CN101578112A - 基于prrsv gp5的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于产生抗猪生殖和呼吸综合征(PRRS)病毒或PRRSV的免疫应答的组合物和方法。本发明部分基于来自RPPSV GP5蛋白外功能区的两个或多个肽结构域的用途，它们各自具有不同的序列。描述了包含了含所述两个或多个结构域的多肽或其编码核酸的组合物和方法。

Description

基于PRRSV GP5的组合物及方法
相关甲请
本申请要求提交于2007年4月30日的美国临时专利申请60/915,049的优先权，该专利申请以其全部(如同在此阐述般)纳入本文作为参考。
技术领域
本发明包括涉及用猪生殖和呼吸综合征(PRRS)病毒或PRRSV多肽产生抗此多肽从而抗PRRSV的免疫应答的组合物和方法。本发明部分基于认识到：与使用单个外功能区相比，使用与HV-2超变区序列不同的多于一个的GP5外功能区可产生更为广泛的抗PRRSV免疫应答。还揭示了编码多于一个外功能区的核酸分子在产生更广泛的免疫应答中的用途。本发明包括包含具有多于一个外功能区的多肽的组合物，或包含一个或多个编码该多肽的核酸分子的组合物。还揭示了使用多肽、其编码核酸分子和/或本发明的组合物来产生免疫应答的方法。
背景技术
PRRSV属于动脉炎病毒科(Ateriviridae)家族，该家族是动物RNA病毒家族之一。如其它RNA病毒一般，PRRS病毒的抗原特性不断地发生变化，这就导致了抗该致病剂的有效疫苗开发中最为麻烦的问题。然而，在PRPSV生物体系中存在不变的基础。重要的是，该病毒感染多细胞生物体的宿主细胞来进行病毒复制或生长。为了进行感染，该病毒必须附着于宿主细胞，作为其生命周期的一部分。为了附着，该病毒必须具有识别宿主细胞上一个或多个特异性受体的病毒受体识别蛋白(RRP)。最后，由于宿主细胞受体通常需要具有特定的功能且并未打算供病毒识别用，该受体通常不会发生改变。
然而，病毒利用细胞受体来附着或识别宿主细胞。含有宿主细胞的生物体可产生识别病毒RRP的抗体来阻止病毒附着于宿主细胞，而不是通过改变受体结构。这些抗体通常被称为中和抗体(NA)。作为应对，病毒群常常在其RRP中含有修饰或对其RRP产生修饰，该修饰可使其逃脱NA的识别。然而，RRP的修饰受到被修饰的RRP必须仍然能够识别用于病毒附着的细胞受体这一事实的限制。如果修饰产生了无功能的RRP，病毒不能附着，也就不能复制或存活。
发明概述
本发明涉及存在于猪生殖和呼吸综合征(PRRS)病毒或PRRSV的GP5蛋白中的氨基酸残基的三维排列。该残基或多肽结构域的排列存在于GP5蛋白的N末端，并被称为GP5蛋白的外功能区。本发明包括在肽、多肽、病毒颗粒或含其它蛋白质的组合物环境中(in the context of)的结构域的用途。在一些实施方式中，该结构域可以重组或融合肽或多肽的形式存在。在其它实施方式中，该结构域可存在于重组病毒颗粒或病毒中，或与它们共存。在另一些实施方式中，可将编码含有该结构域的肽或多肽的核酸分子用于表达该结构域，以用于本发明的实践。
本发明部分基于如下的预料不到的发现：可选择其序列在先前未曾认识到的HV-2超变区中有变化的外功能区用于制备以及用来在动物中产生抗PRRSV的免疫应答(包括保护性应答)的材料。在一些实例中，制备了至少两种PRRSV分离株并将它们用于产生免疫应答，由于HV-2结构域中存在至少一个序列差异，这些分离株各自含有不同的GP5蛋白。在其它实例中，制备了至少三种或四种PRRSV分离株并将它们用于产生保护性应答，由于至少在HV-2结构域中存在序列差异，这些分离株各自含有不同的GP5蛋白。
本发明包括认识到：在推定的信号序列之后，GP5外功能区可视为是位于推定的跨膜结构域(或跨膜域或MSD)之前的三个结构域的组合。按GP5蛋白由N末端到C末端的序列顺序，这些结构域是：HV-1超变区(“HV1”)，保守区(“CR”)和HV-2超变区(“HV2”)，其后带有一个推定的跨膜结构域(“TR”或MSD)。图1提供了一个非限制性的例子。由于认识到HV2的鉴定对于产生抗PRRSV的免疫应答的重要性，本发明包括HV2序列中存在差异的至少两种GP5外功能区的组合。在一些实例中，所述至少两种外功能区可存在于至少两个PRRSV分离株中，给予这些分离株可产生本文所述的免疫应答。
因此在第一方面，本发明包括至少第一多肽结构域和第二多肽结构域的组合，各结构域含有共价连接于HV2的保守GP5基序，且各结构域在动物对象中对PRRSV感染有抗原性。在许多实施方式中，该连接是多肽中氨基酸残基之间的肽键或酰胺键。GP5基序和HV2可毗连，从而在相同多肽分子中HV2可直接跟随在该基序之后。在其它实施方式中，该基序和HV2可通过接头(例如一个或多个氨基酸残基)分隔。在另一些实施方式中，该基序和HV2可通过非肽键的化学键连接。
本发明的这一方面包括第一和第二多肽结构域的其它实施方式，其中至少一个结构域是还含有共价连接于保守GP5基序的HV1的扩展结构域。这就使得至少一个结构域按序列顺序含有至少三个区域：HV1、含保守GP5基序的保守区(CR)和HV2。当然本发明的实施方式包括两个或多于两个结构域(例如三个或四个结构域)的组合，其中结构域中的至少两个是本文所述的扩展结构域。在一些实例中，组合中的各结构域均为扩展结构域。
在一些实施方式中，至少两种多肽结构域的组合是至少两种PRRSV分离株的组合，所述分离株各自含有所述结构域中的至少一种。在许多实例中，各结构域均为含有HV1、CR和HV2的扩展结构域，由于HV2中的至少一个序列差异，各结构域均不相同。当然，所述结构域可任选含有其它序列差异，例如HV1中的一个或多个差异。
结构域的组合可存在于GP5多肽的组合中，各GP5多肽存在于各自的PRRSV分离株。因此本发明包括两种或多种分离株的组合，各分离株含有具有扩展多肽结构域的GP5蛋白，所述扩展多肽结构域含有如本文所述的不同的HV2序列。例如，在一个非限制性的四分离株组合中，第一多肽结构域存在于第一分离株中，第二多肽结构域存在于第二分离株中，第三多肽结构域存在于第三分离株中，而第四多肽结构域则存在于第四分离株中。各分离株至少会由于分离株GP5蛋白中HV2序列的不同而彼此不同。当然，分离株中也可存在其它序列差异，例如HV1中的一个或多个差异。
在除了GP5蛋白的基于多肽的实施方式中，第一和第二多肽结构域可位于相同分子上或位于两个单独的多肽分子上。第一和第二结构域各自含有保守GP5基序，该基序用氨基酸序列C(E/S)LNG(T/A)，SEQ ID NO：1表示。本发明的实施方式包括两种结构域中各自的保守GP5基序相同的组合。或者，通过SEQ ID NO：1所示的保守基序中有限的变异(四种可能的序列)，第一和第二结构域的序列可不同，从而使得结构也不同。
如本文所述，组合中的各结构域包括HV2，其序列在各结构域中均是不同的。在扩展结构域的情况下，各结构域之间的HV1序列也可任选不同。这部分基于非限制性的观点：含有HV1、CR和HV2的扩展结构域形成一个识别“袋”，当一个组合被用于产生免疫应答时，该识别“袋”应不同于组合中的不同结构域，以提高多样性。因此作为非限制性的例子，HV2中存在的序列差异可产生一个变化的“袋”结构，而HV2和HV1均改变则可产生另一种不同变化的“袋”结构。虽然本发明的一些实施方式包括仅HV2和HV1中发生序列变化，其它实施方式可包括在CR中发生序列变化。
在许多实施方式中，HV2约含8个基酸残基和/或一个由三肽序列X0WL表示的保守部分，其中X0是20种天然存在的氨基酸残基中的一种。该三肽序列可位于HV2的起始处或N末端。在一些实施方式中，该保守三肽序列包括序列DWL，其中X0是天冬氨酸(D)。在其它实施方式中，X0是天冬酰胺(N)或除天冬氨酸(D)以外的其它任何氨基酸残基。在另一些实施方式中，X0是酸性氨基酸残基，例如谷氨酸(E)或谷胺酰胺(Q)；碱性氨基酸残基，例如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)；具有脂族侧链的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)或异亮氨酸(I)或甘氨酸(G)或亮氨酸(L)或缬氨酸(V)；具有含羟基侧链的氨基酸残基，例如苏氨酸(T)或丝氨酸(S)；或具有芳香侧链的氨基酸残基，例如酪氨酸(Y)。
在第二方面中，本发明基于具有两个或多个结构域的组合中各结构域中保守GP5基序和HV2的抗原性和/或免疫原性。在一些实施方式中，在至少两个结构域的各个结构域中，保守GP5基序和HV2以及任选的HV1的存在形成一个识别“袋”，由此产生了抗原性和/或免疫原性，因此本发明包括含有所述结构域的抗原性和免疫原性组合物。在其它的实施方式中，各结构域存在于与细胞膜或其它脂质双层结合或联合的单独多肽分子中。在一些实例中，该多肽分子包含TR，例如GP5跨膜结构域，其可促进与膜或脂质双层的联合。在一些实施方式中，所述膜可为无细胞的膜或细胞膜的碎片或部分，例如围绕细胞产生的病毒颗粒的外膜或包衣。
其它组合物包括与例如单个病毒颗粒或分离的病毒颗粒膜结合或膜缔合(associate)的两个或多个多肽分子。所述病毒颗粒可为感染性的或非感染性的，且各自独立地可具有或不具有复制能力。病毒颗粒可为PRRSV颗粒或其它病毒的颗粒，例如含有所述多肽分子的重组病毒颗粒。可用于表达本发明多肽的重组病毒颗粒的非限制性的例子包括猪腺病毒和痘病毒。
可将同时具有感染性和复制能力的病毒颗粒称为病毒体。因此，在一些实施方式中，组合物可包含与单个病毒体或分离的病毒体膜结合或膜缔合的两个或多个多肽分子。在含有两个或多个病毒体(例如两个或多个PRRSV颗粒)的组合物的实施方式中，一个或多个(病毒体)可为含有如本文所述的第一或第二多肽结构域的天然存在的PRRSV颗粒或分离株。在一些实例中，多于一个至高达全部的颗粒是天然存在的分离株。
当然，本发明的其它实施方式包括多于两种多肽结构域或病毒颗粒的组合，它们各自含有如本文所述的保守GP5基序和HV2，任选具有HV1。因此，具有除了第一和第二多肽结构域的其它多肽结构域的组合物也清楚地包含在本发明的范围内。当然，在这样的实施方式中，组合中各多肽结构域中的HV2以及任选HV1在序列上与组合中各其它结构域的HV2以及任选的HV1的序列不同，从而结构也不同。
在其它方面中，本发明包括一种制备本文所述的组合物的方法。在一些实施方式中，方法可包括：鉴别或选择至少一个第一多肽结构域和一个第二多肽结构域，各结构域如本文所述；组合所述结构域，形成组合物。在许多实例中，方法可包括：鉴别或选择至少一个含有第一结构域的第一多肽分子和一个含有第二结构域的第二多肽分子；合并所述多肽，形成组合物。在一些实例中，组合可包括加入形成组合物所需的一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体。
在其它实施方式中，鉴别或选择可在PRRSV分离株中，基于各分离株中HV2的序列来进行。在一些实例中，鉴别或选择可通过同时检测HV2序列和GP5分子的一个或多个其它部分(例如保守基序或HV1)来进行。检测方法的一个非限制性例子包括使用抗体来识别给定的HV2序列，该给定序列任选与GP5分子的其它部分联合或在所述其它部分中。其它非限制性的检测方法包括对HV2进行氨基酸测序，或对HV2的编码序列进行核酸测序。
在一些实施方式中，检测可以是在获自动物对象(例如被PRRSV感染的个体)的生物液体样品中检测PRRSV。该方法可包括使所述样品或其稀释形式与能够与GP5蛋白中HV2的至少一部分结合的结合剂接触。该样品可获自猪对象，但任何被PRRSV或PRRSV载体感染的对象均可使用。生物液体可为其中可检测性地存在GP5蛋白和/或PRRSV颗粒的任何液体。非限制性的例子包括对象的身体分泌物，例如唾液、泪液、粘液、鼻涕和阴道分泌物，以及其它体液，例如血液、血清、血浆、精子、精液和尿液，以及排泄物中的任何液体组分或排泄物的液体提取物。
在另一些实施方式中，可对不含本文所述的HV2的新PRRSV分离株进行鉴别、选择或检测。可将新分离株有利地与例如含本文所述的一个、两个、三个、四个或更多个结构域的PRRSV分离株一起，用于本发明的组合中。可预期含有新分离株的组合是有利的，因为与不含新分离株的组合所引发的应答相比，其产生新的抗体或免疫应答的可能性更高。
如上所述，本发明的其它方面是产生抗体应答(体液免疫应答)或免疫应答的方法。在一些实施方式中，方法可包括：将如本文所述的多肽结构域的组合给予具有能产生应答的免疫系统的动物对象。虽然给定的应答可视为包括针对结构域或含该结构域的多肽的应答，本发明也包括识别一个或多个PRRSV分离株中GP5而产生的应答。在一些实施方式中，抗体应答包括产生一种或多种中和抗体。在其它实施方式中，免疫应答包括产生一种或多种细胞免疫应答，例如T细胞介导的应答。在一些实例中，抗体应答或免疫应答是抗PRRSV颗粒(例如表达含本发明的多肽结构域的GP5蛋白的颗粒)的保护性应答。
