CN103641920B - 猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)的保护性抗原决定子的鉴定及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保护性抗原决定子多肽(PAD多肽)以及编码PAD的核酸。PAD通过PRRSV的GP5蛋白和M蛋白组成的异源二聚体产生,其中GP5的细胞外结构域具有不同的N糖基化状态。PAD及其编码核酸可用于开发抗PAD抗体,有效提供抗PRRSV感染保护作用的疫苗,以及检测PAD特异性疫苗产生的PAD抗体的存在的诊断方法中。本发明还涉及抗PAD抗体的产生方法,用于接种猪以提供抗PRRSV的保护作用的方法,制备所述疫苗的方法,以及治疗猪中的PRRSV感染的方法和检测抗PRRSV的PAD的抗体的方法。
Description
本申请是申请日为2006年11月29日的申请号为200680044869.X标题为“猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保护性抗原决定子的鉴定及其用途”的申请的分案申请
交叉申请
本申请根据35U.S.C.§119要求2005-11-29提交的临时申请60/740,519的优先权,该申请全文包含在本文中作为参考。
技术领域
本发明的实施方案总体涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),更具体涉及PRRSV的新保护性抗原决定子(PAD)的发现,以及其在疫苗、治疗和诊断分析中的应用。
背景技术
1987年中,美国猪生产业经历了一种未知的感染性疾病,对养猪业造成了严重的经济影响。该疾病综合征在欧洲包括德国、比利时、荷兰、西班牙和英格兰都有报道。
该疾病的特征在于繁殖不能,呼吸疾病和各种临床症状包括丧失胃口,发热,腹泻以及轻微的神经症状。该综合征的主要组成部分是繁殖不能,表现为早产,晚期流产,先天体弱,死产,木乃伊胎,产崽率降低,以及动情期恢复延迟。临床呼吸疾病症状在3周龄以下的猪中最为明显,并据报道出现于所有生产期。受累幼猪生长缓慢,皮毛粗糙,呼吸窘迫(“喘粗气”),并且死亡率增加。
该疾病综合征由很多名称,包括猪神秘病(mystery swine disease)(MSD),猪流行性流产(porcine epidemic abortion)以及呼吸综合征(respiratory syndrome)(PEARS),猪不孕与呼吸综合征(swine infertility and respiratory syndrome)(SIRS)。现在通常使用的名称是猪繁殖与呼吸综合征(PRRS);该术语在本专利申请中通篇使用。
PRRSV优选在肺泡肺巨噬细胞中生长(Wensvoort et al.,1991)。一些细胞系,诸如CL2621以及其他从猴肾细胞系MA-104克隆的其他细胞系也对病毒敏感。一些已知的PRRSV毒株的保藏号为CNCM I-1102,I-1140,I-1387,I-1388,ECACC V93070108,或ATCCVR2332,VR2385,VR2386,VR2429,VR2474,和VR2402。PRRSV基因组长度为15kb,包含编码RNA依赖性RNA聚合酶的基因(ORF1a和ORF1b)以及编码结构蛋白的基因(ORFs2-7;Meulenberget al.,1993and Meulenberg et al.,1996)。ORF5编码主要包膜糖蛋白,称为GP5。ORFs2,3和4分别编码糖蛋白GP2,GP3和GP4。这些糖蛋白在PRRSV的Lelystad病毒分离株的纯化病毒粒子中以较低的丰度存在。GP5蛋白长度大约200个氨基酸,分子量25kDa,并与ER中的ORF6编码的基质蛋白M形成二硫键连接的异源二聚体。M蛋白长度大约190氨基酸,19kDa,并且是非糖基化。核壳体蛋白N由ORF7编码。来自欧洲和北美的PRRSV分离株的基因组序列的分析,以及其与单克隆抗体的反应性已经证实了它们代表两种不同的抗原类型。这些洲的分离株在遗传上不同并且从共同祖先在较早以前分离(Murtaugh et al.,1995)。
动脉炎病毒(arteriviruses)的基因组组成类似冠状病毒和托罗病毒,它们的复制涉及亚基因组mRNA的3’-共末端嵌套组的形成mRNAs(sg mRNAs)(Chen et al.,1993,J.Gen.Virol.74:643-660;Den Boon et al.,1990,J.Virol.,65:2910-2920;De Vries etal.,1990,Nucleic Acids Res.,18:3241-3247;Kuo et al.,1991,J.Virol.,65:5118-5123;Kuo et al.,1992;U.S.application Ser.Nos.08/131,625and08/301,435)。几种北美分离株的部分序列也被测定(美国申请08/131,625和08/301,435;Mardassi et al.,1994,J.Gen.Virol.,75:681-685)。目前可得的疫苗不诱导病毒中和型VN抗体或诱导的抗体水平不适合对抗PRRSV感染。目前没有商业可得的含有预防PRRSV感染或治疗PRRS的抗体的产品。目前商业可得的疫苗不提供对抗PRRS的适当保护。保守估计表明PRRS造成每年美国工业花费$60亿。
为了上述和其他原因,需要本发明。
发明简述
本发明人首次识别了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保护性抗原决定子(PAD),其可治疗并提供抗PRRSV感染保护作用。令人吃惊的,本发明人鉴定出PRRSV的糖蛋白5(GP5),基质(M)蛋白,或者GP5和M蛋白通过二硫键连接形成的异源二聚体可产生提供抗PRRSV保护作用的PAD。连接M蛋白与GP5蛋白的二硫键来自北美PRRSV毒株位置9和EUPRRSV位置8上M蛋白的半胱氨酸以及北美PRRSV毒株位置48和欧洲PRRSV毒株位置50上的GP5蛋白的半胱氨酸。
一个实施方案中,本发明提供一或多种分离的多肽,包含含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的糖蛋白5(GP5)的抗原序列,其中GP5蛋白在北美PRRSV毒株中天冬酰胺GP5蛋白的位置1-44或在欧洲PRRSV毒株中GP5蛋白的位置1-46的天冬酰胺具有不同的N-糖基化模式。另一个实施方案中,本发明提供分离的多肽,其包含含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基质(M)蛋白的抗原序列。另一个实施方案中,抗原序列包括上述的PRRSV GP5序列和基质蛋白(M蛋白),其中GP5蛋白通过二硫键连接所述M蛋白,所述二硫键由北美PRRSV毒株中第9位以及EU PRRSV毒株中第8位的M蛋白的半胱氨酸与北美PRRSV毒株GP5蛋白的第48位或欧洲PRRSV毒株中第50位的半胱氨酸形成,从而产生GP5-M异源二聚体。本发明的一个方面中,PAD包括GP5-M异源二聚体,其中包含GP5的细胞外结构域以及M的细胞外结构域。
另一个实施方案中,本发明提供了分离的核酸,其编码本发明的任何PAD多肽。因此,本发明提供了产生针对PRRSV的一或多个保护性抗原决定子(PAD)的抗体的方法,用于制备对抗PRRSV的至少一种PAD的疫苗的方法,给猪接种的方法,预防或治疗猪中的PRRSV感染的方法,以及检测动物中针对PRRSV的至少一种保护性抗原决定子(PAD)的抗体的方法。
本发明涉及产生针对PRRSV的至少一种保护性抗原决定子(PAD)的抗体的方法,包括提供至少一种PAD多肽或编码PAD多肽的核酸,并将所述肽或核酸给予动物对象。本发明还涉及产生针对PRRSV的至少一种保护性抗原决定子(PAD)的抗体的方法,包括:提供PAD多肽或编码PAD多肽的核酸,并将所述多肽或核酸给予动物对象。本发明还提供制备针对PRRSV的至少一种PAD的疫苗的方法,所述疫苗包括PAD多肽或编码PAD多肽的核酸。另一个实施方案中,对猪疫苗接种的方法包括给予猪在给予易感猪时有效对抗PRRSV感染的量的包含至少一种PAD多肽或编码PAD多肽的核酸疫苗。本发明涉及预防或治疗猪中的PRRSV感染的方法,包括给予猪治疗有效量的疫苗,所述疫苗具有至少一种PAD多肽或编码至少一种PAD多肽的核酸。治疗猪中的PRRSV感染的另一种方法包括给予需要治疗的动物针对PRRSV的至少一种保护性抗原决定子(PAD)的抗体。还涉及检测动物中针对PRRSV的至少一种保护性抗原决定子(PAD)的抗体。该方法包括保温动物例如猪的生物学样品包括抗血清与PAD多肽一段足以使得抗体结合发生的时间,并测定抗体与所述多肽的结合。
另一个实施方案中,本发明提供了分离的抗至少一种PAD多肽或编码PAD多肽的核酸的抗体。本发明还公开了对抗PRRSV感染的疫苗,其中包含有效对抗PRRSV感染的量的至少一种PAD多肽或编码至少一种PAD多肽的核酸。另一方面,所述疫苗包括生理学接受的载体。另一实施方案中,本发明提供试剂盒,其中包含以下物质的至少一种:PAD多肽,编码PAD多肽的核酸,抗PAD多肽的抗体或包含PAD多肽或编码PAD多肽的核酸的疫苗。
因此,本发明的一个目的是提供分离的多肽,其包含含有PRRSV的GP5的PRRSV的PAD。
本发明的另一目的是提供分离的多肽,包含含有PRRSV基质蛋白(M)的PRRSV的PAD。
本发明的另一目的是提供分离的多肽,包含PRRSV的PAD,所述PAD中含有通过二硫键与PRRSV的M蛋白连接的PRRSV的GP5。
本发明的另一目的是提供分离的编码PAD多肽的核酸。
本发明的另一目的是提供产生针对PRRSV的保护性抗原决定子(PAD)的抗体。
本发明的另一目的是提供制备疫苗的方法。
本发明的另一目的是提供针对PRRSV的PAD对猪进行免疫接种从而有效保护猪对抗PRRSV感染。
本发明的另一目的是提供针对PRRSV的PAD的疫苗,用于保护猪对抗PRRSV感染。
本发明的另一目的是提供治疗或预防猪中的PRRSV感染的方法。
本发明的另一目的是提供检测针对PRRSV的保护性抗原决定子(PAD)的抗体的方法。
本发明的另一目的是提供免疫性结合PRRSV的PAD多肽的抗体。
本发明的另一目的是提供有效对抗PRRSV感染的疫苗。
本发明的另一目的是提供诊断试剂盒用于分析或检测PRRSV的PAD的抗体。
本发明的这些和其他实施方案通过以下具体描述显而易见。所有公开内容全文包含在此作为参考。
附图简述
图1:PRRSV GP5信号序列与细胞外结构域(氨基酸1-60)的氨基酸比较。GP5的中和表位加下划线。N-糖基化糖基化粗体显示。细胞外结构域中的N-聚糖的存在或位置与对PRRSV易感性或PRRSV中和抗体的出现有关。
图2:包含VR2332和HLV013抗血清的非还原Western免疫印迹。猪用VR2332或HLV013在第一天攻击。所有猪在第90天用VR2332攻击。两种检测的抗原的蛋白浓度相同。抗血清1:4000稀释。泳道1是标准梯。泳道2是IA97-7895抗原和正常猪血清。泳道3是HLV013抗原和正常猪血清。泳道4是LA97-7895抗原和接种(p.i.)42天后的HLV013抗血清。泳道5是HLV013抗原和p.i.后42天的HLV013抗血清。泳道6是IA97-7895抗原和p.i.42天后的VR2332抗血清。泳道7是HLV013抗原和p.i.42天后的VR2332抗血清。泳道8是IA97-7895抗原和p.i.104天后的HLV013抗血清。泳道9是HLV013抗原和p.i.104天之后的HLV013抗血清。泳道10是IA97-7895抗原和p.i.104天后的VR2332抗血清。泳道11是HLV013抗原和p.i.104天后的VR2332抗血清。泳道12是标准梯。
图3:活PRRSV接种之后猪的不同血清样品的非还原Western印迹。随着中和抗体(FFN)效价的增加,对GP-M的抗体反应强度的增加表明GP-M特异性抗体的保护性作用。然而抗GP5单体的抗体强度降低。反应强度稍有降低也见于N-N同源二聚体和基质单体,但以前的研究显示这些蛋白的特异性抗体并非保护性的。泳道1-梯,泳道2-中和效价=256,泳道3-中和效价=1024,泳道4-中和效价=2048。
图4:两次接种HIV013或VR2332的猪中的中和抗体反应。每组6只猪的几何平均效价。*第1组猪(对照)在整个研究中中和抗体一直为阴性。与第2组相比,第3组猪具有更快、更强的抗同源和异源病毒的中和抗体产生。
图5:接种异源毒株(MN184)后的中和抗体反应。参照实施例2对各个泳道的描述。该试验提供证据表明对糖基化不同的各种毒株的保护性抗体反应存在很大差异。缺乏aa44之前的糖基化的HLV013与VR2332相比具有更快、更强的攻击前抗体反应,所述反应的交叉反应性更强。HLV013接种的猪在攻击后具有更快的记忆效应和更快地产生抗攻击毒株抗体。注意到MN184和VR2332的GP5-M异源二聚体由于存在另外的N-多肽而具有稍高的分子量。
图6:比较实施例3中针对不同PRRSV聚糖类型组产生的中和抗体的几何平均效价。
图7:比较第1组和第2组的猪的抗体反应性的非还原Western印迹。参见实施例3中的表关于泳道内容物的描述。该图显示与单独的HLV013相比,在HLV013-HLV093方案中产生的保护性抗体的增加是由于对GP5-M的反应性增加。
图8:比较HLV093接种的猪(泳道1)和VR2332-VR2332接种的猪(泳道3)的抗体图谱的非还原Western印迹。泳道2显示梯。纯化的VR2332蛋白用作受试抗原(10ug每泳道)。一级抗体稀释度为1:100,二级抗体稀释度为1:2000。泳道1中的抗-VR2332FFN效价为256,泳道3中的为16。因此HLV013-HLV093接种的猪与VR2332-VR2332接种的猪相比具有更高的抗-VR2332中和效价。对GP-M异源二聚体的反应的明显差异也见于Western印迹中。
图9:VR2332GP5-M异源二聚体。虚线表示N-连接的聚糖(未按比例显示(not toscale))。
图10:HLV013GP5-M异源二聚体。
图11:HLV093GP5-M异源二聚体。
图12:HLV092GP5-M异源二聚体。
图13:Lelystad GP5-M异源二聚体。
图14:肽ELISA数据。肽ELISA检测PRSSV GP5的病毒中和表位的抗体。猪(n=6每组)用相同效价的HLV013或VR2332PRRSV在第0天接种。
图15:用HLV013粗病毒抗原(CVA)或Intervet’s杀死的疫苗接种的猪中的平均IDEXX ELISA反应。
图16.没有聚糖封闭(block)或屏蔽(shield)的中和表位。
图17.具有聚糖封闭的中和表位(BNE)。
图18.仅仅具有聚糖屏蔽的中和表位。
图19.具有聚糖封闭和聚糖屏蔽的高度糖基化毒株。
图20.HLV013完整ORF5和6,分别对应GP5和M蛋白。
图21A和21B.编码基质蛋白的ORF6序列。
图22A和22B.PRRSV GP5信号序列和细胞外结构域的氨基酸序列的实例。
图23.对应GP5的HLV092完整ORF5。
图24.对应GP5的HLV093完整ORF5。
优选实施方案详述
本发明人首先鉴定了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保护性抗原决定子(PAD),其提供针对PRRSV感染的治疗和保护。
本领域已知利用PRRSV疫苗的异源保护作用的降低或缺失。本发明人认为PRRSV的糖蛋白5(GP5)细胞外结构域中天冬酰胺N-糖基化模式的改变或GP5与另一种蛋白例如PRRSV的M蛋白的相互作用导致GP5构象的改变在提供针对PRRSV的保护作用中起重要作用。一方面,GP的结构通过与PRRSV的M蛋白形成异源二聚体而改变。见图9-12。核苷酸或氨基酸序列的改变可导致构象改变或在GP5细胞外结构域上添加或减少N-连接的糖基化位点。本发明人还表明对PRRSV的M蛋白的改变也可影响异源二聚体构象。本发明人相信PRRSV的糖蛋白5(GP5)细胞外结构域或PRRSV的糖蛋白5(GP5)与基质蛋白(M蛋白)通过二硫键连接形成的GP5-M异源二聚体中天冬酰胺的N-糖基化模式的改变导致提供抗PRRSV感染保护的PAD。连接M蛋白和GP5蛋白的二硫键来自位于北美毒株位置48和欧洲毒株位置50的GP5蛋白的半胱氨酸。一方面,所述半胱氨酸位于北美PRRSV毒株M蛋白的位置9以及欧洲PRRSV毒株中的位置8。
一个实施方案中,本发明提供一或多个包含分离的多肽的PAD,所述分离的多肽包含含有PRRSV的糖蛋白5(GP5)的抗原序列,其中GP5蛋白具有不同的天冬酰胺N-糖基化模式,所述天冬酰胺位于北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置1-44或者位于欧洲PRRSV毒株GP5蛋白的位置1-46。一方面,PAD包括GP5的细胞外结构域。另一方面,PAD包括GP5细胞外结构域的中和表位。一方面,所述中和表位具有氨基酸序列SHLQLIYNL。
另一个实施方案中,本发明提供包含分离的多肽的PAD,所述分离的多肽含有包含PRRSV的基质(M)蛋白的抗原序列。一方面,所述抗原序列是M蛋白的细胞外结构域。一方面,所述所述细胞外结构域包括NA或EU PRRSV毒株的M蛋白的前30或更少个氨基酸。
另一个实施方案中,所述抗原序列包含本文所述的GP5序列以及PRRSV的基质(M)蛋白,其中GP5蛋白通过二硫键连接于M蛋白,所述二硫键由北美PRRSV毒株位置9和EUPRRSV位置8上M蛋白的半胱氨酸以及北美PRRSV毒株位置48和欧洲PRRSV毒株位置50上的GP5蛋白的半胱氨酸形成,从而产生GP5-M异源二聚体。
本发明一个实施方案中,GP5的PAD可不具有位于NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的任何聚糖。另一方面,GP5的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖。另一方面,GP5的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖并且具有或不具有位于NA PRRSVGP5蛋白中氨基酸1-35的聚糖,例如在一些NA PRRSV毒株中所见。
本发明一个实施方案中,GP5-M异源二聚体的PAD可不具有位于NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的任何聚糖。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖并且具有或不具有NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的聚糖,例如在一些NA PRRSV毒株中所见。
