CN107922462A - 含prrsv次要蛋白的重组病毒载体及其制造方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明包括重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗或组合物具体地，本发明包括编码和表达PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5和/或E抗原、蛋白、表位或免疫原的重组腺病毒载体。这样的疫苗或组合物可用于保护动物免受PRRSV感染。

Description

含PRRSV次要蛋白的重组病毒载体及其制造方法与用途
相关申请的交叉参考
本申请主张2015年6月23日申请的临时申请USSN 62/183,410的优先权，且以全文引用的方式并入本文中。
以引用的方式并入
任何前述申请及其中或在其审查期间所引用的所有文献(“申请引用文献”)和申请引用文献中所引用或参考的所有文献，和本文中所引用或参考的所有文献(“本文中引用文献”)，和本文中引用文献中所引用或参考的所有文献以及本文中或任何以引用的方式并入本文中的文献所提及的任何产品的任何制造商说明、说明书、产品说明和产品介绍均在此以引用的方式并入本文中，且可用于本发明的实践。本申请中的任何这样的文献的引用或标识均不承认这样的文件可用作本发明的现有技术，且不反映所引用的专利文献的有效性，专利性和/或可执行性的任何观点。本文中利用GenBank登录号提及的所有序列以全文引用的方式并入本文中，且所述序列是到本申请的申请日为止如GenBank所示的。
关于序列表的声明
以文本格式代替纸件拷贝提供与本申请相关的序列表，并且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为MER_15_265_ST25。文本文件为279KB；其建立于2016年6月13日；且其与本说明书的申请同时以电子方式经由EFS-Web提交。
发明领域
本发明涉及重组腺病毒载体化PRRSV疫苗、组合物和使用方法。
发明概述
PRRSV为猪的破坏性病毒感染，具有巨大的经济重要性(Derald J.Hol tkamp,2013)。不同分离株的抗原特征存在较大变异性，且预防感染的有效措施有限。PRRS可用的疫苗有两大类，其为经减毒修饰的活病毒(MLV)或经杀死的病毒疫苗。尽管在同源物攻击方面有效，但MLV疫苗无法在许多循环变体之间提供更广保护且具有恢复至野生型引起爆发性感染的可能性。此外，用MLV接种的动物持续散出病毒，且使用此疫苗的农场不可能无PRRSV。另一方面，与MLV疫苗相比，经杀死的病毒疫苗安全得多，但不太有效。因此，可用于预防感染的当前选择既不安全也不有效(Charerntantanakul,2012)(Tjeerd G.Kimman,2009)。在过去二十年的大部分时间中，已有开发可解决当前疫苗的主要缺点的重组疫苗的一致努力(Zhang,2012)。然而，尽管做了大量工作，但市场上尚无特许用于预防PRRSV感染的单一重组疫苗。过去评估的大部分重组疫苗是基于据信为中和抗体反应的靶标的病毒包膜蛋白中的一种或组合。然而，缺少对包膜蛋白之间或与靶标细胞上受体的功能性相互作用的彻底理解妨碍了有效重组疫苗的合理设计。
PRRSV的病毒包膜蛋白通常基于蛋白在病毒粒子中的丰度归类为主要和次要蛋白(Dokland,2010)(Dea S,2000)。主要病毒包膜蛋白为gp5(ORF 5)和M(ORF 6)且形成二聚物。次要包膜蛋白为gp2(ORF2)、gp3(ORF3)、gp4(ORF4)和E(ORF2b)且很可能为新鉴别出的病毒蛋白gp5a(ORF 5a)。据信次要包膜蛋白以多聚物形式存在，且其涉及与受体CD163的直接相互作用且介导病毒进入(Phani B.Das,2010)。