在一些实例中，抗体应答或免疫应答可针对HV2不同的至少两种PRRSV变体或菌株，例如可能在特定地理区域中存在的那些。因此，本发明的实施方式包括针对如下变体的应答：PRRSV在欧洲流行的一种或多种莱利斯塔德(Lelystad)分离株变体、北美的一种或多种变体、或韩国血清型，或在亚洲或南美发现的一种或多种PRRSV变体。
在其它实施方式中，在对象中产生抗体或免疫应答的方法可包括：鉴别或选择如本文所述的至少一个第一多肽结构域和一个第二多肽结构域，然后将所选的结构域给予对象，以产生抗体或免疫应答。在一些实施方式中，所述鉴别或选择可为鉴别或选择至少一种含有所述第一多肽结构域的第一多肽和含有所述第二多肽结构域的第二多肽，然后将所选的多肽给予对象。在许多实例中，第一和第二多肽中的至少一种可存在于一个PRRSV分离株中。在一些实例中，所述多肽各自存在于一个PRRSV分离株中。
在另外的实施方式中，鉴别或选择可为鉴别或选择至少一种含有所述第一多肽结构域的第一PRRSV分离株和一种含有所述第二多肽结构域的第二PRRSV分离株，然后将所选的分离株给予对象。在一些实施方式中，鉴别或选择可为鉴别或选择至少三种或至少四种、或更多种分离株。在许多实例中，所述选择是基于PRRSV分离株GP5蛋白中的HV2序列。基于HV2序列的鉴别或选择可用任何适合的方法进行，这些方法包括但不限于：HV2的氨基酸序列分析、基于PCR或基于抗体的HV2检测；或关于先前已表征的PRRSV分离株中HV2序列的知识。
关于本发明一个或多个实施方式的详情示于附图和下文的描述中。本发明的其它特征、目的和优点基于附图、详细描述和权利要求书应是明显的。
附图简述
图1显示了典型的美洲型PRRSV菌株(VR-2332)和欧洲型PRRSV菌株(莱利斯塔德株，LV)的氨基酸序列比较。鉴别了它们各自的推定信号序列、和HV1、“保守区”或CR(含保守GP5基序)、以及HV2(下划线)。还指示了HV1典型的非限制性的起始位点。
图2是关于本文的PRRSV分离株组的图示。
图3显示了得自公众可获得的PRRSV序列的包含保守GP5基序和HV2的GP5外功能区序列的一部分的比对。对应于序列的NCBI(国家生物技术信息中心)登录号与分离株一并示出。分离株包括北美和欧洲菌株，以及其它类型菌株。
图4显示了GP5蛋白介导的PRRSV与宿主猪细胞之间的相互作用。
图5是GP5蛋白氨基酸序列的凯特-杜力特(Kyte-Doolittle)疏水性曲线。所示的编号来自一种美洲分离株。在对应于推定跨膜区起始处的约氨基酸残基62处，存在一个向疏水残基的快速转化。
图6提供了典型PRRSV GP5蛋白编码序列的基因库(GenBank)登录号和GI号。
定义
如本文所用，术语猪生殖和呼吸综合征(PRRS)病毒或PRRSV，是指已报道可导致以下疾病的病毒：PRRS；猪神秘病(Mystery Swine Disease，MSD)；早先被称为“蓝耳综合征”的猪不孕和呼吸道综合征(Swine Infertility and RespiratorySyndrome，SIRS)；猪流行性流产和呼吸器官综合征(porcine epidemic abortion andrespiratory syndrome，PEARS)；瓦氏综合征(Wabash syndrome)；神秘猪病(MPD)；猪瘟；英国的蓝流产病(blue abortion)或蓝耳病；荷兰的蓝流产病(abortus blau)；德国的猪蓝耳病(seuchenhafter spatabort der schweine)；和海克-海克病(Heko-Hekodisease)(Shimizu等，1994)。病毒导致疾病的其它可选命名包括：蓝耳病、蓝耳猪病、神秘猪病(Enfermedad misteriosa del cerdo)、流行性蓝耳病(Epidemisch spatabortder sauen)、蓝耳病(Lane r bing，汉语)、猪蓝耳病(Maladie blue du porc)、神秘猪病(Maladie mystérieuse du porc)、神秘猪病、新猪病、1988-1989瘟疫、蓝耳病(
Figure A20088000072900131
schweinekrankheit)、猪生殖和呼吸综合征(Sindrome disgenesico yrespiratorio del cerdo)、猪神秘综合征(Sindrome misterioso del cerdo)、猪生殖和呼吸综合征(Syndrom reproductive et respiratoire du porc)、猪生殖和呼吸综合征(Syndrome dysgenesique et respiratoire du porc)、和HAAT综合征(Syndrome HAAT，Hyperthermie-Anorexie-Avortement de la Truie)。
如本文所用，术语PRRSV的“GP5蛋白”和“主要包膜糖蛋白”是指由本领域所理解的PRRSV基因组的ORF5编码的多肽。代表性但非限制性的GP5序列编码序列包括由图6中的登录号和GI号所鉴别的那些。不受理论束缚而是为了促进对本发明的理解，由PRRSV基因组的ORF5编码的GP5蛋白据信是PRRSV中的受体识别蛋白(RRP)。GP5蛋白的外功能区在美洲菌株中约起始于氨基酸N30至D61，在欧洲菌株中约起始于D33至G63(参见图1)。美洲型菌株和欧洲菌株的代表性差异在于：(1)GP5蛋白的全部氨基酸分别为200和201；(2)与美洲菌株相比，欧洲菌株具有更长的信号序列；以及(3)与美洲菌株相比，欧洲菌株显示更少的变异。本发明部分基于对约1740种GP5各自的序列及其各自的外功能区中HV2的分析和鉴别。代表性的序列示于图3中。虽然可用那些代表性的序列来实施本发明，本发明并不限于那些序列。
术语“HV-1区”或“HV1”是指位于如本文所述的GP5保守区N末端的多肽序列。该区域任选存在于本发明的多肽结构域中。但是该序列存在时，其长度可为多达约14或更多个氨基酸残基，特别关注11、12、13和14(个氨基酸)的长度。在其它实施方式中，也可使用约11、约9、约7、约5或约3或更少(个氨基酸)的长度。本发明包括该区域序列发生显著变化的实施方式。HV1序列的非限制性例子包括图3中所示的那些。
可用另一具有相似特征和性质的残基，对已揭示序列中的氨基酸残基进行保守取代或置换。如本文所用，本发明的保守氨基酸取代示于下表1中。
表1
Figure A20088000072900141
Figure A20088000072900151
本发明实施方式的详细描述
概论
本发明部分基于现有PRRSV遗传信息(例如GP5蛋白的DNA序列)的分析。还分析了从显示临床PRRS征状的猪分离的PRRSV的序列。该分析促成了两种超变区(即HV-1和HV-2)的鉴别，其中HV-2区以任一种X0WL三肽起始，其中X0为20种天然存在的氨基酸中的一种，如本文所述。该分析还促成鉴别出美洲菌株中第I42至T53位和欧洲菌株第I44至T55位的保守序列(参见图1)。
PRRSV美洲菌株和欧洲菌株外功能区中保守区的存在表明：该保守区参与了作为受体识别蛋白的GP5蛋白与要被PRRSV感染的宿主细胞上的受体之间的直接接触。以该观念为基础，且不受理论的束缚，在保守区任一侧的两个HV区据信可用作保持该保守区疏水特性的“门”(或结构基序)。早先对HV-1区和保守区的评论并未推进GP5蛋白免疫原性的研究，这是因为HV-1区域中存在过多的变异。但受到HV-2中超变性的启示，不能合乎逻辑地预期到HV-2将参与GP5与宿主细胞受体之间的相互作用。
本发明也部分基于认识到：可考虑将HV-1区的变异与显示较少变异的HV-2序列组合。因此，本发明包括：(1)基于HV2序列变异对PRRSV分离株进行分选，将它们基于免疫学相似性分组；和(2)对不同组中的PRRSV菌株的组合进行选择，以制备可给予后可提供更广泛的异源保护的广谱疫苗。分选和选择可任选包括对HV-1区的考虑。此外，分离株可任选首先经减毒或失活，再将其作为疫苗或免疫原性组合物施用。减毒的非限制性的例子包括本领域普通技术人员已知的方法，例如对培养物(例如细胞或组织)进行传代培养，或在动物中进行传代。当然，可在体外进行传代。灭活的非限制性例子包括本领域普通技术人员已知的那些方法，例如加热、辐照、化学灭活处理。
本发明包括根据第61位氨基酸将所有美洲菌株任选划分为两组。据报道多于85％的美洲型分离株在61位包括D(Asp)或S(Ser)。例外的(分离株)(少于15％)通常在61位包含非C(Cys)、F(Phe)、M(Met)、W(Trp)和P(Pro)的氨基酸残基。因此，本发明包括第一HV2残基(对应于61位)是非C、F、M、W和P的氨基酸残基的实施方式。在一些实施方式中，该残基选自A(Ala)、G(Gly)、V(Val)、L(Leu)、I(Ile)、S(Ser)、T(Thr)、N(Asn)、E(Glu)、Q(Gln)、R(Arg)、K(Lys)、H(His)或Y(Tyr)。在另外的实施方式中，然而，该残基选自C、F、M、W或P。
本发明包括基于观察到的序列信息，将美洲菌株任选分类为两组：组D和组S，它们各自具有8个亚组(分别为D-1至D-8以及S-1至S-8)。本发明还包括基于观察到的序列信息，将所有欧洲菌株划分为八(8)个亚组(E-1至E-8)。这些分组如图2所示。
所述组和亚组是本发明一些实施方式的基础，其中可选择来自不同组或亚组的至少一个第一和第二多肽结构域(各自含有与本文所述的HV2共价连接的保守GP5基序)的组合，并将其用于生产组合物或疫苗，这些组合物或疫苗可产生比使用单独(或个别)的多肽结构域更广泛的抗体或免疫应答。在一些实施方式中，将二到四种或更多种多肽结构域的组合用于实施本发明。在另一些实施方式中，使用来自一个组或亚组的结构域可导致产生针对来自相同组或亚组的多于一个结构域的抗体或或免疫应答。
本发明的非限制性例子包括：至少四个结构域的组合，其中这四种中不带重复的每一种选自本文中称为D-1至D-8、S-1至S-8以及E-1至E-8的24个亚组之一。可能组合的数量可通过数学公式(24×23×22×21)/(4×3×2×1)粗略估计，或约为10,600种。但是在一些实施方式中，可能的组合的数量会显著降低，其中各组合含有至少一个来自各组D和组S亚组的结构域以及一个来自E-1至E-8的结构域。可用公式(8×8×8×21)/(4×3×2×1)对该例子进行粗略估计，或约448种。在只采用组D和组S亚组的其它实施方式中，可能的组合的数量也有所降低。类似地，在使用来自E-1至E-8的四个结构域的实施方式中，可能的组合的数量进一步降低。
更通常而言，本发明的组合物或疫苗可包括来自如本文所述的组D或组S的至少一个多肽结构域。因此，两个结构域的组合可具有来自组D或组S的一个结构域。在其它实施方式中，组合物或疫苗可包括亚组D结构域的任何组合和/或亚组S结构域的任何组合。因此，两个结构域的组合可具有均来自组D或均来自组S或每组各一的结构域。在许多实施方式中，用在组合中的多肽结构域存在于用作本发明组合物或疫苗的PRRSV分离株GP5蛋白中。因此，本发明还包括根据GP5蛋白中的HV-2序列，将PRRSV分离株鉴别和分类为本文所述的相同的组和亚组。然后，可对分类的分离株如所公开的进行选择。
作为其它的非限制性例子，本发明的组合物或疫苗可包含：
来自D-1亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它D亚组或任何S或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自D-2亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它D亚组或任何S或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自D-3亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它D亚组或任何S或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自D-4亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它D亚组或任何S或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自D-5亚组的一个分离株或结构域，和来自其它任何D亚组或任何S或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自D-6亚组的一个分离株或结构域，和来自其它任何D亚组或任何S或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自D-7亚组的一个分离株或结构域，和来自其它任何D亚组或任何S或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自D-8亚组的一个分离株或结构域，和来自其它任何D亚组或任何S或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域。
