JP2009506129A - 改善された免疫原性を有するprrsv抗原で動物を予防接種するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)主要表面タンパク質GP5の低グリコシル化された変異体に曝露したブタは、野生型(wt)又はグリコシル化されたGP5で免疫化したブタによって産生される中和抗体のレベルに比して、PRRSV中和抗体の産生を増強した。本発明は、PRRSVに対するブタにおける改善された免疫応答を得る方法、改善された免疫応答を得るのに有用な組成物、及びPRRSV主要表面タンパク質GP5の低グリコシル化されたバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
Description
関連出願の相互参照
本願は、2005年8月30日に出願された、米国仮特許出願第60/712,357号に対する優先権を主張する。
本願は、2005年8月30日に出願された、米国仮特許出願第60/712,357号に対する優先権を主張する。
連邦支援の研究又は開発に関する供述
本発明は、米国農務省からのNational Research Initiative Competitive Grant第2004−01576号の下で、及びNational Center for Research Resources Project第P20RR15636号のNational Institute of Health COBREプログラムの下で、政府の支援で実施された。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、米国農務省からのNational Research Initiative Competitive Grant第2004−01576号の下で、及びNational Center for Research Resources Project第P20RR15636号のNational Institute of Health COBREプログラムの下で、政府の支援で実施された。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
技術分野
本発明は、一般的には、改善された免疫原性を有するブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)抗原を含む組成物及びその使用のための方法に関する。本明細書に記載されている組成物及び方法は、PRRSV抗原に対するブタの改善された免疫原性反応をもたらし、従って、PRRSV感染に対する、ブタの改善された保護を与える。
本発明は、一般的には、改善された免疫原性を有するブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)抗原を含む組成物及びその使用のための方法に関する。本明細書に記載されている組成物及び方法は、PRRSV抗原に対するブタの改善された免疫原性反応をもたらし、従って、PRRSV感染に対する、ブタの改善された保護を与える。
PRRSVは、ブタを冒す経済的に重要な病原体である。PRRSVによる成熟雌ブタ及び雌ブタの感染は、生殖障害をもたらし得る。また、PRRSVは、全ての年齢のブタにおいて呼吸疾患を引き起こし得る。PRRSVによる感染からブタを保護するために、ブタにワクチンを接種することは可能である。しかしながら、現在市販されているワクチン(そのほとんどは、弱毒化生ワクチンである。)は、少々効果がなく、それゆえ改良されるべきである。PRRSVに対する保護の完全な免疫学的機序は不明であるが、PRRSV中和抗体がこの保護に対して中心的な役割を占めていることは明確に示されている。不運なことに、(野生型の形態にある)PRRSV自体又はこれから誘導された現在の生ワクチンは、タイミングよく、且つ効果的な(すなわち保護的な)レベルで、ウィルス特異的中和抗体を誘導する能力が乏しい。
(2002年12月31日、Calvertらによる)米国特許第6,500,662号「Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS)virus and uses thereof」は、感染性北米PRRSV cDNAクローンの開発及びワクチンとしてのその使用を記載する。しかしながら、米国特許第6,500,662号は、低グリコシル化されたPRRSV抗原を含むPRRSVワクチンを開示していない。
別の研究では、多様な北米PRRSV系由来のGP5タンパク質(又はORF5タンパク質)の配列が、互いに、及びレリスタッド系として知られる代表的な欧州PRRSV単離株と比較され、GP5コンセンサス配列のアスパラギン44(N44)及びアスパラギン51(N51)におけるN結合型グリコシル化部位が、検査されたPRRSV単離株全てにおいて保存されていることを明らかにした(Pirzadeh et al.,Can.J.Vet Res.,1998, 62:170−77)。しかしながら、GP5コンセンサス配列のアスパラギン31(N31)に位置するN−グリコシル化部位は、ある種の北米PRRSV単離株中には存在せず、及び欧州PRRSVレリスタッド系単離株中に存在しない。4つの北米PRRSV系及びレリスタッド系由来の組換えGST−GP5融合タンパク質が、不溶性封入体としてイー・コリ(E.coli)中で産生され、再生され、ウサギにおける免疫原として使用された。イー・コリ中で産生されたこのような組換えタンパク質は、その本来のN−グリコシル化部位を保持しているが、本部位をグリコシル化しない。
IAF−Klop北米PRRSV単離株のGP5遺伝子へのCMVプロモーター融合物を含むDNAワクチンをブタに接種することによって、免疫化された動物において、PRRSV曝露に対する保護が得られることも示されている(Pirzadeh and Dea,1998,J.General Virology,79, 989−999)。このGP5遺伝子単離株は、DNAワクチンで免疫化されたブタで発現されると、グリコシル化されると推定されるN31、N44及びN51アスパラギン残基を含有するGP5タンパク質をコードする。イー・コリによって産生されたGST−GP5(IAF−Klop系のGP5遺伝子の固有のN−グリコシル化部位を保持するが、本部位をグリコシル化しない。)によるブタのワクチン接種は、ウィルス曝露されたブタの肺を保護しなかった。
低グリコシル化されたPRRSVタンパク質の発現をもたらす変異を含有する欧州PRRSV感染性クローンも記載されている(Wissink et al.,2004,J.Gen.Virol.85:3715−23)。本参考文献は、PRRSVレリスタッド系GP(5)タンパク質のアスパラギン残基53(N53)部位のN結合型グリコシル化を防止する変異を前記部位に含有するPRRSVが感染性であること、及び感染性PRRSVレリスタッド系ウィルス粒子を産生できることを報告している。これに対して、N46の部位のN結合型グリコシル化を防止するPRRSVレリスタッド系GP(5)タンパク質のN46に変異を含有するPRRSVは、感染性ではなく、感染性PRRSVレリスタッド系ウィルス粒子を産生しない。Wissinkらは、欧州PRRSV GP2aタンパク質中のN−グリカン部位が、及び、その類推に基づき、GP5タンパク質のN53部位が、天然宿主中で、受容体相互作用又は免疫遮蔽を含むなどの多くの異なるレベルで作用し得ることを推測している。
PRRSV以外のウィルスでは、グリカン残基は、多様な役割に関与している。一般に、N結合型グリコシル化は、タンパク質の正確な折りたたみ、標的化及び生物活性のために重要である(Helenius,A.and M.Aebi.,Annu.Rev.Biochem.73:1019−1049, 2004.、Williams,D.B.and Glycoconj J.,12:iii−iv, 1995、Zhang,et al.,Glycobiology 14:1229−46, 2004)。外被に封入された多くのウィルスにおいて、外被タンパク質は、糖部分の付加によって修飾され、外被タンパク質のN結合型グリコシル化は、受容体結合、膜融合、細胞中への透過及びウィルス発芽等の、ウィルス糖タンパク質の多様な機能を担っている(Braakman,I.and E.van Anken,Traffic 1:533−9, 2000、Doms et al.Virology 193:545−62, 1993)。最近の研究は、タンパク質の折りたたみ及び細胞内輸送(Shi,X.and R.M.Elliott,J.Virol.78:5414−22, 2004)並びにインフルエンザウィルス赤血球凝集素(HA)タンパク質の生物活性及び抗原性(Abe,Y.,et al.,J.Virol.78:9605−11, 2004)における、ハンタンウィルスの糖タンパク質のN結合型グリコシル化の役割を示している。更に、ウィルス外被タンパク質のグリコシル化は、ウィルス中和抗体反応を回避、遮断又は最小化するために、幾つかの異なる、外被に封入されたウィルスによって使用されている、ウィルスの免疫回避及び持続のための主要なメカニズムであることが明白になってきた。この効果の例は、SIV(Reitter,J.N.et al.,Nat.Med.4:679−84, 1998)及びHIV−1(Wei,X et al.,Nature 422:307−12, 2003)、HBV(Lee,J.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.303:427−32, 2003)、インフルエンザ(Skehel,J.J.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1779−83, 1984)及びアルテリウィルスLDV(Chen,Z.et al.Virology 266:88−98, 2000)に関して報告されている。
発明の要旨
本発明は、上述の問題に照らして開発された。PRRSV主要表面タンパク質GP5の低グリコシル化されたバリアントが、野生型(wt)又はグリコシル化されたGP5で免疫化されたブタによって産生される中和抗体のレベルと比べて、免疫化されたブタによって産生されるPRRSV中和抗体のレベルを増大させたことが示されている。
本発明は、上述の問題に照らして開発された。PRRSV主要表面タンパク質GP5の低グリコシル化されたバリアントが、野生型(wt)又はグリコシル化されたGP5で免疫化されたブタによって産生される中和抗体のレベルと比べて、免疫化されたブタによって産生されるPRRSV中和抗体のレベルを増大させたことが示されている。
本発明は、第一に、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34又はアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化されたPRRSVGP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することを含む、前記ブタにおけるPRRSV抗原に対する改善された免疫応答を誘発する方法を提供する。前記方法のある実施形態において、配列番号1におけるアスパラギン34又はアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位は、不活化されている。このポリヌクレオチドは、感染性PRRSV RNA分子又は、感染性PRRSV RNA分子をコードするDNA分子を含み得る。感染性PRRSV RNA分子は、北米PRRSV誘導体又は欧州PRRSV誘導体である。あるいは、本ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが低グリコシル化されたGP5タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドへ作用可能に連結されたDNA分子を含み得る。本プロモーターは、本発明のある好ましい実施形態において、CMVプロモーターである。あるいは、本ポリヌクレオチドは、ウィルスベクターであり得る。使用できる代表的なウィルスベクターは、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びTGEVベクターを含む。
配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34又はアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドを得るために、PRRSV配列の多様な種類及び源を使用することが可能である。本発明のある実施形態において、低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドは、直接的な合成、北米PRRSV単離株GP5ヌクレオチド配列の変異誘発又はコンセンサス北米PRRSV GP5ヌクレオチド配列の変異誘発によって得られる。北米PRRSV単離株GP5ヌクレオチド配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13のGP5タンパク質をコードするヌクレオチドの群から選択できる。コンセンサス北米PRRSV GP5ヌクレオチド配列は、配列番号14と少なくとも85%同一であるコンセンサスGP5タンパク質をコードする。本発明の他の実施形態において、低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドは、直接的な合成、欧州PRRSV単離株GP5ヌクレオチド配列の変異誘発又はコンセンサス欧州PRRSV GP5ヌクレオチド配列の変異誘発によって得られる。欧州PRRSV単離株GP5ヌクレオチド配列は、配列番号15と少なくとも85%同一であるGP5タンパク質をコードする。
本発明の方法を効果的に実施するために、特定されたN結合型グリコシル化部位を不活化する多様な方法を使用することが可能である。アスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位を不活化するための好ましい方法の1つは、アスパラギンコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することである。この置換コドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードすることができる。より好ましい実施形態において、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている。他の実施形態において、アスパラギン34に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化されている。このアスパラギン34のN結合型グリコシル化部位は、該アスパラギン34をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化できる。別のアミノ酸をコードするコドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードすることができる。他の好ましい実施形態において、参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位の両者は、アスパラギン34及びアスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化することができる。アスパラギン34及びアスパラギン51をコードする両コドンは、それらのグリコシル化部位を不活化するために、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードするコドンと置換することができる。あるいは、両グリコシル化部位を不活化するために、両コドンは、アラニン残基をコードするコドンと置換することができる。あるいは、他の技術によって、他のN結合型グリコシル化部位を不活化しながら、前記アスパラギン34又は前記アスパラギン51をコードする1つのコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって、N結合型グリコシル化部位の1つが不活化される。
好ましい実施形態において、前記方法は、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34又はアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアントタンパク質をコードする北米PRRSV誘導体である感染性PRRSVRNA分子を使用する。より好ましい実施形態において、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位の両者が、不活化されている。参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位の両者は、アスパラギン34及びアスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化することができる。アスパラギン34及びアスパラギン51をコードする両コドンは、それらのグリコシル化部位を不活化するために、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードするコドンで置換することができる。あるいは、両コドンは、そのグリコシル化部位を不活化するために、アラニン残基をコードするコドンと置換することができる。
この方法を実施するため、前記ポリヌクレオチドを含有する組成物は、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、非経口注射、筋肉内注射、無針注射、電気穿孔法、経口送達、鼻内送達、口腔鼻送達又はこれらの何れかの組み合わせによって投与される。投与される組成物は、治療上許容される担体を更に含み得る。この治療上許容される担体は、タンパク質、緩衝液、界面活性剤及びポリエチレングリコールポリマー又はこれらの何れかの組み合わせからなる群より選択される。
投与される組成物は、アジュバントを更に含み得る。このアジュバントは、水酸化アルミニウム、キルA、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア及びCpGオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせであり得る。投与される組成物は、インターロイキン1(IL−1)、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−12、ガンマインターフェロン(g−IFN)、細胞壊死因子、MDP(ムラミルジペプチド)、免疫賦活薬複合体(ISCOM)及びリポソーム等の第二のアジュバントも含み得る。
PRRSV抗原に対するブタの改善された免疫応答は、該ブタによるPRRSV中和抗体の増大した産生を含み得る。典型的には、本発明の方法及び組成物によるブタの免疫化に際して、PRRSV中和抗体の増大した産生が観察される。改善された免疫応答は、成熟雌ブタ、雌ブタ、成熟雄ブタ又は仔ブタにおいて得られ得る。
本発明は、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34又はアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が該ブタに対して不活化されている低グリコシル化されたPRRSVGP5ポリペプチドバリアントを含む組成物を投与することを含む、PRRSV抗原に対する、ブタにおける改善された免疫応答を誘発する方法も提供する。低グリコシル化されたPRRSVGP5ポリペプチドバリアントタンパク質は、上述の方法で使用された同一のポリヌクレオチドによって、細菌、酵母又は哺乳動物発現系中で産生され得る。