本发明一个实施方案中,GP5的PAD可不具有位于EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的任何聚糖,如在Lelystad中所见。另一方面,GP5的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖。另一方面,GP5的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖并且具有或不具有EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的聚糖,例如在一些EU PRRSV毒株中所见。
本发明一个实施方案中,GP5-M异源二聚体的PAD可不具有来自EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的任何聚糖,如在Lelystad中所见。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有位于EUPRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖并且具有或不具有EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的聚糖,例如在一些EU PRRSV毒株中所见。
另一个实施方案中,PAD包括抗原序列,所述抗原序列包含NA PRRSV的GP5的氨基酸36-45和PRRSV的M蛋白的细胞外结构域。另一方面,M蛋白细胞外结构域包含氨基酸1-30。本发明另一实施方案中,PAD包括抗原序列,所述抗原序列包含EU PRRSV的GP5的氨基酸38-47和PRRSV的M蛋白的细胞外结构域。GP5蛋白可具有不同的天冬酰胺N-糖基化模式,所述天冬酰胺位于北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置1-44或者位于欧洲PRRSV毒株GP5蛋白的位置1-46。这些变化也包括在本发明的PAD中。
因此,通过鉴定这样的PAD可开发有效对抗PRRSV的疫苗,所述PAD包含N-糖基化的或非-N-糖基化的来自GP5细胞外结构域的氨基酸1-46的GP5蛋白或M蛋白通过二硫键与来自PRRSV的GP5细胞外结构域的氨基酸1-46的N-糖基化或非-N-糖基化GP5蛋白相连的GP5-M异源二聚体。
本发明的疫苗包括本文所述的PAD多肽,并可包括但不限于免疫原性片段,其衍生物,类似物或变体,包括与图1所示任意PAD氨基酸序列至少65%相同,80%相同,95%相同或100%相同的氨基酸序列。SEQ ID NOS:__。
本发明的PAD包括下述片段的衍生物,类似物或变体,所述片段是免疫原活性易于筛选的片段,以及免疫原性片段,例如图1和21所示片段(SEQ ID NOS:__)。因此,可利用中和分析来检测其衍生物、类似物或变体,或利用诸如荧光聚焦中和(FFN)实验检测所述衍生物、类似物或变体为异源PRRSV攻击的猪提供保护作用的能力,或利用对异源二聚体进行的Western印迹检测来表明异源抗体的产生。因此,特异性片段可包括但不限于具有图1和21所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:__)的片段。认为GP5-M异源二聚体的片段可提供类似程度的保护作用是合理的。
一方面,所述疫苗可为减毒的疫苗、灭活的疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗、载体疫苗或基于DNA的疫苗。另一方面,所述疫苗可用于免疫计划或方案中。本发明另一方面中,PAD可用于制备抗体诊断基于PAD的PRRSV接种是否成功或产生用于预防和/或治疗PRRSV感染的疫苗。除了用作疫苗,本发明的PAD多肽可用作抗原刺激抗体产生,所述抗体可用于被动免疫治疗,用作诊断剂,以及用作其他方法诸如亲和层析的试剂。
定义:
本发明术语"猪繁殖与呼吸综合征病毒"或"PRRSV"指病毒,其导致疾病PRRS,PEARS,SIRS,MSD和/或PIP(术语"PIP"不常用目前),包括衣阿华PRRSV毒株,美国发现的其他PRRSV毒株(例如,VR2332),加拿大发现的PRRSV毒株(例如,IAF-exp91),欧洲发现的PRRSV毒株(例如,Lelystad病毒,PRRSV-10),以及与这些病毒密切联系的已经出现或将来出现的变体。
不受影响的猪是没有暴露于猪繁殖与呼吸综合征感染因子的猪,或已经暴露于猪繁殖与呼吸综合征感染因子诸如PRRSV但没有显示疾病症状的猪。受影响的猪是显示PRRSV症状或从其可分离PRRSV的猪。
术语“治疗”指减轻或缓解PRRSV感染的至少一种不良作用或症状。PRRS的临床表征或症状包括体重下降(weight loss),体重增加减少(decreased weight gain),嗜眠症(lethargy),呼吸窘迫(respiratory distress),“喘粗气(thumping)”(呼气费力(forcedexpiration)),发热(fever),皮毛粗糙(roughened haircoats),打喷嚏(sneezing),咳嗽(coughing),眼睛水肿(eyeedema)以及偶发结膜炎(conjunctivitis)。病变可包括宏观和/或微观肺病变(gross and/or microscopic lung lesion),心肌炎(myocarditis),淋巴腺炎(lymphadenitis),脑炎(encephalitis)和鼻炎(rhinitis)。此外,PRRSV以及衣阿华毒株的毒力较低和非毒性形式已经发现,其可导致上述症状中的一部分或根本不产生症状。PRRSV的毒性较低和非毒性形式可根据本发明使用提供针对猪繁殖与呼吸疾病的保护作用。
术语“ORF”指开放框架,或编码多肽的片段,其分离自病毒基因组,包括PRRSV基因组。本发明的多聚核酸中,ORF可部分(作为片段)或全部包括,并且可与相邻ORF的5’或3’末端重叠。
“核酸”或“多核苷酸”指嘌呤和嘧啶,其中含有任何长度的聚合物,包括聚核糖核苷酸和聚脱氧核糖核苷酸或混合的聚核糖-聚脱氧核糖核苷酸。这包括单链-和双链分子,即,cDNA,mRNA,DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA杂合子,以及将碱基与氨基酸主链相连形成的“蛋白质核酸”(PNA)。这也包括含有修饰的碱基的核酸。
“载体”是任何用于将核酸转移进宿主细胞的工具。载体可为可连接另外的DNA片段的复制子,从而使得连接的片段得以复制。“复制子”是任何遗传元件(例如质粒,噬菌体,粘粒,染色体,病毒)其作为DNA体内复制的自主复制单元,即能在其自身的控制之下进行复制。术语“载体”包括病毒和非病毒工具,用于将核酸在体外、离体或体内条件下引入细胞。病毒载体包括甲病毒,逆转录病毒,腺伴随病毒,痘病毒(pox),杆状病毒,痘苗病毒,单纯疱疹病毒,Epstein-Barr和腺病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒,脂质体,细胞转染剂(cytofectins),DNA-蛋白复合体,以及生物聚合物。除了核酸,载体也可含有一或多个调节区,和/或可选择标记用于选择、测定和监测核酸转移结果(转移到哪个组织,表达持续时间等)。
“盒”指DNA片段,其可插入载体的特定限制位点。该DNA片段编码目的多肽,并且盒以及限制位点用于保证将盒插入适当的读框中用于转录和翻译。
当所述DNA导入细胞内时,细胞被外源或异源DNA“转染”。
当转染的DNA改变表型时,细胞被外源或异源DNA“转化”。转化的DNA可整合入(共价连接)染色体DNA,构成细胞的基因组。
“核酸分子”指核糖核苷酸的磷酸酯聚合形式(腺苷,鸟苷,尿苷或胞苷;“RNA分子”)或脱氧核糖核苷酸(脱氧腺苷,脱氧鸟苷,脱氧尿苷或脱氧胞苷;“DNA分子”)或其任何磷酸酯类似物,诸如硫代磷酸酯和硫酯,可为单链形式或双链螺旋。双链DNA-DNA,DNA-RNA和RNA-RNA螺旋都是可能的。术语核酸分子,具体是DNA或RNA分子,仅指分子的一级和二级结构,并且不限于任何具体的三级形式。因此,该术语包括见于线性或环状DNA分子(例如限制片段)、质粒和染色体等中的双链DNA。在对具体的双链DNA分子的结构的讨论中,序列可根据常规表示成沿DNA未转录链(即具有与mRNA类似的序列的链)的5’到3’方向。“重组DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。
本文中“多肽”通常指具有超过8个氨基酸的肽和蛋白质。
“保守修饰的变体”用于氨基酸以及核酸序列。对于具体的核酸序列,保守修饰的变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的核酸,或核酸不编码氨基酸序列的情况下,指基本相同的序列。由于遗传密码简并性,大量功能相同的核酸编码任何给定多肽。例如,密码子CGU,CGC,CGA,CGG,AGA和AGG都编码精氨酸。因此,在精氨酸通过密码子描述的每个位置,密码子可改变成任何对应密码子,其不改变编码的多肽。所述核酸变体是“沉默取代”或“沉默改变”,这是“保守修饰的改变“的一种。本文中每个编码多肽的多核苷酸序列也描述任何可能的沉默改变,除非另有说明。因此,沉默改变是每个编码氨基酸的核酸序列的内在特征。本领域技术人员认识到核酸中的每个密码子(除了AUG,其通常是蛋氨酸的唯一密码子)可经标准技术修饰产生功能相同的分子。一些实施方案中,编码PAD的核酸序列优选经优化在用于产生酶的具体的宿主细胞(例如酵母,哺乳动物,植物,真菌等)中表达。
对于氨基酸序列,本领域技术人员认识到对核酸、肽、多肽或蛋白序列的单个取代、缺失或添加改变、添加或缺失所编码序列中单个氨基酸或小部分氨基酸,其未“保守修饰的变体”,在本文称为“变体”,其中改变导致氨基酸被化学类似的氨基酸取代。已知保守取代列表提供了功能相似的氨基酸。见例如Davis et al.,“Basic Methods in MolecularBiology”Appleton&Lange,Norwalk,Connecticut(1994)。所述保守修饰的变体补充并不排除本发明所述多态性变体,种间类似物,以及等位基因。
以下8组每个都包含互为保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A),甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R),赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L),蛋氨酸(M),缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W);7)丝氨酸(S),苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C),蛋氨酸(M)(见例如,Creighton,1984,Proteins)。
术语“相同”或百分比“相同性”在两或多个核酸或多肽序列的情况下,指相同或具有规定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的序列或亚序列(即在比较窗或规定区域中比较和排列最大相应性时,在规定的区域中(例如PRRSV的GP5蛋白的中和表位序列)具有大约70%相同性,优选75%,80%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,或更高相同性),如利用BLAST或BLAST2.0序列比较算法以及下列默认参数,或通过人工比对和目测评估所测定的那样。所述序列称为“基本相同”。该定义也用于受试序列的互补序列。所述定义还包括具有缺失和/或添加的序列,以及具有取代的序列。如下所述,优选算法可用于计算缺口等。优选,长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域或50-100个氨基酸或核苷酸的区域中存在相同性。
为了序列比较,通常一个序列作为参照序列,与受试序列比较。利用序列比较算法,将受试和参照序列输入计算机,说明亚序列坐标,如果必要,说明序列算法程序参数。可使用默认程序参数或可使用其他参数。序列比较算法随后基于程序参数计算受试序列与参照序列的百分比序列相同性。
“比较窗”包括参照长度为20-600个中任何数目的连续位置的片段,更常见所述片段长度为大约100-大约150,其中当两条序列最佳排列时所述序列可与相同个连续位置的参照序列比较。排列序列用于比较的方法是本领域已知的。排列序列用于比较可通过例如局部同源性排列进行,例如见Smith&Waterman,1991,Adv.Appi.Math.2:482,通过同源性排列进行,见Needleman&Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443,通过搜索类似性方法进行,见Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA85:2444,通过计算机执行这些算法进行(GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575Science Dr.,Madison,Wis.),或通过人工排列和目测进行(见例如,CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1995supplement)。
另一适合确定百分比序列相同性和序列相似性的排列实例是BLAST和BLAST2.0算法,分别描述于Altschul et al.,1977,Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul etal.,1990,J.Mol.Biol.215:403-410。进行BLAST分析的软件可通过National Center forBiotechnology Information(http://world wide web at ncbi.nlm.nih.gov/)获得。该算法涉及通过鉴定查询序列中长度W的短词来来首先鉴定高评分序列对(HSPs),当与数据库序列中相同长度的词比较时,其或匹配或满足一些正值阈值分数T。T指相邻词评分阈值(Altschul et al.,supra)。这些初始相邻词击中作为启动搜索发现较长的包含它们的HSP的种子,词击中可沿每个序列的两个方向随累计排列分数增加而延伸。累计分数对于核苷酸序列利用参数M(匹配残基对的奖励分;总>0)和N(不匹配残基罚分;总<0)。对于氨基酸序列,得分矩阵用于计算累积得分。每个方向词击中的延伸在以下情况下停止:累计排列分比最大获得值降低数量X;累计评分为零或更低;或到达每个序列末端。BLAST算法参数W,T和X决定排列敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列),默认词长(W)为11,预期(E)为10,M=5,N=-4并且对两条链都进行比较。对于氨基酸序列,BLASTP程序利用默认词长3,预期(E)10,以及BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff&Henikoff,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)排列(B)50,预期(E)10,M=5,N=-4,并比较两条链。
BLAST算法也进行两序列相似性的统计学分析(见例如,Karlin& Altschul,1993,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA90:5873-5787)。一种BLAST算法提供的相似性测定法是最小和概率(smallest sum probability)(P(N)),其表明两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配的概率。例如,如果受试核酸与参照核酸相比的最小和概率小于大约0.2,更优选小于大约0.01,最优选小于大约0.001,则核酸被认为与参照序列相似。
两个核酸序列或多肽基本相似的指示是第一核酸编码的多肽与抗第二核酸编码的多肽的抗体免疫学交叉反应,如下所示。因此,肽通常与第二多肽基本相同,例如,两个肽仅仅在保守取代上不同。另一表明两个核酸序列基本相同的指示是两个分子或其互补物在严格条件下互相杂交,如下所述。两个核酸序列基本相同的另一指示是可使用相同的引物扩增核酸序列。
本文中蛋白或肽基本不含细胞物质或不含化学前提或其他化学物质,则为“分离的”或“纯化的”。本发明的变体肽可纯化到均质或其他纯度。纯化水平有赖于使用目的。重要特征在于所述制备允许变体肽的所需功能,即使存在大量其他成分时也如此。
一些用途中,“基本不含细胞物质”包括制备这样的变体肽,其具有低于大约30%(干重)其他蛋白质(即污染性蛋白质),低于大约20%其他蛋白质,低于大约10%其他蛋白质,或低于大约5%其他蛋白质。如果变体多肽是重组制备的,其也可基本不含培养基,即培养基代表低于蛋白质制备物的大约20%。
术语“基本不含化学前体或其他化学物质”包括从参与变体肽合成的化学前体或其他化学物质分离的变体肽制备物。一个实施方案中,“基本不含化学前体或其他化学物质”包括这样的变体蛋白制备物,其含有低于大约30%(干重)化学前体或其他化学物质,低于大约20%化学前体或其他化学物质,低于大约10%化学前体或其他化学物质,或低于大约5%化学前体或其他化学物质。
分离的变体蛋白可从天然表达它的细胞纯化,从经改变表达它的细胞纯化(重组),或利用已知的蛋白合成方法来合成。例如,将编码变体PAD蛋白的核酸分子克隆入表达载体,并将所述表达载体引入宿主细胞,在宿主细胞中表达变体蛋白。变体蛋白可随后通过适当纯化方案利用标准蛋白纯化技术从细胞分离。许多这些技术在下文详述。
在氨基酸至少是蛋白质的最终氨基酸序列的一部分时蛋白由氨基酸序列组成。由此,蛋白可为PAD多肽,变体PAD多肽和/或具有其他氨基酸分子,诸如氨基酸残基(连续编码的序列),天然相关或异源氨基酸残基/肽序列。所述蛋白具有一些其他氨基酸残基或可包含数百个或更多其他氨基酸。关于这些蛋白的各种变体如何制备/分离的描述见下文。
本发明的变体蛋白可与异源序列连接形成嵌合或融合蛋白。所述嵌合和融合蛋白包含可操作连接于具有并非基本与变体蛋白同源的氨基酸序列的异源蛋白的变体蛋白。“可操作连接”表明变体蛋白和异源蛋白框内融合。异源蛋白可融合于变体蛋白的N或C末端。
嵌合或融合蛋白可通过标准重组DNA技术制备。例如,编码不同蛋白序列的DNA片段根据常规技术框内连接。另一实施方案中,融合基因通过常规技术包括自动DNA合成仪来合成。可选,可利用锚定引物对基因片段进行PCR扩增,所述引物导致两连续基因片段之间重叠,随后退火并再扩增产生嵌合基因序列(见Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology,1992)。此外,许多表达载体可商购,其编码融合部分(例如GST蛋白)。变体蛋白的编码核酸可克隆入所述载体使得融合部分与变体蛋白框内连接。
