van Nieuwstadt et al., 19
96, 70:4767-4772)。
【０００８】 ＯＲＦ５によってコードされたＥＡＶの主要なエンベロープ糖タンパク質はウ
イルス付着タンパク質であることがあり、中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は
このタンパク質に向けられている(de Vries, J. Virol., 1992; 66:6294-6303;
Faaberg, J. Virol., 1995; 69:613-617)。ＰＲＲＳＶの緊密に関連した要素で あるＬＤＶの主要なエンベロープタンパク質もＯＲＦ５によってコードされ、数
種類の異なる中和ＭＡｂがＯＲＦ５タンパク質を特異的に免疫沈降することが分
かった(Cafruny et al., Vir. Res., 1986; 5:357-375)。従って、ＯＲＦ５によ
ってコードされる主要なエンベロープタンパク質は、ＰＲＲＳＶに対する中和抗
体を誘導することがあると思われる。
【０００９】 ＯＲＦ５中の数種類の超可変領域を同定し、抗原性であると予想した（米国特
許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細
書）。ウイルスの抗原性変更は宿主免疫応答による変異体の直接的選択の結果で
あると提案されている（Domingo et al., J. Gen. Virol., 1993, 74:2039-2045
による概説）。従って、これらの超可変領域は、宿主の免疫選択圧力によるもの
と思われ、ＰＲＲＳＶ単離体中で抗原多様性が観察されることを説明することが
できる。
【００１０】 ＩＳＵ３９２７などの米国のＰＲＲＳＶ単離体のＭおよびＮタンパク質は、硬
度に保存される（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。Ｍ
およびＮタンパク質はＰＲＲＳＶビリオンの構造を保存する上で不可欠のもので
あり、Ｎタンパク質は機能的に厳しく制約を受けることがある。従って、（ａ）
ＭおよびＮタンパク質は主要抗体選択圧力に暴露されたり、または（ｂ）Ｍおよ
びＮタンパク質をコードすると思われるＯＲＦ６および７はウイルスビルレンス
に関与しているかまたはこれと相関しているとは思われない。しかしながら、興
味深いことには、ＬＤＶＭタンパク質の更に高度な配列変異が異なる神経ビルレ
ンスを有するＬＤＶ単離体の間で見られた(Kuo et al., 1992, Vir. Res., 23:5
5-72)。
【００１１】 ＯＲＦ１ａおよび１ｂは、フレームシフトによって単一タンパク質（ウイルス
ポリメラーゼ）に翻訳されることが予想される。ＯＲＦ２〜６は、ウイルス膜関
連タンパク質をコードすることができる。
【００１２】 ゲノムＲＮＡに加えて、多くの動物ウイルスは１種類以上のｓｇｍＲＮＡ種を
産生し、制御された仕方でウイルス遺伝子を発現させる。ＰＲＲＳＶに感染した
細胞では、３′共末端ネステドセット(3'-coterminal nested set)を表す７種類
のウイルス特異性ｍＲＮＡが合成される（ｍＲＮＡ１〜７、この順に大きさが減
少）。ｍＲＮＡ１はゲノムｍＲＮＡを表す。それぞれのｓｇｍＲＮＡは、ウイル
スゲノムの５′末端由来のリーダー配列を含む。
【００１３】 ｓｇｍＲＮＡの数は、アルテリウイルスの間で異なり、同一ウイルスの異なる
単離体の間でも異なる。ＥＡＶ感染細胞および欧州ＰＲＲＳＶ感染細胞では、６
個のｓｇｍＲＮＡのネステドセット(nested set)が検出された。しかしながら、
ＬＤＶ感染細胞では、ゲノムＲＮＡの他に、６個の（ＬＤＶ−Ｃ）または７個の
（ＬＤＶ−Ｐ）ｓｇｍＲＮＡのネステドセット(nested set)が含まれている。Ｌ
ＤＶ−Ｐの追加のｓｇｍＲＮＡ１−１は、ＯＲＦ１ｂの３′末端を含み、ウイル
スポリメラーゼのＣ−末端を表すタンパク質に潜在的に翻訳することができる。
ＬＤＶおよびＥＡＶのｓｇｍＲＮＡの配列分析は、リーダー−ｍＲＮＡ結合モチ
ーフが保存されることを示唆している。最近、欧州ＬＶのリーダー−ｍＲＮＡ結
合配列も、共通モチーフＵＣＡＡＣＣまたは硬度に類似した配列を含むことが示
された。
【００１４】 ｓｇｍＲＮＡは、ウシコロナウイルス（ＢＣＶ）および伝染性胃腸炎ウイルス
（ＴＧＥＶ）のような幾つかのコロナウイルスのビリオン中にパッケージされて
いることが示されている。しかしながら、別種のコロナウイルスであるマウス肝
炎ウイルス（ＭＨＶ）の精製ビリオンには、微量のｓｇｍＲＮＡしか検出されな
かった。ＰＲＲＳＶの関連性の高いウイルスであるＬＤＶのｓｇｍＲＮＡもビリ
オンにはパッケージされず、精製ＬＤＶビリオンにはゲノムＲＮＡしか検出され
なかった。
【００１５】 ＬＤＶおよびＥＡＶのｓｇｍＲＮＡは、詳細に特性決定されている。しかしな
がら、ＰＲＲＳＶ株、特に米国ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡに関する情報は極めて
限定されたものである。従って、米国ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡを更に完全に特
性決定する必要があると思われる。
【００１６】 ＭＨＶのパッケージングシグナルはＯＲＦ１ｂの３′末端に位置しており、従
ってＭＨＶのゲノムＲＮＡのみがパッケージされる。しかしながら、ＢＣＶおよ
びＴＧＥＶのｓｇｍＲＮＡは精製ビリオン中に見出されている。ＢＣＶおよびＴ
ＧＥＶのパッケージングシグナルは、決定されていない。アウラアルファウイル
スｓｇｍＲＮＡは、パッケージングシグナルがｓｇｍＲＮＡに存在すると思われ
るため、ビリオンに効率的にパッケージされる。シンドビスウイルス２６Ｓのｓ
ｇｍＲＮＡは、パッケージングシグナルが（ｓｇｍＲＮＡには存在せず）ゲノム
部分にあるので、ビリオンにはパッケージされない。
【００１７】 ｓｇｍＲＮＡの発生には、数種類の機構が関与している。コロナウイルスは、
ユニークなリーダーＲＮＡによって開始された転写機構であって、リーダーＲＮ
Ａであって、リーダーＲＮＡをゲノムの大きさの（−）鎖鋳型ＲＮＡの３′末端
から転写され、この鋳型から解離した後、下流の遺伝子間領域で鋳型ＲＮＡに再
結合して、ｓｇｍＲＮＡの転写を開始する機構を利用している。このモデルから
、５′リーダーがその３′末端に特異配列を含み、ＯＲＦ２〜７のそれぞれに先
行してゲノム中で更に下流で反復していることが予想される。リーダーは、ｓｇ
ｍＲＮＡのそれぞれの本体にリーダー−ｍＲＮＡ結合部分を介して結合している
。
【００１８】 ＰＲＲＳＶの様々な株が、続いて特性決定されている（Halbur et al., J. Ve
t. Diagn. Invest., 8:11-20 (1996); Meng et al., J. Vet. Diagn. Invest.,
8:374-381 (1996); Meng et al., J. Gen. Virol., 77: 1265-1270 (1996); Men
g et al., J. Gen. Virol., 76:3181-3188 (1995); Meng et al., Arch. Virol.
, 140:745-755 (1995); Halbur et al., Vet. Pathol., 32:200-204 (1995); Mo
rozov et al., Arch. Virol., 140: 1313-1319 (1995); Meng et al., J. Gen.
Virol., 75:1795-1801 (1994); Halbur et al., J. Vet. Diagn. Invest., 6:25
4-257 (1994); 上記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される
）。
【００１９】 ＰＲＲＳＶは、養豚施設(nursery)および離乳したブタの肺炎の重要な原因で ある。ＰＲＲＳＶは、養豚施設のブタの肺炎によりかなりの経済的損失を引起す
（その正確な程度は完全には知られていない）。ＰＲＲＳＶの比較的低ビルレン
ス株が初期に流行るため、過去数年間は生殖器疾患がＰＲＲＳＶ感染症の支配的
な臨床的結果であった。ＰＲＲＳＶの比較的高ビルレンス株が流行ってきている
ため、呼吸器疾患がＰＲＲＳＶに関連した主要な問題となってきた。様々なＰＲ
ＲＳＶ株によって引起される疾患から保護するためのワクチンが必要であると思
われる。
【００２０】 意外なことには、米国および世界的にも動物ワクチンの市場は、ヒトワクチン
の市場より大きい。従って、家畜を疾病から保護することによって誘導される実
質的な講習衛生上の利点の他に、新規な獣医用ワクチンの開発が経済的に奨励さ
れている。
【００２１】 発明の概要 従って、本発明の目的は、 配列番号： （ＩＳＵ−１２）または 配列番号： （ＩＳＵ−５５）を含むブタ生殖器および呼吸器症候群ウイル
ス（ＰＲＲＳＶ）をコードするＤＮＡ配列を提供することである。
【００２２】 本発明のもう一つの目的は、 配列番号： のヌクレオチド１９１〜７３８７（ＯＲＦ１ａ）、 配列番号： のヌクレオチド７３７５〜１１７５７（ＯＲＦ１ｂ）、 配列番号： のヌクレオチド１１７６２〜１２５２９（ＯＲＦ２）、 配列番号： のヌクレオチド１２３８５〜１３１１６（ＯＲＦ３）、 配列番号： のヌクレオチド１２９３０〜１３４６３（ＯＲＦ４）、 配列番号： のヌクレオチド１３４７７〜１４０７６（ＯＲＦ５）、 配列番号： のヌクレオチド１４０６４〜１４５８５（ＯＲＦ６）、および 配列番号： のヌクレオチド１４５７８〜１４９４６（ＯＲＦ７）を包含す
る、または
【００２３】 配列番号： のヌクレオチド１９１〜７６９９（ＯＲＦ１ａ）、 配列番号： のヌクレオチド７６５７〜１２００９（ＯＲＦ１ｂ）、 配列番号： のヌクレオチド１２０７４〜１２８４１（ＯＲＦ２）、 配列番号： のヌクレオチド１２６９７〜１３４５８（ＯＲＦ３）、 配列番号： のヌクレオチド１３２４２〜１３７７５（ＯＲＦ４）、 配列番号： のヌクレオチド１３７８９〜１４３８８（ＯＲＦ５）、 配列番号： のヌクレオチド１４３７６〜１４８９７（ＯＲＦ６）、および 配列番号： のヌクレオチド１４８９０〜１５２５８（ＯＲＦ７）を包含す
る ＩＳＵ−１２のＩＳＵ−５５のオープンリーディングフレームをコードするＤ
ＮＡ配列を提供することである。
【００２４】 また、本発明の目的は、ＩＳＵ−１２またはＩＳＵ−５５をコードするＤＮＡ
配列、またはそれらの１種類以上のＯＲＦによってコードされるポリペプチドを
提供することである。
【００２５】 更にもう一つの本発明の目的は、ＩＳＵ−１２またはＩＳＵ−５５の１種類以
上のＤＮＡ配列によってコードされる１種類以上のポリペプチドを含んでなるＰ
ＲＲＳＶに対する抗体を誘導する組成物を提供することである。
【００２６】 本発明のもう一つの目的は、ＩＳＵ−１２またはＩＳＵ−５５の１種類以上の
ＯＲＦのＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドの有効量をブタ生殖器ま
たは呼吸器疾患から保護する必要のあるブタに投与することによって、ブタを上
記疾患から保護する方法を提供することである。
【００２７】 更にもう一つの本発明の目的は、ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−５５株をＰＲＲＳＶの
他の株から識別する方法であって、 （ａ） 下記の２種類のプライマー ５５Ｆ ５′−ＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＣ−３′、および ３ＲＦＬＰ ５′−ＧＧＣＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＧ−３′ を用いてＰＲＲＳＶのＤＮＡ配列を増幅し、 （ｂ） 段階（ａ）の増幅した配列をＤｒａＩで消化し、 （ｃ） ６２６ｂｐ、１８７ｂｐおよび１３５ｂｐの３種類の制限断片をＰＲ
ＲＳＶ ＩＳＵ−５５株と相関させる ことを特徴とする、方法を提供することである。
【００２８】 上記および他の目的は、下記の好ましい態様の説明によって明らかになるもの
であり、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）のアイオワ株の
１種類以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされたタ
ンパク質、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ２によってコードされたタンパク質
と少なくとも９４％であるが１００％未満の相同性を有するタンパク質、ＰＲＲ
ＳＶのアイオワ株のＯＲＦ３によってコードされたタンパク質と少なくとも８８
％であるが１００％未満の相同性を有するタンパク質、ＰＲＲＳＶのアイオワ株
のＯＲＦ４と少なくとも９３％の相同性を有するタンパク質、ＰＲＲＳＶのアイ
オワ株のＯＲＦ５と少なくとも９０％の相同性を有するタンパク質、ＰＲＲＳＶ
のアイオワ株のＯＲＦ６およびＯＲＦ７の一方または両方によってコードされた
タンパク質と少なくとも９７％であるが１００％未満の相同性を有するタンパク
質、長さが少なくとも５アミノ酸でありかつブタ宿主中でＰＲＲＳＶ単離体によ
る攻撃に対して防御を効果的に刺激する上記タンパク質の抗原性領域、およびそ
れらの組合せからなる群から選択される精製および／または単離されたポリペプ
チド、上記のポリペプチドまたはポリペプチド類をコードする単離されたポリ核
酸、上記のポリヌクレオチドまたは（複数の）ポリペプチドの有効量を含んでな
るワクチン、上記のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに特異的に結合する抗
体、上記のものの産生法、および(i)ＰＲＲＳからブタを効果的に保護する、（i
i）ＰＲＲＳＶに暴露されたまたはＰＲＲＳに罹っているブタを治療する、およ び（iii）上記のものを用いてＰＲＲＳＶを検出する方法によって提供されたも のである。
【００２９】 好ましい態様の詳細な説明 本出願では、低ビルレンス単離体および「中」および高ビルレンスを有する４
種類の他のオイオワ株ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列を決
定した。様々なＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜７の比較に基づいて、既知の最小
ビルレンスの米国単離体（ＩＳＵ３９２７）は、ＯＲＦ２〜４には他の米国単離
体と比較して比較的高い配列変異がある。更に、ＯＲＦの配列の分析に基づけば
、米国ＰＲＲＳＶの主要な遺伝子型には少なくとも３種類の副遺伝子型(minor g
enotype)が存在する。
【００３０】 様々なＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ５タンパク質の配列分析は、非保存アミノ酸
置換を含む３種類の超可変領域を示している。これらの領域は、コンピューター
分析によって予想されたように、親水性でありかつ抗原性でもある。
【００３１】 本発明において、「ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス」または「ＰＲＲ
ＳＶ」は、ＰＲＲＳＶのアイオワ株、米国で発見された他のＰＲＲＳＶの株（例
えば、ＶＲ２３３２）、カナダで発見されたＰＲＲＳＶの株（例えば、ＩＡＦ−
ｅｘｐ９１）、欧州で発見されたＰＲＲＳＶの株（例えば、レリスタッドウイル
ス、ＰＲＲＳＶ−１０）、およびこれまでに出現しかつ将来に出現するこれらの
ウイルスの関連性の高い変異株などのＰＲＲＳ、ＰＥＡＲＳ、ＳＩＲＳ、ＭＳＤ
、および／またはＰＩＰ（「ＰＩＰ」という用語は現在では用いられなくなって
いる）といった疾患を引起すウイルスを表す。
【００３２】 ＰＲＲＳＶの「アイオワ株」としては、（ａ）本発明者らによってアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)に寄
託された、および／または本願明細書および／または先行米国特許出願連続番号
第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書のいずれかに
記載されているＰＲＲＳＶ単離体、（ｂ）ＣＲＬ１１１７１細胞中で培養または
これを通過させるときに６種類を上回るｓｇｍＲＮＡを産生するＰＲＲＳウイル
ス、（ｃ）感染から１０日後に５週齢のカエサリアン(caesarean)由来の初乳を 欠失した子ブタに少なくとも４０％の総肺病変または肺硬化を生じるＰＲＲＳＶ
、（ｄ）下記の表２に記載のＰＲＲＳＶ ＯＲＦへの相同性が最小限であるタン
パク質をコードするゲノムを有するＰＲＲＳＶ単離体、および／または（ｅ）こ
のようなウイルスを識別する特徴を有する任意のＰＲＲＳＶが挙げられる。
【００３３】 本発明のワクチンがブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に
よる感染からブタを保護する場合には、このワクチンは有効である。ワクチンを
感染していないブタに投与した後、生物学的に純粋なウイルス単離体（例えば、
ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６または下記の他のウイルス単離体）を接種したとき
、保護されていない同様なブタで単離体によって典型的に引起される変化や症状
と比較して（すなわち、適当な対照物に対して）、疾患のあらゆる総体的または
組織病理学的変化（例えば、肺の病巣）および／または症状が軽くなる場合には
、このワクチンはＰＲＲＳＶによる感染からブタを保護する。更に具体的には、
本発明のワクチンは、ワクチン投与を必要としている１頭以上の適当なブタに投
与した後、適当な時間（例えば、１〜４週）の後、生物学的に純粋なＰＲＲＳＶ
単離体の大きな試料（１０３〜７ＴＣＩＤ５０）を接種することによって有効で
あることを示すことができる。次に、血液試料を接種したブタから約１週間後に
採取し、血液試料からウイルスを単離する試みを行う（例えば、下記の実験VIII
に示したウイルス単離手続きを参照）。ウイルスが単離されれば、ワクチンが有
効でない可能性があることを示唆しており、ウイルスを単離することができなけ
れば、ワクチンが有効である可能性があることを示唆している。
【００３４】 従って、本発明のワクチンの有効性を定量的に（すなわち、適当な対照群と比
較して硬化した肺組織の比率の減少）または定性的に（例えば、血液からのＰＲ
ＲＳＶの単離、免疫ペルオキシダーゼ分析法（下記）による肺、扁桃またはリン
パ組織試料でのＰＲＲＳＶ抗原の検出など）評価することができる。ブタ生殖器
および呼吸器疾患の症状は、定量的（例えば、体温／熱）、半定量的（例えば、
呼吸困難の程度（下記に詳細に説明）、または定性的（例えば、１以上の症状の
存在または非存在、またはチアノーゼ、肺炎、心および／または脳の病変の様な
１種類以上の症状の緩快など）に評価することができる。
【００３５】 未感染ブタは、ブタ生殖器および呼吸器疾患感染性物質に暴露されたことがな
い、またはブタ生殖器および呼吸器疾患感染性物質に暴露されたことがあるがこ
の疾患の症状を示さないブタである。感染ブタは、ＰＲＲＳの症状を示す、また
はＰＲＲＳＶを単離することができるブタである。
【００３６】 ＰＲＲＳの臨床的兆候または症状としては、嗜眠、呼吸困難、「サンピング(t
humping)」（強制呼気）、熱、ヘアコートの荒れ(roughened haircoats)、くし ゃみ、咳、眼浮腫(eye edema)、および場合によっては結膜炎を挙げることがで きる。病変としては、総体的および／または微視的肺病変、心筋炎、リンパ節炎
、脳炎および鼻炎を挙げることができる。更に、ＰＲＲＳＶおよびアイオワ株の
余りビルレンスが高くないおよび非ビルレンス形態であって、上記症状のサブセ
ットを引起すことができるかまたは症状を全く引起さないものも見出されている
。ＰＲＲＳＶの余りビルレンスが高くないおよび非ビルレンス形態は、それでも
なお本発明に従って用いてブタ生殖器および呼吸器疾患から保護することができ
る。
【００３７】 「ポリ核酸」という用語は、ウイルスまたは感染性物質から単離されたＲＮＡ
またはＤＮＡに相当するまたは相補性のＲＮＡまたはＤＮＡ、並びにｍＲＮＡお
よびｃＤＮＡを表す。「ＯＲＦ」とは、ＰＲＲＳＶゲノムなどのウイルスゲノム
から単離されたオープンリーディングフレームまたはポリペプチドコードセグメ
ントを表す。本発明において、ＯＲＦは、部分（画分として）または全体が包含
され、かつ隣接ＯＲＦの５′−または３′−配列（例えば、下記の図１および実
験１を参照）と重複することができる。「ポリヌクレオチド」はポリ核酸と同等
であるが、特有の分子または分子の群を定義することがある（例えば、ポリ核酸
の群のサブセット）。
【００３８】 下記の実験において、（ａ）低ビルレンス米国ＰＲＲＳＶ単離体および（ｂ）
様々なビルレンスの他の２種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜５の単離、
クローニングおよび配列決定を行った。これら３種類のヌクレオチドおよびアミ
ノ酸の推定配列を、他の既知のＰＲＲＳＶ単離体の相当する配列と比較した（例
えば、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書を参照）。これら
の結果は、かなりの遺伝子変異が米国ＰＲＲＳＶと欧州ＰＲＲＳＶとの間だけで
なく、米国単離体でも見られることを示している。
【００３９】 検討を行った７種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体間のアミノ酸配列アイデンティテ
ィーは、ＯＲＦ２では９１〜９９％であり、ＯＲＦ３では８６〜９８％であり、
ＯＲＦ４では９２〜９９％であり、ＯＲＦ５では８８〜９７％であった。既知の
最小ビルレンス米国単離体（ＩＳＵ３９２７）は、他の米国単離体と比較して、
ＯＲＦ５〜７よりもＯＲＦ２〜４での配列変異が高い。抗原ポテンシャルを有す
る３種類の超可変領域は、ＯＲＦ５によってコードされる主エンベロープ糖タン
パク質で同定されている。
【００４０】 ＯＲＦ２〜７の配列の対方式の比較および系統樹分析は、米国ＰＲＲＳＶの主
遺伝子型内では少なくとも３群のＰＲＲＳＶ変異体（または副遺伝子型(minor g
enotype)）が存在することを示していた。既知の最小ビルレンス米国単離体は、
異なるビルレンスを有する他の米国単離体とは異なる枝を形成する。この研究の
結果は、ＰＲＲＳＶおよびワクチン開発の分類学に関連を有する。
【００４１】 もう一つのの実験では、ＰＲＲＳＶに感染した細胞のｓｇｍＲＮＡを特性決定
した。データーは、６または７個のｓｇｍＲＮＡの３′共末端ネステドセット(3
'-coterminal nested set)がＰＲＲＳＶの様々な単離体を感染させた細胞に形成
されることを示していた。しかしながら、幾つかのコロナウイルスおよびアルフ
ァウイルスとは異なり、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡはビリオン中にはパッケージ
されず、ＰＲＲＳＶのゲノムＲＮＡのみが精製ビリオンに検出された。様々なビ
ルレンスを有する様々なＰＲＲＳＶ単離体では、ｓｇｍＲＮＡの数の変異も観察
された。２種類の米国単離体のＯＲＦ２〜７を更に配列分析し、それらを欧州Ｌ
Ｖと比較すると、ＰＲＲＳＶのリーダー−ｍＲＮＡの不均一性が明らかになる。
【００４２】 下記の実験２に示すように、６個以上のｓｇｍＲＮＡの３′共末端ネステドセ
ット(3'-coterminal nested set)がＰＲＲＳＶの様々な単離体を感染させた細胞
に形成される。ｓｇｍＲＮＡのネステドセット(nested set)の存在は、欧州単離
体であるレリスタッドウイルス（ＬＶ）と同様に米国ＰＲＲＳＶはＬＤＶ、ＥＡ
ＶおよびＳＨＦＶなどの新規に提案されたArteriviridae科に属することを示し ている。ＯＲＦ特異性プローブを用いるノーザンブロット分析は、ＰＲＲＳＶｓ
ｇｍＲＮＡの構造はポリシストロン性であり、ｓｇｍＲＮＡ７を除くｓｇｍＲＮ
Ａのそれぞれが多重ＯＲＦを含むことを示している。従って、それぞれのｓｇｍ
ＲＮＡの配列は隣接するより大きなｓｇｍＲＮＡの３′部分内に含まれ、ｓｇｍ
ＲＮＡの総ての５′末端がより小さなｓｇｍＲＮＡの配列とは重なり合わない。
【００４３】 しかしながら、ｓｇｍＲＮＡの数とウイルス肺炎ビルレンスとの間には明確な
相関はない。追加種のｓｇｍＲＮＡ３−１は、その５′末端に４５アミノ酸のコ
ード容量を有する小さなＯＲＦ（ＯＲＦ３−１）を含むことが見出された。
【００４４】 下記の実験２では、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡはビリオン中にパッケージされ
ないことが示されている。ｓｇｍＲＮＡがビリオンにパッケージされるかどうか
は、ｓｇｍＲＮＡがパッケージングシグナルを有するかどうかによって変化する
ことがある。ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡはビリオン中にパッケージされないので
、ＰＲＲＳＶのキャプシド化シグナルはウイルスゲノムにとってユニークである
が、ｓｇｍＲＮＡには存在しないＯＲＦ１領域に局在していると思われる。
【００４５】 下記の実験２では、ＰＲＲＳＶの２種類の米国単離体ＩＳＵ７９およびＩＳＵ
１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４の接合部分（リーダー−ｍＲＮＡ接合配列）
を決定する。リーダー−ｍＲＮＡ接合配列アイデンティティーの情報により、（
ａ）感染性クローンおよび／またはワクチンとして用いられるキメラウイルス、
および（ｂ）１個以上の遺伝子を適当な感染可能な宿主に挿入または「往復」さ
せるためのベクターを効果的に産生するための手段が提供される。このようなキ
メラウイルス、感染性クローンおよびベクターを設計し、産生する方法は、既知
である（例えば、Sambrook et al., 「分子クローニング：実験室便覧(Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual)」，第２版, Cold Spring Harbor Laboratory
, コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨークを参照）。
【００４６】 ２個の単離体のｓｇｍＲＮＡ３および４のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列は異な
っている（ＩＳＵ７９のｍＲＮＡ３−１についてはＴＴＧＡＣＣ、ｍＲＮＡ３に
ついてはＧＴＡＡＣＣ、およびｍＲＮＡ４についてはＴＴＣＡＣＣ）。接合部に
おけるヌクレオチドの差のほとんどは、最初の３個のヌクレオチドに存在する。
最後の３個のヌクレオチドは不変であり、リーダー配列のｓｇｍＲＮＡの本体へ
の結合はリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の５′末端内で起こることを示唆している
。同様な観察は、ＬＶ、ＥＡＶおよびＬＤＶについても報告されている。
【００４７】 単離体ＩＳＵ７９における追加のｓｇｍＲＮＡ３−１の獲得は、新規なリーダ
ーｍＲＮＡ接合配列を生成する単一ヌクレオチド置換によるものである。この置
換は接合部分の最後のヌクレオチドで起こり、リーダー−ｍＲＮＡ接合モチーフ
の最後のヌクレオチドはリーダーの結合および転写の開始にとって重要であるこ
とを示唆している。
【００４８】 リーダーとコロナウイルスの遺伝子間領域との配列の相同性から、塩基対形成
がリーダーによって開始される転写に必須であるという仮説が導かれたが、ｓｇ
ｍＲＮＡの転写において塩基対形成が必要であるということの実験的証明は報告
されていない。例えば、融合工程に関与するコロナウイルスおよびアルテリウイ
ルスのいずれにおいてもリーダーの３′末端の配列は知られていないのである。
【００４９】 数種類の証明法がコロナウイルスについてのリーダー開始転写機構を支持して
いるが、コロナウイルスに感染した細胞にマイナス鎖ｓｇｍＲＮＡおよびｓｇ複
製中間体（ｓｇＲＩ）が存在することは、ｓｇｍＲＮＡ合成に関与する機構がリ
ーダー配列の接合配列との単なる塩基対形成より複雑であることを示唆している
。しかしながら、マイナス鎖ｓｇｍＲＮＡはＬＤＶを除きアルテリウイルスには
検出されておらず、ｓｇＲＩはＥＡＶに感染した細胞だけに検出されている。従
って、アルテリウイルス、特にＰＲＲＳＶにおけるｓｇｍＲＮＡ合成は、コロナ
ウイルスより複雑でなくなる可能性がある。
【００５０】 ２種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜７の配列合成およびこれらの配列
とＬＶとの比較により、リーダー−ｍＲＮＡ接合配列の不均一性が明らかになっ
ている。ｓｇｍＲＮＡに相当しない位置にリーダー−ｍＲＮＡ接合モチーフが存
在すると、ＰＲＲＳＶおよび他のアルテリウイルスのゲノムのリーダーおよび接
合配列に保存されている６ヌクレオチドのみの短い伸張が、リーダーがＯＲＦの
上流のこれらの特異的接合部位へ効率的に結合するのに十分であるかどうかにつ
いて疑問が生じる。しかしながら、この明確な矛盾は、下記の２つの可能性によ
って説明することができる。
【００５１】 第一に、二次構造またはリーダー−ｍＲＮＡ接合部分の周りの配列のような追
加的構造要素は、リーダーの特異的部位への融合（結合）に関与していることが
予想される。ＭＨＶでは、ＵＣＵＡＡＡＣのコンセンサス配列（リーダー−ｍＲ
ＮＡ接合配列）に隣接する配列がｓｇＤＩＲＮＡ転写の効率に影響を与え、かつ
コンセンサス配列がＤＩｍＲＮＡの合成に必要であるが、単独では十分でないこ
とが示されている。
【００５２】 第二に、２つのリーダー−ｍＲＮＡ接合領域の距離がｓｇｍＲＮＡの転写に影
響することがある。下流のリーダー−ｍＲＮＡ接合領域は上流のリーダー−ｍＲ
ＮＡ接合領域からのＭＨＶのｓｇＤＩＲＮＡ合成を抑制していることが明らかに
されている。２個のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の分離が３５ヌクレオチド未満
であるときには、抑制は有意であった。しかしながら、２個のリーダー−ｍＲＮ
Ａ接合領域が１００を上回るヌクレオチドによって分離されているときには、（
上流のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列からの）より大きなｓｇＤＩＲＮＡ合成の有
意な阻害は見られなかった。
【００５３】 以前に報告されている実験結果は、下記の実験２に記載の観察結果と一致して
おり、ｓｇｍＲＮＡ４の他にｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種がＰＲＲＳＶ単離体の
幾つかに見られる。ＰＲＲＳＶのアイオワ株におけるｓｇｍＲＮＡ４および３−
１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列は、約２２６ヌクレオチドだけ離れている。従
って、上流のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列からのより大きなｓｇｍＲＮＡ３−１
の合成は、下流のリーダー−ｍＲＮＡ４接合配列の存在によって抑制されない。
【００５４】 対照的に、マルチ・ポテンシャル・リーダー−ｍＲＮＡ接合配列(multiple po
tential leader-mRNA junction sequences)はＯＲＦ３、５、６および７の上流 の様々な位置に見出されているが、ノーザンブロット分析ではこれらのリーダー
−ｍＲＮＡ接合モチーフに相当するｓｇｍＲＮＡはなかった。これらのリーダー
−ｍＲＮＡ接合配列のほとんどは、ＯＲＦ７（ポテンシャル・リーダー−ｍＲＮ
Ａ接合配列(potential leader-mRNA junction sequences)は１１４ヌクレオチド
だけ離れている）を除き、下流のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列から５０ヌクレオ
チド未満だけ離れている。しかしながら、ノーザンブロット分析でのｓｇｍＲＮ
Ａ７は、広汎な広がりのバンドを示した。従って、上流のリーダー−ｍＲＮＡ接
合配列からのより大きなｓｇｍＲＮＡ７の転写は、下流の接合配列によって余り
抑制されないことがあるが、これはノーザンブロット分析により多量に存在する
ｓｇｍＲＮＡ７からは容易には識別されない。
【００５５】 プラーク精製したＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ−１２（１９９２年１０月３０日に
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Col
lection)、１２３０１パークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド２０
８５２、米国に登録番号ＶＲ２３８５［プラーク精製３回］およびＶＲ２３８６
［プラーク精製なし］で寄託）のＯＲＦ２〜７、およびＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ
−２２、ＩＳＵ−５５、ＩＳＵ−３９２７（１９９３年９月２９日にアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)にそ
れぞれＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０およびＶＲ２４３１の登録番号で寄託）のＯ
ＲＦ６〜７、ＩＳＵ−７９およびＩＳＵ−１８９４（１９９４年８月３１日にア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collect
ion)にそれぞれＶＲ２４７４およびＶＲ２４７５の登録番号で寄託）は、米国特
許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書に詳細に記載されている。しか
しながら、これらの遺伝子の単離、クローニングおよび配列決定に用いられる手
法は、あらゆるＰＲＲＳＶのゲノムポリ核酸の単離、クローニングおよび配列決
定にも応用することができる。従って、本発明は、下記の実験に開示されている
特定の配列に限定されない。
【００５６】 例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡを比較的多量に製造するための（
および、所望ならば、転写によりＲＮＡをおよび／または既知のイン・ビボまた
はイン・ビトロ法に準じて翻訳によりタンパク質を製造するプライマーは、ＰＲ
ＲＳＶゲノムから得られた２以上の配列が決定されている配列情報（例えば、Ｖ
Ｒ２３８５、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＶＲ２４３１、ＶＲ２４７４、ＩＳ
Ｕ−１８９４、ＶＲ２３３２およびレリスタッドウイルスのＯＲＦ２〜７）に基
づいて設計することができる。少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％
のアイデンティティーを有する長さが約１５〜５０ヌクレオチドの領域を、決定
された配列から選択する。欠失が（例えば、少なくとも５ヌクレオチドの）配列
の１つに起こる領域を、ＰＲＲＳＶの１つの株または型のポリ核酸をもう一つの
ものと比較して選択的に増幅するための（例えば、北米および欧州株のＰＲＲＳ
Ｖの差別的診断のための）選択的プライマーの製造の基礎として用いることがで
きる。
【００５７】 ゲノムポリ核酸が、既知の方法によって一旦増幅されて、適当な宿主にクロー
ニングされると、クローンは本明細書に開示した配列情報に基づいて設計したプ
ローブでスクリーニングすることができる。例えば、長さが約５０〜５００ヌク
レオチドの領域を２個以上の配列（例えば、下記の実験IIIに開示されているＰ ＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ６〜７）の高度のアイデンティティー（例えば、
少なくとも９０％）に基づいて選択し、適当な長さおよび配列アイデンティティ
ーのポリヌクレオチドを既知の方法（例えば、選択された領域を含むポリ核酸か
らの適当な断片の自動合成、または制限、ポリヌクレオチドに特異的にハイブリ
ダイズするプライマーを用いるＰＣＲぞうふく、および電気泳動による単離）に
よって製造することができる。ポリヌクレオチドは、例えば３２Ｐ（放射測定）
またはビオチン（蛍光測定法による検出）で標識することができる。このプロー
ブを、次にクローンのポリ核酸とハイブリダイズさせ、既知の方法によって検出
する。
【００５８】 本発明者らは、ＯＲＦ２〜４の１個以上をＰＲＲＳＶのビルレンスに関連づけ
ることができることを見出した。例えば、ビルレンスが比較的低いＰＲＲＳＶの
少なくとも１個の単離体は、ＯＲＦ４に欠失を有するとも考えられる（例えば、
米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の実験VIII〜XI参照）。
更に、ビルレンスが最低の既知の単離体（ＶＲ２４３１）は、他の米国ＰＲＲＳ
Ｖ単離体と比較してＯＲＦ２〜４におけるヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報
において比較的高度の分散を示す。従って、１態様では、本発明はＶＲ２４３１
のＯＲＦ２〜４に関連したポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。
【００５９】 もう一つの態様では、本発明は、次にＰＲＲＳＶによるチャレンジに対して直
接または間接的に免疫原的に保護するＰＲＲＳＶ単離体から得たポリ核酸であっ
て、ポリ核酸を含むＰＲＲＳＶを低ビルレント（すなわち、「低ビルレンス」（
ｌｖ）表現型、米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書における
相当する説明を参照）または非ビルレント（いわゆる「欠失変異体」）とする程
度まで欠失または変異したポリ核酸に関する。好ましくは、ＯＲＦ２〜４の１種
類以上は、ＰＲＲＳウイルスを非ビルレントにする程度まで欠失または変異して
いる。しかしながら、本発明のポリ核酸のＯＲＦ２〜４の１個以上の領域であっ
て、(i)抗原および／または免疫保護ペプチド断片をコードし、（ii）ポリ核酸 を含むＰＲＲＳウイルスにはビルレンスを付与しない領域を保持するのが望まし
い。
【００６０】 本発明は、ＰＲＲＳＶ自体であって、ＯＲＦ２〜４の１個以上が低ビルレント
または非ビルレントとする程度まで欠失または変異しているもの（例えば、ＶＲ
２４３１）も包含する。このようなウイルスは、ワクチンとしてまたは適当な宿
主（例えば、ＭＡ−１０４、ＰＳＰ３６、ＣＲＬ１１１７１、ＭＡＲＣ−１４５
、またはブタ肺胞マクロファージ細胞）を外来遺伝子で形質転換するベクターと
して用いられる。本発明の欠失変異体を用いて発現することができる好ましい異
種遺伝子としては、タンパク質またはブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス抗
原以外の抗原（例えば、仮性狂犬病および／またはブタインフルエンザウイルス
タンパク質および／またはポリペプチド含有抗原、ブタ成長ホルモンなど）、ま
たはポリペプチドを基剤とするアジュバント（例えば、ワクチン組成物について
米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書に記載されているもの）
をコードするものが挙げられる。
【００６１】 本発明のポリ核酸のある種の態様では、ＰＲＲＳＶＯＲＦの３′末端領域（例
えば、長さが２００〜７００ヌクレオチド）であって、その少なくとも一部が直
ぐ下流のＯＲＦの５′領域と重複することがあるものを含むことも望ましい。同
様に、ＯＲＦの３′末端領域が直ぐ下流のＯＲＦの５′末端領域と重複する場合
には、直ぐ下流のＯＲＦと重複するＯＲＦの５′領域を保持することが望ましい
ことがある。
【００６２】 本発明者らは、ＰＲＲＳＶゲノムにおけるＯＲＦ５が、ＰＲＲＳＶに感染した
まま培養物を支持することができる哺乳類宿主細胞でのウイルスの複製に関係し
ていると思われることも見出した。従って、本発明は、ＰＲＲＳＶゲノムから得
たポリ核酸であって、ＯＲＦ５が多重コピー（いわゆる「過剰生産変異体」）に
存在することがあるものに関する。例えば、本発明のポリ核酸は、高複製（ｈｒ
）表現型ＰＲＲＳＶ単離体からの少なくとも２個の、更に好ましくは２〜１０個
のＯＲＦ５のコピーを含むことができる。
【００６３】 興味深いことには、ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ−１２はＯＲＦ５の５′末端付近
に意外なほど多数のポテンシャル開始コドン（ＡＴＧ／ＡＵＧ配列）を有してお
り、この遺伝子の交互開始部位を示していると思われる。従って、ＰＲＲＳＶ単
離体のＯＲＦ５によってコードされるタンパク質の交互形態が、特に交互ＯＲＦ
が実験的に決定されたものと同様な分子量を有するタンパク質（例えば、長さが
約１５０〜約２５０アミノ酸の）をコードする場合に、存在することができる。
ＩＳＵ−１２のＯＲＦ５に対する最も可能性のあるコード領域を、図１に示す。
【００６４】 既知の方法に従って、欠失および過剰生産変異体を製造することができる。例
えば、ポリ核酸変異体であって、ポリペプチドをコードする領域の配列に「サイ
レント」または縮重変化を含むものを製造することができる。適当な縮重突然変
異を選択し、作成することによって、既知の制限酵素によって認識されるポリ核
酸配列を置換することができる（例えば、下記の実験２参照）。従って、ＯＲＦ
の３′末端および下流のＯＲＦの５′末端の１または２つでサイレント縮重突然
変異を行うと、ｈｒＯＲＦ５タンパク質生成物、ＰＲＲＳＶまたは他のウイルス
エンベロープタンパク質および／またはＰＲＲＳＶタンパク質の抗原性断片の１
または多数のコピーをコードするポリ核酸を含むことがある合成ポリ核酸（いわ
ゆる「カセット」）を挿入することができる。この「カセット」には適当な開始
コドン（ＡＴＧ）が先行することがあり、３′末端における終止コドン（ＴＡＡ
、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で適当に終結することができる。ポリペプチドをコード
しないオリゴヌクレオチド配列を挿入することができ、あるいはカセットを挿入
することができないのは勿論である。これにより、いわゆる欠失変異体を提供す
ることができる。
【００６５】 本発明は、ＶＲ２４３１のＯＲＦによってコードされるポリペプチドの領域お
よび位置であって、この単離体の低ビルレンスに関与することがあるものにも関
する。従って、本発明の単離しおよび／または精製したポリペプチドは、ＰＲＲ
ＳＶのＯＲＦ２、３および４の１個以上の「低ビルレンス突然変異によってコー
ドされたもの（またはその低ビルレンス断片であって、長さが少なくとも５アミ
ノ酸であるもの）であって、ＯＲＦ２によってコードされるポリペプチドの１２
〜１４位の１個以上がＲＧＶ（但し、「Ｒ」、「Ｇ」および「Ｖ」は相当するア
ミノ酸に対する１文字略号である）であり、４４〜４６位がＬＰＡであり、８８
位がＡであり、９２位がＲであり、１４１位がＧであり、１８３位がＨであり、
２１８位がＳであり、２４０位がＳであり、２５２〜２５６位がＰＳＳＳＷであ
るもの、またはそれらの組合せであることができる。上記のアミノ酸位置アイデ
ンティティーの１個以上と更に組合わせることができる他のアミノ酸残基アイデ
ンティティーとしては、１７４位（Ｉ）および２３５位（Ｍ）のものが挙げられ
る。
【００６６】 本発明の単離しおよび／または精製したポリペプチドは、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ
３によってコードされたものであって、上記アミノ酸アイデンティティーの１以
上を１１（Ｌ）、２３（Ｖ）、２６〜２８（ＴＤＡ）、６５〜６６（ＱＩ）、７
０（Ｎ）、７９（Ｎ）、９３（Ｔ）、１００〜１０２（ＫＥＶ）、１３４（Ｋ）
、１４０（Ｎ）、２２３〜２２７（ＲＱＲＩＳ）、２３４（Ａ）および２３５（