本発明は、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米PRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドと、治療上許容される担体とを含む組成物も提供する。ある実施形態において、前記組成物は、配列番号1におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応するN結合型両グリコシル化部位が不活化されている、ポリヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、本組成物は、感染性北米PRRSVRNA分子又は感染性北米PRRSVRNA分子をコードするDNA分子の何れかを含み得る。他の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、低グリコシル化された北米PRRSVGP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドへ作用可能に連結されているDNA分子を含む。ある実施形態において、このプロモーターはCMVプロモーターである。更に他の実施形態において、前記組成物中のポリヌクレオチドは、ウィルスベクターを含む。前記組成物中で使用できるウィルスベクターは、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びTGEVベクターの何れか1つであり得る。
前記組成物のポリヌクレオチドにおいて、N結合型グリコシル化部位は、アスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化される。アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードする。本組成物の他の実施形態において、さらなるN結合型グリコシル化部位は、アスパラギン34をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化される。別のアミノ酸をコードする本コドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードすることができる。従って、本願によって、配列番号1の北米参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応する前記N結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている低グリコシル化された北米PRRSVGP5ポリペプチドバリアントタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む好ましい組成物が提供される。N結合型グリコシル化部位の両者は、アスパラギン34及びアスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化することができる。アスパラギン以外のアミノ酸をコードするこれらのコドンは、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする。
前記組成物中で使用される治療上許容される担体は、タンパク質、緩衝液、界面活性剤、及びポリエチレングリコールポリマー又はこれらの何れかの組み合わせであり得る。前記組成物は、少なくとも1つのアジュバントを更に含む。このアジュバントは、水酸化アルミニウム、キルA、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア及びCpGオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせであり得る。前記組成物は、更に、インターロイキン1(IL−1)、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−12、ガンマインターフェロン(g−IFN)、細胞壊死因子、MDP(ムラミルジペプチド)、免疫賦活薬複合体(ISCOM)及びリポソームからなる群から選択される第二のアジュバントも含み得る。
配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米PRRSV GP5ポリペプチドバリアントと、治療上許容される担体とを含む組成物も、本発明によって提供される。好ましい実施形態において、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34又はアスパラギン51の両者に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化されている。低グリコシル化されたPRRSVGP5ポリペプチドバリアントタンパク質は、上述の方法において使用される同一のポリヌクレオチドによって、細菌、酵母、又は哺乳動物発現系中で産生され得る。
本発明は、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米PRRSVGP5ポリペプチドバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。ある実施形態において、配列番号1におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応するN結合型両グリコシル化部位が不活化されているポリヌクレオチドが提供される。好ましい実施形態において、この単離されたポリヌクレオチドは、感染性北米PRRSVRNA分子又は感染性北米PRRSVRNA分子をコードするDNA分子の何れかを含み得る。他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、低グリコシル化された北米PRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドへ作用可能に連結されたDNA分子を含む。ある実施形態において、このプロモーターはCMVプロモーターである。更に他の実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ウィルスベクターを含む。前記組成物中で使用できるウィルスベクターは、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びTGEVベクターの何れか1つであり得る。
単離されたポリヌクレオチドにおいて、N結合型グリコシル化部位は、アスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンで置換することによって不活化される。アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードする。他の好ましい実施形態において、更なるN結合型グリコシル化部位は、アスパラギン34をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化される。別のアミノ酸をコードする本コドンは、アラニン又はグルタミン残基をコードすることができる。従って、低グリコシル化された北米PRRSVGP5ポリペプチドバリアントタンパク質をコードし、配列番号1の北米参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている好ましいポリヌクレオチドが提供される。N結合型グリコシル化部位の両者は、アスパラギン34及びアスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化することができる。アスパラギン以外のアミノ酸をコードするこれらのコドンは、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする。
本発明は、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米PRRSVGP5ポリペプチドバリアントである単離されたポリペプチドも提供する。単離した低グリコシル化されたPRRSVGP5ポリペプチドバリアントタンパク質は、上述の方法において使用される同一のポリヌクレオチドによって、細菌、酵母又は哺乳動物発現系中で産生し、クロマトグラフィー又は他の技術によって精製することができる。
本発明の更なる特徴及び利点並びに本発明の多様な実施形態の構造及び操作は、添付の図面を参照しながら、以下に詳しく記載されている。
図面の簡単な説明
添付の図は、明細書に組み入れられ、明細書の一部を形成し、本発明の実施形態を説明し、明細書とともに、本発明の原理を説明するために役立つ。
添付の図は、明細書に組み入れられ、明細書の一部を形成し、本発明の実施形態を説明し、明細書とともに、本発明の原理を説明するために役立つ。
図1は、PRRSV GP5及びMタンパク質の一過性発現を示す。A.脳心筋炎ウィルスからIRES(IE)に隣接するGP5及びMコード領域を示すバイシストロン性構築物の模式図。コード領域は、GP5コード領域のすぐ上流に存在するT7 RNAポリメラーゼプロモーター(黒四角)の調節下にある。折れ曲がった矢印は、ベクターからのT7 RNAポリメラーゼによる転写の位置及び方向を示す。B.バイシストロン性ベクターによって形質移入された細胞におけるGP5及びMタンパク質の発現。偽の形質移入した細胞(レーン1)又はプラスミドを形質移入した細胞(レーン2ないし7)を材料及び方法に記載されているとおりに放射性標識し、抗Gp5抗体(レーン1ないし5)又は抗M抗体(レーン6ないし7)で免疫沈降させた。免疫沈降されたタンパク質は、未処理のままとし(−)(レーン1、2、6、及び7)、又はEndo H(レーン3)、PNGaseF(レーン4)で処理し(+)、電気泳動によって分析した。レーン5は、ツニカマイシンで処理された、(+)形質移入された細胞から免疫沈降したタンパク質を含有する。キロダルトンにおける相対的な分子量(Mr)を有するタンパク質の移動度を示す。
図2は、WT−GP5及びバイシストロン性プラスミドを有するその変異体のグリコシル化分析を示す。A.バイシストロン性ベクター、及びアミノ酸位置34、44及び51における3つのグリコシル化候補部位を有するPRRSV GP5の示される模式図。B.本研究で使用される多様な変異体。C.wt及びGP5変異体の発現及びEndo Hに対するそれらの感受性。実験は、図1に対する説明文に記載のとおり実施し、タンパク質を抗GP5抗体で免疫沈降させ、Endo Hde消化する(+)か又は未消化のままにし(−)、電気泳動によって分析した。GP5変異体タンパク質を矢頭によって示す。キロダルトンにおける相対的な分子量(Mr)を有するタンパク質の移動度を右に示す。
図3は、GP5変異体をコードする変異体ウィルスの特徴づけを示す。A.MARC−145細胞中でのwt(FL−12)及び多様なPRRSV変異体の単一段階の増殖動態。6ウェル中に播種した細胞を、3の感染効率でPRRSVに感染させ、感染後の示される時点で培養上清を回収し、ウィルス力価を測定した。3つの独立した実験から、標準偏差(誤差バー)とともに平均力価を示す。B.変異体ウィルスのプラーク形態。開いた矢印及び矢頭は、ほとんど透明ではないプラークを示す。C.PRRSV変異体を回収するトランス相補性。wt GP5タンパク質を発現させる細胞からの変異体ウィルス回収物の定量分析。3つの独立した実験からのウィルスの平均収量を、(誤差バーによって表される)標準偏差とともに示す。
図4は、変異体ウィルス粒子中へ組み込まれ、変異体ウィルスで感染した細胞中で合成したGP5の検査を示す。A.感染した細胞の培養上清からの放射性標識したウィルス粒子を免疫沈降させ、Endo Hで処理し(+)又は処理せず(−)に、電気泳動によって分析した。レーン1及び2では、Endo H消化されたGP5及びEndo H消化さていないGP5が白括弧によって示されている。B.多様な変異体ウィルスで感染した細胞を放射性標識し、GP5を免疫沈降させ、Endo Hで処理し(+)、又は処理せず(−)に、電気泳動によって分析した。レーン2及び3におけるEndo H消化した及びしていないGP5を白括弧により示す。キロダルトンで示された相対的な分子量(Mr)を有するタンパク質の移動度を、各パネルの右側に示す。
図5は、北米PRRSV GP5のn末端アミノ酸配列と、北米PRRSV GP5参照n末端配列(配列番号1、NVSL97−7895系)との配列比較を示す。200個のアミノ酸のタンパク質を並置した最初の60個のN末端アミノ酸を示す。前記タンパク質中のアスパラギン34「NSS」及びアスパラギン51「NGT」のN結合型グリコシル化部位を太字で示す。参照GP5タンパク質の残基29と残基35の間に存在する他のN結合型グリコシル化部位に下線が付されている。
図6は、欧州PRRSV GP5 N末端アミノ酸配列と北米PRRSV GP5参照n末端配列(配列番号1、NVSL97−7895系)との配列比較を示す。約200個のアミノ酸タンパク質の完全なGP5タンパク質の並置を示しており、ここで、前記タンパク質中のアスパラギン51「NGT」N結合型グリコシル化部位を太字で示す(すなわち、配列番号15中のアスパラギン53)。
定義
本明細書で使用される「許容される担体」とは、組成物の他の成分に対して有害ではなく、及び適用されるべき材料に対して有害ではない担体を指す。「治療上許容される担体」とは、組成物の他の成分に対して有害ではなく、及びヒト又は他の動物のレシピエントに対して有害ではない担体を指す。組成物の他の成分に関して、「有害ではない」とは、前記担体が、他の成分と反応せず、又は他の成分を分解せず、又はその他それらの有効性を妨害しないことを意味する。成分の有効性の妨害は、成分の単なる希釈を包含しない。動物との関連で、「有害ではない」とは、前記担体が、植物又は動物に対して傷害を与えず、又は致死的ではないことを意味する。
本明細書で使用される「許容される担体」とは、組成物の他の成分に対して有害ではなく、及び適用されるべき材料に対して有害ではない担体を指す。「治療上許容される担体」とは、組成物の他の成分に対して有害ではなく、及びヒト又は他の動物のレシピエントに対して有害ではない担体を指す。組成物の他の成分に関して、「有害ではない」とは、前記担体が、他の成分と反応せず、又は他の成分を分解せず、又はその他それらの有効性を妨害しないことを意味する。成分の有効性の妨害は、成分の単なる希釈を包含しない。動物との関連で、「有害ではない」とは、前記担体が、植物又は動物に対して傷害を与えず、又は致死的ではないことを意味する。
本明細書で使用される「アジュバント」とは、免疫応答を誘導する抗原の能力を亢進させる、前記抗原とともに使用される全ての材料を指す。
本明細書で使用される「投与」とは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド又はそれらの組成物を対象へ提供する全ての手段を指す。投与手段の非限定的な例は、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、非経口注射、筋肉内注射、無針注射、電気穿孔法、経口送達、鼻内送達、口腔鼻送達又はこれらの何れかの組み合わせを含む。
本明細書で使用される「抗原」とは、宿主中に免疫応答を誘導する全ての実体を指す。
本明細書で使用される「コンセンサス配列」とは、2つ又はそれ以上の相同的な配列を並置し、共通のアミノ酸、DNA又はRNA配列に対応する新たな配列を誘導することによって作製されるアミノ酸、DNA又はRNA配列を指す。
本明細書で使用される「低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアント」とは、生じたGP5変異タンパク質中のN結合型グリコシル化部位の数が減少するように、1つ又は以上のN結合型グリコシル化部位を含む、元のアミノ酸又は非バリアントアミノ酸配列が変化されているPRRSV GP5タンパク質を指す。この定義の下では、グリコシル化部位の同一数を含有する元のGP5配列を有するGP5タンパク質を産生するために、元のGP5タンパク質又は非バリアントGP5タンパク質をイー・コリ(E.coli)中で発現させても、低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアントの産生をもたらさない。
本明細書で使用される「免疫応答」とは、特定の抗原に結合し、分解し又はその他阻害する抗体及び/又は(Tリンパ球等の)細胞の産生を指す。「改善された免疫応答」等の関連する語は、免疫化された宿主の抗原に対する反応において、何らかの測定可能な改善をもたらす方法及び組成物の使用を指す。例えば、免疫応答における測定可能な改善は、改善された免疫応答を与える構造的修飾を欠如する抗原で免疫化された対照動物において観察される産生のレベルに対する、中和抗体の増大した産生(すなわち、増大した抗体力価)を含むが、これに限定されるわけではない。
「感染性RNA分子」とは、許容的宿主細胞中に導入されたときに、機能的なウィルス粒子の産生のための全ての必要な要素をコードするRNA分子を指す。
本明細書で使用される「感染性クローン」とは、感染性RNA分子をコードするDNA分子を指す。
本明細書で使用される「北米PRRSV」とは、以下に限定されるわけではないが、NVSL97−7895系(Truong et al,Virology,325:308−319及びこれに含有される参考文献)又は、(Pirzadeh et al.Can.J.Vet Res,62:170−177及びこれに含有される参考文献に記載されている)IAF−Klop、MLV、ATCC VR−2332、ATCC VR−2385、IAF−BAJ、IAF−DESR、IAF−CM、IAF93−653、IAF93−2616、IAF94−3182IAF94−287系等の北米PRRSV単離株と関連するポリヌクレオチド配列を含む全てのPRRSVを指す。本発明において、北米PRRSV単離株と関連するポリヌクレオチド配列を含むPRRSVは、GP5コード領域が、配列番号1と少なくとも85%のタンパク質配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含有するPRRSVである。
本明細書で使用される「欧州PRRSV」とは、以下に限定されるわけではないが、レリスタッド系等の、北米PRRSV単離株と関連するポリヌクレオチド配列を含む全てのPRRSVを指す(Wissink et al.,J.Gen.Virol.85:3715, 2004及びこれに含有される参考文献)。本発明において、欧州PRRSV単離株と関連するポリヌクレオチド配列を含むPRRSVは、GP5コード領域が、配列番号15と少なくとも85%のタンパク質配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含有するPRRSVである。
本明細書で使用される「%同一性」とは、2つの最適に並置されたDNA、RNA又はタンパク質セグメントの規定された長さの中で同一である配列中の要素(すなわちアミノ酸又はヌクレオチド)の数を指す。「%同一性」を算出するために、同一の要素の数を、並置されたセグメントの所定の長さ中の要素の総数によって除し、100を乗じる。同一性%が、タンパク質に関して使用される場合には、ある種のアミノ酸残基は同一でなくてもよいが、それにも関わらず、類似の化学的特性(例えば、酸性又は塩基性残基、疎水性残基、親水性残基、水素結合のドナー又はアクセプター残基)を有するアミノ酸残基の置換を反映する保存的アミノ酸置換であることが理解される。このような置換は、分子の機能的特性を変化させない場合があり得る。その結果、保存的置換を説明するために、タンパク質配列の%同一性を増加させることが可能である。
序論