多肽有时含有除外常规的20种天然存在氨基酸以外的氨基酸。许多氨基酸,包括末端氨基酸可经天然过程修饰,例如加工和其他翻译后修饰,或通过本领域已知的化学修饰技术进行修饰。天然存在多肽内的常见修饰见教科书,图示,以及研究报告等,均为本领域已知的。因此,本发明的变体肽包括衍生物或类似物,其中取代的氨基酸残基不是遗传密码编码的,并且包括取代组,其中成熟多肽与另外的化合物融合,诸如增加多肽半寿期的化合物(例如,聚乙二醇),或者其中另外的氨基酸与成熟多肽融合,诸如前导或分泌序列或用于纯化多肽或原肽序列的序列。
已知修饰包括但不限于乙酰化,酰化,ADP-核糖基化,酰胺化,与黄素共价结合,与血红素部分共价结合,与核苷酸或核苷酸衍生物共价结合,与脂质或脂质衍生物共价结合,与磷脂酰肌醇共价连接,交联,环化,二硫键形成,去甲基化,形成共价交联,形成半胱氨酸,形成焦谷氨酰胺,甲酰化,gamma羧化,糖基化,GPI锚定物形成,羟化,碘化,甲基化,肉豆蔻酰化,氧化,蛋白水解,磷酸化,异戊烯化,外消旋化,硒基化,硫酸盐化,转运-RNA介导的氨基酸向蛋白的添加诸如精氨酸化,以及泛化。
本发明还提供变体蛋白和肽,其包含或由以下片段组成,所述片段作为抗原决定子和/或可治疗PRRSV感染和/或提供抗PRRSV感染的保护作用。
本发明的片段包括来自PAD多肽或变体蛋白的至少8个或更多连续氨基酸残基。
术语“片段”,“衍生物”和“类似物”用于本发明的多肽时,意指基本保持与所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽,即作为抗原决定子和/或提供抗PRRSV感染的治疗和/或保护作用。所述片段,衍生物和类似物可基于保持一或多种PAD多肽生物活性的能力来选择,即作为抗原决定子和/或提供抗PRRSV感染的治疗和/或保护作用的能力。因此,类似物包括来自不同毒株或种并保持与PAD多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。本发明的多肽疫苗可为重组多肽,天然多肽或合成多肽,优选重组多肽。
“抗原决定子”在没有另外说明下,是能激发特定动物或物种内的免疫反应的分子。抗原决定子包括蛋白质分子,例如聚氨基酸序列,多肽,片段,衍生物或变体,其中可包括其他部分,例如碳水化合物部分,诸如聚糖和/或脂质部分。
本发明的抗原决定子也可为异源的,包括来自其他病毒、PRRSV毒株或科的中和表位的抗原决定子,其与应答于本发明的PAD产生的抗体或抗血清交叉反应,例如GP5-M异源二聚体,并能在具体动物例如猪中激发免疫反应。
"M"在本文指PRRSV的基质蛋白或PRRSV多肽。术语“M”包括这样的片段,衍生物或类似物,其可与GP5蛋白形成异源二聚体,并提供与PRRSV毒株的交叉反应。
"GP5"在本文指PRRSV的糖蛋白5。术语“GP5”也包括这样的片段,衍生物或类似物,其可与GP5蛋白形成异源二聚体,并提供与PRRSV毒株的交叉反应。因此,GP5类似物,例如来自另外的动脉炎病毒的GP5也包含在本发明内。GP5类似物中对应NA PRRSV毒株中GP5的位置44或EU PRRSV毒株中GP5的位置46的位置可由本领域技术人员确定,并包含在本发明范围内。
术语"GP5-M异源二聚体"包括与PRRSV的M蛋白结合的GP5或任何改变GP5构象的其他蛋白或肽,从而在给予猪时提供抗PRRSV的保护作用。本领域技术人员能利用标准技术和方法检测GP5的构象改变,例如利用仅仅识别非异源二聚体形式的GP5蛋白的单克隆抗体。因此,本发明一方面包括来自相同或不同毒株或病毒的GP5蛋白或M蛋白,所述毒株或病毒包括但不限于马动脉炎病毒(EAV),乳酸脱氢酶升高型病毒(lactate dehydrogenase-elevating virus)(LDV),和猿出血热病毒(SHFV)家族成员。因此,除了本发明,嵌合GP5-M异源二聚体也可用作PAD,例如用于免疫方案中。
本发明中,GP5蛋白的细胞外结构域长度大约60-65个氨基酸,包括信号肽和加工后的短N末端区,长度大约30个氨基酸,包括N糖基化位点。见图1。本发明术语“高变”区指GP5蛋白的细胞外结构域的区域,例如PRRSV(NA)北美毒株中GP5的氨基酸1-35以及(EU)样PRRSV毒株中GP5的氨基酸1-37或GP5类似物或等价物。GP5的其他片段、类似物或衍生物中细胞外结构域的对应区域和位置可通过例如本发明所述的比对方法确定。此外,本发明还涉及GP5细胞外结构域中一或多个氨基酸的突变,其导致所述氨基酸的糖基化。因此,可在细胞外结构域中产生在NA PRRSV毒株中位置44或EU PRRSV毒株中的位置46以外的位置具有糖基化的GP5,其具有相同效果(对抗PRRSV感染的保护作用)。这些变体也可用于本发明中。
本文中M蛋白的细胞外结构域指M蛋白N末端的前30个氨基酸或其类似物或等价物。M蛋白的其他片段,类似物或衍生物中的对应区域和位置可通过本发明所用比对方法确定。
术语“生物学样品”指通常含有抗体或病毒颗粒的哺乳动物(例如猪,兔,马)的体液或组织。所述物质是本领域已知的,并不限于血液,血浆,血清,脊髓液,淋巴液,呼吸道、肠道或泌尿生殖道分泌物,眼泪,唾液,乳液,白细胞和骨髓瘤。
本发明中,抗体的定义与本领域常用的一致:它们是哺乳动物应答抗原攻击产生的多亚基蛋白。本发明的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体,以及所述抗体的片段,包括但不限于Fab或F(ab')hd2,和Fv片段。
本发明中,术语“亚基”指本身具有抗原性的PRRSV部分,即能在动物中诱导免疫反应的部分。该术语应理解为包括可通过重组和生物化学方法获得的亚基。
本发明术语“多价”意指含有一个以上来自PRRSV的分离株的疫苗,所述分离株可来自相同种(即PRRSV的不同分离株)或来自不同PRRSV。对于给定PRRSV的属和种,每种分离株可与其他分离株共有一些抗原(即“共同”抗原),而其他抗原对于该分离株而言为独特的。因为多价疫苗为宿主免疫系统提供多种抗原,宿主中刺激的免疫反应比仅仅单个分离株刺激的更广。
本发明术语“分离株”指获自特定来源的病毒。分离株可与术语“毒株”互换使用。
术语“毒性”指保持感染动物宿主的能力的分离株。
术语“灭活的”指含有不能继续复制和/或生长的感染生物体的疫苗。
术语"PRRSV"指所有属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属的PRRSV。
术语“疫苗”指药物组合物,其包含至少一种免疫学PAD,可诱导动物中的免疫反应,并可能但不必包含一或多种其他可促进所述活性组分的免疫学活性的成分。疫苗还可包括其他药物组合物中常用的组分。疫苗的免疫活性组分包括原始形式的完全活病毒,或者在所谓的修饰的活疫苗中的减毒病毒,或所谓的杀死的疫苗中通过适当方法灭活的病毒。另一形式中,疫苗的免疫活性组分可包含所述病毒的适当元件(亚单位疫苗),由此,这些元件可通过以下方法产生:破坏整个活生物体或所述病毒的生长培养物,随后进行纯化步骤产生所需的结构,或适当操作适宜系统诱导合成过程并随后进行分离和纯化步骤,所述系统诸如但不限于细菌、昆虫、哺乳动物或其他物种,或通过利用适宜药物组合物直接掺入遗传物质而在需要疫苗的动物中诱导所述合成过程(多核苷酸接种)。疫苗可包括一种或同时包括一种以上的上述元件。
术语“保护”,“保护作用”,“保护性免疫力"或"保护性免疫反应,"在本发明中意指宿主猪对本发明的疫苗或多肽产生主动免疫反应,诸如暴露于病毒或毒性病毒攻击之后,猪能对抗感染。因此,保护性免疫反应将在暴露于病毒后使得猪的病死率和死亡率降低。本领域技术人员理解在商业背景中,保护性免疫反应的产生可通过评估接种对整个猪群的影响来估计,例如接种后的猪中仍然有少量出现死亡和病死。此外,保护作用还包括减轻任何宏观或组织病理学改变的严重性(例如肺中的病变)和/或PRRS的症状,所述减轻作用是与没有受到保护的相似的猪中的分离株导致的改变和症状相比的(即与适宜对照相比)。因此,保护性免疫反应将减轻PRRSV的症状,包括但不限于与对照猪相比PRRS的临床表现或症状减轻,所述临床表现或症状包括:体重下降,体重增加减少,嗜眠症,呼吸窘迫,“喘粗气”(呼气费力),发热,皮毛粗糙,打喷嚏,咳嗽,眼睛水肿以及结膜炎,宏观病变,微观肺损伤,心肌炎,淋巴腺炎,脑炎和鼻炎。
术语“活病毒”指保持感染适当对象的能力的病毒(与灭活(杀死的)或亚单位疫苗相比)。
术语“免疫有效量”指有效减轻、消除、治疗、预防或控制PRRSB感染症状、疾病、病症或病情的量。
一个实施方案中,本发明涉及包含PRRSB的PAD,在本文中称为PAD多肽。本发明涉及的多肽可为PAD的类似物,衍生物或变体,以及其免疫活性或功能片段。所述多肽可为分离的、合成的、或利用编码PAD的核酸重组表达的形式。
本发明PAD的实例包括但不限于图1,20,21和22所示的氨基酸序列(SEQ IDNOS:__)。这些PAD可作为片段、多肽、蛋白或者作为具有所需的在GP5-M异源二聚体的细胞外结构域的糖基化的PRRSV根据本文所述的免疫学方案给药。本发明核酸分子的其他实例包括但不限于编码以下肽的核苷酸序列:(HLV013)MLGRCLTAGC CSQLPFLWCI VPFCLVALVNANSNSGSHLQ LIYNLTLCEL NGTDWLKDKF(SEQ ID NO:__)或HLV093MLGRCLTACY CLRLLSLWCIVPFWFAVLVS ANSNSSSHLQ SIYKLTLCEL NGTEWLNERF(SEQ ID NO:__)。
本发明还提供编码本发明PAD的分离的和/或重组核酸。根据本发明的实施方案,PAD的核苷酸序列编码PRRS的中和表位。此外,应理解基于本领域总体状态,其他与PAD的核苷酸或氨基酸序列等价的序列包含在本发明中。例如,GP5细胞外结构域的氨基酸序列中的一些缺失、插入和取代包含在本发明中,除非所述突变消除PAD诱导中和抗体产生的能力。
本发明编码PAD的核酸可用于多种用途,包括相应PAD多肽的重组表达。
本发明的核酸包括编码整个PAD的核酸以及编码PAD多肽的亚序列的核酸。例如,本发明包括编码并非全长PAD的多肽但具有抗PRRSB感染的保护性抗原活性的核酸。本发明不仅包括含有前述核苷酸序列的核酸,也包括与所示实施方案基本相同或基本互补的核酸。例如,本发明包括包含这样的核苷酸序列的核酸,所述核苷酸序列与前述序列至少约70%相同,更优选与所示核苷酸序列至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%,更优选至少90%,更优选至少95%相同。核苷酸序列可如上所示修饰,只要编码的多肽能诱导中和抗体的产生即可。
编码本发明PAD的核酸可利用本领域已知方法获得。适宜核酸(例如,cDNA,基因组或亚序列)可被克隆,或体外扩增,诸如利用适宜引物在聚合酶链反应(PCR)中,连接酶链反应(LCR),基于转录的扩增系统(TAS),自我维持性序列复制系统(SSR)进行。多种克隆和体外扩增方法是本领域已知的。足以指导本领域技术人员进行克隆的这些技术的实例和说明见于Berger and Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods inEnzymology152Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger);Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nd ed.)Vol.1-3,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Press,NY,(Sambrook et al.);CurrentProtocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel et al.,eds.,Current Protocols,ajoint venture between Greene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(1994Supplement)(Ausubel);Cashion et al.,美国专利5,017,478;和Carr,欧洲专利0,246,864。足以指导本领域技术人员进行体外扩增的技术的实例见于Berger,Sambrook,and Ausubel,以及Mullis et al.,(1987)美国专利4,683,202;PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications(Innis et al.,eds)Academic Press Inc.SanDiego,Calif.(1990)(Innis);Amheim&Levinson(Oct.1.1990)C&EN36-47;The Journal OfNIH Research(1991)3:81-94;(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173;Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,1874;Lomell et al.(1989)J.Clin.Chem.,35:1826;Landegren et al.,(1988)Science241:1077-1080;Van Brunt(1990)Biotechnology8:291-294;Wu and Wallace(1989)Gene4:560;和Barringer et al.(1990)Gene89:117。编码本发明PAD多肽的核酸或这些核酸的亚序列可通过任何上述适宜方法制备,包括例如克隆和限制适宜序列。
编码PAD多肽的核酸可随后通过利用载体、质粒或构建体等引入原核或真核宿主细胞以产生本发明的PAD多肽。常见的表达盒含有可操作连接于编码糖基转移酶或其他目的酶的核酸的启动子。表达盒通常包括可引入适宜宿主细胞的表达载体,包括例如细菌、昆虫、真菌、植物或动物细胞。构成型或受调节的启动子均可用于本发明。本发明的表达载体可通过已知技术转入所选细胞,包括例如磷酸钙转染,DEAE-葡聚糖介导的转染,缩并(transvection),显微注射,阳离子脂质介导的转染,电穿孔,转导,划痕(scrapeloading),基因枪注射(ballistic introduction),感染或其他方法。(见MoleculeCloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))。转染的细胞可通过例如质粒中所含基因显示的抗生素抗性来选择,所述基因诸如amp,gpt,neo和hyg基因。
PAD多肽类似物,片段或其他衍生物或其变体或表达它的细胞可用作抗原制备抗体。本发明包括例如单克隆和多克隆抗体,嵌合、单链以及Fab片段。因此,本发明也包括产生针对一或多个上述的PAD多肽的方法,包括提供PAD多肽或其生物学功能类似物或衍生物或变体,将多肽以有效诱导免疫反应的量给予动物对象产生抗PAD多肽的抗体。因此,本发明包括产生PRRSV的保护性抗原决定子(PAD)的抗体的方法,包括给予猪第一GP5-M异源二聚体,其中所述第一GP5-M异源二聚体的GP5具有在北美(NA)PRSSV毒株的位置44的糖基化或欧洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化。所述方法还包括给予猪第二GP5-M异源二聚体,其中所述第二GP5-M异源二聚体的GP5不具有在北美(NA)PRSSV毒株的位置44或欧洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化。本发明人还认为NA和EUPRRSV中的氨基酸51和53对于用作PAD是重要的,并相信它们参与病毒粘附以及VN抗体可与其反应。本发明的PAD可根据本文所述的免疫方案给予。本发明另一方面中,动物可为非人动物,例如,大鼠,马,牛,小鼠,猪,羊,兔或鸡。
因此,本发明提供选择性结合PAD多肽,其衍生物、类似物或变体以及片段的抗体。所述抗体可用于定量或定性检测上文所述的PAD多肽或变体。
已知许多方法可产生和/或鉴定针对给定肽的抗体,诸如PAD多肽。数种所述方法描述于Harlow,Antibodies,Cold Spring Harbor Press,(1989)。可使用全长PAD多肽,衍生物,类似物或抗体或片段或融合蛋白。
为了制备单克隆抗体,可使用任何已知通过连续细胞系培养提供抗体的技术。实例包括各种技术,见诸如Kohler,G.and Milstein,C.,Nature256:495-497(1975);Kozboret al.,Immunology Today4:72(1983);(Cole et al.,pg.77-96,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985)。单克隆抗体可通过杂交瘤制备,其为能分泌特定单克隆抗体的不朽细胞系。所述不朽细胞系通过融合两个不同的细胞类型,通常是淋巴细胞,其中一种是肿瘤细胞来在体外产生。
抗PAD抗体包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是本领域已知的。多克隆抗体可在哺乳动物中激发,例如通过免疫剂以及如果需要还可加上佐剂的一或多次注射来进行。通常,免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹腔内注射而注射入哺乳动物中。所述免疫剂可包括PAD多肽,衍生物,类似物或变体以及片段或其融合蛋白。可将免疫剂和已知在被免疫的哺乳动物中具有致免疫性的蛋白连接。所述致免疫性蛋白包括但不限于匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin),血清白蛋白,牛胸腺球蛋白,以及大豆胰蛋白酶抑制物。可用佐剂的实例包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂(单磷酸脂质A,合成海藻糖(trehalose)dicorynomycolate)。免疫方案可由本领域技术人员选择而无需过多试验。
另一个实施方案中,提供制备抗PRRSV疫苗的方法。一方面,所述方法包括提供PAD多肽,其衍生物,类似物,变体或片段。可选,制备抗PRRSV疫苗的方法包括将PAD多肽与生理可接受载体或稀释剂混合。通常,疫苗作为可注射水溶液或混悬液来制备。油性基质中的疫苗也可用于诸如吸入。也可配制可在使用前溶解或悬浮的固体形式。通常可加入与活性成分相容并可药用的药学或生理学载体。所述载体的实例包括但不限于,水,盐水,葡萄糖或甘油。也可使用载体的组合。本领域技术人员熟悉药学或生理学可接受的载体或稀释剂。
本发明还提供疫苗。另一个实施方案中,提供了这样的疫苗,其包含至少一种PAD多肽,其衍生物,类似物,变体或片段。另一方面,所述疫苗包括编码PAD多肽的核酸,其衍生物,类似物,变体或片段.
