TW201605471A - 豬繁殖與呼吸道症候群病毒（ｐｒｒｓｖ）ｇｐ５爲主之組成物及方法 - Google Patents

豬繁殖與呼吸道症候群病毒（ｐｒｒｓｖ）ｇｐ５爲主之組成物及方法 Download PDF

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Abstract

本揭示包括一種用來對抗豬繁殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒(或PRRSV)以產生免疫反應之組成物及方法。本揭示某種程度上以使用二或更多個來自PRRSV GP5蛋白質細胞膜外區之胜肽區段為基礎，其中每個含有不同序列。本揭示描述出一種包含二或更多個區段之多胜肽或編碼出其的核酸之組成物及方法。

Description

豬繁殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)GP5為主之組成物及方法 發明領域
本揭示包括一種針對使用豬繁殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒(或PRRSV)多胜肽來對該多胜肽(因此PRRSV)產生免疫反應之組成物及方法。本揭示某種程度上基於使用多於一個在HV-2高變異區域內序列不同之GP5細胞膜外區(ectodomain)能夠產生出比使用單一細胞膜外區更寬廣的抗PRRSV免疫反應之認知。本揭示亦使用一種可編碼出多於一個細胞膜外區的核酸分子來產生較寬廣的免疫反應。本說明包括一種含有多於一個細胞膜外區的多胜肽或一或多個能編碼出該多胜肽之核酸分子的組成物。本發明亦描述出一種使用多胜肽、可編碼出其的核酸分子及/或本揭示之組成物來產生免疫反應的方法。
發明背景
PRRSV屬於動物RNA病毒家族之一的動脈炎病毒科(Ateriviridae)家族。如其它RNA病毒般，PRRS病毒的抗原性質會不斷變化，此在發展出對抗此致病物質之有效疫苗上產生最疑難的問題。但是，在PRRSV生物系統上有一 些基本原則未改變。重要的是，為了複製或生長，病毒會感染多細胞有機體的宿主細胞。為了感染，病毒必需附著至宿主細胞作為其生命循環的一部分。對附著來說，病毒必需具有一能識別出一或多個在宿主細胞上的特定受體之病毒受體識別蛋白質(RRP)。最後，宿主細胞的受體通常不會改變，因為其通常需要用於特別功能而不意欲用於病毒識別。
但是，病毒會使用此細胞受體來附著或識別宿主細胞。除了修改受體結構外，包含此宿主細胞的有機體可產生出能識別病毒的RRP抗體以阻礙病毒附著至宿主細胞。此抗體通常指為中和抗體(NA)。為了因應，病毒群經常包括或產生對其RRP修飾而讓其逃離NA之識別。但是，對RRP之修飾則由於此經修飾的RRP仍然必需識別出用於病毒附著之細胞受體的事實而有所限制。若修飾產生出無官能性RRP時，則病毒無法附著因此無法複製或存活。
發明概要
本揭示係關於顯現在豬繁殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒(或PRRSV)的GP5蛋白質中之胺基酸殘基的三維安排。此殘基或多胜肽區段安排顯現在GP5蛋白質之N終端部分處，且已經指為GP5蛋白質的細胞膜外區。本揭示包括將此區段使用在含胜肽、多胜肽、病毒顆粒或其它蛋白質的組成物之環境中。在某些具體實例中，此區段可以重組或融合胜肽或多胜肽形式呈現。在其它具體實例中，此區段可存在於重組的病毒顆粒或病毒中或與其一起。在進 一步具體實例中，可使用一種能編碼出包含該區段的胜肽或多胜肽之核酸分子來表現出用於本揭示之實行的區段。
本揭示某種程度上基於出乎意料的發現，其中可選擇在先前未獲評估的HV-2高變異區域內序列不同之細胞膜外區，以便使用於一能在動物中對PRRSV產生免疫反應(包括保護反應)的物質之製備及使用。在某些實例中，製備及使用至少二種PRRSV分離株(每種由於在HV-2區域內至少一個序列不同而包含不同的GP5蛋白質)來產生免疫反應。在其它實例中，製備及使用至少三或四種PRRSV分離株(每種由於至少在HV-2區域內的序列不同而包含不同的GP5蛋白質)來產生保護反應。
本揭示包括下列認知：GP5細胞膜外區可視為接在一推定的訊息序列之後，處於一推定的穿膜區域(或膜跨越區段或MSD)前之三個區域的組合。從GP5蛋白質的N終端相繼至C終端之順序來看，此些區域為HV-1高變異區域(“HV1”)、守恆區域(“CR”)及HV-2高變異區域(“HV2”)，然後其接著為推定的穿膜區域(“TR”或MSD)。第1圖提供一非為限制的實施例。因為HV2之識別對產生對抗PRRSV的免疫反應重要，本揭示包括至少二個在HV2序列中不同之GP5細胞膜外區的組合。在某些實例中，此至少二個細胞膜外區可存在於至少二種PRRSV分離株中，其能給藥而產生如描述於本文的免疫反應。
因此在第一觀點中，本揭示包括至少一第一多胜肽區段與一第二多胜肽區段之組合，其中每個區段包括共價 連結至HV2之守恆的GP5模體(motif)且每個區段為在遭受PRRSV感染的動物中之抗原。在許多具體實例中，此連結為一胜肽鍵或在多胜肽中於胺基酸殘基間之醯胺連結。GP5模體及HV2可鄰接，如此在相同多胜肽分子中的HV2立即接在此模體之後。在其它具體實例中，模體及HV2可由連結子(諸如，一或多個胺基酸殘基)分隔。在進一步具體實例中，除了胜肽鍵外，此模體及HV2可經由化學連結來連結。
本揭示的觀點包括另一個第一及第二多胜肽區段之具體實例，其中該些區段之至少一個為一延伸區段，其進一步包括共價連結至守恆的GP5模體之HV1。此產生至少一個包含至少三個區域(以相繼的順序標出為HV1、包含守恆的GP5模體之守恆區域(CR)及HV2)的區段。當然，本揭示的具體實例包括二或多於二個區段(諸如三或四個區段)之組合，其中此至少二個區段為如描述於本文的延伸區段。在某些實例中，在組合中的每個區段皆為延伸區段。
在某些具體實例中，至少二個多胜肽區段之組合為至少二種PRRSV分離株之組合，其每種包含該些區段之至少一個。在許多實例中，此些區段每個皆為一包含HV1、CR及HV2之延伸區段，其中每個區段因為在HV2內至少一個序列不同而不同。當然，此些區段可選擇性包含其它序列差異，諸如在HV1中的一或多個差異。
此些區段之組合可存在於GP5多胜肽之組合中，其中每個多胜肽皆存在於PRRSV分離株上。因此，本揭示包括二或更多種分離株之組合，其每種包含一具有延 伸的多胜肽區段(其包含如描述於本文的不同HV2序列)之GP5蛋白質。例如及在非為限制的四種分離株之組合中，第一多胜肽區段存在於第一分離株中，第二多胜肽區段存在於第二分離株中，第三多胜肽區段在第三分離株中及第四多胜肽區段存在於第四分離株中。每種分離株將與其它不同，至少由於在分離株的GP5蛋白質中之HV2序列不同。當然，於此些分離株中亦可存在有其它序列差異，諸如在HV1中的一或多個差異。
在除了GP5蛋白質外之以多胜肽為基礎的具體實例中，此第一及第二多胜肽區段可位於相同分子上或位於二個分離的多胜肽分子上。此第一及第二區段每個皆包括一守恆的GP5模體(由胺基酸序列C(E/S)LNG(T/A)，SEQ ID NO：1表示)。本揭示的具體實例包括在二個區段每個中之守恆的GP5模體皆相同之組合。再者，此第一及第二區段可經由在守恆的模體(如由SEQ ID NO：1指出)內有限的變化性(四種可能的序列)於序列及如此結構上不同。
如描述於本文，在組合中的每個區段皆包含一在每個區段當中皆不同之HV2序列。在延伸區段的實例中，於每個區段間之HV1序列亦可選擇性不同。此某種程度上基於下列非為限制的觀點，其中包含HV1、CR及HV2的延伸區段將形成一識別“口袋”，其應該在此組合的不同區段當中不同，以便當使用此組合來產生免疫反應時可提供增加的相異性。如此非為限制的實施例為，在HV2中之序列差異可在“口袋”結構中造成改變，同時在HV2及HV1二者中 的序列改變可對“口袋”結構造成不同的改變。及當本揭示的某些具體實例僅包括在HV2及HV1中之序列改變時，其它具體實例可包括在CR中的序列改變。
在許多具體實例中，HV2包含約8個胺基酸殘基及/或由三胜肽序列X0WL表示的守恆部分，其中X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一。此三胜肽序列可位於HV2的開始處或N終端末端處。在某些具體實例中，此守恆的三胜肽序列包含序列DWL，其中X0為天冬胺酸(D)。在其它具體實例中，X0為天冬醯胺酸(N)或除了天冬胺酸(D)外的任何其它胺基酸殘基。在進一步具體實例中，X0為酸性胺基酸殘基，諸如麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)；鹼性胺基酸殘基，諸如精胺酸(R)、離胺酸(K)或組胺酸(H)；含有脂肪族側鏈的胺基酸殘基，諸如丙胺酸(A)或異白胺酸(I)或甘胺酸(G)或白胺酸(L)或纈胺酸(V)；含有羥基包含側鏈的胺基酸殘基，諸如酥胺酸(T)或絲胺酸(S)；或含有芳香族側鏈的胺基酸殘基，諸如酪胺酸(Y)。
在第二觀點中，本揭示基於在二或更多個區段之組合的每個區段中之守恆的GP5模體及HV2之抗原性及/或致免疫性。在某些具體實例中，守恆的GP5模體及HV2及選擇性HV1之存在將形成一識別“口袋”，於至少二個區段的每個中將產生抗原性及/或免疫性，如此本揭示包括包含此些區段的抗原性及免疫性組成物。在額外的具體實例中，此些區段每個存在於與細胞膜或其它脂質雙層結合或關聯之各別多胜肽分子中。在某些實例中，此多胜肽分子包括 TR，諸如容易與薄膜或脂質雙層結合的GP5穿膜區段。在某些具體實例中，此膜可為無細胞的膜或細胞膜之片斷或部分，諸如環繞由細胞所產生的病毒顆粒之包膜或被覆。
進一步組成物包括二或更多個諸如與單一病毒顆粒或各別病毒顆粒膜結合或膜關聯之多胜肽分子。此病毒顆粒可為感染或非感染型，及各自獨立地為有或沒有複製能力。此病毒顆粒可為PRRSV顆粒或另一種病毒顆粒，諸如包含此多胜肽分子的重組病毒顆粒。可使用來表現出本揭示之多胜肽的重組病毒顆粒之非為限制的實施例包括豬腺病毒及痘病毒。