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)糖タンパク質5(GP5)は、最も豊富な外被糖タンパク質であり、インビボでの中和抗体の主要な誘導因子である。N結合型グリコシル化部位と推定される3つの部位(N34、N44、及びN51)が、GP5外部ドメインに存在し、該ドメイン中には、主要な中和エピトープも存在する。グリコシル化部位と推定されるこれらの部位の何れがPRRSVのライフサイクル及び中和抗体の誘導におけるグリカン部分の役割に使用されるかを決定するために、本発明者は、これらの部位に単一及び複数のアミノ酸置換を含有するGP5変異体のパネルを作製した。野生型(wt)及び変異体タンパク質の一過性発現及びその後の生化学的研究は、成熟GP5が、3つの部位全てに高濃度マンノース型の糖部分を含有することを明らかにした。その後、感染性PRRSVを回収するために、これらの変異は完全長のcDNAクローン中に取り込まれた。本発明者らの結果は、N44残基を含む変異が、感染性子孫の産生をもたらさなかったことを示し、N44が、ウィルス感染性のための最も重要なアミノ酸残基であることを示唆する。N34、N51及びN34/51に変異を有するウィルスは、wtPRRSVよりも低い力価になり、MARC145細胞において低下した細胞変性効果を示した。血清中和アッセイにおいて、変異体ウィルスは、wt PRRSV特異的抗体による中和に対して増強された感受性を示した。更に、変異体ウィルスをブタに接種すると、wtPRRSV及び変異体に対する中和抗体の有意により高いレベルが誘導され、従って、GP5の外部ドメイン中のグリカン残基の喪失は、近くの中和エピトープの免疫原性及びインビトロでの中和に対するこれらのウィルスの感受性の両者を強化することが示唆された。これらの結果は、増強された保護的効力のPRRSVワクチンを開発するために多大な重要性を有するはずである。
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)糖タンパク質5(GP5)は、最も豊富な外被糖タンパク質であり、インビボでの中和抗体の主要な誘導因子である。N結合型グリコシル化部位と推定される3つの部位(N34、N44、及びN51)が、GP5外部ドメインに存在し、該ドメイン中には、主要な中和エピトープも存在する。グリコシル化部位と推定されるこれらの部位の何れがPRRSVのライフサイクル及び中和抗体の誘導におけるグリカン部分の役割に使用されるかを決定するために、本発明者は、これらの部位に単一及び複数のアミノ酸置換を含有するGP5変異体のパネルを作製した。野生型(wt)及び変異体タンパク質の一過性発現及びその後の生化学的研究は、成熟GP5が、3つの部位全てに高濃度マンノース型の糖部分を含有することを明らかにした。その後、感染性PRRSVを回収するために、これらの変異は完全長のcDNAクローン中に取り込まれた。本発明者らの結果は、N44残基を含む変異が、感染性子孫の産生をもたらさなかったことを示し、N44が、ウィルス感染性のための最も重要なアミノ酸残基であることを示唆する。N34、N51及びN34/51に変異を有するウィルスは、wtPRRSVよりも低い力価になり、MARC145細胞において低下した細胞変性効果を示した。血清中和アッセイにおいて、変異体ウィルスは、wt PRRSV特異的抗体による中和に対して増強された感受性を示した。更に、変異体ウィルスをブタに接種すると、wtPRRSV及び変異体に対する中和抗体の有意により高いレベルが誘導され、従って、GP5の外部ドメイン中のグリカン残基の喪失は、近くの中和エピトープの免疫原性及びインビトロでの中和に対するこれらのウィルスの感受性の両者を強化することが示唆された。これらの結果は、増強された保護的効力のPRRSVワクチンを開発するために多大な重要性を有するはずである。
中和抗体は、PRRSVに対する保護と大きな相関があることが知られている。本発明者らは、PRRSV GP5タンパク質中のグリコシル化部位の除去が、(1)修飾されたPRRSV系がPRRSV回復期抗血清によって中和される能力、及び(2)ブタに接種するために使用された場合に、この修飾されたPRRSV系がPRRSV中和抗体の前例のないレベルを生じる能力の有意な亢進をもたらすことを発見した。PRRSV感染に対して免疫化するために使用される全ての生の(wt又は弱毒化された)ウィルスに対してこの概念を適用することは、PRRSV感染に対する効果的な保護を付与するために使用する上で、多大な影響を有する。
現時点で、(1)弱毒化された生ワクチン、(2)(試験管内で増殖され、化学的に不活化されたwt PRRSVに基づいた)不活化されたワクチン、及び(3)群れの全ての動物に対して、体系的様式で、目的を定めて病原性wtPRRSVでの感染を使用するという、PRRSV感染に対して免疫化するための3つの主要なアプローチが存在する。これら3つの方法のうちの何れが最も効果的であるかにについての考察及び論議は数多く存在する。本発明は、免疫化のために使用されるアプローチに関わらず、有益である。PRRSVのタンパク質のグリコシル化レベルを修飾するための生PRRSVの遺伝的変化は、弱毒化されたPRRSVワクチン系、又は不活化したワクチンを作製するために使用されるwtPRRSV系、又は大量感染による集団の直接的な接種に使用されるwt PRRSV系の何れかで実施できる。
PRRSVは、ウマ動脈炎ウィルス(EAV)、乳酸脱水素酵素ウィルス(LDV)、及びサル出血熱ウィルス(SHFV)も含むニドウィルス目内のアルテリウィルス科に属する。ウィルスゲノムは、約15.0kb長の正の螺旋状直鎖RNA分子であり、5’末端にキャップ構造を、3’末端にポリ(A)尾部を有する。8個の翻訳領域(ORF)が、前記ウィルスゲノム中でコードされている。最初の2つの翻訳領域(ORF1a及びORF1ab)は、ポリタンパク質の加工並びにゲノムの転写及び複製に関与する非構造性(NS)ウィルスポリタンパク質をコードする。ORF2ないし7中にコードされるウィルス構造タンパク質は、5’末端に共通のリーダー配列を有するmRNAの3’共末端入れ子状セットとして合成される、6個のサブゲノムのキャップ及びポリアデニル化されたmRNAから発現される。主要なウィルス外被タンパク質は、糖タンパク質5(GP5)であり、これは、ウィルスゲノムのORF5中にコードされている。GP5は、大きさが約25kDaのグリコシル化された膜通過タンパク質である。GP5は、推定上のN末端シグナルペプチドを有し、成熟タンパク質の最初の40残基を含む小さな外部ドメイン中に位置する3つのN結合型グリコシル化部位の候補を有する。EAV及びLDVでは、主要な外被糖タンパク質は、ORF6遺伝子産物であるウィルスマトリクス(M)タンパク質とジスルフィド結合されたヘテロ二量体を形成する。PRRSVGP5とMタンパク質との間で同様の相互作用が観察されているが、相互作用の様式はまだ定義されていない。GP5及びMタンパク質のヘテロ二量体の形成が、感染性PRRSVの重合において重大な役割を担っている可能性があると推測されている。ウィルスの重合における役割に加え、GP5は、感受性宿主細胞中へのウィルスの侵入に関与すると思われる。GP5は、PRRSVに対する生体内での標的細胞であるブタ肺胞マクロファージ(PAM)中に侵入するための宿主細胞受容体であるシアロアドヘシンと相互作用すると推測されている。受容体認識におけるGP5の役割は、N末端外部ドメイン中の主要な中和エピトープの存在によって裏付けられ、従って、感染過程におけるGP5外部ドメインに関する中心的な役割を示唆する。
GP5外部ドメインのN結合型グリカンは、タンパク質の適切な機能性のために不可欠であり得る。N結合型グリコシル化は、一般的に、タンパク質の正確な折りたたみ、標的化及び生物活性にとって重要である。多くの封入されたウィルスにおいて、外被タンパク質は、糖部分の付加によって修飾され、外被タンパク質のN結合型グリコシル化は、受容体結合、膜融合、細胞への浸透及びウィルス出芽等のウィルス糖タンパク質の多岐にわたる機能を担う。最近の研究は、タンパク質の折りたたみ及び細胞内輸送、並びに赤血球凝集素(HA)タンパク質の生物活性及び抗原性における、ハンタンウィルス糖タンパク質のN結合型グリコシル化の役割を示してきた。更に、ウィルス外被タンパク質のグリコシル化が、ウィルス中和抗体反応を回避し、遮断し又は最小化するために、外被に封入された幾つもの異なるウィルスによって使用されているウィルスの免疫回避及び持続のための主要なメカニズムであることが明白になってきた。この効果の例は、SIV及びHIV−1、HBV、インフルエンザに関して報告されており、更に重要なことに、PRRSV、アルテリウィルスLDVの事例で報告されている。
近年、PRRSVに対する逆遺伝子系の開発が、本発明者を含む幾つもの研究室から報告されている。明らかに、感染性クローンを用いた変異性研究によって、アルテリウィルスのウィルスゲノムの転写及び複製機序がよりよく理解されるに至った。従って、生体内で感染性ウィルスを発生させ又は中和抗体を惹起させる上での、PRRSVのGP5の生物活性におけるN結合型グリコシル化の重要性を検討するために、本発明者らは、個別に又は多様な組み合わせで、N結合型グリコシル化候補部位の各々が変異されたGP5変異体タンパク質の系列を構築した。グリコシル化パターン、実験での接種を通じた、感染性ウィルス回収における役割及びwt PRRSVに対して又は変異体ウィルスに対して生じた抗体による交差中和における役割に関して、得られた変異体タンパク質を調べた。本データは、3つのグリコシル化候補部位が全て、高濃度マンノース型グリカンでのグリコシル化のために使用され、残基44でのGP5タンパク質のグリコシル化が、感染性PRRSVの回収にとって不可欠であることを示す。極めて重要なことに、中和及び抗体反応研究から得られた本発明者らのデータは、他のウィルスに対してすでに記載されているとおり、PRRSVによる天然の感染がグリカン遮蔽メカニズムを基礎とした免疫回避を伴い得、従って、PRRSVに感染した動物で観察される、あまり有効であない保護的液性免疫応答を説明するために役立ち得ることを示す。
N結合型グリコシル化部位及び不活化方法
糖タンパク質におけるN結合型グリコシル化は、典型的に、Asn−Xaa−Ser/Thr(NXS/T)配列(式中、Xaa(X)は、Pro以外の何れかのアミノ酸残基である。)に生じる。多様な変異が、N結合型グリコシル化部位に導入されて、それらの不活化を付与することができる。不活化の好ましい方法は、アスパラギン残基を、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸をコードする残基で置換することを含む。本発明のより好ましい実施形態において、アスパラギン残基は、アラニン又はグルタミン残基で置換される。
糖タンパク質におけるN結合型グリコシル化は、典型的に、Asn−Xaa−Ser/Thr(NXS/T)配列(式中、Xaa(X)は、Pro以外の何れかのアミノ酸残基である。)に生じる。多様な変異が、N結合型グリコシル化部位に導入されて、それらの不活化を付与することができる。不活化の好ましい方法は、アスパラギン残基を、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸をコードする残基で置換することを含む。本発明のより好ましい実施形態において、アスパラギン残基は、アラニン又はグルタミン残基で置換される。
N結合型グリコシル化部位、特に配列番号1のGP5参照タンパク質のアスパラギン34及び/又は51に対応するN結合型グリコシル化部位を不活化する他の方法も、本明細書で想定される。Xaa位置のプロリン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸又はロイシン等の特定のアミノ酸の置換も、N結合型グリコシル化部位を不活化するために使用することができる(Kasturi et al.,Biochem J.323(2):415−9, 1997)。あるいは、N結合型グリコシル化部位の最終ヒドロキシアミノ酸位置(すなわち、NXS/T配列のセリン又はスレオニン残基)を、何れかの非ヒドロキシアミノ酸(すなわち、セリン又はスレオニン以外の何れかのアミノ酸)と置換することも、N結合型グリコシル化部位を不活化するために使用することができる。N結合型グリコシル化部位を不活化するために使用される非ヒドロキシアミノ酸の例は、システインを含む(Kasturi et al.,J.Biol.Chemistry 270(24), 14756−14761, 1995)。
アミノ酸置換に加え、アミノ酸の挿入又はアミノ酸の欠失等のN結合型グリコシル化部位を不活化する変異の他の種類も、本発明によって想定される。当業者は、N結合型グリコシル化部位が、NXS/T配列中の中心的アミノ酸(すなわち、アスパラギン残基)を除去して、当該グリコシル化部位の不活化をもたらす欠失によって容易に不活化できることを理解する。X残基又はセリン/スレオニン残基の欠失は、S残基又はT残基の後に、天然に存在する配列中の別のS残基又はT残基が続かないある種のN結合型グリコシル化部位を同様に不活化することができる。Xが、非ヒドロキシアミノ酸である(すなわち、セリンでもスレオニンでもない)場合には、N残基のカルボキシ末端に何れかのアミノ酸残基を挿入することによって、N結合型グリコシル化部位を不活化することができる。X残基のカルボキシ末端に何れかの非ヒドロキシアミノ酸を挿入することによっても、N結合型グリコシル化部位を不活化することができる。
要約すれば、本発明を実施するために使用される変異の重要な特徴は、変異が、GP5タンパク質中のアスパラギン34及び/又はアスパラギン51の部位におけるN結合型グリコシル化を不活化することであることが理解される。理論によって限定されるものではないが、これらの変異の重要な特徴は、タンパク質のある種の領域(すなわち、配列番号1のGP5参照タンパク質中のアスパラギン34及び/又はアスパラギン51の部位に対応する残基)におけるグリコシル化を防止することであると考えられる。これらの部位でグリコシル化を防止することによって、野生型ウィルスの重要なエピトープを通常遮蔽している糖残基が除去され、したがって、免疫応答の改善が誘発可能となる。その結果、同定されたN結合型グリコシル化部位を不活化するために、及び改善された免疫応答を誘発する抗原を取得するために、変異の多くの異なる種類(すなわち、アミノ酸の置換、挿入又は欠失)を使用できることが期待される。
本発明のPRRSVポリヌクレオチド及びポリペプチドの説明
本発明の方法は、多様な異なる源から誘導され得る多様な異なるポリヌクレオチドを用いて実施することができる。ポリヌクレオチドの全ての共通した特徴は、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34、アスパラギン51、又はアスパラギン34とアスパラギン54の両者に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化されている、低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードすることである。配列番号1の参照GP5タンパク質中のアスパラギン34及びアスパラギン54に対応するN結合型グリコシル化部位を同定するために、非変異体及び正常にグリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチド配列を、配列番号1の参照GP5タンパク質と並置することが可能である。このような並置の例は、図5及び6に示される。本配列比較において使用される具体的な配列が、表1に記載されている。
本発明の方法は、多様な異なる源から誘導され得る多様な異なるポリヌクレオチドを用いて実施することができる。ポリヌクレオチドの全ての共通した特徴は、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34、アスパラギン51、又はアスパラギン34とアスパラギン54の両者に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化されている、低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードすることである。配列番号1の参照GP5タンパク質中のアスパラギン34及びアスパラギン54に対応するN結合型グリコシル化部位を同定するために、非変異体及び正常にグリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチド配列を、配列番号1の参照GP5タンパク質と並置することが可能である。このような並置の例は、図5及び6に示される。本配列比較において使用される具体的な配列が、表1に記載されている。
本発明の方法において不活化し、使用することができる配列番号1の参照GP5タンパク質中のアスパラギン34又はアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位を同定するために、所望の北米PRRSV単離株(図5)又は欧州PRRSV単離株(図6)のGP5タンパク質が、配列番号1の参照GP5タンパク質(北米系NVSL97−7895)と並置される。参照タンパク質として配列番号1のGP5タンパク質を使用することによって、当業者は、何れかのGP5タンパク質におけるN結合型グリコシル化部位を容易に同定することができ、次に、本発明の低グリコシル化されたGP5タンパク質変異体を構築することができる。従って、「配列番号1の参照GP5タンパク質における(アスパラギン34及び/又はアスパラギン51)に対応する」という語は、何れかのGP5タンパク質中のN結合型グリコシル化部位の記述子としての役割を果たすことが明らかである。
低グリコシル化されたGP5タンパク質は、配列番号1ないし13を含む(但し、これらに限定されるわけではない。)北米PRRSV単離株、配列番号14等の北米PRRSVコンセンサス配列とアミノ配列レベルで少なくとも85%同一である北米PRRSV単離株、又は北米PRRSVコンセンサス配列から取得され得る。低グリコシル化されたGP5タンパク質は、配列番号15を含む(但し、これに限定されるわけではない。)欧州PRRSV単離株、配列番号15等の欧州PRRSVコンセンサス配列とアミノ配列レベルで少なくとも85%同一である欧州PRRSV単離株、又は欧州PRRSVコンセンサス配列からも取得され得る。低グリコシル化されたGP5変異体をコードするポリヌクレオチドを取得するために、上に列挙された源の何れかから得たポリヌクレオチドは、低グリコシル化されたGP5変異体ポリペプチドをコードするように、標準的な部位特異的変異誘発技術によって変異誘発することができる。あるいは、望ましい低グリコシル化されたGP5変異体ポリペプチドをコードする完全に合成のDNA配列を構築することが可能である。これは、典型的には、ポリペプチド配列を対応するポリヌクレオチド配列へと変換する「back translate」等の配列分析プログラムを使用することによって達成される(GCG Wisconsin Package(商標)、Accelrys,Inc,San Diego,CA)。所望であれば、望ましい発現宿主(すなわち、哺乳動物又は酵母)中での使用に適したコドンを取り込んだ合成遺伝子の設計を与えるために、「back translate」プログラム中に、適切な「コドンバイアス」が組み込まれる。