大部分先前开发重组疫苗的尝试集中于主要蛋白gp5、M或组合(Dea,1998)。此很可能由于主要蛋白的抗体在PRRSV感染动物中易于检测且假设其可能将中和靶标呈现至免疫系统。此外，gp5中的较大程度序列变异性指示这些蛋白处于免疫选择压力下。然而，gp5特异性抗体自中和血清中耗尽指示这些抗体基本上属于血清的非中和部分(Juan Li,2012)。因此，这些已指示除主要蛋白以外，主要中和靶标存在于病毒包膜蛋白上且很可能存在于次要蛋白上。尽管已作出大量工作将主要蛋白开发为重组疫苗(在经纯化重组蛋白至使用多种载体平台递送的疫苗范围内)中的抗原(Jazmina L.G.Cruza,2010)，但由于未能获得稳健的保护而尚未使其面市。
近来，对开发重组PRRS疫苗的关注已偏移至次要蛋白(Jing-Qiang Ren,2014)(Sakthivel Subramaniam,2014)(Z.S.WANG,2011)。此偏移已主要由三项近来的发现驱动。第一，两种次要蛋白gp2和gp4展示出直接结合至CD163受体。第二，次要蛋白而非主要蛋白与EAV(马动脉炎病毒(Equine arteritis Virus)，也为动脉炎病毒(arterivirus))的交换改变病毒的向性，指示次要蛋白在与受体相互作用以及引导病毒至靶标细胞中的重要性(Lu Z1,2012)(Tian D,2012)。最后，CD163(其为次要蛋白的主要受体)的基因敲除突变体预防病毒感染，而CD169(主要蛋白的受体)的类似基因敲除不影响病毒进入(RandallS.Prather,2013)。尽管在次要蛋白在病毒进入中的作用以及作为中和抗体反应的相关靶标方面的知识渐增，但迄今为止基于次要蛋白开发的重组疫苗中无一个会产生经接种动物免于PRRS感染的保护。
此处，我们呈现将另一次要蛋白E包括在此次要蛋白组合中会产生显著不同的保护性应答。出人意料地，E蛋白以及gp2、gp3和gp4的存在诱导了稳健的免疫反应且减少了来自PRRS攻击的肺损伤。此为第一次展示E蛋白是能诱导保护性免疫反应的蛋白复合物的至关重要的组分。此不仅通过将E蛋白鉴别为次要蛋白复合物的必需组分，而且通过自促进蛋白复合物形成的单一载体平台表达所有四种蛋白来获得。此新发现将不仅用来进一步理解病毒蛋白与细胞受体之间的重要相互作用，而且奠定了获得实际上不含活PRRSV的通用重组PRRS疫苗的基础。
在我们手中，用汇集的表达gp2、gp3和gp4的质粒接种动物未能产生稳健的免疫反应(未公开的观察结果)。来自此动物试验的结论为：推测这些蛋白以多聚物形式存在，且因此需要所有蛋白在单一细胞内同时表达以促进多聚化，从而形成将中和表位呈现至免疫系统的正确构象。后续生物化学分析也表明了这一点，所有蛋白被放置在单一载体中以允许同时表达。出人意料地，在此处报导的动物试验中，我们已发现这还不足以诱导保护性免疫反应。实际上，利用这些抗原诱导保护性免疫反应的至关重要的因素为所引入的使蛋白自胞内区室重新靶向至细胞表面的修饰。经修饰与未经修饰蛋白之间的这样的显著差异完全出人意料且将开放用于解决在多种病毒靶标情况下类似挑战的新途径。据我们所知，这也是首次发现PRRSV包膜次要蛋白的免疫原性在一定程度上增强，其可通过自单一载体同时表达所有次要蛋白且引入增强细胞表面表达的修饰来获得针对PRRS攻击保护免于肺损伤以及降低血清病毒血症水平。
参考文献
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本发明提供新颖的PRRSV疫苗组合物及其制造方法与用途。
本发明部分基于以下惊人且出人意料的发现：将另一PRRSV次要蛋白(E)包括在其他次要蛋白的组合中会产生显著不同的保护性应答。在一些实施方案中，足够量的E蛋白，例如其跨膜(TM)、氨基末端(NT)或其羧基末端(CT)结构域可以用于引发所述保护性应答。
出人意料地，E蛋白以及gp2、gp3和gp4的存在诱导了稳健的免疫反应且减少来自PRRS攻击的肺损伤。此为第一次E蛋白展示为能诱导保护性免疫反应的蛋白复合物的至关重要的组分。
照此，所公开的疫苗不仅通过将E蛋白鉴别为次要蛋白复合物的必需组分来获得，而且通过自促进蛋白复合物形成的单一载体平台表达所有四种蛋白来获得。