感染及充分複製型二者的病毒顆粒可指為病毒體。因此在某些具體實例中，此組成物可包括二或更多個諸如與單一病毒體或各別病毒體膜結合或膜關聯之多胜肽分子。在包含二或更多種病毒體(諸如二或更多種PRRSV顆粒)的組成物之具體實例中，其一或多種可為包含如描述於本文的第一或第二多胜肽區段之天然產生的PRRSV顆粒或分離株。在某些實例中，多於一種(最多全部)顆粒為天然產生的分離株。
當然，本揭示的額外具體實例包括多於二個多胜肽區段或病毒顆粒之組合，其每個皆包含如描述於本文之守恆的GP5模體及HV2、選擇性含有HV1。在本揭示的範圍內亦陳述出包含除了第一及第二多胜肽區段外的額外多胜肽區段之如此組成物。當然在此些具體實例中，於一組合的每個多胜肽區段中之HV2及選擇性HV1與在此組合之每個其 它區段中的HV2及選擇性HV1於序列及如此結構上不同。
在進一步觀點中，本揭示包括一種製備描述於本文的組成物之方法。在某些具體實例中，此方法可包括識別或選擇出至少第一多胜肽區段及第二多胜肽區段(每個區段皆如於本文所描述)，及結合該些區段而形成一組成物。在許多實例中，此方法可包括識別或選擇出至少一包含第一區段的第一多胜肽分子與一包含第二區段的第二多胜肽分子，且結合此些多胜肽而形成一組成物。在某些實例中，此結合可包括加入一或多種醫藥上可接受的賦形劑及/或載劑來形成一組成物。
在其它具體實例中，可以於每種分離株中的HV2序列為基礎在PRRSV分離株當中進行識別或選擇。在某些實例中，可藉由一起偵測HV2序列與GP5分子的一或多個其它部分(諸如守恆的模體或HV1)來進行識別或選擇。此偵測方法之一個非為限制的實施例包括使用能識別所提供的HV2序列(選擇性與GP5分子的另一個部分組合或在其背景中)之抗體。其它非為限制的偵測方法包括HV2之胺基酸定序或編碼出HV2的序列之核酸定序。
在某些具體實例中，可偵測在來自動物患者(諸如感染有PRRSV之個體)的生物流體樣品中之PRRSV。該方法可包括讓該樣品或其稀釋形式與一黏合劑(其黏合在GP5蛋白質中之HV2的至少一部分)接觸。該樣品可來自豬患者，但是可使用任何由PRRSV感染的患者或PRRSV載體。此生物流體可為檢測存在有GP5蛋白質及/或PRRSV顆粒的 任何流體。非為限制的實施例包括患者的身體分泌物，諸如唾液、淚液、黏液、鼻涕及陰道分泌物；和其它身體流體，諸如血液、血清、血漿、精液、精漿及尿；和排泄物之任何流體組分或排泄物之流體萃取物。
在進一步具體實例中，可進行不具有HV2與如揭示於本文的序列之新穎PRRSV分離株的鑑別、選擇或偵測。在本揭示諸如與揭示於本文的含一、二、三、四或更多個區段之PRRSV分離株的組合中可有利地使用一新穎的分離株。預計含有此新穎的分離株之組合將優良，因為其將具有產生抗體或免疫反應(其當與對缺乏此新穎分離株的組合之反應比較時新穎)的較高可能性。
如上述指出，本揭示的額外觀點為一種產生抗體反應(體液免疫反應)或免疫反應之方法。在某些具體實例中，此方法可包括將如描述於本文的多胜肽區段之組合給藥至具有能產生反應的免疫系統之動物患者。雖然所提供的反應可視為包括一針對此些區段或包含此些區段的多胜肽之反應，本揭示包括產生一亦能識別出在一或多個PRRSV分離株中的GP5之反應。在某些具體實例中，此抗體反應包括產生一或多種中和抗體。在其它具體實例中，此免疫反應包括產生一或多個細胞免疫反應，諸如T細胞主導的反應。在某些實例中，此抗體反應或免疫反應為一種對抗PRRSV顆粒(諸如表現出包含本揭示的多胜肽區段之GP5蛋白質的顆粒)之保護反應。
在某些實例中，此抗體反應或免疫反應為對抗至 少二種在HV2中不同之PRRSV變種或株(諸如，可能存在於特別的地理區域內之那些)。本揭示的如此具體實例包括對抗一或多種在歐洲流行的萊利斯塔德(Lelystad)分離株變種、一或多種PRRSV的北美或韓國血清類型變種或一或多種在亞洲或南美發現的PRRSV變種之反應。
在額外的具體實例中，於患者中產生抗體或免疫反應之方法可包括如描述於本文般識別或選擇出至少第一多胜肽區段與第二多胜肽區段，接著將所選擇的區段給藥至患者以產生抗體或免疫反應。在某些具體實例中，可識別或選擇出至少一包含第一多胜肽區段的第一多胜肽與一包含第二多胜肽區段的第二多胜肽，接著將所選擇的多胜肽給藥至患者。在許多實例中，該第一及第二多胜肽之至少一種可存在於PRRSV分離株中。在某些實例中，每個多胜肽皆存在於PRRSV分離株中。
在另一個具體實例中，可識別或選擇出至少一包含第一多胜肽區段的第一PRRSV分離株與一包含第二多胜肽區段的第二PRRSV分離株，接著將所選擇的分離株給藥至患者。在某些具體實例中，識別或選擇出至少三種或至少四種或更多種分離株。在許多實例中，此選擇以在PRRSV分離株的GP5蛋白質中之HV2序列為基礎。可使用任何合適的方法來進行以HV2序列為基礎的識別或選擇，包括(但不限於)HV2的胺基酸序列分析、以PCR為基礎或以抗體為基礎的HV2偵測；或在先前標出特徵的PRRSV分離株中之HV2序列知識。
在伴隨的圖形及下列描述中提出本揭示的一或多個具體實例之細節。本揭示的其它特徵、目標及優點將從圖形及詳細說明及從申請專利範圍中明瞭。
第1圖顯示出典型的美國型PRRSV株(VR-2332)及歐洲型PRRSV株(萊利斯塔德株，LV)之胺基酸序列比較。每個推定的訊息序列與HV1、“守恆區域”或CR(包括守恆的GP5模體)及HV2(有劃底線)一起鑑別。其亦指出HV1之典型及非為限制的起始位置。
第2圖為如揭示於本文的PRRSV分離株群之圖式表示。
第3圖顯示出來自公開可得到的PRRSV序列之GP5細胞膜外區序列(包括守恆GP5模體及HV2)的一部分之排列。一起指出與該些序列相符合的NCBI(國家生物工藝學資訊中心(National Center for Biotechnology Information))登錄號碼與此些分離株。此些分離株包括北美及歐洲株二者和其它型式。
第4圖闡明在PRRSV與宿主豬細胞間之GP5蛋白質主導的交互作用。
第5圖為GP5蛋白質的胺基酸序列之凱特-都里透(Kyte-Doolittle)疏水性圖。所指出的號碼來自美國分離株。在約胺基酸殘基62處快速偏移至疏水殘基，此與推定的穿膜區域之開始相符合。
第6圖提供典型的PRRSV GP5蛋白質編碼序列之基因銀行(Genbank)登錄及GI編號。
定義
如使用於本文，名稱“豬繁殖與呼吸道症候群(PRRS)病毒或PRRSV”指為一已經報導會造成PRRS；神秘豬病(Mystery Swine Disease)(MSD)；豬不育及呼吸道症候群(SIRS)，其先前已知為“藍耳症候群”；豬流行性流產及呼吸道症候群(PEARS)；瓦巴什(Wabash)症候群；神秘豬病(Mystery Pig Disease)(MPD)；豬瘟；在大英聯合國為藍色流產病或藍耳病；在荷蘭為藍色流產兒(abortus blau)；在德國為豬繁殖與呼吸道症候群(seuchenhafter spatabort der schweine)；及黑克黑克(Heko-Heko)疾病(清水(Shimizu)等人，1994)的病毒。此病毒所造成的症狀之額外另一種名稱包括藍耳病、藍耳豬病、豬神秘病(enfermedad misteriosa del cerdo)、豬流行性流產(epidemisch spatabort der sauen)、藍耳病(Lane r bing)(中國)、藍豬病(maladie blue du porc)、豬神秘病(maladie mysterieuse du porc)、神秘豬病(Mystery pig disease)；新的豬病(New pig disease)，1988-1989的瘟疫；Ratselhafte schweinekrankheit、豬繁殖與呼吸道症候群(sindrome disgenesico y respiratorio del cerdo)、豬神秘症候群(sindrome misterioso del cerdo)、豬繁殖與呼吸道症候群(syndrom reproductive et respiratoire du porc)、豬繁殖與呼吸道症候群(syndrome dysgenesique et respiratoire du porc)及HAAT症候群(母豬發燒厭食流產(hyperthermie-anorexie-avortement de la truie))。
如於本文中所使用的名稱PRRSV之“GP5蛋白質”及“主要包膜糖蛋白”指為由如在技藝中所了解由PRRSV基因組之ORF5所編碼出的多胜肽。典型且非為限制，GP5序列編碼序列包括由在第6圖中所提供的登錄及GI編號所鑑別之那些。不由理論所限制且提供以改良對本揭示之了解，咸信由PRRSV基因組之ORF5所編碼出的GP5蛋白質為一在PRRSV中的受體識別蛋白質(RRP)。GP5蛋白質的細胞膜外區從約胺基酸N30至約D61(對美國株來說)及從約D33至G63(對歐洲株來說)開始(參見第1圖)。在美國型式株與歐洲株間的典型差異為：(1)GP5蛋白質之總胺基酸各別為200及201；(2)與美國株比較，歐洲株具有較長的訊息序列；及(3)與美國株比較，歐洲株顯示出較少變化。本揭示某種程度上基於在每個中的HV2(大約1740 GP5序列)及其各別的細胞膜外區之分析及鑑別。典型的序列顯示在第3圖中。雖然本揭示可使用那些典型的序列來實行，但本揭示不限於此。
名稱“HV-1區域”或“HV1”指為存在於如描述於本文的GP5之守恆區域的N終端末端處之多胜肽序列。此區域選擇性存在於本揭示的多胜肽區段中。但是當存在時，此序列的長度最高可為約14或更多個胺基酸殘基，特別考慮到長度11、12、13及14。在其它具體實例中，亦可使用長度約11、約9、約7、約5或約3或較少個殘基。本揭示包括此區域的序列相當大地不同之具體實例。HV1序列之非為限制的實施例包括顯現在第3圖中的那些。