或者，本发明的组合物或疫苗可包含：
来自S-1亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它S亚组或任何D或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自S-2亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它S亚组或任何D或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自S-3亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它S亚组或任何D或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自S-4亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它S亚组或任何D或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自S-5亚组的一个分离株或结构域，和来自其它任何S亚组或任何D或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自S-6亚组的一个分离株或结构域，和来自其它任何S亚组或任何D或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自S-7亚组的一个分离株或结构域，和来自其它任何S亚组或任何D或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自S-8亚组的一个分离株或结构域，和来自其它任何S亚组或任何D或E亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域。
类似地，本发明的实施方式包括本发明的组合物或疫苗，这些组合物或疫苗可包含：
来自E-1亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它E、D或S亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自E-2亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它E、D或S亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自E-3亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它E、D或S亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自E-4亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它E、D或S亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自E-5亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它E、D或S亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自E-6亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它E、D或S亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自E-7亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它E、D或S亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域；
来自E-8亚组的一个分离株或结构域，和来自任何其它E、D或S亚组的至少一个或多个(例如二或三或更多个)分离株或结构域。
然而，在一些实施方式中，本发明的组合不是如本文所述的VR2332和LV的GP5外功能区的组合。在其它实施方式中，本发明的组合不是具有桥接HV2和GP5推定跨膜区间边界的如下序列的仅为GP5外功能区的组合：
ANKFDWAVET(SEQ ID NO：7)
ANKFDWAVEP(SEQ ID NO：8)
AGEFDWAVET(SEQ ID NO：9)
ADKFDWAVEP(SEQ ID NO：10)
ADRFDWAVEP(SEQ ID NO：11)或
SSHFGWAVET(SEQ ID NO：12)。
但本发明特别预期的实施方式包括结构域的组合，所述结构域中，X0WL中的X0残基和HV2序列中的至少一个其它残基在组合的结构域间均不同。
如本文所述，各多肽结构域(且由此各分离株)含有由氨基酸序列C(E/S)LNG(T/A)，SEQ ID NO：1所表示的保守GP5基序。因此，本发明的实施方式包括结构域，其中GP5基序由如下氨基酸序列表示：CELNGT(SEQ ID NO：2)、CELNGA(SEQ ID NO：3)、CSLNGT(SEQ ID NO：4)或CSLNGA(SEQ ID NO：5)。在其它实施方式中，保守GP5基序更大，其由氨基酸序列I(Y/F)(N/D/S/K)(L/S/F/M)(T/P/M)(L/I)C(E/S)LNG(T/A)，SEQ ID NO：6表示，其对应于图1所示的“保守区”。
基于病毒的组合物
本发明基于用于组合中的多肽结构域中保守GP5基序和HV2的抗原性和/或免疫原性，如本文所述。因此，本发明包括如上所述的病毒分离株的组合。非限制性的例子包括图3所列病毒分离株(基于它们的序列保存信息)的组合，因为这些分离株可被分类到本文所述的组和亚组。在一些实施方式中，那些分离株中的至少两个或多个，例如三个或四个或多个的组合预期可用于本发明的实践中。
此外，本发明包括病毒分离株和病毒颗粒的组合，该病毒分离株和颗粒各自含有本文所述组合的多肽。在其它实施方式中，可采用两种或多种病毒颗粒。含多肽结构域的本发明病毒颗粒的非限制性例子包括感染性或非感染性病毒颗粒病毒颗粒，其具有或不具有独立复制能力。其它非限制性的例子包括体外培养或传代的病毒颗粒；减毒病毒；以及重组病毒颗粒。
在许多实施方式中，病毒颗粒是具有外膜的PRRSV颗粒，外膜含有带有本发明多肽结构域的GP5蛋白。在其它实施方式中，该病毒颗粒可为带有外膜的非PRRS病毒，所述外膜含有任选作为如本文所述GP5蛋白的一部分的多肽结构域。其它实施方式包括带有外膜的PRRSV或非PRRSV病毒颗粒，该外膜例如通过具有本文所述的不同外功能区的两个或多个GP5蛋白，含有两个或多个本发明的多肽结构域。在一些实例中，病毒颗粒是带有含多拷贝的编码GP5蛋白的ORF5序列的的基因组的PRRSV。此类病毒分离株先前已报道过，并被称为“生产过剩突变体(overproduction mutant)”或“高复制表型”PRRSV。本发明包括如下的PRRSV：该PRRSV已经过重组修饰而含有和表达多于一种GP5蛋白，这些蛋白各自含有如本文所述的具有不同HV2区的多肽结构域。在其它实施方式中，重组病毒可为：昆虫病毒，例如杆状病毒(Baculovirus)，早先曾报道其能表达PRRSV GP5蛋白；猪腺病毒或痘病毒。
在另一些实施方式中，病毒分离株或病毒颗粒是具有感染性和复制能力的，例如PRRSV分离株或感染性颗粒。在大多数实例中，所述颗粒含有体内感染后编码且能表达GP5蛋白的基因组以产生GP5。既具有感染性又具有复制能力的颗粒可被称为病毒体。在另外的实施方式中，本发明的颗粒具有感染性但无复制能力，但任选能在细胞内表达GP5蛋白。
在包含使用PRRSV分离株的实施方式中，可基于分离株中HV2序列来鉴别或选择分离株。在一些实例中，例如在使用图3所示分离株的实例中，可基于对已表征分离株中的HV2序列的序列信息的观察或基于其相关知识，进行所示鉴别或选择。在其它实例中，例如其中的分离株先前并未被表征过，则可通过检测HV2序列来进行选择，例如通过采用识别给定的HV2序列的抗体、对分离株的GP5编码序列(ORF5)进行测序、或纯化并对GP5蛋白进行氨基酸测序。基于抗体的检测的非限制性例子包括：免疫沉淀和分析，例如ELISA、RIA和蛋白质印迹法。测序的非限制性例子包括：基于二脱氧核苷酸的DNA分子测序和基于PCR的测序，包括基于反转录GP5编码RNA分子然后进行PCR的方法。在一些实施方式中，对分离株的选择包括检测GP5蛋白除HV2以外的一个或多个部分的序列，例如保守基序和/或HV1。
在基于抗体的检测方法的许多实施方式中，抗体不与存在于多种PRRSV株和分离株中的GP5蛋白结合。相反，抗体应对HV2具有足够的特异性，从而使其能够全部或部分基于HV2的序列或结构来检测特定的分离株。除了使用抗体之外，例如使用标记的抗体来促进其检测，还可使用结合PRRSV GP5蛋白HV2的抗体片段。该抗体片段可为HV2结合抗体的Fv或Fab区；其它非限制性例子包括：单链抗体，其包括单链Fv区和单链Fab区。抗体和抗体片段优选为单克隆，但在一些实例中也可为多克隆。
在另一些实施方式中，PRRSV分离株的检测可通过使用来自猪对象(例如被PRRSV感染的个体)的生物液体样品进行。该方法可包括：使样品或其稀释形式接触结合GP5蛋白HV2的结合剂，优选去除生物液体中存在的其它分子。在许多实施方式中，所述对象是猪，样品可为猪的体液或分泌物。可获得用于本发明的样品的猪的非限制性例子包括：公猪、母猪、肥猪和小母猪。猪的年龄可为1-约30天、31-约40天、41-约50天或51-约60天，或更大。
当然，生物液体可为其中可检测性地存在GP5蛋白和/或PRRSV颗粒的液体。非限制性例子包括身体分泌物，例如唾液、泪液、粘液、鼻涕和阴道分泌物，以及其它体液，例如血液、血清、血浆、精子、精液和尿液，以及排泄物中的任何液体组分或排泄物的液体提取物。
在生物液体含有PRRSV颗粒的情况下，检测可通过基于PCR的方法进行以检测GP5蛋白编码核酸分子，例如含GP5蛋白的DNA或RNA分子或该分子至少编码HV2的部分。
在其它实施方式中，选择和检测可为选择和检测具有GP5蛋白的PRRSV分离株，该GP5蛋白带有HV2序列，该序列不同于本文所揭示的或早先已表征的任何HV2序列。如此的新分离株仍可分类为本文所述的组或亚组之一中。或者，该分离株可能不能分类到本文所述的组或亚组之一中，从而可有利地用作所揭示的组合的一部分，这是因为新分离株产生新抗体或免疫应答的可能性更高。
因此，本发明包括在对象中通过使用含GP5蛋白的PRRSV分离株来产生抗体或免疫应答的方法，所述GP5蛋白带有HV2序列，该序列不同于本文所揭示的任何HV2序列。因此，该分离株的HV2可以不是本文中所记载的任何一种，或不包括在所揭示的任何组或亚组中。该方法可包括：将PRRSV分离株鉴别为含有含不同于图3中或任何D、S或E亚组的任何HV2序列的HV2区的GP5多肽分子的分离株，并将所述分离株给予所述对象，以在所述对象中产生抗体或免疫应答。可用本文所述的任何方法来鉴别或测定独特的HV2序列，这些方法包括作为非限制性例子的基于抗体或核酸的方法，然后与本发明的揭示进行比较。在一些实施方式中，如本文所述，该分离株经减毒或灭活。
多肽和组合物
本发明基于含保守GP5基序和如本文所述的HV2的多肽结构域的抗原性和/或免疫原性。HV2部分对结构域的抗原性和/或免疫原性做出贡献，从而与仅使用所述结构域中的一种相比，联合使用含两种不同结构域的多肽分子可产生更为广泛的抗体或免疫应答。因此，本发明包括两种或多种多肽结构域的组合，例如呈组合物或疫苗形式，以及它们在免疫对象的方法中的用途。