在另一方面中，本发明提供PRRSV次要蛋白的重组病毒载体表达嵌合形式，如与其相应的野生型基因相比，其含有不同的细胞定位决定子。具体地，已添加VSV糖蛋白(G)和组织纤维蛋白溶酶原活化因子蛋白(tPA)的一部分以引起所得嵌合基因产物定位至细胞表面。这些重组载体引发宿主动物针对PRRSV的安全且有效的免疫反应。照此，引入至PRRSV次要蛋白中以获得其表面表达的修饰产生了与共同表达E蛋白以及gp2、gp3和gp4的类似作用。
因此，本发明由此提供用于获得100％不含活PRRSV的通用重组PRRS疫苗的路线图。
本发明更尤其涉及一种腺病毒载体化PRRSV疫苗或组合物，其包含一种或多种具有且表达某些PRRSV抗原的工程化重组腺病毒载体和任选选用的药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物。PRRSV可为任何病毒株，因为出于以下更充分论述的原因，本文公开的新颖且创造性的组合物和方法普遍地适用于所有已知和尚待发现的PRRSV病毒株。
PRRSV抗原包括任何组合形式的PRRSV次要蛋白(例如gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E)，并且任选包括额外的PRRSV主要蛋白(例如gp5或M)。与其他次要蛋白相似，gp5a相对高度保守，并且被申请人设想为本发明的安全并且有效的重组病毒载体的有效添加或取代。
PRRSV重组载体可在动物宿主中含有并且表达至少以下基因或组分(rtg＝重新靶向；CMV＝巨细胞病毒启动子；SV40＝猴病毒40启动子；IRES＝内部核糖体进入位点，自身裂解2A肽，来源于口蹄病(FMD)病毒、马鼻炎A病毒、明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asignavirus)或猪捷申病毒-1)的组合(按任何次序，并且由任何启动子组件PE驱动，包括所指明的一个，并且包括诸如IRES和2A-肽的组件)：1)(PE)gp2,(PE)gp3,(PE)gp4,(PE)E；2)(PE)rtg gp2,(PE)gp3和(PE)gp4；3)(PE)rtg gp2,(PE)rtg gp3和(PE)rtg gp4；4)(PE)rtggp2,(PE)rtg gp3,(PE)rtg gp4和(PE)E；5)(PE)rtg gp2,(PE)rtg gp3,(PE)rtg gp4和(PE)rtg E；6)(PE)rtg gp2,(PE)rtg gp4和(PE)rtg E；7)(PE)rtg gp2和(PE)rtg gp4,8)(M-(SV40)-(CMV)-gp5-(IRES)-gp5a；9)gp2-(SV40)-(CMV)-E；10)rtg gp2-(SV40)-(CMV)-E；11)rtg gp2-(SV40)-(CMV)-rtg E；12)(CMV)-E；11)E-(p2A)-gp2-(SV40)-(CMV)-gp4；12)rtg E-(p2A)-rtg gp2-(SV40)-(CMV)-rtg gp4；13)(PE)gp2-(PE)gp4-(PE)E；14)(PE)gp2-(PE)E；15)(PE)gp2；16)(PE)gp2-(PE)gp3；16)(PE)gp2-(PE)gp4；17)(PE)gp2-(PE)gp5a；18)(PE)E；19)(PE)E-(PE)gp3；20)(PE)E-(PE)gp4；19)(PE)E-(PE)gp5a；20)。在一个有利的实施方案中，载体含有并且表达至少野生型或其“rtg”形式的(PE)gp2、(PE)gp4和(PE)E。载体也可有利地包含gp2加编码PRRSV多肽的任何其他基因。
重新靶向可通过分别用VSV的TM和CT结构域置换现有gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E蛋白跨膜(TM)和细胞质尾(CT)结构域来实现。在一个实施方案中，gp5和M蛋白也可经历重新靶向程序。天然PRRSV蛋白序列此外或替代地可被tPA信号序列以及VSV的TM和CT中的一个或两个(或来自其他适合的表面表达多肽的那些相同组件)置换。或者，重新靶向可通过用VSV的CT结构域置换现有gp2、gp3、gp4、gp5a、E、gp5或M蛋白CT结构域(也即，不改变现有TM结构域)来实现。E的重新靶向也可通过用来自II型膜蛋白的序列、或用VSV-G或其组合、或其他表面糖蛋白的TM/CT结构域置换其细胞定位信号来实现。