Ｍ）位のものまたはそれらの任意の組合せから選択することができ、これは更に
３２（Ｆ）、３８（Ｍ）、９６（Ｐ）、１４３（Ｌ）、２１３〜２１７（ＦＱＴ
Ｓ）、２３１（Ｒ）および２５２（Ａ）位の１以上と組合わせることもできる。
【００６７】 本発明の単離しおよび／または精製したポリペプチドは、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ
４によってコードされたものであって、上記アミノ酸アイデンティティーの１以
上を１３（Ｅ）、４３（Ｎ）、５６（Ｇ）、５８〜５９（ＴＴ）、１３４（Ｔ）
，１３９（Ｉ）位のものまたはそれらの任意の組合せから選択することができ、
これは更に２〜３（ＡＡ）、５１（Ｇ）および６３（Ｐ）位の１以上と組合わせ
ることもできる。
【００６８】 本発明は、ＶＲ２４３１のＯＲＦ２〜４の任意の１個によってコードされるポ
リペプチドの５個以上のアミノ酸、好ましくは１０個以上のアミノ酸であって全
長までのポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、上記３
節で詳細に説明したアミノ酸位置に相当する（複数の）コドンにおけるポリヌク
レオチドをＶＲ２４３１の相当するＯＲＦによってコードされるタンパク質の相
当するアミノ酸をコードするポリヌクレオチドで置換したものにも関する。
【００６９】 本発明のもう一つの態様では、ポリ核酸は、ＰＲＲＳＶの１個以上のタンパク
質、またはその抗原領域をコードする。好ましくは、本発明の核酸は、ＰＲＲＳ
Ｖ膜（エンベロープ）タンパク質の少なくとも１個の抗原領域をコードする。更
に好ましくは、本発明のポリ核酸は、ＯＲＦ５ＰＲＲＳＶタンパク質生成物（下
記の説明を参照）からの超可変領域をコードし、または（ｂ）ＰＲＲＳＶの高ビ
ルレンス（ｈｖ）表現型の単離体からのＯＲＦ−５遺伝子の少なくとも１コピー
（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書における「ｈｖ表現型
」の説明を参照）、およびＰＲＲＳＶ単離体のゲノムからのＯＲＦ−２、ＯＲＦ
−３、ＯＲＦ−４、０ＲＦ−５および／またはＯＲＦ−６の少なくとも１個の十
分に長い断片、領域または配列を含み、（複数の）相当するタンパク質の抗原領
域をコードしかつｈｖ表現型ＰＲＲＳＶ単離体などによる次のチャレンジに対す
る防御を効果的に刺激する。
【００７０】 更に好ましくは、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ−２、ＯＲＦ−３、ＯＲＦ−５および／
またはＯＲＦ−６によってコードされる少なくとも１個の全エンベロープタンパ
ク質が本発明のポリ核酸に含まれ、本発明のポリ核酸はＰＲＲＳＶからのＯＲＦ
２〜４の１個の十分に長い部分を除外しまたは修飾して、これを含むＰＲＲＳＶ
を低ビルレントまたは非ビルレントとする。最も好ましくは、ポリ核酸はＰＲＲ
ＳＶのアイオワ株の単離体（例えば、ＶＲ２３８５（３回プラーク精製したＩＳ
Ｕ−１２）、（非プラーク精製ＩＳＵ−１２）、ＶＲ２４２８（ＩＳＵ−５１）
、ＶＲ２４２９（ＩＳＵ−２２）、ＶＲ２４３０（ＩＳＵ−５５）、ＶＲ２４３
１（ＩＳＵ−３９２７）、ＶＲ２４７４（ＩＳＵ−７９）および／またはＩＳＵ
−１８９４）のゲノムから単離される。
【００７１】 本発明の更に好ましい態様としては、ＰＲＲＳＶ、好ましくはＰＲＲＳＶのア
イオワ株の超可変領域からのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが挙げ
られる。従って、このようなポリヌクレオチドは、下記のアミノ酸配列の１個（
以上）をコードする。
【表１】
【００７２】 この態様では、３２〜３８、５７〜６６および／または１２０〜１２８位の超
可変領域の１以上が包含されている限り、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５の他のアミノ酸配
列（図３または米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号または第０８／
３０１，４３５号明細書に開示）をコードすることができる（本発明は、特にＬ
ＶおよびＶＲ２３３２のＯＲＦ５のタンパク質およびポリヌクレオチドを除外す
る）。
【００７３】 本発明の更に好ましい態様は、式（Ｉ）または（II） ５′−α−β−３′ （Ｉ） ５′−α−β−γ−３′ （II） （式中、αは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ２、３および４、およびこのよ
うな抗原性および／または低ビルレンス断片をコードするその領域からなる群か
ら選択されるポリヌクレオチドによってコードされる少なくとも１個のポリペプ
チドまたはその抗原性または低ビルレンス断片をコードし、βは、ＰＲＲＳＶの
アイオワ株由来のＯＲＦ５の少なくとも１コピーまたはその抗原性断片（例えば
、１以上の超可変領域）、好ましくは高複製（ｈｒ）表現型由来の完全長コピー
であり、γは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ６およびＯＲＦ７および抗原性
断片をコードするその領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドによって
コードされる少なくとも１個のポリペプチドまたはその抗原性断片をコードする
）の配列を有するポリ核酸を含んでなる、から本質的になる、またはからなるこ
とができる精製製剤に関する。
【００７４】 あるいは、本発明は、式（III） ５′−β−δ−γ−３′ （III） （上記式中、 βおよびγは上記に定義されたとおりであり、δは共有結合またはポリ核酸の
転写および／または翻訳に実質的に影響を及ぼさない結合性ポリ核酸である）の
配列を有するポリ核酸を含んでなる、から本質的になる、またはからなることが
できる精製製剤に関することができる。好ましくは、βは、ＰＲＲＳＶのアイオ
ワ株のＯＲＦ５によってコードされたタンパク質の少なくとも１個の超可変領域
をコードするポリヌクレオチドであり、更に好ましくは、ＰＲＲＳＶのアイオワ
株のＯＲＦ５によってコードされる全長タンパク質をコードする。
【００７５】 本発明は、式（IV） ５′−α−β−δ−γ−３′ （IV） （上記式中、α、β、γおよびδは、上記式（Ｉ）〜（III）で定義したとおり である）の配列を有するポリ核酸を含んでなる、から本質的になる、またはから
なることができる精製製剤に関することができる。
【００７６】 本発明は、式（Ｖ） ５′−ε−ζ−ι−κ−ξ−３′ （Ｖ） （上記式中、 εは、場合によっては含まれており、ポリヌクレオチドα、β、γおよびδを
操作上発現する手段を提供する５′末端ポリヌクレオチド配列であり、ζは式Ｋ
ＴＶＡＣＣ（式中、ＫはＴ、ＧまたはＵであり、ＶはＡ、ＧまたはＣである）の
ポリヌクレオチドであり、ιは長さがせいぜい約１３０（好ましくは、せいぜい
１００）のポリヌクレオチドであり、κは通常のマーカーまたはレポーター遺伝
子α、β、γおよびそれらの操作結合した組合せからなる群から選択される１個
以上の遺伝子を含んでなるポリヌクレオチドであり、但し、α、βおよびγは上
記の式（Ｉ）〜（IV）において定義した通りであり、ξは、場合によっては含ま
れており、ポリヌクレオチドα、β、γおよびδの操作発現を抑制せずかつ（例
えば、プラスミド中の）εに操作結合することができる３′末端ポリヌクレオチ
ド配列である）の配列を有するポリ核酸発現ベクターまたはプラスミドを含んで
なる、から本質的になる、またはからなることができる精製製剤に関することも
できる。
【００７７】 適当なマーカーまたはレポーター遺伝子としては、例えば、ネオマイシン、エ
リスロマイシンまたはクロラムフェニコールのような抗生物質に対する耐性を提
供するもの、β−ラクタマーゼ、ＤＨＦＲ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グル
コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、および米国特
許第４，１９０，４９６号明細書第３２欄３３行目〜第３８欄４４行目（上記明
細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）に開示されている
酵素のような既知の検出可能な酵素をコードするもの、および既知の抗体（例え
ば、マウスＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ラットＩｇＧなど）またはプロテインＡ、プ
ロテインＧ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニ
ン（ＫＬＨ）、ウシγ−グロブリン（ＢＧＧ）、ラクトアルブミン、ポリセリン
、ポリグルタメート、レシチンなどのような既知の抗原性タンパク質をコードす
るものが挙げられる。
【００７８】 ポリヌクレオチドιは、好ましくはリーダー−ｍＲＮＡ接合配列と直ぐ下流の
ＯＲＦの開始コドンとの間に位置したＰＲＲＳＶゲノムからのポリヌクレオチド
配列に少なくとも８０％相同なポリヌクレオチド配列である。長さが「約１３０
」ヌクレオチドとは、κの操作発現に悪影響を与えないポリヌクレオチドιの長
さを表す。例えば、ＩＳＵ７９では、ＯＲＦ７の発現を抑制しないリーダー−ｍ
ＲＮＡ接合配列をＯＲＦ７の開始コドンから１２９塩基上流に見出すことができ
る（下記の実験２参照）。ポリヌクレオチドιに適する典型的な配列を、図１お
よび９に示される配列から推定することができる。
【００７９】 本発明のポリ核酸は、ポリヌクレオチドの混合物としてまたは頭−尾（センス
−アンチセンス）または頭−頭方式で共有結合した上記配列の組合せを含んでな
る、から本質的になる、またはからなることもできる。上記配列に相補性のポリ
核酸およびその組合せ（アンチセンスポリ核酸）も、本発明に包含される。従っ
て、ＯＲＦ５の多重または変異体コピーを有することに加えて、本発明のポリ核
酸は、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦ５の抗原または超可変領域などのＯＲＦ
１〜７の１個以上の多重または変異体コピーを含むこともできる。
【００８０】 上記および下記の実験および米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号
および第０８／３０１，４３５号明細書に記載の方法と同様に、ＰＲＲＳＶゲノ
ム（例えば、宿主で発現可能な適当なプラスミドに挿入したもの）の適当に調整
した制限断片を含む組換えクローンのライブラリーを（例えば、E. coliを宿主 として用いて）調製することができる。次に、クローンを適当なプローブ（例え
ば、ＯＲＦ２〜３の保存配列に基づく；例えば、米国特許出願連続番号第０８／
３０１，４３５号明細書の図２２を参照）でスクリーニングする。次いで、正の
クローンを選択して、適当な濃度まで成長させることができる。次に、ポリ核酸
を、既知の方法に準じて正のクローンから単離することができる。次いで、ＰＣ
Ｒに適するプライマーを上記のようにして設計して調製し、ポリ核酸の所望な領
域を増幅することができる。増幅したポリ核酸を、次に既知の方法によって単離
および分離することができる。
【００８１】 本発明の精製製剤は、ＶＲ２３８５、ＶＲ２４３０および／またはＶＲ２４３
１のＯＲＦ５〜７の少なくとも１個と少なくとも９７％の配列アイデンティティ
ー（または相同性）を有する配列、および下記のようにＶＲ２３８５、ＶＲ２４
２８、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＶＲ２４３１、ＶＲ２４７４およびＩＳＵ
−１８９４のＯＲＦ２〜５の少なくとも１個と少なくとも最小配列アイデンティ
ティー（または相同性）を有するポリペプチドをコードする配列からなる群から
選択されるポリ核酸を含むこともできる。
【表２】
【００８２】 好ましくは、ポリ核酸は、ｈｖＰＲＲＳＶたんりたいＶＲ２３８５、ＶＲ２４
２９、ＩＳＵ−２８、ＩＳＵ−７９および／またはＩＳＵ−９８４のＯＲＦ２〜
４の１個以上の十分に長い領域または部分を除外または修飾して、単離体を低ビ
ルレントまたは非ビルレントにする。
【００８３】 本出願に関して、「相同性」とは、通常の相同性決定法に準じて整列された（
例えば、MACVECTORまたはGENEWORKSコンピュータープログラム、米国特許出願連
続番号第０８／３０１，４３５号明細書の実験IIIに記載の手続きに従って整列 された）１種類以上のウイルスの配列における同一ヌクレオチドまたはアミノ酸
残基の割合を表す。
【００８４】 好ましくは、本の単離したポリ核酸は、タンパク質、ポリペプチドまたはそれ
らの抗原性断片であって、長さが少なくとも１０アミノ酸でありかつ抗原性に本
質的ではない非相同性アミノ酸を保存的に置換することができるものをコードす
る。タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの抗原性断片は、下記のような極性
基の一員で置換されるときには、保存的に置換される。
【００８５】 塩基性アミノ酸： リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）
【００８６】 酸性アミノ酸： アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ
）、グルタミン（Ｇｌｎ）
【００８７】 親水性の非イオン性アミノ酸： セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラ
ギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）
【００８８】 含硫アミノ酸： システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ） 疎水性の芳香族アミノ酸： フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ
）
【００８９】 疎水性の非芳香族アミノ酸： グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌ
ｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）
【００９０】 更に詳細には、本のポリ核酸は、ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８
６、ＶＲ２４２８、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＶＲ２４３１、ＶＲ２４７４
および／またはＩＳＵ−１８９４の第二、第三、第四、第五、第六および／また
は第七番目のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２〜７）によってコードさ
れる（複数の）タンパク質の１個以上をコードする（例えば、米国特許出願連続
番号第０８／３０１，４３５号明細書の図３および／または配列番号：１５、１
７、１９、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６
３および６５に示されている配列の１個以上）。
【００９１】 ＯＲＦ６および７は、これらの遺伝子のヌクレオチド配列が高ビルレンス（ｈ
ｖ）および低ビルレンス（ｌｖ）単離体中に高度に保存されるので、ＰＲＲＳＶ
のビルレンスおよび複製表現型を調節するものとは思われない（米国特許出願連
続番号第０８／３０１，４３５号明細書の実験III参照）。しかしながら、ＰＲ ＲＳＶ単離体のＯＲＦ５は、高複製（ｈｒ）および低複製（ｌｒ）単離体には余
り保存されないと思われる。従って、ｈｒＰＲＲＳＶ単離体由来のＯＲＦ５が本
のポリ核酸に含まれていれば、ポリ核酸から産生される組換えワクチンの産生お
よび発現が増強される。
【００９２】 更に、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５は、典型的にはポリペプチドの抗原性と関連した
３種類の親水性の超可変領域を含む。従って、本発明はＰＲＲＳＶＯＲＦ５の１
種類以上の超可変領域を含んでなるポリペプチド、好ましくは式ａ−ｂ−ｃ−ｄ
−ｅ−ｆ−ｇのポリペプチドであって、
【００９３】 ａは、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５によってコードされるタンパク質の１〜３１位に相
当するポリ（アミノ酸）、またはポリペプチドの抗原性に悪影響を及ぼさないポ
リ（アミノ酸）の断片であり、
【００９４】 ｂは、上記の表１の超可変領域１に示されている配列からなる群から選択され
るアミノ酸配列であり、
【００９５】 ｃは、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５によってコードされるタンパク質の３９〜５６位に
相当するアミノ酸配列（好ましくは、１個以上（好ましくは１〜１０個）のアミ
ノ酸が保存的に置換される式ＬＱＬＩＹＮＬＴＬＣＥＬＮＧＴＤＷＬの配列）で
あり、
【００９６】 ｄは、上記の表１の超可変領域２に示されている配列からなる群から選択され
るアミノ酸配列であり、
【００９７】 ｅは、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５によってコードされるタンパク質の６７〜１１９位
に相当するアミノ酸配列であって、１個以上（好ましくは、１〜２０、更に好ま
しくは１〜１０個）のアミノ酸残基が保存的に置換されかつポリペプチドの抗原
性に悪影響を及ぼさないものであり、
【００９８】 ｆは、上記の表１の超可変領域３に示されている配列からなる群から選択され
るアミノ酸配列であり、
【００９９】 ｇは、カルボキシル基（式−ＣＯＯＨの基）、ＰＲＲＳＶＯＲＦ５によってコ
ードされるタンパク質の１２９〜２００位に相当するアミノ酸配列またはその断
片であって、ポリペプチドの抗原性に悪影響を及ぼさないものである ものをコードするポリヌクレオチドも包含する。
【０１００】 従って、本発明のポリ核酸は、免疫防御用に用いるときには（例えば、ワクチ
ンの製造では）、高複製単離体（すなわち、ＣＲＬ１１１７１細胞などで１０６ 〜１０７ＴＣＩＤ５０の力価にまで成長する単離体、米国特許出願連続番号第０
８／３０１，４３５号明細書の実験VIII〜XIの説明も参照）由来のＯＲＦ５の少
なくとも１コピーを含むのが好ましい。
【０１０１】 一方、ｌｖ単離体ＶＲ２４３１は、ｈｖ単離体と比較して欠失変異体であると
考えられる（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の実験III およびVIII〜XI参照）。欠失は、ノーザンブロット分析によれば、ＯＲＦ４にあ
ると思われる。従って、本発明のポリ核酸は、本発明液防御用に用いるときには
、好ましくは高ビルレンスに関与するｈｖ単離体由来のＯＲＦ４の領域を含まず
、更に好ましくは隣接のＯＲＦ３および５と重複しないＯＲＦ４の領域を除外す
る。
【０１０２】 （少なくともＰＲＲＳＶについては）ヌクレオキャプシドタンパク質もそれに
対する抗体もブタをＰＲＲＳＶから免疫学的に保護しないことも知られている。
従って、本発明のポリ核酸は、免疫防御用に用いるときには、ウイルスエンベロ
ープタンパク質の抗原性領域をコードするＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２、３、４
、５および６由来の１個以上の領域の１個以上のコピーを含むが、ブタに投与し
たときには、ＰＲＲＳに関連した症状または組織病理学的変化を生じない。好ま
しくは、この領域は、他のＰＲＲＳＶ単離体のエンベロープタンパク質に対する
抗体と免疫学的に交差反応性である。
【０１０３】 同様に、本発明のポリ核酸によってコードされるタンパク質は、このタンパク
質を含んでなる組成物を投与したブタをＰＲＲＳから保護し、このタンパク質に
対する抗体は他のＰＲＲＳＶ単離体のエンベロープタンパク質と免疫学的に交差
反応性である。更に好ましくは、本発明のポリ核酸は、ＰＲＲＳＶ単離体の全エ
ンベロープタンパク質またはこれに少なくとも８０％相同性でありかつ非相同性
残基が保存的に置換されるタンパク質、あるいはこれに少なくとも９８％相同性
であるタンパク質をコードする。最も好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは
、図１に示された配列の１つであり、そこに引用されているオープンリーディン
グフレームの少なくとも１個を包含する。
【０１０４】 ウイルスのゲノムにおける比較的短い部分を用いて、感染動物からの組織およ
び／または生物学的流体試料をスクリーニングまたは同定し、および／または本
明細書に記載されておりかつ家畜およびウイルス診断学および獣医学の分野で通
常の技術を有する者に知られている方法によって関連ウイルスを同定することが
できる。従って、本発明のもう一つの態様は、ＰＲＲＳＶゲノム（好ましくは、
ＰＲＲＳＶのアイオワ株）のＯＲＦ２〜７由来の長さが１５〜２０００ｂｐ、好
ましくは１８〜１０００ｂｐ、更に好ましくは２１〜１００ｂｐの断片から本質
的になる単離した（かつ所望ならば、精製した）ポリ核酸を包含する。特に好ま
しくは、本発明の単離したポリ核酸断片は、ＰＲＲＳＶのアイオワ株のゲノムの
ＯＲＦ２〜７の１個以上の末端から得られ、最も好ましくは下記の実験１および
２、および米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の配列番号：
１〜１２および２８〜３４に記載のプライマーからなる群から選択される。
【０１０５】 本発明は、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルスを分析するための診断キッ
トであって、（ａ）長さが１０〜５０ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレオ
チドであって、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルスのアイオワ株由来のゲノ
ムポリ核酸にハイブリダイズするものを含んでなる第一のプライマー、（ｂ）長
さが１０〜５０ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレオチドを含んでなる第二
のプライマーであって、この第二のプライマーの上記配列がブタ生殖器および呼
吸器症候群ウイルスの上記アイオワ株由来の上記ゲノムポリ核酸に見出されかつ
第一のプライマーがハイブリダイズする配列の下流にあるもの、および（ｃ）増
幅したポリ核酸を検出することができる試薬を含んでなる診断キットにも関する
。好ましくは、この試薬はインターカレート染料であり、その蛍光特性は二本鎖
ＤＮＡへのインターカレーション時に変化する。
【０１０６】 本発明の単離したポリ核酸断片は、（ｉ）ウイルスポリ核酸に相当する（相補
性の）ｃＤＮＡの１種類以上の適当な制限酵素による消化、（ii）（（複数の）
所望なＯＲＦの５′および３′末端領域または５′末端の上流または３′末端の
下流の領域に相補性の適当なプライマーを用いる）ＰＣＲによる増幅およびクロ
ーン、または（iii）市販の自動ポリヌクレオチド合成装置を用いる合成によっ て得ることができる。
【０１０７】 本発明のもう一つの態様は、ＰＲＲＳウイルス、好ましくはＰＲＲＳＶのアイ
オワ株由来の１種類以上のタンパク質またはその抗原性断片に関する。上記のよ
うに、ＰＲＲＳウイルス（好ましくは、ＰＲＲＳＶのアイオワ株）由来のタンパ
ク質の抗原性断片は長さが少なくとも５アミノ酸であり、特に好ましくは、長さ
が少なくとも１０アミノ酸であり、抗原性断片を含む組成物を投与したブタでの
免疫学的防御応答を提供しまたは刺激する。
【０１０８】 タンパク質の抗原性部分の測定法は、当業者には知られている（上記の説明を
参照）。更に、完全長のタンパク質が宿主動物（例えば、ブタ）で抗原性である
ことを最初に示すことによってタンパク質の本質的な抗原性断片を測定すること
もできる。タンパク質の特定領域または配列に特異的に結合する抗体の存在下で
もタンパク質が抗原性である場合には、この領域または配列は免疫防御にとって
本質的でない可能性がある。一方、タンパク質が、タンパク質の特定領域または
配列に特異的に結合する抗体の存在下では最早抗原性でなくなる場合には、この
領域または配列は、抗原性にとって本質的であると考えられる。
【０１０９】 ＰＲＲＳＶのＯＲＦ５における３種類の超可変領域は、総ての入手可能なＰＲ
ＲＳＶ単離体のＯＲＦ５生成物のアミノ酸配列を比較することによって同定した
（例えば、図２Ｄ参照）。これらの３種類の領域でのアミノ酸変動は著しく、構
造的には保存されない（図２Ｄ）。３種類総ての超可変領域は親水性でありかつ
抗原性である。従って、これらの領域は、ウイルス膜に暴露されており、従って
宿主の免疫選択圧力下にあると考えられる。
【０１１０】 本発明は、上記のポリ核酸の１種類以上、好ましくはＰＲＲＳＶ、更に好まし
くはＰＲＲＳＶのアイオワ株のＯＲＦの１種類以上によってコードされるタンパ
ク質またはその抗原性断片にも関する。本発明のタンパク質および抗原性断片は
、ＰＲＲＳＶに対するブタの免疫、ＰＲＲＳＶ（特に、ＰＲＲＳＶのアイオワ株
）への暴露または感染似ついてブタをスクリーニングするための血清学的試験な
どに用いられる。
【０１１１】 例えば、本発明のタンパク質は、ＶＲ２３８５、ＩＳＵ−２２（ＶＲ２４２９
）、ＩＳＵ−５５（ＶＲ２４３０）、ＩＳＵ−１８９４、ＩＳＵ−７９（ＶＲ２
４７４）およびＩＳＵ−３９２７（ＶＲ２４３１）（例えば、図２および／また
は米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書の配列番号：１５、１
７、１９、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６
７、６９および７１に示されている配列の１個以上）のＯＲＦ２〜７によってコ
ードされるタンパク質、長さが５アミノ酸〜タンパク質の全長未満であるこれら
のタンパク質少なくとも１個の抗原性領域、上記表２に示されているＰＲＳＳＶ
ＯＲＦによってコードされるタンパク質との相同性が最小であるポリペプチド、
およびＶＲ２３８５、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＩＳＵ−１８９４、ＩＳＵ
−７９およびＶＲ２４３１のＯＲＦ６〜７の１つによってコードされるタンパク
質と少なくとも９７％の相同性を有するポリペプチド（例えば、米国特許出願連
続番号第０８／３０１，４３５号明細書の配列番号：１７、１９、４３、４５、
４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９および６１）からなる群から選択さ
れることができる。好ましくは、本発明のタンパク質は、ＶＲ２３８５、ＶＲ２
４２８、ＶＲ２４２９、ＶＲ２４３０、ＶＲ２４３１、ＶＲ２４７１およびＩＳ
Ｕ−１８９４のＯＲＦ２〜５（例えば、図２Ａ〜Ｄ参照）からなる群から選択さ
れるＯＲＦによってコードされる配列、その変異体であって、これを投与したブ
タに効果的な免疫学的防御を提供しかつアミノ酸配列中に１〜１００（好ましく
は、１〜５０、更に好ましくは１〜２５）の欠失または保存的置換が存在するも
の、および長さが少なくとも５、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸のその
抗原性断片であって、これを投与したブタに効果的な免疫学的防御を提供するも
のを有する。
【０１１２】 更に好ましくは、本発明のタンパク質変異体またはタンパク質断片は、完全長
の天然に存在するタンパク質（すなわち、ＰＲＲＳＶＯＲＦによってコードされ
るタンパク質）に特異的に結合するモノクローナル抗体に対して、相当する完全
長の天然に存在するタンパク質の結合アフィニティーの少なくとも１％、好まし
くは少なくとも１０％の結合アフィニティーを有する。
【０１１３】 本発明は、ポリペプチドの産生法であって、本発明のポリ核酸を操作発現系で
発現させ、発現したポリペプチドを発現系から精製することを特徴とする、方法
にも関する。適当な発現系としては、タンパク質およびポリペプチドのイン・ビ
トロまたはイン・ビボでの発現に通常用いられるもの、例えばイン・ビトロ発現
およびイン・ビボ発現のためのウサギ網状赤血球系、修飾またはキメラＰＲＲＳ
Ｖ（ＭＡ−１０４、ＣＲＬ１１１７１、ＰＳＰ−３６、ＰＳＰ−３６−ＳＡＨ、
ＭＡＲＣ−１４５およびブタ肺胞マクロファージのような感染可能な宿主細胞に
感染するのに用いられる）、または通常の発現系（例えば、細菌プラスミドおよ
び相当する宿主細菌、酵素発現系および相当する宿主酵素など）で用いるための
既知プロモーター（例えば、チミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０など）の
操作制御下で本発明のポリ核酸を含む通常の発現ベクターが挙げられる。次に、
発現したポリペプチドまたはタンパク質を、通常の精製および／または単離法に
よって発現系から精製または単離する。
【０１１４】 本発明の他の特徴は、下記の代表的態様の説明の経過中に明らかにされるが、
これらの態様は発明の例示の目的で示されるものであり、発明を制限しようとす
るものではない。
【０１１５】 例１ 概要 １個の低ビルレンス、１個の「中」ビルレンスおよび１個の高ビルレンス米国
ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜５の配列を決定して、分析した。他のＰＲＲＳＶ
単離体の既知配列と比較すると、異なるビルレンスを有する７個の米国単離体の
ＯＲＦ２〜５には、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルのいずれでもかなりの配
列変動があることが示されている。しかしながら、これら７種の米国単離体のＯ
ＲＦ６および７は、高度に保存されている（米国特許出願連続番号第０８／３０
１，４３５号明細書）。欧州ＬＶおよび米国単離体のＯＲＦ２〜７にも、広汎な
配列変動が見られた。既知の最小ビルレンス米国ＰＲＲＳＶ単離体（ＩＳＵ−３
９２７）は、他の米国単離体と比較して最大の配列変動を示した。
【０１１６】 米国単離体の系統的関連性も分析した。米国単離体のＯＲＦ２〜７の系統分析
では、主要な米国ＰＲＲＳＶ遺伝子型中に少なくとも３つの群のＰＲＲＳＶ変異
体があることが示唆された。従って、異なる地理学上の領域から更に多くのウイ
ルス単離体が検討されているので、多数の追加の主または副遺伝子型が同定され
ると思われる。
【０１１７】 興味深いことには、既知の最小ビルレンス米国ＰＲＲＳＶ単離体（ＩＳＵ−３
９２７）は、他の米国単離体とは異なる分科を形成する。ヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列の分析でも、単離体ＩＳＵ３９２７は他の米国単離体と比較してＯＲ
Ｆ２〜４で最大の変動を示すことが明らかになった。単離体ＩＳＵ３９２７にお
けるこれらの変動の多くは、非保存アミノ酸置換を生じる。しかしながら、単離
体ＩＳＵ３９２７におけるこれらの非保存変化は、他の米国単離体と比較して、
特定の領域に限定されるとは考えられず、それらはＯＲＦ２〜４中に存在する。
従って、配列変動とウイルスビルレンスとの間の特異的相関は、（ＯＲＦ３にお
けるある位置はビルレンスに関係している（図２Ｂ参照；３０、４８、５４〜５
６、１３４、１４０、１４３、１４７、１５３、２０６および２１５位）と思わ
れ、これらの位置の１個以上におけるアミノ酸はＰＲＲＳＶＯＲＦ３によってコ
ードされる他の既知のタンパク質を突然変異するための基礎として働くことがで
きるが）完全には解明されていない。
【０１１８】 結果 ７個の米国ＰＲＲＳＶたんりたい間のアミノ酸配列アイデンティティーは、Ｏ
ＲＦ２では９１〜９９％であり、ＯＲＦ４では９２〜９９％であり、ＯＲＦ５で
は８８〜９７％であった。既知の最小ビルレント米国単離体は、他の米国単離体
と比較して、ＯＲＦ５〜７よりＯＲＦ２〜４での配列変動が高い。抗原性を有す
る３個の超可変領域をＯＲＦ５によってコードされる主エンベロープ糖タンパク
質で同定した。
【０１１９】 ＯＲＦ２〜７の対毎の比較および系統樹分析により、米国ＰＲＲＳＶの主遺伝
子型内に少なくとも３群のＰＲＲＳＶ変異体（または副遺伝子型）が存在するこ
とが示唆された。既知の最小ビルレント米国単離体は、異なるビルレンスを有す
る他の米国単離体とは異なる分科を形成する。この研究の結果は、ＰＲＲＳＶお
よびワクチン開発の分類学について示唆が与えられる。
【０１２０】 図１は、米国単離体であるＩＳＵ３９２７、ＩＳＵ２２およびＩＳＵ５５と他
の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのヌクレオチド配列の比較を示している。ＶＲ２３
８５のヌクレオチド配列を最上部に示し、異なる部分だけを示している。それぞ
れのＯＲＦの開始コドンは＋＞で示し、それぞれのＯＲＦの終止コドンは星印（
＊）で示す。サブゲノムｍＲＮＡ３、４および３−１についてのリーダー−ｍＲ
ＮＡ接合配列に下線を施し、それぞれのＯＲＦの開始コドンに対する接合配列の
位置を、それぞれのＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示
す。この整列に用いたＶＲ２３８５（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６
２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）、ＶＲ２３３２、ＩＳＵ７９お
よびＩＳＵ１８９４（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）
は、以前に報告したものである。
【０１２１】 材料および方法 細胞およびウイルス ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞系を用いて、ＰＲＲＳＶを増殖させた。細胞を
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１×抗生物質（ペニシリンＧ１０，０００
単位／ml、ストレプトマイシン１０，０００mg／mlおよびアンホテリシンＢ２５
mg／ml）を補足したDulbeccoの最小必須培地（ＤＭＥＭ）で成長させた。
【０１２２】 この研究で用いたＰＲＲＳＶの３種類のＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５およびＩＳＵ
３９２７と呼ばれる米国単離体を、ＰＲＲＳの発生中のアイオワ州の様々な農場
から得たブタ肺から単離した。３種類総ての単離体は、ＣＲＬ１１１７１細胞上
で３回プラーク精製した後、更に実験に供した。比較病理学的研究では、単離体
ＩＳＵ３９２７は１０種類の異なる米国ＰＲＲＳＶ単離体の中で最小ビルレンス
の単離体であることを示した。単離体ＩＳＵ２２は高ビルレンス単離体であり、
単離体ＩＳＵ５５は「中程度」の病原性である。この実験に用いた３種類のウイ
ルス単離体総ては、７代目のものであった。
【０１２３】 ＰＲＲＳＶ細胞内ＲＮＡの単離 ＣＲＬ１１１７１細胞の集密的単層をそれぞれＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５および
ＩＳＵ３９２７であるＰＲＲＳＶの３種類の米国単離体を０．１の感染多重度（
ｍ．ｏ．ｉ．）で感染させた。感染から２４時間後、感染細胞を冷ＰＢＳ緩衝液
で３回洗浄した。次に、総細胞内ＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネート
およびフェノール−クロロホルム抽出(Stratagene)によって単離した。ＲＮＡ製
剤中におけるウイルス特異的ＲＮＡ種の存在は、ノーザンブロットハイブリダイ
ゼーションによって確かめた（データーは示さなかった）。総細胞内ＲＮＡは、
分光光度法によって定量した。
【０１２４】 逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ） 第一の鎖の相補性（ｃ）ＤＮＡは、以前に報告したようにランダムプライマー
を用いる逆転写によって総細胞内ＲＮＡから合成した(Meng et al., 1993, J. V
et. Diagn. Invest., 5:254-258)。ＰＲＲＳＶの３種類の単離体のＯＲＦ２〜５
の総タンパク質コード領域を増幅するため、２組のプライマーをＶＲ２３８５お
よびＬＶの配列に基づいて設計した。プライマーＪＭ２５９（５′−ＧＧＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＴＴＧＴＧＧＡＧＣＣＧＴ−３′）およびＪＭ２６０（５′−ＧＧＧ ＧＡＡＴＴＣ ＧＧＧＡＴＡＧＧＧＡＡＴＧＴＧ−３′）はＯＲＦ４および５の配
列を増幅し、プライマーＸＭ９９２（５′−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＧ−
ＴＡＡＴＡＧ（Ａ）ＧＴＣＴＧ−３１およびＸＭ９９３（５′−ＧＧＴＧＡＡＴ ＴＣ ＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＴＣＣＧＧＧＣ−３′）はＯＲＦ２および３の配
列を増幅した。これらのプライマーの５′末端にユニーク制限部位（ＥｃｏＲＩ
またはＢａｍＨＩ）を導入して、クローニングを促進した。縮重塩基Ｇ（Ａ）を
、ＶＲ２３８５およびＬＶの配列に基づいてプライマーＸＭ９９２において合成
した(Meulenberg et al., 1993; 米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５
号明細書）。ＰＣＲは、以前に報告した方法で行った(Meng et al., 1993, J. V
et. Diagn. Invest., 5:254-258)。
【０１２５】 クローニングおよびヌクレオチド配列決定 ＲＴ−ＰＣＲ生成物を、０．８％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
それぞれＯＲＦ２および３並びにＯＲＦ４および５を表す２種類のＰＣＲ断片を
、グラスミルク法(glassmilk procedure; GENECLEAN, BIO 101, Inc.)によって 精製した。精製断片をそれぞれＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、以前に報
告した方法でベクターｐＳＫ＋にクローニングした(Meng et al., 1993)。E. co
li DH 5α細胞を、組換えプラスミドの形質転換に用いた。白色コロニーを選択 し、１００mg／mlアンピシリンを含むＬＢブロスで成長させた。組換えプラスミ
ドを含むE. coli細胞をリゾチームで溶解し、次にプラスミドをQiagenカラム(QI
AGEN Inc.)を用いて単離した。
【０１２６】 ウイルスインサートを含むプラスミドを、自動ＤＮＡシークエンサー(Applied
Biosystem, Inc.)を用いて配列決定した。３種類のＰＲＲＳＶ単離体のそれぞ れからのＯＲＦ２〜５の全配列を表す３種類以上の独立したＣＤＮＡクローンを
、ユニバーサルおよび復帰プライマーを用いて配列決定した。数種類のウイルス
特異的プライマーであるＸＭ９６９（５′−ＧＡＴＡＧＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＴ
ＡＧ−３′）、ＸＭ９７０（５′−ＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣ−３
′）、ＸＭ１００６（５′−ＧＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＧＡ−３′）、Ｘ
Ｍ０７７（５′−ＣＡＡＣＣＡＧＧＣＧＴＡＡＡＣＡＣＴ−３′）およびＸＭ０
７８（５′−ＣＴＧＡＧＣＡＡＴＴＡＣＡＧＡＡＧ−３′）も用いて、ＯＲＦ２
〜５の配列を決定した。
【０１２７】 配列分析 配列データーを組合わせて、Mac Vector (International Biotechnologies, I
nc.)およびGene Workds (IntelliGenetics, Inc.)コンピューターソフトウェア プログラムを用いて分析した。系統発生分析は、PAUPソフトウェアパッケージ第
３．１．１版(David L. Swofford, Illinois Natural HIstory Survey, シャン ペン, イリノイ）を用いて行った。PAUPは、最大倹約アルゴリズムを用いて、系
統樹を構築する。
【０１２８】 結果 ＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列分析 ５種類のＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ７９、ＩＳＵ１８９４、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ
５５およびＩＳＵ３９２７のＯＲＦ２〜５の配列を決定し、ＶＲ２３８５、ＶＲ
２３３２およびＬＶなどの他の既知のＰＲＲＳＶ単離体と比較した(Meulenberg
et al., 1993)。単離体ＶＲ２３８５、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５、ＩＳＵ７９、 ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ３９２７のＯＲＦ６および７の配列は、以前に報告
されていた（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。この実
験に用いた単離体は、実験的に感染したブタにおける肺ビルレンスが異なること
が示されている（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８
／３０１，４３５号明細書）。ＩＳＵ３９２７は、１０種類の異なる米国ＰＲＲ
ＳＶ単離体の中で最小ビルレンスの単離体である（米国特許出願連続番号第０８
／１３１，６２５号明細書および米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５
号明細書）。
【０１２９】 他の米国ＰＲＲＳＶ単離体と同様に、これらの単離体のＯＲＦ２〜４は互いに
重複した（図１）。しかしながら、ＬＶとは異なり、米国単離体のＯＲＦ４およ
び５は１０ヌクレオチドだけ離れている（図１）。ＬＶのＯＲＦ４および５は、
１ヌクレオチドだけ重複した。ＬＶにおけるＯＲＦ５の開始コドンＡから米国単
離体におけるＴへの単一ヌクレオチドの置換は、ＯＲＦ４停止コドンの１０ヌク
レオチド下流に米国単離体のＯＲＦ５の開始コドンを設置する。従って１０ヌク
レオチドの非コード配列は、既知の米国単離体のＯＲＦ４および５の間に現われ
る（図１）。
【０１３０】 ＩＳＵ７９のＯＲＦ２は、他の米国単離体より３ヌクレオチドだけ短い。ＯＲ
Ｆ２の停止コドンの直前のＴＧＧからＴＡＧへの単一ヌクレオチドの置換により
、ＩＳＵ７９に新たな停止コドンが生じる（図１）。他の米国単離体と比較して
ＩＳＵ３９２７のＯＲＦ５には、３ヌクレオチド欠失も見られた（図１）。総て
の米国単離体のＯＲＦ２〜５の大きさは、他のＯＲＦより３ヌクレオチド短いＩ
ＳＵ７９のＯＲＦ２およびＩＳＵ３９２７のＯＲＦ５を除き同一である（図１）
。
【０１３１】 図１に示される７個の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜５の配列の比較は、
米国単離体のＯＲＦ２〜５にはかなりのヌクレオチド配列の変動があることを示
している（図１）。ヌクレオチド配列アイデンティティーは、ＶＲ２３８５、Ｖ
Ｒ２３３２、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４間にお
いて、ＯＲＦ２では９６〜９８％であり、ＯＲＦ３では９２〜９８％であり、Ｏ
ＲＦ４では９２〜９９％であり、ＯＲＦ５では９０〜９８％であった（表３）。