本发明提供了这样的疫苗,其为杀死的疫苗(灭活的疫苗),减毒疫苗(经修饰的活疫苗),亚单位疫苗,DNA疫苗或基于重组病毒的疫苗。本发明另一方面提供了疫苗用于保护猪对抗PRRSV感染导致的疾病。本发明的疫苗通常用于预防性治疗,其免疫猪对抗PRRSV毒性毒株引起的疾病。但是,所述疫苗也用于治病性治疗已经感染了PRRSV毒性毒株的猪。
本发明人认为PRRSV治疗和预防基于与目前的疫苗策略完全不同的理论,例如涉及与细胞介导的免疫力(CMI)和/或病毒中和(VN)抗体。本发明人相信PRRSV具有“聚糖屏蔽”,其阻断或屏蔽中和表位(NE)。该屏蔽避免了识别有天冬酰胺天冬酰胺连接的聚糖或其他聚糖部分的关键中和表位造成的体液免疫反应,使得中和表位不能产生中和抗体。本发明人还相信PRRSV在一些情况中具有NE阻断聚糖(图17)。宿主“种跳跃(species jump)”见于RNA病毒的情况下,抗NE中和抗体(Nab)可容易的诱导(图16)。这些第一“种跳跃”系列(train)在阻断或屏蔽位置不具有聚糖,可通过抗NE Nab轻易消除。
由于新宿主种类受到感染或出现类似的种(quasispecies),Ne被与NE直接相邻的聚糖(保守区域)阻断(BNE)(图17),例如图10中HLV013的序列。因此,Nab是针对BNE产生的。聚糖屏蔽(SNE)在出现的准种中在临近Ne的高变区出现。因此,Nab的出现可较慢和/或针对含有BNE和SNE逃跑突变体无效(图19)。
只有聚糖屏蔽存在例如罕见野生型突变体时,则诱导抗NE的Nab(图19),例如HLV093。见图11。该Nab仅仅提供对抗具有聚糖屏蔽的毒株的保护作用。因此,仅仅具有聚糖屏蔽的毒株不能在易感宿主群体中保持。这些不具有聚糖屏蔽(BNE[图17],然后是NE[图18])野生型突变体的连续免疫导致多克隆Nab,其保护对抗出现的优势型异源病毒毒株并提供交叉反应性(图19)。
因此,病毒首先形成聚糖阻断,然后形成聚糖屏蔽(图19)。异源Nab可通过第一次接种不具有聚糖屏蔽的聚糖封闭的表位(BNE)然后接种不具有聚糖封闭的NE来制备,该方法称为反向表位发展免疫法(reversed epitope evolution immunization)。
因此,本发明人相信猪第一次暴露于PRRSV毒株并随后暴露于不同的在GP5的高变细胞外结构域中糖基化程度更高的PRRSV毒株的情况下,猪的免疫系统仅仅识别中和表位中GP5和M上的非糖基化区域以及血清型之间的共同表位。结果,免疫系统不能识别PRRSV上的新的糖基化表位,导致无效免疫。
本发明人首先认识到这一理论可被开发用于开发和给予单个或多价PRRSV疫苗以及利用PRRSV同种型的聚糖分型的PRRSV免疫方案。因此,PRRSV的糖基化模式(聚糖类型)可用于PRRSV毒株的初始分组。
根据本发明,北美和欧洲基因型的PRRSV毒株根据其糖基化模式分组。本发明被发明人称作聚糖分型方案。与ORF5的序列同源性相比,聚糖分型是分辨异源PRRSV毒株作为出现在群体中的新的毒株的更为精确的方法。本发明人认为糖基化模式的区分可用于单个或多价疫苗中或免疫接种方案和方法的开发中。一方面,毒株可根据它们是否是欧洲或北美毒株来分型。PRRSV毒株分型的一方面,第一个字母是EU(欧洲样)或NA(北美样)来命名基因型簇。EU指PRRSV同种型,特征是在GP5中46和/或53位具有保守聚糖。NA指这样的PRRSV同种型,特征是在GP5DI44和/或51位具有保守聚糖。每个毒株的编号对应表7所示GP5氨基酸序列细胞外结构域中糖基化位点的数目,但除外了位于NA毒株的aa44和51以及EU毒株的aa46和53的高度保守的聚糖。因此,NA-0指不具有聚糖的NA毒株GP5细胞外结构域,EU-0指不具有聚糖的EU毒株GP5细胞外结构域。例如,NA-1指除NA毒株aa44和51的高度保守聚糖之外,具有位于GP5细胞外结构域中的1个聚糖的NA毒株GP5细胞外结构域。
本发明还涉及新鉴定的PRRSV毒株,可利用上述方法根据本发明进行聚糖分型。发明人认为本文的聚糖分型方案可用于治疗或预防其他利用“聚糖屏蔽”逃避免疫系统的病毒,例如用于设计免疫策略。新的或已知的PRRSV毒株也可利用本领域标准技术和已知方法从野外分离。
根据本发明,毒性或非毒性PRRSV可用于疫苗中或免疫方案中。本发明人发现给药具有位于GP5细胞外结构域中的N糖基化具体是位置44(或46)(所述位置根据GP5类似GP5-M异源二聚体中的北美或欧洲PRRSV而不同)的聚糖的PRRS病毒毒株来免疫猪能激发猪的免疫系统,并且当随后给予不具有GP5细胞外结构域中的糖基化氨基酸的PRRSV毒株并随后用具有位于GP5多肽细胞外结构域中的糖基化的PRRSV攻击时可激发更强的免疫反应。见表6。这是由于GP5高变区中的聚糖可抑制/延迟保护性抗PAD抗体反应的事实。此外,缺乏位置44的聚糖导致抗病毒异源毒株的保护作用。例如,在GP5的中和表位中缺乏聚糖的毒株诸如HLV093可用于在遭遇PRRSV的其他聚糖类型之前激发免疫反应。例如,GP5中高变区(1-37)缺乏聚糖的毒株诸如HLV013可用于在遭遇PRRSV的其他聚糖类型之前激发免疫系统。
抗PRRSV感染的免疫方案的一个方面,给药具有本发明PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD的病毒,所述PAD具有位于欧洲毒株GP5位置46的糖基化,然后给药具有本发明PRRSVGP5-M异源二聚体的PAD,所述PAD不具有位于北美毒株GP5位置44的糖基化,然后用在GP5的中和表位中糖基化的PRRSV攻击。
另一方面,给药具有本发明PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD的病毒,所述PAD具有位于欧洲毒株GP5位置46的糖基化,然后给药具有本发明PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD的病毒,所述PAD不具有位于欧洲GP5位置46的糖基化,然后用在GP5中和表位中糖基化的PRRSV毒株攻击。
抗PRRSV感染的免疫方案的一个方面,给予包含本发明PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD,所述PAD具有位于北美毒株位置44的糖基化,然后给予包含本发明PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD,所述PAD不具有位于北美毒株位置44的糖基化,然后用在GP5中和表位中糖基化的PRRSV毒株攻击。另一方面,给予包含本发明PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD,所述PAD具有位于欧洲毒株GP5的位置46的糖基化,然后给予包含本发明PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD,所述PAD不具有位于欧洲毒株GP5的位置46的糖基化,然后用在GP5中和表位中糖基化的PRRSV毒株攻击。.
本发明一个实施方案中,GP5的PAD不具有来自NA PRRSV GP5蛋白的氨基酸1-35中的聚糖。另一方面,GP5的PAD具有在NA PRRSV GP5蛋白位置44的聚糖。另一方面,GP5的PAD具有在NA PRRSV GP5蛋白位置44的聚糖,并在NA PRRSV GP5蛋白的氨基酸1-35中具有或不具有聚糖,例如,在一些NA PRRSV毒株中所见。
本发明一个实施方案中,GP5-M异源二聚体的PAD不具有在NA PRRSV GP5蛋白的氨基酸1-35中的聚糖。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有在NA PRRSV GP5蛋白位置44的聚糖。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有在NA PRRSV GP5蛋白位置44的聚糖,并在NAPRRSV GP5蛋白的氨基酸1-35中具有或不具有聚糖,例如,在一些NA PRRSV毒株中所见。
本发明一个实施方案中,GP5的PAD不具有在EU PRRSV GP5蛋白的氨基酸1-37中的聚糖,例如在Lelystad中所见。另一方面,GP5的PAD具有在EU PRRSV GP5蛋白位置46的聚糖。另一方面,GP5的PAD具有在EU PRRSV GP5蛋白位置46的聚糖,并在EU PRRSV GP5蛋白的氨基酸1-37中具有或不具有聚糖,例如,一些EU PRRSV毒株中所见。
本发明一个实施方案中,GP5-M异源二聚体的PAD不具有在EUPRRSV GP5蛋白的氨基酸1-37中的聚糖,例如在Lelystad中所见。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有在EUPRRSV GP5蛋白位置46的聚糖。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有在EU PRRSV GP5蛋白位置46的聚糖,并在EU PRRSV GP5蛋白的氨基酸1-37中具有或不具有聚糖,例如,一些EUPRRSV毒株中所见。
本发明的抗PRRSV免疫方法的优势在于其导致在用提供异源反应性的PRRSV各种毒株攻击时,高水平中和抗体在早期抗体反应中出现。本发明的免疫策略可用于治疗和预防其他病毒感染,包括但不限于HIV和流感病毒。
因此,包含并类似HLV013的毒株可提供抗所有其他聚糖类型的直接保护或不提供抗所有其他聚糖类型的直接保护而是提供使得免疫系统准备好从而持续对抗具有不同程度聚糖屏蔽的PRRSV PAD的间接保护。反之,随后接种不同毒株的PAD,所述PAD与HLV093的PAD在GP5高变区细胞外结构域的糖基化相似,从而可获得所有PRRSV毒株中的重要中和表位,诸如在GP5高变区细胞外结构域中糖基化程度更高的那些。由此,PRRSV的聚糖分型导致PRRSV给药的分级或次序或组合,其可有效产生对多种PRRSV的免疫应答。本发明一方面,需要多种GP5-M异源二聚体(聚糖类型)是以诱导抗多种PRRSV毒株的广泛保护作用。
不希望受任何理论束缚,本发明人相信所有显示GP5不同聚糖类型的免疫原可一同给予,这是由于“原始抗原罪孽(original antigenic sin)”(OAS)的概念导致的,其中针对第二病毒感染激发的抗体反应与原始变体感染相比其反应更强。因此,发明人认为猪的免疫系统可利用单个PAD激发或利用多个PAD免疫获得与前者相比更广的并且反应性更强的免疫反应。多价疫苗策略的应用避免了原始抗原罪孽。因此,本发明中,可同时或连续给予多个PRRSV毒株或PAD。为治疗PRRSV或诱导抗PAD所有表位的保护性抗体,猪需要暴露于多个GP5,M,或GP5-M异源二聚体聚糖类型。
本发明一个实施方案中,提供了鉴定激发抗PRRSV保护作用的GP5-M异源二聚体的方法。该方法也包括GP5和M蛋白或GP5-M异源二聚体的片段、衍生物或类似物。一方面,本发明包括给予受试猪第一GP5-M异源二聚体,其中GP5具有在北美(NA)PRSSV毒株的位置44的糖基化或欧洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化。给予受试猪第一GP5-M异源二聚体之后给予第二GP5-M异源二聚体,其中所述第二GP5-M异源二聚体的GP5不具有在北美(NA)PRSSV毒株的位置44或欧洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化。受试猪和对照猪随后用感染量的致PRRS病毒例如Lelystad攻击。本领域技术人员熟悉致PRRS毒株以及实现感染的途径和所需剂量。该方法包括测定第一和第二给药的GP5-M异源二聚体是否有效保护猪对抗攻击PRRSV。
确定GP5-M异源二聚体是否提供抗PRRSV保护的各种方法和技术是本领域已知的,包括但不限于观察受试猪和对照猪PRRS症状的差异,例如PRRS临床表征或症状,包括体重下降,体重增加减少,嗜眠症,呼吸窘迫,“喘粗气”(呼气费力),发热,皮毛粗糙,打喷嚏,咳嗽,眼睛水肿结膜炎,宏观病变微观肺病变,心肌炎,淋巴腺炎,脑炎和鼻炎。受试猪中观察到与对照猪相比PRRS症状的任何降低表明第一和第二给药的GP5-M异源二聚体提供一定程度的抗PRRS保护。与对照猪中的情况相比,受试猪中观察到的类似症状或任何PRRS症状的增加表明第一和第二给药的GP5-M异源二聚体没有提供一定程度的抗PRRS保护。
另一方面,确定GP5-M异源二聚体是否提供抗PRRSV感染的保护作用包括确定攻击PRRSV在受试猪中的存在或缺失,这可通过电子显微镜或抗体或测定法诸如荧光聚焦中和(FFN)检测或Western印迹测定法进行,因为异源二聚体可用于表明异源抗体产生和保护。攻击PRRSV的存在表明第一和第二给药的GP5-M异源二聚体不能提供有效抗PRRS保护,攻击PRRSV的缺失表明第一和第二给药的GP5-M异源二聚体提供有效抗PRRS保护。
本发明的GP5-M异源二聚体可利用各种载体和病毒递送,例如,PRRSV。因此,本发明另一方面包括鉴定激发抗PRRSV保护的病毒。这些鉴定的GP5-M异源二聚体或病毒可用于PRRSV免疫方案或疫苗中。例如,可给予猪包含在GP5细胞外结构域中糖基化的GP5-M异源二聚体的PRRSV,所述糖基化具体是NA PRRSV位置44的糖基化或EU PRRSV位置46的糖基化。该方法也包括给予在GP5位置44或46不具有糖基化的氨基酸的NA或EU PRRSV毒株。为确定这些病毒是否提供保护,给予这些“受试”病毒的猪可用PRRSV或任何致PRRS的病毒攻击,并且观察任何PRRS症状并与接受攻击病毒的对照猪比较以确定“受试”病毒是否提供PRRSV保护作用。
另一方面,本发明的方法包括鉴定激发抗PRRSV的保护作用的病毒或PAD的方法,所述病毒或PAD用于下述免疫方案或疫苗中:给予GP5片段,衍生物或类似物,所述GP5具有北美(NA)PRSSV毒株的位置44的糖基化或具有欧洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化,并作为异源二聚体例如与PRRSV M蛋白的异源二聚体,随后给予不具有北美(NA)PRSSV毒株的位置44或欧洲(EU)PRRSV毒株的位置46的糖基化的GP5异源二聚体。为确定这些PAD是否提供保护,给予这些“受试”PAD的猪可用PRRSV或任何致PRRS的病毒攻击,并且观察到任何PRRS症状并与接受攻击病毒的对照猪比较以确定“受试”PAD是否提供PRRSV保护作用。保护作用可利用死亡率和病死率确定。
发明人认为任何杀死的(灭活的)PRRSV,减毒的(修饰的活)PRRSV,亚基,DNA或基于重组载体的、具有GP5,M,或GP5-M异源二聚体的任何组合可被聚糖分型并用于渐进性、连续或组合免疫方案或策略。一方面,所述免疫方案或策略诱导PAD抗体。
本发明人认为欧洲样PRRSV毒株可类似进行聚糖分型(表7)并用于针对美国样PRRSV的对猪的免疫方案中。
本发明一个PRRS疫苗的实施方案包括减毒的PRRS疫苗,其具有GP5,M,或GP5-M异源二聚体。减毒的毒株诱导PRRS相关疾病的性质在病毒是活减毒的病毒时明显降低或完全丧失。因此,需要具体的活PRRSV疫苗,其包含这样的减毒PRRSV毒株,产生抗减毒PRRSV毒株的GP5-M的GP5,M,或异源二聚体的免疫反应而不导致疾病。
制备减毒病毒的方法是本领域已知的,包括连续在细胞培养物上在适合细胞系上连续传代或化学诱变。例如,减毒PRRSV变体可在细胞系上通过病毒连续例如Marc145,CL2621,MA-104细胞或猪肺泡巨噬细胞传代制备大约10-100代,使得突变累积从而使得病毒减毒。连续传代指用病毒分离株感染细胞系,从宿主细胞回收病毒子代,随后用病毒子代感染宿主细胞产生下一代。在细胞系上传代的过程中,病毒丧失在猪中导致疾病的能力,例如变成无致病性或非致病性病毒,但保持在猪中复制并产生保护性免疫反应的能力。
因此,为了制备疫苗,减毒PRRSV分离株在适宜细胞系即Marc145,CL2621或MA-104细胞上在细胞培养物中生长到足以产生疫苗的效价。PRRSV根据本领域已知的方法回收。例如,病毒可从细胞培养物取出,并从细胞成分分离,通常通过常见澄清化步骤,例如离心,并随后根据需要利用本领域常用方法纯化。PRRSV随后可被浓缩,冷冻并保存在-70℃或在4℃冻干并保存。
减毒病毒的分离后可分析其基因组序列确定减毒表型的基础。这可通过测序病毒DNA并鉴定减毒分离株相对于对照病毒基因组序列的核苷酸改变来进行。因此,使得毒性PRRSV毒株减毒的分子改变得以表征。