申请人进一步设想将PRRSV抗原呈现至宿主动物的免疫系统的许多替代手段。举例而言，抗原可呈现在病毒样粒子(VLP)的表面上。在其他实施方案中，抗原的可溶形式可施用至宿主动物，其中蛋白彼此寡聚化(包括三聚化)，或另外与VSV-G的组分或其他病毒蛋白寡聚化，或任何寡聚化(包括三聚化基序)(例如来自细菌GCN4的基序及其类似物)。此外，设想I型病毒表面糖蛋白的TM/CT结构域实现与来自VSV-G的相应的结构域相同的目的，并且因此可与来自VSV-G的相应的结构域互换。
因此，现已公开本发明，本领域技术人员将认识到用于实现基本上相同的呈现PRRSV次要蛋白(包括E、gp2、gp3、gp4、gp5a)、主要蛋白(包括gp5和M)，或次要和/或主要蛋白的组合)至宿主动物的免疫系统的许多替代和功能等效的方式。
本发明也涉及一种接种动物的方法，其包括向动物施用有效量的一种或多种疫苗或组合物，一种或多种疫苗或组合物可包含有效量的腺病毒载体化PRRSV疫苗和任选药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物。施用可为皮下、鼻内、肌肉内、经皮、皮内、黏膜(包括经口)或任何其他施用。
本发明进一步涉及使用初免-加强方案施用疫苗或组合物。本发明进一步包括一种用于执行引发或诱导免疫反应的方法的试剂盒，其可包含重组Ad5免疫组合物或疫苗或灭活的免疫组合物或疫苗中的任一个和用于执行方法的说明书。
因此，本发明的一个目标为在本发明内不包括任何先前已知的产品、制备产品的工艺，或使用产品的方法，使得申请人有权并且在此公开任何先前已知产品、工艺或方法的免责声明。另外注意，本发明不希望在本发明的范畴内包括不符合书面说明和USPTO的启用要求(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83章)的任何产品、制备产品的方法或使用产品的方法，因此申请人有权并且在此公开任何先前所述产品、制备产品的方法或使用产品的方法的免责声明。
这些及其他实施方案公开于以下详述中或自以下详述为明显的并且包括于以下详述中。
附图简述
以举例方式给出，但并不意欲将本发明仅限制于描述的特定实施方案的以下详述可与附图结合而最佳地理解，其中：
图1呈现用于产生表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)次要病毒包膜蛋白的四种不同重组病毒载体的插入序列的图。vAD3042表达不具有E的经密码子优化的PRRSV gp2、gp3和gp4(A)；vAD3038表达不具有E的经密码子优化的重新靶向(“rtg”)的rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4(B)；vAD3041表达具有E的经密码子优化的gp2、gp3、gp4(C)；vAD3067表达具有E的经密码子优化的rtg-gp2、rtg-gp3、rtg-gp4(D)；vAD3046表达经密码子优化的猪流感病毒血球凝集素(SIV-HA)(E)；vAD3069表达经密码子优化的核蛋白(Np或N)、M、gp5和gp5a(F)；和vAD3064表达经密码子优化的rtg-M、rtg-gp5和rtg-gp5a(G)；
图2为展示PRRSV“主要”和“次要”蛋白在病毒膜的表面上的布置的示意图；
图3为展示PRRSV“次要”蛋白的布置和相互作用的示意图，如当前和所公开证据指示这些蛋白理解为与宿主细胞表面受体(例如CD163)相互作用；
图4为展示插入在vAD3041通道3(A)和vAD3042通道3(B)中的PRRSV次要蛋白的区域的PCR扩增子的凝胶图像；
图5A呈现用于使PRRSV包膜蛋白重新靶向细胞表面的流程；