在所揭示的序列中之胺基酸殘基可守恆地經由另一個具有類似的特徵及性質之殘基取代或置換。如於本文中所使用，本揭示之守恆的胺基酸取代顯示在下列表1中。
較佳實施例之詳細說明/實行本揭示之模式的詳細說明 共通部分
本揭示某種程度上基於現在PRRSV基因訊息(諸如GP5蛋白質之DNA序列)的分析。亦分析分離自顯示出臨床PRRS症狀的豬之PRRSV序列。此分析導致二個高變異區域(HV-1及HV-2)之識別，其中HV-2區域以任一X0WL三胜肽模體開始，其中X0為如描述於本文之20個天然產生的胺基酸殘基之一。此分析亦導致在美國株之位置I42至T53中及在歐洲株之位置I44至T55中的守恆區域之識別(參見第1圖)。
在PRRSV的美國株及歐洲株當中，於細胞膜外區中的守恆區域之存在指出此守恆區域參與在GP5蛋白質(如為受體識別蛋白質)與於欲由PRRSV感染的宿主細胞上之受體間的直接接觸。基於此構想且不由理論所限制，咸信在守恆區域的任一邊上之二個HV區域提供作為維持此守恆區域的疏水性質之“閘”(或結構模體)。HV-1區域及守恆區域之先前評論並未發展出GP5蛋白質致免疫性的研究，因為在HV-1區域中的變化太多。但是按照在HV-2中的高變異能力，預計HV-2將參與在GP5與宿主細胞受體間之交互作用並不合邏輯。
本揭示某種程度上亦基於可組合著考量在HV-1區域中的變化與顯示出較少變化的HV-2序列之認知。因此，本揭示包括(1)以HV2序列變化為基礎來分類PRRSV分離株，以免疫學類似物為基礎來分組；及(2)選擇在不同組 中的PRRSV株之組合，以製得在給藥後能提供較寬廣的異種保護之寬廣範圍的疫苗。此分類及選擇可選擇性包括考慮HV-1區域。額外的是，在以疫苗或免疫性組成物給藥前，首先選擇性減弱或失活此些分離株。減弱之非為限制的實施例包括由熟練人士已知的方法，諸如在培養基中(諸如在細胞或組織中)連續傳代(serial passage)或在動物中傳代。當然可試管內進行傳代。失活之非為限制的實施例包括由熟知技藝之人士已知的那些，諸如加熱、輻照、化學失活處理。
本揭示包括以胺基酸位置61為準將全部美國株選擇性分成二組。已報導多於85%的美國型式分離株在位置61處包括D(Asp)或S(Ser)。例外(少於15%)通常為在位置61處具有除了C(Cys)、F(Phe)、M(Met)、W(Trp)及P(Pro)外的胺基酸殘基。因此，本揭示包括與位置61相符合的第一HV2殘基為除了C、F、M、W及P外之胺基酸殘基的具體實例。在某些具體實例中，此殘基選自於A(Ala)、G(Gly)、V(Val)、L(Leu)、I(Ile)、S(Ser)、T(Thr)、N(Asn)、E(Glu)、Q(Gln)、R(Arg)、K(Lys)、H(His)或Y(Tyr)。但是，在另一個具體實例中，此殘基選自於C、F、M、W或P。
本揭示包括以所觀察的序列訊息為準將美國株選擇性分類成二群(群組D及群組S)，且每群含八個子群(各別為D-1至D-8及S-1至S-8)。本揭示進一步包括以所觀察的序列訊息為準將全部歐洲株分成八個(8)子群(E-1至E-8)。這些群組闡明在第2圖中。
此些群組及子群為本揭示的某些具體實例之基礎，其中可選擇及使用來自不同群組或子群的至少第一及第二多胜肽區段(每個包含共價連結至HV2之守恆的GP5模體，如描述於本文)之組合，以產生一可產生比分別(或各別)使用此些多胜肽區段更寬廣的抗體或免疫反應之組成物或疫苗。在某些具體實例中，於本揭示之實行中使用二至四或更多個多胜肽區段的組合。在進一步具體實例中，使用來自一個群組或子群的區段可導致對多於一個來自相同群組或子群的區段產生抗體或免疫反應。
本揭示之非為限制的實施例包括至少四個區段之組合，其中從描述於本文的24個子群(如D-1至D-8、S-1至S-8及E-1至E-8)之一中選擇出此四個的每個(沒有重複)。可能的組合數之粗糙近似值由數學式(24×23×22×21)/(4×3×2×1)提供或為約10,600。但是在某些具體實例中，若每個組合包括至少一個來自群組D及群組S之子群每個的區段和一個來自E-1至E-8的區段時，可能的組合數明顯減少。此實施例的粗糙近似值由式(8×8×8×21)/(4×3×2×1)提供或為約448。在僅使用群組D及群組S子群的其它具體實例中，可能的組合數亦減少。類似地，使用來自E-1至E-8的四個區段之具體實例時，其可能的組合數進一步減少。
更廣泛來說，本揭示之組成物或疫苗可包括至少一個來自如描述於本文的D及S群組每組之多胜肽區段。因此，二個區段的組合可具有來自D及S群組每個之一個區 段。在其它具體實例中，此組成物或疫苗可包括一D子群區段及/或S子群區段之任何組合的任何組合。因此，二個區段的組合可具有二者皆來自群組D或二者皆來自群組S或每個群組皆一個。在許多具體實例中，於組合中所使用的多胜肽區段存在於使用作為本揭示的組成物或疫苗之PRRSV分離株的GP5蛋白質中。因此，本揭示亦包括以在GP5蛋白質中的HV-2序列為基礎來識別，且將PRRSV分離株分類至描述於本文的相同群組及子群中。然後，可如所揭示般來選擇經分類的分離株。
至於額外非為限制的實施例，本揭示之組成物或疫苗可包括：一來自D-1子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它D子群或任何S或E子群之分離株或區段；一來自D-2子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它D子群或任何S或E子群之分離株或區段；一來自D-3子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它D子群或任何S或E子群之分離株或區段；一來自D-4子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它D子群或任何S或E子群分離株或區段；一來自D-5子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如 二或三或更多個)來自任何其它D子群或任何S或E子群之分離株或區段；一來自D-6子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它D子群或任何S或E子群之分離株或區段；一來自D-7子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它D子群或任何S或E子群之分離株或區段；或一來自D-8子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它D子群或任何S或E子群之分離株或區段。
再者，本揭示之組成物或疫苗可包括：一來自S-1子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它S子群或任何D或E子群之分離株或區段；一來自S-2子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它S子群或任何D或E子群之分離株或區段；一來自S-3子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它S子群或任何D或E子群之分離株或區段；一來自S-4子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它S子群或任何D或E子群之分離株或區段； 一來自S-5子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它S子群或任何D或E子群之分離株或區段；一來自S-6子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它S子群或任何D或E子群之分離株或區段；一來自S-7子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它S子群或任何D或E子群之分離株或區段；或一來自S-8子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它S子群或任何D或E子群之分離株或區段。
類似地，包括本揭示之組成物或疫苗的本揭示之具體實例可包括：一來自E-1子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它E、D或S子群之分離株或區段；一來自E-2子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它E、D或S子群之分離株或區段；一來自E-3子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它E、D或S子群之分離株或區段；一來自E-4子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它E、D或S子群之分離株或區段；一來自E-5子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它E、D或S子群之分離株或區段； 一來自E-6子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它E、D或S子群之分離株或區段；一來自E-7子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它E、D或S子群之分離株或區段；或一來自E-8子群的分離株或區段及至少一或多個(諸如二或三或更多個)來自任何其它E、D或S子群之分離株或區段。
但是，在某些具體實例中，本揭示之組合不為如描述於本文的VR2332及LV之GP5細胞膜外區的組合。在其它具體實例中，本揭示之組合不為僅有GP5細胞膜外區與橋接在HV2與GP5之推定的穿膜區域間之界面的下列序列之組合：