本文中已描述了多肽结构域的性质。通常，结构域含有共价连接到HV2区的保守GP5基序。许多实施方式中以肽键或酰胺键来连接GP5基序和HV2，从而就从N末端至C末端而言，它们是毗连的。其它实施方式包括使用接头部分。接头部分的非限制性例子包括：短肽序列，例如长度约为1、2、3、4或5个氨基酸的短肽；非肽接头，例如链中具有至少一个碳原子的原子短链；或其它合成接头。在短肽序列的情况下，氨基酸可为任何天然存在的氨基酸，例如本文表1中所示的20种氨基酸。在一些其它实施方式中，基序和HV2可通过非肽键接头(例如碳-碳键)共价连接。
使用第一和第二多肽结构域时，结构域可位于同一多肽分子或两条单独的分子上。在许多实施方式中，结构域位于单独的多肽分子上，所述多肽分子各自包括跨膜结构域或其它可促成与脂质双层结合的蛋白结构域。跨膜结构域还可存在于同时含有两个结构域的单独多肽分子中。在一些实施方式中，跨膜结构域是本领域普通技术人员已知的和如本文所述的PRRSV GP5蛋白的推定跨膜区。
在许多实施方式中，结构域位于单独的GP5蛋白上。在众多其它实施方式中，结构域在保守GP5基序中具有相同的序列，例如由CELNGT(SEQ ID NO：2)表示的序列。然而即便具有相同的保守GP5基序，第一和第二多肽结构域在HV2序列中是不同的，这就使得结构域之间具有所需的抗原性和/或免疫原性差异。
在含有第一和第二多肽结构域的单独的GP5蛋白的许多实施方式中，GP5蛋白从N末端至C末端各自可包含：推定的信号序列、HV-1超变区、含保守GP5基序的保守区(CR)、HV-2超变区、推定的跨膜区以及GP5蛋白的残余部分。在其它实施方式中，GP5蛋白可不含推定的信号序列的全部或部分。当然，也可使用保留了所揭示的多肽结构域的抗原性和/或致免疫特性，但具有较少GP5部分的的多肽分子。非限制性例子包括：包含HV-1超变区、含保守GP5基序的保守区(CR)和HV-2超变区、任选带有如上所述的跨膜结构域的多肽分子。
通常，所揭示的HV2区的长度约为8个氨基酸残基。在另外的实施方式中，该长度可为6、7、8、9和10个残基。残基的确切数量并不重要，只要所得的结构域保留了所需的抗原活性和/或致免疫活性。在一些实施方式中，HV2以三肽序列X0WL起始，其中X0如本文所定义。因此，在一些实施方式中，HV2如序列X0WLX1X2X3X4X5所示，其中X0、X1、X2、X3和X4各自独立地是表1所示的20种天然存在的氨基酸之一，且X5选自任何氨基酸残基，任选排除C(Cys)、F(Phe)、M(Met)、W(Trp)和P(Pro)。
在其它实施方式中，HV2是如X0WLX1X2X3X4D所示的D组序列，其中天冬氨酸(D)残基(位于X0WLX1X2X3X4D结尾处)可用除C、F、M、P、W、S、T和Y以外的任何氨基酸残基取代(例如用A、G、V、L、I、N、E、Q、R、K或H取代)，X0如上所定义，且是如下所示的亚组D-1至D-8之一：
D-1：其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基(或X1是酸性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-2：其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是Ser、Thr、Tyr或碱性氨基酸残基(或X1是Ser、Thr、Tyr或碱性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-3：其中，X1和X2各自独立地是脂族氨基酸残基，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-4：其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是Ser、Thr、Tyr或碱性氨基酸残基(或其中X1是Ser、Thr、Tyr或碱性氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-5：其中，X1和X2各自独立地是酸性氨基酸残基，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-6：其中，X1和X2各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X3是酸性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-7：其中，X1和X2各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X3是具有含羟基的R基团的非芳族氨基酸残基(例如Ser或Thr)，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；或
D-8：其中，X1和X2各自独立地是碱性氨基酸残基或含芳香环的氨基酸残基，例如酪氨酸(Y)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或苯丙氨酸(F)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)。
在其它实施方式中，HV2是如序列X0WLX1X2X3X4X5(其中X0如上所定义)所示的S组序列，且是如下所示的亚组S-1至S-8之一：
S-1：其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是天冬酰胺(N)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-2：其中，X1和X2各自独立地是酸性氨基酸残基，除了X2不为天冬酰胺(N)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-3：其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基(或其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-4：其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是Ser、Thr、Tyr或碱性氨基酸残基(或其中，X1是Ser、Thr、Tyr或碱性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基；或其中，X1和X2各自独立地是Ser、Thr、Tyr或碱性氨基酸残基；或其中，X1和X2各自独立地是脂族氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-5：其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是Ser、Thr、Tyr或碱性氨基酸残基(或其中，X1是Ser，Thr，Tyr或碱性氨基酸残基，X2是除N(Asn)以外的酸性氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-6：其中，X1是碱性氨基酸残基，X2是天冬酰胺(N)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-7：其中，X1和X2各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是T或Y；或
S-8：其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基(或其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基；或其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基)，X3是酸性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S。
在其它实施方式中，HV2是如下亚组E-1至E-8所示的E组序列：
序列NWLSX2X3X4X5(表示为E-1)，其中，X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸之，X5是酸性或脂族氨基酸残基；
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-2)，其中，X0是除天冬酰胺(N)以外的酸性氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是酸性或脂族氨基酸残基；
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-3)，其中，X0是碱性氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是酸性或脂族氨基酸残基；
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-4)，其中，X0是任何非酸性和非碱性氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是酸性或脂族氨基酸残基；
序列NWLSX2X3X4X5(表示为E-5)，其中，X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；
序列X0WLX1NX3X4X5(表示为E-6)，其中，X0是除天冬酰胺(N)以外的任何氨基酸残基，X1、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-7)，其中，X0是除天冬酰胺(N)以外的任何氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，除了X2不是天冬酰胺(N)，X5任何非酸性氨基酸残基；或
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-8)，其中，X0是任何非酸性氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5任何非酸性氨基酸残基。
术语“非酸性”是指不是酸性氨基酸的氨基酸残基；术语“非碱性”是指不是碱性氨基酸的氨基酸残基。
在含第一和第二多肽结构域的单独多肽分子的实施方式中，可在本文所述的方法中共同或分别给予该多肽分子。当共同给予时，可将它们配制成组合物。任选地，组合物含有本领域普通技术人员所需的一种或多种可接受的载体或赋形剂或辅料。
制备方法
本发明包括制备如本文所述的多肽结构域和多肽分子的方法。在一些实施方式中，可通过从头合成的方法来制备肽或短肽，例如本领域普通技术人员已知的自动化化学方法。或者，可在可获得的编码本发明的多肽结构域和多肽分子的核酸分子的基础上通过使用重组DNA法来进行制备。可用已知的技术来修饰核酸分子序列，例如但不限于，基于PCR的突变和核酸分子的从头合成，例如本领域普通技术人员已知的自动化化学方法。
基于使用重组DNA技术的方法可用于生产本发明的多肽。此类方法可包括：在合适的表达系统(例如体外细胞培养体系或生产动物)中表达核酸分子，从该表达系统中分离所表达的多肽。表达系统可包括编码本发明多肽的核酸序列，并操作性连接到合适调控或启动子序列。适合的细胞或细胞系的非限制性例子包括：猪肺泡巨噬细胞、CRL 11171、MA-104、MARC-145、PSP-36和PSP-36-SAH。生产动物的非限制性例子是猪，例如公猪、母猪(sow)、肥猪(fattener)或小母猪(gilt)。
产生所揭示的多肽结构域后，该方法可包括：将其选择为第一多肽结构域，和/或与本文所述的第二多肽结构域组合，以形成组合物。该组合可包含加入一种或多种可接受的载体、赋形剂和/或辅料以形成组合物。
在一些实施方式中，例如含有基于PRRSV的核酸分子，表达系统产生将所揭示的多肽掺入其外膜的病毒颗粒。基于PRRSV的核酸分子可为已经过修饰以表达含本文所述HV2区的GP5蛋白的病毒基因组。在另一些实施方式中，核酸分子包含多于一个拷贝的GP5蛋白编码序列，其中各拷贝编码不同的如本文所述的HV2区。在其它实施方式中，表达系统不含细胞，例如在兔网状细胞系统的情况下。
还提供了生产PRRSV颗粒的其它方法。在一些实施方式中，生产包括选择和/或分离如本文所述的PRRSV分离株。所述选择和/或分离可包括：如本领域普通技术人员已知或如本文所述地培养分离株或对其进行传代。在另外的实施方式中，选择可为从被感染的对象(例如猪)中选择分离株，还包括从对象中获得感染性的液体和/或组织以用作如本文所述的HV2区的来源。感染性的液体和/或组织的非限制性例子包括：血液、血清、血浆、鼻分泌物、精子、精液和尿液，以及肺组织、扁桃腺组织、淋巴结组织、排泄物中的液体组分或排泄物的液体提取物。在一些实施方式中，可将感染性液体和/或组织用作所揭示的组合的部分。非限制性例子包括：将液体或组织与第二HV2区(任选在如本文所述的多肽分子或病毒颗粒中)组合起来用作接种物。