本发明的一个实施方案包括将任何位置的序列改变单独或组合引入以在已知PRRSV毒株中或其他待鉴定和分离的毒株中产生减毒病毒子代。具有所述改变的病毒基因组可通过任何本领域技术人员已知的用于将核苷酸改变引入克隆的DNA的标准重组DNA技术来制备(Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates&Wiley Interscience,New York,1989)。随后可将基因组连接入适宜载体,所述载体被转染入宿主细胞以产生病毒子代。
疫苗前的PRRSV可混合成包含适当剂量并包括可药用的载体,诸如盐水和/或佐剂,诸如氢氧化铝。因此,本发明的PRRSV可包括免疫原有效量的一或多种本发明所述的PRRSV。
减毒病毒组合物可利用生理可接受的载体和/或佐剂引入猪中。有用的载体是本领域已知的,包括例如水,缓冲水,盐水,甘氨酸,透明质酸等。产生的水溶液可包装后使用或冻干后使用,冻干制备物在给药之前可重新水化,如上所述。所述组合物可包含实现适当生理条件所需的可药用辅助物质,诸如pH调节剂和缓冲剂,张力调节剂,湿润剂等,例如乙酸钠,乳酸钠,氯化钠,氯化钾,氯化钙,山梨聚糖单月桂酸酯,三乙酰胺油酸酯等。
本文公开的活减毒病毒的给药可通过任何适宜方法进行,包括胃肠外注射(诸如腹腔内、皮下或肌肉内注射),或将病毒局部应用(通常在药物配制剂中)到气道表面。将病毒局部给药气道表面可通过鼻内给药(例如利用滴管,药签,或吸入器,其将药物配制剂沉淀在鼻内)。将病毒给药气道的局部应用可通过吸入给药进行,诸如产生药物配制剂的可吸入颗粒(包括固体颗粒和液体颗粒),所述颗粒含有病毒,作为气溶胶悬液,并使得对象吸入可吸入颗粒。给药药物配制剂的可吸入颗粒的方法和工具是本领域已知的,可采用常规技术。接种之后,宿主至少部分或完全对所给予血清型的PRRSV感染具有免疫力,或对正在出现的轻度或中度PRRSV感染具有抗性。
另一个实施方案中,一种具体的具有上文所述的所需PAD的毒株的减毒PRRSV可与具有上文所述所需PAD的PRRSV其他毒株的减毒病毒组合,获得抗多PRRSV的保护作用。根据本发明,不同PRRSV可连续给药或渐进性给药或可选在混合物中同时给药。本发明疫苗组合物的连续或渐进性给药是激发足够水平的抗多种PRRSV毒株免疫力所需的。可单次或多次给药本发明的疫苗组合物。多次给药是激发足够免疫水平所需的。诱导的免疫力的水平可通过测定中和型分泌和血清抗体的量来监测,调节的剂量或重复接种是保持所需保护水平所需的。减毒毒株诱导PRRS相关疾病的性质如上所述在毒株是灭活形式时明显降低或完全丧失。
根据本发明,PRRSV疫苗的一个实施方案包括灭活的(杀死的)、具有GP5,M,或GP5-M蛋白异源二聚体的PRRSV。上文所述灭活毒株诱导PRRS相关疾病的性质在毒株是灭活(杀死)的情况下明显降低或完全缺失。PRRSV毒株的灭活可通过多种方法实现,包括冷冻-干燥,化学处理(例如利用噻汞撒或福尔马林),超声处理,辐照,加热或其他足以防止病毒复制或生长同时保持PRRSV的毒株的免疫原性的方法。
灭活的疫苗通过本领域已知方法制备。例如,一旦毒株扩增到高效价,本领域技术人员显而易见病毒抗原物质可通过本领域已知方法获得。例如,PRRSV抗原物质可通过稀释、浓缩或提取获得。PRRSV可通过利用福尔马林或利用二乙烯亚胺(BEI)处理来灭活,两种方法都是本领域已知的。例如,利用福尔马林灭活PRRSV毒株可通过将PRRSV悬液与37%甲醛混合到甲醛的最终浓度为0.05%来进行。PRRSV-甲醛混合物可通过恒速在室温搅拌大约24小时来混合。随后通过检测适宜细胞系例如,Marc145,CL2621或MA-104细胞上的生长来检测灭活的PRRSV混合物中残余的活病毒。
通过BEI灭活PRRSV可通过例如将本发明的PRRSV悬液与0.1M BEI(2-溴代-乙胺,在0.175N NaOH中)混合到BEI的最终浓度为1mM来进行。PRRSV-bei混合物可通过恒速在室温搅拌大约48小时来混合,然后加入1.0M硫代硫酸钠到终浓度0.1mM。再混合2小时。随后通过检测适宜细胞系例如,Marc145细胞上的生长来检测灭活的PRRSV混合物中残余的活病毒。本发明前述的灭活的PRRSV可与任何用于配置灭活病毒疫苗到适宜剂量水平的可药用佐剂或生理载体混合。杀死的PRRSV疫苗的适宜配制剂和给药模式的描述如下。
一个实施方案中,本发明的PRRSV疫苗可为亚单位疫苗。一方面,所述亚基可为PRRSV的GP5,M,或GP5-M异源二聚体。病毒亚基可利用生化方法得自PRRSV,或其可通过适宜细胞中的重组手段来表达。例如,表达病毒亚基的方法描述在以下参考文献中:Possee,1986,Virus research5:43;Kuroda et al.,.1986,EMBO J.5:1359;Doerfler,1986,Curr.Topics Microbiol.Immunol.131:51;Rigby,1983,J.Gen.Virol.64:255;Mackett etal.,1985,In:DNA Cloning,A Practical Approach,Vol II,Ed.D.M.Glover,IRL Press,Washington,D.C.;Rothestein,1985,In:DNA Cloning,A Practical Approach,Supra;Kinney et al.,1988,J.Gen.Virol.69:3005;Panical et al.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:5364;Small et al.,1985,In:Vaccinia Viruses asVectors for Vaccine Antigens,pp.175-178,Ed.J.Quinnan,Elsevier,N.Y。
本发明一个实施方案中,GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基可通过重组技术以足以用于亚单位疫苗的水平大量在体外制备。
另一方面,GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基可通过重组载体、病毒载体或病毒表达。另一方面,表达所述亚基的重组载体、病毒载体或病毒本身可作为疫苗组分来作为抗原或佐剂并激发或增强猪对GP5,M,或单独的GP5-M蛋白异源二聚体的免疫反应。
本发明另一个实施方案中,所述疫苗包括含有编码来自PRRSV毒株的抗原GP5,M,或GP5-M异源二聚体或其免疫原性片段的核酸的重组病毒载体。适宜重组病毒载体包括但不限于:活腺病毒、痘病毒,杆状病毒,伪狂犬病病毒(PRV),委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)载体诸如毒株V3526或TC-83,以及来自VEE的病毒复制子颗粒(VRP),马动脉炎病毒(EAV),或传染性胃肠炎病毒(TGE)。
本发明的重组病毒还可包含GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基中一种聚糖类型的多个拷贝。可选,重组病毒可包含一个以上GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基聚糖类型,从而该病毒可表达两或多种不同GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基。一方面,GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基在GP5蛋白细胞外结构域的糖基化方面不同。
为构建本发明的病毒载体,优选将GP5,M,或GP5-M蛋白异源二聚体亚基序列插入病毒毒株中并处于病毒自身的表达控制序列控制下。将GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基序列插入病毒载体并在病毒DNA中进行改变例如以的插入连接序列等技术是本领域已知的,参见例如T.Maniatis et al,"Molecular Cloning.A Laboratory Manual",Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982)。因此,根据本发明,用于表达GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基蛋白的适宜病毒表达载体的构建是本领域已知的。上文所述的重组病毒本身可直接用作疫苗组分。根据本发明实施方案,包含GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基的重组病毒直接通过接种引入受体猪。重组病毒在直接引入受体猪时,感染猪的细胞并在猪的细胞中产生GP5,M,或GP5-M异源二聚体亚基。
为了制备表达GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的重组病毒载体,编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的cDNA被插入病毒基因组,例如活腺病毒、痘病毒,杆状病毒,伪狂犬病病毒(PRV),委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)载体诸如毒株V3526或TC-83,以及来自VEE的病毒复制子颗粒(VRP),马动脉炎病毒(EAV),或传染性胃肠炎病毒(TGE)。重组病毒载体可通过任何已知标准重组DNA技术制备(Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates&WileyInterscience,New York,1989),用于将核苷酸改变引入克隆的DNA。病毒基因组可与适宜载体连接用于转染到宿主细胞中产生病毒子代。
对于任何前述重组病毒载体,编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的cDNA与真核启动子可操作连接,在编码抗原和真核细胞终止信号以及poly(A)信号的cDNA的5'末端、在编码抗原的cDNA的3'末端。本发明中,“可操作连接”指本发明的多核苷酸(如cDNA分子)和含有表达控制序列(DNA)例如转录启动子和终止序列的多核苷酸,其位于载体或细胞中从而cDNA编码的抗原通过表达控制序列调节。克隆DNA诸如编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的cDNA并将包含表达控制序列的DNA与其可操作连接的方法是已知的。适合表达编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的启动子的实例在重组病毒载体中是巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子,Rous肉瘤病毒长末端重复(RSV-LTR)启动子,猿病毒40(SV40)立即早期启动子,以及可诱导启动子诸如金属硫蛋白启动子。具有终止信号和poly(A)信号的DNA的实例是SV40晚期poly(A)区。适合制备抗原的病毒表达系统的另一实例是Sindbis表达系统,其可得自Invitrogen。这些商业可得的表达载体和系统的使用是本领域已知的。
本发明另一实施方案中,将疫苗提供作为核酸或DNA分子疫苗,其激发猪中的活性免疫反应。DNA分子疫苗由具有编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的核酸分子的DNA组成。编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的核酸在GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子的起始密码子或其附近与启动子可操作连接,使得当核酸接种到猪的细胞中能从核酸转录GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段。优选,DNA分子是质粒。可用于DNA疫苗的启动子是本领域已知的,包括但不限于RSV LTR启动子,CMV立即早期启动子,以及SV40T抗原启动子。一方面,核酸在编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的序列的终止密码子或其附近可操作连接于包含转录终止序列和poly(A)识别信号的核酸片段。可在可接受的药物载体或脂质或脂质体载体中提供所述DNA疫苗,类似Felgner的美国专利5,589,466和5,580,859所述那样。最后,制备药物级质粒DNA的方法在Marquet et al.的美国专利5,561,064中教导。
因此,利用包含上文所述的任何适宜方法,表达GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的DNA疫苗可用于免疫猪对抗PRRSV。DNA疫苗的一个优势是DNA分子通常作为质粒扩增,这是制备疫苗的简单且不昂贵的方法,由于疫苗并非活疫苗,与活重组病毒载体疫苗县官许多调节问题与DNA疫苗无关。本领域技术人员理解本发明的DNA疫苗可包括合成制备的核酸,其通过本领域已知的化学合成方法制备。
本发明另一实施方案中,所述疫苗由分离的或纯化的GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段组成。优选,GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段在重组细菌或真核细胞表达载体中制备,产生被分离并纯化用于制备疫苗的抗原。例如,GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段可在以下细胞中制备:微生物诸如细菌、酵母或真菌;真核细胞诸如哺乳动物或昆虫细胞;或在重组病毒载体诸如腺病毒,痘病毒,疱疹病毒,Simliki森林病毒,杆状病毒,细菌噬菌体,sindbis病毒,仙台病毒,或委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)载体诸如毒株V3526或TC-83,以及来自以下病毒的病毒复制子颗粒(VRPs):VEE,马动脉炎病毒(EAV),或传染性胃肠炎病毒(TGE)。适合制备GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的适宜细菌包括大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,以及任何其他能表达异源多肽的酵母菌。利用上述细菌、重组病毒载体、真核细胞产生用于疫苗中的抗原的方法是本领域已知的。
为制备由GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段组成的疫苗,编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段的核酸在质粒中,并且所述核酸可操作连接于影响GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段在微生物中表达的启动子。适宜启动子包括但不限于T7噬菌体启动子,T3噬菌体启动子,beta-半乳糖苷酶启动子,以及Sp6噬菌体启动子。GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原或其免疫原片段在微生物中的表达使得GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子可利用发酵技术制备,其在商业上用于制备大量重组抗原多肽。分离和纯化抗原的方法是本领域已知的并包括诸如凝胶过滤,亲和层析,离子交换层析或离心等方法。
为了有利于GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子或其免疫原片段的分离,制备融合多肽,其中GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子或其免疫原片段与另一多肽相连,所述多肽使得可通过亲和层析分离。优选,融合多肽可利用前述一种表达系统制备。例如,编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子或其免疫原片段的cDNA核酸序列在5'或3'末端与编码多肽的核酸相连。所述核酸可在适当密码子读框中连接,从而产生融合蛋白,其中GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子或其一部分的氨基和/或羧基末端与允许作为融合多肽简单回收抗原的多肽融合。