图5B-5D呈现rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4蛋白的图，其中内源性TM和CT结构域已被水疱性口炎病毒-G(VSV-G)跨膜(TM)和细胞质尾(CT)结构域置换，已置换信号序列，已添加表位标记，并且已插入接头序列；
图6呈现已被表位标记的rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4蛋白转染的经固定的HEK293T细胞的免疫荧光分析(IFA)图像；
图7展示来自用编码各个重新靶向的包膜蛋白中的每一个的质粒转染的HEK 293T细胞的免疫共沉淀(co-IP)裂解物的抗VSVG蛋白印迹(WB)；
图8展示来自用编码各个重新靶向的包膜蛋白或猪CD16中的每一个的质粒转染的HEK 293T细胞的co-IP裂解物的数个WB。IP：α-VSV，Wb：α-VSV-HRP(A)，IP：α-VSV，Wb：α-CD163(B)；IP：α-CD163，Wb：α-CD163-生物素(C)；
图9A至9C呈现感染有vAD3038(含有经密码子优化的rtg-gp234)的HEK 293细胞的双重免疫荧光分析(IFA)图像；并且用对所标示的蛋白具有特异性的两种抗体和不同荧光团标记同时染色。图像通过使用特异于每一荧光团的滤光器获自相同光场。相应的图像用箭头展示；
图10为详述在整个研究中所收集的样品和收集时间的图表；
图11为展示肺损伤分数在不同组中的分布的图。vAD3042(表达经密码子优化的、野生型gp2、野生型gp3和野生型gp4的Ad5)；vAD3041(表达经密码子优化的、野生型gp2、野生型gp3、野生型gp4和野生型E的Ad5)；vAD3038(表达经密码子优化的、rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4的Ad5)；和vAD3033(表达猪流感病毒(SIV)的经密码子优化的血球凝集素(HA)基因的Ad5，阴性对照)。中位数(交叉条)和平均值(+)和方框表示第1与第3四分位数间范围之间的范围。灰色圆圈指示每一组中每一个别动物的实际肺分数；
图12列出并且描述序列表中呈现的序列；
图13为SEQ ID NO：34-39中所示的gp2多肽序列的ClustalW比对；
图14为SEQ ID NO：40-45中所示的gp3多肽序列的ClustalW比对；
图15为SEQ ID NO：46-51中所示的gp4多肽序列的ClustalW比对；
图16为SEQ ID NO：52-58中所示的E多肽序列的ClustalW比对；
图17为SEQ ID NO：62-65中所示的gp5a多肽序列的ClustalW比对；
图18为展示施用vAd3038(Gp234-Rtrg+经杀死的疫苗)或vAd3046(SIV-HA)的猪的肺损伤分数的图；
图19为展示施用vAd3038(Gp234-Rtrg+经杀死的疫苗)或vAd3046(SIV-HA)的猪的血清病毒负荷的图；
图20比较在攻击之前和之后第1、2、4和5组的免疫反应。蛋白印迹用于以下各项探测：抗V5，用于观察E蛋白含量(左上)；抗Flag，用于检测gp3(右)；和抗HA，用于观察gp4蛋白含量(左下)；
图21为展示施用vAD3067(IM/IM)随后杀死的疫苗，vAD3067(IN/IM)随后杀死的疫苗；vAD3067+vAD3064(IN/IM)随后杀死的疫苗；或vAD3046随后安慰剂的猪的肺损伤分数的图。所有经杀死的疫苗均IM一次给予；
图22为施用vAD3067(IM/IM)随后杀死的疫苗，vAD3067(IN/IM)随后杀死的疫苗；vAD3067+vAD3064(IN/IM)随后杀死的疫苗；或vAD3046和安慰剂的猪的血清病毒负荷的图。所有经杀死的疫苗均IM一次给予；
图23展示经设计以探究E与重新靶向的gp4之间可能的相互作用(未观察到相互作用)的免疫沉淀研究的结果。在构建体中，Flag标记连接至gp3；V5标记连接至E；HA标记连接至gp4；并且Myc标记连接至gp2。WB(蛋白印迹)、IP(免疫沉淀)、S(可溶gp)和V(VSV标记的gp)；