使用方法
本发明包括在对象中通过给予所揭示的第一和第二多肽结构域的组合来产生抗体或免疫应答的方法。在一些实施方式中，该方法包括给予产生抗体和/或免疫应答有效量的所揭示的组合物。在许多实例中，给予的量足以在治疗对象中产生针对以后由一种或多种PRRSV分离株造成的攻击(例如受PRRSV感染)的保护状态。在一些实例中，方法还可包括额外给予所揭示的组合物作为“加强免疫”。对象的非限制性例子包括：母猪、小母猪、怀仔母猪或怀仔的小母猪。在一些实施方式中，对象为约1-12周龄的猪，例如约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10或约11周。在其它实施方式中，猪龄约为12-约56周或更大，例如约14、约16、约18、约20、约22、约24、约26、约28、约30、约32、约34、约36、约38、约40、约42、约44、约46、约48、约50、约52、或约54周。在其它实施方式中，猪已经断奶和/或已过了由母体抗体提供适当保护的阶段。
作为疫苗在对象(例如猪)中产生保护状态的所揭示组合或组合物的有效量，可通过将该疫苗给予未受影响的猪然后用PRRSV分离株对其进行攻击来确定。在一些实例中，可对分离株进行纯化或分离，从而使其病毒颗粒具有相同的基因组或相同GP5蛋白或相同GP5外功能区。用于攻击的分离株的非限制性例子包括：图3所列的那些分离株，以及从受到分离株感染的动物中获得的感染性体液或组织。在一些实施方式中，可在加强免疫接种后约3-约8周后给予攻击，该攻击可使用大量或过量PRRSV。
如果与用相同的分离株攻击未接种分离株(未用疫苗处理的)的猪的结果相比，疫苗或其量可降低PRRSV感染任何征状和/或任何肉眼可观察到的变化或病理学变化的严重度，该疫苗或其量是有效的。当然，猪应该是不带PRRSV的，例如先前没有暴露于病毒的猪，或已暴露于病毒但在足够长的时间段内没有征状而将其鉴别为未感染的猪。或者，可使用在获自猪的体液或组织样品中检测PRRSV或抗PRRSV抗体的存在的测试法来将猪鉴别为未受感染。
PRRSV感染的征状的非限制性例子包括：发烧、呼吸窘迫、发绀、肺炎、昏睡、打喷嚏、咳嗽、眼肿、蓝耳以及心和/或脑损伤。此外，可通过其它定量或定性方法确定用于攻击中的分离株的存在。非限制性例子包括：在经或未经接种后约2天-约2周内检测受攻击的猪的肺损伤、或血液或血清样品中的病毒。与未处理的猪相比，接种的猪损伤降低提供了一种检测感染的定量方法。或者，检测到接种的猪的血液或血清中有病毒表明接种可能并未起效，而病毒检测阴性则表明接种有效。
对象中免疫保护的有效刺激可由暴露于本发明的组合或组合物后所产生的抗体和/或免疫应答来介导。对象的非限制性例子可为：先前未曾暴露于PRRSV的猪、曾暴露于PRRSV的猪、或蒙受PRRSV感染影响的猪。在许多实施方式中，抗体应答的产生包括产生抗GP5蛋白的中和抗体，所述抗GP5蛋白包括其中HV2的全部或部分。可通过分析来自经处理动物的血液或血清中此类抗体的存在来对该抗体的产生进行确认。此类抗体的检测方法的非限制性例子包括：ELISA、RIA和蛋白质印迹法。
本发明包括如本文所述地在对象中产生抗体和/或免疫应答的方法。在一些实施方式中，该方法至少包括：i)鉴别或选择第一PRRSV分离株，该分离株包含含第一HV-2超变区的多肽分子；ii)鉴别或选择第二PRRSV分离株，该分离株包含含不同于所述第一超变区的第二HV-2超变区的多肽分子；和iii)将第一和第二分离株给予对象，以在所述对象中产生抗体和/或免疫应答。在一些实施方式中，方法可包括：选择一种或多种带有其它不同HV-2区的其它分离株，然后将其与所述第一和第二分离株一起给予。在其它实施方式中，该方法可包括与所述第一和第二分离株一起给予一种或多种未经选择的分离株。
当然，所给予的所述第一和第二分离株的量应足以产生所需的抗体和/或免疫应答。在一些实施方式中，给药量足以在对象中产生抗后继一种或多种分离株的PRRSV感染的已接种或受保护状态。
在一些实例中，鉴别或选择可包括：i)分析PRRSV GP5外功能区HV-2超变区的氨基酸序列；ii)对PRRSV GP5外功能区HV-2超变区进行基于PCR或基于抗体的检测；或iii)相对于另一分离株，了解PRRSV GP5外功能区HV-2超变区序列。
在其它实施方式中，产生抗体和/或免疫应答的方法包括：给予含选自D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7或D-8的HV-2区的第一多肽(抗原性的)结构域和含选自S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7或S-8的HV-2区的第二多肽(抗原性的)结构域。在许多实例中，在北美，可有利地使用带有一个或多个不同的多肽(抗原性)结构域的组合，所述多肽结构域选自D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7和S-8。
在其它实施方式中，给药包括两种或多种选自E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7和E-8的多肽(抗原性)结构域。在许多实例中，可将这一组合有利地用在欧洲。在其它实施方式中，可根据发现PRRSV分离株的特定地理区域，在24个亚组中选择两种或多种不同多肽(抗原性)结构域的组合。非限制性例子包括在韩国、中国、日本、东南亚或南美洲发现的分离株。在其它实施方式中，在韩国、中国或日本中使用的组合可与在北美洲使用的组合相同。在其它实施方式中，在用于北美洲或亚洲地区的结构域组合中，可不包括任何E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7和E-8结构域。
在另一些实施方式中，可在本发明的实践中给予两种或多种多肽(抗原性)结构域或含所述结构域的多肽分子或分离株的组合，所述结构域包括至少一种来自在一地理区域检测到的每一亚组的结构域。可用本领域普通技术人员已知的任何适合的方法来给予多肽(抗原性)结构域或包含所述结构域的多肽分子或分离株。非限制性例子包括：注射、鼻内给予或口服给予一种或多种多揭示的分离株或一种或多种来自PRRSV感染对象的细胞和/或组织样品。
如果独立地给药或施用，可以给药间的任选时间间隔，相继给予所述结构域或含有所述结构域的多肽分子或分离株。时间间隔的非限制性例子包括：约1-约2天；约1、约3或约5周；约1、约3、约4或约6个月，或更长。可在初次给药事件和一次或多次后继的“加强免疫”事件之间采用相同的时间间隔。
不论是同时给药还是分别给药，一种或多种多肽分子可以是膜结合或膜缔合的，例如与脂质双层缔合。在一些实例中，膜来自细胞，例如是细胞膜的碎片。在其它实施方式中，膜是囊泡，例如脂质体，水包油或油包水悬液。细胞衍生的膜的非限制性例子包括如本文所述的PRRSV颗粒或其它病毒颗粒的外膜。
试剂盒
可将多肽结构域、多肽分子和分离株，以及包含多肽结构域、多肽分子和分离株的组合和组合物和它们的使用方法纳入一个或多个根据熟知的过程生产的试剂盒中。因此，本发明包括用于本文所述的一种或多种方法的含有一种或多种试剂的试剂盒，所述试剂包括一种或多种如本文所述的多肽结构域、多肽分子或分离株，或包含多肽结构域、多肽分子和分离株的组合和组合物。这样的试剂盒任选还可包含关于其在本发明一种或多种方法中的使用的鉴别说明书、标签或技术说明书。这样的试剂盒可包括容器，其中各容器含有用于所述方法的一种或多种不同的试剂(通常以浓缩形式)。通常还会包括一套技术说明书。
在对本发明进行总体描述后，通过以下的实施例更容易理解本发明，这些实施例以举例的方式提供，除非另有说明并不意味着对本发明进行限制。
实施例
实施例1：保守GP5序列无法产生受保护的状态
本发明部分基于认识到：在两种分离株所含的GP5在保守区中具有相同序列的情况下，先前被第一PRRSV分离株感染的猪能够康复，但对第二分离株易感。这种事件的非限制性例子示于下表2中，其中各事件中的猪从所鉴别的分离株之一(表中所示各事件的第一项)的感染下康复，然后如所示地发现被至少一种其它分离株(各事件1-3和5-7中的第二项)感染。指示了各分离株包含外功能区的GP5序列部分，图1中所示的保守区用下划线表示，HV2区中的区别用黑体表示。
表2
Figure A20088000072900301
基于对这些事件的研究发现：抗一种分离株的GP5蛋白中保守区的抗体不足以提供抗后继PRRSV的保护。此外，HV-1区的序列不能对这些事件提供适当的解释。所示的大部分事件在HV1序列中没有变化。这就引导发现HV2区中的序列变异参与了逃避动物的免疫监视，该动物先前暴露于HV-2区中序列不同的PRRSV。换言之，如上所述的GP5外功能区中的保守序列不能产生保护性针对GP5蛋白中具有不同HV-2区的另一PRRSV的抗体或免疫应答。
该发现部分引导了所揭示的组合、组合物和方法。
实施例2：PRRSV分离株的增殖
PRRSV分离株增殖和维持的方法先前已有报道(参见例如Meng等，1994，J. Gen.Virol.75：1795-1801和Meng等，1996，J of Vet.Diag.Invest.8：374-381)。非限制性例子包括：使用细胞系ATCC CRL 11171，其能以单层形式生长而适于接种病毒分离株。其它细胞和细胞系包括MA-104、PSP-36、PSP-36-SAH、MARC-145和猪胚泡巨噬细胞。
作为非限制性的例子，可使用约0.1、0.5或1的多重性感染(moi)，然后孵育约48小时，再确认感染和病毒复制。可如下进行确认：去除上清(培养基)和固定细胞，再用标记的抗PRRSV抗体进行检测，所述抗体为例如N蛋白(由ORF7编码)特异性单克隆抗体，或针对如本文所述的特定GP5蛋白HV2区的抗体。
实施例3：病毒分离株的组合
如本文所述，可至少基于HV2序列来分类(鉴别)和选择用于本发明组合中的PRRSV分离株。以下数据显示了众多PRRSV分离株中各自的GP5序列(包括外功能区)部分，其中一些在外功能区外的区域中存在差异。如本文所述的HV1、保守区(CR)和HV2的位置示于数据底部，HV1的起始指示是非限制性的代表性例子。
包括了将序列分类到所揭示的组中，可将来自不同亚组的分离株的组合用于本发明中。因此，作为一个非限制性的例子，可将D-4分离株(Ingelvac-ATP)、D-1分离株(Ingelvac-MLV或MJ-3至MJ-14之一)、S-1分离株(MJ-1或MJ-2)和D-3分离株(MJ-15或MJ-16)的组合用于如本文所述地在对象中产生免疫应答。
其它非限制性的例子是：D-1分离株(MJ-17至MJ-27之一)、D-6分离株(MJ-28至MJ-30之一)、D-2分离株(MJ-34或MJ-35)和D-3分离株(例如MJ-36)的组合。下文数据所示的分离株的所有其它组合在符合本发明的情况下在本文所述的制备和用途中都明确地予以考虑。
包括欧洲菌株(LV)在内的所有菌株
Ingelvac-ATP             LVNANSNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLKDKFD(组D-4)
VR-2332                  LANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
Ingelvac-MLV             LANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
主要-Pac(Prime-Pac)      LVNASYSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-1                     LANASSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNHFS(组S-1)
MJ-2                     LANANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNHFS(组S-1)