用于制备用于疫苗中的GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子或其免疫原片段的真核细胞表达系统的实例是谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因融合系统,其可得自AmershamPharmacia Biotech,Piscataway,N.J.,该系统利用pGEX-4T-1表达载体质粒。编码GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子或其免疫原片段的cDNA在适当密码子读框中与编码GST的DNA融合。融合多肽的GST部分允许利用谷胱甘肽琼脂糖4B亲和层析快速纯化融合多肽。纯化之后,融合多肽的GST部分可通过利用位点特异性蛋白酶诸如凝血酶或因子Xa来切割来去除,产生不含GST多肽的抗原决定子。不含GST多肽的GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子或其免疫原片段可通过第二轮谷胱甘肽琼脂糖4B亲和层析产生。
制备包含GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子或其免疫原片段的疫苗的另一方法是将编码抗原决定子的cDNA与编码聚组氨酸的DNA密码子框内连接的方法。聚组氨酸优选包含6个组氨酸残基,其允许通过金属亲和层析优选镍亲和层析来纯化融合多肽。为制备不含聚组氨酸的GP5,M,或GP5-M异源二聚体抗原决定子或其免疫原片段,裂将解位点诸如肠激酶裂解位点融合在适当读框中在编码聚组氨酸的密码子和编码抗体的密码子之间。不含聚组氨酸的抗原通过利用肠激酶裂解来去除聚组氨酸而制备。不含组氨酸的抗原通过第二轮金属亲和层析结合游离聚组氨酸来制备。见Motin et al.Infect.Immun.64:4313-4318(1996)。得自Invitrogen,Carlsbad,California的Xpress System,是可商购的试剂盒,用于随后分离聚组氨酸-多肽融合蛋白。
免疫原性组合物包括疫苗可通过在多种配制剂中制备,例如注射剂,溶液或乳化剂。免疫原例如GP5,M,或GP5-M异源二聚体可与与免疫原相容的可药用赋形剂混合。所述赋形剂可包括水,盐水,葡萄糖,甘油,乙醇及其组合。免疫原性组合物以及疫苗还可包括辅助物质,诸如湿润剂户哦乳化剂,pH缓冲剂,或提高效力的辅助剂。
免疫组合物和疫苗可经胃肠外给药,通过皮下注射或肌内注射或任何其他适合方式。免疫原制备物和疫苗可以与制剂匹配的方式给药,量可为治疗有效性,免疫原性并且为保护性的量。给药的量有赖于待治疗的对象,包括例如该个体的免疫系统合成抗体的能力,如果需要产生细胞介导的免疫反应的能力。需要给予的活性药剂的精确量有赖于医师的判断。但是,适宜剂量范围可由本领域技术人员轻易确定并有赖于免疫原生物体来确定(beof the order of micrograms of the immunogens)。首次给药和加强剂量的适宜方案也不同,但包括首次给药以及随后的给药。所述剂量有赖于给药途径并根据宿主的大小而不同。
免疫原作为免疫原组合物的浓度根据本发明通常为大约1-大约95%。如果抗原与佐剂一同给药免疫原性可明显提高,通常以磷酸盐缓冲盐水中的0.005-0.5百分比溶液使用。佐剂促进抗原的免疫原性但其自身不必是免疫原性的。佐剂可通过保持抗原在接近给药位点的局部以产生有利于将抗原缓慢持续释放到免疫系统细胞的储库来起作用。佐剂还吸引免疫系统的细胞到抗原储库并刺激所述细胞激发免疫反应。
免疫刺激剂或佐剂用于改善宿主对例如疫苗的免疫反应已经有很多年。本发明的疫苗可与佐剂联用,例如脂聚糖,氢氧化铝,和磷酸铝(alum),与膜蛋白抗原复合的皂角苷(免疫刺激复合体),具有矿物油的聚醚聚合物(pluronic polymers with mineral oil),矿物油中的杀死的分枝杆菌,弗氏完全佐剂,细菌产物,诸如胞壁酰二肽(MDP)和脂聚糖(LPS),以及脂质A,和脂质体。理想佐剂的所需性质包括:(1)缺乏毒性;(2)刺激长期持续的免疫反应的能力;(3)制备简单,可稳定的长期保存;(4)激发针对不同途径给予的抗原的CMI和HIR的能力;(5)与其他佐剂协同;(6)可与抗原呈递细胞(APC)群体选择性反应;(7)特异性激发适当T-辅助细胞1(TH1)或TH2稀细胞特异性免疫反应的能力;和(8)选择性增加针对抗原的适当抗体(例如,IgA)的水平的能力。本发明所用佐剂无需具有所有上述性质。
给药本发明疫苗组合物的任何实施方案的途径包括但不限于,经口鼻,肌肉内,腹腔内,皮内,皮下,静脉内,动脉内,眼内,口服以及透皮或通过吸入或栓剂。疫苗可通过任何途径给药包括但不限于,注射器,雾化器,混合器(misters),无针注射装置,或微粒攻击基因枪(Biolistic bombardment)。
本发明一方面,如果疫苗是亚单位疫苗、DNA疫苗或基于重组的疫苗,本发明人认为可利用单个M蛋白而仅仅变化GP5蛋白,例如其聚糖类型,而仍保持抗PRRSV保护作用。
可选,PRRSV的GP5,M,或GP5-M异源二聚体的超过一种聚糖类型可用于本发明所述的疫苗。其中包括来自不同PRRSV的GP5,M,或GP5-M异源二聚体以及根据聚糖分型相同或相似GP5,M,或GP5-M异源二聚体的多个拷贝。本发明人认为任何用于治疗本发明的PRRS的疫苗可进一步包括至少一种其他抗猪病原体的疫苗,所述病原体例如猪流感病毒(SIV),猪圆环病毒(PCV),猪肺炎支原体或猪副嗜血杆菌。
作为疫苗效力的一个指标,可对从接种后个体收集的样品进行ELISA确定是否针对包含PAD多肽、其衍生物、类似物或变体或片段的疫苗的抗PAD抗体。比照参比抗PAD抗体测定个体样品。
本发明疫苗的效力可通过测定疫苗是否对猪提供抗PRRSV感染保护作用来测定。在下述情况中,疫苗保护猪对抗PRRSV感染:在将该疫苗给予一或多个未受感染的猪之后随后用生物学纯病毒分离株(例如,VR2385,VR2386,或下文所述其他分离株)攻击导致任何宏观或病理学严重度降低(例如肺损伤)和/或疾病症状与未受保护的相似猪中该分离株引起的常见改变或症状相比(即相对于适当的对照)严重度降低。更具体的,本发明的疫苗显示通过如下方式显示为有效的:将疫苗给予一或多个需要所述疫苗的适宜猪,然后在一段适宜时间(例如1-4周)之后用大量生物学纯PRRSV分离株的样品(103-7TCID50)攻击。大约1周之后从攻击的猪获取血样,并尝试从血样中分离病毒。病毒的分离表示疫苗不是有效的,并且不能分离所述病毒表明疫苗是有效的。
因此,本发明疫苗的有效性可定量(即与适当对照组相比固化(consolidated)肺组织百分比降低)或定性(例如从血液分离PRRSV,在肺、扁桃体或淋巴结组织样品中通过免疫过氧化物酶测定法检出PRRSV抗原等)。猪繁殖与呼吸疾病的症状可定量(即温度/发热),半定量(例如呼吸窘迫严重度)或定性(例如一或多种症状的存在或缺失或一或多种症状严重度的降低,诸如紫绀,肺炎,心和/或脑损伤等)评估。
因此,本发明也提供对易感宿主例如猪进行免疫接种以对抗PRRSV的方法,包括给予该宿主有效保护对抗PRRSV感染的量的PAD多肽、其衍生物、类似物或变体或片段。本领域技术人员理解表达PAD多肽、其衍生物、类似物或变体或片段的核酸也可用于免疫接种中。另一个实施方案中,提供了预防或治疗动物中的PRRSV的方法,其中给予所述动物治疗有效量的PAD或编码PAD的核酸。一方面,所述动物是猪。
本发明还涉及新的PAD多肽,其衍生物、类似物或变体或片段或编码本发明PAD多肽的核酸,其可为单独的或与其他免疫原性多肽组合,给予动物例如猪,所述给药可利用多种递送系统或方法进行。所述递送方法或系统包括但不限于脂质体递送系统,裸露的递送系统,电穿孔,病毒,载体,病毒载体或可摄入的递送系统,其中PAD多肽或编码PAD的核酸被摄取,例如其可在饲料或水中。此外,PAD多肽,其衍生物、类似物或变体或片段或编码本发明PAD多肽的核酸可经腹腔,口服,鼻内,皮下,皮内,肌肉内,局部或静脉内给药(或经配制用于给药),或可通过任何药物学有效途径(即有效产生免疫力)给药或经配制用于给药。另一方面,所述方法还包括PAD多肽,其衍生物、类似物或变体或片段或编码本发明PAD多肽的核酸以有效保护对抗PRRSV感染的量存在于生理可接受的载体。
除了用作疫苗以外,PAD多肽和编码PAD多肽的核酸可用作抗原产生用于被动免疫治疗中的抗体,用作诊断剂,用作其他方法诸如亲和层析中的试剂。
一个相关方面,本发明包括所谓的“被动”免疫方法用于预防或治疗PRRSV。例如,抗血清包含利用PRRSV或其突变体或其免疫原性片段免疫异源宿主产生的抗体,用于治病性治疗PRRSV感染的猪。但即使提供主动免疫的疫苗,即包含PRRSV或其突变体或其免疫原性片段的疫苗已经在具体情况中也显示在作为抗各种疾病的治病性治疗中给药时有效。因此,本发明提供的免疫力可为主动免疫或被动免疫,并且疫苗和抗血清的使用目的是预防性或治病性应用。
根据本发明的该方面,给予动物对象例如猪有效量的抗体,所述抗体特异性结合本发明的PAD多肽,其衍生物,类似物,变体或片段。根据相关实施方案,所述方法和组合物还可包含结合至少一或多种PAD多肽的抗体的组合。所述抗体也可与载体一同给药,如本文所述。通常,根据本发明的这方面,所述抗体将可经腹腔,口服,鼻内,皮下,皮内,肌肉内,局部或静脉内给药(或经配制用于给药),也可通过任何药物学有效途径(即有效产生免疫力)给药或配制用于给药。因此,PRRSV抗体可用于抑制和/或治疗PRRSV感染。
本发明还涉及诊断和药物试剂盒,其包含一或多个充满了一或多种本发明前述组合物的容器,本发明前述组合物例如编码PAD多肽,其衍生物,类似物,变体或片段的核酸,或针对PAD多肽,其衍生物、类似物或变体或片段或编码本发明PAD多肽的核酸的抗体。因此,本发明的多核苷酸,多肽和抗体以及疫苗可作为研究药剂以及治疗和诊断PRRSV的物质使用。具体的,认为试剂盒可用于确定猪是否被成功接种从而使得抗PAD抗体存在收集的样品中。例如,收集来自用上述PAD多肽免疫的动物例如猪的生物学样品,并与PAD多肽或其他抗PAD抗体制备物保温足够抗体结合发生的一段时间。与PAD多肽结合的抗体或其他抗PAD抗体制备物利用本领域技术人员已知方法检测,例如Western印迹分析和/或ELISA测定法。
本发明的抗PAD抗体具有多种用途,例如,抗-PAD抗体可用于PRRSV的诊断试验中,例如检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。可使用本领域已知的各种检测试验,在均质或异质阶段中进行的诸如竞争结合试验,直接或间接夹心测定法以及免疫沉淀测定法(Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.(1987)pp.147-158)。用于诊断试验中的抗体可用可检测部分标记。本发明抗体的检测可通过将抗体与可检测部分偶联(例如物理连接)来进行。可检测部分的实例包括各种酶,修复基团,荧光物质,发光物质,生物发光物质和放射活性物质。适宜酶的实例包括辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶,beta-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。适宜修复基团复合体的实例包括链霉抗生物素/生物素和亲和素/生物素;适宜荧光物质的实例包括伞形酮,荧光素,异硫氰酸荧光素,罗丹明,二氯三吖嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein),丹磺酰氯或藻红蛋白;发光物质的实例包括鲁米诺;生物发光物质的实例包括萤光素酶,萤光素,和萤光素,适宜放射活性物质的实例包括I125,I131,S35或H3。可检测部分应能直接或间接产生可检测信号。本领域已知任何将抗体与可检测部分偶联的方法可使用,包括以下参考文献中描述的那些:Hunter et al.,Nature,144:945(1962);David et al.,Biochemistry,13:1014(1974);Pain et al.,J.Immunol.Meth.,40:219(1981);和Nygren,J.Histochem.andCytochem.,30:407(1982)。本发明人认为所述诊断试剂盒对于去除各种水平的PRRSV的过程有价值,包括但不限于个体(农场),区域性和/或全国水平。
抗PAD抗体也可用于从重组细胞培养物或天然来源中亲和纯化PAD。在该过程中,抗PAD抗体利用常用方法固定在适宜支持物上,诸如Sephadex树脂或滤纸。固定的抗体随后可与包含待纯化的PAD的样品接触,然后用适宜溶剂洗涤支持物,基本去除样品中除了与固定的抗体结合的PAD之外的所有物质。最后,支持物利用另一种适宜溶剂洗涤,将PAD从抗体释放出来。
虽然本发明已经参考PAD多肽描述,应理解其包括其衍生物,类似物,变体或片段以及类似的蛋白可具有添加、缺失或取代但基本上不影响重组多肽的保护性抗原的性质。
本发明的疫苗组合物包含将减毒PRRSV给予易感猪或有感染PRRSV风险的猪以提高猪自身的免疫反应能力。所述量定义为“免疫有效剂量”。在该用途中,精确量有赖于猪的健康状态和重量,给药方式,配制性质等。疫苗组合物还掺入其他物质以稳定pH,或作为佐剂,湿润剂或乳化剂,可改善疫苗有效性。疫苗通常配制成胃肠外给药的形式,并经皮下或肌内注射。所述疫苗还可利用本领域已知的方法配制成栓剂或可口服给药的形式。
足以产生抗PRRSV免疫力的疫苗的量通过本领域已知方法确定。所述量可基于疫苗接受者的特征和所需免疫力水平确定。通常,疫苗的量或给药剂量通过本领域熟练技术人员确定或可通过常规试验轻易确定。每种毒株的病毒疫苗的量可调节,例如增加或减少,产生这样的配制剂,其提供足够的抗所需PRRSV感染的保护作用。本发明人认为不同毒株可以任何认为可有效预防或治疗PRRSV感染的量组合在疫苗组合物中,并且如果出现交叉保护可包含其他毒株。对其他PRRSB毒株的感染的交叉保护有赖于中PRRSV毒株的给药次序(order)或猪以前是否感染过PRRSV,如上所述。
根据本发明,GP5细胞外结构域中具有相同或不同糖基化模式的不同的PRRSV或PRRSV的PAD,例如,GP5,M,和/或GP5-M异源二聚体的PAD可依次或渐进性给药或在混合物中交替给药。依次或渐进性给药本发明的疫苗组合物是激发足够水平的免疫力以扩增PRRSV毒株所需的。可单次或多次给药本发明的疫苗组合物。多次给药是激发足够免疫力水平所需的。诱导的免疫力水平可通过测定中和型分泌抗体和血清抗体的量来检测,可调节剂量或重复接种以维持所需保护水平。
在抗PRRSV感染的免疫方案的一个方面,给药本发明具有PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD的病毒,其中具有北美毒株的GP5的位置44的糖基化,然后给药本发明具有PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD的病毒,其中不具有北美毒株的GP5的位置44的糖基化,随后用在GP5中和表位糖基化的PRRSV攻击。
另一方面,给药本发明具有PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD的病毒,其中具有在欧洲毒株的GP5的位置46的糖基化,然后给药本发明具有PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD的病毒,其中不具有欧洲毒株的GP5的位置46的糖基化,随后用在GP5中和表位具有糖基化的PRRSV攻击。