【０１３２】 最小ビルレンス単離体ＩＳＵ３９２７は、７種類の米国単離体の中で最大の変
動を有する（図１および表３）。ＩＳＵ３９２７と他の米国単離体との間のヌク
レオチド配列アイデンティティーは、ＯＲＦ２では９３〜９４％であり、ＯＲＦ
３では８９〜９０％であり、ＯＲＦ４では９１〜９３％であった（表３）。ＯＲ
Ｆ６および７（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）と同様
に、ＩＳＵ３９２７のＯＲＦ５は３ヌクレオチドの欠失を除き有意な変化はない
（図１）。ＩＳＵ３９２７のＯＲＦ５は、他の米国単離体のＯＲＦ５と９１〜９
３％のヌクレオチド配列アイデンティティーを共有している（表３）。
【０１３３】 しかしながら、ＬＶおよび米国単離体の間のＯＲＦ２〜５には、広汎な配列変
動が見られた（図１および表３）。ＬＶおよび米国単離体の間のヌクレオチド配
列アイデンティティーは、ＯＲＦ２では６５〜６７％であり、ＯＲＦ３では６１
〜６４％であり、ＯＲＦ４では６３〜６６％であり、ＯＲＦ５では６１〜６３％
であった（表３）。ＬＶおよび米国ＰＲＲＳＶの間のＯＲＦ６および７には、広
汎な遺伝子変動も存在する（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号お
よび第０８／３０１，４３５号明細書）。これらの結果は、最小ビルレント単離
体ＩＳＵ３９２７は米国単離体と最も関係が少なく、遺伝子変動はほとんどがＯ
ＲＦ２〜４にあることを示している。
【０１３４】 ＩＳＵ７９で観察されたＯＲＦ２における停止コドンの前のＴＧＧからＴＡＧ
への単一ヌクレオチド置換は、７個のｓｇｍＲＮＡを産生する単離体ＩＳＵ５５
およびＩＳＵ３９２７にも存在するが、それぞれ６個のｓｇｍＲＮＡしか合成し
ない単離体ＩＳＵ２２、ＩＳＵ１８９４またはＶＲ２３８５には存在しない（米
国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号
明細書）。これらの結果は、ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７のリーダー−ｍＲ
ＮＡ３−１接合配列はＩＳＵ７９と同じであると思われることを示唆している（
図１）。
【０１３５】 ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４についてのリーダ
ー−ｍＲＮＡ結合配列は、ｓｇｍＲＮＡ３についてはＯＲＦ３の８９ヌクレオチ
ド上流のＧＵＡＡＣＣ、およびｓｇｍＲＮＡ４についてはＯＲＦ４の１０ヌクレ
オチド上流のＵＵＣＡＣＣであると決定された（米国特許出願連続番号第０８／
３０１，４３５号明細書；下記の実験２を参照）。単離体ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５
５およびＩＳＵ３９２７と単離体ＶＲ２３８５、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９
４との配列を比較すると、ｓｇｍＲＮＡ３および４についてのリーダー−ｍＲＮ
Ａ結合配列は米国単離体中で保存されていることを示唆している（図１）。
【０１３６】 ＯＲＦ２〜５によってコードされる推定アミノ酸配列の分析 図２は、米国単離体ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５およびＩＳＵ３９２７と他の既知
のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２（Ａ）、ＯＲＦ３（Ｂ）、ＯＲＦ４（Ｃ）およ
びＯＲＦ５（Ｄ）の推定アミノ酸配列の整列を示す。ＶＲ２３８５の配列を最上
部に示し、差だけを示す。欠失は（−）によって示す。ＬＶ（Ｄ）のＯＲＦ５に
おける提案シグナルペプチド配列には、下線を施す(Meulenberg et al., 1995) 。ＯＲＦ５（Ｄ）における抗原性を有する３種類の超可変領域は、星印（＊）に
よって示した。この整列に用いた公表配列は、ＬＶ(Meulenberg et al., 1993) 、ＶＲ２３８５（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０８
／３０１，４３５号明細書）、ＶＲ２３３２、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４
（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）であった。
【０１３７】 塩基性アミノ酸が高含量でありかつそれが親水性であることに基づいて、ＯＲ
Ｆ７の転写生成物はヌクレオキャプシドタンパク質（米国特許出願連続番号第０
８／１３１，６２５号および第０８／３０１，４３５号明細書; Meulenberg et
al., 1993; Conzelmann et al., 1993; Mardassi et al., 1994）。ＯＲＦ６生 成物は潜在的なアミノ末端シグナル配列を欠きかつ潜在的な膜貫通断片を表すこ
とができる数個の疎水性領域を含む。従って、ＯＲＦ６生成物は、Ｍタンパク質
であると予想された（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第
０８／３０１，４３５号明細書; Meulenberg et al., 1993; Conzelmann et al.
, 1993）。
【０１３８】 コンピューター分析は、米国単離体のＯＲＦ２〜５によってコードされる生成
物は総て膜関連タンパク質を連想させるヒドロパシー特性を有する。ＯＲＦ２〜
５の翻訳生成物は、それぞれ疎水性アミノ末端を含む。Ｎ−末端の疎水性配列は
これらのＯＲＦのそれぞれについてのシグナル配列として機能し、ＯＲＦ２〜５
の感染細胞の小胞体への輸送に関与することがある。ＯＲＦ２〜５のそれぞれに
おける少なくとも１個の追加の疎水性ドメインが、カルボキシ末端に見られた。
これらの追加の疎水性ドメインは、膜アンカーとして機能することができる。
【０１３９】 検討を行った７種類の米国単離体のＯＲＦ２〜５の推定アミノ酸配列もかなり
変動し、図１で観察されたヌクレオチドの差のほとんどはサイレント突然変異で
はないことを示していた。ＶＲ２３８５、ＶＲ２３３２、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５
５、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４の間のアミノ酸配列のアイデンティティー
は、ＯＲＦ２では９５〜９９％であり、ＯＲＦ３では９０〜９８％であり、ＯＲ
Ｆ４では９４〜９８％であり、ＯＲＦ５では８８〜９７％であった（表３）。
【０１４０】 また、最小ビルレント単離体ＩＳＵ３９２７は、他の米国単離体と比較して、
ＯＲＦ５〜７（米国特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書および表
３）よりもＯＲＦ２〜４（図２および表３）で、より大きな変動を示した。ＬＶ
のＯＲＦ２〜５は、米国単離体のＯＲＦとそれぞれ５７〜６１％、５５〜５６％
、６５〜６７％および５１〜５５％だけのアミノ酸配列アイデンティティーを共
有している（表３）。欧州ＬＶと米国単離体との比較では、ＯＲＦ２〜５中に欠
失または挿入が見られた（図２）。
【０１４１】 ＯＲＦ５生成物の配列比較では、ＯＲＦ５のＮ末端領域は、（ａ）米国単離体
とＬＶとの間でも、（ｂ）様々な米国単離体同士でも極めて可変である（図２Ｄ
）。ＬＶでは、ＯＲＦ５の最初の３２〜３３アミノ酸残基がシグナル配列を表す
ことができる（Meulenberg et al., 1995; 図２Ｄ）。従って、総てのＰＲＲＳ Ｖ単離体におけるＯＲＦ５の潜在的シグナル配列は極めて不均一である。この不
均一性は、シグナルペプチドは開裂して、成熟ビリオンには存在しないので、任
意の宿主免疫選択圧力によるものではない。
【０１４２】 ３個の追加の超可変領域も、入手可能な総てのＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ５の
アミノ酸配列を比較することによって同定した（図２Ｄ）。これらの３つの領域
におけるアミノ酸変動は著しく、構造的には保存されない（図２Ｄ）。コンピュ
ーター分析は、３つの超可変領域総てが親水性でありかつ抗原性であることを示
唆している。従って、これらの領域はウイルス膜に暴露されており、宿主免疫選
択圧力下にあると思われる。しかしながら、ＯＲＦ５エンベロープタンパク質に
おけるこれらの超可変領域の抗原決定基としての特異的機能を確かめるには更に
実験が必要なことがある。
【０１４３】 ＰＲＲＳＶの米国単離体中の系統発生的関係 米国ＰＲＲＳＶと欧州ＰＲＲＳＶはＭおよびＮ遺伝子の分析に基づいて２種類
の異なる遺伝子型を表すことは以前に示されている（米国特許出願連続番号第０
８／３０１，４３５号明細書）。米国ＰＲＲＳＶ単離体の系統発生的関連性を決
定するため、図１および２に示した７種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜
７を最初にGeneWorks プログラム(Intelligenetics, Inc.)を用いて整列した。 次に、PAUPプログラム(David L. Swofford, Illinois Natural History Survey,
シャンペン, イリノイ）を用いて、ＰＲＲＳＶの米国単離体中の関連性を示す 系統樹を構築した。
【０１４４】 図３の系統樹は、PAUPソフトウェアパッケージ第３．１．１版を用いる最大倹
約法によって構築した。最短の長さの（最も倹約した）分科は、徹底的な検索法
を行うことによって見出された。分科の長さ（アミノ酸置換の数）は、それぞれ
の分科の上に示す。分析に用いる配列は、ＬＶ、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３３２、
ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４である。
【０１４５】 この系統樹は、主要な米国ＰＲＲＳＶ遺伝子型には少なくとも３群の変異体（
または副遺伝子型）があることを示唆している。最小ビルレンスの米国ＰＲＲＳ
Ｖ単離体ＩＳＵ３９２７は、他の米国単離体とは異なる分科を形成している（図
３）。単離体ＩＳＵ２２、ＩＳＵ７９、ＩＳＵ１８９４およびＶＲ２３３２は、
第二の副遺伝子型を表すもう一つの分科を形成する。第三の副遺伝子型は、単離
体ＩＳＵ７９およびＶＲ２３８５によって表される（図３）。極めて類似した樹
は、図１に示された７個の米国単離体のＯＲＦ１ｂの最後の６０ヌクレオチドを
分析することによっても得られた（データーは示されていない）。同一の系統樹
トポロジーは、GeneWorks プログラムを用いて算術的手段による未秤量対群法(u
nweighted pair-group method with arithmetic mean; UPGMA)によっても生成し
た（データーは示されていない）。
【０１４６】 要約すると、ＰＲＲＳＶの様々な遺伝子型を確認し、更に解明した。米国ＰＲ
ＲＳＶの主遺伝子型中の少なくとも３種類の副遺伝子型を、ＯＲＦ２〜７の配列
の分析に基づいて同定した。欧州ＰＲＲＳＶおよび米国ＰＲＲＳＶ間のみでなく
、米国ＰＲＲＳＶ単離体同士の遺伝子変動も、同様に確認し、ＰＲＲＳＶの不均
一性を示した。最小ビルレンスの米国ＰＲＲＳＶ単離体であるＩＳＵ３９２７は
、他の米国単離体と比較して、ＯＲＦ２〜４において予想外に高い配列変動を有
する。
【表３】
【０１４７】 例２ ＰＲＲＳＶの複製中に、ゲノムＲＮＡの他に６個のサブゲノムｍＲＮＡ（ｓｇ
ｍＲＮＡ）を合成する。これらのｓｇｍＲＮＡを、この実験で特性決定した。
【０１４８】 ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡは、ＰＲＲＳＶに感染した細胞中で３′−共末端ネ
ステドセットを形成する。これらのｓｇｍＲＮＡのそれぞれはポリシストロン性
であり、（ＯＲＦ特異プローブを用いるノーザンブロット分析によって示される
ように）ｓｇｍＲＮＡを除き多重オープンリーディングフレームを含む。ｓｇｍ
ＲＮＡはビリオンにはパッケージされず、ゲノムＲＮＡのみが精製ビリオンで検
出され、ＰＲＲＳＶのキャプシド化シグナルはＯＲＦ１領域に位置しているらし
いことを示唆した。
【０１４９】 ＰＲＲＳＶ感染細胞中のｓｇｍＲＮＡの数は、異なるビルレンスを有するＰＲ
ＲＳＶ単離体中で変化する。幾つかのＰＲＲＳＶ単離体におけるｓｇｍＲＮＡの
追加種は、ＯＲＦ４の上流の配列に由来することが上記の実験１で示され、ｓｇ
ｍＲＮＡ３−１と命名した。
【０１５０】 単離体ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４、並びに単
離体ＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列は、共通の
６ヌクレオチド配列モチーフＴ（Ｇ）ＴＡ（Ｇ／Ｃ）ＡＣＣを含む。これらの２
個の米国単離体のゲノムＲＮＡの配列分析を行い、レリスタッドウイルス（ＬＶ
）と比較したところ、ＰＲＲＳＶ単離体中でリーダー−ｍＲＮＡ接合配列が不均
一であることが明らかになった。リーダー−ｍＲＮＡ接合領域の数、位置および
配列は、米国単離体およびＬＶ間並びに米国単離体中で変化した。リーダー−ｍ
ＲＮＡ接合配列の最後の３ヌクレオチドＡＣＣは不変である。最初の３ヌクレオ
チドに、変動が見られた。
【０１５１】 ｓｇｍＲＮＡ３−１の５′末端配列をＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のゲノ
ム配列と比較することによって、ＩＳＵ１８９４におけるＴからＩＳＵ７９にお
けるＣへの単一ヌクレオチド置換によりＩＳＵ７９に新たなリーダー−ｍＲＮＡ
接合配列、従って、ｓｇｍＲＮＡの追加種（ｓｇｍＲＮＡ３−１）が生じること
が分かった。ＯＲＦ３−１と命名され、４５アミノ酸のコード容量を有する小さ
なＯＲＦが、ｓｇｍＲＮＡ３−１の５′末端で同定された。
【０１５２】 材料および方法 ウイルスおよび細胞 用いたＰＲＲＳＶ単離体（ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５、ＩＳＵ７９、ＩＳＵ１８
９４およびＩＳＵ３９２７）は、アイオワ州の様々な農場から得たブタ肺から単
離した。連続的細胞系ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１を用いて、ウイルスを単離し、
成長させた。これらのＰＲＲＳＶ単離体を３回のプラーク精製によって生物学的
にクローニングし、ＣＲＬ１１１７１細胞上で成長させた。この研究に用いたウ
イルス単離体の総ては、第７代であった。
【０１５３】 ＩＳＵ２２およびＩＳＵ７９は病原性が高く、接種後１０日目に剖検した実験
的に感染させた５週齢のカエサリアン(caesarean)由来の初乳を欠失した子ブタ の肺組織の５０〜８０％の硬化を生じる。対照的に、ＩＳＵ５５、ＩＳＵ１８９
４およびＩＳＵ３９２７は病原性が低く、同じ実験では肺組織の１０〜２５％し
か硬化しなかった（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号および第０
８／３０１，４３５号明細書）。
【０１５４】 ウイルス特異的総細胞内ＲＮＡ、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡおよびビリオンＲＮＡの
調製 ＣＲＬ１１１７１細胞の集密的単層を、第７代目のＰＲＲＳＶの様々な単離体
を０．１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で感染させた。ＰＲＲＳＶ特異的総細胞
内ＲＮＡを、通常のグアニジニウムイソチオシアネート法(Stratagene)によって
ＰＲＲＳＶ感染細胞から単離した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セ
ルロースカラムクロマトグラフィー(Invitrogen)によって総細胞内ＲＮＡから濃
縮した。
【０１５５】 ＰＲＲＳＶビリオンＲＮＡを単離するため、集密的ＣＲＬ１１１７１細胞をＰ
ＲＲＳＶの単離体ＩＳＵ３９２７で０．１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。感染細
胞の７０％を上回る量が細胞変性硬化を示したとき、培養物を凍結融解を３回行
い、培地を４℃にて１２００×ｇで２０分間清澄化した。次に、ウイルスをポリ
エチレングリコールで沈澱させた後、米国特許出願連続番号第０８／１３１，６
２５号明細書に記載の通りの塩化セシウムグラディエント遠心分離によって精製
した。精製したウイルスを、２０μ／mlの最終濃度のＲＮアーゼＡを用いて３７
℃で９０分間処理した。次に、ウイルスをペレット化し、ビリオンＲＮＡを通常
のグアニジニウムイソチオシアネート法を用いて単離した。
【０１５６】 ｃＤＮＡ合成およびポリメラーゼ連鎖反応 ｃＤＮＡは、以前に報告したようにランダムプライマーを用いる逆転写によっ
て総細胞内ＲＮＡから合成し、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した(Meng et
al., 1993, J. Vet. Diagn. Invest., 5:254-258)。
【０１５７】 ノーザンブロット分析 ウイルス感染細胞および擬似感染細胞由来の総細胞内ＲＮＡ１０μｇを、ホル
ムアルデヒド−アガロースゲル中でレーン当たりに用いた。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ
およびビリオンＲＮＡを分離するため、ビリオンＲＮＡ１５ngおよびポリ（Ａ） ＋ ＲＮＡ０．２μｇを、レーン当たりに加えた。ＲＮＡは、通常の方法に従って
ホルムアルデヒドで変性した（Sambrook et al., 「分子クローニング：実験室 便覧(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)」，第２版, Cold Spring Harb
or Laboratory, コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク）。ＲＮＡの 電気泳動分離、ＲＮＡブロッティングおよびハイブリダイゼーションは、米国特
許出願連続番号第０８／１３１，６２５号明細書に記載の方法で行った。幾つか
の実験では、グリオキサール−ＤＭＳＯアガロースゲルも米国特許出願連続番号
第０８／１３１，６２５号明細書に記載の方法で行った。
【０１５８】 プローブを調製するため、ＯＲＦ１ｂ〜７のそれぞれからの特異的ｃＤＮＡ断
片を、ＯＲＦ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって生成させた。プラ
イマーは、それぞれのプライマーが所定のＯＲＦの特異的断片のみを増幅し、重
複している隣接ＯＲＦどうしがあらゆる所定のｃＤＮＡプローブには含まれない
ような方法で設計した。ＯＲＦ１ｂ−７を表すｃＤＮＡプローブを生成するため
のプライマー対は、ＯＲＦ１ｂについてはＩＭ７２９／ＩＭ７８２であり、ＯＲ
Ｆ２についてはＩＭ３１２／ＩＭ３１３であり、ＯＲＦ３についてはＸＭ１０２
２／ＩＭ２５８であり、ＯＲＦ４についてはＸＭ１０２４／ＸＭＩ０２３であり
、ＯＲＦ５についてはＰＰ２８７／ＰＰ２８６であり、ＯＲＦ６についてはＰＰ
２８９／ＸＭ７８０であり、ＯＲＦ７についてはＰＰ２８５／ＰＰ２８４である
（表４）。
【０１５９】 クローニング、配列決定およびヌクレオチド配列分析 ＲＴ−ＰＣＲのプライマーは、ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８
９４のＯＲＦ２〜５の全タンパク質コード領域を増幅するＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ
２３８５の配列に基づいて設計した。プライマーＪＭ２５９およびＪＭ２６０は
０ＲＦ４および５の増幅に用い、ＸＭ９９２およびＸＭ９９３はＯＲＦ２および
３の増幅に用いた（表４）。ＰＣＲ生成物の末端にユニーク制限部位（ＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩ）を導入することによって、これらのＯＲＦの置換に対する
カセット法が可能となった。
【０１６０】 ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１９８４のＯＲＦ２〜３およびＯＲＦ４〜５のＰＣＲ
生成物をそれぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化した後、精製して、以前に
報告した通りにベクターｐＳＫ＋にクローニングした(Meng et al., 1993, J. V
et. Diagn. Invest., 5:254-258)。ウイルスインサートを含むプラスミドを、通
常の自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystem, Inc.)で配列決定した。そ れぞれのウイルス単離体からのＯＲＦ２〜５の全配列を表す少なくとも３個のｃ
ＤＮＡクローンを、普遍および復帰プライマー並びに他のウイルス特異的配列決
定プライマーで配列決定した（ＸＭ９６９、ＸＭ９７０、ＸＭ１００６、ＸＭ０
７８およびＸＭ０７７；表４を参照）。
【０１６１】 ｓｇｍＲＮＡ３、４および３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列を決定するた
め、プライマー対ＩＭ７５５およびＤＰ５８６（表４）をＲＴ−ＰＣＲに用いて
、相当する５′末端配列を増幅した。生成するＰＣＲ生成物を、ウイルス特異的
プライマーＸＭＤ７７およびＸＭ１４１を用いる直接ＰＣＲ配列決定によって精
製して、配列決定した（表４）。これらの配列を組合わせて、Mac Vector (Inte
rnational Biotechnologies, Inc.)およびGeneWorks (IntelliGenetics, Inc.) コンピューターソフトウェアプログラムによって分析した。
【０１６２】 オリゴヌクレオチド この研究に用いた合成オリゴヌクレオチドを、表４にまとめた。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置(Applied Biosystem)を用いて一本鎖Ｄ ＮＡとして合成し、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した
。
【０１６３】 結果 ｓｇｍＲＮＡはＰＲＲＳＶビリオンにパッケージされない。 ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡがパッケージされるかどうかを決定するため、ＰＲ
ＲＳＶ単離体ＩＳＵ３９２７のビリオンをＣｓＣｌグラディエントによって精製
した。精製ビリオンをＲＮアーゼで処理した後、ビリオンをペレット化して、Ｒ
ＮＡを抽出し、ビリオン表面に付着した総てのＲＮＡ種を除去した。ＰＲＲＳＶ
感染細胞の単離体ＩＳＵ３９２７からの総細胞内ＲＮＡと共にＲＮアーゼＡで処
理したビリオンからのＲＮＡをホルムアルデヒドゲル中で分離し、プライマーＰ
Ｐ２８４およびＰＰ２８５を用いるＰＣＲによってウイルスゲノムの３′末端配
列から生成したプローブを用いてハイブリダイゼーションした（米国特許出願連
続番号第０８／１３１，６２５号明細書；表４）。
【０１６４】 ゲノムＲＮＡのみがＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ３９２７の精製ビリオン中に検出
され（図４）、ｓｇｍＲＮＡの検出可能な量は３週間の暴露の後でも精製ビリオ
ンには見られなかった。対照的に、ゲノムＲＮＡの他に、７種のｓｇｍＲＮＡが
ＩＳＵ３９２７で感染した細胞で検出された（図４）。同様な結果は、２つの他
の米国単離体ＩＳＵ５５およびＩＳＵ７９で観察された。
【０１６５】 異なるビルレンスを有する米国ＰＲＲＳＶ単離体中のｓｇｍＲＮＡの数の変動 米国ＰＲＲＳＶおよび欧州ＰＲＲＳＶなどの本発明前に既知の総てのアルテリ
ウイルスは、７つのｓｇｍＲＮＡを合成する３種類のＬＤＶ変異体（ＬＤＶ−Ｐ
、ＬＤＶ−ａおよびＬＤＶ−ｖ）を除き６個のｓｇｍＲＮＡを産生することが示
された。しかしながら、６個のｓｇｍＲＮＡのネステドセットがＬＤＶ−Ｃ株で
産生される。
【０１６６】 米国ＰＲＲＳＶ単離体中のｓｇｍＲＮＡには変動があるかどうかを比較するた
め、ＣＲＬ１１１７１細胞の集密的単層に異なるビルレンスを有する米国ＰＲＲ
ＳＶの５種類の異なる単離体を０．１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。総細胞内Ｒ
ＮＡを、感染から２４時間後にウイルス感染細胞から単離した。ｃＤＮＡ断片を
、プライマーＰＰ２８４およびＰＰ２８５を用いるＰＣＲによってウイルスゲノ
ムの究極３′末端から生成させた（表４）。ｃＤＮＡ断片をランダムプライマー
伸張法によって３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識し、（ホルムアルデヒドゲル条で分離し
た）総細胞内ＲＮＡとハイブリダイゼーションした。
【０１６７】 ＲＮＡの分析では、ゲノムＲＮＡの他に６個以上のｓｇｍＲＮＡのネステドセ
ットが、異なるビルレンスを有する米国ＰＲＲＳＶの５個の単離体の１つで感染
させた細胞中に存在することが示された（図５）。同様な結果は、総細胞内ＲＮ
Ａをグリオキサール−ＤＭＳＯアガロースゲル上で分離したときに得られた。Ｐ
ＲＲＳＶ単離体のＩＳＵ５５、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ３９２７は、７種類の容
易に識別可能なｓｇｍＲＮＡを産生し、単離体ＩＳＵ２２およびＩＳＵ１８９４
は６種類のｓｇｍＲＮＡを産生した（図５）。米国ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３８
５は、６種類のｓｇｍＲＮＡも産生する（米国特許出願連続番号第０８／１３１
，６２５号明細書）。ｓｇｍＲＮＡの追加種は、ｓｇｍＲＮＡ３および４の間に
位置し、ｓｇｍＲＮＡ３−１と命名した。ｓｇｍＲＮＡは、５個のＰＲＲＳＶの
単離体中で大きさがほとんど異ならず、異なっていても僅かであった（図５）。
しかしながら、肺ビルレンスとこれら５種類の単離体で観察されるｓｇｍＲＮＡ
の数との間には相関はないと思われる。
【０１６８】 ｓｇｍＲＮＡ３−１は欠陥のある干渉性ＲＮＡではなく、プローブのリボソー
ムＲＮＡへの非特異的結合の結果ではない。 コロナウイルスでは、ＭＨＶを高ｍ．ｏ．ｉ．で組織培養で連続的に継代する
ときに、様々な大きさの様々な欠陥のある干渉性ＲＮＡ（ＤＩＲＮＡ）が生成し
た。ＤＩＲＮＡは、未希釈継代の際のトロウイルスに感染した細胞でも観察され
た。従って、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡ３−１がＤＩＲＮＡとなる可能性を検討
した。
【０１６９】 この可能性を除外するため、ｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種を産生するＰＲＲＳ
Ｖ単離体ＩＳＵ７９の元のウイルス保存株を、それぞれ０．１、０．０１および
０．００１の異なるｍ．ｏ．ｉ．でＣＲＬ１１１７１細胞中で４回継代した。コ
ントロール実験では、ＩＳＵ７９の元のウイルス保存株の４回の未希釈継代を行
った。４回の継代の後、総細胞内ＲＮＡをウイルス感染細胞から単離し、ノーザ
ンブロット分析をウイルスゲノムの究極３′末端から生成した同じプローブを用
いて繰返した。
【０１７０】 ｓｇｍＲＮＡの分析では、ｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種が様々なｍ．ｏ．ｉ．
を有する総てのＲＮＡ製剤並びに未希釈継代からのＲＮＡ製剤に存在することが
示された（図６Ａ）。更に、ＤＩＲＮＡを用いる場合に通常に見られるように、
ｓｇｍＲＮＡ３−１の存在下では他のｓｇｍＲＮＡの合成には干渉や減少はなか
った。
【０１７１】 ２回の高希釈継代の後には、ＭＨＶのＤＩＲＮＡは消失することが示された。
従って、ＩＳＵ７９の元のウイルス保存株がＤＩＲＮＡを含むときには、ＤＩＲ
ＮＡは４回の高希釈継代の後に消失することが示された。上記の実験データーは
、ＤＩＲＮＡとは異なり、ｓｇｍＲＮＡ３−１の複製は標記位の量から独立して
いることを示している。従って、ｓｇｍＲＮＡ３−１は、ＤＩＲＮＡではない。
【０１７２】 総細胞内ＲＮＡのノーザンブロット分析では、プローブは総細胞質ＲＮＡ製剤
中に豊富に含まれる１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡに非特異的に結合する
ことができる。あるいは、多量に存在するリボソームＲＮＡは、ゲル中のリボソ
ームＲＮＡと共に波形で同時移動することができるウイルス特異的ｓｇｍＲＮＡ
の遅延を引起すことがある。
【０１７３】 リボソームＲＮＡへのプローブの非特異的結合による２つの追加バンドは、Ｌ
Ｖ感染細胞およびＬＤＶ感染細胞で観察された。従って、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲ
ＮＡ３−１は、プローブのリボソームＲＮＡへの非特異的結合による可能性があ
る。
【０１７４】 この可能性を除外するため、ポリアデニル化ＲＮＡを、２個のＰＲＲＳＶ単離
体ＩＳＵ５５およびＩＳＵ７９のいずれかで感染したＣＲＬ１１１７１細胞の総
細胞内ＲＮＡから単離した。ＩＳＵ５５およびＩＳＵ７９はいずれも、ｓｇｍＲ
ＮＡ３−１の追加種を産生する（図５）。ポリアデニル化ＲＮＡのノーザンブロ
ット分析は、これら２種類の単離体のいずれかで感染した細胞中にｓｇｍＲＮＡ
３−１の追加種が存在することを示し、ｓｇｍＲＮＡ３−１は、プローブのリボ
ソームＲＮＡへの非特異的結合によらないことを示唆していた。
【０１７５】 ｓｇｍＲＮＡは３′共末端ネステドセットを表し、ｓｇｍＲＮＡ３−１はＯＲ
Ｆ４の上流の配列から誘導される。ゲノムＲＮＡの他に、６個のｓｇｍＲＮＡは
ウイルスゲノムの究極３′末端からのｃＤＮＡプローブを用いてＶＲ２３８５で
感染した細胞で検出される（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６２５号明
細書）。従って、ベルンウイルス（ＢＥＶ）、ＬＤＶ、ＥＡＶ、コロナウイルス
およびＬＶと同様にして、米国ＰＲＲＳＶの複製にはｓｇｍＲＮＡの３′共末端
ネステドセットの合成も必要である（米国特許出願連続番号第０８／１３１，６
２５号および第０８／３０１，４３５号明細書）。
【０１７６】 これらのｓｇｍＲＮＡを更に詳細に分析するため、ＯＲＦ１ｂ〜７のそれぞれ
について特異的な７種類のｃＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲのた
めのプライマーの設計は、ＶＲ２３８５の配列に基づいていた。プライマー、す
なわちＯＲＦ１ｂについてＩＭ７２９およびＩＭ７８２、ＯＲＦ２についてＩＭ
３１２およびＩＭ３１３、ＯＲＦ３についてＸＭ１０２２およびＩＭ２５８、Ｏ
ＲＦ４についてＸＭ１０２４およびＸＭ１０２３、ＯＲＦ５についてＰＰ２８６
およびＰＰ２８７、ＯＲＦ６についてＰＰ２８９およびＸＭ７８０、およびＯＲ
Ｆ７についてＰＰ２８４およびＰＰ２８５、および３′非コード領域（ＮＣＲ）
の配列および位置を、表４に示す。プライマーは、プライマーのそれぞれの組が
特定のＯＲＦからの断片を増幅するだけであり、隣接ＯＲＦ間の重複配列はいず
れの所定の断片にも含まれないような方法で設計した。従って、これらの７個の
ＤＮＡ断片のそれぞれは、ＯＲＦ７および３′−ＮＣＲの両方を表す断片７を除
き１個の特定のＯＲＦのみを表す。
【０１７７】 これらの７個のＤＮＡ断片に３２Ｐ−ｄＣＴＰを標識して、ＰＲＲＳＶの２種
類の米国単離体ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のいずれかに感染した細胞から
抽出される総細胞内ＲＮＡのノーザンブロットにハイブリダイズした。擬似感染
したＣＲＬ１１１７１細胞から単離した総細胞内ＲＮＡは、コントロールとして
包含された。
【０１７８】 ノーザンブロット分析は、ＯＲＦ１ｂから生成したプローブ１はゲノムＲＮＡ
とのみハイブリダイズすることを示した。プローブ２〜７はそれぞれゲノムＲＮ
Ａの他に１以上の追加ＲＮＡ種とハイブリダイズする（図７）。これらの結果は
、６個（ＩＳＵ１８９４）またはそれ以上（ＩＳＵ７９）の３′共末端ネステド
セットが、ＯＲＦ７をコードする最小の３′末端ＲＮＡ（ｓｇｍＲＮＡ７）を有
するＰＲＲＳＶ感染細胞で形成されることを示している（図７Ａおよび７Ｂ）。
米国ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡは総て、ゲノムＲＮＡの３′末端を含むが、所定
のｓｇｍＲＮＡの大きさによってゲノムの５′末端に向かって様々な距離で伸張
する。
【０１７９】 ＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ３−１は、プローブ４〜７とハイ
ブリダイズするが、プローブ１、２および３とはハイブリダイズせず、ｓｇｍＲ
ＮＡ３−１がＯＲＦ４〜７並びに３′−ＮＣＲを含むことを示している。従って
、ｓｇｍＲＮＡ３−１は、ＯＲＦ４の上流の配列から生成される。
【０１８０】 単一ヌクレオチド置換により、ｓｇｍＲＮＡ３−１の追加種が得られる。ノー
ザンブロットハイブリダイゼーションデーターは、ｓｇｍＲＮＡ３−１がＯＲＦ
４の上流の配列から誘導されることを示した（図７Ｂ）。ｓｇｍＲＮＡ３−１の
正確な位置およびリーダー−ｍＲＮＡ接合配列を決定するため、プライマーの組
ＩＭ７５５およびＤＰ５８６を設計した（表４）。
【０１８１】 プライマーＩＭ７５５およびＤＰ５８６を用いるＲＴ−ＰＣＲを、ＩＳＵ１８
９４またはＩＳＵ７９のいずれかで感染した細胞から単離した総細胞内ＲＮＡを
用いて行った。ＩＳＵ７９はｓｇｍＲＮＡ３−１を生成するが、ＩＳＵ１８９４
は生成しない（図５）。３０秒間のＰＣＲ伸張を行い、ｓｇｍＲＮＡ３、４およ
び３−１の５′末端配列を表す短い断片を優先的に増幅した。
【０１８２】 ＲＴ−ＰＣＲ生成物の分析では、大きさが約１．１ｋｂおよび０．４５ｋｂの
２個の断片を、ＩＳＵ１８９４ウイルスに感染した細胞の総ＲＮＡから増幅した
（図８Ａ）。これらの２個の断片は、それぞれｓｇｍＲＮＡ３および４の５′部
分を表す。ＩＳＵ１８９４の単離体で観察された２個の断片に加えて、ｓｇｍＲ
ＮＡ３−１の５′部分を表す約０．６ｋｂの第三の断片もＩＳＵ７９で感染した
細胞の総ＲＮＡから増幅した（図８Ａ）。
【０１８３】 ｓｇｍＲＮＡ３、４および３−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列を決定するた
め、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のＲＴ−ＰＣＲ生成物をGENECLEANキット(
Bio 101, Inc.)を用いてアガロースゲルから精製し、自動ＤＮＡシークエンサー
(Applied Biosystem)を用いて直接配列決定した。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の５′末 端を配列決定するのに用いたプライマー（ＸＭ１４１およびＸＭ０７７、表４）
を、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のゲノム配列に基づいて設計した（図９）
。２個の米国ＰＲＲＳＶ単離体のｓｇｍＲＮＡ３、４および３−１のリーダー−
ｍＲＮＡ接合配列（リーダーはｓｇｍＲＮＡの合成中にｍＲＮＡ本体に結合する
）を、２個の単離体のｓｇｍＲＮＡおよびゲノムＲＮＡの５′末端の配列を比較
することによって決定した（図８Ｂ）。
【０１８４】 ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ３および４のリーダー−ｍＲ
ＮＡ接合配列は、同一であった。ｓｇｍＲＮＡ３については、リーダー−接合配
列（ＧＵＡＡＣＣ）はＯＲＦ３の８９ヌクレオチド上流に位置している。ｓｇｍ
ＲＮＡ４については、ＵＵＣＡＣＣはＯＲＦ４の１０ヌクレオチド上流に位置し
ている（図８Ｂおよび図９）。ＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ３−１のリーダー−ｍ
ＲＮＡ接合配列はＵＵＧＡＣＣであって、ＯＲＦ４の２３６ヌクレオチド上流に
位置している（図８Ｂおよび９）。
【０１８５】 ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のゲノム配列の配列整列は、ＩＳＵ１８９４
におけるＴからＩＳＵ７９におけるＣへの単一ヌクレオチド置換により、ＩＳＵ
７９における追加のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列ＵＵＧＡＣＣが得られることを
示している（図８Ｂおよび９）。従って、ｓｇｍＲＮＡ（３−１）の追加種が形
成される（図５）。ｓｇｍＲＮＡ４に含まれるＯＲＦ４〜７の他に、ｓｇｍＲＮ
Ａ３−１は５′末端に４５アミノ酸のコード容量を有する追加の小さなＯＲＦ（
ＯＲＦ３−１）を含む（図９）。この小さなＯＲＦは、ＯＲＦ４の開始コドンの
ちょうど１ヌクレオチド前で停止する。
【０１８６】 ２個の米国単離体のＯＲＦ２〜７の配列分析により、リーダーｍＲＮＡ接合配
列の不均一性が明らかになる。 ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のＯＲＦ２〜５をクローニングし、配列決定
した（上記の実験１参照）。ＩＳＵ７９は７個の容易に識別可能なｓｇｍＲＮＡ
を生成するが、ＩＳＵ１８９４は６個の識別可能なｓｇｍＲＮＡを生成する（図
５および７）。ＯＲＦ２〜５の任意の所定の領域における少なくとも３個のｃＤ
ＮＡクローンを、普遍および逆プライマー並びにウイルス特異的プライマーＸＭ
９６９、ＸＭ９７０、ＸＭ１００６、ＸＭ０７８およびＸＭ０７７を用いてそれ
ぞれのウイルス単離体について配列決定した（表４）。ＩＳＵ１８９４およびＩ
ＳＵ７９のＯＲＦ６および７の配列は、米国特許出願連続番号第０８／３０１，
４３５号明細書に開示されている。
【０１８７】 配列分析は、ＩＳＵ７９およびＩＳＵ１８９４のＯＲＦ２〜７が、ＯＲＦ４お
よびＯＲＦ５の間の１０ヌクレオチドの非コード領域を除き、互いに重複してい
ることを示した。同じ知見は、ＶＲ２３８５について以前に得られていた（米国
特許出願連続番号第０８／３０１，４３５号明細書）。これはＬＶなどの提案し
たArteriviridae科の総ての成員が重複している０ＲＦを含むので、極めて異例 である。しかしながら、コロナウイルスのＯＲＦは、遺伝子間非コード配列によ
って隔てられている。従って、米国ＰＲＲＳＶは、ＯＲＦ４および５の接合領域
におけるゲノム構成に関してコロナウイルスに幾分類似していると思われる。
【０１８８】 ＩＳＵ１８９４のＯＲＦ２は、ＩＳＵ７９より１アミノ酸だけ長い（図９）。
ＯＲＦ２の停止コドンＴＡＧは、ＩＳＵ１８９４ではＴＧＧに変化し、直ぐ後に
ＩＳＵ１８９４での新たな停止コドン（ＴＧＡ）が続いていた（図９）。ＩＳＵ
７９およびＩＳＵ１８９４の他のＯＲＦの大きさは同一であった（図９）。しか
しながら、ＩＳＵ７９とＩＳＵ１８９４との間のＯＲＦ２〜７の全配列中には多
数の置換が存在する（図９）。
【０１８９】 測定したまたは予想したリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の数および位置は、ＩＳ
Ｕ１８９４とＩＳＵ７９との間で変化した（図９）。ＯＲＦ４の１０ヌクレオチ
ド上流の正規のリーダー−ｍＲＮＡ４接合配列ＴＴＣＡＣＣの他に、ＩＳＵ７９
におけるＯＲＦ４の２３６ヌクレオチド上流に位置した追加のリーダー−ｍＲＮ
Ａ３−１接合配列（ＴＴＧＡＣＣ）があった（図９）。ｓｇｍＲＮＡ４および３
−１のリーダー−ｍＲＮＡ接合配列は２２６ヌクレオチドだけ離れており、ノー
ザンブロット分析（図５）およびＲＴ−ＰＣＲ増幅（図８Ａ）で観察されたｓｇ
ｍＲＮＡ４および３−１の推定の大きさと相関した。
【０１９０】 リーダー−ｍＲＮＡ３接合配列は、ＩＳＵ１８９４とＩＳＵ７９との間で同一
のＧＴＡＡＣＣであり、ＯＲＦ３の８９ヌクレオチド上流に位置した。ＩＳＵ１
８９４およびＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡ２および６の予想リーダー−ｍＲＮＡ接
合配列も同一であった（図９）。
【０１９１】 しかしながら、ＩＳＵ１８９４とＩＳＵ７９の予想したリーダー−ｍＲＮＡ５
接合配列は異なっている（図９）。ＩＳＵ７９については３個の潜在的リーダー
−ｍＲＮＡ５接合配列がある（ＧＣＡＡＣＣ、ＧＡＧＡＣＣおよびＴＣＧＡＣＣ 、それぞれＯＲＦ５の５５、７０および１０５ヌクレオチド上流に位置している
）。２個の潜在的リーダー−ｍＲＮＡ５接合配列も、ＩＳＵ１８９４に見られた
（ＧＡＡＡＣＣおよびＴＣＧＡＣＣ、それぞれＯＲＦ５の７０および１０５ヌク
レオチド上流に位置した）（図９）。これらの差は、これらの単離体の予想した
リーダー−ｍＲＮＡ５接合配列における２ヌクレオチド置換によるものであった
（図９）。
【０１９２】 ＯＲＦ７の１５ヌクレオチド上流のリーダー−ｍＲＮＡ７接合配列の他に、こ
れら２個の単離体のそれぞれにおけるＯＲＦ７の１２９ヌクレオチド上流に位置
する追加のリーダー−ｍＲＮＡ７接合配列（ＡＴＡＡＣＣ）が見出された（図９
）。しかしながら、この追加のリーダー−ｍＲＮＡ７接合配列に相当するｓｇｍ
ＲＮＡは、ノーザンブロット分析で広範に拡散したバンドを生じた多量に存在す
るｓｇｍＲＮＡ７と明確に識別されなかった（図５、６および７）。
【０１９３】 この実験で分析したＬＶと２個の米国単離体とのリーダー−ｍＲＮＡ接合配列
の数および位置の変動は、ＬＶのリーダー−ｍＲＮＡ接合配列を２個の米国単離
体であるＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のそれと比較することによっても見出
した。総合すれば、これらのデーターは、ＰＲＲＳＶのｓｇｍＲＮＡが多形であ
り、ｓｇｍＲＮＡの数および正確な大きさは分析を行った特定のＰＲＲＳＶ単離
体によって変化することを示している。しかしながら、６個のｓｇｍＲＮＡのネ
ステドセットが標準的なアルテリウイルスゲノム構成および転写を最もよく反映
していると思われる。
【表４】
【０１９４】 例３ 細胞系ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１を用いて、ＰＲＲＳＶ単離体を増殖させた。
細胞系の保持およびウイルスの単離は、以前に記載したのと同じであった(Meng
et al., J. Gen. Virol., 75:1795-1801 (1994); Meng et al., J. of Veterina
ry Diagnostic Investigation, 8:374-381 (1996))。形質細胞腫細胞系ＳＰ２／
Ｏを用いて、ＭＡｂ調製における細胞融合を行った。ＰＲＲＳＶＡＴＣＣＶＲ２
３８５を、ＰＲＲＳＶに特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
のスクリーニングの抗原として用いた。
【０１９５】 間接免疫蛍光分析法（ＩＡＦ） ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞の単層に、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５を０．１の
感染多重度で接種し、４８時間インキュベーションし、メタノールで固定した。
ハイブリドーマ上清を、固定した細胞単層上で３７℃にて３０分間インキュベー
ションした。フルオレセイン標識したヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）接合体を
用いて、特異反応を検出した。１個のＰＲＲＳＶＮ（ＯＲＦ７生成物）特異的モ
ノクローナル抗体ＰＰ７ｅＦ１１を正のコントロールとして用い、非ＰＲＲＳＶ