MJ-3                     LANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-4                     LANASNGSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-5                     LANASNHSSSHLQLTYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-6                     LANASNNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-7                     LASASNSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-8                     LATPSPSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-9                     LANASNANSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-11                    LANASNVNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-12                    LANASNDNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-13                    LANASNSNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-14                    LANASNSNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD(组D-1)
MJ-15                    LANASNGNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLAGKFD(组D-3)
MJ-16                    LANASNSSNSHLQLIYNLTLCELNGTDWLAGKFD(组D-3)
MJ-17                    LANASNDSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD(组D-1)
MJ-18                    LANASNTSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD(组D-1)
MJ-19                    LANASNNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD(组D-1)
MJ-20                    LANANNTSSSHLQLIYNLTLCELNGTDXLAEKFD(组D-1)
MJ-21                    LANANNSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-22                    LANASNNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANQFD(组D-6)
MJ-23                    LANASSNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-24                    LANASANSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-25                    LANASHNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-26                    LANASQNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-27                    LANASSNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANRFD(组D-1)
MJ-28                    LANASSDNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANNFD(组D-6)
MJ-29                    LANASSDNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANNFD(组D-6)
MJ-30                    LASANSINSPHLQLIYNLTLCELNGTDWLAGEFD(组D-6)
MJ-31                    LASASNNSSSRLQLIYNLTLCELNGTDWLADRFN(组D-1)
MJ-32                    LADAHSSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLADRFD(组D-1)
MJ-33                    LANAGNNSSSHLQLIYNLTLCELNGTEWLAERFD(组D-1)
MJ-34                    LGSASSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLASRFD(组D-2)
MJ-35                    LVDANNSSSSHFQLIYNLTICELNGTDWLKARFD(组D-2)
MJ-36                    LVDANNSSSSHFQLIYNLTICELNGTDWLAARFD(组D-3)
MJ-37                    LVDANGNSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLANRFD(组D-1)
MJ-38                    LVNANSTSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLGDKFD(组D-1)
MJ-39                    LVNANSSSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLTNKFD(组D-4)
MJ-40                    LVNANSSSSSHLQSIYNLTLCELNGTDWLGNKFD(组D-1)
MJ-41                    LVDANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNDKFD(组D-5)
MJ-42                    LVDANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNEKFD(组D-5)
MJ-43                    LVNANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNEKFD(组D-5)
MJ-44                    LVNANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD(组D-1)
MJ-45                    LVNANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLGNKFD(组D-1)
MJ-46                    LANANSSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLDKKFD(组D-4)
MJ-47                    LVNANSASSSHSQLIYNLTLCELNGTDWLDGKFE(组D-1)
MJ-48                    LVNANSASSSHSQLIYNLTLCELNGTDWLAGKFE(组D-3)
MJ-49                    LVNANSTSSSPFQLIYNLTLCELNGTDWLQGKFN(组D-1)
MJ-50                    IANASSNSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLAGKFD(组D-3)
MJ-51                    IVNANSNSSSHIQLIYNLTLCELNGTDWLADKFD(组D-1)
MJ-52                    IVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-53                    VVNANSNSSSHFQSIYNLTLCELNGTKWLATKFD(组D-2)
MJ-54                    LDNANSTSSSHFQSIYNLTLCELNGTEWLAENFD(组D-6)
MJ-55                    LDNANSTSSSHFQSIYNLTLCELNGTKWLAEHFD(组D-1)
MJ-56                    LVNANSTSSSHFQSIYNLTLCELNGTDWLKEKFD(组D-4)
MJ-57                    LVDANSSSSSHFQSIYNLTLCELNGTDWLTERFD(组D-4)
MJ-58                    LVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLAQKFD(组D-1)
MJ-59                    LVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLAKKFD(组D-2)
MJ-60                    LVDANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGPDWLKKNFD(组D-6)
MJ-61                    LVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLKEKFD(组D-4)
MJ-62                    LVGANGNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLDEKFD(组D-5)
MJ-63                    LVNASSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLKNKFD(组D-4)
MJ-64                    LVNAHSNSSSHFQSIYNLTLCELNGTDWLDKKFD(组D-4)
MJ-65                    LVNAHDNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNKKFD(组D-4)
MJ-66                    LVNASNTSSSYFQSIYNLTLCELNGTDWLKDKFD(组D-4)
MJ-67                    LVNASNSSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLQGKFD(组D-1)
MJ-68                    IVNASNSNSSHLQSIYSLTLCELNGTEWLGKNFD(组D-6)
MJ-69                    LVNANNSSSSHFQSIYNLTLCELNGTEWLAKNFN(组D-6)
MJ-70                    LVNASSNNSSHFQLIYNLTLCELNGTEWLAKNFI(组D-6)