在抗PRRSV感染的免疫方案的另一个方面,给药本发明包含PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD,其具有北美毒株的GP5的位置44的糖基化,然后给药本发明包含PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD,其不具有北美毒株的GP5的位置44的糖基化,随后用在GP5中和表位中具有糖基化的PRRSV攻击。另一方面,给药本发明具有PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD,其在欧洲毒株的GP5的位置46的糖基化,然后给药本发明具有PRRSV的GP5-M异源二聚体的PAD,其不在欧洲毒株的GP5的位置46的糖基化,随后用在GP5中和表位中糖基化的PRRSV攻击。
本发明一个实施方案中,GP5的PAD可不具有来自NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的任何聚糖。另一方面,GP5的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖。另一方面,GP5的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖并且具有或不具有位于NA PRRSVGP5蛋白氨基酸1-35的聚糖,例如在一些NA PRRSV毒株中所见。
本发明一个实施方案中,GP5-M异源二聚体的PAD可不具有来自NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的任何聚糖。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有位于NA PRRSV GP5蛋白中位置44的聚糖并且具有或不具有NA PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-35的聚糖,例如在一些NA PRRSV毒株中所见。
本发明一个实施方案中,GP5的PAD可不具有来自EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的任何聚糖,如在Lelystad中所见。另一方面,GP5的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖。另一方面,GP5的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖并且具有或不具有位于EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的聚糖,例如在一些EU PRRSV毒株中所见。
本发明一个实施方案中,GP5-M异源二聚体的PAD可不具有来自EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的任何聚糖,如在Lelystad中所见。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有位于EU PRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖。另一方面,GP5-M异源二聚体的PAD具有位于EUPRRSV GP5蛋白中位置46的聚糖并且具有或不具有位于EU PRRSV GP5蛋白中氨基酸1-37的聚糖,例如在一些EU PRRSV毒株中所见。
实施例:
实施例1:
鉴定PRRSV的PAD的溶液不显而易见,因为其他人并没有将关于北美和欧洲PRRSV毒株以及马动脉炎病毒(EAV)的信息总结成知识。例如,EAV的修饰活疫苗(MLV)非常有效而PRRSV的MLV并非如此。许多科学家的显而易见的结论是两种病毒的相似性和差异的比较对于开发PRRSV的疫苗而言没有价值。从2005年2月份开始,发明人研究了多篇公开物,总结了许多重要信息,并通过推理鉴定PRRSV的保护性抗原决定子是基质-糖蛋白5(M-GP5)异源二聚体。
PRRS流行病令人最感兴趣且最困扰的一个方面是北美和欧洲分离株之间的差异,以及至少在将PRRSV活疫苗从美国引入欧洲之前,在西欧PRRS相对较轻的事实。此外,一些小的传统美国农场,PRRSV自发消失而没有明显的原因。但在美国,PRRS总对经济造成更具有破坏性的损失(尤其对于大的猪群而言)。因此,本发明人比较了VR2332(常见的北美毒株)上的N糖基化位点和Lelystad病毒(常见的欧洲毒株)上的N糖基化位点。见表1。注意HLV013和Lelystad病毒之间的相似性;但是这两种病毒并非相同,因为GP5信号序列和GP5高变区非常不同。根据公开文献,有证据表明活Lelystad病毒保护猪对抗PRRS的程度比VR2332高。在AA1-43缺乏糖基化是PRRS在欧洲部分地区和美国一些农场中严重性降低的原因。即,Lelystad病毒在欧洲已经天然免疫猪,并且与HLV013类似的毒株对于美国有限数目的农场的影响也如此。北美毒株VR2332和Mn184在糖基化方面非常不同的事实使得我们比较VR2332与Lylstad毒株的抗体反应性(表2)。由于Lelystad病毒的抗体与Lelystad的GP5-M异源二聚体反应,我们认为GP5-M异源二聚体含有PRRSV的保护性抗原决定子并可作为PRRS抗性的基础。
表1.比较不同PRRSV毒株的AA序列和N-糖基化
*Ingelvac MLV,Ingelvac ATP,和PrimePac MLV都类似于VR2332
本发明人意识到EAV的MLV疫苗非常有效。因此,本发明人比较了PRRSV与EAV的免疫学和基因组的多个方面(表3)。
表2.通过Western印迹比较VR2332和Lelystad毒株的抗体反应性
*?表明结果未公开
**肽ELISA阳性
表3.比较PRRSV和EAV对PRRSV的保护性抗原决定子的诱导
表征 | PRRSV | EAV |
宿主 | 猪 | 马 |
可体外培养 | 是 | 是 |
GP5主要病毒中和型(VN)表位 | 是 | 是 |
抗GP5抗体诱导免疫力 | 否 | 否 |
对核壳体(N)和基质(M)的弱VN活性 | 是 | 是 |
抗N,M,和其他GP抗体诱导免疫力 | 否 | 否 |
修饰活疫苗(MLV)诱导抗该病毒所述毒株的免疫力 | 否 | 是 |
MLV诱导抗所有毒株的N的抗体 | 是 | 否* |
MLV诱导抗所有毒株的M的抗体 | 是 | 是 |
MLV诱导抗所有毒株的GP5的抗体 | 否 | 是 |
MLV诱导素数毒株的M-GP5异源二聚体的抗体 | ?** | 是 |
抗GP5-M异源二聚体抗体对抗疾病 | ?** | 是 |
M-GP5异源二聚体已经合成 | 否 | 是 |
M上的肝素受体 | 是 | ? |
GP5上的唾液酸 | 是 | ? |
信号序列和高变区上天冬酰胺的N-糖基化,其位于GP-5蛋白AA序列 | 是 | 否 |
的保守VN表位的左边 | ||
GP-5蛋白AA序列的保守VN表位上天冬酰胺的N-糖基化 | 是 | 是 |
GP-5蛋白AA序列中存在半胱氨酸 | 是 | 是 |
M和GP-5通过二硫键连接 | 是 | 是 |
*马对EAV核壳体不反应;睾丸中携带病毒的雄马具有抗N抗体。
**未公开
+由于EAV不具有位于VN保守表位左边的N-糖基化位点;认为GP5-M异源二聚体包含PRRS的保护性抗原决定子
-PRRSV中的GP5与EAV包膜蛋白GL同义。通过总结和推断,鉴定保护性抗原决定子(PAD)。PRRSV的PAD是与GP5-M异源二聚体相关的抗原,由此作为公开的基础。Plagemann,Faaberg和Osorio仅仅关注PRRSV的GP5蛋白相关的病毒中和(VN)方面的情况。但抗体不仅中和病毒,还产生抗PRRSV保护作用,抗体干扰基质蛋白上的肝素受体和GP5的唾液酸组分,其防止病毒粘附并进入猪肺泡巨噬细胞(表3)。抗体抑制的概念在本文中并非仅指病毒中和本身。总之,
·PRRSV毒株Lelystad和HLV013在残基1-43氨基酸(AA)不具有聚糖(在信号序列中或保守中和表位的上游高变区中)
·PRRSV的毒性和疫苗病毒的抗体不与所有PRRSV分离株的GP5-M异源二聚体反应,这是由于存在位于1-43AA的聚糖
·PRRSV GP5的1-43AA的聚糖是诱饵表位A(Osorio)和过量聚糖(Plagemann),但这些研究者认为诱饵聚糖仅仅参与抗GP5保守区的病毒中和(VN)抗体的产生(未涉及重要基质蛋白)
·实际上,诱饵聚糖干扰抗GP5-M异源二聚体抗体产生而不仅仅是干扰抗GP5VN抗体的产生。GP5-M异源二聚体抗体防止PRRSV粘附并进入猪肺泡巨噬细胞(不仅仅中和病毒)。如果AA1-43缺乏聚糖,抗体仅仅由活PRRSV诱导,由此可得出现有MLV PRRSV疫苗无效。
PRRSV研究者的焦点在利用常规方法开发病毒疫苗,其涉及与细胞介导的免疫(CMI)和/或病毒中和(VN)抗体相关的机制。Plagemann,Faaberg,和Osorio鉴定了位于GP5上的保守表位,其与VN抗体相关。但GP5保守表位抗体单独不诱导足够的抗PRRSV抗体保护。Plagemann和Faaberg认为GP5上的聚糖干扰VN抗体产生,Osorio认为诱饵表位组织VN抗体产生。Osorio将含VN抗体的血清注入母猪,保护其小猪对抗PRRSV;但对幼年小猪注射抗体制备物之后,并未产生保护作用。幼年小猪未受保护的原因是Osorio的抗血清缺乏完全的PAD抗体组(Osorio用于诱导在GP5的AA1-43含有聚糖的VN抗体的所有病毒)。因此,PAD抗体与仅仅针对GP5蛋白的抗体非常不同。
Murtaugh证实VN抗体不参与清除天然感染的猪中的病毒并支持与CMI相关的机制。Murtaugh最近在多伦多(2004-3-5)的会议中认为,PRRSV的保护性决定子没有被描述。这些专家的公开出版物和PRRSV研究中的其他出版物(见附件)反复说明PRRSV是独特的病毒,对同源病毒产生一些抗体,并对异源病毒的攻击几乎没有保护作用,CMI和VN反应出现慢,并且不一定与病毒抗性相关。对于其他科学家显而易见,PAD是GP5蛋白保守区与基质相连的异源二聚体形式的组合。此外,GP5蛋白必须不含有氨基酸1-43之间的N糖基化天冬酰胺。已经公开基质蛋白(发夹受体)参与病毒与猪肺泡巨噬细胞(PAM)的粘附,并且GP5蛋白含有允许进入PAM的唾液酸残基。PAD抗体(GP5-M异源二聚体)由此防止PRRSV粘附和进入,而不仅仅是中和病毒。目前可得的疫苗不产生PRRSV的PAD的抗体。
实施例2:最近我们实验室的工作显示PRRSV活毒株(图2,毒株HLV013)在GP5氨基酸44之前缺乏聚糖将诱导高效价GP中和表位,其可由中和肽ELISA测定法测出。Western免疫印迹对HLV013的进一步分析显示对GP5和GP5-M异源二聚体的早期抗体反应当与VR2332和来自感染猪的HLV013的血清相比显示,与来自VR2332感染的猪的血清相比,所述抗体与PRRSV毒株IA97-7895更多的交叉反应(图2和图3)。这些研究的结果使得我们相信与GP5-M异源二聚体相关的N糖基化模式是更有效的中和抗体反应的重要组成部分。
糖基化对中和抗体出现的影响首先在本实验中显示。在该实验中,3组6只PRRSV阴性猪如表A所示处理。对猪在第0天接种并在第28天再次接种,然后在第90天用异源毒株接种。血清在研究过程中收集,并检测针对接种毒株和异源毒株的中和抗体(图4)。
表A:猪接种试验1设计
组# | 第0天(第一次) | 第42天(加强) |
1 | PBS | PBS |
2 | VR2332 | VR2332 |
3 | HLV013 | HLV013 |
该试验证明对糖基化不同的毒株的保护性抗体反应之间存在很大差别。见图5。缺乏a44之前的聚糖的HLV013与VR2332相比具有更快、更强的攻击前抗体反应,并且交叉反应性更强。攻击后的猪用HLV013接种,其具有更快的嗜睡反应并且产生抗攻击毒株的抗体的反应时间更快。
下表对应图5中的Western印迹。
每个泳道含有10ug纯化的PRRSV。一级抗体1:100稀释,二级抗体1:2000稀释。
实施例3:动物接种:2只2-3周龄的猪从没有可检测PRRSV存在的来源获得并圈养在ISU研究机构中。适应环境后,经鼻感染猪105TC-ID50所需毒株。在接种后第-7,0,7,21,35和70天对猪放血,允许足够时间产生中和抗体,然后人工安乐死。血清分成数个等分,送到ISU诊断实验室,进行抗N抗体ELISA(Herdcheck,IDEXX),送到SDSU诊断实验室进行MARC145血清中和测定法(FFN),并送到明尼苏达大学(University of Minnesota)进行中和肽ELISA(Plagemann)。剩余血清用于在ISU抑制AM感染试验。
进行本试验来进一步评估GP5N-聚糖缺乏的毒株产生高效价中和抗体的能力及其交叉反应性。获得PRRSV阴性猪并随机分入3组,如表B所示。试验末,从所有猪收集血清,检测抗各种不同PRRSV毒株的病毒中和抗体(表C)。
表B:
组# | 第0天 | 第70天 | 第103天 |
1 | HLV013 | HLV013 | NA |
2 | HLV013 | HLV093 | NA |
3 | HLV013 | HLV093 | NVSL97-7895 |
所有PRRSV的剂量均为1ml,IM为1x106TCID50/ml
NA=未进行
表C:抗PRRSV不同毒株的中和抗体效价(几何平均值)
尽管所有3组产生同源和异源中和效价,第2组中的效价明显更高。第3组中第三聚糖类型的加入没有使得抗体反应超过第2组的情况。这表明HLV013和HLV093的组合最适合作为通用疫苗激发异源中和抗体。
聚糖屏蔽效应可进一步通过比较具有相同数目的位于aa44之前的聚糖的毒株组的几何平均值来显示。用于FFN测定法中的7种不同毒株基于聚糖类型分成3个不同的组;NA-0,NA-1和NA-2。我们预期不考虑GP5序列同源性,抗NA-0毒株效价最高且抗NA-2毒株的效价最低。这实际上是图6所示的情况。预测保护性抗体的交叉反应的能力支持可利用聚糖分型确定PRRSV毒株的异源性。
实施例4:收集肺泡巨噬细胞:从培养物收集AM,如前所述(Mengeling,Thacker)。猪(4-6周龄)被麻醉并通过放血处死。从胸腔取出肺进行肺灌洗。灌洗液包含补充有遗传霉素(0.5mg/ml)的Dulbecco改良的Eagles培养基(DMEM),青霉素(25U/ml),链霉素(25μg/ml),多粘菌素B硫酸酯(3U/ml),以及两性霉素B(25ug/ml)。灌洗液随后分配并多次吸出以收集AM。我们预期通过收集来自个体猪的吸出液可收集100-200ml灌洗液每只猪。来自不同猪的液体不会被混合以避免免疫反应和鉴定对PRRSV的AM易感性的任何差异。收集的液体在1000g离心15min,重悬于50ml PBS,洗涤2次以上。计数AM并以浓度大约5x107AM/1.5ml重悬于PBS,保存于液氮中。用PRRSV毒株VR2332感染AM来确认批次,并进行免疫过氧化物酶单层分析(IPMA)利用已知的阳性和阴性血清确定TCID50。
实施例5:抗体对肺泡巨噬细胞的感染的抑制作用:多克隆或单克隆抗体稀释2倍,加入105TCID50的各种同源和异源PRRSV毒株。混合物37℃保温1小时,接种到96孔培养板的肺泡巨噬细胞(AM)。细胞在37℃与5%CO2保温1小时,洗涤,并保温直到接种后10小时(Delputte)。固定细胞,基于免疫过氧化物酶染色计算感染细胞百分比。利用t检验比较治疗孔和对照孔之间感染细胞的百分比。
实施例6:免疫过氧化物酶单层分析:利用IPMA确定感染的细胞的百分比,如Delputte et al所述。简而言之,在37℃将固定的细胞与抗核壳体单克隆抗体保温1小时,在PBS中用10%山羊血清1/100稀释,然后在37℃与过氧化物酶标记的山羊抗小鼠Ig保温1小时。感染的细胞通过0.05M乙酸盐缓冲液(pH5)中含有0.05%H2O2的3-氨基-9-乙基咔唑底物溶液显示。通过用乙酸缓冲液洗涤来阻断反应。病毒阳性细胞和总细胞通过光学显微镜计数来确定感染的细胞的百分比。
实施例7:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE):等体积的抗原与2xLDS加样缓冲液(Invitrogen)混合,其中包括还原剂或没有还原剂。所有样品煮沸5分钟。利用4-12%预制的梯度Novex Nu-PAGE凝胶(Invitrogen)以及XCell SureLock mini-cell(Invitrogen),15μl的每种样品被加载到其各自的孔中。SeeBlue Plus2与染色的梯以体积10μl加载于第一和最后一个孔中。在凝胶上加载样品并且在缓冲液核心和较低的缓冲液小室中充满1x MES缓冲液(Invitrogen),供电电流设定为200V,并允许进行45分钟。