特異的ＭＡｂからの細胞培養上清ＰＰＡｃ８を負のコントロールとして用いた。
【０１９６】 ＭＡｂ製剤 ＰＲＲＳＶＯＲＦ４および５の組換えバキュロウイルスを感染した昆虫細胞か
らの全細胞溶解生成物を免疫源として用いて、マウスを免役した。ＰＲＲＳＶＯ
ＲＦ４および５を含む組換えバキュロウイルスの構築は、以前に報告したとおり
の方法で行った(Bream et al., J. Virol., 67:2665-2663 (1993))。簡単に説明
すれば、ＰＲＲＳＶＯＲＦ４および５遺伝子を、個別にＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＩの制限部位を含むプライマーを用いて、ｐＰＳＰ・ＰＲＲＳＶ２〜７の鋳型
からＰＣＲ増幅した(Morozov et al., Archives of Virology, 140:1313-1319 (
1995))。増幅した断片を上記の制限酵素で切断し、ベクターＰＶＬ１３９３(Inv
itrogen)に連結した。挿入した遺伝子はポリヒドリン遺伝子プロモーターの制御
下にあり（O'Reilly et al., バキュロウイルス発現ウイルス: 実験室便覧(Bacu
lovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual), １０７〜２３４頁，第２
版，ニューヨーク：W.H. Freeman and Company (1992))、制限酵素消化およびＰ
ＣＲ増幅によって確かめた。次に、組換えベクターＤＮＡおよび線形化したAuto
grapha Califomia multinuclear polyhedrosis virus DNA (Invitrogen)を説明 書に記載の方法でＳｆ９細胞に同時トランスフェクションした。組換えバキュロ
ウイルス中の挿入遺伝子は、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅によって
確かめた(O'Reilly et al., 1992)。組換えウイルスを用いて、昆虫細胞に接種 し、細胞溶解生成物をマウスの免疫に用いた。免疫は、２週間間隔で３〜５回の
腹腔内注射によって行った。脾臓細胞を以前に報告されている方法でＳＰ２／Ｏ
骨髄腫細胞とハイブリダイゼーションした(Brown & Ling, 「ネズミモノクロー
ナル抗体(Murine Monoclonal Antibodies)」／抗体：実際的方法(Antibodies: a
practical approach), ８１〜１０４頁，Catty D. Zoxford監修，Washing, D.C., IRL Press (1988))。ハイブリドーマを、ＩＦＡを用いてＰＲＲＳＶ特異 抗体の分泌についてスクリーニングし、ＰＲＲＳＶＡＴＣＣＶＲ２３８５との反
応を検出した。正のハイブリドーマを選択して、３回クローニングした。４個の
ＭＡｂをＧＰ４に対して展開し、６個のＭａｂをタンパク質に対して展開した。
Ｍａｂを、MonoAb IDキット(Zymed Laboratories Inc.)でイソタイプとした。
【０１９７】 酵素結合イムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ） ＥＬＩＳＡは、詳細に記載されている（Harlow & Lane, 抗体：実験室便覧(An
tibodies: A laboratory manual)，４７１〜６１２頁，Cold Spring Harbor Lab
oratory, ニューヨーク(1988); Ausubel et al., 分子生物学の簡単な方法(Shor
t protocols in molecular biology)，１１．５〜１１．７頁，第２版，ニュー ヨーク，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992)）。コ ーティング抗原を、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５感染細胞から１％Triton X-100で抽
出した。ＭＡｂを、プレートに結合する抗原を用いてＥＬＩＳＡでの結合活性に
ついて試験した。正常細胞からの抽出物および非ＰＲＲＳＶ特異的ＭＡｂからの
細胞培養液ＰＰＡｃ８を、それぞれ負の抗原および負のコントロールとして用い
た。ＰＲＲＳＶＮ特異的ＭＡｂであるＰＰ７ｅＦ１１を、正のコントロールとし
て用いた。特異的反応を、ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ペルオキシダーゼ接
合体を用いて検出し、基質２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリ
ン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を用いて確かめた。次に、光学密度を４０５
nm（Ａ４０５）で測定した。
【０１９８】 固定細胞ＥＬＩＳＡは、以前に報告されている方法で行い(van Nieuwstadt et
al., J. Virol., 70:4767-4772 (1991))、ＭＡｂとＰＲＲＳＶの農場単離体と の反応性を試験した。簡単に説明すれば、ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞の単層
にＰＲＲＳＶの農場単離体を０．００１の感染多重度で接種し、４８時間インキ
ュベーションし、メタノールで固定した。次に、細胞を１％ＢＳＡで室温にて１
時間ブロックした。ＭＡｂの細胞培養上清を２倍シリーズで希釈し、固定細胞プ
レートに加えた。ＰＰ７ｅＦ１１およびＰＰＡｃ８を、それぞれ正および負のコ
ントロールとして用いた。特異的反応を、上記の方法で検出した。
【０１９９】 イムノブロット法 ウェスタンイムノブロット分析は、以前に報告されている通りに行った（Harl
ow & Lane, 抗体：実験室便覧(Antibodies: A laboratory manual)，４７１〜６
１２頁，Cold Spring Harbor Laboratory, ニューヨーク(1988)）。タンパク質 試料を様々な条件下で処理した後、ゲルで分離した。変性条件については、試料
を２％SDＳおよび５％２−メルカプトエタノールを含むLaemmli試料中１００℃ で３分間処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。非変性条件下では、試料を１％Tr
iton X-100を含む試料緩衝液中で４０℃にて２０分間処理し、ＰＡＧＥにかけた
。次に、分離したタンパク質を、電気泳動によってニトロセルロース膜に移した
。ニトロセルロース膜を、３％ＢＳＡでブロックした。ＭＡｂを、マルチスクリ
ーニング装置を用いて膜上での抗原との反応性についてスクリーニングした。ブ
タ抗ＰＲＲＳＶ血清を正のコントロールとして用いて、ＰＰＡｃ８由来の細胞培
養物上清を負のコントロールとして用いた。結合した抗体は、ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ＋ＩｇＡ＋ＩｇＭペルオキシダーゼ接合体またはヤギ抗ブタＩｇＧペルオキシ
ダーゼ接合体とインキュベーションした後、４−クロロ−１−ナフトール基質で
発色することによって検出した。
【０２００】 ウイルス中和（ＶＮ）試験 ＭＡｂのウイルス中和活性は、以前に報告された方法を幾つか改良を行って試
験した(Mecham et al., Viral Immunol., 3:161-170 (1990); White et al., J.
Gen. Virol., 71:4767-4772 (1990))。ハイブリドーマ上清を、３０〜７０プラ
ーク形成単位を含む同容積のＰＲＲＳＶと混合し、これを１０％モルモット補体
を含むＤＭＥＭで希釈した。ウイルス−抗体混合物を３７℃で１時間インキュベ
ーションした後、６ウェルプレートでＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞の単層に移
し、３７℃で更に１時間インキュベーションした。次に、アガロース培地混合物
で、単層を被覆した。３７℃で３日間インキュベーションした後、単層を０．０
５％ニュートラルレッド／アガロースで染色した。ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を正の
コントロールとして用い、非ＰＲＲＳＶ特異的ＭＡｂ由来のハイブリドーマ細胞
培地を負のコントロールとして用いた。
【０２０１】 ＩＦＡで同定したＰＲＲＳＶ特異的Ｍａｂ ハイブリドーマを、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５に感染したＡＴＣＣＣＲＬ１１１
７１細胞上でＩＦＡでスクリーニングした。ＩＦＡ陽性のハイブリドーマを選択
して、増幅し、クローニングした。６個のＭＡｂをＰＲＲＳＶＥタンパク質に対
して展開し、４個をＧＰ４に対して展開した。それらの総ては、強度には若干差
があるが強い核周囲蛍光を示し、これはＰＲＲＳＶＮタンパク質特異的ＭＡｂの
細胞質染色とは異なっていた（図１０）。この結果は、オリゴ糖の糖タンパク質
への移行は一般に小胞体およびゴルジ体のような特定の区画で行われるので、Ｇ
Ｐ４およびＥ糖タンパク質はＰＲＲＳＶ感染細胞の非細胞区画で合成され、蓄積
されることを示していた(Pfeffer et al., Ann. Rev. Biochem., 56:829-852 (1
987))。ＧＰ４およびＥは、膜関連糖タンパク質と予想された(Meng et al., 199
4, & Morozov et al., Archives of Virology, 140:1313-1319 (1995))。対照的
に、ＰＲＲＳＶＮタンパク質は塩基性および親水性が高く、ＰＲＲＳＶ感染細胞
の細胞質で合成され、これはＮ−特異的ＭＡｂ染色によりＩＦＡでの蛍光の細胞
質ゾル分布の観察によって示された。総てのＭＡｂは、サブタイプＩｇＭとして
同定した。
【０２０２】 ＥＬＩＳＡにおけるＰＲＲＳＶ抗原との反応性 洗剤処理に対するエピトープの感受性を測定するため、ＥＬＩＳＡを行い、Ｍ
Ａｂの１％Triton X-100で抽出したＰＲＲＳＶ抗原との反応性を試験した。Ｅタ
ンパク質に対するＭＡｂの中では、ＰＰ5bＨ４のみがＰＲＲＳＶ抗原に対して強
い反応性を示した（図１１）。Ｅ特異的ＭＡｂの残部とＰＲＲＳＶ抗原との間に
は、明瞭な反応は見られなかった。ＧＰ４に対するＭＡｂの中では、ＰＰ4bＢ３
のみがＰＲＲＳＶ抗原と穏和な反応性を示した。ＧＰ４に対するＭＡｂの他の３
個は、反応性は全く示されなかった。負のコントロールは、ＥＬＩＳＡでは反応
を示さなかった。
【０２０３】 １０個のＭＡｂの中、ＰＰ５ｂＨ４およびＰＰ４ｂＢ３のみが洗剤抽出したＰ
ＲＲＳＶ抗原とＥＬＩＳＡにおける反応性を示した。この結果は、ＰＰ５ｂＨ４
によって認識されるエピトープは耐Triton X-100処理性であり、ＰＰ４ｂＢ３の
エピトープは部分的に耐洗剤性であることを示唆していた。他の８個のＭＡｂに
よって認識されたエピトープは処理に対して感受性であり、配座依存性であるこ
とがある。Triton X-100は、一般に細胞膜の非変性特性に対して細胞膜を破壊す
るように選択されるが(Deutscher, 「タンパク質精製入門(Guide to protein pu
rification)」，酵素学の方法(Methodsin Enzymology)，第１８２巻，サンディ エゴ，カリフォルニア，Academic Press, Inc. (1990))、この試験ではＰＲＲＳ
Ｖタンパク質のエピトープは、ＭＡｂ結合によって観察したところ、抽出工程の
際に幾分変化した。
【０２０４】 イムノブロット分析 ウェスタンブロッティングを行い、ＭＡｂとＰＲＲＳＶ抗原との反応性を測定
して、ＭＡｂが配座依存性エピトープに対するものであるという推論を確かめた
。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの変性条件下では、ＰＰ５ｂＨ４のみが、ブタ抗ＰＲＲＳ
Ｖ血清を用いて検出した推定物Ｅと一致する２６ｋＤａの位置における精製ＰＲ
ＲＳＶビリオンのバンドを認識した（図１２）。次に、イムノブロッティングを
非変性ＰＡＧＥで行い、エピトープが非変性条件下で保存されるかどうかを試験
した。６個のＭＡｂ〜Ｅの中で、ＰＰ５ｂＨ４のみがＰＲＲＳＶ抗原と反応を示
した。ＭＡｂ〜ＧＰ４の中、いずれもこの試験における条件下では精製ビリオン
または感染細胞中のＰＲＲＳＶ抗原を認識しなかった（結果は示されていない）
。
【０２０５】 ＰＰ５ｂＨ４を除き、ＭＡｂはイムノブロットでＰＲＲＳＶ抗原を認識するこ
とはできず、これらのＭＡｂによって認識されたエピトープは連続的構造から誘
導されないことを示唆していた。ＭＡｂＰＰ５ｂＨ４は２６ｋＤａの位置におい
てＰＲＲＳＶと反応し、Ｅの分子質量についての報告が確認された(Meulenberg
et al., Virology, 192:62-72 (1995))。この結果は、他の９個のＭＡｂによっ てにクローン指揮されたエピトープは洗剤処理に対して感受性であり、ＥＬＩＳ
Ａのものに相当することを示した。また、この結果は、エピトープが配座依存性
であることを示唆していた。ＰＰ４ｂＢ３は、ウェスタンブロットにおいてＰＲ
ＲＳＶ抗原と全く反応性を示さず、これはＰＡＧＥおよび移行の際にエピトープ
が喪失しまたは変更されることによる可能性がある。
【０２０６】 ウイルス中和活性 プラーク減少分析を行って、ＥおよびＧＰ４タンパク質に対するＭＡｂの中に
は、ウイルス中和活性があるかどうかを試験した。１個のみのＥ特異的ＭＡｂ、
すなわちＰＰ５ｄＢ４が、ＶＲ２３８５単離体に対し相同的中和の能力を示した
。正のコントロールであるブタ抗ＰＲＲＳＶ血清も、ウイルス中和活性を示した
。
【０２０７】 ＧＰ４およびＥに対する１０個のＭＡｂの中で、少なくともＰＰ５ｄＢ４はＰ
ＲＲＳＶＶＲ２３８５に対して相同的ウイルス中和活性を示した。ＰＰ５ｄＢ４
はＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット水溶性においてＰＲＲＳＶ抗原を認識す
ることができないので、中和エピトープは配座依存性であった。また、ＰＰ５ｄ
Ｂ４の中和活性は、エピトープの少なくとも一部はビリオン表面上に位置してお
り、ＭＡｂにより接近可能であることを示唆している。ＰＰ５ｄＢ４の中和活性
の機構は明らかでない。これは、ウイルス結合または細胞中への侵入がブロック
されることによるものと考えることができる。
【０２０８】 他のＰＲＲＳＶ単離体との反応性 ＰＲＲＳＶの農場での単離体を増殖させ、固定細胞ＥＬＩＳＡでのＭＡｂの交
差反応性を試験し、他のＰＲＲＳＶ単離体でのエピトープの存在を測定した（表
５）。固定細胞ＥＬＩＳＡを用いたが、これらのＭＡｂのほとんどが配座依存性
エピトープを認識しかつこれらのエピトープを固定細胞に保存することができる
からである。総てのＭＡｂは総ての単離体と反応するが、異なる力価で反応する
。この結果は、ＭＡｂによって認識されたエピトープが、試験した単離体中に保
存されることを示唆している。しかしながら、試験を行った単離体には抗原性の
差がある。力価が２５６以上である場合には、反応性強度は高として任意に定義
され、力価が６４〜１２８である場合には中として、また力価が３２以下である
場合には低として定義された。試験を行った２３個の単離体の中、ＰＲＲＳＶＶ
Ｒ２３８５のみが１０個のＭＡｂの中７個と高い反応性を有した。５個の単離体
は、１０個のＭＡｂの中少なくとも６個と低い反応性を有し、１２個の単離体は
１０個のＭＡｂの中少なくとも６個と中程度の反応性を有し、他の５個の単離体
は半数のＭＡｂと低反応性を有した。ＭＡｂ ＰＰ４ｄＧ６およびＰＰ５ｂＨ４
は、ほとんどの単離体と他のＭＡｂより低い反応性を示した。ＰＰ４ｂＢ３は、
総てのＭＡｂの中で、ＧＰ４およびＥタンパク質に対して最も強い反応性を示し
た。力価の差は、１個のＭＡｂと異なる単離体との反応については６４倍程度で
あり、例えばＰＲＲＳＶＲＰ１０およびＲＰ１２と反応するＭＡｂＰＰ４ｃＢｌ
１の力価は、それぞれ１６および１０２４であった。一方、１個の単離体とのＭ
Ａｂの力価の差は１２８倍程度であり、例えばＰＲＲＳＶＲＰ１１と反応するＭ
ＡｂＰＰ４ｂＢ３およびＰＰ４ｂＣ５の力価はそれぞれ１０２４および８であっ
た。この結果は、異なるＭＡｂによって認識されるエピトープは異なっているこ
とを示唆した。正のＭＡｂコントロールは、ＩＳＵ−５１を除き総ての単離体と
強い反応性を示す。ＭＡｂとＰＲＲＳＶ単離体との反応性の差は、ＶＲ２３８５
、ＩＳＵ２２、ＩＳＵ５５およびＲＰ４５のアミノ酸配列アイデンティティーが
ＯＲＦ４では９４〜９８％であり、ＯＲＦ５では８８〜９７％であるという報告
と一致した(Meng et al., J. Gen. Virol., 140:745-755 (1995))。
【０２０９】 要約すれば、６個のＭＡｂがＰＲＲＳＶＥタンパク質に対して開発され、４個
がＧＰ４に対して開発された。ＰＰ５ｂＨ４を除き、それらの総ては、ＥＬＩＳ
Ａおよびイムノブロッティングによって測定したところ、配座依存性エピトープ
に対するものであった。ＭＡｂＰＰ５ｄＢ４は、ＶＲ２３８５に対してウイルス
中和活性を示した。ＭＡｂとＰＲＲＳＶの農場での単離体との反応性のパターン
は、ＰＲＲＳＶＧＰ４およびＥには抗原性の差があることを示唆し、これにより
ＭＡｂのＰＲＲＳＶＮおよびＯＲＦ３生成物に対するＭＡｂについての以前の報
告が確かめられた(Nelson et al., J. Clinical Microbiology, 31:3184-3189 (
1993); Drew et al., J. General Virol., 76:1361-1369 (1995); Wieczorek-Kr
ohmer et al., Veterinary Microbiology, 51:257-266 (1996))。
【０２１０】 例４ 細胞およびウイルス ＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞を用いてＰＲＲＳＶを増殖させ、ＰＲＲＳＶ精
製は以前に報告された方法で行った(Meng et al., J. Gen.Virol., 75:1795-180
1 (1994); Meng et al., J. Vet. Diag. Invest., 8:374-381 (1996); Halbur e
t al., Vet. Pathol, 32:648-660 (1995))。ＰＲＲＳＶ単離体ＡＴＣＣＶＲ２３
８５(Meng et al., 1994 & Morozov et al., 1995)は、ＯＲＦ２〜４遺伝子のＰ
ＣＲ増幅に用いた。
【０２１１】 Spodoptera frugiperdaクローン９（Ｓｆ９）およびHigh FiveTM (Invitrogen
)昆虫細胞を培養して、バキュロウイルスを増殖させた。バキュロウイルス株Aut
ographa California multinuclear polyhedrosis virus（ＡｃＭＮＰＶ）を、組
換えバキュロウイルス構築のための親ウイルスとして用いた。
【０２１２】 ＡｃＭＮＰＶ組換え体伝達ベクターの構築 ＰＲＲＳＶＯＲＦ２、３および４を別個に含むバキュロウイルス伝達ベクター
の構築を、以前に報告された方法で行った(Bream et al., J. Virol., 67:2655-
2663 (1993))。簡単に説明すれば、ＰＲＲＳＶＯＲＦ２〜４遺伝子は、ＯＲＦ２
および３の遺伝子についてはＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ、ＯＲＦ４についてはＢ
ａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位を含むプライマーで、ｐＰＳＰ・ＰＲＲＳ
Ｖ２〜７プラスミドの鋳型から別個にＰＣＲ増幅した。
【０２１３】 ＯＲＦ２についての前進プライマーは５′ＧＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＡ
ＡＣＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＧＴ３′であり、復帰プライマーは５′ＣＣＡＣＣＴ ＧＣＡＧ ＡＴＴＣＡＣＣＧＴＧＡＧＴＴＣＧＡＡＡＧ３′であった。ＯＲＦ３に
ついての前進プライマーは５′ＣＧＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣ
ＴＡＡＴＡＧＣＴ３′であり、復帰プライマーは５′ＣＧＣＧＣＴＧＣＡＧＴＧ
ＴＣＣＣＴＡＴＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＣ３′であった。ＯＲＦ４についての前進
プライマーは５′ＧＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＡＡＴＴＧＧＴＴＴＣＡＣＣＴＡＴ
ＡＡ３′であり、復帰プライマーは５′ＡＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＣ
ＧＧＣＡＣＧＡＴＡＣＡＣ３′であった。増幅断片を上記の制限酵素で切断し、
ＯＲＦ２および３断片についてはベクターｐＦａｓｔＢＡＣ１(GIBCO BRL)に、 ＯＲＦ４断片についてはベクターＰＶＬ１３９３(Invitrogen)に連結した。挿入
した遺伝子は、ポリヘドリン遺伝子プロモーターによって制御され(O'Reilly et
al., バキュロウイルス発現ベクター：実験室便覧(Baculovirus Expression Ve
ctors: A Laboratory Manual), W.H. Freeman & Co., ニューヨーク（１９９２ 年））、制限酵素消化およびＰＣＲ増幅によって確かめた。次に、ＯＲＦ２〜４
遺伝子を別々に含む組換えベクターを単離して、ＯＲＦ２伝達ベクターについて
はｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ２、ＯＲＦ３伝達ベクターについてはｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ
３、およびＯＲＦ４伝達ベクターについてはｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ４と命名した。
ｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ２およびｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ３については、それらのＤＮＡ
を単離し、Ｂａｃｍｉｄと呼ばれるバキュロウイルスの全ゲノムを含むコンピテ
ントなＤＨ１０ＢＡＣE. coli 細胞(GIBCO BRL)にトランスフェクションした。
【０２１４】 組換えウイルスのトランスフェクションおよび選択 ＯＲＦ２および３について、組換えウイルスをＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣＴＭ発現
系(GIBCO BRL)を用いて生成した。単離した組換えＢａｃｍｉｄＤＮＡをＳｆ９ 昆虫細胞にトランスフェクションした後、細胞培地をウイルス保存物として回収
した。ＯＲＦ４組換えウイルス構築のため、ｐＰＳＰ・Ａｃ−ｐ４ＤＮＡおよび
線形化ＡｃＭＮＰＶＤＮＡ(Invitrogen)を説明書に記載されているようにＳｆ９
細胞に同時トランスフェクションした。推定的組換えバキュロウイルスを、３回
の閉塞体が負のプラーク精製(occlusion body-negative plaque purification) の後に選択した。組換えウイルスに挿入された遺伝子は、ハイブリダイゼーショ
ンおよびＰＣＲ増幅によって確かめた(O'Reilly et al., 1992)。４個の組換え 体を組み換えバキュロウイルスの３株のそれぞれについて選択した。ブタ抗ＰＲ
ＲＳＶ血清を用いる間接免疫蛍光法は、それぞれの株についての４個の組換え体
が同様なタンパク質発現レベルを有することを示した。更に検討を行うため、そ
れぞれの株から１個をＯＲＦ２の組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｐ２、ＯＲ
Ｆ３の組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｐ３、およびＯＲＦ４の組換えウイル
スについてはｖＡｃ−Ｐ４と命名した。
【０２１５】 間接免疫蛍光分析（ＩＦＡ） ＩＦＡは、至る所で詳細に記載されていた(O'Reilly et al., 1992)。簡単に 説明すれば、High FiveTM細胞の単層に、野生型（ｗｔ）のＡｃＭＮＰＶまたは それぞれｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４の組換えウイルスを０
．１の感染多重度で感染させ、７２時間インキュベーションした。ブタ抗ＰＲＲ
ＳＶ血清を用いて、昆虫細胞で発現される特異タンパク質を検出した。総タンパ
ク質発現を、固定した感染細胞で検出し、染色して、蛍光顕微鏡下で観察した。
細胞表面発現を、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清で４℃にて１時間インキュベーションし
た未固定および未透過性化細胞上で検出し、フルオレセインで標識したヤギ抗ブ
タＩｇＧ接合体で４℃にて１時間染色した後、蛍光顕微鏡下で観察した。
【０２１６】 イムノブロッティング ウェスタンイムノブロッティングを、以前に報告された方法で行った（Harlow
& Lane, 抗体：実験室便覧(Antibodies: A laboratory manual)，Cold Spring
Harbor Laboratory, ニューヨーク(1988)）。組換えウイルスまたはｗｔＡｃＭ ＮＰＶで感染させた昆虫細胞からの細胞抽出物を、この分析に用いた。タンパク
質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、電気泳動によってニトロセルロース膜に移した
。膜を、ブタノール抗ＰＲＲＳＶ血清と共に室温にて１時間インキュベーション
した。特異反応をヤギ抗ブタＩｇＧペルオキシダーゼ接合体で検出した後、４−
クロロ−１−ナフトール基質中で発色した。
【０２１７】 ツニカマイシン処理 High FiveTM細胞に、ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３、ｖＡｃ−Ｐ４またはｗｔ ＡｃＭＮＰＶを感染させ、細胞−培地中５μｇ／mlツニカマイシンと共に感染後
０〜７２時間インキュベーションした。未処理の昆虫細胞を、同時にコントロー
ルとして感染させた。細胞溶解生成物を回収して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイム
ノブロッティングを行った(O'Reilly et al., 1992)。
【０２１８】 組換えタンパク質の免疫原性 ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４に感染した昆虫細胞の細胞溶
解生成物を用いて、ウサギでの組換えタンパク質の免疫原性を試験した。２匹の
１２週齢のウサギに、これらの組換えタンパク質をそれぞれ筋肉内および皮下注
射した。２回の追加免疫注射の１０日後に、血液を採取した。抗体を間接ＥＬＩ
ＳＡで試験した(Ausubel et al., 分子生物学の簡単な方法(Short protocols in
molecular biology)，１１．５〜１１．７頁，第２版，ニューヨーク，Green P
ublishing Associates and John Wiley & Sons (1992)）。精製したＰＲＲＳＶ ビリオンを超音波処理し、９６ウェルのプレートのコーティングに用い、ヤギ抗
ウサギＩｇＧへペルオキシダーゼ接合体を用いて、ウサギ血清試料中の抗ＰＲＲ
ＳＶ抗体を検出した。免疫前ウサギ血清を、負のコントロールとして用いた。基
質２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（Ａ
ＢＴＳ）を用いて、特異反応を確かめた。
【０２１９】 結果 組換えウイルスの構築および確認 構築法の詳細を、方法において説明する。ＯＲＦ２および３については、組換
えバキュロウイルスを組み換えＢａｃｍｉｄを含むE. coliから選択した後、Ｓ ｆ９昆虫細胞のトランスフェクションから集めた。組換えウイルスを、更にＤＮ
ＡハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅によって確かめた。感染細胞由来の
ＤＮＡとＯＲＦ２〜４のＰＲＲＳＶ遺伝子由来の特異的プローブとのハイブリダ
イゼーション、およびＰＣＲ増幅のいずれも、組換えバキュロウイルスはクロー
ニングした正しい遺伝子を有することを示していた（データーは示されていない
）。
【０２２０】 組換えウイルスｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４の表面免疫蛍
光 High FiveTM細胞にｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３、ｖＡｃ−Ｐ４またはｗｔＡ ｃＭＮＰＶを感染させ、７２時間インキュベーションし、メタノールで固定して
、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を用いるＩＦＡによって総タンパク質発現を検討した。
未固定および未透過性化昆虫細胞を４℃で染色し、ＩＦＡによって細胞表面の免
疫蛍光を検出した。ｖＡｃ−Ｐ２に感染した細胞では、弱い細胞質蛍光があり、
ｖＡｃ−Ｐ３またはｖＡｃ−Ｐ４に感染した昆虫細胞では強い細胞質蛍光があり
、ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した細胞では特異蛍光は見られなかった（図１７）。
ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４に感染し、４℃で染色し、固定
および透過性化を行わなかった昆虫細胞には、明瞭な細胞表面免疫蛍光が見られ
た（図１５）。細胞表面染色は、ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した昆虫細胞では見ら
れなかった。また、抗体の非存在下において組換えウイルスに感染した昆虫細胞
は、蛍光を全く示さなかった（データーは示さない）。
【０２２１】 発現した組換えタンパク質の分析 High FiveTM細胞の単層にｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３、ｖＡｃ−Ｐ４または ｗｔＡｃＭＮＰＶを０．１の感染多重度で感染させ、７２時間インキュベーショ
ンした。昆虫細胞における組換えタンパク質の発現を、全細胞抽出物を用いて分
析した。総タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロッティン
グによってニトロセルロース膜に移し、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清で検出した（図１
９Ａ）。精製したＰＲＲＳビリオンを加え、同じゲルで分析した。昆虫細胞で発
現したＯＲＦ２生成物は、Ｍｒにおいて２７および２９ｋＤａの種として検出さ
れた。ＯＲＦ３生成物は、２２、２５、２７〜３１および３５〜４３ｋＤａの多
バンド種として検出された。２７〜３１および３５〜４３ｋＤａのＭｒにおける
シグナルは、識別して単一バンドとすることは困難であり、特異なグリコシル化
または部分タンパク質分解による可能性がある。ＯＲＦ４生成物は、１５、１８
、２２、２４、２８および３０ｋＤａの多バンド種として見出された。これらの
特異的バンドは、ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した昆虫細胞では見られなかった。精
製したＰＲＲＳＶ試料では、Ｍｒで少なくとも４つのバンド：１５、１９、２７
〜３１および４５ｋＤａがあった。精製したＰＲＲＳビリオンで検出された特異
的バンドは、正常細胞コントロールでは見られなかった（図１９Ａ）。
【０２２２】 組換えタンパク質をグリコシル化した。 組換えバキュロウイルスまたはｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した昆虫細胞のツニカ
マイシン処理を行い、ツニカマイシンがＮ−結合グリコシル化を阻害するので組
換えタンパク質がＮ−グリコシル化されるかどうかを試験した。処理の後、ＯＲ
Ｆ２組換えタンパク質の２９ｋＤａのバンドが消失し、２５ｋＤａが出現し、２
７ｋＤａの種には変化がなかった（図２０Ａ）。ＯＲＦ３の組換えタンパク質に
ついては、２７〜３１および３５〜４３ｋＤａの種が消失し、２２〜２７ｋＤａ
のバンドには変化がなかった。ＯＲＦ３の組換えタンパク質の２７ｋＤａの種は
、ツニカマイシン処理の後には更に多くなった。Ｎ−グリコシル化阻害の後、Ｏ
ＲＦ４の組換えタンパク質は、１５および１８ｋＤａの種のみとして示され、２
２〜３０ｋＤａのバンドは消失した。１５および１８ｋＤａのバンドは、ツニカ
マイシン処理の後には更に鮮明かつ濃くなった。ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した昆
虫細胞からの抽出物では、シグナルは全く検出されなかった。
【０２２３】 組換えタンパク質の免疫原性 ＯＲＦ２〜４生成物の組換えタンパク質の免疫原性について、ｖＡｃ−Ｐ２、
ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４に感染した昆虫細胞の溶解生成物でウサギを免
役することによって試験した。ウサギ血清試料中の抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在は、
ＥＬＩＳＡによって検出した。免役したウサギの平均力価は、ｖＡｃ−Ｐ２、ｖ
Ａｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４細胞溶解生成物の群についてそれぞれ１９２、１
２８および３８２であった（表６）。
【０２２４】 検討 ＰＲＲＳＶのＯＲＦ２〜４の遺伝子をＢＥＶＳにクローニングし、組換えタン
パク質を昆虫細胞で発現させた。Ｓｆ９細胞で閉塞体が負のプラーク(occlusion
body-negative plaque)を選択する代わりにE. coliで組換えバキュロウイルス の選択工程を行ったので、ＯＲＦ２および３のクローニング法はＯＲＦ４よりも
ずっと速やかであった。High FiveTM細胞でのタンパク質収率はＳｆ９細胞より 高いと考えられているので、Ｓｆ９細胞をバキュロウイルスの増殖に用い、High
FiveTM細胞をタンパク質発現に用いた(Wickham et al., Biotechnology Progre
ss, 8:391-396 (1992) & Davis et al., In Vitro Cell and Developmental Bio
logy, 29A:388-390 (1993))。High FiveTM細胞は無血清培地に適合させ、将来の
タンパク質精製に役立つようにしてあり、また大規模な工業的生産に適する懸濁
培養に適合させることもできる。
【０２２５】 組換えタンパク質は、ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４組換え
ウイルスに感染した昆虫細胞で発現することをＩＦＡによって示された。ｖＡｃ
−Ｐ２に感染した細胞では弱い細胞質蛍光があり、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−
Ｐ４に感染した細胞では強い細胞質蛍光があった。ｖＡｃ−Ｐ２に感染した細胞
の蛍光が弱い理由は知られておらず、メタノールで固定した後のエピトープの変
化による可能性がある。未固定および未透過性化昆虫細胞は４℃で染色して、ブ
タ抗ＰＲＲＳＶ抗体が細胞表面タンパク質のみと反応し細胞質には入らないよう
にした。ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３およびｖＡｃ−Ｐ４組換えウイルスに感染
した昆虫細胞には、明瞭な細胞表面免疫蛍光が見られたが、これは組換えタンパ
ク質が効率的に加工されて、細胞表面に転移されたことを示している。この結果
は、ＯＲＦ２〜４生成物が膜関連タンパク質であることを示唆しており、これは
配列研究からの予測と一致している(Morozov et al., Archives of Virology, 1
40:1313-1319 (1995))。しかしながら、これらの生成物がＰＲＲＳＶに感染した
哺乳類細胞の細胞表面にも転移されまたは組立てて表面タンパク質としてのビリ
オンとなるかどうにかについては明らかではない。最近の報告は、ＯＲＦ３およ
び４生成物がウイルス性構造タンパク質であることを示していた(VAN Nieuwstad
t et al., J. Virol., 70:4767-4772 (1996))。これらのタンパク質の運命を検 討するには、更に実験を行う必要がある。
【０２２６】 免疫ブロット法の結果は、組換えタンパク質が昆虫細胞で効率的に発現したこ
とを示していた。ＯＲＦ２生成物は、Ｍｒが２７および２９ｋＤａの種として検
出された。ツニカマイシン処理により２９ｋＤａバンドがなくなり、２５ｋＤａ
の種が導入され、２７ｋＤａには変化が見られず、２９ｋＤａがＮ−グリコシル
化されたことを示唆していた。ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５ＯＲＦ２の予想Ｍｒは２
９．５ｋＤａであり、２個の可能なグリコシル化部位を有する(Morozov et al.,
1995)。２５ｋＤａの種は、３７〜３８シグナル配列(Meulenberg et al., Viro
logy, 192:62-72 (1995))が成熟タンパク質で除去されるならば、ＯＲＦ２のコ アタンパク質である可能性がある。２９と２５ｋＤａのバンドの４ｋＤａの差は
、１個のグリコシル残基のＭｒが約２〜３ｋＤａであるので、炭水化物構造によ
るものと思われる(Trimble et al., J. Biol. Chem., 250:2562-2567 (1983))。
２７ｋＤａの種は、ツニカマイシン処理に感受性ではなく、Ｏ−結合グリコシル
化または他の翻訳後修飾によって修飾される可能性がある。
【０２２７】 昆虫細胞におけるＯＲＦ３生成物は、免疫ブロット法によって検出された２２
〜４３ｋＤａの多バンド種として示された。２８〜４３ｋＤａの種は、ｖＡｃ−
Ｐ３に感染した昆虫細胞のツニカマイシン処理によって除去され、これらはＮ−
結合糖タンパク質でありかつ多バンドはディファレンシャルグリコシル化(diffe
rential glycosylation)によるものであることを示唆していた。ＰＲＲＳＶＶＲ
２３８５ＯＲＦ３生成物の予想Ｍｒは、２８．７ｋＤａ（ＬＶのものより約２ｋ
Ｄａ小さい）であり、７個の可能なＮ−結合グリコシル化部位を有する(Morozov
et al., 1995)。ＯＲＦ３の組換えタンパク質の２７ｋＤａの種はコアタンパク
質である可能性があるが、これはツニカマイシン処理の後に量が増加し（図２０
Ａ）かつエンドグリコシダーゼＦによる精製ＰＲＲＳＶビリオンの処理の後には
２７ｋＤａのバンドが出現しかつ４５ｋＤａのバンドが消失したからである（デ
ーターは示さない）。２７ｋＤａより小さな種は、切詰めタンパク質(truncated
protein)またはタンパク質分解生成物である可能性がある。無処理試料の２７ 〜４３ｋＤａのバンドは個々のバンドに識別することは困難であり、これらは過
剰負荷または部分タンパク質分解による可能性がある。４３ｋＤａの種は、７個
のＮ−結合グリコシル化部位を有しかつ約２〜３ｋＤａが各グリコシル残基と見
なされているので、完全にグリコシル化された生成物である可能性がある(Trimb
le et al., 1983)。最近の報告は、ＬＶのＯＲＦ３が４５〜５０ｋＤａの構造タ
ンパク質をコードし、昆虫細胞中のＯＲＦ３の組換えタンパク質が放射性免疫沈
澱によってＭｒが２８〜４４ｋＤａとして検出されたことを示していた。２８ｋ
Ｄａの種は、ＬＶＯＲＦ３生成物のコア生成物として見出された。米国特許出願
連続番号第ＰＲＲＳＶとＬＶのＯＲＦ３からの組換えタンパク質のＭｒには差が
あると考えられており、これは用いられる発現系が異なっているかまたはこれら
２種類の単離体でこの遺伝子が異なっていることによる可能性がある。もう一つ
の報告には、バキュロウイルスで発現したＬＶＯＲＦ３のカルボキシ末端の１９
９アミノ酸の組換え融合タンパク質はＮ−グリコシル化されず(Katz et al., Ve
t. Microbiol., 44:65-76 (1995))、これは同一遺伝子からの発現生成物の多様 性が説明されることを示していた。
【０２２８】 昆虫細胞におけるＯＲＦ４は、１５〜３０ｋＤａの多バンド種として検出され
た。ツニカマイシン処理の後には、２２〜３０ｋＤａのバンドはなくなり、１５
，１８ｋＤａのバンドには変化がなく、これは２２〜３０ｋＤａの種が様々な程
度にＮ−グリコシル化されていることを示唆していた。ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５
のＯＲＦ４は、４個の可能なＮ−グリコシル化部位を有する１９．５ｋＤａのタ
ンパク質をコードすると予想された(Morozov et al., 1995)。ＯＲＦ４生成物の
１５ｋＤａの種はコアタンパク質であり、１８ｋＤａのバンドはコアタンパク質
とＯ−結合グリコシル残基または他の修飾物である可能性がある。ＬＶＯＲＦ４
が３１〜３５ｋＤａの構造タンパク質をコードし、昆虫細胞で発現したＯＲＦ４
の組換えタンパク質が１７ｋＤａのコアタンパク質を有する２０〜２９ｋＤａの
種として検出されたことが報告された(VAN Nieuwstadt et al., 1996)。また、 Ｍｒに差があることの理由は、クローニングされる遺伝子の差および発現系が異
なることによると思われる。もう一つの報告は、ＯＲＦ４が十分に保存される領
域ではないことを示すことによって差を説明していた(Kwang et al., J. Vet. D
iag. Invest., 6:293-296 (1994))。
【０２２９】 組換えタンパク質によるウサギの免疫では、これらが抗ＰＲＲＳＶ抗体を誘導
したことを示していた。この結果は、これらの組換えタンパク質が、ＰＲＲＳＶ
に感染した哺乳類細胞におけるそれらの天然の相手と同様な免疫原性を有するこ
とを示唆している。
【０２３０】 この研究は、ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のＯＲＦ２〜４がＢＥＶＳで発現し、昆
虫細胞の細胞質および細胞表面のいずれでも検出されることを示していた。ＯＲ
Ｆ２〜４の組換えタンパク質は、Ｎ−結合糖タンパク質であり、グリコシル化の
程度によって識別される。精製ＰＲＲＳＶビリオンを同時に分析し、免疫ブロッ
ト法で４個のバンドを示した。しかしながら、オリゴクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体を欠いているため、ＯＲＦ２〜４生成物のいずれかが精製ビリオンで
検出されるかどうかを予測することは困難である。ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清の組換
えタンパク質との反応は、これらのタンパク質の天然の結合相手が天然の宿主に
免疫応答を誘導したことを示唆した。ウサギでの抗ＰＲＲＳＶ抗体の誘導は、こ
れらの組換えタンパク質が、ＰＲＲＳＶに感染した天然宿主に天然のＯＲＦ２〜
４生成物と同様な免疫原性を有することを示唆していた。
【表５】
【０２３１】 例５ 細胞およびウイルス ＡＴＣＣ ＣＲＬ１１１７１細胞を用いて、ＰＲＲＳＶを増殖させた(Meng et
al., 1994 and 1996; Halbur et al., 1995)。Spodoptera frugiperda clone 9
（Ｓｆ９）およびHigh FiveTM (Invitrogen)昆虫細胞を用いて、バキュロウイ ルスを増殖させた。ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３８５(Meng et al., 1994 and 199