图24展示经设计以探究E与重新靶向的gp3之间可能的相互作用(未观察到相互作用)的IP研究的结果。
详述
应注意，在本发明中并且尤其在权利要求和/或段落中，术语诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”及其类似术语可具有美国专利法中赋予其的含义；例如其可意谓“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”及其类似术语；并且术语诸如“基本上组成为(consisting essentiallyof)”和“基本上由组成(consists essentially of)”具有美国专利法中赋予其的含义，例如其允许不明确叙述各要素，但排除现有技术中所发现或影响本发明的基本或新颖特征的要素。
除非另外解释，否则本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。除非上下文另外明确指示，否则单数术语“一个/一种(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。类似地，除非上下文另外明确指示，否则字语“或”意欲包括“和”。
术语“约”在本文中用于意指大致、在...范围内、粗略地或左右。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过向上或向下扩展所示数值的边界来调整其范围。一般而言，术语“约”在本文中用于修改数值到所陈述值上方和下方10％的偏差。在一个方面中，术语“约”意指加上或减去所使用数字的数值的20％。因此，约50％意指在45％-55％的范围内。在本文中利用终点叙述的数值范围包括范围内包含的所有数字和分数(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应理解，假定所有数字及其分数均由术语“约”修饰。
在本发明中，腺病毒5(Ad5)或另一适合的载体用于在动物宿主中体内递送和表达所选PRRSV包膜蛋白，以在动物中引发针对使用有毒性的PRRSV的实验或天然攻击的安全并且有效的免疫反应。
虽然Ad5用于递送本发明中的PRRSV蛋白，但可使用任何其他适合的载体。举例而言，杆状病毒、痘病毒(包括禽痘病毒和金丝雀痘病毒)可以用于递送本文公开的新颖并且创造性的基因组合。在另一个实施方案中，猪巨细胞病毒(PCMV)可以用作载体，其为在整个体内组织(包括新生猪崽的鼻)中发现的疱疹病毒，其中其引起发炎(鼻炎)。
本发明由此涉及一种疫苗或免疫组合物，其可包含有效量的一种或多种工程化的Ad5载体或其他适合的载体和任选药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物。
因此，本发明包括工程化的Ad5载体或其他适合的表达PRRSV包膜蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原的载体，其在动物中引发免疫原性反应。PRRSV蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原包括至少一种PRRSV次要蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原，选自PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a和E。
如本文所使用，术语“PRRSV次要多肽、抗原、表位或免疫原”系指猪繁殖与呼吸综合征病毒的任何次要多肽、抗原、表位或免疫原。目前，次要多肽或其组分包括gp2、gp3、gp4、gp5a和E蛋白，但可能存在与也可有效用于实践所公开的本发明的目前已知次要蛋白相关的其他蛋白。一般而言并且如本文所使用，术语“胞外结构域”是指延伸至细胞外空间中的膜蛋白的结构域。照此，对与给定蛋白的胞外结构域同一性百分比的任何指示不意欲包括与蛋白的非胞外结构域(包括跨膜结构域(TMD)和细胞质结构域(CTD))的比较。