ANKFDWAVET(SEQ ID NO：7)
ANKFDWAVEP(SEQ ID NO：8)
AGEFDWAVET(SEQ ID NO：9)
ADKFDWAVEP(SEQ ID NO：10)
ADRFDWAVEP(SEQ ID NO：11)或
SSHFGWAVET(SEQ ID NO：12)。
但是，本發明特別考慮到的具體實例包括一些區段之組合，其中在X0WL中的X0殘基與在HV2序列中的至少一個額外殘基二者於此組合之區段間不同。
如描述於本文，每個多胜肽區段(及如此每種分離株)皆包括由胺基酸序列C(E/S)LNG(T/A)，SEQ ID NO：1所表示之守恆的GP5模體。如此，本揭示之具體實例包括由胺 基酸序列CELNGT(SEQ ID NO：2)、CELNGA(SEQ ID NO：3)、CSLNGT(SEQ ID NO：4)或CSLNGA(SEQ ID NO：5)所表示的GP5模體之區段。在其它具體實例中，守恆的GP5模體較大及由胺基酸序列I(Y/F)(N/D/S/K)(L/S/F/M)(T/P/M)(L/I)C(E/S)LNG(T/A)，SEQ ID NO：6表示，其與顯示在第1圖中的“守恆區域”相符合。
病毒為基礎的組成物
如描述於本文般，本揭示以在多胜肽區段中組合著使用守恆的GP5模體與HV2之抗原性及/或致免疫性為基礎。因此，本揭示包括如上所述之病毒分離株的組合。非為限制的實施例包括編列在第3圖的病毒分離株之組合(以其序列儲存訊息為準)，如它們可分類成揭示於本文的群組及子群。在某些具體實例中，預計在本揭示之實行上使用至少二或更多個(諸如三或四或更多個)那些分離株之組合。
本揭示額外包括病毒分離株與病毒顆粒之組合，其中每種皆包含一於本文所揭示的組合之多胜肽。在其它具體實例中，使用二或更多種病毒顆粒。本揭示之包含多胜肽區段的病毒顆粒之非為限制的實施例包括感染或非感染型病毒顆粒，其各自獨立地具有或不具有複製能力。額外非為限制的實施例包括試管內培養或傳代之病毒顆粒、減弱的病毒及重組病毒顆粒。
在許多具體實例中，此病毒顆粒為一具有外膜(其包括含有本揭示之多胜肽區段的GP5蛋白質)之PRRSV顆粒。在其它具體實例中，此病毒顆粒可為具有一包含多 胜肽區段(選擇性為如描述於本文的GP5蛋白質之一部分)外膜之非PRRS病毒。進一步具體實例包括具有一包含二或更多個所揭示的多胜肽區段之外膜(諸如經由二或更多種具有如描述於本文的不同細胞膜外區之GP5蛋白質)的PRRSV或非PRRSV病毒顆粒。在某些實例中，此病毒顆粒為一含有一基因組(其包括可編碼出GP5蛋白質的ORF5序列之多重複製品)之PRRSV。此些病毒分離株先前已報導及指為“高產突變型(overproduction mutant)”或“高複製表現型”PRRSV。本揭示包括諸如已經重組改質而包含及表現出多於一種GP5蛋白質(每種皆如描述於本文般包含一具有不同的HV2區域之多胜肽區段)的PRRSV。在其它具體實例中，此重組病毒可為昆蟲病毒，諸如桿狀病毒(其先前已經報導能表現出PRRSV GP5蛋白質)、豬腺病毒或痘病毒。
在進一步具體實例中，此病毒分離株或病毒顆粒為感染型且具複製能力，諸如PRRSV分離株或感染型顆粒。在大部分實例中，此顆粒包括一能編碼出及在感染後活體內產生GP5而表現出GP5蛋白質之基因組。具感染及複製能力二者的顆粒可指為病毒體。在另一個具體實例中，本揭示之顆粒為感染型且不具複製能力，但是其選擇性能細胞內表現出GP5蛋白質。
在包含使用PRRSV分離株的具體實例中，此分離株可以在分離株中的HV2序列為基礎來識別或選擇。在某些實例中(諸如表示在本文第3圖中的分離株)，可基於序列訊息的回顧或基於在已標出特徵的分離株中之HV2序列的 知識來識別或選擇。在其它實例中(諸如先前尚未標出特徵的分離株)，可藉由偵測HV2序列來選擇，諸如使用可識別所提供的HV2序列之抗體、定序該分離株之GP5編碼序列(ORF5)、或純化及胺基酸定序GP5蛋白質其本身。以抗體為基礎的偵測之非為限制的實施例包括免疫沉澱(immunoprecipitation)及試驗，諸如ELISA、RIA及西方墨點法。定序之非為限制的實施例包括DNA分子之以二去氧核苷酸為基礎的定序及以PCR為基礎的定序(包括以編碼出GP5的RNA分子之反轉錄接著PCR為基礎的方法)。在某些具體實例中，此分離株之選擇包括偵測GP5蛋白質除了HV2外之一或多個部分的序列，諸如守恆的模體及/或HV1。
在以抗體為基礎的偵測方法之許多具體實例中，此抗體不黏合至如在多重PRRSV株及分離株中所發現的GP5蛋白質。反而，此抗體應該對HV2足夠特定，如此其能全部或部分以HV2序列或結構為基礎來偵測特別的分離株。除了使用抗體(諸如經標定的抗體)來使其偵測容易外，亦可使用黏合PRRSV GP5蛋白質的HV2之抗體片斷。此抗體片斷可為HV2黏合抗體的Fv或Fab區域；其它非為限制的實施例包括單鏈抗體，包括單鏈Fv區域及單鏈Fab區域。此抗體及抗體片斷較佳為單株，但是在某些實例中可為多株。
在進一步具體實例中，使用來自豬患者(諸如感染有PRRSV的個體)之生物流體樣品來偵測PRRSV分離株。該方法可包括讓該樣品或其稀釋形式與一黏合GP5蛋白質的HV2之黏合劑接觸，以排除存在於生物流體中之其它 分子較佳。在許多具體實例中，此患者為豬且此樣品可來自豬的身體流體或分泌物。可獲得樣品以使用於本揭示的豬之非為限制的實施例包括公豬、母豬、養肥的禽畜及女豬。此豬的年齡範圍可從1至約30、31至約40、41至約50、或51至約60天或較大。
當然，此生物流體應該為一檢測性存在有GP5蛋白質及/或PRRSV顆粒的流體。非為限制之實施例包括身體分泌物，諸如唾液、淚液、黏液、鼻涕及陰道分泌物；和其它身體流體，諸如血液、血清、血漿、精液、精漿及尿；和排泄物的任何流體組分或排泄物之流體萃取物。
若此生物流體包含PRRSV顆粒時，可使用以PCR為基礎的方法來偵測，以偵測編碼出GP5蛋白質之核酸分子，諸如包含GP5蛋白質或編碼出至少HV2的分子之一部分的DNA或RNA分子。
在額外的具體實例中，可選擇及偵測出具有GP5蛋白質(其含有一與任何於本文所揭示者或如先前所標出的特徵不同之HV2序列)的PRRSV分離株。此新穎的分離株仍然可歸類至如揭示於本文的群組或子群之一中。再者，此分離株可未歸類至所揭示的群組或子群之一中，如此可有利地使用作為所揭示的組合之部分，因為此新穎的分離株將具有能產生新穎的抗體或免疫反應之較高可能性。
因此，本揭示包括一種將包含含有與於本文所揭示的任何HV2序列不同之HV2序列的GP5蛋白質之PRRSV分離株使用在患者中來產生抗體或免疫反應的方法。因 此，此分離株之HV2可不為任何於本文所描述者或可包括任何所揭示的群組或子群。此方法可包括識別出此PRRSV分離株包含一含有可與第3圖的任何HV2序列、或任何D、S或E子群區別之HV2區域的GP5多胜肽分子；及將該分離株給藥至患者，以在患者中產生抗體或免疫反應。可藉由於本文所揭示的任何方法(至於非為限制的實施例包括以抗體或核酸為基礎的方法)，接著與本揭示比較來識別或決定出可區別的HV2序列。在某些具體實例中，如描述於本文般減弱或失活此分離株。
多胜肽及組成物
如描述於本文般，本揭示以包含守恆的GP5模體及HV2之多胜肽區段的抗原性及/或致免疫性為基礎。HV2部分促成此區段之抗原性及/或致免疫性，使得組合著使用包含二個不同區段的多胜肽分子造成產生較寬廣的抗體或免疫反應(與僅使用此些區段之一比較)。因此，本揭示包括二或更多個多胜肽區段之組合(諸如在組成物或疫苗中)和其在讓患者免疫的方法中之用途。
此多胜肽區段的本質已經描述於本文。通常來說，此區段包括共價連結至HV2區域之守恆的GP5模體。許多具體實例具有胜肽鍵或醯胺連結來連結該GP5模體及HV2，以便當從N終端至C終端來考慮此序列時它們鄰近。其它具體實例包括使用連結子部分。連結子部分之非為限制的實施例包括短胜肽序列，諸如長度約1、2、3、4或5個胺基酸；及非胜肽連結子，諸如在鏈中含有至少一個碳原 子的原子短鏈或其它合成連結子。在短胜肽序列的實例中，此胺基酸可為任何天然產生的胺基酸，諸如於本文表1中的胺基酸。在某些可替代的具體實例中，模體及HV2可經由非胜肽鍵連結(諸如碳碳鍵)來共價連結。
隨著使用第一及第二多胜肽區段，此些區段可位於相同多胜肽分子或二個分離的分子上。在許多具體實例中，此些區段位於各別的多胜肽分子上，其每個皆包括穿膜區段或其它允許與脂質雙層結合的蛋白質區段。此穿膜區段亦可存在於包含二區段的單一多胜肽分子中。在某些具體實例中，該穿膜區段為如已由熟知技藝之人士所知及如描述於本文的PRRSV GP5蛋白質之推定的穿膜區域。
在許多具體實例中，此些區段位於各別的GP5蛋白質上。在許多其它具體實例中，此些區段在守恆的GP5模體中具有相同序列，諸如由CELNGT(SEQ ID NO：2)表示。但是甚至具有相同的守恆GP5模體，此第一及第二多胜肽區段的HV2序列不同，此說明出想要的在區段間之抗原性及/或致免疫性不同。
在包含第一及第二多胜肽區段的各別GP5蛋白質之許多具體實例中，每個GP5蛋白質可包含(從N終端至C終端)推定的訊息序列、HV-1高變異區域、包括守恆的GP5模體之守恆區域(CR)、HV-2高變異區域、推定的穿膜區域及GP5蛋白質之剩餘者。在其它具體實例中，GP5蛋白質可缺乏全部或部分的推定訊息序列。當然，亦可使用保留有所揭示的多胜肽區段之抗原及/或免疫性質但是含有較少 GP5組分的多胜肽分子。非為限制的實施例包括一包含下列之多胜肽分子：HV-1高變異區域、包括守恆的GP5模體之守恆區域(CR)及HV-2高變異區域，選擇性含有如上所述的穿膜區段。
通常來說，所揭示的HV2區域長度為約8個胺基酸殘基。在另一個具體實例中，此長度可為6、7、8、9或10個殘基長。殘基的精確數目不重要，只要所產生的區段保留想要的抗原及/或免疫活性。在某些具體實例中，HV2以三胜肽序列X0WL開始，其中X0如於本文中所定義。因此在某些具體實例中，HV2由序列X0WLX1X2X3X4X5表示，其中X0、X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為顯示在表1中之天然產生的胺基酸殘基之一，及X5選自於任何胺基酸殘基，選擇性除了C(Cys)、F(Phe)、M(Met)、W(Trp)及P(Pro)外。