配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位は、図5に示される代表的な北米PRRSV単離株の全てに、及び代表的な欧州PRRSVレリスタッド系に存在する(図6)。これらの典型的及び非限定的北米及び欧州PRRSV系において、この位置でのN結合型グリコシル化部位は、配列「NGT」を含む。しかしながら、他のPRRSVバリアントが、本明細書で教示されている方法によって同様に不活化され得る、構造的に互換性のある他のN結合型グリコシル化部位をこの位置(すなわち、NXS又はT)に含み得ることも予期される。N結合型グリコシル化部位は、対応するポリヌクレオチド配列において、アスパラギン51の代わりに、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンを使用することによって不活化することができる。これらの場合、低グリコシル化された北米PRRSVGP5タンパク質中での対応するアミノ酸配列は、「QGT」、「AGT」、又は「XGT」等の配列を含み、ここで、Xは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。アスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化された北米PRRSV GP5タンパク質単離株のこれら又は他の低グリコシル化された変異体は、他のN結合型グリコシル化部位が不活化された他の低グリコシル化されたGP5変異体とも組み合わせられ得る。N結合型グリコシル化部位を不活化する他の方法は、NXS/T配列の「X」又は「S/T」残基のアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含み、上に記載されている。
配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン34に正確に対応するN結合型グリコシル化部位は、本明細書に示されているある種の代表的な北米PRRSV単離株中のみに存在する。より具体的には、代表的な北米PRRSV単離株であるIAF−BAJ(配列番号3)、94−3182(配列番号7)及び94−287(配列番号8)のGP5タンパク質は、配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン34に正確に対応するN結合型グリコシル化部位を含有し、N結合型グリコシル化部位「NSS」を含む。本明細書に示されていない他のPRRSVGP5単離株は、配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン34に対応するN結合型グリコシル化部位も含有し、これらの他のGP5タンパク質の低グリコシル化されたバリアントも、本明細書に記載されている方法を使用して取得できることは、もちろん予期される。配列番号3、7及び8のこのN結合型グリコシル化部位又はアスパラギン34N結合型グリコシル化部位を含有する他のPRRSV単離株は、対応するポリヌクレオチド配列中のアスパラギン34の代わりに、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンを使用することによって不活化することが可能である。アスパラギン34におけるN結合型グリコシル化部位が「NSS」である場合には、低グリコシル化された北米PRRSV GP5タンパク質変異体中の対応するアミノ酸配列は、「QSS」、「ASS」、又は「XSS」等の配列を含む(Xは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。)。あるいは、「NSS」配列のセリン残基は、非ヒドロキシアミノ酸(すなわち、非スレオニンの非セリン)で置換することができる。これらの場合、低グリコシル化された北米PRRSV GP5タンパク質バリアント中の対応するアミノ酸配列は、配列「NSX」を含む(Xは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。)。この特定のグリコシル化部位を不活化するために、「NSS」配列の2つのセリン残基の間への(すなわち、セリン35と36の間への)非ヒドロキシアミノ酸の挿入も使用することができる。
配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン34に正確に対応するN結合型グリコシル化部位を欠失する他の北米PRRSV単離株において、残基30(配列番号2、3、4、6、7、8、9、11、13における図5の「NAS」)及び残基33(配列番号3、8における図5の「NNS」、配列番号6、10における「NSS」、配列番号11、13における「NDS」)に位置する他のN結合型グリコシル化部位も不活化することができる。換言すれば、配列番号1の参照GP5タンパク質の残基30及び33に対応するアミノ酸の位置に位置する、他の北米単離株中のN結合型グリコシル化部位を不活化することも可能であり、本発明の方法において使用することができる。理論によって限定されるものではないが、配列番号1のGP5参照タンパク質の残基29と残基35との間に位置するPRRSV GP5タンパク質の領域は、多様な異なるアミノ酸配列を許容できる超可変領域(図5)であるように思われる(図5;Pirzadeh et al.,Can.J.Vet Res.,1998, 62:170−177も参照されたい。)。天然に存在するある種のPRRSV単離株は、この領域(すなわち、配列5、12の北米単離株、配列番号15の欧州単離株)中にN結合型グリコシル化部位を含有しないが、他の単離株は、この領域中に1ないし3個のグリコシル化部位を含有し得る。その結果、配列番号1のGP5参照タンパク質の残基29と残基35の間に位置する領域において、所定のGP5タンパク質のグリコシル化部位の何れか1つを不活化することが、PRRSV GP5タンパク質に対する改善された免疫応答を誘発するための組成物又は方法として、本明細書において想定される。更に、配列番号1のGP5参照タンパク質の残基29と残基35の間に位置する領域において、所定のGP5タンパク質のグリコシル化部位の2つ以上又は全てを不活化することも、PRRSVGP5タンパク質に対する改善された免疫応答を誘発するための組成物又は方法として、本明細書において想定される。
北米及び欧州PRRSV配列の並置は、配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位が、代表的な欧州PRRSV単離株中にも存在することを示す。この事例において、N結合型グリコシル化部位は、配列「NGT」を含み、配列番号1参照配列のアスパラギン51は、配列番号15のアスパラギン53に対応する。このN結合型グリコシル化部位は、対応する欧州PRRSVポリヌクレオチド配列において、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンを、アスパラギン53の代わりに使用することによって不活化できる。これらの場合、低グリコシル化された欧州PRRSVGP5タンパク質変異体中の対応するアミノ酸配列は、「QGT」、「AGT」又は「XGT」等の配列を含む(Xは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。)。アスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化されている欧州PRRSV単離株のこれら又は他の低グリコシル化された変異体は、他のN結合型グリコシル化部位が不活化されている他の低グリコシル化されたGP5変異体とも組み合わせられ得る。
低グリコシル化されたGP5変異体タンパク質は、PRRSV感染からブタを保護するための生ワクチン、不活化ワクチン又は弱毒ワクチンを調製するために使用することができるPRRSウィルスによってコードされ得る。本発明の好ましい実施形態において、本発明の低グリコシル化されたGP5変異体タンパク質は、感染性PRRSVのRNAを産生することができる感染性PRRSVクローンへ加工される。低グリコシル化されたGP5変異体タンパク質をコードするように加工され得る感染性北米PRRSVクローンに関する記述は、米国特許第6,500,662号、Nielsen et al.,J.Virol.77:3702−11, 2003、及びTruong et al.,Virology 325:308−19, 2004に見出される。ワクチン中で使用するためのPRRSVウィルスを得るために変異誘発され得る北米PRRSV感染性クローン配列には、北米NVSL97−7865系(配列番号16)及びVR−2332系(配列番号17)が含まれるが、これらに限定されるものではない。低グリコシル化されたGP5変異体タンパク質をコードするように加工され得る感染性欧州PRRSVクローンに関する記述は、米国特許第6,268,199号に見出される。ワクチンが、生のPRRSV又は弱毒されたPRRSVを含む実施形態において、配列番号1の参照GP5タンパク質中のN44に対応するN結合型グリコシル化部位(すなわち、図5及び6の「NLT」配列)は、この部位のグリコシル化がPRRSVの感染性に必要であるので、不活化されない。欧州PRRSV単離株の場合には、配列番号1の参照GP5タンパク質中のN44に対応するN結合型グリコシル化部位は、代表的な欧州PRRSVレリスタッド系(配列番号15、図6)のアスパラギン46で始まるNLT配列である。欧州PRRSV系のN46N結合型グリコシル化部位も、感染性に必要であり、生の又は弱毒したPRRSVワクチンが使用される本発明の実施形態において不活化されない。
あるいは、低グリコシル化されたGP5変異体タンパク質は、DNAワクチンとともにブタへ導入できる。このようなDNAワクチンは、典型的には、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドへ作用可能に連結されたDNA分子を含む。低グリコシル化されたGP5バリアントタンパク質の発現を誘導するために使用することができるプロモーターは、CMV(サイトメガロウィルス)最初期プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウィルス)長期反復プロモーター及びSV40(サルウィルス40)T抗原プロモーターを含むが、これらに限定されるわけではない。ある実施形態において、このプロモーターは、CMVプロモーターである。
更なる他の実施形態において、低グリコシル化されたGP5変異体タンパク質を発現する単離されたポリヌクレオチドは、PRRSV以外のウィルスベクターを含む。PRRSV以外のウィルスベクターは、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びTGEVベクターを含むが、これらに限定されるわけではない。このようなベクターは、(TGEVベクターに関する)米国特許第7,041,300号及び(アルファウィルスベクターに関する)第6,692,750号等の多様な刊行物中に記載されている。
治療上許容される担体及びアジュバント
本発明を実施する際に、低グリコシル化されたGPバリアントポリペプチド又は低グリコシル化されたGP5バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、治療上許容される担体又は賦形剤と組み合わせられ得る。このような担体に関する非限定的な例には、生理塩類溶液又は他の同様の塩類溶液、血清アルブミンタンパク質等のタンパク質、炭酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩又はトリスベースの緩衝液等の緩衝液、NP40又はトリトンX100等の界面活性剤、及びポリエチレングリコールポリマーが含まれる。このような担体の何れの組み合わせも、本発明の組成物及び方法において使用することができる。生の又は弱毒したPRRSVウィルスを含む組成物のための好ましい担体は、50ないし100mg/mLの間の濃度の酢酸dl−α−トコフェロールである。
本発明を実施する際に、低グリコシル化されたGPバリアントポリペプチド又は低グリコシル化されたGP5バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、治療上許容される担体又は賦形剤と組み合わせられ得る。このような担体に関する非限定的な例には、生理塩類溶液又は他の同様の塩類溶液、血清アルブミンタンパク質等のタンパク質、炭酸塩、リン酸塩、ホスホン酸塩又はトリスベースの緩衝液等の緩衝液、NP40又はトリトンX100等の界面活性剤、及びポリエチレングリコールポリマーが含まれる。このような担体の何れの組み合わせも、本発明の組成物及び方法において使用することができる。生の又は弱毒したPRRSVウィルスを含む組成物のための好ましい担体は、50ないし100mg/mLの間の濃度の酢酸dl−α−トコフェロールである。
低グリコシル化されたGP5バリアントポリペプチド又は低グリコシル化されたGP5バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの何れかを含有する組成物中でのアジュバントの使用も想定される。このようなアジュバントは、典型的には、実際、水性又は油性の何れかである。使用できるアジュバントは、水酸化アルミニウム、キルA、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア、及びCpGオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されるわけではない。使用できるCpGアジュバントの多様な種類は、米国特許第6,977,245号及び第6,406,705号に記載される。
細胞の免疫応答を増強させる他のアジュバント(すなわち、Tヘルパー細胞(Th.sub.1及びTh.sub.2)亜集団増強物質)の使用も想定される。このようなアジュバントには、インターロイキン1(IL−1)、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−12、ガンマインターフェロン(g−IFN)、細胞壊死因子、MDP(ムラミルジペプチド)、免疫賦活薬複合体(ISCOM)及びリポソームが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
組成物の投与は、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、非経口注射、筋肉内注射、無針注射、電気穿孔法、経口送達、鼻内送達、口腔鼻送達又はこれらの何れかの組み合わせによって達成できる。無針注射は、典型的には、Agro−Jet(登録商標)注射器(Medical International Technologies,Montreal,Canada)等のデバイスで典型的に達成される。
(実施例)
以下の実施例は、低グリコシル化された多様な北米PRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードする多様なPRRSVの構築、PRRSV抗原に対する改善された免疫応答を誘発するために使用されるこのようなポリヌクレオチドを含む組成物、及びPRRSV抗原に対するブタにおける改善された免疫応答を誘発するための組成物を説明する。
材料及び方法
細胞、培地、及び抗体
10%ウシ胎仔血清(FBS)及び増殖培地1mLあたりペニシリン100単位、ストレプトマイシン20単位及びカナマイシン20単位を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で、MARC−145細胞を増殖させた。RNA電気穿孔法、ウィルス感染、ウィルス増殖及びプラークアッセイのために、これらの細胞を使用した。5%FBS及び上述の抗生物質を含有するアールの塩を有する基礎培地(MEM)中で、ベビーハムスター腎臓(BHK−21)細胞を維持した。GP5の一過性発現の後の免疫蛍光アッセイ(IFA)又は放射能標識及び免疫沈降実験の何れかのために、BHK−21細胞を使用した。全ての細胞を37℃及び5%CO2の環境で維持した。PRRSV GP5及びMタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体は、Carl A.Gagnon(University of Quebec,Montreal,Canada)から頂いた。ヌクレオカプシドタンパク質(N)に対するモノクローナル抗体は、National Veterinary Services Laboratories(NVSL,Ames,IA,USA)から購入した。抗マウスAlexa−488は、Molecular Probes,Inc.(Eugene,Oregon,USA)から入手した。
細胞、培地、及び抗体
10%ウシ胎仔血清(FBS)及び増殖培地1mLあたりペニシリン100単位、ストレプトマイシン20単位及びカナマイシン20単位を含有するダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で、MARC−145細胞を増殖させた。RNA電気穿孔法、ウィルス感染、ウィルス増殖及びプラークアッセイのために、これらの細胞を使用した。5%FBS及び上述の抗生物質を含有するアールの塩を有する基礎培地(MEM)中で、ベビーハムスター腎臓(BHK−21)細胞を維持した。GP5の一過性発現の後の免疫蛍光アッセイ(IFA)又は放射能標識及び免疫沈降実験の何れかのために、BHK−21細胞を使用した。全ての細胞を37℃及び5%CO2の環境で維持した。PRRSV GP5及びMタンパク質に対するウサギポリクローナル抗体は、Carl A.Gagnon(University of Quebec,Montreal,Canada)から頂いた。ヌクレオカプシドタンパク質(N)に対するモノクローナル抗体は、National Veterinary Services Laboratories(NVSL,Ames,IA,USA)から購入した。抗マウスAlexa−488は、Molecular Probes,Inc.(Eugene,Oregon,USA)から入手した。
GP5及びPRRSV感染性クローンをコードするプラスミドの遺伝子操作
pBR322中の完全長のPRRSV感染性cDNAクローン(FL12、配列番号16)を、EcoRV及びBstZ17I制限酵素で消化し、同一酵素部位を使用して、PRRSVのORF2、完全なORF3ないし7及び全体的な3’UTRを包含する約4.9kbpの断片をpBR322中にクローニングした。この中間体プラスミドは、突然変異誘発のためのテンプレートとしての役割を果たし、GP5内のN結合型グリコシル化候補部位(N34、N44、及びN51)に変異を導入した(図2)。突然変異誘発は、標準的な技術を使用して、合成プライマー(表2)による重複伸長PCRを使用して実施した。
pBR322中の完全長のPRRSV感染性cDNAクローン(FL12、配列番号16)を、EcoRV及びBstZ17I制限酵素で消化し、同一酵素部位を使用して、PRRSVのORF2、完全なORF3ないし7及び全体的な3’UTRを包含する約4.9kbpの断片をpBR322中にクローニングした。この中間体プラスミドは、突然変異誘発のためのテンプレートとしての役割を果たし、GP5内のN結合型グリコシル化候補部位(N34、N44、及びN51)に変異を導入した(図2)。突然変異誘発は、標準的な技術を使用して、合成プライマー(表2)による重複伸長PCRを使用して実施した。
BsrGI及びBstEII制限酵素でPCR産物を消化し、中間体プラスミド中に戻した。望ましい変異を含有するクローンを同定し、配列決定によって確認した。GP5のコード領域全体を配列決定し、クローン中に更なる変異が存在しないことを確認した。同一制限酵素部位を使用して、GP5コード領域中に変異を含有する中間体プラスミドからのEcoRV−PacI断片を、全長のcNDAクローン中に戻した。全長のクローン中のGP5コード領域を再度、PRRSV特異的内部プライマーで配列決定し、変異の存在を確認した。