6)を用いて、遺伝子増幅を行い、ＢＥＶＳにクローニングした。ＰＲＲＳＶビリ
オンは、以前に報告されている方法で精製した(Meng et al., 1994)。バキュロ ウイルスのAutographa california multinuclear polyhedrosis virus（ＡＣＭ ＮＰＶ）株を親ウイルスとして用いて、組換えウイルスを構築した。
【０２３２】 ＡｃＭＮＰＶ組換え転移ベクターの構築 ＰＲＲＳＶ ＶＲ２３８５のＯＲＦ５〜７の核酸配列は、以前に報告されてい
た(Meng et al., 1994)。ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５〜７を個別に含むバキュロウイ ルス転移ベクターの構築は、以前に報告されている方法を用いて行った(Bream e
t al., 1993)。簡単に説明すれば、ＰＲＲＳＶ ＯＲＦ５〜７遺伝子を、Ｂａｍ
ＨＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位を含むプライマーで鋳型ｐＰＳＰ・ＰＲＲＳＶ
２−７プラスミド個別にＰＣＲ増幅した。ＯＲＦ５の前進プライマーは５′ＴＧ
ＣＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＧＧＧ３′であり、復帰
プライマーは５′ＣＧＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣ
ＡＣ３′であった。ＯＲＦ６についての前進プライマーは５′ＧＧＧＧＡＴＣＣ ＡＧＡＧＴＴＴＣＡＧＣＧＧ３′であり、復帰プライマーは５′ＧＧＧＡＡＴＴ Ｃ ＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＡＣ３′であった。ＯＲＦ７についての前進
プライマーは５′ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＣＣ３′であり、
復帰プライマーは５′ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＡＴＴＣ３′であった。
増幅した断片をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、単離して、ベクターＰＶ
Ｌ１３９３(Invitrogen)に連結し、これをまたＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切
断して正確な配向を確保した。挿入遺伝子はポリヘドリン遺伝子プロモーターの
制御下にあり(O'Reilly et al., 1992)、制限酵素消化およびＰＣＲ増幅で確認 した。ＯＲＦ５〜７遺伝子を個別に含んでいる組換えベクターを単離した：ＯＲ
Ｆ５にはｐＰＳＰ．Ａｃ−Ｅ、ＯＲＦ６５にはｐＰＳＰ．Ａｃ−Ｍ、およびＯＲ
Ｆ７にはｐＰＳＰ．Ａｃ−Ｎ転移ベクター。
【０２３３】 組換えウイルスのトランスフェクションおよび選択 Ｓｆ９昆虫細胞を、線形化ＡｃＭＮＰＶＤＮＡ(Invitrogen)およびそれぞれｐ
ＰＳＰ．Ａｃ−Ｅ、ｐＰＳＰ．Ａｃ−ＭおよびｐＰＳＰ．Ａｃ−Ｎの組換えプラ
スミドＤＮＡを用いて、製造業者の指示に従って同時トランスフェクションした
。推定的組換えウイルスを、３回の閉塞体が負のプラーク(occlusion-negative
plaque)の精製後に選択した。組換えウイルスに挿入された遺伝子は、ハイブリ ダイゼーションおよびＰＣＲ増幅によって確かめた(O'Reilly et al., 1992)。 ４個の組換え体を組み換えウイルスの３株のそれぞれについて選択し、ブタ抗Ｐ
ＲＲＳＶ血清を用いる免疫蛍光分析法と同様であることを見出した。それぞれの
株から１個の組換えウイルスを任意に選択し、ＯＲＦ５を含む組換えウイルスに
ついてはｖＡｃ−Ｅ１、ＯＲＦ６を含む組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｍ１
、およびＯＲＦ７を含む組換えウイルスについてはｖＡｃ−Ｎ１と命名した。
【０２３４】 免疫ブロット法 ウェスタン免疫ブロット分析は、以前に報告されている方法に従って行った(H
arlow and Lane, 1988)。感染した昆虫細胞、精製ＰＲＲＳＶまたは正常細胞か らの全タンパク質を、試料として用いた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
し、電気泳動によりニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を３％Ｂ
ＳＡでブロックし、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清と室温にて１時間反応させた。結合抗
体は、ヤギ抗ブタＩｇＧペルオキシダーゼ接合体とインキュベーションした後、
４−クロロ−１−ナフトール基質と発色させることによって検出した。
【０２３５】 ツニカマイシン処理 感染したHigh FiveTM細胞を５μｇ／mlツニカマイシンと共に細胞−培地中で 感染後０〜７２時間インキュベーションし、回収してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った
(O'Reilly et al., 1992)。
【０２３６】 グリコシダーゼによる開裂 組換えタンパク質または精製ＰＲＲＳＶの場合には、エンドグリコシダーゼＦ
／Ｎ−グリコシダーゼＦ混合物（ＰＮＧアーゼＦ）およびエンドグリコシダーゼ
Ｈ(Boehringer-Mannheim Biochemicals)を用いて、製造業者の指示通りに感染Hi
gh FiveTM細胞（０．１ＰＦＵ／細胞；感染後７２時間）からの溶解生成物を処 理した。簡単に説明すれば、１０５個の細胞を、３０μｇのリーシス緩衝液で溶
解した。次に、細胞溶解生成物１０μｇをＰＮＧアーゼＦ、エンドグリコシダー
ゼＨで消化し、または未処理のマーカー保持し、未処理コントロールとして用い
た。試料を３７℃で２４時間インキュベーションした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で
分析した。
【０２３７】 放射性免疫沈澱（ＲＩＰ） 組換えバキュロウイルスまたは野生型（ｗｔ）ＡｃＭＮＰＶに感染したHigh F
iveTM細胞および未感染High FiveTM細胞をメチオニン不含培地で１回洗浄し、感
染から４８時間後に１時間飢餓状態にした。次に、５０ｃｉ／mlのTrans35S標識
（メチオニンおよびシスチン）(Amersham Life Science Inc.)／メチオニン不含
培地を、感染細胞に加えた。３時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＩＰＡリー
シス緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；１ｍＭ ＥＤＴＡ；１５
０ｍＭ ＮａＣｌ；１％ＮＰ４０；１％デオキシコール酸ナトリウム；０．１％
SDＳ）に加えた。免疫沈澱およびゲル電気泳動は、以前に記載されている方法で
行った(Hutchinson et al., J. Virol., 66:2240-2250 (1992))。
【０２３８】 間接免疫蛍光分析（ＩＦＡ） ＩＦＡは、以前に報告されている方法で行った(O'Reilly et al., 1992)。Hig
h FiveTM細胞の単層にｗｔＡｃＭＮＰＶまたは組換えバキュロウイルスを接種し
、７２時間インキュベーションし、固定して、総ての組換えタンパク質発現をブ
タ抗ＰＲＲＳＶ血清で検出した。接種を行った昆虫細胞は、細胞表面タンパク質
の存在についても検討した。未固定で未透過性化細胞をブタ抗血清と４℃で１時
間反応させ、フルオレセインを標識したヤギ抗ブタＩｇＧ接合体と共に４℃で更
に１時間インキュベーションした後、蛍光顕微鏡下で観察した。
【０２３９】 組換えタンパク質の免疫原性 ｖＡｃ−Ｅ１、ｖＡｃ−Ｍ１、およびｖＡｃ−Ｎ１に感染した昆虫細胞の溶解
生成物を、１２週齢のウサギに筋肉内および皮下注射した。２匹のウサギを、Ｅ
、ＭおよびＮ組換えタンパク質のそれぞれについて免役した。３週間の間隔を置
いて、２回の追加接種を行った。注射投与量は、２×１０６個の昆虫細胞由来の
細胞溶解生成物であった。２回目の追加接種の１０日後に、血液を採取した。抗
体は、間接ＥＬＩＳＡで試験した。精製ＰＲＲＳＶビリオンを超音波処理し、９
６ウェルのプレートのコーティングに用い、ヤギ抗ウサギＩｇＧペルオキシダー
ゼ接合体を用いて、ウサギ血清試料中の抗ＰＲＲＳＶ抗体を検出した。免疫前ウ
サギ血清を、負のコントロールとして用いた。基質２，２′−アジノ−ビス（３
−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を用いて、特異的反
応を明らかにした。
【０２４０】 結果 組換えバキュロウイルスにおけるＰＲＲＳＶの存在の確認 ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲ増幅を行い、組換えバキュロウイルスに
クローニングされた遺伝子が含まれていることを確認した。ＰＲＲＳＶ遺伝子か
らのプローブと組換えバキュロウイルスのハイブリダイゼーションにより、ＰＲ
ＲＳＶ遺伝子が組み換えバキュロウイルスに含まれていることが示された。ＰＲ
ＲＳＶ遺伝子からの特異的プライマーによるＰＣＲ増幅では、組換えウイルスか
らでありかつｗｔＡｃＭＮＰＶにはない単一バンドが示された（結果は示されて
いない）。これらの試験により、組換えバキュロウイルスがＰＲＲＳＶ遺伝子Ｏ
ＲＦ５〜７を含むことを確かめた。
【０２４１】 組換えウイルスｖＡｃ−Ｎ１ではなく、ｖＡｃ−Ｅ１およびｖＡｃ−Ｍ１にお
ける表面免疫蛍光 ｖＡｃ−Ｅ１、ｖＡｃ−Ｍ１、ｖＡｃ−Ｎ１およびｗｔＡｃＭＮＰＶに感染し
たHigh FiveTM細胞を、総発現タンパク質および細胞表面発現の存在について検 討した。ｖＡｃ−Ｅ１およびｖＡｃ−Ｍ１に感染した細胞には、弱い細胞質傾向
が見られた。対照的に、ｖＡｃ−Ｎ１に感染した昆虫細胞には、強い細胞質蛍光
が見られ、ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した細胞には、蛍光は見られなかった（図１
８）。ｖＡｃ−Ｅ１およびｖＡｃ−Ｍ１に感染した細胞には、明瞭な細胞表面免
疫蛍光が見られた（図１６）。しかしながら、ｖＡｃ−Ｎ１およびｗｔＡｃＭＮ
ＰＶに感染した昆虫細胞には、表面免疫蛍光は見られなかった。また、組換えウ
イルスに感染した抗体昆虫細胞の非存在下では、蛍光は全く見られなかった（デ
ーターは示されない）。
【０２４２】 昆虫細胞で発現したＯＲＦ５〜７生成物の分析 昆虫細胞での予想タンパク質の発現を分析するため、High FiveTM細胞の集密 単層に、０．１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で、それぞれｖＡｃ−Ｅ１、ｖＡｃ−
Ｍ１およびｖＡｃ−Ｎ１を感染させ、７２時間インキュベーションした。総タン
パク質試料にＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理を行い、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清を用いてウェ
スタンブロット法によって分析した（図１９Ａ）。昆虫細胞で発現した組換えタ
ンパク質Ｅは、１６、１８、２０、２４および２６ｋＤａの多バンド種として検
出された。昆虫細胞で発現したＥは、精製ＰＲＲＳＶにおける２６ｋＤａの種で
ある天然のＥと比較して多様性が大きくかつＭｒが低かった。昆虫細胞で発現し
たＭは、１９ｋＤａのバンドとして検出され、精製ＰＲＲＳＶでの天然Ｍに相当
した。昆虫細胞で発現したＮは、１５ｋＤａのバンドとして検出され、これも精
製ＰＲＲＳＶでの天然Ｎに相当した。これらの特異的バンドは、正常な昆虫細胞
（結果は示されていない）およびｗｔＡｃＭＮＰＶに感染したものでは検出され
なかった。精製ＰＲＲＳビリオンは、同じゲルで分析した。少なくとも５個のバ
ンド１５、１９、２４，２６〜３０および４５ｋＤａが見られた。精製ＰＲＲＳ
ビリオンで検出された特異的バンドは、正常な哺乳類細胞コントロールでは見ら
れなかった。
【０２４３】 バキュロウイルス発現Ｅ、ＭおよびＮのグリコシル化分析 昆虫細胞で発現したＥ、ＭおよびＮがＮ−グリコシル化を行うかどうかを決定
するため、組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞をツニカマイシンで処理
し、Ｎ−結合グリコシル化を阻害した。ツニカマイシン処理の後には、２０〜２
６ｋＤａの種はｖＡｃ−Ｅ１に感染した昆虫細胞では検出されなかったが、１６
および１８ｋＤａのバンドが更に多くなった。ｖＡｃ−Ｍ１およびｖＡｃ−Ｎ１
に感染した細胞では、ＭおよびＮタンパク質のＭｒにはツニカマイシン処理の後
には変化が見られなかった（図２０Ｂ）。
【０２４４】 組換えタンパク質の免疫原性 組換えタンパク質Ｅ、ＭおよびＮを、ｖＡｃ−Ｅ１、ｖＡｃ−Ｍ１およびｖＡ
ｃ−Ｎ１に感染した昆虫細胞の溶解生成物でウサギを免役することによって、免
疫原性について試験した。次に、ＥＬＩＳＡを行い、ウサギ血清試料における抗
ＰＲＲＳＶ抗体の存在について試験した。Ｅ、ＭおよびＮで免役したウサギの平
均力価は、それぞれ３８４、３２０および２，０５６であった（表７）。
【０２４５】 検討 ＰＲＲＳＶの遺伝子Ｅ、ＭおよびＮを含む組換えバキュロウイルスを構築し、
昆虫細胞でＥ、ＭおよびＮを発現させた。High FiveTM細胞のタンパク質収率は Ｓｆ９細胞より高いと考えられるので、Ｓｆ９細胞をバキュロウイルスの増殖に
用い、High FiveTM細胞をタンパク質発現に用いた(Wickman et al., 1992 and D
avis et al., 1993)。
【０２４６】 免疫蛍光分析では、遺伝子Ｅ、ＭおよびＮを含む組換えウイルスに感染した昆
虫細胞でこれらの遺伝子を発現させ、ＥおよびＭは昆虫細胞の細胞表面に輸送さ
れた。この結果は、昆虫細胞で発現したＥおよびＭは膜関連タンパク質であり、
翻訳後修飾において効率的に加工されることを示唆していた。ＥおよびＭの細胞
質免疫蛍光強度が昆虫細胞で低いことの理由は、不明である。感染した昆虫細胞
の固定後にエピトープが喪失しまたは修飾されることによるのかもしれない。ｖ
Ａｃ−Ｎ１に感染した昆虫細胞では、強い細胞質免疫蛍光だけが観察され、表面
蛍光は検出されなかった。この結果は、バキュロウイルス発現Ｎが細胞表面に輸
送されず、細胞質ゾルにあることを示唆していた。この特徴は、配列研究から予
測された極めて親水性のヌクレオキャプシドタンパク質としてのその性質と一致
している(Meng et al., 1994)。
【０２４７】 組換えＥタンパク質は免疫ブロット法で多バンドを示し、Ｍｒが２６ｋＤａよ
り小さいバンドは精製ＰＲＲＳＶでは見られなかった。昆虫細胞で発現したＥは
、精製ＰＲＲＳＶでは２６ｋＤａの種である天然Ｅと比較して、多様性が一層大
きくかつＭｒが低かった（図１９）。多バンドは、翻訳後修飾の際の昆虫細胞で
の差別的グリコシル化によるものであるかもしれない。ツニカマイシン処理によ
り、２０〜２６ｋＤａのバンドがなくなり、１６ｋＤａのバンドの強度が増加し
た。処理後に１８ｋＤａのバンドが存在することは、Ｏ−結合グリコシル化、ホ
スホリル化または他の翻訳後修飾による可能性があった。２０〜２６のバンドは
、昆虫細胞におけるＥの差別的Ｎ−グリコシル化種のバンドを表す。１６ｋＤａ
のバンドは、グリコシル化されていないリーダー不含コアタンパク質である可能
性がある。組換えタンパク質ＥのＰＮＧアーゼＦおよびエンドグリコシダーゼＨ
処理の予備研究では、複雑なグリコシル化が行われることを示していた。ツニカ
マイシンおよびＰＮＧアーゼＦおよびエンドグリコシダーゼＨ処理のいずれでも
、１９および１５ｋＤａのバンドの移動度は変化しなかったので、組換え体Ｍお
よびＮはＮ−結合グリコシル化を行わなかった。これらの結果は、２０〜２６ｋ
Ｄａの組換えタンパク質ＥはＮ−グリコシル化され、昆虫細胞で発現した組換え
ＭおよびＮタンパク質はＮ−グリコシル化されないことを示唆している。ツニカ
マイシン処理後の移動度の変化は、配列研究から決定したＥポリペプチドにおけ
る２個のＮ−結合グリコシル化部位の存在と一致していた(Meng et al., 1994) 。しかしながら、配列研究は、ＭおよびＮポリペプチドには、それぞれ２および
１個の潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位があることを示唆していた。バキュロウ
イルス発現ＭおよびＮでは、Ｎ−結合グリコシル化は検出されなかった。天然の
ものと比較して、昆虫細胞での組換えタンパク質は、免疫ブロット法から分かる
ように、ずっと豊富である（組換えタンパク質の装填量は、図１９ではＰＲＲＳ
Ｖレーンの約１％であった）。しかしながら、オリゴクローナルまたはモノクロ
ーナル抗体なしでは、差を測定することは困難である。
【０２４８】 精製ＰＲＲＳＶについては、少なくとも５個のバンド、１５、１９、２４、２
６〜３０および４５ｋＤａがある。この結果は、ＰＲＲＳＶビリオンには少なく
とも３種類の構造タンパク質があるという以前の報告と一致している(Conzelman
n et al., Virology, 193:329-339 (1993); Nelson et al., J. Clin. Microbio
l., 31:3184-3189 (1994)and Mardassi et al., Arch. Virol., 140:1405-1418
(1994))。精製ＰＲＲＳＶでの４５ｋＤａのバンドは、報告されているようにＯ ＲＦ３生成物である可能性がある(Kapur et al., J. Gen. Virol., 77:1271-127
6 (1996))。２４、２７〜３０ｋＤａの種は数字で表すことはできない。ＰＮＧ アーゼＦおよびエンドグリコシダーゼＨで処理した後、バンドパターンはＰＲＲ
ＳＶ試料については変化した。ＰＮＧアーゼＦで処理したＰＲＲＳＶでは、１６
−ｋＤａのバンドはＥのグリコシル化されていないリーダーが除去されたコアタ
ンパク質を表し、２７−ｋＤａのバンドはＥ、ＭおよびＮの他のＰＲＲＳＶのも
う一つの構造タンパク質を示している可能性がある。しかしながら、これらのバ
ンドの性質は、オリゴクローナルまたはモノクローナル抗体によって決定する必
要がある。
【０２４９】 ウサギ免疫試験の結果は、組換えタンパク質でウサギを免役して得た抗体が天
然のＰＲＲＳＶウイルス抗原を認識することができることを示唆していた。組換
えタンパク質は、ＰＲＲＳＶに感染した哺乳類細胞ではその天然のものと同じ抗
原性を示し、特に組換え体Ｎは、ウサギでＥおよびＮより高い抗体力価を誘導し
た。
【表６】
【０２５０】 例６ ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の改質生ウイルスワク
チンを凍結乾燥ウイルスケーキとして調製し、滅菌水で再構成し、皮下（ＳＣ）
または筋肉内（ＩＭ）経路で投与した。この研究の目的は、３週齢のブタでのＰ
ＲＲＳＶワクチンの免疫原性を１回の２ml用量をＩＭまたはＳＣでワクチン接種
することによって確認することであった。また、ＰＲＲＳＶワクチンが、ビルレ
ントＰＲＲＳＶかぶＩＳＵ−１２によるチャレンジからブタの保護において、２
ml用量をＩＭまたはＳＣで１回ワクチン接種した３週齢のブタで安全でありかつ
有効であるかどうかも決定した。
【０２５１】 動物の選択 ７０頭の雑種ＰＲＲＳＶ血清反応陰性のブタ（陽性比＜０．４に対するＩＤＥ
ＸＸ ＥＬＩＳＡ試料）をEvergreen Partners（ モーリス，ミネソタ）から購 入し、この研究に用いた。総てのブタは、ワクチン接種の時点で３週齢であった
。
【０２５２】 ワクチンの組成 ウイルス株ＩＳＵ−５５を含んでなるＰＲＲＳＶワクチンを、ウイルス継代レ
ベルＸ＋５で生産した。ワクチンは、使用前に２°〜７℃で保存した。ワクチン
は、５個を力価測定した。
【０２５３】 ワクチン接種−効力試験 保存ワクチンを、凍結乾燥ウイルスの一部を滅菌水で再構成することによって
調製した。保存ワクチンを、培地で最小保護用量レベル（用量当たり約１０４Ｔ
ＣＩＤ５０）にまで希釈した。調製したワクチンの典型的な分量を、ウイルス抗
原の定量の目的で−７０℃に保持した。この研究に用いた７０頭のＰＲＲＳＶ血
清反応陰性の感受性の強いブタを、無作為に４つの処理群に分け、下記のように
してわく接種した。
【表７】
【０２５４】 注射部位は、右首（ＩＭ）または側腹部ひだ（ＳＣ）に行った。コントロール
ブタ（ＣおよびＤ群）には、ワクチンやプラシーボワクチンを接種しなかった。
【０２５５】 ワクチン接種の前に、総てのブタから採血してワクチン接種前血清検査を行っ
た。コントロール動物は、チャレンジの前に採血して、ＰＲＲＳＶに対して血清
反応陰性（ＩＤＥＸＸ ＥＬＩＳＡ Ｓ／Ｐ比＜０．４）のままであることを確
かめた。
【０２５６】 チャレンジおよび観察手続き ワクチン接種から３６日後、群Ａ、ＢおよびＣの２０頭のブタのそれぞれを共
通隔離室(common isolation room)で混合し(commingled)、ビルレントＰＲＲＳ Ｖでチャレンジした。群Ｄの動物は、非チャレンジコントロールとして残した。
ビルレントＩＳＵ−１２ＰＲＲＳＶチャレンジウイルスは、アイオワ州立大学（
エイムス、アイオワ）から入手した。ビルレントＩＳＵ−１２ＰＲＲＳＶチャレ
ンジウイルスを、ＰＳＰ３６細胞で膨張させた後、凍結（−７０℃）保存物とし
て保持した。それぞれのブタノールに、チャレンジウイルス２mlを鼻内投与した
。ＰＲＲＳＶチャレンジ保存物を融解し、１０４ＴＣＩＤ５０／２mlに希釈した
後、投与した。チャレンジウイルスは、チャレンジの際には氷に固定した。チャ
レンジウイルス製剤の分量を−７０℃に保持して固定した後、ＰＳＰ３６細胞上
で力価測定した。動物を、−１および０のチャレンジ後日数（ＤＰＣ）に観察し
て、各種臨床症状にについてベースラインおよび１〜１０ＤＰＣを確立した。
【０２５７】 臨床的観察 ブタを、食欲不振、嗜眠、下痢、神経学的症状、呼吸困難、チアノーゼおよび
死亡のようなチャレンジ後の臨床症状について毎日評価を行った。
【０２５８】 肺病変の評価 個々のブタの肺を、チャレンジから１０日後の剖検時に全体的病巣について検
討した。全体的肺病巣の採点者は、それぞれのブタがどの処理群に属しているの
か知らされていなかった。簡単に説明すれば、それぞれの肺葉での肺病巣につい
ての得点は、ＰＲＲＳＶ様病巣（色および組織に基づく）を示す肺葉の比率を計
算して記録し、その肺葉について可能な点数を掛けた。各肺葉についての最大得
点は、肺葉によって占められる全肺容積の相対比によって決定された。次に、総
ての肺葉の背側および腹側の外観からの得点を加えて、各ブタについての総得点
を得た。各動物についての可能な最大総得点は、１００であった。
【０２５９】 統計分析 ワクチン接種体(vaccinates)およびコントロールについての臨床的症状および
全体的病巣の得点を、変動分析を用いて比較した（一般的線形モデル）。非階層
化全体的病巣得点を用いる分散モデルの分析の使用は、正規確率分布内の得点を
当てはめることによって正当化された。パラメーター分析の誤差の比較は、それ
らが正規分布していることを示唆し、分散分析についての主要な仮定を実証して
いた。従って、階層化した全体的肺病巣得点を用いるデーター分析は、必要なか
った。総ての統計分析は、ＳＡＳソフトウェアを用いてＩＢＭコンピューターで
行った。
【０２６０】 結果及び検討 ＶＳコードワクチンでのＰＲＲＳＶ抗原力価 ＰＲＲＳＶワクチン抗原力価測定の結果を、表８に示す。５回の力価測定から
のワクチンの用量当たりの平均ＰＲＲＳＶ力価は、１０３．９２ＴＣＩＤ５０で
あった。
【０２６１】 臨床的観察 ワクチン接種の後、ワクチン接種したブタのいずれにも、臨床的症状は見られ
なかった。ビルレントＰＲＲＳＶＩＳＵ−１２ｐ６を投与した後、ワクチン接種
体およびコントロールブタは、チャレンジ後の１０日間の観察期間中に呼吸器ま
たは神経学的疾患の有意な臨床的徴候は見られなかった。
【０２６２】 全体的肺病巣の病理学 全体的肺病巣の採点の結果を、表９に示す。ＰＲＲＳＶ投与の後、全体的肺表
層の得点は、ＩＭワクチン接種したブタ（群Ａ）では０〜２９であり、平均得点
は１４．１５であり、ＳＣワクチン接種したブタ（群Ｂ）では１〜２７であり、
平均得点は１１．２０であり、ワクチン接種していないチャレンジコントロール
ブタ（群Ｃ）では７〜５７であり、平均得点は２５．８０であり、ワクチン接種
していない非チャレンジコントロールブタ（群Ｄ）では１〜２８であり、平均得
点は１０．９０であった。ＩＭおよびＳＣワクチン接種したブタのいずれも、ワ
クチン接種していないチャレンジコントロールブタより肺病巣は有意に少ない（
ｐ＜０．０５）。ワクチン接種したブタは、ワクチン接種していない非チャレン
ジブタの全体的肺病巣の得点と比較して、全体的肺病巣得点に有意差はなかった
（Ｐ＞０．０５）。ワクチン接種していないチャレンジコントロールブタは、ワ
クチン接種していない非チャレンジコントロールブタより有意に高い全体的肺病
巣を有していた（Ｐ＜０．０５）。
【０２６３】 結論 この研究の結果は、ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルスの改質生ウイルス
ワクチンが、ビルレントＰＲＲＳＶチャレンジによって引起される呼吸器疾患の
予防における補助として３週齢以上の健康なブタに使用するのに有効であること
を示している。改質生ワクチンを接種した３週齢ブタの１００％は、ワクチン接
種の後に局部的または全身的臨床上の悪影響を受けなかった。これらのブタは、
ワクチン接種後の３６日の全観察期間中健康かつ活動的であった。ワクチンを１
０３．９２ＴＣＩＤ５０の用量で筋肉内または皮下投与したブタは、外来性のビ
ルレントＰＲＲＳＶチャレンジ株ＩＳＵ−１２を投与した後は、ワクチン接種し
ていないチャレンジコントロールブタと比較して全体的肺病巣の発現が有意に減
少した（ｐ＜０．０５）。ワクチン接種したブタのチャレンジ後の全体的肺病巣
得点は、ワクチン接種していない非チャレンジコントロールと統計学的に識別で
きなかった（ｐ＞０．０５）。分散のパラメーター分析の誤差の分析では、それ
らが正規分布していることを示唆し、分散分析についての主要な仮定を実証して
いた。ワクチン接種したブタは、いずれもチャレンジ後の期間中に臨床的徴候を
示さなかった。
【表８】
【表９】
【０２６４】 例７ ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３８５の完全配列 材料および方法 ウイルスおよび細胞 ＰＲＲＳＶ単離体ＶＲ２３５５、継代７を、この研究に用いた。連続細胞系Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１１１７１を、ウイルスの成長およびウイルス感染細胞培養からの
ウイルスＲＮＡおよび総ＲＮＡの単離に用いた。
【０２６５】 ｃＤＮＡのクローニングおよびＰＣＲ増幅 ＶＲ２３８５のゲノムのＯＲＦ１領域を特性決定するため、ランダムｃＤＮＡ
λライブラリーをUni-Zap cDNAクローニングキット(Stratagene, ラヨラ, カリ フォルニア）を用いて構築した。簡単に説明すれば、ＣＲＬ１１１７１細胞にＶ
Ｒ２３８５ウイルスを０．１のＭ．Ｏ．Ｉ．で感染させ、感染細胞からの総ＲＮ
Ａを感染から２４時間後にグアニジニウムチオシアネート法を用いて単離した。
最初に、ＯＲＦ２の５′末端に特異的なプローブを用いて、ランダムｃＤＮＡラ
イブラリーをスクリーニングした。このプローブとハイブリダイズしたプラーク
を単離して、精製した。ウイルスｃＤＮＡインサートを含むファージミド(phage
mids)を、ExAssistヘルパーファージおよびE. coli SOLR細胞(Stratagene, ラヨ
ラ, カリフォルニア）を用いるイン・ビトロ切除によって回収した。ＯＲＦ１に
特異的な重複断片とハイブリダイゼーションした後に、大きさが２〜６ｋｂの範
囲のウイルス特異的ｃＤＮＡインサートを有する数個の組換えファージミドを選
択した。次に、ウイルスｃＤＮＡインサートを含むプラスミドを精製し、自動Ｄ
ＮＡシークエンサー(Applied Biosystems, フォスターシティー, カリフォルニ ア）を用いてサンガーのジデオキシヌクレオチド連鎖停止法によって配列決定し
た。普遍、逆およびＰＲＲＳＶ特異的内部プライマーを用いて、配列を決定した
。ＯＲＦ１ａおよび１ｂの配列を表す少なくとも２個の独立したｃＤＮＡクロー
ンを配列決定した。ライブラリーで表されない１つの領域（ｎｔ１９５０〜２０
５０）を、プルーフリーディングTag Extender (Stratagene)のＴａｇＤＮＡポ リメラーゼを用いて、プライマーＩＭ６８７（５−ＣＣＣＣＡＴＴＧＴＴＧＧＡ
ＣＣＴＧＴＣＣ−３′）およびＩＭ２５００（５′−ＧＴＣＡＣＡＡＣＡＧＧＧ
ＡＣＣＧＡＧＣ−３′）でＰＣＲ増幅した。配列決定データーを集めて、Mac Ve
ctor (Ingternational Biotechnologies, Inc., コネチカット）およびGene Wor
ks (IntelliGenetics, カリフォルニア）コンピュータープログラムを用いて分 析した。
【０２６６】 プライマー伸張実験およびＲＮＡ配列決定法 プライマー伸張実験は、SureScript Preamplification System for First Str
and cDNA Synthesis (Gibco BRL)を用いて行った。３２Ｐひょうしきしたオリゴ
ヌクレオチドＲＮＳ（５′−ＣＣＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧ
ＴＣＡＣ−３′）を、総容積が１２μlのＶＲ２３８５のウイルスＲＮＡ０．５ μｇと混合し、ＲＮＡを９０℃で１０分間変性した。試料を、第一鎖ｃＤＮＡ緩
衝液(first strand cDNA buffer)で１９μlの総量に調整し、４２℃で５分間イ ンキュベーションし、プライマーのアニーリングを行った。次に、Super Script
II逆転写酵素を反応に加えて、反応混合物を４２℃または５０℃で 分間イ ンキュベーションした。試料を４０％ポリアクリルアミドゲル中で分析した。リ
ーダーの部分配列を含むプライマー伸張生成物をｐＰＲ５９クローンの配列決定
反応に続いて泳動した。オリゴヌクレオチドＲＮＳは、配列決定反応のプライマ
ーとして作用した。
【０２６７】 精製ウイルスＲＮＡの直接配列決定は、γ３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドＲＮ
Ｓ（５′−ＣＣＡＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣ−３′）
および１５１Ｅｘｔ（５′−ＡＧＣＡＴＣＣＣＡＧＡＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＧＧ
ＧＧ−３′）と共にRT RNA Sequencing Kit (USB, クリープランド, オハイオ）
を用いて行った。配列決定は、配列決定反応当たり精製ウイルスＲＮＡ０．５μ
ｇを用いて、製造業者の使用説明書に準じて行った。
【０２６８】 結果 ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のリーダー配列 以前は、λＺａｐベクターにおけるＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のオリゴｄＴおよ
びランダムｃＤＮＡライブラリーを、そして今回はＯＲＦ１ｂの部分の配列を構
築し、完全ＯＲＦ２〜７を決定した。ＯＲＦ１のＡＴＧ開始コドンの１６１ヌク
レオチド上流のＶＲ２３８５の部分リーダー配列は、クローンｐＰＲ５９から得
た。ＬＤＶのリーダー配列は１５６ヌクレオチドであり、ＬＶ（ＰＲＲＳＶの欧
州単離体）のリーダー配列は２２１ヌクレオチドであることは、以前に示されて
いる。米国ＰＲＲＳＶの完全リーダー配列を決定するため、プライマー伸張実験
を行った。１つの実験では、SuperScript II逆転写酵素を用いて４２節し及び５
０℃で、ｃＤＮＡを合成した。もう一つの実験では、Ｍｎの存在下でｒＴｔｈ
ＤＮＡポリメラーゼを６０℃でのｃＤＮＡ合成に用い、ｃＤＮＡ合成中のリーダ
ーＲＮＡにおける二次構造のポテンシャルを最小限にした。総ての実験において
、生成したｃＤＮＡ断片の長さは同一であり、約１９０ヌクレオチド出会った。
ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５の完全リーダー配列を検出するため、ウイルスＲＮＡの
直接配列決定を行った。スクロースグラディエントによって精製したウイルスか
ら単離したビリオンＲＮＡを、直接ＲＮＡ配列決定反応に用いた。直接ＲＮＡ配
列決定は、ＯＲＦ１ａのＡＵＧ開始コドンの１０〜６７ｎｔ上流の位置における
リーダー配列に相補性のプライマーを用いて行った。リーダー特異的プローブを
用いるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって以前に検出された１６１
ｎｔのリーダー配列の他に、追加の２７ヌクレオチドのリーダー配列を同定した
。リーダーの究極５′末端における２個のヌクレオチドは、配列決定ゲル中の４
個のレーン総てで強いバンドが観察されたため、同定することができなかった。
直接ＲＮＡ配列決定によって決定されたリーダーの大きさは、プライマー伸張実
験の結果と相関した。直接ＲＮＡ配列決定によって得られたデーターを更に確か
めるため、ＲＴ−ＰＣＲを、リーダーの究極５′末端に相当する１6b．ｐ．のプ
ライマーおよびリーダーの３′末端の１０ｎｔ上流に位置したアンチセンスプラ
イマーを用いて行った。直接ＲＮＡ配列決定によって得られた結果と一致する予
想された１８０ｂ．ｐ．のＰＣＲ断片を増幅した。従って、ＰＲＲＳＶＶＲ２３
８５のリーダーの推定的大きさは１９０ｎｔであり、ＬＶ（２２１ｎｔ）、ＥＡ
Ｖ（２１２ｎｔ）およびＳＨＦＶ（２０８ｎｔ）について報告されたものより小
さいが、ＬＤＶ（１５６ｎｔ）について報告されたリーダー配列より大きかった
。リーダーの３′末端の接合領域の配列は、ＴＴＴＡＡＣＣであった。ＯＲＦ１
ａのＡＴＧ開始コドンは、この配列の直ぐ下流に位置している。同様な結果は、
ＬＶ、ＬＤＶおよびＳＨＦＶについても報告されており、ＯＲＦ１ａの開始コド
ンは接合配列の後にも位置している。しかしながら、ＥＡＶリーダー接合配列の
ゲノムは、ＯＲＦ１ａの開始コドンの１３ｎｔ上流に報告されていた。ＶＲ２３
８５のリーダー配列とＬＶ、ＬＤＶおよびＳＨＦＶのリーダー配列の間のヌクレ
オチド配列アイデンティティーの割合は、それぞれ５５％、４７％および３８％
であった。意外なことには、ＶＲ２３８５のリーダーの３′末端の最後の４４ヌ
クレオチドのみが、ＬＶのリーダー配列と有意な相同性を有している（この領域
では８６％アイデンティティー）。ＶＲ２３８５とＬＤＶ（６４％）およびＳＨ
ＦＶ（６３％）との間では、この４４ｎｔ領域では、比較的高い相同性も見られ
た。ＶＲ２３８５とＥＡＶのリーダー配列の間には、有意な相同性は見られなか
った。
【０２６９】 ＰＲＲＳＶゲノムのクローニングおよび配列決定 ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のＯＲＦ１を分析するため、λＺａｐベクターにおけ
るランダムプライムドｃＤＮＡライブラリーを、ウイルス感染細胞の総ＲＮＡか
ら構築した。ｃＤＮＡライブラリーからの２０を超過する重複ｃＤＮＡクローン
を選択して、配列決定した（図２３）。ほとんどの領域について、配列は、少な
くとも２個の独立したクローンから決定した。ヌクレオチド１９００〜２０５０
に相当する領域はｃＤＮＡライブラリーでは表されず、このゲノム領域をＰＣＲ
増幅し、配列決定した。配列分析は、ポリＡ配列を除くＰＲＲＳＶ（米国単離体
ＶＲ２３８５）のゲノムＲＮＡは長さが１５１００ヌクレオチドであった。
【０２７０】 ＯＲＦ１ａ／１ｂにおける機能的ドメインおよび関連ウイルスとの相同性 ＯＲＦ１ａの大きさの予想は、７１７９ヌクレオチドである。これは、ヌクレ
オチド１９１から７３８７までに及んでおり（停止コドンＴＡＧを除外）、２３
９９アミノ酸のポリタンパク質をコードする。リーダーゲノム接合領域はＬＶの
それに類似しており、ＡＴＧ開始コドンは、リーダーのＴＴＴＡＡＣＣは胃列の
直後に位置している。ＬＶおよびＶＲ２３８５のＯＲＦ１配列を比較したとき、
差を同定した。ＬＶにおけるＯＲＦ１ａは、長さが７１８８ヌクレオチドであり
、ＶＲ２３８５より３アミノ酸だけ短い２３９６アミノ酸をコードする。ＶＲ２
３８５およびＬＶのヌクレオチド配列を対にして比較したところ、ＯＲＦ１ａの
５′末端は３′末端より発散性であることを示唆していた。ＶＲ２３８５および
ＬＶの間のヌクレオチド配列５５％アイデンティティーは、ＯＲＦ１ａの３′末
端では６１％であり、（ヌクレオチド３０５０〜７３８７）、ＯＲＦ１ａの最初
の１５００ヌクレオチドでは５５％、ヌクレオチド１５００〜２５００の涼気で
は４６％である。ＯＲＦ１ａ中の最可変領域は、ヌクレオチド２５００〜３００
０の間に位置し、ＶＲ２３８５とＬＶとの間には有意な相同性はなかった。アミ
ノ酸アイデンティティーは１〜５３０アミノ酸の領域については４９％であり、
１１００〜２３９９アミノ酸の領域については５５％であり、アミノ酸５３０〜
１１００に及ぶ領域では有意な相同性は見られなかった。ＶＲ２３８５とＬＤＶ
のＯＲＦ１ａの配列を比較したところ、最初の２０００ヌクレオチドには５２％
の相同性があり、ＯＲＦ１ａの最後の３８００ヌクレオチドでは５５％の相同性
があった（ＶＲ２３８５における３４００〜７１９７ｎｔおよびＬＤＶにおける
２８５０〜６６７８ｎｔに相当）。ＶＲ２３８５の２０００〜３４００ｎｔおよ
びＬＤＶの２５００〜２８５０ｎｔの領域は高可変性であり、ＬＤＶゲノムには
５００ｎｔを上回る欠失がある。予想アミノ酸配列の比較では、アミノ酸１〜５
００の領域についての相同性は３６％であり、予想タンパク質の最後の１３００
アミノ酸を含む領域（ＶＲ２３８５では１１２０〜２３５３ａａについては３９
％であり、ＬＤＶでは９４０−２２２６ａａ）については３９％であった。
【０２７１】 ＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａによってコードされた予想タンパク質の分析では、
他のアルテリウイルスおよびコロナウイルスについて報告されたものと同様に、
２つのパパイン様システインプロテアーゼドメイン（ａａ６３〜１６５およびａ
ａ２６１〜３４７）および１つの３Ｃ様セリンプロテアーゼドメイン（ａａ１５
４２〜１６４４）があることが明らかになった。ＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａの親
水性プロフィールは、ＬＶおよびＬＤＶと同様であった。タンパク質の５′ハー
フ（ＶＲ２３８５における最初の１１００ａａ）はほとんどが親水性であり、究
極３′末端（ＶＲ２３８５におけるａａ２２３０〜２３９９）は親水性であり、
タンパク質の３′ハーフは４つの疎水性領域（ＶＲ２３８５の１１２９〜１２０
７ａａ、１２４０〜１２８６ａａ、１４７８〜１６４３ａａおよび１８５６〜２
０７６の領域）を有する。
【０２７２】 ＶＲ２３８５ＯＲＦ１ｂは長さが４３８９ヌクレオチドであり、ヌクレオチド
７３６９から１１７５７（停止コドンＴＧＡを除く）に及び、１４６３ａａのタ
ンパク質をコードした。ＶＲ２３８５ＯＲＦ１ｂとＬＶ、ＬＤＶおよびＥＡＶの
ヌクレオチドおよび予想アミノ酸配列を比較したところ、ＯＲＦ１ｂはＯＲＦ１
ａより保存されていることが確かめられた。ＶＲ２３８５とＬＶとの間のヌクレ
オチドおよびアミノ酸の相同性は、ＯＲＦ１ｂではそれぞれ６４および６７％で
あり、ＯＲＦ１ａでは５８および５３％であった。ＶＲ２３８５とＥＡＶの予想
タンパク質を比較したところ、３６％の相同性をし召した。ＶＲ２３８５の予想
ＯＲＦ１ｂタンパク質は、ＬＶ、ＬＤＶ、ＥＡＶおよびコロナウイルスについて
記載したのと同様に、推定的ポリメラーゼドメイン（アミノ酸３７３〜５７６）
、推定的ジンクフィンガードメイン（アミノ酸６４７〜６８９）、およびＲＮＡ
ヘリカーゼドメイン（アミノ酸７９３〜１０１５）を含む。
【０２７３】 コロナウイルスおよびアルテリウイルスのＯＲＦ１領域の分子特性決定は、Ｏ
ＲＦ１ポリタンパク質が２個の重複ＯＲＦであるＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂに
よって発現されることを示していた。ＯＲＦ１ａと−１フレームで重複している
ＯＲＦ１ｂの発現は、いわゆるリボソームフレームシフト機構によって起こり、
リボソームがＯＲＦ１ａ停止コドンを迂回し、ＯＲＦ１ｂによってコードされた
タンパク質を翻訳する。フレームシフト領域は、「滑りやすい配列」に続いて擬
似結節構造から綯っている。ＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａ／ＯＲＦ１ｂ接合領域の
分析は、潜在的な滑りやすい配列（５′−ＵＵＵＡＡＡＣ−３′）が、ＯＲＦ１
ａの停止コドンおよび提案された擬似結節構造の３ヌクレオチド上流に位置して
いることを示唆した。この領域は、コロナおよびアルテリウイルスで極めて保存
されており、ＶＲ２３８５およびＬＶの間のヌクレオチド配列の相同性は８６％
であった。
【０２７４】 ＶＲ２３８５とＬＶのリーダー配列の比較は、これらの２種類のウイルスが点
突然変異および場合によっては組換えによって互いに異なっていることを示唆し
た。これらの２種類のウイルスのリーダー配列における広汎な配列の差は、ＰＲ
ＲＳＶにおけるリーダー配列が保存されず、広汎な突然変異による変化を受けや
すいことを示唆していた。リーダーにおけるほとんどの保存領域は３′末端にお
ける最後の４４ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列酸アイデンティティー(n
ucleotide sequence acid identity)はＶＲ２３８５とＬＶとの間では８６％で あり、ＶＲ２３８５とＬＤＶとの間では６８％であった。ＶＲ２３８５の推定的
リーダー配列は１９０ｎｔであり、ＬＶのリーダー配列より３１ｎｔ短く、また
ＬＤＶのそれより３５ｎｔ長い。図２４に示されるように、ＬＶのリーダー配列
と比較してＶＲ２３８５リーダー（ヌクレオチド１４５の後に位置する）には２
０ｎｔの欠失がある。ＶＲ２３８５およびＬＤＶのリーダー配列を比較すると、
ＬＤＶのリーダー配列の相当する領域に２０ｎｔのギャップが導入されたときに
、最大の相同性の得点が得られることが示唆された（図２４）。同様に、ＬＶお
よびＬＤＶリーダー配列の整列中に５０ｎｔのギャップがＬＤＶリーダーに導入
されるときに最高相同性の得点が得られた。この結果は、リーダーのこの領域が
ウイルス複製にとって重要ではなく、ウイルス発生の際にリーダーのこの領域に
欠失顔こり得ることを示唆している。この観察により、ＶＲ２３８５、ＬＶおよ
びＬＤＶの中のリーダー配列の長さに差が見られることも説明することができた
。
【０２７５】 例８ ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５のサブゲノムｍＲＮＡにおけるリーダー配列およびリー
ダー−本体接合部位の特性決定 ＰＲＲＳＶＶＲ２３８５の完全なリーダー配列を決定するため、リーダー特異
的３２Ｐ標識ＰＣＲプローブを用いるオリゴｄＴｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いるウイルスＲＮＡのＲＮＡ連結（ＲＮＡ円
形化）の後、ＯＲＦ７およびリーダー特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ、
およびウイルスＲＮＡの５′末端の直接配列決定（例７）などの幾つかの方法を
用いた。第一に、リーダー配列の１００ｂ．ｐ．断片をプローブとして用いて、
オリゴｄＴλライブラリーからリーダー配列を含むｃＤＮＡクローンを検出した
。８個のｃＤＮＡクローンを分析して配列決定し、これらのクローンがｍＲＮＡ