在其它具體實例中，HV2為由X0WLX1X2X3X4D所表示的D群組序列，其中天冬胺酸(D)殘基(在X0WLX1X2X3X4D的末端處)可由除了C、F、M、P、W、S、T及Y外之任何胺基酸殘基置換(諸如由A、G、V、L、I、N、E、Q、R、K或H置換)，及其中X0如上所述；及由下列所表示的子群D-1至D-8之一：D-1：其中X1為脂肪族胺基酸殘基、X2為酸性胺基酸殘基(或X1為酸性胺基酸殘基及X2為脂肪族胺基酸殘基)、X3為鹼性胺基酸殘基及X4為包含芳香環的胺基酸殘基，諸如苯丙胺酸(F)；D-2：其中X1為脂肪族胺基酸殘基，X2為Ser、Thr、Tyr 或鹼性胺基酸殘基(或X1為Ser、Thr、Tyr或鹼性胺基酸殘基及X2為脂肪族胺基酸殘基)，X3為鹼性胺基酸殘基及X4為包含芳香環的胺基酸殘基，諸如苯丙胺酸(F)；D-3：其中X1及X2每個各自獨立地為脂肪族胺基酸殘基、X3為鹼性胺基酸殘基及X4為包含芳香環的胺基酸殘基，諸如苯丙胺酸(F)；D-4：其中X1為酸性胺基酸殘基，X2為Ser、Thr、Tyr或鹼性胺基酸殘基(或X1為Ser、Thr、Tyr或鹼性胺基酸殘基及X2為酸性胺基酸殘基)，X3為鹼性胺基酸殘基及X4為包含芳香環的胺基酸殘基，諸如苯丙胺酸(F)；D-5：其中X1及X2每個各自獨立地為酸性胺基酸殘基，X3為鹼性胺基酸殘基及X4為包含芳香環的胺基酸殘基，諸如苯丙胺酸(F)；D-6：其中X1及X2每個各自獨立地為天然產生的胺基酸殘基之一，X3為酸性胺基酸殘基及X4為包含芳香環的胺基酸殘基，諸如苯丙胺酸(F)；D-7：其中X1及X2每個各自獨立地為天然產生的胺基酸殘基之一，X3為具有羥基包括R基團的非芳香族胺基酸殘基(諸如Ser或Thr)及X4為包含芳香環的胺基酸殘基，諸如苯丙胺酸(F)；或D-8：其中X1及X2每個各自獨立地為鹼性胺基酸殘基或包含芳香環的胺基酸殘基，諸如酪胺酸(Y)、絲胺酸(S)、酥胺酸(T)或苯丙胺酸(F)；X3為鹼性胺基酸殘基及X4為包含芳香環的胺基酸殘基，諸如苯丙胺酸(F)。
在額外的具體實例中，HV2為由X0WLX1X2X3X4X5(其中X0如上所述)所表示的S群組序列及由下列所表示的子群S-1至S-8之一：S-1：其中X1為酸性胺基酸殘基，X2為天冬醯胺酸(N)，X3為鹼性胺基酸殘基，X4為包含芳香環的胺基酸殘基(諸如苯丙胺酸(F))及X5為S；S-2：其中X1及X2每個各自獨立地為酸性胺基酸殘基(除了X2不為天冬醯胺酸(N)外)，X3為鹼性胺基酸殘基，X4為包含芳香環的胺基酸殘基(諸如苯丙胺酸(F))及X5為S；S-3：其中X1為脂肪族胺基酸殘基，X2為酸性胺基酸殘基(或X1為酸性胺基酸殘基及X2為脂肪族胺基酸殘基)，X3為鹼性胺基酸殘基，X4為包含芳香環的胺基酸殘基(諸如苯丙胺酸(F))及X5為S；S-4：其中X1為脂肪族胺基酸殘基，X2為Ser、Thr、Tyr或鹼性胺基酸殘基(或X1為Ser、Thr、Tyr或鹼性胺基酸殘基及X2為脂肪族胺基酸殘基；或X1及X2每個各自獨立地為Ser、Thr、Tyr或鹼性胺基酸殘基；或X1及X2每個各自獨立地為脂肪族胺基酸殘基)，X3為鹼性胺基酸殘基，X4為包含芳香環的胺基酸殘基(諸如苯丙胺酸(F))及X5為S；S-5：其中X1為酸性胺基酸殘基，X2為Ser、Thr、Tyr或鹼性胺基酸殘基(或X1為Ser、Thr、Tyr或鹼性胺基酸殘基及X2為除了N(Asn)外的酸性胺基酸殘基)，X3為鹼性胺基酸殘基，X4為包含芳香環的胺基酸殘基(諸如苯丙胺酸(F))及X5為S； S-6：其中X1為鹼性胺基酸殘基，X2為天冬醯胺酸(N)，X3為鹼性胺基酸殘基，X4為包含芳香環的胺基酸殘基(諸如苯丙胺酸(F))及X5為S；S-7：其中X1及X2每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一，X3為鹼性胺基酸殘基，X4為包含芳香環的胺基酸殘基(諸如苯丙胺酸(F))及X5為T或Y；或S-8：其中X1為酸性胺基酸殘基，X2為酸性胺基酸殘基(或X1為酸性胺基酸殘基及X2為脂肪族胺基酸殘基；或再者，X1為脂肪族胺基酸殘基及X2為酸性胺基酸殘基)，X3為酸性胺基酸殘基，X4為包含芳香環的胺基酸殘基(諸如苯丙胺酸(F))及X5為S。
在更額外的具體實例中，HV2為由如下的子群E-1至E-8之一所表示的E基團序列：序列NWLSX2X3X4X5(由E-1表示)，其中X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸之一及X5為酸性或脂肪族胺基酸殘基；序列X0WLX1X2X3X4X5(由E-2表示)，其中X0為除了天冬醯胺酸(N)外的酸性胺基酸殘基，X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一，及X5為酸性或脂肪族胺基酸殘基；序列X0WLX1X2X3X4X5(由E-3表示)，其中X0為鹼性胺基酸殘基，X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一，及X5為酸性或脂肪族胺基酸殘基；序列X0WLX1X2X3X4X5(由E-4表示)，其中X0為任何非酸 性及非鹼性胺基酸殘基，X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一，及X5為酸性或脂肪族胺基酸殘基；序列NWLSX2X3X4X5(由E-5表示)，其中X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一，及X5為絲胺酸(S)或酥胺酸(T)；序列X0WLX1NX3X4X5(由E-6表示)，其中X0為除了天冬醯胺酸(N)外之任何胺基酸殘基，X1、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一，及X5為絲胺酸(S)或酥胺酸(T)；序列X0WLX1X2X3X4X5(由E-7表示)，其中X0為除了天冬醯胺酸(N)外的酸性胺基酸殘基，X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一(除了X2不為天冬醯胺酸(N)外)，及X5為任何非酸性胺基酸殘基；或序列X0WLX1X2X3X4X5(由E-8表示)，其中X0為任何非酸胺基酸殘基，X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一，及X5為任何非酸性胺基酸殘基。
名稱“非酸性”指為除了酸性胺基酸外的胺基酸殘基，及名稱“非鹼性”指為除了鹼性胺基酸外的胺基酸殘基。
在包含第一及第二多胜肽區段的各別多胜肽分子之具體實例中，此多胜肽分子在揭示於本文的方法中可一起或分別給藥。當一起給藥時，它們可配製成一組成物。此組成物可如由熟練的人士想要般選擇性包含一或多種可接受的載劑或賦形劑或佐藥。
製備方法
本揭示包括一種製備如描述於本文的多胜肽區段及多胜肽分子之方法。在某些具體實例中，可使用重新合成(諸如由熟練人士已知的自動化化學方法)來製備胜肽或短多胜肽。再者，可使用以編碼出本揭示之多胜肽區段及多胜肽分子的核酸分子之可用度為基礎的重組DNA方法來製備。核酸分子的序列可藉由已知技術來修改，諸如(但不限於)以PCR為基礎的致突變及核酸分子之重新合成(諸如由熟練人士已知的自動化化學方法)。
可使用以使用重組DNA技術為基礎的方法來產生所揭示的多胜肽。此方法可包括在合適的表現系統(諸如試管內細胞培養系統)中或在生產動物中表現出核酸分子；及分離來自此表現系統之經表現的多胜肽。此表現系統可包括一編碼出所揭示的多胜肽且操作連結至合適的控制或啟動子序列之核酸序列。合適的細胞或細胞株之非為限制的實施例包括豬肺泡巨噬細胞、CRL 11171、MA-104、MARC-145、PSP-36及PSP-36-SAH。生產動物之非為限制的實施例有豬，諸如公豬、母豬、養肥的禽畜或女豬。
在產生所揭示的多胜肽區段後，此方法可包括選擇及/或結合其(如為如描述於本文之第一多胜肽區段與第二多胜肽區段)以形成一組成物。此結合可包括加入一或多種可接受的載劑、賦形劑及/或佐藥以形成一組成物。
在某些具體實例中(諸如含有以PRRSV為基礎的核酸分子)，此表現系統可產生在顆粒外膜內摻入所揭示的 多胜肽之病毒顆粒。以PRRSV為基礎的核酸分子可為一已經修改而表現出包含如揭示於本文的HV2區域之GP5蛋白質的病毒基因組。在進一步具體實例中，此核酸分子包括多於一個GP5蛋白質編碼序列的複製品，其中每個複製品能譯出如描述於本文之不同HV2區域。在其它具體實例中，此表現系統無細胞(諸如在兔網狀紅血球系統的實例中)。
本揭示亦提供其它產生PRRSV顆粒的方法。在某些具體實例中，此產生包括選擇及/或分離如描述於本文的PRRSV分離株。此選擇及/或分離可包括培養或傳代分離株，如已由熟知技藝之人士所知或如描述於本文。在另一個具體實例中，此選擇可為來自受感染的患者(諸如豬)之分離株，及進一步包括從患者獲得之經感染的流體及/或組織以使用作為如描述於本文之HV2區域來源。受感染的流體及/或組織之非為限制的實施例包括血液、血清、血漿、鼻子分泌物、精液、精漿及尿和肺組織、扁桃腺組織、淋巴結組織、排泄物的流體組分或排泄物之流體萃取物。在某些具體實例中，可使用受感染的流體及/或組織作為所揭示的組合之部分。非為限制的實施例包括使用流體或組織與第二HV2區域組合作為接種體，選擇性在如描述於本文的多胜肽分子或病毒顆粒中。
使用方法