GP5が第一シストロンであり、その後に、脳心筋炎ウィルス(EMCV)配列内リボソーム進入部位(IRES)及びMコード配列が続くバイシストロン性ベクター中にwt GP5及び個々の変異をクローニングした(図1A)。相補性研究のため、完全長のGP5も、CMVプロモーターにより駆動されるベクター(pcDNA3.0(商標)、Clontech Laboratories,Inc.,Mountain View,CA,USA)中にクローニングした。この目的のため、GP5コード領域をPCR増幅し、クローニングし、配列決定した。
インビトロでの転写及び電気穿孔法
完全長プラスミドをAclIで消化し、直鎖化したDNAをテンプレートとして使用して、製造元(Ambion,Inc.,Austin,Tx,USA)の推奨どおりに、及び上述のとおり、mMESSAGE mMACHINE Ultra T7(商標)キットを使用して、キャッピングされたRNA転写産物を得た。反応混合物をDNaseIで処理して、DNAテンプレートを消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出し、最後にイソプロパノールで沈殿させた。インビトロでの転写産物の完全性を、グリオキサルアガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色によって分析した。
完全長プラスミドをAclIで消化し、直鎖化したDNAをテンプレートとして使用して、製造元(Ambion,Inc.,Austin,Tx,USA)の推奨どおりに、及び上述のとおり、mMESSAGE mMACHINE Ultra T7(商標)キットを使用して、キャッピングされたRNA転写産物を得た。反応混合物をDNaseIで処理して、DNAテンプレートを消化し、フェノール及びクロロホルムで抽出し、最後にイソプロパノールで沈殿させた。インビトロでの転写産物の完全性を、グリオキサルアガロースゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色によって分析した。
MARC−145細胞から単離した全RNA5.0μgとともに、インビトロでの転写産物約5.0μgをMARC−145細胞に電気穿孔した。Bio−Rad Gene Pulser Xcell(商標)(Bio−Rad,Inc.,Hercules,CA,USA)を使用して、1.25%DMSOを含有するDMEM400μL中の約2×106個の細胞を、4.0mmキュベット中にて、250V、950μFで1回パルスした。標準的な増殖培地中に前記細胞を希釈し、60mm細胞培養プレート中に播種した。電気穿孔された細胞の少量を24ウェルプレート中に播種し、電気穿孔から48時間後のNタンパク質の発現(これは、ゲノムの複製及び転写を示す。)を検討した。間接的免疫蛍光アッセイ(IFA)を使用して、Nタンパク質の発現を一度確認すると、60mmプレート中の電気穿孔された細胞のバルクから得た上清を、電気穿孔から48時間後に回収し、清澄化し、未処理のMARC−145細胞上へと通過させた。IFAを使用して、Nタンパク質の発現とともに、細胞変性効果(CPE)について、感染した細胞を観察した。CPE及び正の蛍光の両者を示す感染細胞から得た上清を、感染性ウィルスを含有するように割り当てた。確認後、ウィルス原株を増殖させ、更なる研究のため、少量の一定分量で、−80℃で凍結した。全ての実験において、wtPRRSVゲノムを含有するF12及びポリメラーゼ欠損PRRSVゲノムを含有するFL12polを対照として使用した。
タンパク質の代謝性放射能標識及び分析
3.0の感染効率で、組換えワクシニアウィルス(vTF7−3)で6ウェルプレート中のBHK−21細胞を感染させた後、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの下で、wt又は多様な変異体のGP5をコードするバイシストロン性プラスミドDNAを形質移入した。製造元のプロトコールどおりに、Lipofectamine2000(商標)を使用して、DNA形質移入を実施した。形質移入16時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、メチオニン/システイン無添加DMEM中で1時間飢餓状態にし、培地1mLあたりExpre35S35S Protein Labeling Mix(NEN Life Sciences,Boston,MA)100μCiを含有するメチオニン/システイン無添加DMEM0.6mLで放射能標識した。放射能標識後、冷PBSで細胞を3回洗浄し、放射性免疫沈澱法(RIPA)緩衝液(10mMトリス−HCl pH8.0、150mM NaCl、1%トリトンX−100、0.1%SDS、1%デオキシコール酸ナトリウム、及び1×プロテアーゼ阻害剤)300μL中で細胞抽出物を調製した。ウサギ抗GP5抗体又は抗Mタンパク質抗体とともに、清澄化した細胞抽出物を40℃で一晩温置した。100μLのRIPA緩衝液中のタンパク質Aセファロース(Pharmacia,Uppsala,Sweden)約4.0mgのスラリーを添加し、更に2時間温置した。免疫沈降した複合体をRIPA緩衝液500μLで3回洗浄し、更なる分析のために使用した。
3.0の感染効率で、組換えワクシニアウィルス(vTF7−3)で6ウェルプレート中のBHK−21細胞を感染させた後、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの下で、wt又は多様な変異体のGP5をコードするバイシストロン性プラスミドDNAを形質移入した。製造元のプロトコールどおりに、Lipofectamine2000(商標)を使用して、DNA形質移入を実施した。形質移入16時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、メチオニン/システイン無添加DMEM中で1時間飢餓状態にし、培地1mLあたりExpre35S35S Protein Labeling Mix(NEN Life Sciences,Boston,MA)100μCiを含有するメチオニン/システイン無添加DMEM0.6mLで放射能標識した。放射能標識後、冷PBSで細胞を3回洗浄し、放射性免疫沈澱法(RIPA)緩衝液(10mMトリス−HCl pH8.0、150mM NaCl、1%トリトンX−100、0.1%SDS、1%デオキシコール酸ナトリウム、及び1×プロテアーゼ阻害剤)300μL中で細胞抽出物を調製した。ウサギ抗GP5抗体又は抗Mタンパク質抗体とともに、清澄化した細胞抽出物を40℃で一晩温置した。100μLのRIPA緩衝液中のタンパク質Aセファロース(Pharmacia,Uppsala,Sweden)約4.0mgのスラリーを添加し、更に2時間温置した。免疫沈降した複合体をRIPA緩衝液500μLで3回洗浄し、更なる分析のために使用した。
エンドグリコシダーゼH(Endo H)処理のために、免疫沈降した複合体を1×変性緩衝液(0.5%SDS、1.0%β−メルカプトエタノール)20μL中に再懸濁し、10分間煮沸した。上清を回収し、1×G5緩衝液(0.05Mクエン酸ナトリウム pH5.5)に調整し、Endo H(New England Biolabs,Beverly,MA,USA)100単位とともに37℃で16時間温置した。未消化の対照試料を同様に処理したが、Endo Hは添加しなかった。Endo H消化の後、試料を等容積の2×SDS−PAGE試料緩衝液と混合し、5分間煮沸し、タンパク質マーカー(Protein Plus Precision Standard,Bio−Rad,Inc)とともに変性条件下でのSDS−12%PAGEによって分離した。ゲルを10%酢酸で15分間固定し、水で3回洗浄し、0.5Mサリチル酸ナトリウムで30分間処理し、乾燥させ、最後にX線フィルムへ−70℃で曝露した。ペプチドN−グリコシダーゼF(PNGaseF)(New England Biolabs,Inc)消化のため、免疫沈降させた複合体を1×G7緩衝液(0.05Mリン酸ナトリウムpH7.5、1.0%NP−40)中に再懸濁し、酵素2単位とともに37℃で16時間温置することによって消化を行った。ツニカマイシン(Sigma,St.Louis,MO)の存在下でのGP5の合成を検討するために、形質移入した細胞を、培地1mLあたりツニカマイシン2.0μgで1時間処理し、上述のとおり、薬物の存在下で放射能標識を3時間実施した。
放射能標識された細胞外ウィルス粒子又は細胞内ウィルスにより発現されたGP5を得るため、MARC−145細胞をwt又は変異体のPRRSVで感染させた。感染から48時間後、細胞を1時間飢餓状態にし、90%メチオニン/システイン無添加DMEM及び10%標準DMEMを含有する培地1mLあたりExpre35S35S Protein Labeling Mix100μCiで24時間放射能標識した。標識後、培養上清を回収し、細胞細片を除去し、細胞外ウィルス粒子を4℃、100,000×gで3時間ペレットにした。ウィルスペレットをRIPA緩衝液200μL中に再懸濁し、抗GP5抗体で免疫沈降し、Endo H処理のあり又はなしに、タンパク質を調べた。細胞内ウィルスによって発現されたGP5の免疫沈降のために、上述のとおり感染を実施し、感染から24時間後、細胞を1時間飢餓状態にし、上述のとおり2時間放射能標識した後、細胞抽出物を調製した。
ウィルス増殖動態及びプラークアッセイ
細胞あたり3.0PFUの感染効率で、変異体又はwt PRRSVでMARC−145細胞を感染させ、インキュベーター中、37℃で温置した。感染後の多様な時点で、感染した細胞からの培養上清の一定分量を回収し、上清中のウィルス力価を測定し、1mLあたり組織培養感染用量50(TCID50/mL)によって表した。ウィルス増殖動態実験を3回実施した。変異体ウィルスのプラーク形態を検討するために、MARC−145細胞を使用してプラークアッセイを実施した。個々のウィルスの10倍連続希釈で細胞を37℃で1時間感染させた。感染した細胞の単層をPBSで洗浄し、0.8%Seaplaqueアガロース(FMC Bioproducts,Rockland,ME USA)を含有するDMEM−5%FBSで覆った。96時間後、アガロースプラグを除去し、細胞の単層を染色溶液(20%ホルムアルデヒド、9.0%エタノール、及び0.1%クリスタルバイオレット)とともに室温で30分間温置した。細胞を水で穏やかに洗浄し、過剰の染色剤を除去し、空気乾燥させて、プラークを検討及び計数した。
細胞あたり3.0PFUの感染効率で、変異体又はwt PRRSVでMARC−145細胞を感染させ、インキュベーター中、37℃で温置した。感染後の多様な時点で、感染した細胞からの培養上清の一定分量を回収し、上清中のウィルス力価を測定し、1mLあたり組織培養感染用量50(TCID50/mL)によって表した。ウィルス増殖動態実験を3回実施した。変異体ウィルスのプラーク形態を検討するために、MARC−145細胞を使用してプラークアッセイを実施した。個々のウィルスの10倍連続希釈で細胞を37℃で1時間感染させた。感染した細胞の単層をPBSで洗浄し、0.8%Seaplaqueアガロース(FMC Bioproducts,Rockland,ME USA)を含有するDMEM−5%FBSで覆った。96時間後、アガロースプラグを除去し、細胞の単層を染色溶液(20%ホルムアルデヒド、9.0%エタノール、及び0.1%クリスタルバイオレット)とともに室温で30分間温置した。細胞を水で穏やかに洗浄し、過剰の染色剤を除去し、空気乾燥させて、プラークを検討及び計数した。
トランス中でwt GP5を発現させることによるウィルス回収の補完
BHK−21細胞をpcDNA−GP5で形質移入した。形質移入から40時間後に、細胞を回収し、GP5変異体をコードする完全長のPRRSV cDNAに由来するキャッピングされたインビトロ転写産物で電気穿孔した。電気穿孔された細胞を新鮮な培地で希釈し、6ウェルプレート中に播種した。電気穿孔された細胞に由来する上清を電気穿孔から48時間後に回収し、遠心分離して細胞細片を除去し、未処理のMARC−145細胞を感染させるために使用した。感染から48時間後に、上述のとおり、IFAによるNタンパク質の発現に関して、感染したMARC−145細胞を検討した。正の細胞数を計数し、上清中に生じた偽の粒子の数を決定した。正の細胞の平均数を3つの独立した実験から算出し、細胞中へ形質移入したインビトロで転写したRNA1μgあたりに生じた偽の粒子の数として表した。
BHK−21細胞をpcDNA−GP5で形質移入した。形質移入から40時間後に、細胞を回収し、GP5変異体をコードする完全長のPRRSV cDNAに由来するキャッピングされたインビトロ転写産物で電気穿孔した。電気穿孔された細胞を新鮮な培地で希釈し、6ウェルプレート中に播種した。電気穿孔された細胞に由来する上清を電気穿孔から48時間後に回収し、遠心分離して細胞細片を除去し、未処理のMARC−145細胞を感染させるために使用した。感染から48時間後に、上述のとおり、IFAによるNタンパク質の発現に関して、感染したMARC−145細胞を検討した。正の細胞数を計数し、上清中に生じた偽の粒子の数を決定した。正の細胞の平均数を3つの独立した実験から算出し、細胞中へ形質移入したインビトロで転写したRNA1μgあたりに生じた偽の粒子の数として表した。
血清中和(SN)アッセイ
血清試料中のPRRSV中和抗体の力価を、上述の蛍光焦点中和アッセイを使用して測定した。5%ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地中のFL12(wt PRRSV)又は、GP5変異体をコードするウィルスであるFL−N34A、FL−N51A、及びFL−N34/51Aの何れかからなる曝露ウィルスの200 TCID50の存在下で、検査血清の連続希釈物を、37℃で60分間温置した。48時間早く播種しておいた集密状態のMARC−145細胞を含有する96ウェル微量滴定プレートへ混合物を添加した。5%CO2を含有する湿度のある大気中にて、37℃で24時間温置した後、50%メタノール及び50%アセトンの溶液で細胞を10分間固定した。PBSによる全面的な洗浄の後、1:500希釈を使用するモノクローナル抗体SDOW17の後に、1:100希釈でのFITCが連結されたヤギ抗マウスIgG(Sigma,St.Louis,MO,USA)でPRRSVのNタンパク質の発現を検出した。対照ウェル中に存在する病巣の90%を阻害した最大希釈の逆数として、中和力価を表した。
血清試料中のPRRSV中和抗体の力価を、上述の蛍光焦点中和アッセイを使用して測定した。5%ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地中のFL12(wt PRRSV)又は、GP5変異体をコードするウィルスであるFL−N34A、FL−N51A、及びFL−N34/51Aの何れかからなる曝露ウィルスの200 TCID50の存在下で、検査血清の連続希釈物を、37℃で60分間温置した。48時間早く播種しておいた集密状態のMARC−145細胞を含有する96ウェル微量滴定プレートへ混合物を添加した。5%CO2を含有する湿度のある大気中にて、37℃で24時間温置した後、50%メタノール及び50%アセトンの溶液で細胞を10分間固定した。PBSによる全面的な洗浄の後、1:500希釈を使用するモノクローナル抗体SDOW17の後に、1:100希釈でのFITCが連結されたヤギ抗マウスIgG(Sigma,St.Louis,MO,USA)でPRRSVのNタンパク質の発現を検出した。対照ウェル中に存在する病巣の90%を阻害した最大希釈の逆数として、中和力価を表した。
GP5変異体及びwtPRRSVによるブタの実験的接種
GP5変異体ウィルス(FL−N34A、FL−N51A及びFL−N34/51A)及びFL12(wt PRRSV)の(MARC145細胞中の3継代を通じて得られた)高い力価のストックを使用して、若齢ブタを感染させた。PRRSV感染がないことを保証する記録を有する特定病原体除去の群れから近日中に離乳した21日齢のブタを購入した。ELISA(Iddex Labs,Portland,ME)によって検査されたところによると、全ての動物は、抗PRRSV抗体に関して陰性であった。1群あたり3匹のブタに、FL12wt PRRSV又はFL−N34A、FL−N51A、及びFL−N34/51A変異体の何れかを感染させた。全ての場合、種菌は、2mLに希釈した105 TICD50からなり、頸部に筋肉内投与された。接種した動物の直腸温を、接種後(PI)15日間モニターした。4、7及び14PIでMARC145細胞を定期的に単離することによって、ウィルス血症を測定した。血清試料を毎週採取し、その期間全体は感染後49日間であった。血清試料を使用して、変異体及びwt PRRSVの各々に関する類似の及び異種性の交差中和力価を検出した。
GP5変異体ウィルス(FL−N34A、FL−N51A及びFL−N34/51A)及びFL12(wt PRRSV)の(MARC145細胞中の3継代を通じて得られた)高い力価のストックを使用して、若齢ブタを感染させた。PRRSV感染がないことを保証する記録を有する特定病原体除去の群れから近日中に離乳した21日齢のブタを購入した。ELISA(Iddex Labs,Portland,ME)によって検査されたところによると、全ての動物は、抗PRRSV抗体に関して陰性であった。1群あたり3匹のブタに、FL12wt PRRSV又はFL−N34A、FL−N51A、及びFL−N34/51A変異体の何れかを感染させた。全ての場合、種菌は、2mLに希釈した105 TICD50からなり、頸部に筋肉内投与された。接種した動物の直腸温を、接種後(PI)15日間モニターした。4、7及び14PIでMARC145細胞を定期的に単離することによって、ウィルス血症を測定した。血清試料を毎週採取し、その期間全体は感染後49日間であった。血清試料を使用して、変異体及びwt PRRSVの各々に関する類似の及び異種性の交差中和力価を検出した。
結果
PRRSV GP5の発現及び特徴
PRRSV97−7895系のGP5は、3つのグリコシル化候補部位(N34、N44、及びN51)を有する。GP5のグリコシル化パターンを検討するために、本発明者は、まず、EMCVからのIRESに隣接するGP5及びMタンパク質のコード領域が、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの調節下に配置されたバイシストロン性ベクターを作製した(図1A)。バイシストロン性ベクターを構築するための論拠は、GP5及びMタンパク質が互いに相互作用することが公知であり(LDV及びEAVの場合)又は(PRRSVの場合)推定されていること、並びに、このような相互作用は、GP5のタンパク質の折りたたみ、グリコシル化、細胞内輸送、及び/又は他の生物活性にとって重要であり得ることである。
PRRSV GP5の発現及び特徴
PRRSV97−7895系のGP5は、3つのグリコシル化候補部位(N34、N44、及びN51)を有する。GP5のグリコシル化パターンを検討するために、本発明者は、まず、EMCVからのIRESに隣接するGP5及びMタンパク質のコード領域が、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの調節下に配置されたバイシストロン性ベクターを作製した(図1A)。バイシストロン性ベクターを構築するための論拠は、GP5及びMタンパク質が互いに相互作用することが公知であり(LDV及びEAVの場合)又は(PRRSVの場合)推定されていること、並びに、このような相互作用は、GP5のタンパク質の折りたたみ、グリコシル化、細胞内輸送、及び/又は他の生物活性にとって重要であり得ることである。