７（５クローン）、６（２クローン）、および２（１クローン）のリーダー配列
を表すことを見出した。リーダー配列の大きさは、７クローンの６つで１６０か
ら１６３ヌクレオチドまで変化した。ｍＲＮＡ６を表すクローンの１つでは、リ
ーダー特異的配列は１７２ヌクレオチドであった。ウイルスのリーダー内の強力
な二次構造がλＺａｐライブラリーの構築の際にリーダーＲＮＡの完全ｃＤＮＡ
合成を妨げた可能性がある。第二の実験では、ウイルスＲＮＡの３′および５′
末端をＴ４ＲＮＡリガーゼを用いて頭−尾方式で連結した。フェノールクロロホ
ルム抽出および沈澱の後、連結ＲＮＡにプライマーＩＭ１００３（アンチオリゴ
ヌクレオチド、リーダー配列の３′末端相補性）およびＩＭ１００４（オリゴヌ
クレオチド、ゲノム３′非コード領域のセグメントに相当、ポリ（Ａ）尾の１０
０ヌクレオチド上流）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。大きさが２５０〜３
５０ヌクレオチドのＰＣＲ生成物の拡散バンドをアガロースゲルから精製し、ｐ
ＳＫ＋ベクターにクローニングした。７個の独立したクローンを配列決定した。
配列分析では、ゲノム３′末端におけるポリＡ配列およびゲノムの５′末端にお
けるリーダー配列を全７クローンで互いに連結したが、リーダー配列の３′末端
からの９５〜９６ヌクレオチドのみがウイルスゲノムの３′末端と連結した。ポ
リＡで配列決定したクローンの大きさは、各クローンで９から４２ヌクレオチド
まで変化し、配列決定されたクローンは独立していることを示唆していた。ＶＲ
２３８５の推定的な完全長のリーダー配列は、スクロースグラディエント精製し
たウイルスから単離したビリオンＲＮＡの５′末端の直接ＲＮＡ配列決定によっ
て決定した。
【０２７６】 ＶＲ２３８５のゲノム内のリーダーｍＲＮＡ接合配列および遺伝子間領域 ＶＲ２３８５株のｓｇＲＮＡのリーダー本体接合領域を特性決定するため、リ
ーダー特異的プライマー、およびそれぞれのｓｇｍＲＮＡに特異的なプライマー
を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。２０感染後時間（ｈ．ｐ．ｉ．）に単離した総
ＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。主要なバンドをアガロースゲルから単
離して、クローニングし、配列決定した。ＰＣＲ生成物の直接配列決定も行った
。ＰＲＲＳＶのゲノムにおけるリーダー本体接合領域を同定するため、リーダー
特異的３２Ｐ標識プローブを用いて、ウイルスＲＮＡから生成したランダムｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングし、リーダー−ＯＲＦ１ａ接合領域を含む幾
つかのクローンを単離して、配列決定した。ｓｇｍＲＮＡ２〜７のリーダー本体
接合領域を特性決定した。
【０２７７】 表１０に、総てのｓｇｍＲＮＡのリーダー−本体接合領域、およびウイルスゲ
ノムにおけるそれらの相当する領域をまとめた。ｓｇｍＲＮＡ２、３および６に
対して単一の接合部位のみが検出され、ｓｇｍＲＮＡ４、５および７については
２個の部位が検出され、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂおよび７ａ、７ｂと命名された
。ＶＲ２３８５におけるリーダーゲノム接合領域は、配列ＣＣＡＣＣＣＣＴＴＴ
ＡＡＣＣによって表され、配列と類似している。
【表１０】
【０２７８】 リーダー本体ｍＲＮＡ接合領域は、ｓｇｍＲＮＡ３、４、５ｂ、６および７ａ
で変化した。表１１で、ＶＲ２３８５、ＬＶ、ＬＤＶおよびＥＡＶのゲノム中の
遺伝子間領域を比較する。ＶＲ２３８５、ＬＶおよびＬＤＶの遺伝子間領域は、
非常に類似している。ほとんどの変動は、これらの領域の最初の３ヌクレオチド
で見られ、最後の４ヌクレオチドは保存されており、ほとんどの領域では、配列
ＡＡＣＣによって表される。変動は、この接合配列の最初の２ヌクレオチドでも
見られた（ＶＲ２３８５のＯＲＦ４の遺伝子間領域におけるＧＡＣＣおよびＣＡ
ＣＣ、ＶＲ２３８５のＯＲＦ５ｂの遺伝子間領域におけるＡＧＣＣ、ＬＶにおけ
るＯＲＦ３の遺伝子間領域におけるＧＡＣＣ、およびＬＤＶのＯＲＦ２の遺伝子
間領域におけるＡＣＣ）。ＶＲ２３８５のｓｇｍＲＮＡ５ａについての遺伝子間
領域はＧＵＣＡＡＣＵであり、ＥＡＶのものと類似している。
【表１１】
【０２７９】 相当するＯＲＦの開始コドンの上流の遺伝子間部位の位置は、４から２３１ヌ
クレオチドまで変化する。表１２は、ＶＲ２３８５とＬＶのゲノムにおける遺伝
子間部位の位置を比較する（数字は、相当するＯＲＦの遺伝子間部位とＡＵＧ開
始コドンの間のヌクレオチドでの距離を表す）。ＶＲ２３８５とＬＶのゲノムに
おけるこれらの部位の位置は、ｓｇｍＲＮＡ３、４、５および６で異なっている
。ＶＲ２３８５ゲノムのｓｇｍＲＮＡ４、５および７の合成のための３個の代替
遺伝子間部位も同定した。以前は、ｓｇｍＲＮＡの６個のバンドだけが、ノーザ
ンブロットハイブリダイゼーション分析によるＶＲ２３８５に感染した細胞で検
出された。追加のｓｇｍＲＮＡがＶＲ２３８５の複製の際に実際に合成されるこ
とを確認するため、リーダーおよびＯＲＦ特異的プライマーを用いてネステドＲ
Ｔ−ＰＣＲを行った。増幅したＰＣＲ生成物は、大きさが同様であり、追加のｍ
ＲＮＡ４ａ、５ａおよび７ａに相当した（図２６）。これらの結果は、相当する
ＯＲＦの開始コドンにより接近しているｓｇｍＲＮＡ４および５の遺伝子間部位
４ｂおよび５ｂがｓｇｍＲＮＡ合成に頻繁に用いられることを示唆していた。ｓ
ｇｍＲＮＡ４および５は、種として遺伝子間部位４ｂおよび５ｂから生成したが
、代替４ａおよび５ａを用いることによっては極少数しか生成しなかった。ｓｇ
ｍＲＮＡ７の場合には、ＯＲＦ７の開始コドンの１２３ｎｔ上流に位置した遺伝
子間部位７ａが頻繁に用いられたが、ＯＲＦ７の開始コドンの９ｎｔ上流に位置
した部位７ｂはｓｇｍＲＮＡ７の合成には余り関与しなかった。
【表１２】
【０２８０】 リーダーゲノム接合配列と、ｓｇｍＲＮＡにおける遺伝子間領域の配列および
リーダー本体接合領域の配列との比較は、リーダーの最後の７ヌクレオチドのみ
（ＴＴＴＡＡＣＣ）がＶＲ２３８５のゲノムにおける遺伝子間領域の配列と相同
性を有することを示していた。総体的相同性は５から７ｎｔまで変化し、唯一の
例外は、遺伝子間領域の１２ｎｔの１１がリーダー配列の３末端に類似している
ｓｇｍＲＮＡ６であった。ｓｇｍＲＮＡのリーダー本体接合領域において、ＣＣ
ＡＣＣＣＣ配列は保存され、リーダーから生成する。しかしながら、様々なｓｇ
ｍＲＮＡについて変化したＣＣＡＣＣＣＣの後の配列は、リーダーの３′末端に
おけるＴＴＴＡＡＣＣ配列と高水準の相同性を有する。様々なｓｇｍＲＮＡにつ
いて検出されたリーダー本体接合配列の変動は、リーダー本体結合が不正確であ
ることを示している。リーダーの３′末端、ｓｇｍＲＮＡのリーダー本体接合領
域、およびＶＲ２３８５のゲノム内の遺伝子間領域の間のヌクレオチド配列の比
較により、リーダーとｓｇｍＲＮＡの本体との実際の接合の領域が検出された（
表II，下線）。
【０２８１】 結論 ＰＲＲＳＶの米国単離体のサブゲノムｍＲＮＡの合成の機構は、ＬＶ、ＬＤＶ
およびＥＡＶの機構と類似している。ＶＲ２３８５で検出された遺伝子間領域は
一層可変であり、ＬＶと比較すると、様々な部位に位置した。リーダー本体接合
配列の変動は、リーダー本体接合が不正確であることを示している。ｓｇｍＲＮ
Ａにおける実際のリーダー本体接合部位の位置は、リーダープライミング以外の
（複数の）機構がｓｇｍＲＮＡの合成に関与している可能性があることを暗示し
ている。ＰＲＲＳＶの米国単離体のゲノムにおける代替リーダー−本体接合部位
は、ＰＲＲＳＶの様々な株の中のｓｇｍＲＮＡの数の変動を生じることができる
。
【０２８２】 例９ ＰＲＲＳＶの農場単離体からのＰＲＲＳＶの高継代ＩＳＵ５５株の同定および
識別についての信頼性のある試験を、下記に示す。以前の研究では、低継代ＩＳ
Ｕ５５株（継代７）の配列を決定し、この配列を用いてＩＳＵ５５ｈｐ株の識別
のためのＲＦＬＰ試験を開発した。第一段階として、ＩＳＵ５５ｐ−７の配列を
分析して、ユニーク制限部位を含む可変領域を同定した。コンピューターによる
配列分析および異なるＰＲＲＳＶ株の配列との比較の後、２つのユニーク制限部
位を含む特異的領域をＯＲＦ４の３′末端で同定した。これらの２つの制限部位
は、ＩＳＵ５５（ｐ−７）配列におけるＯＲＦ２のＡＴＧ開始コドンの上流位置
に対して、１５１０位のＤｒａＩ（ＴＴＴ／ＡＡＡ）および１６９７位のＢａｌ
Ｉ（ＭｓｃＩ）（ＴＧＧ／ＣＣＡ）であった。これらの２つの制限部位は、ＩＳ
Ｕ５５株の相当する領域にのみ存在したが、他のＰＲＲＳＶ株には存在しなかっ
た。
【０２８３】 コンピューター解析の結果を確かめるため、高継代ＩＳＵ５５株の配列を決定
した。ＯＲＦ３〜７などのゲノム領域（２６９６ｂ．ｐ．）をＰＣＲによって増
幅し、配列決定した。高継代ＩＳＵ５５の配列を、ＩＳＵ５５継代７の配列と比
較した。この比較の結果を、図２７（ｃＤＮＡ整列）、図２８（ＯＲＦマップ）
および図２９（制限酵素ＤｒａＩおよびＢａｌＩを用いる制限パターン）に示す
。ＰＲＲＳＶＩＳＵ５５の低継代および高継代の配列は、極めて保存された。高
継代ＩＳＵ５５株には、１５ヌクレオチドの置換しか見られなかった。ＯＲＦ３
〜７の大きさおよび相対的位置は、同一のままである。高継代ウイルスにおける
単一ヌクレオチドの変化は、低継代ＩＳＵ５５と比較して高継代ウイルスの配列
には追加のＤｒａＩ部位を生じた（図２９）。この知見により、低継代ＩＳＵ５
５ウイルスから高継代ウイルスを識別する機会が提供される。芽球(BLAST)探索 を行い、ＩＳＵ５５の高継代株の特異的領域をGenBankデーターベースで利用可 能な他のＰＲＲＳＶ配列と比較した。ＩＳＵ５５高継代株のユニーク制限部位（
ＩＳＵ５５ｈｐの制限マップの９６６および１１５９位における２個のＤｒａｌ
部位および１１５７位におけるＢａｌＩ部位）を含む２３７ｂｐの断片を比較の
ための鋳型として用いた。芽球探索の結果は、これらの部位がＩＳＵ５５高継代
株についてユニークであり、データーベースで利用可能な２４の他のＰＲＲＳＶ
単離体には存在しないことを示唆していた。
【０２８４】 ＩＳＵ５５高継代株のＯＲＦ５（６０３ｂｐ）を他のＰＲＲＳＶ株のＯＲＦ５
とも比較した。予想されたように、ＩＳＵ５５の７継代株は最高の相同性得点を
有し、ヌクレオチド置換は３に過ぎない。第二の高相同性得点を有する株はＮＡ
ＤＣ８であり、ＩＳＵ５５ｈｐ株のＯＲＦ５と比較してＯＲＦ５におけるヌクレ
オチド置換は３３であった。芽球探索で比較したＰＲＲＳＶ株の残りは、ＯＲＦ
５において更に変動を示した（６３ｎｔまでの変化）。これらのデーターは、Ｉ
ＳＵ５５ＰＲＲＳＶ株がこれまでに特性決定した他の総てのＰＲＲＳＶ株と異な
ることを明らかに示している。
【０２８５】 ＰＣＲ−ＲＦＬを開発して、ＩＳＵ５５高継代株をＰＲＲＳＶのＩＳＵ５５ｌ
ｐウイルスおよび他の株から識別した。ＲＦＬＰしけんのため、２つのプライマ
ーを合成した。前進プライマー５５Ｆ ５′−ＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧ
ＡＣＡＧＧ−３′（８２３位）および復帰プライマー３ＲＦＬＰ ５′−ＧＧＣ
ＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＧ−３′（１８３８位）（ＩＳＵ５５高継代
株の２６９6bｐの配列決定した断片の５′末端からの位置）。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ
試験の復帰プライマーは、このプライマーが多数のＰＲＲＳＶ単離体と共にＰＣ
Ｒ−ＲＦＬＰにおいて用いられ、特異的であることが示されているのでＭＬＶＲ
ｅｓＰＲＲＳＶワクチン株を識別するためにＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験に用いられた
ものと同一であった（Wesley et al., J. Vet. Diagn. Invest., 10:140-144 (1
998); Wesley et al., Amer. Assoc. Of Swine Practitioners, pp. 141-143 (1
996); Andreyev et al., Arch. Virol., 142:993-1001 (1997); Mengeling et a
l., 1997; 上記の文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用される）
。制限酵素ＤｒａＩを用いる消化の後、３個の断片（６２６ｂｐ、１８７ｂｐお
よび１３５ｂｐ）が生成する。ＢａｌＩで消化した後、大きさが６２６および３
２２ｂｐの２つの断片を形成した。他のＰＲＲＳＶ株のＰＣＲおよび制限酵素消
化の後、１０２６ｂｐの断片がコンピューターデーターの解析に準じて形成され
る。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ試験をバリデートするため、総ＲＮＡをＩＳＵ５５ｈｐ、
ＩＳＵ１２ｌｐ、ＩＳＵ１２ｈｐ株から単離し、プライマー５５Ｆおよび３ＲＦ
ＬＰを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。１０２６ｂｐの断片を、総ての単離体から
増幅した。これらの断片を精製し、制限酵素ＤｒａＩおよびＢａｌＩで消化した
。生成物を１．５％アガロースゲルで分析した。図３０に試験の結果を示す。ラ
イン１は、ＩＳＵ５５ｈｐ株の未処理の１０２6bｐＰＣＲ断片を示す。ライン２
および５は、ＤｒａＩ（ライン２）およびＢａｌＩ（ライン５）で消化したＩＳ
Ｕ５５ｈｐのＰＣＲ生成物を示す。断片６２６ｂｐ、１８７ｂｐおよび１３５ｂ
ｐがＤｒａＩでの消化の後に形成され、６２６および３２２ｂｐの断片がＢａｌ
Ｉで消化した後に形成した。ライン３、４、６および７は、ＩＳＵ１２ｌｐ（ラ
イン３および６）およびＩＳＵ１２ｈｐ（ライン４および７）のＰＣＲ生成物の
ＤｒａＩ消化（ライン３および４）およびＢａｌＩ消化（ライン６および７）の
結果を示す。ＩＳＵ１２ｌｐおよびｈｐ株との総ての反応において、１０２６ｂ
ｐのＰＣＲ断片を検出した。これらのデーターは、ＩＳＵ５５ｈｐ株のＰＣＲ−
ＲＦＬＰ識別についての予測と相関している。
【０２８６】 明らかに、本発明の多数の改質および変更は、上記の教示の観点で可能である
。従って、特許請求の範囲内において、本発明は本明細書に具体的に記載された
もの以外に実施することができることを理解すべきである。
【０２８７】 例１０ 弱毒化ＰＲＲＳＶワクチン株（ＩＳＵ５５ｐ４９）のゲノムの配列決定 ＶＲ２３８５株の配列を決定した後、得られた配列決定情報を用いて、弱毒化
ＰＲＲＳＶ株（ワクチン株）の配列を決定した。ワクチン株の全ゲノムを、２１
の重複断片で増幅し、配列決定した。配列決定データーを組合わせると、ゲノム
の全体の大きさは１５，４１２ヌクレオチドであり、ＶＲ２３８５株のゲノムの
長さと比較して３０９ｎｔ長かった。ＯＲＦマップおよびそれらの位置を、図３
１に示す。ワクチン株とＶＲ２３８５株のゲノムを比較したところ、ＯＲＦ１ｂ
−ＯＲＦ７の大きさと相対的位置は同じであった。ＯＲＦ１ａは最も可変であり
、１個の３０９ヌクレオチド欠失が、ワクチン株の配列と比較してＶＲ２３８５
のゲノムに見出された。この欠失はフレームにあり、ＶＲ２３８５ＰＲＲＳＶの
ゲノムの５′末端から３２４２ヌクレオチドの位置のＯＲＦ１ａの領域に配置さ
れた。もう一つの３ヌクレオチドは、ワクチン株のゲノムに比較して１ａａ欠失
を引起すゲノムの領域２５０４〜２５１５ｎｔで欠失した。ワクチン株およびＶ
Ｒ２３８５株の異なるＯＲＦのゲノムの比較の結果を、表１３にまとめる。これ
らの株の間の全般的ＤＮＡの相同性は約９１％であり、両株で１４０９４ヌクレ
オチドが同一であった。３０９ｎｔの欠失を除けば、ＤＮＡ相同性は９３％であ
った。リーダー配列は、ＶＲ２３８５株についてだけ、ウイルスＲＮＡの直接配
列決定によって決定し、ＶＲ２３８５のリーダーの５′末端に特異的な１７ｂｐ
プライマーを用いて、ワクチン株のリーダーの１７０ｎｔ部分を増幅した。これ
らの配列を比較すると、総体的相同性は９４％であり、両株には単一のヌクレオ
チド欠失があり、ＶＲ２３８５リーダーのヌクレオチドＡ（７５位）およびＧ（
１１９位）は、ワクチン株のリーダーではなくなっており、ワクチン株リーダー
のヌクレオチドＡ（８７位）およびＧ（１２４位）はＶＲ２３８５株のリーダー
ではなくなっている。
【０２８８】 ワクチン株のＯＲＦ１ａは１９１から７６９９ｎｔまでに及び、２５０３アミ
ノ酸（ａａ）タンパク質を個々ととし、これはＶＲ２３８５株のＯＲＦ１ａタン
パク質と比較して１０３ａａ長い。ワクチン株およびＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａ
で予想されたタンパク質の総体的なａａ同一性は、８８％（ＶＲ２３８５におけ
る欠失を含まなければ９２％）であった。ＬＶのＯＲＦ１ａタンパク質と比較す
ると、総体的ａａ同一性は約４７％であったが、異なるタンパク質類似性を有す
る幾つかの領域を同定することができる。５′末端（ワクチン株におけるａａ１
〜５２９およびＬＶにおけるａａ１〜５２１、５０％ａａ同一性）は比較的保存
性であり、３′末端（ワクチン株でのａａ１２３２〜２５０３およびＬＶでのａ
ａ１１１５〜２３９６、５８％ａａ同一性）は比較的保存性であり、その間（ワ
クチン株でのａａ５３０〜１２３１およびＬＶでのａａ５２２〜１１１４）は超
可変領域（ＨＶＲ）であった。ＨＶＲにおける相同性を更に詳細に検討したとこ
ろ、１つの短い領域（９４ａａ）であって、ワクチン株とＬＶとの間でａａ相同
性が５０％であるものを検出することができた。この領域は、ワクチン株ではａ
ａ１０１５〜１１０８、およびＬＶではａａ９２９〜１０２１に及ぶ。興味深い
ことには、ＯＲＦ１ａで予想されたタンパク質における相同性は、下記のように
して提供することができる。すなわち、保存的領域１（ワクチン株／ＶＲ２３８
５株でのａａ１〜５２９、ＬＶでのａａ１〜５２１、ワクチン株とＶＲ２３８５
との間のａａ同一性９０％、ワクチン／ＶＲ２３８５株とＬＶとの間のａａ同一
性５０％）超可変領域（ＨＶＲ）（ワクチン株でのａａ５３０〜１２３１、ＶＲ
２３８５株でのａａ５２０〜１１２７、ＬＶでのａａ５２２〜１２３２、ワクチ
ン株とＶＲ２３８５の間のａａ同一性８４％、ＶＲ２３８５のＯＲＦ１ａタンパ
ク質での１０３ａａ欠失、ワクチン／ＶＲ２３８５株とＬＶとの間のａａ同一性
４０％未満）、および保存適量域２（ワクチン株でのａａ１２３２〜２５０３、
ＶＲ２３８５株でのａａ１１２８〜２３９９、ＬＶでのａａ１１２８〜２３９６
、ワクチン株間のａａ同一性９６％、およびワクチン／ＶＲ２３８５株およびＬ
Ｖ間のａａ同一性５７％）。ワクチン株のＨＶＲにおける９４アミノ酸断片（ａ
ａ９２９〜１０２１）は、ＬＶと５０％ａａ相同性を有し、この領域はＶＲ２３
８５株では欠失している。
【０２８９】 ワクチン株でのＯＲＦ１ｂはｎｔ７６８７〜１２０６９に及び、１４６１ａａ
タンパク質をコードし、これは大きさがＶＲ２３８５と同様である。ヌクレオチ
ドおよびアミノ酸を比較したところ、ＯＲＦ１ｂはＯＲＦ１ａと比較して遙かに
保存的である。ワクチン株とＶＲ２３８８とのヌクレオチド相同性は９３％であ
り、それらの予想されるタンパク質の相同性は９７％であった。ＬＶのＯＲＦ１
ｂ（１４６２ａａ）と比較すると、ａａ同一性は６７％であった。１つの可変領
域が、ＬＶと比較してＯＲＦ1b（ａａ１３６７〜１４６１）の３′末端で検出さ
れた。
【０２９０】 ワクチン株のＯＲＦ２〜ＯＲＦ７領域は、ＶＲ２３８５と同様なゲノム構成を
示し、ＯＲＦの大きさおよび相対位置は同様であった。ワクチン株とＶＲ２３８
５との間の相同性のデーターを表１３に示す。ワクチン株とＬＶとのヌクレオチ
ド（アミノ酸）同一性はＯＲＦ２については６６％（６１％）であり、ＯＲＦ３
については６１％（５５％）であり、ＯＲＦ４については６６％（６７％）であ
り、ＯＲＦ５については６３％（５１％）であり、ＯＲＦ６については６８％（
７９％）であり、ＯＲＦ７については６０％（５８％）であった。
【表１３】
【０２９１】 例１１ ＶＲ２３８５単離体における欠失の分析 ＶＲ２３８５ＰＲＲＳＶから増幅したＰＣＲ生成物は、ＯＲＦ１ａに４４5bｐ
の欠失が存在することを示していた。上記の４４５ｂｐの欠失並びに３０９ｂｐ
の欠失はフレームにあり、重複しており、独立した起源のものであると思われた
。プラーク精製の後、これらの欠失変異体はＶＲ２３８５の固体に現われ、４４
５ｎｔの欠失を有する変異体はウイルス保存物で主成分となった。この変異体は
、低継代ウイルス、高継代ウイルスおよびブタで２回継代したウイルスから単離
したＲＮＡのＰＣＲ検討に基づけば安定であると考えられる。３０９ｂｐ欠失変
異体は少量であると思われ、ネステドＰＣＲによってのみ特異的プライマーを用
いて幾つかのウイルス保存物から増幅することができた。
【０２９２】 例１２ 連続継代ＰＲＲＳＶの特性決定 細胞培養の継代によって弱毒化が起こるかどうかを決定するため、ＶＲ２３８
５継代７（ｐ７）およびＶＲ２３８５継代８５（ｐ８５）を用いて３週齢のブタ
に感染させた。感染から１０日後に、推定の全体的肺病巣および臨床的呼吸器得
点は、低継代ウイルスに感染したブタでは有意に高かった。ゲノムのＯＲＦ２〜
７領域を配列決定し、比較した。ＶＲ２３８５の２つの継代の遺伝子分析では、
ＯＲＦ６は最も保存され、アミノ酸レベルで１００％相同であることを示してい
る。残りのＯＲＦは、アミノ酸相同性が９５〜９８％であり、未熟な停止コドン
を含むＶＲ２３８５ｐ８５のＯＲＦ２では、推定１０個のアミノ酸の切捨てを生
じた。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２および
ＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列
の比較。
【図１Ｂ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２および
ＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列
の比較。
【図１Ｃ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２および
ＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列
の比較。
【図１Ｄ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２および
ＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列
の比較。
【図１Ｅ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２および
ＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列
の比較。
【図１Ｆ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２および
ＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列
の比較。
【図１Ｇ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ３９２７，ＩＳＵ２２および
ＩＳＵ５５と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２〜５のヌクレオチド配列
の比較。
【図２Ａ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ２２，ＩＳＵ５５およびＩＳ
Ｕ３９２７と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４お
よびＯＲＦ５の推定アミノ酸配列の整列。
【図２Ｂ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ２２，ＩＳＵ５５およびＩＳ
Ｕ３９２７と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４お
よびＯＲＦ５の推定アミノ酸配列の整列。
【図２Ｃ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ２２，ＩＳＵ５５およびＩＳ
Ｕ３９２７と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４お
よびＯＲＦ５の推定アミノ酸配列の整列。
【図２Ｄ】 米国単離体ＩＳＵ７９，ＩＳＵ１８９４，ＩＳＵ２２，ＩＳＵ５５およびＩＳ
Ｕ３９２７と他の既知のＰＲＲＳＶ単離体とのＯＲＦ２，ＯＲＦ３，ＯＲＦ４お
よびＯＲＦ５の推定アミノ酸配列の整列。
【図３】 様々なビルレンスを有する７種類の米国ＰＲＲＳＶ単離体のＯＲＦ２〜７のヌ
クレオチド配列に基づいた系統樹。
【図４】 ＩＳＵ３９２７に感染したＣＲＬ１１１７１細胞（レーン１）およびＩＳＵ３
９２７の精製ビリオン（レーン２）から単離したＲＮＡのノーザンブロット分析
。
【図５】 それぞれＩＳＵ２２（レーン１）、ＩＳＵ５５（レーン２）、ＩＳＵ７９（レ
ーン３）、ＩＳＵ１８９４（レーン４）およびＩＳＵ３９２７（レーン５）に感
染したＣＲＬ１１１７１細胞から単離した総細胞内ＲＮＡのノーザンブロット分
析。
【図６Ａ】 様々な感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）のＩＳＵ７９を感染させたＣＲＬ１１１７
１細胞から単離した総ＲＮＡ（Ａ）およびＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ５５およびＩ
ＳＵ７９を感染させた細胞から単離したポリアデニル化ＲＮＡのノーザンハイブ
リダイゼーション。
【図６Ｂ】 様々な感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）のＩＳＵ７９を感染させたＣＲＬ１１１７
１細胞から単離した総ＲＮＡ（Ａ）およびＰＲＲＳＶ単離体ＩＳＵ５５およびＩ
ＳＵ７９を感染させた細胞から単離したポリアデニル化ＲＮＡのノーザンハイブ
リダイゼーション。
【図７Ａ】 ＩＳＵ１８９４（Ａ）およびＩＳＵ７９（Ｂ）を感染させたＣＲＬ１１１７１
細胞から単離した総細胞内ｍＲＮＡのノーザンブロット分析。
【図７Ｂ】 ＩＳＵ１８９４（Ａ）およびＩＳＵ７９（Ｂ）を感染させたＣＲＬ１１１７１
細胞から単離した総細胞内ｍＲＮＡのノーザンブロット分析。
【図８】 ＩＳＵ１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４（レーン１）およびＩＳＵ７９のｓ
ｇｍＲＮＡ３、４および４−１（レーン２）の５′末端配列のＲＴ−ＰＣＲ増幅
（但し、レーンＬは１−ｋｂマーカー）（Ａ）、およびＩＳＵ７９およびＩＳＵ
１８９４のｓｇｍＲＮＡ３および４およびＩＳＵ７９のｓｇｍＲＮＡのリーダー
−ｍＲＮＡ接合配列（但し、それぞれのＯＲＦの開始コドンに対するゲノム中の
リーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は、ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス
（−）数によって示される）（Ｂ）。
【図９Ａ】 ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のＯＲＦ２〜７の配列整列（但し、各ＯＲＦ
の開始コドンは＋＞によって示され、各ＯＲＦの終止コドンは星印（＊）によっ
て示され、決定されたまたは予想されたリーダー−ｍＲＮＡ接合配列には下線が
付けられ、各ＯＲＦの開始コドンに対するリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は
各ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示される）。
【図９Ｂ】 ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のＯＲＦ２〜７の配列整列（但し、各ＯＲＦ
の開始コドンは＋＞によって示され、各ＯＲＦの終止コドンは星印（＊）によっ
て示され、決定されたまたは予想されたリーダー−ｍＲＮＡ接合配列には下線が
付けられ、各ＯＲＦの開始コドンに対するリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は
各ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示される）。
【図９Ｃ】 ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のＯＲＦ２〜７の配列整列（但し、各ＯＲＦ
の開始コドンは＋＞によって示され、各ＯＲＦの終止コドンは星印（＊）によっ
て示され、決定されたまたは予想されたリーダー−ｍＲＮＡ接合配列には下線が
付けられ、各ＯＲＦの開始コドンに対するリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は
各ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示される）。
【図９Ｄ】 ＩＳＵ１８９４およびＩＳＵ７９のＯＲＦ２〜７の配列整列（但し、各ＯＲＦ
の開始コドンは＋＞によって示され、各ＯＲＦの終止コドンは星印（＊）によっ
て示され、決定されたまたは予想されたリーダー−ｍＲＮＡ接合配列には下線が
付けられ、各ＯＲＦの開始コドンに対するリーダー−ｍＲＮＡ接合配列の位置は
各ＯＲＦの上流のヌクレオチドのマイナス（−）数によって示される）。
【図１０】 ＰＲＲＳＶを感染させた細胞を用いるＭＡｂの免疫蛍光分析法。ハイブリドー
マ上清を、感染したＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞上でＩＦＡで試験した。タン
パク質特異的ＭＡｂとの反応による典型的な免疫蛍光を、ここに示す。Ａ．ＧＰ
４特異的ＭＡｂ、ＰＰ４ｂＢ３；Ｂ．Ｅ特異的ＭＡｂ、ＰＰ５ｄＢ４；Ｃ．Ｎ特
異的ＭＡｂ、ＰＰｅＦ１１；およびＤ．負のコントロール、ＰＰＡｃ８。
【図１１】 ＥＬＩＳＡにおけるＭＡｂおよび洗剤抽出したＰＲＲＳＶ抗原の反応性。ＰＲ
ＲＳＶ感染細胞から洗剤１％Triton X-100で抽出し、１％ＢＳＡでブロックした
抗原でプレートをコーティングした。ハイブリドーマ上清を、それぞれ正および
負のコントロールＰＰｅＦ１１およびＰＰＡｃ８で試験した。特異的反応が、抗
マウスＩｇＧペルオキシダーゼ接合体で検出された。ＡＢＴＳ基質をプレート中
で２０分間インキュベーションした後、Ａ４０５を測定した。ＰＰ４ｂＢ３から
出発した最初の４個のＭＡｂはＧＰ４特異抗体であり、ＰＰ５ｂＨ４から出発し
た次の６個のＭＡｂはＥ特異抗体である。
【図１２】 免疫ブロッティングにおけるＥ特異的ＭＡｂおよびＰＲＲＳＶビリオンの抽出
物の反応性。分子量標準（ｋＤａ）を、図の左側に示す。レーン：１，ＰＰ５ｄ
Ｂ４；２，ＰＰ５ｂＨ４；３，負のコントロール：ＰＰＡｃ８；４，正のコント
ロール：ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清；５，負のコントロール：正常なブタ血清。
【図１３】 モノクローナル抗体の力価。
【図１４】 ＰＲＲＳＶ単離体とＰＲＲＳＶに対するＭＡｂとの反応性パターン。ＭＡｂの
力価は、図１３に示した。反応性パターンは、少なくとも６個のＭＡｂと任意の
１個の単離体との力価に準じて決定した：＜＝３２−低反応性；６４〜１２８−
中反応性；＞＝２５６−高反応性。上記の群に属さない単離体をその他とした。
試験した単離体の総数は２３であった。
【図１５】 昆虫細胞での組換えタンパク質発現の免疫蛍光検出。High FiveTM細胞をｖＡ ｃ−Ｐ２（Ａ）、ｖＡｃ−Ｐ３（Ｂ）、ｖＡｃ−Ｐ４（Ｃ）およびｗｔＡｃＭＮ
ＰＶ（Ｄ）に感染させ、メタノールで固定し、ブタ抗ＰＲＲＳＶ血清と反応させ
た。特異的反応は、フルオレセイン標識したヤギ抗−ブタＩｇＧ接合体によって
検出され、蛍光顕微鏡下で観察された。
【図１６】 High FiveTM細胞での組換えタンパク質の細胞表面発現。昆虫細胞をｖＡｃ− Ｐ５（Ａ）、ｖＡｃ−Ｍ（Ｂ）、ｖＡｃ−Ｎ（Ｃ）およびｗｔＡｃＭＮＰＶ（Ｄ
）に感染させ、７２時間インキュベーションし、固定および透過性化(permeabil
ization)を行わずに４℃で染色した。ブタ抗−ＰＲＲＳＶ血清を用いて細胞表面
組換えタンパク質と反応させ、フルオレセイン標識したヤギ抗−ブタＩｇＧ接合
体を用いて蛍光顕微鏡下で観察される任意の特異反応を検出した。
【図１７】 昆虫細胞で発現した組換えＧＰ２、ＧＰ３およびＧＰ４タンパク質の免疫蛍光
検出。High FiveTM細胞を、ＯＲＦ２を含む組換えバキュロウイルスｖＡｃ−Ｐ ２（Ａ）、ＯＲＦ３を含むｖＡｃ−Ｐ３（Ｂ）、ＯＲＦ４を含むｖＡｃ−Ｐ４（
Ｃ）またはｗｔＡｃＭＮＰＶ（Ｄ）で感染させ、メタノールで固定し、ブタ抗−
ＰＲＲＳＶ血清と反応させた。特異的反応は、フルオレセイン標識したヤギ抗−
ブタＩｇＧ接合体によって検出され、蛍光顕微鏡下で観察された。
【図１８】 昆虫細胞で発現した組換えタンパク質ＧＰ５、ＭおよびＮの免疫蛍光検出。Hi
gh FiveTM細胞を、ＯＲＦ５を含む組換えバキュロウイルスｖＡｃ−Ｐ５（Ａ） 、Ｍ遺伝子を含むｖＡｃ−Ｍ（Ｂ）、Ｎ遺伝子を含むｖＡｃ−Ｎ（Ｃ）またはｗ
ｔＡｃＭＮＰＶ（Ｄ）で感染させ、メタノールで固定し、ブタ抗−ＰＲＲＳＶ血
清と反応させた。免疫蛍光は、Ｅ、ＭおよびＮタンパク質を発現する細胞の細胞
質に見られる。
【図１９】 昆虫細胞における組換えタンパク質発現の免疫ブロット法による検出。全タン
パク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１５％ゲル中で分離し、ニトロセルロース膜
に移した。ブタ抗−ＰＲＲＳＶ血清を用いて、膜をインキュベーションし、特異
的反応をヤギ抗−ブタＩｇＧペルオキシダーゼ接合体によって検出した。分子量
標準（ｋＤａ）を、図の左側に示す。レーン：１，ｗｔＡｃＭＮＰＶに感染した
High FiveTM細胞；２，ｖＡｃ−Ｐ２に感染したHigh FiveTM細胞；３，ｖＡｃ−
Ｐ３に感染したHigh FiveTM細胞；４，ｖＡｃ−Ｐ４に感染したHigh FiveTM細胞
；５，精製ＰＲＲＳＶビリオン；６，正常なＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞。（
Ｂ）．レーン：１，ｖＡｃ−Ｐ５に感染したHigh FiveTM細胞；２，ｗｔＡｃＭ ＮＰＶに感染したHigh FiveTM細胞；３，ｖＡｃ−Ｍに感染したHigh FiveTM細胞
；４，ｖＡｃ−Ｎに感染したHigh FiveTM細胞；５，精製ＰＲＲＳＶウイルス； ６，正常なＡＴＣＣＣＲＬ１１１７１細胞。矢印は、組換えタンパク質のＭｒに
おける位置または範囲を示す。イメージを、Hewlett Packard ScanJet 3c/Tスキ
ャナーおよびAdobe Photoshop 3.0 (Adobe System Inc.)のプログラムで走査し た。
【図２０】 昆虫細胞で発現した組換えタンパク質Ｅ、ＭおよびＮのグリコシル化分析。（
Ａ）ｖＡｃ−Ｐ２、ｖＡｃ−Ｐ３、ｖＡｃ−Ｐ４またはｗｔＡｃＭＮＰＶに感染
させた昆虫細胞のツニカマイシン処理。（Ｂ）ｖＡｃ−Ｐ５、ｖＡｃ−Ｍ、ｖＡ
ｃ−ＮまたはｗｔＡｃＭＮＰＶに感染させた昆虫細胞のツニカマイシン処理。
【図２１】 ＰＣＲによるＰＲＲＳＶＯＲＦ２〜７遺伝子の増幅に用いたプライマー。各プ
ライマー内の下線を施した配列は、次のクローニング段階を促進する目的で導入
された特異的制限酵素部位を表す。
【図２２】 昆虫細胞で発現したＰＲＲＳＶＯＲＦ２〜５の組換えタンパク質。ａ＝ＰＲＲ
ＳＶＯＲＦ２〜５の生成物の予想ＭｒおよびＮ−グリコシル化部位は、ヌクレオ
チド配列の研究に基づいている(Meng et al., 1994 & Morozov et al., 1995)。
ｂ＝昆虫細胞での発現生成物。ｃ＝ツニカマイシン処理後のバンドは、免疫ブロ
ット分析によって決定した。ｄ＝リーダーを含まないコアタンパク質は、ツニカ
マイシン処理分析に基づいて決定する。ツニカマイシン処理後の組換え生成物中
の他のバンドの存在は、Ｏ−結合グリコシル化、ホスホリル化または他の転写後
修飾による可能性がある。
【図２３】 ＶＲ２３８５ｃＤＮＡライブラリーから配列決定した２０個の重複ｃＤＮＡク
ローン。
【図２４】 ＶＲ２３８５およびＬＶのリーダー配列のＤＮＡ整列。
【図２５Ａ１】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ２】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ３】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ４】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ５】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ａ６】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。５′末端整列。
【図２５Ｂ１】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｂ２】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｂ３】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｂ４】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｂ５】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。中央ＤＮＡ整列。
【図２５Ｃ１】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ２】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ３】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ４】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ５】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ６】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ７】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ８】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２５Ｃ９】 ＶＲ２３８５およびＬＶのＯＲＦ１ａの整列。３′末端整列。
【図２６】 ｍＲＮＡ４ａ、５ａおよび７ａに相当するＰＣＲ生成物を増幅するためのリー
ダーおよびＯＲＦ特異的プライマーを用いるネステドＲＴＰＣＲの結果。
【図２７】 低継代および高継代ＩＳＵ−５５のＤＮＡ配列整列。
【図２８】 ＩＳＵ−５５の高継代および低継代株のＯＲＦマップ。
【図２９】 高継代ＩＳＵ−５５株の配列における追加ＤｒａＩ部位を示す制限マップ。
【図３０】 ＩＳＵ−５５ｈｐ、ＩＳＵ−１２ｌｐおよびＩＳＵ−１２ｈｐ株から単離され
、プライマー５５Ｆおよび３ＲＦＬＰを用いるＲＴＰＣＲに用いられる総ＲＮＡ
についてのＲＦＬＰ試験の結果。
【図３１】 ＩＳＵ−５５ｈｐのＯＲＦのゲノムマップおよびリスト。
【図３２】 ＩＳＵ−５５のヌクレオチド配列。
【図３３】 ＩＳＵ−１２（ＶＲ２３８５）のヌクレオチド配列。
【図３４】 ＩＳＵ−５５およびＩＳＵ−１２（ＶＲ２３８５）のヌクレオチド配列の整列
。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月１５日（２０００．３．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】 発明の概要 従って、本発明の目的は、配列番号：５５（ＩＳＵ−１２）または配列番号： ５４ （ＩＳＵ−５５）を含むブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳ
Ｖ）をコードするＤＮＡ配列を提供することである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】 本発明のもう一つの目的は、配列番号：５５のヌクレオチド１９１〜７３８７
（ＯＲＦ１ａ）、 配列番号：５５のヌクレオチド７３７５〜１１７５７（ＯＲＦ１ｂ）、 配列番号：５５のヌクレオチド１１７６２〜１２５２９（ＯＲＦ２）、 配列番号：５５のヌクレオチド１２３８５〜１３１１６（ＯＲＦ３）、 配列番号：５５のヌクレオチド１２９３０〜１３４６３（ＯＲＦ４）、 配列番号：５５のヌクレオチド１３４７７〜１４０７６（ＯＲＦ５）、 配列番号：５５のヌクレオチド１４０６４〜１４５８５（ＯＲＦ６）、および 配列番号：５５のヌクレオチド１４５７８〜１４９４６（ＯＲＦ７）を包含す
る、または
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２３】 配列番号：５４のヌクレオチド１９１〜７６９９（ＯＲＦ１ａ）、 配列番号：５４のヌクレオチド７６５７〜１２００９（ＯＲＦ１ｂ）、 配列番号：５４のヌクレオチド１２０７４〜１２８４１（ＯＲＦ２）、 配列番号：５４のヌクレオチド１２６９７〜１３４５８（ＯＲＦ３）、 配列番号：５４のヌクレオチド１３２４２〜１３７７５（ＯＲＦ４）、 配列番号：５４のヌクレオチド１３７８９〜１４３８８（ＯＲＦ５）、 配列番号：５４のヌクレオチド１４３７６〜１４８９７（ＯＲＦ６）、および 配列番号：５４のヌクレオチド１４８９０〜１５２５８（ＯＲＦ７）を包含す
る ＩＳＵ−１２のＩＳＵ−５５のオープンリーディングフレームをコードするＤ
ＮＡ配列を提供することである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】 また、本発明の目的は、ＩＳＵ−１２またはＩＳＵ−５５をコードするＤＮＡ
配列、またはそれらの１種類以上のＯＲＦによってコードされるポリペプチドを
提供することである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】 更にもう一つの本発明の目的は、ＩＳＵ−１２またはＩＳＵ−５５の１種類以
上のＤＮＡ配列によってコードされる１種類以上のポリペプチドを含んでなるＰ
ＲＲＳＶに対する抗体を誘導する組成物を提供することである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 アメリカン・サイアナミド・カンパニー ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＣＹＡＮＡＭＩＤ Ｃ ＯＭＰＡＮＹ アメリカ合衆国ニュージャージイ州07940 −0874 マディソン・フアイブジラルダフ アームス（番地なし) (72)発明者 プレム、エス．ポール アメリカ合衆国アイオワ州、アメス、アリ ゾナ、サークル、4206 (72)発明者 ヤンジン、ツァン アメリカ合衆国テキサス州、サン、アント ニオ、バブコック、ナンバー、2201、2626 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA14 BA32 CA04 DA02 EA02 GA11 HA12 HA15 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ52 QR08 QR32 QR36 QR42 QR55 QR62 QS25 QS34 QX02 4C085 AA03 BA51 CC04 DD86 FF13 4H045 AA11 AA30 BA10 CA01 DA86 EA29 EA53 FA74