本揭示包括一種經由給藥所揭示的第一及第二多胜肽區段之組合以在患者中產生抗體或免疫反應的方法。在某些具體實例中，此方法包括給藥有效量之所揭示 的組成物以產生抗體及/或免疫反應。在許多實例中，此給藥量能在接受治療的患者中有效產生保護狀態，而對抗隨後由一或多個PRRSV分離株所激發的免疫反應(諸如由PRRSV感染)。在某些實例中，此方法可進一步包括額外給藥所揭示的組成物作為“補強注射”。患者之非為限制的實施例包括母豬、女豬、懷孕的母豬或懷孕的女豬。在某些具體實例中，此患者為年齡從約1至12週的豬，諸如約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10或約11週。在其它具體實例中，年齡從約12至約56週或較老的豬，諸如約14、約16、約18、約20、約22、約24、約26、約28、約30、約32、約34、約36、約38、約40、約42、約44、約46、約48、約50、約52或約54週。在額外的具體實例中，此豬已經斷奶及/或已過了母親抗體提供適當保護的階段。
亦可藉由將疫苗給藥至未受影響的豬，接著以PRRSV分離株激發免疫反應來決定所揭示的組合或組成物(如為疫苗)能在患者(諸如豬)中產生保護狀態之有效量。在某些實例中，此分離株可經純化或分離，使得其病毒顆粒具有相同基因組或相同GP5蛋白質或相同GP5細胞膜外區。使用於激發免疫反應的分離株之非為限制的實施例包括編列在第3圖中的那些和來自感染有該分離株的動物之經感染的身體流體或組織。在某些具體實例中，可在補強注射接種後約3至約8週後激發免疫反應，及可以較多或過量的PRRSV來激發。
當與使用相同的分離株來激發未接種疫苗(未以 疫苗處理)的豬之免疫反應的結果比較時，若此疫苗或其量可減低PRRSV感染的任何症狀之嚴重性及/或任何顯著或組織病理改變時，其有效。當然此豬應該無PRRSV，諸如未預曝露至病毒或已經曝露一段足夠的時間但是無症狀而將其識別為未感染的豬。再者，此豬可使用分析來偵測在來自豬的身體流體或組織樣品中之PRRSV或抗PRRSV抗體存在而識別為未感染。
PRRSV感染的症狀之非為限制的實施例包括發燒、呼吸窘迫、發紺、肺炎、嗜睡、打噴嚏、咳嗽、眼睛浮腫、藍耳及心及/或腦病灶。額外的是，可藉由其它定量或定性方法來測量使用於激發免疫反應的分離株之存在。非為限制的實施例包括偵測肺病灶，或在激發免疫反應的豬(已或未接種，在約2天至約2週後)之血液或血清樣品中的病毒。在已接種疫苗的豬中之病灶減少(與未處理的豬比較)可提供偵測感染的定量方法。再者，在已接種疫苗的豬之血液或血清中偵測到病毒時指出此接種已無效，同時病毒的負偵測指出此接種已有效。
可藉由在曝露至本揭示的組合或組成物後產生抗體及/或免疫反應來主導在患者中的免疫保護之有效刺激。此患者之非為限制的實施例可為未預曝露至PRRSV的豬或已經曝露至PRRSV或遭受來自PRRSV感染影響的豬。在許多具體實例中，抗體反應之產生包括對抗GP5蛋白質(包括全部或部分在其中的HV2)的中和抗體之產生。可藉由化驗來自經治療的動物之血液或血清關於此抗體的存在來 進行証實此抗體產生。此抗體偵測試驗之非為限制的實施例包括ELISA、RIA及西方墨點法。
本揭示包括一種在如描述於本文的患者中產生抗體及/或免疫反應之方法。在某些具體實例中，此方法包括至少i)識別或選擇出一包含第一HV-2高變異區域的多胜肽分子之第一PRRSV分離株；ii)識別或選擇出一包含與該第一高變異區域不同的第二HV-2高變異區域之多胜肽分子的第二PRRSV分離株；及iii)將此第一及第二分離株給藥至患者以在患者中產生抗體及/或免疫反應。在某些具體實例中，此方法可包括選擇一或多種含有額外不同的HV-2區域之額外分離株，接著將其與第一及第二分離株給藥。在其它具體實例中，此方法可包括給藥一或多種未經選擇的分離株與第一及第二分離株。
第一及第二分離株的給藥量應該當然足以產生想要的抗體及/或免疫反應。在某些具體實例中，此給藥量足以在患者中產生接種疫苗或保護狀態而對抗隨後由一或多種分離株的PRRSV感染。
在某些實例中，此識別或選擇可包括：i)PRRSV GP5細胞膜外區HV-2高變異區域之胺基酸序列分析；ii)PRRSV GP5細胞膜外區HV-2高變異區域之以PCR為基礎或以抗體為基礎的偵測；或iii)與另一種分離株相關的已知PRRSV GP5細胞膜外區HV-2高變異區域序列。
在其它具體實例中，產生抗體及/或免疫反應的方法包括給藥一包含選自於D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、 D-6、D-7或D-8之HV-2區域的第一多胜肽(抗原)區段，及一包含選自於S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7或S-8之HV-2區域的第二多胜肽(抗原)區段。在許多實例中，在北美中使用與二或更多種選自於D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7及S-8的不同多胜肽(抗原)區段組合有利。
在其它具體實例中，此給藥包括二或更多種選自於E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7及E-8的多胜肽(抗原)區段。在許多實例中，此組合使用在歐洲中有利。在額外的具體實例中，二或更多種不同多胜肽(抗原)區段之組合可依在特別的地理區域中所發現之PRRSV分離株而選自於24個子群。非為限制的實施例包括在南韓、中國、日本、東南亞或南美中所發現的分離株。在額外的具體實例中，在南韓、中國或日本中所使用的組合可與使用在北美中者相同。在其它具體實例中，可從使用於北美或亞洲場所中的區段之組合中排除任何E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7及E-8區段。
在進一步具體實例中，於本揭示之實行中可給藥二或更多個多胜肽(抗原)區段(其包含來自在地理區域處所偵測到的每個子群之至少一種)或包含其的多胜肽分子或分離株之組合。可藉由已由熟知技藝的人士所知之任何合適方法來給藥此多胜肽(抗原)區段或包含其之多胜肽分子或分離株。非為限制的實施例包括注射、鼻內給藥或口服給藥一或多種所揭示的分離株或一或多種來自PRRSV感染 的患者之細胞及/或組織樣品。
若分別給藥或施加此些區段或包含其之多胜肽分子或分離株時，可在給藥間以可選擇的時間間隔來相繼給藥。非為限制的時間間隔實施例包括約1至約2天；約1、約3或約5週；約1、約3、約4或約6月或較長。可在主要給藥事件與一或多個隨後的“補強注射”事件間使用相同的時間間隔。
不論是一起或分別給藥，此多胜肽分子可諸如藉由與脂質雙層結合而膜結合或膜關聯。在某些實例中，此薄膜來自細胞，諸如細胞膜片斷。在其它具體實例中，此薄膜為小囊之膜，諸如脂粒、油在水中或水在油中懸浮液。細胞衍生出的薄膜之非為限制的實施例包括PRRSV顆粒或如描述於本文的其它病毒顆粒之外膜。
成套配方
多胜肽區段、多胜肽分子及分離株、和包含其之組合及組成物及其使用方法可具體化在一或多個根據熟知程序所製造的成套配方中。因此，本揭示包括一含有一或多種試劑(其包含一或多個如描述於本文的多胜肽區段、多胜肽分子或分離株)或包含其之組合或組成物的成套配方，以便使用在一或多種如揭示於本文的方法中。此成套配方選擇性進一步包括關於其使用在本揭示的一或多種方法中之確認描述或標籤或用法說明。此成套配方可包括一些容器，每個含有一或多種在此方法中所使用的不同試劑(典型以濃縮形式)。典型將亦包括一組用法說明。
現在已共通地描述出本發明且將透過參考至經由闡明所提供的下列實施例而更容易地了解，除非有詳細指明否則不意欲限制本揭示。
實施例 實施例1：守恆的GP5序列產生保護狀態失敗
本揭示某種程度上基於下列之了解：預先感染PRRSV的第一分離株之豬可恢復但是易受第二分離株影響，其中此二分離株包括一在守恆區域中具有相同序列之GP5蛋白質。此些事件之非為限制的實施例顯示在下列表2中，其中每個事件包括從經鑑別的分離株之一感染而恢復的豬(在表中的每個事件組之第一行)，然後發現其經如指出的至少一種其它分離株感染(1-3及5-7每個事件的第二行)。在每種分離株中，包含此細胞膜外區之GP5序列的一部分指出含有守恆區域(如在第1圖中以劃線識別)，及在HV2區域中的差異以粗黑指出。
以此些事件之研究為基礎，已發現針對對抗在分離株的GP5蛋白質中之守恆區域的抗體不足以提供對抗隨後的PRRSV之保護。額外的是，HV-1區域之序列不對此些事件提供適當解釋。所顯示出的事件多數包括在HV1序列中無改變。此導致發現在HV-2區域中的序列變化參與避開已預先曝露至在HV-2區域中含有不同序列的PRRSV之動物的免疫監視。另外一種描述為，在如上述顯示的GP5細胞膜外區中之守恆序列無法產生可保護性對抗另一種在GP5蛋白質中含有不同HV-2區域的PRRSV之抗體或免疫反應。
此發現在某種程度上導致所揭示的組合、組成物及方法。
實施例2：PRRSV分離株之繁殖
PRRSV分離株之繁殖及維持方法先前已經報導(參見例如眠(Meng)等人，1994，J.Gen.Virol.75：1795-1801及眠等人，1996，J.Vet.Diag.Invest.8：374-381)。非為限制的實施例包括使用細胞株ATCC CRL 11171，其可在合適於預防接種病毒分離株之單層中生長。另一種細胞及細胞株包括MA-104、PSP-36、PSP-36-SAH、MARC-145及豬肺泡巨噬細胞。
至於非為限制的實施例，可使用約0.1、0.5或1的多重性感染(moi)，接著在証實感染及病毒複製前培養約48小時。可藉由移出上層液(培養媒質)及固定細胞，接著以經標定的抗PRRSV抗體(諸如對N蛋白質特定的單株抗體(由ORF 7編碼)或對抗如描述於本文的GP5蛋白質之特別HV2區域的抗體)偵測來証實。
實施例3：病毒分離株組合
如描述於本文，可至少以HV2序列為基礎來分類(鑑別)及選擇PRRSV分離株以使用在本揭示之組合中。下列資料顯示出在許多典型的PRRSV分離株每個中之GP5序列的一部分(包括細胞膜外區)，其某些在細胞膜外區外的區域中不同。在資料底部處指出如描述於本文的HV1、守恆區域(CR)及HV2之場所，HV1開始的跡象為一非為限制的典型實施例。