“动物”意欲为哺乳动物、人类、禽类及其类似者。动物可选自由以下各项组成的组：马类动物(例如马)、犬类动物(例如狗、狼、狐狸、郊狼、胡狼)、猫类动物(例如狮子、老虎、家猫、野猫、其他大猫以及包括猎豹和山猫的其他猫类动物)、绵羊类动物(例如绵羊)、牛类动物(例如牛、母牛、水牛)、猪类动物(猪)、禽类动物(例如鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、鸵鸟、鸸鹋和食火鸡)、灵长类动物(例如原猴、眼镜猴、猴、长臂猿、猿)和鱼类动物。术语“动物”也包括所有发育阶段，包括胚胎和胎儿阶段的个体动物。
在本发明中，猪科动物针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护为最重要的。然而，本文公开的概念将同样适用于其他病毒，如此处，关键的“细胞进入介导性”表面蛋白的相对较低或有限表达使得疫苗开发尤其具挑战性。因此，如本文中所公开，这样的“次要包膜蛋白”对细胞表面的重新靶向和/或伴随已广泛深远的应用于所有包膜病毒。
在一个实施方案中，Ad5免疫组合物或疫苗包含一种或多种工程化的Ad5载体和任选药学上或兽医学上可接受的赋形剂、佐剂、载剂或媒介物。工程化的Ad5载体可包含编码PRRSV次要蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原的多核苷酸。PRRSV蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原可为gp2、gp3、gp4、gp5a、E或其任何片段。
如本文所使用，术语“抗原”或“免疫原”意指在宿主动物中诱发特异性免疫反应的物质。抗原可包含经杀死的、减毒或活的整个生物体；生物体的子单元或部分；含有表达表位、多肽、肽、蛋白或其具有免疫原性特性的片段的插入序列的重组载体；在呈现至宿主动物时能够诱导免疫反应的核酸碎片或片段；蛋白、多肽、肽、表位、半抗原或其任何组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
如本文所使用，术语“免疫原性蛋白或肽”也包括在施用至宿主后，能够引起针对蛋白的体液和/或细胞类型的免疫反应的意义上为免疫活性的肽和多肽。优选地，蛋白片段使得其具有与全部、完整的天然蛋白基本上相同的免疫活性。因此，本发明的蛋白质片段包含至少一种表位或抗原决定子，或基本上由其组成，或由其组成。术语表位(也称为抗原决定子)为由免疫系统所识别的大分子的一部分并且能够诱导体液型(B细胞)和/或细胞型(T细胞)的免疫反应。
术语“免疫原性蛋白质或肽”进一步包括序列的缺失、添加和取代，只要多肽用于产生如本文所定义的免疫反应。就此而言，尤其优选取代将通常在自然界中保守，即那些在氨基酸家族内发生的取代。举例而言，氨基酸一般分成四个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳族氨基酸。合理可预测的是，亮氨酸经异亮氨酸或缬氨酸独立置换或反过来；天冬氨酸经谷氨酸独立置换或反过来；苏氨酸经丝氨酸独立置换或反过来；或氨基酸经结构相关氨基酸的类似保守置换对生物活性将不具有显著影响。与参考分子具有基本上相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质的免疫原性的次要氨基酸取代的蛋白质因此在参考多肽的定义内。
术语“表位”是指由免疫系统所识别的大分子的一部分并且能够诱导体液型(B细胞)和/或细胞型(T细胞)的免疫反应。术语也可与“抗原决定子”或“抗原决定子位点”互换使用。识别相同表位的抗体可在显示一个抗体阻断另一抗体与目标抗原的结合的能力的简单免疫分析中鉴别。
组合物或疫苗的“免疫反应”为在宿主中产生对所关注的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包括(但不限于)以下作用中的一或多个：产生抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞，特异性地针对所关注的组合物或疫苗中包括的抗原。优选地，宿主将呈现治疗性或保护性免疫反应，从而对新感染的抗性将增强和/或疾病的临床严重度将降低。这样的保护将通过通常由感染宿主显示的症状的减少或缺乏、更快速恢复时间和/或感染宿主中降低的病毒效价展示。