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号： （ＩＳＵ−１２）からなるブタ生殖器および呼吸器症候群ウイ
    ルス（ＰＲＲＳＶ）をコードするＤＮＡ配列。
  2. 【請求項２】 配列番号： のヌクレオチド１９１〜７３８７（ＯＲＦ１ａ）、 配列番号： のヌクレオチド７３７５〜１１７５７（ＯＲＦ１ｂ）、 配列番号： のヌクレオチド１１７６２〜１２５２９（ＯＲＦ２）、 配列番号： のヌクレオチド１２３８５〜１３１１６（ＯＲＦ３）、 配列番号： のヌクレオチド１２９３０〜１３４６３（ＯＲＦ４）、 配列番号： のヌクレオチド１３４７７〜１４０７６（ＯＲＦ５）、 配列番号： のヌクレオチド１４０６４〜１４５８５（ＯＲＦ６）、および 配列番号： のヌクレオチド１４５７８〜１４９４６（ＯＲＦ７）からなる
    群から選択される請求項１に記載のＰＲＲＳＶのオープンリーディングフレーム
    をコードするＤＮＡ配列。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド。
  4. 【請求項４】 請求項２に記載のＤＮＡ配列によってコードされる１個以上のポリペプチドを
    含んでなるＰＲＲＳＶに対する抗体を誘導するための組成物。
  5. 【請求項５】 配列番号： （ＩＳＵ−５５）からなるＰＲＲＳＶをコードするＤＮＡ配列
    。
  6. 【請求項６】 配列番号： のヌクレオチド１９１〜７６９９（ＯＲＦ１ａ）、 配列番号： のヌクレオチド７６８７〜１２０６９（ＯＲＦ１ｂ）、 配列番号： のヌクレオチド１２０７４〜１２８４１（ＯＲＦ２）、 配列番号： のヌクレオチド１２６９２〜１３４５８（ＯＲＦ３）、 配列番号： のヌクレオチド１３２１２〜１３７７５ＯＲＦ４）、 配列番号： のヌクレオチド１３７８９〜１４３８８（ＯＲＦ５）、 配列番号： のヌクレオチド１４３７６〜１４５９２（ＯＲＦ６）、および 配列番号： のヌクレオチド１４８９０〜１５２５８（ＯＲＦ７）からなる
    群から選択される請求項５に記載のＰＲＲＳＶのオープンリーディングフレーム
    をコードするＤＮＡ配列。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド。
  8. 【請求項８】 ブタにおいて抗体を誘導するのに有効な配列番号： （ＩＳＵ−５５）によ
    ってコードされるＰＲＲＳＶの一定量および生理学的に許容可能なキャリヤーを
    含んでなる、ＰＲＲＳＶに対する抗体を誘導するための組成物。
  9. 【請求項９】 請求項６に記載のＤＮＡ配列によってコードされる１個以上のポリペプチドを
    含んでなる、ＰＲＲＳＶに対する抗体を誘発するための組成物。
  10. 【請求項１０】 上記の５週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病 変を統計学的に有意な量だけ減少させ、この量が接種していない５週齢の初乳を
    欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変と比較して有意であり 、すなわちｐ値が０．０１未満である、請求項８に記載の組成物。
  11. 【請求項１１】 上記の５週齢の初乳を欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病 変を統計学的に有意な量だけ減少させ、この量が接種していない５週齢の初乳を
    欠失したカエサリアン(caesarean)由来のブタの肺の病変と比較して有意であり 、すなわちｐ値が０．０１未満である、請求項９に記載の組成物。
  12. 【請求項１２】 更にアジュバントを含んでなる、請求項８に記載の組成物。
  13. 【請求項１３】 更にアジュバントを含んでなる、請求項９に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 ブタ生殖器および呼吸器疾患からブタを保護する方法であって、請求項８に記
    載の組成物の有効量をこの疾患から保護する必要があるブタに投与することを含
    んでなる、方法。
  15. 【請求項１５】 上記ワクチンを経口または非経口投与する、請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 上記ワクチンを筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、皮下または鼻内投与する、請
    求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ブタ生殖器および呼吸器疾患からブタを保護する方法であって、請求項９に記
    載の組成物の有効量をこの疾患から保護する必要があるブタに投与することを含
    んでなる、方法。
  18. 【請求項１８】 上記ワクチンを経口または非経口投与する、請求項１４に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 上記ワクチンを筋肉内、皮内、静脈内、腹腔内、皮下または鼻内投与する、請
    求項１７に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 ＰＲＲＳＶ ＩＳＵ−５５株をＰＲＲＳＶの他の株から識別する方法であって
    、 （ａ） 下記の２種類のプライマー ５５Ｆ ５′−ＣＧＴＡＣＧＧＣＧＡＴＡＧＧＧＡＣＡＣＣ−３′、および ３ＲＦＬＰ ５′−ＧＧＣＡＴＡＴＡＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＧ−３′ を用いてＰＲＲＳＶのＤＮＡ配列を増幅し、 （ｂ） 段階（ａ）の増幅した配列をＤｒａＩで消化し、 （ｃ） ６２６ｂｐ、１８７ｂｐおよび１３５ｂｐの３種類の制限断片をＰＲ
    ＲＳＶ ＩＳＵ−５５株と相関させる ことを特徴とする、方法。
JP2000530103A 1998-02-06 1999-02-08 ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）のポリ核酸によってコードされるタンパク質 Pending JP2002504317A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/019,793 1998-02-06
US09/019,793 US6380376B1 (en) 1992-10-30 1998-02-06 Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
PCT/US1999/002630 WO1999039582A1 (en) 1998-02-06 1999-02-08 Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010256079A Division JP2011103883A (ja) 1998-02-06 2010-11-16 ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）のポリ核酸によってコードされるタンパク質