MJ-71                    LVNANSSSSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLKDKFD(组D-4)
MJ-72                    LVNANSNSSSHLQLIYNLTLCELNGADWLKDKFA(组D-4)
MJ-73                    LVNASNSNSSHLQLIYNLTLCELNGTDWLGNKFN(组D-1)
MJ-74                    LVNANSNNSSHLQLIYNLTLCSLNGTDWLANKFD(组D-1)
MJ-75                    LASANNNHSSHLQSIYNLTLCELNGTDWLSDKFD(组D-4)
MJ-76                    LASANGNHSSHLQSIYNLTLCELNGTDWLRSRFS(组S-4)
MJ-77                    LVGASNTSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNNHFY(组S-7)
MJ-78                    IVDANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNNHFN(组D-5)
MJ-79                    LVDANSNSSSHFQLIYNLTLCELNGTDWLNNHFT(组S-7)
MJ-80                    PVNANNGSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNSKFD(组D-4)
MJ-81                    PVNANNGTSSYSQLIYNLTICELNGTEWLGSKFD(组D-2)
MJ-82                    LVNAANTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLVNRFD(组D-1)
MJ-83                    LANANNTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLVGKFE(组D-3)
MJ-84                    LANANSTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLDDNFD(组D-6)
MJ-85                    LVNANSSSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLDKKFY(组S-7)
MJ-86                    LVNANNTSSSYSQLIYNLTLCELNGADWLKEHFS(组S-5)
MJ-87                    LVNANNTNSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLKGHFS(组S-4)
MJ-88                    LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTEWLGNSFN(组D-7)
MJ-89                    LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTEWLGTKFS(组S-4)
MJ-90                    LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTEWLGEKFS(组S-3)
MJ-91                    LVNANSTNSSYSQLIYNLTLCELNGTEWLGKNFS(组S-8)
MJ-92                    LVNANSTNSSYSQLIYKLTLCELNGTEWLGKKFS(组S-4)
MJ-93                    LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLNEKFS(组S-2)
MJ-94                    LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLNDKFS(组S-2)
MJ-95                    LVNANSTSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLDGHFS(组S-3)
MJ-96                    LVNANSTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNGQFS(组S-3)
MJ-97                    LVNANNTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNGRFS(组S-8)
MJ-98                    LVNANNTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNGKFS(组S-3)
MJ-99                    LVNANSTSSSYSQLIYNLTICELNGTDWLNEHFS(组S-2)
MJ-100                   LVNASNNSSSYSQLIYNLTLCELNGTDWLNKKFS(组S-5)
MJ-101                   LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLDKTFD(组D-7)
MJ-102                   LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLDKSFD(组D-7)
MJ-103                   LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNKTFD(组D-7)
MJ-104                   LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNKSFD(组D-7)
MJ-105                   LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNRSFD(组D-7)
MJ-106                   LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNESFD(组D-7)
MJ-107                   LVNASNNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLSNNFD(组D-6)
MJ-108                   LVNASNNGSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNTFD(组D-7)
MJ-109                   LVNANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNDHFS(组S-2)
MJ-110                   LVNANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNEHFS(组S-2)
MJ-111                   LVNANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNSHFS(组S-5)
MJ-112                   LVNAHSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNKHFS(组S-5)
MJ-113                   LVNANSSNSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNHFS(组S-1)
MJ-114                   LVNASNDSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNGHFS(组S-3)
MJ-115                   LVNASNSSSSNLQLIYNLTICELNGTDWLKNHFS(组S-5)
MJ-116                   LVNASSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLENHFS(组S-1)
MJ-117                   LVNANSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLKNHFS(组S-5)
MJ-118                   LVNANSNSSSNLQLIYNLTICELNGTEWLGSHFS(组S-4)
MJ-119                   LVNADSNSSSHLQLIYNLTICELNGTDWLNNHFG(组D-5)
MJ-120                   LVNANNSSSSHTQLIYNLTLCELNGTEWLSHKFD(组D-8)
MJ-121                   LVNAANSSSSHFQSIYNLTLCELNGTDWLSKKFD(组D-8)
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MJ-124                   FADGNGNNSTY-QYIYNLTICELNGTNWLSGHFE(组E-1)
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MJ 133                   FADGNGNSSTY QYIYNLTICELNGTNWLSGHFN(组E-1)
MJ-134                   FADGNGNNSTY-QYIYNLTICELNGTDWLSNHFS(组E-6)
MJ-135                   FADGNDNNSTY-QYIYNLTICELNGTNWLSNHFS(组E-5)
MJ-136                   FADGNGDSSTY-QYIYNLTICELNGTDWLSSHFG(组E-7)
LV                       FADGNGDSSTY-QYIYNLTICELNGTDWLSSHFG(组E-7)
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本文所引用的所有文献一起全部纳入本文作为参考，不论之前有没有特别引入过。如本文所用，术语“一种”、“一个”和“任何”各自包括其单数和复数形式。
在对本发明进行了完整的描述后，本领域普通技术人员应理解本发明可在等价参数、浓度和条件的广泛范围内施行而不脱离本发明的精神和范围，且无需进行过度的试验。虽然对本发明是结合其特定实施方式来描述的，应理解可对其进行进一步的改变。本申请覆盖总体上符合本发明原理的任何变化、用途或改变，并包括根据本发明所属领域中已知或常规实践而对本发明的偏离，其可应用于本发明上下文中的基本特征中。
序列表
SEQ ID NO：1
C(E/S)LNG(T/A)
SEQ ID NO：2
CELNGT
SEQ ID NO：3
CELNGA
SEQ ID NO：4
CSLNGT
SEQ ID NO：5
CSLNGA
SEQ ID NO：6
I(Y/F)(N/D/S/K)(L/S/F/M)T(L/I)C(E/S)LNG(T/A)

Claims (24)

1.一种免疫原性组合物，其至少包含第一抗原性结构域和第二抗原性结构域，所述结构域各自包含：