バイシストロン性プラスミドの形質移入によるGP5及びMの一過性発現後の放射能標識及び抗GP5抗体による免疫沈降は、2つの主要なタンパク質種を明らかにした。約25.5kDaの質量で移動するタンパク質種は、GP5の完全にグリコシル化された形態である(図1B、レーン2)。N結合型各グリコシル化は、分子量約2.5kDaをタンパク質に付加するので、このことは、3つのグリコシル化候補部位が全て、おそらく、GP5のグリコシル化のために使用されることを示す。前記タンパク質種も抗M抗体で免疫沈降したので(レーン7)、19.0kDaタンパク質種は、ウィルス性Mタンパク質である。本結果は、GP5及びMタンパク質が、両タンパク質を発現する細胞中で互いに相互作用することを示す。高濃度マンノース種のオリゴ糖鎖を除去する酵素であるEndo Hで処理すると、GP5のサイズは、約18kDaまで低下するのに対し、Mタンパク質のサイズは変化しないままであった(レーン3)。タンパク質主鎖から全ての種類の糖を除去する酵素であるPNGaseFによるGP5の処理(レーン4)又はツニカマイシンの存在下でのGP5の合成(レーン5)は、Endo−H処理をしたタンパク質よりもわずかに迅速な電気泳動度で移動するタンパク質を生じた。ツニカマイシン処理又はPNGaseFによる消化が、グリコシル化されていないタンパク質を生じるのに対し、Endo−H処理は、N結合型グリコシル化部位の各々にN−アセチルグルコサミン残基を保持するタンパク質を生じるので、これは予想される。約30kDa分子量の主なタンパク質種が、抗M抗体で免疫沈降されたことには注目すべきである。このタンパク質の正体は不明であるが、Mタンパク質と相互作用する細胞内タンパク質であり得る。
上記研究から得られた結果は、GP5のグリコシル化されていない形態及び完全にグリコシル化された形態が、それぞれ、18.0kDa及び25.5kDaの見かけの分子量を有することを示唆する。GP5の完全にグリコシル化した形態を生成するために、3つのグリコシル化候補部位が全て使用されるようである。前記部分がEndo Hによる消化に対して高感度であるので、これらの部位へ付加されるグリカン部分は、高濃度のマンノース種である。更に、本結果は、GP5のグリコシル化されていない形態と完全にグリコシル化された形態の両者が、Mタンパク質と相互作用するようであることを示す。
GP5のグリコシル化に使用されるN結合型グリコシル化部位の分析
GP5中のN結合型グリコシル化候補部位の全て又は幾つかが糖部分の付加のために使用されるかどうかをより正確に決定するために、3つのグリコシル化候補部位N34、N44及びN51(図2A)が全て、個別に又は多様な組み合わせで、アラニンへ変化された(図2B)バイシストロン性プラスミド中に一連の変異体を作製した。プラスミドで形質移入された細胞において、前記タンパク質を放射能標識し、抗GP5抗体で免疫沈降した。免疫複合体は、Endo Hで未処理のままとし、又は処理されるかの何れかであり、SDS−PAGEによって検査した。図2Cにあるデータから明らかなように、単一の変異(N34A、N44A又はN51A)を有するGP5変異体タンパク質は、約23.0kDaのタンパク質種として移動した(レーン4、6及び8、矢印)。Endo Hで処理すると、これらのタンパク質は、Endo H処理後のwtGP5(レーン3)と同様、約18.0kDaのタンパク質種として移動した(それぞれレーン5、7及び9)。前記タンパク質の電気泳動による移動度のわずかな差異は、2つのN−アセチルグルコサミン残基を含有する単一変異体と比較して、wtタンパク質は、Endo H処理後に3つのN−アセチルグルコサミン残基を全て保持するという事実を反映している可能性が最も高い。二重変異体(N34/44A、N44/51A及びN34/51A)は、約20.5kDaタンパク質近くに移動するタンパク質種を生じ(レーン10、12及び14)、Endo H処理の際、タンパク質のサイズが18.0kDaまで低下した(レーン11、13、及び15)。三重変異体(N34/44/51A)は、18.0kDaタンパク質として移動するタンパク質を生じ(レーン16)、Endo H消化に対して耐性があった(レーン17)。
GP5中のN結合型グリコシル化候補部位の全て又は幾つかが糖部分の付加のために使用されるかどうかをより正確に決定するために、3つのグリコシル化候補部位N34、N44及びN51(図2A)が全て、個別に又は多様な組み合わせで、アラニンへ変化された(図2B)バイシストロン性プラスミド中に一連の変異体を作製した。プラスミドで形質移入された細胞において、前記タンパク質を放射能標識し、抗GP5抗体で免疫沈降した。免疫複合体は、Endo Hで未処理のままとし、又は処理されるかの何れかであり、SDS−PAGEによって検査した。図2Cにあるデータから明らかなように、単一の変異(N34A、N44A又はN51A)を有するGP5変異体タンパク質は、約23.0kDaのタンパク質種として移動した(レーン4、6及び8、矢印)。Endo Hで処理すると、これらのタンパク質は、Endo H処理後のwtGP5(レーン3)と同様、約18.0kDaのタンパク質種として移動した(それぞれレーン5、7及び9)。前記タンパク質の電気泳動による移動度のわずかな差異は、2つのN−アセチルグルコサミン残基を含有する単一変異体と比較して、wtタンパク質は、Endo H処理後に3つのN−アセチルグルコサミン残基を全て保持するという事実を反映している可能性が最も高い。二重変異体(N34/44A、N44/51A及びN34/51A)は、約20.5kDaタンパク質近くに移動するタンパク質種を生じ(レーン10、12及び14)、Endo H処理の際、タンパク質のサイズが18.0kDaまで低下した(レーン11、13、及び15)。三重変異体(N34/44/51A)は、18.0kDaタンパク質として移動するタンパク質を生じ(レーン16)、Endo H消化に対して耐性があった(レーン17)。
従って、上述の変異性研究から、3つのグリコシル化候補部位が全てグリコシル化に使用され、完全に成熟したPRRSV GP5を生じることが明らかである。3つのグリコシル化部位は全て、高濃度マンノース種のグリカン部分によって修飾されるようである。
GP5変異体による感染性PRRSVウィルスの回収
感染性PRRSVの産生におけるN結合型グリコシル化の重要性を評価するために、GP5変異体タンパク質のコード領域を完全長のcDNAクローン中に挿入した。クローンから生じたキャッピングされたインビトロ転写産物をMARC−145細胞中に電気穿孔し、感染性PRRSVの産生を検討した。この結果は、N34、N51及びN34/51に変異を含有する完全長の転写産物で電気穿孔された細胞から、感染性ウィルスが容易に回収されることを示した。回収されたウィルスの増殖動態は、wtウィルスのものと同様であるが、N34及びN51に変異を含有するFL−N34A及びFL−N51Aウィルスの全体的な収量は、MARC−145細胞では約1桁低いのに対し、二重変異(N34/51A)を有するFL−N34/51Aは、wt PRRSVよりもほぼ1.5対数低かった(図3A)。感染した細胞からのRNAのRT−PCR増幅後のヌクレオチド配列決定は、これらのウィルスが安定であり、所望の変異を含有し、他の変異がGP5領域全体に検出されなかったことを示した(データは示さず)。
感染性PRRSVの産生におけるN結合型グリコシル化の重要性を評価するために、GP5変異体タンパク質のコード領域を完全長のcDNAクローン中に挿入した。クローンから生じたキャッピングされたインビトロ転写産物をMARC−145細胞中に電気穿孔し、感染性PRRSVの産生を検討した。この結果は、N34、N51及びN34/51に変異を含有する完全長の転写産物で電気穿孔された細胞から、感染性ウィルスが容易に回収されることを示した。回収されたウィルスの増殖動態は、wtウィルスのものと同様であるが、N34及びN51に変異を含有するFL−N34A及びFL−N51Aウィルスの全体的な収量は、MARC−145細胞では約1桁低いのに対し、二重変異(N34/51A)を有するFL−N34/51Aは、wt PRRSVよりもほぼ1.5対数低かった(図3A)。感染した細胞からのRNAのRT−PCR増幅後のヌクレオチド配列決定は、これらのウィルスが安定であり、所望の変異を含有し、他の変異がGP5領域全体に検出されなかったことを示した(データは示さず)。
MARC−145細胞に対してウィルスプラークアッセイを実施し、変異体ウィルスのプラーク表現型をモニターした。wt PRRSVによって生じたプラークは清澄であり、明瞭であったのに対し、変異体ウィルスは、異なる表現型を有するプラークを産生した。FL−N34A、FL−N51A及びFL−N34/51Aウィルスは、より明瞭でないプラークを生じ、前記プラーク内の細胞の多くが正常であるように見えた(図3B、塗りつぶされていない矢印)。更に、FL−N51A、FL−N34/51Aは、ウィルスが細胞単層を排除できなかった幾つかのプラークを産生した(図3B、塗りつぶされた矢印)。本データは、wt PRRSVと比較すると、回収された変異体ウィルスは、実際、細胞変性がより少ないことを示す。
本発明者は、変異体テンプレートFL−N44A、FL−N31/44A、FL−N44/51A及びFL−N31/44/51Aを用いて感染性PRRSVを回収することができなかったので、GP5コード領域中の変異が、ゲノムRNAの粒子への充填等の、RNAテンプレートの幾つかの他の機能に影響を及ぼした可能性がある。これに対処するために、本発明者は、トランスでwt GP5を発現する細胞が、感染性PRRSVを生成することができない変異体RNAテンプレートの充填を補助し得るかどうかを検討した。pcDNA−GP5で形質移入されたBHK−21細胞をインビトロ転写産物で電気穿孔し、電気穿孔から48時間後に、培養上清を回収し、未処理のMARC−145細胞を感染させるために使用し、PRRSV偽粒子の産生を測定した。偽粒子が生じる場合、次に、これらの感染したMARC−145細胞中でNタンパク質の発現を観察することが期待される。Nの発現は、偽粒子の細胞中への進入後に複製を設定するキャプシド形成された完全長変異体RNAゲノムを、ナイーブMARC−145細胞が受容する場合にのみ可能である。本発明者は、以前に回収できなかった全ての変異体のうち、2つの変異体の完全ゲノム(FL−N44A及びFL−N34/44A)を含有する偽粒子を回収することができた(図3C)。変異体ウィルスにより感染された培養物中の各緑色蛍光細胞は、1つの感染性偽粒子を表す。これらの粒子は、外被上には機能的wt GP5のみを含有するが、ゲノム中に非機能性変異体GP5のためのコード配列を含有するので、周囲の細胞に拡散する感染性粒子を産生することができない。他の変異体テンプレート(FL−N44/51A及びFL−N31/44/51A)を有する偽感染性粒子を回収する複数の試みは成功しなかった。
これらの実験から産生された感染性偽粒子の数の定量的な概算は、細胞中へ電気穿孔された変異体RNA1μgあたり約1000個の粒子が産生されることを示唆する(図3D)。これは、wt GP5をコードするRNAで得られるものより約100倍低い。感染性偽粒子のこのような低レベルの産生は、wt GP5を発現する細胞の約5ないし10%が、これらの細胞中でのNタンパク質の発現によって明らかなように、完全長の転写産物を受け取ったに過ぎないという事実によるものであり得る。形質移入された細胞中でのwt G5の発現の低いレベルは、これらの偽ウィルス粒子の産生の低いレベルに関与し得た可能性もある。
変異体ウィルス中に組み込まれたGP5の検査及び感染した細胞中で発現された前記ウィルス
形質移入された細胞から産生された感染性ウィルス粒子中に組み込まれたGP5タンパク質の性質を決定するために、本発明者は、wt及び変異体ウィルスで感染された細胞から得た放射能標識されたPRRSVを作製した。培養上清中に存在する細胞外ウィルス粒子を、超遠心によりペレットにし、抗GP5抗体を使用する免疫沈降及びその後の電気泳動分析によって、これらのウィルス粒子中に存在するGP5を調べた。結果は、ウィルス粒子中へ組み込まれたwt GP5が、EndoH消化に部分的に耐性のある(レーン2)、約25ないし27kDaタンパク質種の広く拡散するバンドとして移動したことを示す(図4A、レーン1)。ウィルス粒子中へ組み込まれたGP5変異体(N34A及びN51A)は、EndoHに対して感受性があった。EndoH消化後に生じた産物のサイズに基づくと、これらの単一部位の変異体中の1つのグリカン部分のみが感受性であるのに対して、その他は耐性があるように見受けられる。対照的に、GP5二重変異体(N43/51A)は、Endo Hに対して耐性であった。更に、変異体ウィルスからのGP5のEndo H消化は、GP5タンパク質主鎖の非常に少量も生じ、これらのウィルスは、Endo H耐性部分及びEndo H感受性グリカン部分を含有するGP5タンパク質を組み込んでいることを示唆している。
形質移入された細胞から産生された感染性ウィルス粒子中に組み込まれたGP5タンパク質の性質を決定するために、本発明者は、wt及び変異体ウィルスで感染された細胞から得た放射能標識されたPRRSVを作製した。培養上清中に存在する細胞外ウィルス粒子を、超遠心によりペレットにし、抗GP5抗体を使用する免疫沈降及びその後の電気泳動分析によって、これらのウィルス粒子中に存在するGP5を調べた。結果は、ウィルス粒子中へ組み込まれたwt GP5が、EndoH消化に部分的に耐性のある(レーン2)、約25ないし27kDaタンパク質種の広く拡散するバンドとして移動したことを示す(図4A、レーン1)。ウィルス粒子中へ組み込まれたGP5変異体(N34A及びN51A)は、EndoHに対して感受性があった。EndoH消化後に生じた産物のサイズに基づくと、これらの単一部位の変異体中の1つのグリカン部分のみが感受性であるのに対して、その他は耐性があるように見受けられる。対照的に、GP5二重変異体(N43/51A)は、Endo Hに対して耐性であった。更に、変異体ウィルスからのGP5のEndo H消化は、GP5タンパク質主鎖の非常に少量も生じ、これらのウィルスは、Endo H耐性部分及びEndo H感受性グリカン部分を含有するGP5タンパク質を組み込んでいることを示唆している。
バイシストロン性ベクターで形質移入された細胞中で、wt及び変異体のGPタンパク質は完全にEndo H感受性であった(図1及び2)ので、本発明者は、PRRSウィルス粒子におけるGP5が広くEndo H耐性形態を含有するという観察に驚いた。前記タンパク質のEndo H耐性形態が、感染した細胞中でも合成されるかどうかを検討するために、wt又は変異体のPRRSVに感染したMARC−145細胞を放射能標識し、GPタンパク質を抗GP5抗体で免疫沈降し、Endo H消化し又は消化せずに、電気泳動により分析した。このような実験の結果は、図4Bに示されている。wt GP5の大部分は、3つの部位全てにEndo H耐性グリカンを含有した(レーン2及び3)のに対し、2つの単一変異体は、1つの部位のみにEndo H耐性グリカンを含有した(レーン4ないし7)。二重変異体中のグリカン部分の幾つかは耐性があるのに対し、その他はEndo Hに対して感受性がある(レーン8及び9)。Endo H耐性のパターンは、ウィルス粒子結合GP5に対して観察されるものと同様であるが、GP5タンパク質及びMタンパク質の両者を発現する細胞において観察されるものとは異なる(図1及び2)。これらの結果は、他のウィルスタンパク質が、GP5上のグリカンの更なる修飾において役割を果たし得ることを示している。
特異的抗体によって中和されるPRRSVの能力に対するGP5の低グリコシル化の影響
ウィルス受容体との相互作用に関与するウィルス糖タンパク質のグリコシル化のレベルは、ウィルス中和抗体と反応するウィルス粒子の能力に影響することが知られている。この現象がPRRSVの場合に生じるかどうかを調べるために、回復期の抗血清によって中和される能力において、グリコシル化パターンの変化したPRRSV GP5変異体(FL−N34A、FL−N51A及びFL−N34/51A)をPRRSV wt(FL12)と比較した。このために、本発明者は、wt PRRSVに感染した4匹の動物から得た回復期の抗血清(感染47日後)を使用した。感染性PRRSV GP5変異体(FL−N34A、FL−N51A及びFL−N34/51A)及び感染性クローン由来のwt PRRSV(FL12)の同様の用量(2000TCID50)を、本発明者の標準的なアッセイプロトコールに従って、血清中和アッセイにおける曝露ウィルスとして使用し、4つの抗wt PRRSV(FL12)血清のセットを参照として使用した。表3は、得られた異なる終点血清中和力価を示す。通常、感染47ないし54日後に回収されたPRRSV wt回復期血清試料は、wt PRRSV中和活性の中程度のレベルを含有し(1:8ないし1:32、表3及び4)、wt PRRSVによる感染に典型的な、抗体中和反応の比較的弱く遅い特徴を反映した。しかしながら、SNアッセイにおいて、低グリコシル化されたPRRSV変異体を、曝露ウィルスとして(GP5外部ドメイン中に1つ又は2つのグリカン部分を欠失する)使用することにより、参照血清の終点を有意に亢進したようであり、終点の力価の亢進は、6倍から22倍までに及んだ(表3)。この観察は、グリカン部分の1つ、特に2つを除去することにより、特異的抗体への中和エピトープの到達性が増加することを明確に示唆する。これらの結果は、wtPRRSVに感染した回復期血清中に、PRRSV中和抗体の有意な量が存在することを示すようであり、これは、SNアッセイでは、完全にグリコシル化されたGP5を含有するwt PRRSVを典型的に使用するために、本来検出できなかったものである。
ウィルス受容体との相互作用に関与するウィルス糖タンパク質のグリコシル化のレベルは、ウィルス中和抗体と反応するウィルス粒子の能力に影響することが知られている。この現象がPRRSVの場合に生じるかどうかを調べるために、回復期の抗血清によって中和される能力において、グリコシル化パターンの変化したPRRSV GP5変異体(FL−N34A、FL−N51A及びFL−N34/51A)をPRRSV wt(FL12)と比較した。このために、本発明者は、wt PRRSVに感染した4匹の動物から得た回復期の抗血清(感染47日後)を使用した。感染性PRRSV GP5変異体(FL−N34A、FL−N51A及びFL−N34/51A)及び感染性クローン由来のwt PRRSV(FL12)の同様の用量(2000TCID50)を、本発明者の標準的なアッセイプロトコールに従って、血清中和アッセイにおける曝露ウィルスとして使用し、4つの抗wt PRRSV(FL12)血清のセットを参照として使用した。表3は、得られた異なる終点血清中和力価を示す。通常、感染47ないし54日後に回収されたPRRSV wt回復期血清試料は、wt PRRSV中和活性の中程度のレベルを含有し(1:8ないし1:32、表3及び4)、wt PRRSVによる感染に典型的な、抗体中和反応の比較的弱く遅い特徴を反映した。しかしながら、SNアッセイにおいて、低グリコシル化されたPRRSV変異体を、曝露ウィルスとして(GP5外部ドメイン中に1つ又は2つのグリカン部分を欠失する)使用することにより、参照血清の終点を有意に亢進したようであり、終点の力価の亢進は、6倍から22倍までに及んだ(表3)。この観察は、グリカン部分の1つ、特に2つを除去することにより、特異的抗体への中和エピトープの到達性が増加することを明確に示唆する。これらの結果は、wtPRRSVに感染した回復期血清中に、PRRSV中和抗体の有意な量が存在することを示すようであり、これは、SNアッセイでは、完全にグリコシル化されたGP5を含有するwt PRRSVを典型的に使用するために、本来検出できなかったものである。
インビボで中和抗体を誘導するPRRSVの能力に対するGP5の低グリコシル化の効果