本揭示包括將序列分類成所揭示的群組及在本揭示之實行中可使用來自不同子群之分離株的組合。如此作為一個非為限制的實施例，可使用D-4分離株(英傑維克(Ingelvac)-ATP)、D-1分離株(英傑維克-MLV或MJ-3至MJ-14之一)、S-1分離株(MJ-1或MJ-2)與D-3分離株(MJ-15或MJ-16)之組合，以便如揭示於本文般在患者中產生免疫反應。
另一個非為限制的實施例為D-1分離株(MJ-17至MJ-27之一)、D-6分離株(MJ-28至MJ-30之一)、D-2分離株(MJ-34或MJ-35)及D-3分離株(諸如MJ-36)之組合。特別考慮由在下列的資料所表示及根據本揭示的分離株之全部其它組合，以用於如描述於本文的製備及用途。
於本文所引用的全部參考資料不論其先前是否特別併入，其全文藉此以參考方式併入本文。如使用於本文，名稱“一”、“一種”及“任何”每種皆意指著包括單一及複數形式二者。
現在已完全描述出本發明，將由熟習該項技術者察知可在廣泛範圍的等效參數、濃度及條件內進行本發明而沒有過度實驗且未離開本揭示之精神及範圍。雖然本發明已以其相關的特定具體實例來描述，要了解其能進一步改質。本申請案意欲廣泛遵循本揭示之原理及包括來自本揭示的此些方案而涵蓋本揭示之任何變化、用途或適應性，如其達到在本揭示所涉及的技藝內已知或常用之實行且如其可應用至在上文中所提出的基本特徵。
SEQ ID NO：1 C(E/S)LNG(T/A)
SEQ ID NO：2 CELNGT
SEQ ID NO：3 CELNGA
SEQ ID NO：4 CSLNGT
SEQ ID NO：5 CSLNGA
SEQ ID NO：6 I(Y/F)(N/D/S/K)(L/S/F/M)T(L/I)C(E/S)LNG(T/A)

Claims (18)

  1. 一種製備免疫性組成物之方法，其包含：識別或選擇出豬繁殖與呼吸道症候群病毒PRRSV之一第一分離株，該第一分離株包含一第一GP5多胜肽分子，該第一GP5多胜肽分子包含在一第一GP5細胞膜外區(ectodomain)中的一第一HV-2高變異區域；識別或選擇出PRRSV之一第二分離株，該第二分離株包含一第二GP5多胜肽分子，該第二GP5多胜肽分子包含在一第二GP5細胞膜外區中的一不同於該第一HV-2高變異區域的第二HV-2高變異區域；及組合該第一及第二分離株之病毒顆粒以形成該免疫性組成物，各病毒顆粒包含一經膜結合之GP5多胜肽。
  2. 如請求項1之方法，其中各識別或選擇獨立地包含PRRSV分離株之PRRSV GP5細胞膜外區HV-2高變異區域的胺基酸定序、核酸定序或以PCR為基礎之偵測。
  3. 如請求項1之方法，其中該等分離株被減弱或失活。
  4. 如請求項1之方法，其中該免疫性組成物更包含一或多種醫藥上可接受的賦形劑或載劑。
  5. 如請求項1之方法，其中該第一及第二HV-2高變異區域之至少一者係各經選擇為具有一不同序列選自於下列：D-1：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸，或X1為天冬 胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-2：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1為為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-3：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-4：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1 為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-5：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-6：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X3為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-7：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X3為絲胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸； D-8：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；S-1：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X2為天冬醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-2：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X2為天冬胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-3：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸，或X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-4：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1為絲胺 酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸，或X1及X2每個各自獨立地為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1及X2每個各自獨立地為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-5：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸及X2為天冬胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-6：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；X2為天冬醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-7：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為酥胺酸或酪胺酸；S-8：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸，或X1為天冬胺 酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸，或X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；E-1：X0為天冬醯胺酸；X1為絲胺酸；X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；E-2：X0為天冬胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；E-3：X0為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；E-4：X0為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或脯胺酸；X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸； E-5：X0為天冬醯胺酸；X1為絲胺酸；X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為絲胺酸或酥胺酸；E-6：X0為20個天然產生的胺基酸殘基排除天冬醯胺酸後之任一者；X2為天冬醯胺酸；X1、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為絲胺酸或酥胺酸；E-7：X0為天冬胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一，例外為X2不為天冬醯胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或脯胺酸；及E-8：X0為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或脯胺酸；X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或脯胺酸。
  6. 一種組成物於製備一藥物以供在個體中產生免疫反應之用途，該組成物係由如請求項1之方法製備。
  7. 一種組成物於製備一藥物以供在個體中產生免疫反應 之用途，該組成物包含：豬繁殖與呼吸道症候群病毒PRRSV之一第一分離株，該第一分離株包含一第一GP5多胜肽分子，該第一GP5多胜肽分子包含在一第一GP5細胞膜外區(ectodomain)中的一第一HV-2高變異區域；及PRRSV之至少一第二分離株，該第二分離株包含一第二GP5多胜肽分子，該第二GP5多胜肽分子包含在一第二GP5細胞膜外區中的一第二HV-2高變異區域，該第二分離株係經識別或選擇以使得該第二HV-2高變異區域不同於該第一HV-2區域。