约13个氨基酸的可变HV-1区和保守GP5基序，所述保守基序如序列C(E/S)LNG(T/A)，SEQ ID NO：1所示，且化学连接于含约8个氨基酸残基的HV-2超变区，
其中，所述第一和第二抗原性结构域包含不同的HV-2超变区。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一和第二抗原性结构域中的至少一个包含序列X0WLX1X2X3X4X5所示的HV-2超变区，其中X0、X1、X2、X3、X4和X5各自独立地为20种天然存在的氨基酸残基之一，除了X5不为半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述HV-2区如序列X0WLX1X2X3X4X5所示，其中X5不是半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸，且为如下所示：
D-1：其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基(或其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-2：其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基(或其中，X1是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-3：其中，X1和X2各自独立地是脂族氨基酸残基，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-4：其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基(或其中，X1是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-5：其中，X1和X2各自独立地是酸性氨基酸残基，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-6：其中，X1和X2各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X3是酸性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；
D-7：其中，X1和X2各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X3是具有含羟基的R基团的非芳族氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)；或
D-8：其中，X1和X2各自独立地是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述HV-2区如序列X0WLX1X2X3X4X5所示，且如下所示：
S-1：其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是天冬酰胺(N)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-2：其中，X1和X2各自独立地是酸性氨基酸残基，除了X2不为天冬酰胺(N)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-3：其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基(或其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-4：其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基(或其中，X1是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基；或其中，X1和X2各自独立地是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基；或其中，X1和X2各自独立地是脂族氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-5：其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基(或其中，X1是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基，X2是除N(Asn)以外的酸性氨基酸残基)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-6：其中，X1是丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)或碱性氨基酸残基，X2是天冬酰胺(N)，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S；
S-7：其中，X1和X2各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X3是碱性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是T或Y；或
S-8：其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基(或其中，X1是酸性氨基酸残基，X2是脂族氨基酸残基，或其中，X1是脂族氨基酸残基，X2是酸性氨基酸残基)，X3是酸性氨基酸残基，X4是含芳香环的氨基酸残基，例如苯丙氨酸(F)，X5是S。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述HV-2区如下所示：
序列NWLSX2X3X4X5(表示为E-1)，其中，X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是酸性氨基酸残基；
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-2)，其中，X0是除天冬酰胺(N)以外的酸性氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是酸性氨基酸残基；
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-3)，其中，X0是碱性氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，和X5是酸性氨基酸残基；
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-4)，其中，X0是任何非酸性和非碱性氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是酸性氨基酸残基；
序列NWLSX2X3X4X5(表示为E-5)，其中，X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；
序列X0WLX1NX3X4X5(表示为E-6)，其中，X0是除天冬酰胺(N)以外的任何氨基酸残基，X1、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-7)，其中，X0是除天冬酰胺(N)以外的酸性氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，除了X2不为天冬酰胺(N)，X5是任何非酸性氨基酸残基；或
序列X0WLX1X2X3X4X5(表示为E-8)，其中，X0是任何非酸性氨基酸残基，X1、X2、X3和X4各自独立地是20种天然存在的氨基酸残基之一，X5是任何非酸性氨基酸残基。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含含第一抗原性结构域的第一多肽分子和含第二抗原性结构域的第二多肽分子。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述第一和第二多肽各自包含GP5跨膜结构域。
8.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述第一和第二多肽中的至少一种是膜结合或膜缔合的。
9.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述第一和第二多肽中的至少一种与PRRSV病毒颗粒结合。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述病毒颗粒是病毒体。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含2-4个PRRSV分离株，其中的两个分离株包含所述第一和第二结构域。
12.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述第一抗原性结构域包含选自D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7和D-8的HV-2区，所述第二抗原性结构域包含选自S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7和S-8的HV-2区。
13.如权利要求6所述的组合物，其还包含一个或多个其它多肽，所述其它多肽包含共价连接于HV-2超变区的保守GP5基序，
其中，所述一个或多个其它多肽含有不同于所述第一和第二多肽的HV-2超变区。
14.一种制备权利要求6所述的组合物的方法，所述方法包括：
鉴别或选择含所述第一结构域的第一多肽和含所述第二结构域的第二多肽分子，以及
合并所述第一和第二多肽，以形成组合物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述合并包括加入药学上可接受的赋形剂或载体。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第一多肽分子包含选自D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7和D-8的HV-2区，所述第二多肽分子包含选自S-1、S-2、S-3、S-4、S-5、S-6、S-7和S-8的HV-2区。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述多肽分子中的至少一种是膜结合或膜缔合的。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述多肽分子中的至少一种与PRRSV病毒颗粒结合。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述病毒颗粒是病毒体。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述合并是2-4个PRRSV分离株的合并，其中的两个分离株包含所述第一和第二多肽分子。
21.一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括：
将权利要求1-13中任一项所述的组合物给予所述对象，从而在所述对象中产生抗所述抗原性结构域的免疫应答。
22.一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法至少包括：
鉴别或选择包含多肽分子的第一PRRSV分离株，所述多肽分子包含第一HV-2超变区，
鉴别或选择包含多肽分子的第二PRRSV分离株，所述多肽分子包含不同于所述第一超变区的第二HV-2超变区，和
将所述第一和第二分离株给予所述对象，从而在所述对象中产生免疫应答。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述选择包括：
对该PRRSV GP5外功能区HV-2超变区进行氨基酸序列分析；
对该PRRSV GP5外功能区HV-2超变区进行基于PCR或基于抗体的检测；或
相对于另一分离株，了解该PRRSV GP5外功能区HV-2超变区序列的状况。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述对象是母猪、小母猪、怀仔的母猪或怀仔的小母猪。
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