宿主のインビボでの接種のために変異体ウィルスが使用されるときに、ウィルス外被糖タンパク質からの炭水化物の除去が、前記変異体に対する中和抗体の高い力価を生じるという1つの顕著な効果が報告されており、幾つかの事例では、wtウィルス自体よりも高い、wtウィルスに対する抗体力価も誘導する。本発明者は、wt PRRSV FL12又はグリコシル化パターンの変化した変異体の各々の同一用量にブタの群を感染させた。興味深いことに、感染後第4、7及び10日目の直腸温の評価及びウィルス血症の評価による感染の臨床的/ウィルス学的評価は、変異体の何れかに対する病原性の減退又は憎悪の所見なしに、FL12に関して既に記載されているとおり、全ての群において感染の同様のパターンを示した。しかしながら、48日間の期間を通じてこれらの動物から血清を連続的にサンプリングすることによって、PRRSV中和抗体反応の誘導の動態が、wt PRRSVと変異体の間で顕著に異なることが示された(表4A及び4B)。変異体の場合に、PRRSV中和抗体反応に特徴的な緩慢で、不十分な性質が、補正されたように見受けられる点まで、前記変異体は、wt PRRSVによって生じたものよりも早期により強い類似の中和抗体反応を生じた(表4)。変異体相同性中和抗体の出現の速度論(表4B)は、インフルエンザ又は仮性狂犬病ウィルス等の他のウィルス感染に関して記載のものと一致するが、PRRSVに関するものとは一致しないより定型的な中和抗体の抗体陽転を示す。最も重要なのは、GP5グリコシル化変異体による感染が、wt PRRSV自体による反応よりも有意に高いwt PRRSV特異的中和抗体反応を誘導したという事実である。変異体ウィルスFL−N34及びFL−N51Aは、wt PRRSV自体よりもwt PRRSVに対する中和抗体力価の5倍高いレベル(p<0.05)を誘導したのに対し、変異体FL−N34/51は、wt PRRSV自体よりもwt PRRSV中和抗体の6倍高い力価(p<0.01)を誘導した(表4B)。
宿主のインビボでの接種のために変異体ウィルスが使用されるときに、ウィルス外被糖タンパク質からの炭水化物の除去が、前記変異体に対する中和抗体の高い力価を生じるという1つの顕著な効果が報告されており、幾つかの事例では、wtウィルス自体よりも高い、wtウィルスに対する抗体力価も誘導する。本発明者は、wt PRRSV FL12又はグリコシル化パターンの変化した変異体の各々の同一用量にブタの群を感染させた。興味深いことに、感染後第4、7及び10日目の直腸温の評価及びウィルス血症の評価による感染の臨床的/ウィルス学的評価は、変異体の何れかに対する病原性の減退又は憎悪の所見なしに、FL12に関して既に記載されているとおり、全ての群において感染の同様のパターンを示した。しかしながら、48日間の期間を通じてこれらの動物から血清を連続的にサンプリングすることによって、PRRSV中和抗体反応の誘導の動態が、wt PRRSVと変異体の間で顕著に異なることが示された(表4A及び4B)。変異体の場合に、PRRSV中和抗体反応に特徴的な緩慢で、不十分な性質が、補正されたように見受けられる点まで、前記変異体は、wt PRRSVによって生じたものよりも早期により強い類似の中和抗体反応を生じた(表4)。変異体相同性中和抗体の出現の速度論(表4B)は、インフルエンザ又は仮性狂犬病ウィルス等の他のウィルス感染に関して記載のものと一致するが、PRRSVに関するものとは一致しないより定型的な中和抗体の抗体陽転を示す。最も重要なのは、GP5グリコシル化変異体による感染が、wt PRRSV自体による反応よりも有意に高いwt PRRSV特異的中和抗体反応を誘導したという事実である。変異体ウィルスFL−N34及びFL−N51Aは、wt PRRSV自体よりもwt PRRSVに対する中和抗体力価の5倍高いレベル(p<0.05)を誘導したのに対し、変異体FL−N34/51は、wt PRRSV自体よりもwt PRRSV中和抗体の6倍高い力価(p<0.01)を誘導した(表4B)。
考察
本研究において、本発明者は、感染性ウィルスの回収におけるPRRSVのGP5のグリコシル化の影響、変異体ウィルスが抗体により中和される能力におけるその役割、インビボでの中和抗体を誘導する上でのその役割を検討した。本発明者は、GP5における3つのグリコシル化候補部位(N34、N44、及びN51)全てが、グリカン部分の付加に使用されることを見い出した。我々は、N44部位でのグリカン付加が、感染性ウィルスの回収に最も決定的であることを明らかにした。更に、我々は、GP5の低グリコシル化された形態を含有するPRRSVが、抗体による中和に対して大変感受性があること、および変異体ウィルスが、類似の変異体ウィルスだけでなくwt PRRSVに対しても中和する抗体の有意により高いレベルを誘導することを示す。
本研究において、本発明者は、感染性ウィルスの回収におけるPRRSVのGP5のグリコシル化の影響、変異体ウィルスが抗体により中和される能力におけるその役割、インビボでの中和抗体を誘導する上でのその役割を検討した。本発明者は、GP5における3つのグリコシル化候補部位(N34、N44、及びN51)全てが、グリカン部分の付加に使用されることを見い出した。我々は、N44部位でのグリカン付加が、感染性ウィルスの回収に最も決定的であることを明らかにした。更に、我々は、GP5の低グリコシル化された形態を含有するPRRSVが、抗体による中和に対して大変感受性があること、および変異体ウィルスが、類似の変異体ウィルスだけでなくwt PRRSVに対しても中和する抗体の有意により高いレベルを誘導することを示す。
GP5中のグリカン付加に3つのN結合型グリコシル化候補部位が全て使用されるという確認が、単一又は複数の部位で変化した変異体を使用することによって与えられた(図2)。生化学的研究は、PRRSV GP5タンパク質が、形質移入した細胞においてMタンパク質とともに発現されたときに、Endo H感受性の高濃度マンノース種のグリカンを含有することを示した。ウィルス粒子中に組み込まれたGP5の大部分がEndo Hに対して耐性がある(図4A)のに対し、形質移入された細胞中のMタンパク質の存在下で発現したGP5は完全にEndo H感受性であるという知見は興味深いものである。形質移入した細胞中のMタンパク質の存在下で発現されたとき、GP5は、ほとんど小胞体中で又はシスゴルジ領域中で蓄積し、それゆえEndo H感受性のままであることが可能である。しかしながら、PRRSVに感染した細胞中では、GP5は、更なるウィルスタンパク質と相互作用し得、小胞体若しくはシスゴルジを越えるGP5の輸送は、他のウィルスタンパク質との複合体を形成することを通じて容易になる。この解釈に一致して、本発明者は、wt若しくは変異体のPRRSVに感染した細胞中で、GP5タンパク質が、Endo Hに対しても耐性があることを観察した。本発明者は、GP5分子の大部分がEndo H耐性を獲得した後、PRRSVウィルス粒子中に組み込まれる内側及び/又はトランスゴルジ領域へ、感染した細胞中の小胞体中で合成されるGP5が輸送されることを示唆する。PRRSVを含むアルテリウィルスを使用する幾つもの研究は、GP5及びMタンパク質がヘテロ二量体を形成し、それがウィルス感染性における重要な役割を担い得ることを示唆する。EAV及びLDVにおいて、ジスルフィド架橋の形成を通じたGP5及びMタンパク質の直接的な相互作用が示されている。このような相互作用は、N結合型オリゴ糖側鎖の更なる処理の前に生じ得、おそらくはGP5が小胞体若しくはシスゴルジ区画の外へ輸送される前に生じ得る。
興味深いことには、wt及び変異体ウィルス粒子中へ組み込まれたGP5のEndo H耐性のパターンが異なることである。wt PRRSV中のGP5分子の大部分は、Endo H耐性であったのに対し、単一部位の変異体ウィルス粒子(FL−N34A及びFL−N51A)中のGP5分子のほとんどは、Endo H感受性であった(図4A)。更に、これらの変異体中の2つのグリカンのうち、1つのみが感受性であったのに対し、その他は耐性であった。二重変異体(FL−N34/51A)ウィルス粒子も、グリカンを含有するGP5を組み込み、そのうちの幾つかもEndo Hに対して感受性があった。これらのデータは、wt及び変異体PRRSVウィルス粒子が、異なる部位で異なるグリカン部分を含有するGP5分子の混合した集団を組み込むという解釈と一致する。wt PRRSVウィルス粒子中へGP5の別個にグリコシル化された形態を組み込むことを示す先行研究は、本発明者の解釈を更に強化する。ウィルス粒子中へ組み込まれたGP5のEndo H感受性のパターンから、N44部位は、Endo H耐性グリカンを含有し得ると推測したくなるが、この部位でEndo H感受性グリカンを有する幾つかのGP5分子が、ウィルス中へ組み込まれた。GP5中の多様な部位でのグリカンのこの独特なパターン及びウィルス粒子中へのGP5の多様な形態の組み込みが、PRRSV感染した動物において見られる免疫応答のパターンと何らかの関連性があるかどうかについては、研究の余地がある。
最近の研究において、レリスタッドPRRSVのGP5中の2つのN結合型グリコシル化部位(N46及びN53)のうち、N46残基のグリコシル化が、ウィルス粒子産生に強く必要とされることが示された。感染性ウィルス量は、N46での変異で、約100倍低下した。この結果は、(北米PRRSVに関して)N44でのグリカン付加が、感染性PRRSVの回収のために絶対的に必須であることを示唆する。その結果、PRRSVの欧州及び北米単離株が、感染性ウィルスの産生に関し、N結合型グリコシル化のための必要条件において幾分異なり得る可能性がある。この点において、レリスタッドウィルスが、僅か2つのN結合型グリコシル化部位を含有するのに対し、本発明者が本研究において使用した北米単離株は、3つのこのような部位を含有することは注目されるべきである。
GP5は、PRRSV中和抗体の産生及び保護的免疫性に関与するPRRSVの最も重要な糖タンパク質である。我々は、GP5外部ドメイン中の残基34及び51でのグリカンの欠如が、生存可能なPRRSV変異体を産生しながら、抗体による中和に対するこれらの変異体の感受性及び近隣の中和エピトープの免疫原性の両者を亢進させることを明らかにする。PRRSV変異体のGP5中にグリカンが存在しないことの直接の効果は、wt PRRSVに感染したブタから得た回復期血清による中和に対するウィルスの増加した感受性であった(表3)。HIV−1及びSIVを用いた研究は、gp160の可変ループ中のグリカンの獲得又は除去が、中和に対するそれらの感受性を修飾することを示している。それゆえ、グリカンは、ウィルス外被糖タンパク質生合成の間に、不可欠な役割の少なくとも2種類を担うことが推定される。ある事例では、グリカンの欠如は、糖タンパク質の欠損を伴い、従って、ウィルス株の全体的な生存性の欠損を伴う。本発明者は、PRRSV GP5のN44でのグリカンが同様の役割を担うものと推測する。第二の事例では、グリカンは、抗体による中和に対してウィルスタンパク質を遮蔽するように機能する可能性を秘める。PRRSV GP5の場合、N34及びN51でのグリカンは、同様の役割を有し得る。HIVの場合、「グリカン遮蔽」は、免疫応答の中和から回避することにより、HIVのインビボでの生存を保障することについて説明する主要な機序であることが推定される。これは、PRRSVと幾つかの平行的な比較を引き出す。各動物中で数ヶ月にわたって持続することが知られているPRRSVによる感染は、ウィルス特異的な免疫応答の中和の誘導に関して、独特の挙動を示す。検出可能なPRRSV中和抗体反応を構築するために、PRRSVに感染した動物が、一般に、正常な時間よりも長い時間を要することは十分に確定されている。一度構築されると、このPRRSV中和反応は弱く、動物によって有意に異なる。抗体反応を中和する上での遅延は、近隣の免疫優性囮エピトープ(アミノ酸位置27ないし30)の存在によるものと推定されており、これは、中和するエピトープ(アミノ酸位置37ないし45)に対する反応を遮蔽及び/又は遅延させる頑強な初期の非保護的免疫応答を惹起する(26、38)。これは、PRRSV中和抗体反応の非典型的な特徴に対して説得的な説明であるが、なお検討を要する。本発明者の研究室において、囮エピトープの欠失が、感染性PRRSVの回収に対して致死的であることが一貫して証明されており(Ansari et al.,未公開データ)、したがって、この仮説を検証することが困難なものになっている。
PRRSV中和反応の独特の性質を説明するための代替的又は補完的機序が、HIV及びSIVに関して提唱された「グリカン遮蔽」現象によって予測され得る可能性がある。SNアッセイではwt PRRSVが使用されるので、本発明者の研究における1つ又は2つのグリカン部分を欠失するPRRSV変異体を使用することによって、別のアッセイでは検出不能であった、wtPRRSV感染動物の血清中にPRRSV中和抗体が多量に存在するという証拠を始めて初めて提示する。PRRSV中和抗体は、宿主の反応中に存在するものの、GP5上のグリカン部分による中和エピトープの遮断若しくは遮蔽のため、感染しているwt PRRSVウィルス粒子と反応することができない。
アルテリウィルス中での糖タンパク質のグリコシル化による中和回避に関する1つの重要な前例が、乳酸脱水素酵素ウィルス(LDV)に関して記載されている。LDVは、その主要糖タンパク質であるVP−3が重度にグリカン遮蔽されているので、抗体中和に対して非常に耐性があるが、LDVの特定の天然株は、VP−3の外部ドメイン中の2つのグリコシル化部位を喪失しているので、中和に対して非常に感受性がある。興味深いことに、この中和感受性表現型は、これらの簡単に中和可能なLDV系によって獲得される宿主中での向神経性の高い程度と相関している。このような神経病原性の亢進は、おそらく、グリカン遮蔽の欠如によるものであるため、神経細胞中の受容体とのウィルス糖タンパク質の相互作用が促進されることを反映している。本発明者がPRRSVによる接種に使用した若齢ブタモデルにおいて、本発明者は、本発明者の所見を温度及びウィルス血症の測定結果に限定したが、PRRSV変異体の何れかとwt PRRSVの間に病原性の差異を検出できなかった。異なる実験条件下では(すなわち、妊娠中の雌ブタモデルにおいて)、これらのPRRSV変異体の病原性に幾らかの変化が観察されるかもしれないことはあり得る。天然の低グリコシル化されたPRRSV系という知見が、普遍的に存在するかどうかは不明であるが、先行報告は、前記系が存在することを示唆している。
本発明者の実験において注目すべき所見は、インビボでブタを感染させた場合に、GP5変異体が、感染の後期相で大きなwt PRRSV中和反応を開始する能力の点で、wt PRRSVを凌駕し得ることであった。平行するシナリオにおいて、本発明者は、類似のPRRSV変異体に対するより高い中和力価のみならず、wt PRRSVに対する大きな力価も観察した(表4A)。更に、反応は比較的早期に生じ、中和力価は感染から14日後に検出可能であり、これは、wt PRRSV感染では通例見られない観察であった(表4B)。PRRSV変異体に感染したブタから得た血清によってwt PRRSVの中和が亢進したことは、グリカンが存在するときに、中和抗体を誘導しない中和エピトープをグリカンが遮蔽していたことを示唆する。この所見は、より優れた、より有効性のあるPRRSVワクチンの設計に大きな重要性を有するものであり、合理的に設計される新しいワクチンが、中和抗体の産生を亢進させるために、GP5のグリコシル化パターンの修飾を有するべきであることを示唆する。更に、PRRSVの免疫学的に主要な糖タンパク質から炭水化物をこのように除去することによって、類似の免疫化系のみならず、関連性のない多様なPRRSV系のSN力価の増強に対しても有する可能性があるこの効果を研究することが重要である。
北米及び欧州PRRSV単離株中でのN結合型グリコシル化部位の同定
不活化可能であり、本発明の方法において使用できる配列番号1の参照GP5タンパク質中のアスパラギン34又はアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位を同定するために、所望の北米PRRSV単離株(図5)または欧州PRRSV単離株(図6)の何れかのGP5タンパク質を、配列番号1(北米NVSL97−7895系)の参照GP5タンパク質と並置する。本実施例では、並置のJotun−Hein法(Hein,J.J.In Methods in Enzymology,Vol.183:pp.626−645, 1990)を使用するDNASTAR,Inc.(Madison,WI,USA)製MegAlign(商標)プログラムを使用して、並置を実施した。多重配列比較パラメータは、ギャップペナルティ11及びギャップ長ペナルティ3であった。対で比較するために、Ktuple値2を使用した。
不活化可能であり、本発明の方法において使用できる配列番号1の参照GP5タンパク質中のアスパラギン34又はアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位を同定するために、所望の北米PRRSV単離株(図5)または欧州PRRSV単離株(図6)の何れかのGP5タンパク質を、配列番号1(北米NVSL97−7895系)の参照GP5タンパク質と並置する。本実施例では、並置のJotun−Hein法(Hein,J.J.In Methods in Enzymology,Vol.183:pp.626−645, 1990)を使用するDNASTAR,Inc.(Madison,WI,USA)製MegAlign(商標)プログラムを使用して、並置を実施した。多重配列比較パラメータは、ギャップペナルティ11及びギャップ長ペナルティ3であった。対で比較するために、Ktuple値2を使用した。
図5において、配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位が、図示されている北米PRRSV単離株の全てに存在し、N結合型グリコシル化部位「NGT」を含むことが明白である。このN結合型グリコシル化部位は、対応するポリヌクレオチド配列において、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンをアスパラギン51の代わりに使用することによって不活化することができる。これらの場合、低グリコシル化された北米PRRSVGP5タンパク質変異体における対応するアミノ酸配列は、「QGT」、「AGT」又は「XGT」等の配列を含む(Xは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。)。アスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化されている北米PRRSV単離株のこれら又は他の低グリコシル化されたバリアントは、他のN結合型グリコシル化部位が不活化される他の低グリコシル化されたGP5バリアントとも組み合わせられ得る。
配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン34に正確に対応するN結合型グリコシル化部位が、特定の北米PRRSV単離株中にのみ存在することが、また図5から明らかである。より具体的に、北米PRRSV単離株であるIAF−BAJ(配列番号3)、94−3182(配列番号7)及び94−287(配列番号8)のGP5タンパク質は、配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン34に正確に対応するN結合型グリコシル化部位を含有し、N結合型グリコシル化部位「NSS」を含む。配列番号3、7及び8のこのN結合型グリコシル化部位は、対応するポリヌクレオチド配列において、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンをアスパラギン34の代わりに使用することによって不活化することが可能である。これらの例では、低グリコシル化された北米PRRSV GP5タンパク質変異体中の対応するアミノ酸配列は、「QSS」、「ASS」又は「XSS」等の配列を含む(Xは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。)。