  8. 如請求項7之用途，其中該第二分離株之識別或選擇是藉由胺基酸定序、核酸定序或以PCR為基礎偵測該第一分離株及第二分離株之HV-2高變異區域的方法。
  9. 如請求項7之用途，其中該第二分離株之識別或選擇是藉由胺基酸定序。
  10. 如請求項7之用途，其中該個體為豬。
  11. 如請求項10之用途，其中該豬為母豬、女豬(gilt)、懷孕的母豬或懷孕的女豬。
  12. 如請求項7之用途，其中該第一及第二GP5多胜肽之至少一者係經膜結合或膜關聯。
  13. 如請求項7之用途，其中該組成物包含二至四種PRRSV分離株。
  14. 如請求項7之用途，其中該第一及第二HV-2高變異區域具有不同序列選自於下列： D-1：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸，或X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-2：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1為為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-3：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸； D-4：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-5：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-6：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X3為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-7：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X3為絲胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及 X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；D-8：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；S-1：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X2為天冬醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-2：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X2為天冬胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-3：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩酪胺酸，或X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸； S-4：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸，或X1及X2每個各自獨立地為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1及X2每個各自獨立地為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-5：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸，或X1為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸及X2為天冬胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-6：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為絲胺酸、酥胺酸、酪胺酸、精胺酸、離胺酸或組胺酸；X2為天冬醯胺酸；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；S-7：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1及X2每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X3為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為酥胺酸或酪胺酸； S-8：X0為20個天然產生的胺基酸殘基之一；X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸，或X1為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸及X2為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸，或X1為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸及X2為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X3為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X4為苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸；及X5為絲胺酸；E-1：X0為天冬醯胺酸；X1為絲胺酸；X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；E-2：X0為天冬胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；E-3：X0為精胺酸、離胺酸或組胺酸；X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；E-4：X0為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或脯胺酸；X1、X2、X3及X4每個 各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為天冬胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸；E-5：X0為天冬醯胺酸；X1為絲胺酸；X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為絲胺酸或酥胺酸；E-6：X0為20個天然產生的胺基酸殘基排除天冬醯胺酸後之任一者；X2為天冬醯胺酸；X1、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為絲胺酸或酥胺酸；E-7：X0為天冬胺酸、麩胺酸或麩醯胺酸；X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一，例外為X2不為天冬醯胺酸；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或脯胺酸；及E-8：X0為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或脯胺酸；X1、X2、X3及X4每個各自獨立地為20個天然產生的胺基酸殘基之一；及X5為甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、精胺酸、離胺酸、組胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或脯胺酸。
  15. 一種組成物，其包含：來自於一第一豬繁殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)分離株的一第一PRRSV GP5包膜多胜肽，該第一PRRSV GP5包膜多胜肽長度為14至201個胺基酸且包含胺基酸序列C(E/S)LNG(T/A)(SEQ ID NO：1)及一第一PRRSV分離株高變異(HV)-2區域胺基酸序列；及來自於一第二PRRSV分離株的一第二PRRSV GP5包膜多胜肽，該第二PRRSV GP5包膜多胜肽長度為14至201個胺基酸且包含胺基酸序列C(E/S)LNG(T/A)(SEQ ID NO：1)及一不同於該第一PRRSV分離株高變異(HV)-2區域胺基酸序列的第二PRRSV分離株高變異(HV)-2區域胺基酸序列。
  16. 如請求項15之組成物，其中該第一及第二PRRSV分離株每個各自獨立地為一群組D、群組S或群組E分離株。
  17. 如請求項16之組成物，其中：該群組D分離株係一子群D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7或D-8分離株；該群組S分離株係一子群S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7或S-8分離株；及/或該群組E分離株係一子群E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7或E-8分離株。
  18. 如請求項16之組成物，其中該第一PRRSV分離株為一群組D分離株且該第二PRRSV分離株為一群組S分離株。
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