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2002504317A true JP2002504317A (ja) 2002-02-12
JP2002504317A5 JP2002504317A5 (ja) 2006-03-30

Family

ID=21795057

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000530103A Pending JP2002504317A (ja) 1998-02-06 1999-02-08 ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）のポリ核酸によってコードされるタンパク質
JP2010256079A Pending JP2011103883A (ja) 1998-02-06 2010-11-16 ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）のポリ核酸によってコードされるタンパク質

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010256079A Pending JP2011103883A (ja) 1998-02-06 2010-11-16 ブタ生殖器および呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）のポリ核酸によってコードされるタンパク質

Country Status (13)

Country Link
US (3) US6380376B1 (ja)
EP (1) EP1047301B1 (ja)
JP (2) JP2002504317A (ja)
KR (2) KR100711656B1 (ja)
AT (1) ATE371373T1 (ja)
AU (1) AU743212B2 (ja)
BR (1) BR9908615A (ja)
CA (2) CA2320359C (ja)
DE (1) DE69936977T2 (ja)
ES (1) ES2294834T3 (ja)
HK (1) HK1032511A1 (ja)
NO (1) NO329875B1 (ja)
WO (1) WO1999039582A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009501901A (ja) * 2005-07-05 2009-01-22 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 診断試験キット
US8399187B2 (en) 2004-06-18 2013-03-19 Regents Of The University Of Minnesota Identifying virally infected and vaccinated organisms
US9080143B2 (en) 2005-06-24 2015-07-14 University Of Minnesota PRRS viruses, infectious clones, mutants thereof, and method of use
JP2017510276A (ja) * 2014-03-21 2017-04-13 ニューテック・ベンチャーズ 非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）及び使用する方法
JP2019512518A (ja) * 2016-03-23 2019-05-16 インターベット インターナショナル ベー． フェー． Ｐｃｖ２およびｐｒｒｓウイルス感染に対する皮内適用のためのワクチン

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2290906C (en) * 1991-06-06 2003-04-01 Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits
US5695766A (en) * 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US6380376B1 (en) * 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
EP0839912A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
WO2000053787A1 (en) * 1999-03-08 2000-09-14 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Dierg Ezondheid B.V. Prrsv vaccines
JP4778620B2 (ja) * 1999-04-22 2011-09-21 ユナイテッド ステイツ デパートメント オブ アグリカルチャー 分離株ｊａ−１４２に基づく、豚繁殖・呼吸障害症候群ワクチン
US6951605B2 (en) * 2002-10-08 2005-10-04 Exxonmobil Research And Engineering Company Method for making lube basestocks
US7632636B2 (en) * 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
US7449296B2 (en) 2005-02-28 2008-11-11 Mj Biologics, Inc. Method and kit for detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus
EP1962900A2 (en) * 2005-11-29 2008-09-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Identification of protective antigenic determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) and uses thereof
CA2734390A1 (en) * 2008-08-25 2010-03-04 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Vaccine against highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome (hp prrs)
AR078253A1 (es) * 2009-09-02 2011-10-26 Boehringer Ingelheim Vetmed Metodos para reducir la actividad antivirica en composiciones pcv-2 y composiciones pcv-2 con mejor inmunogenicidad
KR102183276B1 (ko) 2011-02-17 2020-11-26 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 신규 유럽형 ｐｒｒｓｖ 스트레인
KR101983980B1 (ko) 2011-02-17 2019-05-30 베링거잉겔하임베트메디카게엠베하 Ｐｒｒｓｖ의 상업적 규모의 제조 방법
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
EP2737058A1 (en) 2011-07-29 2014-06-04 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH INFECTIOUS cDNA CLONE OF EUROPEAN PRRS VIRUS AND USES THEREOF
UA114503C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv та mycoplasma hyopneumoniae
UA114504C2 (uk) 2012-04-04 2017-06-26 Зоетіс Сервісіз Ллс Комбінована вакцина pcv, mycoplasma hyopneumoniae та prrs
US9120859B2 (en) 2012-04-04 2015-09-01 Zoetis Services Llc Mycoplasma hyopneumoniae vaccine
MX2014013964A (es) * 2012-05-17 2015-03-04 Zoetis Llc Vacunacion eficaz contral el virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino (prrs) antes del destete.
CN105073130A (zh) 2013-03-15 2015-11-18 勃林格殷格翰动物保健公司 猪生殖与呼吸综合征病毒、组合物、疫苗及使用方法
EA201890110A1 (ru) * 2015-06-23 2018-05-31 Мериал, Инк. Рекомбинантные вирусные векторы, содержащие минорные белки prrsv, и способы их получения и применения
US10279031B2 (en) 2016-05-11 2019-05-07 Phibro Animal Health Corporation Composition comprising antigens and a mucosal adjuvant and a method for using
CN114404439B (zh) * 2022-02-11 2023-07-11 山东农业大学 抑制不同类型猪繁殖与呼吸综合症病毒感染的阻断剂

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5213795A (en) * 1990-10-24 1993-05-25 Oxford Encephalomyocarditis virus vaccine
CA2290906C (en) * 1991-06-06 2003-04-01 Stichting Centraal Diergeneeskundig Instituut Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits
DE601062T1 (de) * 1991-08-26 1995-05-18 James Edward Collins Vakzine gegen und diagnosemethode für das schweine-unfruchtbarkeits- und atmungs-syndrom (suas).
US6982160B2 (en) * 1991-08-26 2006-01-03 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Immunogenic compositions that include SIRS virus
US6042830A (en) * 1992-08-05 2000-03-28 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Viral agent associated with mystery swine disease
MX9204885A (es) 1991-08-26 1994-05-31 Boehringer Animal Health Inc Composicion de vacuna que comprende virus del sindrome de infertilidad y respiratorio de los cerdos.
US5846805A (en) * 1991-08-26 1998-12-08 Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
AU2696792A (en) 1991-09-16 1993-04-27 David A Benfield Vaccine for mystery swine disease and method for diagnosis thereof
EP0610250B2 (en) 1991-10-14 2008-10-29 Intervet International BV Porcine reproductive respiratory syndrome (prrs) vaccine and diagnostic
FR2686097B1 (fr) * 1992-01-14 1994-12-30 Rhone Merieux Preparation d'antigenes et de vaccins de virus de la mystery disease, antigenes et vaccins obtenus pour la prevention de cette maladie.
TW289731B (ja) * 1992-07-09 1996-11-01 Akzo Nv
US6380376B1 (en) * 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6251397B1 (en) 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
US6773908B1 (en) * 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US5695766A (en) * 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US5419907A (en) * 1992-11-10 1995-05-30 Iowa State University Research Foundation, Inc. Pathogenic porcine respiratory coronavirus
DE69426228T2 (de) * 1993-02-08 2001-03-01 Bayer Ag Verfahren zum Vermehren des das Reproduktions- und Atemwegs-Syndrom verursachenden Schweinevirus und dessen Verwendung als Impfstoff.
EP0984068B1 (en) * 1993-04-27 2012-03-28 Innogenetics N.V. Sequences of hepatitis c virus genotypes and their use as therapeutic and diagnostic agents
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
EP0659885A1 (en) * 1993-12-21 1995-06-28 Akzo Nobel N.V. Vaccine against viruses associated with antibody-dependent-enhancement of viral infectivity
DE4407489A1 (de) * 1994-03-07 1995-09-14 Bayer Ag Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines
PT676467E (pt) * 1994-04-11 2002-02-28 Akzo Nobel Nv Estirpes europeias de vacina do virus do sindroma reprodutivo e respiratorio porcino (prrsv)
DK53595A (da) * 1994-05-13 1995-11-14 Iberica Cyanamid Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner
CA2196555C (en) 1994-08-05 2012-07-03 Michael P. Murtaugh Vr-2332 viral nucleotide sequence and methods of use
DE69632658T2 (de) * 1995-03-14 2005-06-09 Akzo Nobel N.V. Expression in der selben Zelle von Polypeptide vom schweinen reproduktiven und respiratorischen Syndrom
ES2102971B1 (es) * 1996-01-25 1998-03-01 Hipra Lab Sa Nueva cepa atenuada del virus causante del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs), las vacunas y medios de diagnostico obtenibles con la misma y los procedimientos para su obtencion.
US5866401A (en) * 1996-03-01 1999-02-02 Schering Corporation Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
US6015663A (en) * 1996-03-01 2000-01-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Restriction enzyme screen for differentiating porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains
US6514731B1 (en) * 1996-05-24 2003-02-04 Chiron Corporation Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
US5976537A (en) * 1996-07-02 1999-11-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine
EP0835930B1 (en) * 1996-10-09 2001-01-31 Akzo Nobel N.V. European vaccine strains of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
DK0980387T3 (da) * 1997-05-06 2007-10-22 Boehringer Ingelheim Vetmed PRRSV-antigene sites, der identificerer peptidsekvenser af PRRS-virus, til anvendelse i vacciner eller diagnostiske assays
GB9820525D0 (en) * 1998-09-21 1998-11-11 Allergy Therapeutics Ltd Formulation
EP1170367A1 (en) 2000-06-27 2002-01-09 Bayer Ag BVDV virus-like particles
CA2591532A1 (en) 2004-09-03 2006-03-09 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8399187B2 (en) 2004-06-18 2013-03-19 Regents Of The University Of Minnesota Identifying virally infected and vaccinated organisms
US9080143B2 (en) 2005-06-24 2015-07-14 University Of Minnesota PRRS viruses, infectious clones, mutants thereof, and method of use
JP2009501901A (ja) * 2005-07-05 2009-01-22 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 診断試験キット
JP2013135688A (ja) * 2005-07-05 2013-07-11 Regents Of The Univ Of Minnesota 診断試験キット
JP2017510276A (ja) * 2014-03-21 2017-04-13 ニューテック・ベンチャーズ 非天然発生のブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス（ｐｒｒｓｖ）及び使用する方法
JP2019512518A (ja) * 2016-03-23 2019-05-16 インターベット インターナショナル ベー． フェー． Ｐｃｖ２およびｐｒｒｓウイルス感染に対する皮内適用のためのワクチン
US11654191B2 (en) 2016-03-23 2023-05-23 Intervet Inc. Vaccine for intradermal application against PCV2 and PRRS virus infection

Also Published As

Publication number Publication date
US6380376B1 (en) 2002-04-30
AU2590899A (en) 1999-08-23
US20080286276A1 (en) 2008-11-20
ATE371373T1 (de) 2007-09-15
HK1032511A1 (en) 2001-07-27
US7264802B2 (en) 2007-09-04
EP1047301B1 (en) 2007-08-29
KR20010082511A (ko) 2001-08-30
KR100696339B1 (ko) 2007-03-20
NO329875B1 (no) 2011-01-17
EP1047301A4 (en) 2002-01-02
US20030138442A9 (en) 2003-07-24
NO20003526L (no) 2000-09-26
JP2011103883A (ja) 2011-06-02
EP1047301A1 (en) 2000-11-02
AU743212B2 (en) 2002-01-24
WO1999039582A1 (en) 1999-08-12
DE69936977T2 (de) 2008-05-29
KR20060017675A (ko) 2006-02-24
ES2294834T3 (es) 2008-04-01
DE69936977D1 (de) 2007-10-11
CA2320359A1 (en) 1999-08-12
KR100711656B1 (ko) 2007-04-27
US20020168379A1 (en) 2002-11-14
CA2751655A1 (en) 1999-08-12
CA2320359C (en) 2013-02-05
CA2751655C (en) 2014-04-22
BR9908615A (pt) 2001-10-02
NO20003526D0 (no) 2000-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU743212B2 (en) Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6977078B2 (en) Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
EP0835315B1 (en) Vaccine for porcine reproductive and respiratory syndrome virus
AU754938B2 (en) PRRSV antigenic sites identifying peptide sequences of PRRS virus for use in vaccines or diagnostic assays
Meulenberg et al. Nucleocapsid protein N of Lelystad virus: expression by recombinant baculovirus, immunological properties, and suitability for detection of serum antibodies
Zhang et al. MONOCLONIAL ANTIE ODIES AGAINST CONFORMATIONALLY
Zhang et al. CELL SURFACE EXPRESSION OF VIRAL PROTEINS OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS IN INSECT CELLS AND THEIR ROLE IN PROTECTION AGAINST RESPIRATORY DISEASE
MXPA99010185A (en) Prrsv antigenic sites identifying peptide sequences of prrs virus for use in vaccines or diagnostic assays

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060131

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20060131

A711 Notification of change in applicant

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711

Effective date: 20060206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20060206

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20081128

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090226

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090305

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090325

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090401

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090421

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090428

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20090528

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20090825

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091125

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20091202

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20091225

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100107

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100125

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100201

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20100225

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100716

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101116

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20110104

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20110126

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20110408

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120813

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120816

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20121011

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20121016