配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン34に正確に対応するN結合型グリコシル化部位を欠失する他の北米PRRSV単離株において、残基30(図5、配列番号2、3、4、6、7、8、9、11、13における「NAS」)及び残基33(図5、配列番号3における「NNS」、図8、配列番号6における「NSS」、図10、配列番号11、13における「NDS」)に位置する他のN結合型グリコシル化部位も不活化することが可能である。換言すれば、配列番号1の参照GP5タンパク質の残基30及び33に対応するアミノ酸の位置に存在する、他の北米単離株中のN結合型グリコシル化部位を不活化することも可能であり、本発明の方法において使用できる。
図6において、配列番号1の参照GP5タンパク質のアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位が、代表的な欧州PRRSV単離株中にも存在し、N結合型グリコシル化部位「NGT」を含むことは明白である。このN結合型グリコシル化部位は、対応するポリヌクレオチド配列において、グルタミン又はアラニン等の他のアミノ酸残基をコードするコドンを、アスパラギン51の代わりに使用することによって不活化することが可能である。これらの例では、低グリコシル化された欧州PRRSV GP5タンパク質変異体における対応するアミノ酸配列は、「QGT」、「AGT」又は「XGT」等の配列を含む(Xは、アスパラギン以外の何れかのアミノ酸である。)。アスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化されている欧州PRRSV単離株のこれら又は他の低グリコシル化されたバリアントは、他のN結合型グリコシル化部位が不活化された他の低グリコシル化されたGP5バリアントとも組み合わせられ得る。
上記の記述を考慮して、本発明の幾つもの利点が達成及び実現されることが明らかである。
前記の実施形態は、本発明の原理及びその実際的な利用を最良に説明することによって、他の当業者が、様々な実施形態で本発明を最良に利用し、想定される具体的な使用に適合するように、様々な修飾を加えて本発明を最良に利用できるようにするために選択及び記載されたものである。
本発明の範囲から逸脱することなく、記載及び例示されている本明細書中の構造及び方法に様々な変更を加えることが可能であるので、上述の記載に含有される又は後述の図面に示される全ての内容は、限定を加えるものではなく、例示として解釈されるべきであることが企図される。従って、本発明の広さ及び範囲は、上述の典型的な実施形態の何れによっても限定されるべきではなく、上述の特許請求の範囲及びその均等物に従ってのみ定義されるべきである。
多様な特許及び非特許参考文献が本明細書に開示されており、その各々は、その全内容が全体として参照により本明細書に明確に組み入れられる。
Claims (66)
- 配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34又はアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている、低グリコシル化されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス(PRRSV)GP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を投与することにより、PRRSV抗原に対するブタの改善された免疫応答を誘発することを含む、ブタにおけるPRRSV抗原に対する改善された免疫応答を誘発する方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、感染性PRRSVRNA分子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、感染性PRRSVRNA分子をコードするDNA分子を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記感染性PRRSVRNA分子が、北米PRRSV誘導体又は欧州PRRSV誘導体である、請求項2又は請求項3に記載の方法。
- 前記感染性PRRSVRNA分子が、低グリコシル化されたPRRSVGP5ポリペプチドバリアントタンパク質をコードする北米PRRSV誘導体であり、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34又はアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている、請求項2に記載の方法。
- 配列番号1におけるアスパラギン51に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化されている、請求項5に記載の方法。
- 配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応する前記N結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている、請求項5に記載の方法。
- 前記N結合型グリコシル化部位の両者が、前記アスパラギン34及び前記アスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項7に記載の方法。
- 別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする、請求項8に記載の方法。
- 前記コドンがアラニン残基をコードする、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、DNA分子を含み、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、低グリコシル化されたGP5タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドへ作用可能に連結されている、請求項1に記載の方法。
- 前記プロモーターがCMVプロモーターである、請求項11に記載の方法。
- 前記N結合型グリコシル化部位が、前記アスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項1に記載の方法。
- 別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項13に記載の方法。
- アスパラギン34に対応する前記N結合型グリコシル化部位が、前記アスパラギン34をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項1に記載の方法。
- 別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項15に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、低グリコシル化されたPRRSVGP5ポリペプチドバリアントタンパク質をコードし、配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応する前記N結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記N結合型グリコシル化部位の両者が、前記アスパラギン34及び前記アスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項17に記載の方法。
- 別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする、請求項18に記載の方法。
- 前記N結合型グリコシル化部位の1つが、前記アスパラギン34又は前記アスパラギン51をコードする1つのコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項17に記載の方法。
- 前記組成物が、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、非経口注射、筋肉内注射、無針注射、電気穿孔法、経口送達、鼻内送達、口腔鼻送達又はこれらの何れかの組み合わせによって投与される、請求項1に記載の方法。
- 前記組成物が、治療上許容される担体を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記担体が、タンパク質、緩衝液、界面活性剤及びポリエチレングリコールポリマー又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記組成物が、アジュバントを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、キルA(Quil A)、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア及びCpGオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びTGEVベクターからなる群から選択されるウィルスベクターを含む、請求項1に記載の方法。
- PRRSV抗原に対する前記ブタの前記改善された免疫応答が、前記ブタによるPRRSV中和抗体の増加された産生を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ブタが、成熟雌ブタ、雌ブタ、去勢されていない雄ブタ又は仔ブタである、請求項1に記載の方法。
- 低グリコシル化されたPRRSVGP5ポリペプチドバリアントをコードする前記ポリヌクレオチドが、直接的な合成、北米PRRSV単離株GP5ヌクレオチド配列の変異誘発又は北米PRRSVコンセンサスGP5ヌクレオチド配列の変異誘発によって得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記北米PRRSV単離株GP5ヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12及び配列番号13からなる群から選択されるペプチドをコードする、請求項29に記載の方法。
- 前記コンセンサス北米PRRSVGP5ヌクレオチド配列が、配列番号14と少なくとも85%同一であるコンセンサスGP5タンパク質をコードする、請求項29に記載の方法。
- 低グリコシル化されたPRRSVGP5ポリペプチドバリアントをコードする前記ポリヌクレオチドが、直接的な合成、欧州PRRSV単離株GP5ヌクレオチド配列の変異誘発又はコンセンサス欧州PRRSVGP5ヌクレオチド配列の変異誘発によって得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記欧州PRRSV単離株GP5ヌクレオチド配列が、配列番号15と少なくとも85%同一であるGP5タンパク質をコードする、請求項32に記載の方法。
- 前記欧州PRRSVGP5ヌクレオチド配列が、配列番号15である、請求項33に記載の方法。
- 配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34又はアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化されたPRRSV GP5ポリペプチドバリアントを含む組成物をブタに投与することにより、PRRSV抗原に対する前記ブタの改善された免疫応答を誘発することを含む、前記ブタにおけるPRRSV抗原に対する改善された免疫応答を誘発する方法。
- 配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米PRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードするポリヌクレオチドと、及び治療上許容される担体とを含む組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、感染性北米PRRSV RNA分子を含む、請求項36に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、感染性北米PRRSV RNA分子をコードするDNA分子を含む、請求項36に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、DNA分子を含み、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、前記低グリコシル化された北米PRRSV GP5ポリペプチドバリアントをコードする前記ポリヌクレオチドへ作用可能に連結されている、請求項36に記載の組成物。
- 前記プロモーターがCMVプロモーターである、請求項39に記載の組成物。
- 前記N結合型グリコシル化部位が、前記アスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項36に記載の組成物。
- アスパラギン以外のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項41に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、低グリコシル化された北米PRRSV GP5ポリペプチドバリアントタンパク質をコードし、配列番号1の北米参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応する前記N結合型グリコシル化部位の両者が不活化されている、請求項36に記載の組成物。
- 前記N結合型グリコシル化部位の両者が、前記アスパラギン34及び前記アスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項43に記載の組成物。
- 別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基の何れかをコードする、請求項44に記載の組成物。
- 前記N結合型グリコシル化部位の1つが、前記アスパラギン34又は前記アスパラギン51をコードする1つのコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項43に記載の組成物。
- 前記治療上許容される担体が、タンパク質、緩衝液、界面活性剤及びポリエチレングリコールポリマー又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項36に記載の組成物。
- 前記組成物が、少なくとも1つのアジュバントを更に含む、請求項34に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、キルA、アルミナゲル懸濁液、ミネラルオイル、グリセリド、脂肪酸、脂肪酸副産物、マイコバクテリア及びCpGオリゴデオキシヌクレオチド又はこれらの何れかの組み合わせからなる群から選択される、請求項48に記載の組成物。
- 前記組成物が、インターロイキン1(IL−1)、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−12、ガンマインターフェロン(g−IFN)、細胞壊死因子、MDP(ムラミルジペプチド)、免疫賦活薬複合体(ISCOM)及びリポソームからなる群から選択される第二アジュバントを更に含む、請求項48に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びTGEVベクターからなる群から選択されるウィルスベクターを含む、請求項36に記載の組成物。
- 配列番号1の参照GP5コンセンサスタンパク質におけるアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米PRRSVGP5ポリペプチドバリアントと、治療上許容される担体とを含む組成物。
- 配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米PRRSVGP5ポリペプチドバリアントをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号1におけるアスパラギン34及びアスパラギン51に対応するN結合型両グリコシル化部位が不活化されている、請求項53に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、感染性北米PRRSVRNA分子を含む、請求項53に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、感染性北米PRRSV RNA分子をコードするDNA分子を含む、請求項53に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、DNA分子を含み、哺乳動物細胞中で活性なプロモーターが、前記低グリコシル化された北米PRRSVGP5ポリペプチドバリアントをコードする前記ポリヌクレオチドへ作用可能に連結されている、請求項53に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記プロモーターがCMVプロモーターである、請求項57に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- アスパラギン51に対応する前記N結合型グリコシル化部位が、前記アスパラギン51をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項53に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項59に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン34に対応するN結合型グリコシル化部位が不活化されている、請求項53に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記アスパラギン34をコードするコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによる、請求項61に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 別のアミノ酸をコードする前記コドンが、アラニン又はグルタミン残基をコードする、請求項61に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記N結合型グリコシル化部位の1つが、前記アスパラギン34又は前記アスパラギン51をコードする1つのコドンを、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするコドンと置換することによって不活化されている、請求項61に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドが、ワクシニアウィルスベクター、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター及びTGEVベクターからなる群から選択されるウィルスベクターを含む、請求項53に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号1の参照GP5タンパク質におけるアスパラギン51に対応する少なくとも1つのN結合型グリコシル化部位が不活化されている低グリコシル化された北米PRRSV GP5ポリペプチドバリアントである単離されたポリヌクレオチド。
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