实施例8:Western免疫印迹:Western印迹可用于进一步分析和鉴定保护性表位。四种印迹垫浸入转移缓冲液,所述缓冲液包含25mM Bis-Tris,25mM N-二(羟乙基)甘氨酸,含有10%甲醇的1mM二乙胺四乙酸(EDTA)。聚偏二氟乙烯(PVDF)短时间浸入甲醇然后置于转移缓冲液中。两张印迹滤纸将浸入转移缓冲液。所有均与余下的缓冲液置于4℃,直到形成凝胶。一旦完成SDS-PAGE,凝胶盒被去除并打开。加载印迹物质之后,印迹模块充满转移缓冲液,并将缓冲液小室中充满Nano纯化水。电流调节成170mA、30V,跑胶75分钟。从印迹三明治去除膜,并转移到盘内,覆盖阻断缓冲液,利用Fish凝胶(1.5mM KH2PO4,20mM Na2HPO4,134mM NaCl,2.7mM KCl,0.05%Tween-20利用0.25%Fish凝胶)ELISA洗涤。将膜留在阻断缓冲液中4℃过夜。1:4000稀释的助血清在20ml阻断缓冲液中制备。倒掉阻断缓冲液,加入猪血清稀释液,在室温摇动60分钟。倒掉猪血清稀释液并将膜在20ml ELISA洗涤液中洗涤10分钟,室温摇动。倒掉洗涤液,重复洗涤步骤两次,总共洗涤3次。最后一次洗涤步骤中,生物素-SP结合的Affinipure山羊抗猪IgG(Jackson Immuno Research)1:2000稀释在20ml封闭缓冲液中。最后的洗涤步骤之后,将山羊抗猪稀释液倒在膜上,室温保持60分钟。三个洗涤步骤如前所述重复。制备20ml封闭缓冲液中的1:2000稀释的链霉抗生物素Hrp(Zymed),倒在PVDF膜上,室温摇动60分钟。三个洗涤步骤再次重复。最后的洗涤步骤中,TMB膜过氧化物酶底物系统(KPL)通过在小盘中混合12.5ml TMB过氧化物底物,12.5ml过氧化物酶溶液B以及2.5ml TMB膜增强剂来制备。一旦完成洗涤,倒掉洗涤液,将膜浸入底物1分钟或直到获得所需辣根过氧化物酶颜色而没有强背景。干燥PVDF膜并在干净塑料布中覆盖,扫描western印迹的电子记录。
实施例9:定量实时PCR:定量实时PCR(qRT-PCR)用作比较抗体阻断AM结合和感染的能力的另一方法。用抗体和PRRSV如上所述感染并保温AM之后,洗涤细胞3次,去除细胞外非结合病毒和抗体-病毒复合体。收集AM,裂解,利用Qiagen病毒旋转试剂盒提取病毒RNA。提取物随后在Bio-Rad iCycler iQ上经过qRT-PCR(Tetracore)检测,与标准曲线比较。循环条件如下::1)RT步骤:52℃、1800秒2)酶活化步骤:95℃、900秒,3)3-步PCR:40个循环(从Tetracore推荐的50循环改变而来)(94℃、30秒,61℃、60秒,72℃、60秒)。
实施例10:在猪中产生抗PRRSV抗体对25-26周龄常规无PRRSV猪注射抗PRRSV PAD疫苗。每周评估两次来自每只猪的血清中ELISA可检测的抗PRRSV抗体,以及对肺泡巨噬细胞感染的抑制(Erdman)。如果没有达到合适的抗体水平每周两次对猪重复注射。暴露6-12周后处死猪,收集血液获得血清。相同年龄的20只猪将作为未受感染的对照并且作为正常猪血清的来源。
实施例11:马中抗PRRSV抗体的产生.两只马通过肌内注射接受在弗氏不完全佐剂中混合的PAD多肽然后接受CVA,每周两次持续8周。评估来自马的血清中肺泡巨噬细胞的感染抑制并进行Western印迹分析。正常马血清通过重复采样在CVA免疫之前收集。
实施例12:抗PRRSV PAD抗体的浓度.含有PRRSV抗体的血浆通过去沉淀除脂质和白蛋白,超滤浓缩到90%球蛋白浓度。
实施例13:评估抗PRRSV保护性抗体的攻击模型.切除子宫并不喂以初乳(Hysterectomy-derived,colostrums-deprived)(HDCD)的猪从Rexanne Struve实验室获得,年龄4-6小时。猪被喂以Esbilac奶替代品。在主要的组中,猪的奶替代品将补充由猪或马球蛋白,其中含有PRRSV PAD抗体。对照猪接受正常猪或马球蛋白,与主要组中的猪所接受的浓度相同。含有球蛋白的Esbilac在36周龄后不喂食。所有猪在3日龄经鼻内用PRRSV毒株HLV092攻击。每种受试制备物或组合物将在10只HDCD猪中评估,所述的猪与10只对照猪同时受到攻击。一半的猪被杀死并在攻击14天后验尸,收集组织(血液、肺、淋巴结、扁桃体)并通过qPCR和病毒分离检测PRRSV的存在。哨兵(sentinel)猪置于每组余下半数猪中,以确定攻击的猪是否能在随后的2周之内传播病毒。
实施例14:PRRSV阳性农场的野外试验:被选择的PRRSV阳性农场具有以下适宜死亡率–产崽率15-20%,喂哺率10-15%。每窝中的猪将随即分配到2组。在24小时龄之前口服给予浓缩的正常球蛋白(NG–第1组)和产生的抗PAD PRRSV Ab浓缩物(第2组),随后通过腹腔内注射基于ISU试验中半寿期给予。每组猪总数基于检测在产崽和喂哺方面而言死亡率降低10%所需的猪的数目。统计学软件(JMP5.1.2,SAS Institute,Inc.,Cary,N.C.)用于确定样品大小以比较两个独立组的比例。在可信度90%,需要672只动物(336每组)在显著性p<.05水平检测死亡率的10%差异(20%-10%)。为了以相同可信度及p水平检测死亡率的10%差异(15%-5%),需要536只动物(268每组)。死亡原因可通过完全尸检以及对样品进行qPCR来确定。
实施例15:统计学分析:收集的定量数据(病毒滴度,qPCR,抗体效价)将利用AVONA分析。比例的卡方检验用于分类数据(死亡率,%肺受累,PRRSV的存在或缺乏)。利用SAS统计学软件进行分析,显著程度设定为p≤0.05。
实施例16:来自实验室和猪研究的支持性数据
表4:FFN数据。在Marc145细胞上检验病毒中和。值表示显示中和活性的最高血清稀释度的倒数。猪(n=6每组)在第0天用伪对照、HLV013,或VR2332PRRSV毒株接种。第14天,HLV013组猪用HLV093加强(加强接种注射)。第42天dpi,仅仅HLV013组显示VN活性。所有组都在第90天用HLV092攻击。HLV013组的VN活性在针对同源和异源病毒检测的过程中持续增长。
*接种后天数
**攻击后天数
***未确定
我们对猪注射了无活性粗病毒抗原,包括从HLV013制备的GP5,M,和GP5-M异源二聚体,并与注射了商购灭活PRRS疫苗(Intervet)的猪比较二者的ELISA反应(图15)。HLV013与商购疫苗相比诱导快速且高抗体效价。
进行攻击研究,其中用活HLV013和VR2332接种受试猪,随后用PRRSV异源毒株(HLV092)攻击(表6)。结果表明保护作用可被两种病毒诱导;但是HLV013诱导抗性的产生似乎更快。试验1中,毒株HLV093在HLV013组中在用HLV013接种后28天检测。
一种接种获PRRSV的免疫方法如下:
步骤1–第1天对猪注射或HLV013(图10)
步骤2–第21天对猪注射或HLV093(图11)
步骤3–第42天对猪注射或HLV092(图12)
这些渐进性步骤免疫的猪产生针对PAD的所有保护性组分的抗体,由此产生针对大多数甚至全部目前主要的PRRSV北美分离株的异源保护作用。对动物注入HLV092一开始不会导致异源保护作用。为了抗欧洲分离株保护,需要利用欧洲聚糖类型的分离株的类似方案,例如激发或给予欧洲PRRSV毒株,其具有很少或不具有在GP5细胞外结构域的氨基酸31-39的糖基化。例如,对猪注射LV不诱导抗VR2332GP5蛋白抗体,并且不诱导针对LV的GP5以及GP5-M异源二聚体的抗体。
表7:本发明人对糖基化分型的发展根据本发明,北美和欧洲基因型中的PRRSV毒株根据其糖基化模式分组。该发现被发明人称为聚糖分型方法。与ORF5的序列同源性相比,聚糖分型是当新毒株出现在群体中时更为精确的发现异源PRRSV毒株的方法。本发明人认为糖基化模式的区分可用于单个或多价疫苗中或在免疫接种方案和策略的开发中。
PRRSV聚糖类型a | 预测的聚糖的数目b,c |
NA-0 | 0d |
NA-1 | 1 |
NA-2 | 2 |
NA-3 | 3 |
NA-4 | 4 |
NA-n | n |
EU-0 | 0 |
EU-1 | 1 |
EU-2 | 2 |
EU-3 | 3 |
EU-4 | 4 |
EU-n | n |
a–NA=北美,EU=欧洲
b–位于GP5细胞外结构域中聚糖的数目,排除位于NA毒株中aa44和51中以及EU毒株中aa46和53的高度保守的聚糖。当这些聚糖缺乏时,它们应如下记录:如果NA-1毒株缺乏aa44的聚糖,描述为NA-1(Δ44)。
c–随着预测的聚糖数目增加,对保护性(中和)抗体和/或对所述抗体的敏感性增加。
d–NA-0和EU-0被认为分别是所有NA和EU的亲本毒株。这些病毒应包含在内以产生交叉反应抗体。在、NA-0和EU-0之后,聚糖分型可作为异源性的预测物,而目前很少用聚糖分型定义PRRSV。
*该方法可用于其它RNA病毒。
表7a:来自HLV013接种的猪的FFN数据(两个高于表5中的情况)。血液在接种后42天收集。在Marc145细胞上检验病毒中和。值表示显示中和活性的最高血清稀释度的倒数。
表8:图16和表6-7中描述的用毒性PRRSV(HLV092)攻击猪的结果
治疗 | IP a严重度 | 病理 b | qPCR c |
对照–非-vacc | 4/5 | PLH:2轻度,1中度 | 5x107 |
Vacc-HLV013 | 0/5 | PLH:3轻度 | 0.00 |
Vacc-VR2332 | 0/5 | PLH:2轻度,3重度 | 0.00 |
a间质性肺炎(IP)肺评分>2(评分范围1-6)的猪的数目
b基于组织病理学,患轻度、重度或重度细支气管周淋巴系统增生(PLH)的猪的数目
c攻击后10天血清的定量PCR(平均病毒拷贝每ml)
表9:PRRSV ORF5测序:将核苷酸序列翻译成氨基酸序列1,预测N-糖基化位点2。仅显示前80个aa,但基因型相关性(百分比相似性)基于整个序列(200aa)。潜在的N-糖基化位点加下划线。
*相同基因型
1ExPASy-Translate Toolhttp://us.expasy.org/tools/dna.html
2NetNGlyc1.0Serverhttp://cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/
保藏
从申请日前至今,病毒HLV013,HLV092,HLV093和MN184的保藏物由Dr.DelbertHarris,Room45,Kildee Hall,Iowa State University,Ames,Iowa50011持有。保藏物可通过请求从专利商标部门及其指派的人员获取。如认可本发明的任何权利要求,申请人可请求ATCC提供至少25株冷冻或冻干的以下样品(每种1ml):HLV013,HLV092,HLV093,HLV094和MN184病毒,其与保藏在上文所述的Room45,Kildee Hall,Iowa State University中的样品相同。此外,申请人的保藏符合37C.F.R.§1.801-1.809的规定,包括保藏时鉴定样品存活力。这25株HLV013,HLV092,HLV093,HLV094和MN184保藏物的冷冻或冻干样品(每种1ml)将在公共保藏机构ATCC保藏30年或最近一次要求之后5年或专利实施期间中最长的一个,如果在该期间死亡则会进行替换。
Claims (4)
1.用于产生针对PRRS保护性效应的分离的多肽,包括:
包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基质蛋白(M蛋白)与PRRSV糖蛋白5(GP5)的异源二聚体的序列,其中所述GP5蛋白通过二硫键与所述M蛋白相连,其中所述二硫键由北美PRRSV毒株中位置9或EU PRRSV毒株中位置8的M蛋白中的半胱氨酸与北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置48或欧洲PRRSV毒株位置50的半胱氨酸之间形成的键所产生,其中所述位置9是从与SEQ ID NO:29的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置8是从与SEQ IDNO:42的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置48是从与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置50是从与SEQ ID NO:4的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,由此产生GP5-M异源二聚体。
2.产生针对PRRSV的抗体的方法,包括给予对象猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基质蛋白(M蛋白)与PRRSV糖蛋白5(GP5)的异源二聚体,其中GP5蛋白通过二硫键与M蛋白相连,其中二硫键由北美PRRSV毒株中位置9或EU PRRSV毒株中位置8的M蛋白中的半胱氨酸与北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置48或欧洲PRRSV毒株中位置50的半胱氨酸之间形成的键产生,其中所述位置9是从与SEQ ID NO:29的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置8是从与SEQ ID NO:42的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置48是从与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置50是从与SEQ IDNO:4的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,由此产生针对PRRSV的抗体。
3.异源二聚体在制备用于针对PRRSV进行接种的试剂盒中的用途,所述异源二聚体包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基质蛋白(M蛋白)与PRRSV糖蛋白5(GP5),其中GP5蛋白通过二硫键与M蛋白相连,其中二硫键由北美PRRSV毒株中位置9或EU PRRSV毒株中位置8的M蛋白中的半胱氨酸与北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置48或欧洲PRRSV毒株中位置50的半胱氨酸之间形成的键产生,其中所述位置9是从与SEQ ID NO:29的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置8是从与SEQ ID NO:42的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置48是从与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置50是从与SEQ ID NO:4的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,将所述异源二聚体给予对象而由此针对PRRSV进行接种。
4.疫苗,其包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基质蛋白(M蛋白)与PRRSV糖蛋白5(GP5)的异源二聚体,其中GP5蛋白通过二硫键与M蛋白相连,其中二硫键由北美PRRSV毒株中位置9或EU PRRSV毒株中位置8的M蛋白中的半胱氨酸与北美PRRSV毒株中GP5蛋白的位置48或欧洲PRRSV毒株中位置50的半胱氨酸之间形成的键产生,其中所述位置9是从与SEQ IDNO:29的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置8是从与SEQ ID NO:42的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置48是从与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行的序列比对所确定的,其中所述位置50是从与SEQ ID NO:4的氨基酸序列进行的序列比对所确定的。
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