如本文所用的术语“免疫原性”蛋白或多肽也指引发如上文所述的免疫反应的氨基酸序列。如本文所用，“免疫原性”蛋白或多肽包括蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指包括一个或多个表位并且因此引发上文所述的免疫反应的蛋白的片段。这样的片段可使用任何数目的本领域中熟知的表位定位技术鉴别。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(GlennE.Morris编，1996)。
举例而言，线性表位可通过例如如下测定：在固体载体上并行合成大量肽，所述肽对应于蛋白分子的部分，并且使肽与抗体反应，而肽仍附接于载体。这样的技术为本领域中已知的并且描述在例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986中。类似地，通过测定氨基酸的空间构象(诸如，通过，例如，X射线结晶和二维核磁共振)常规地鉴别构象表位。参见例如Epitope Mapping Protocols，同上。
合成抗原也包括在定义内，例如多表位、侧接表位及其他重组或合成衍生的抗原。出于本发明的目的，免疫原性片段将通常包括分子的至少约3个氨基酸、约5个氨基酸、约10-15个氨基酸、约15-25个氨基酸或大于25个氨基酸。片段长度不存在临界上限，其可包含蛋白质序列的几乎全长，或甚至包含蛋白质的至少一个表位的融合蛋白。
因此，表达表位的多核苷酸的最小结构为其包含编码PRRSV蛋白或多肽的表位或抗原决定子的核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。编码总蛋白或多肽的片段的多核苷酸包含编码总蛋白或多肽的序列的最少15个核苷酸、有利地约30-45个核苷酸、并且优选约45-75个、至少57、87或150个连续或邻接核苷酸，或基本上由其组成，或由其组成。表位测定程序，诸如产生重叠肽文库(Hemmer等人，1998)、Pepscan(Geysen等人，1984；Geysen等人，1985；Van der Zee R.等人，1989；Geysen,1990；Multipin.RTM.Peptide SynthesisKitsde Chiron)和算法(De Groot等人，1999)，可用于实践本发明，并且无需过多的实验。
“多核苷酸”为含有任何组合形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物的任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可具有三维结构，并且可执行任何已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包括双链、单链和三链螺旋分子。除非另外指明或需要，否则作为多核苷酸的本文所述的本发明的任何实施方案包括DNA、RNA或杂合分子的双链形式和已知或预测会构成其双链形式的两种互补形式中的每一个。
术语“密码子优化”是指最佳配置编码蛋白、多肽、抗原、表位、结构域或片段的核酸序列以用于在所选宿主中表达/翻译的方法。一般而言，基因表达水平取决于许多因素，诸如启动子序列和调控组件。最重要的因素之一为将转录物基因的密码子使用调适成宿主的典型密码子使用(Lithwich,G.and Margalit,H.,Genome Res.13,2665-2673,2003)。因此，在翻译选择下原核基因组中高度表达的基因具有明显的密码子使用偏好。这是因为其使用由最丰富tRNA种类所识别的密码子的小型子集(Ikemura,T.,J.Mol.Biol.151,389-409,1981)。调节此密码子调适的力被称为翻译选择并且其强度在快速生长细菌中很重要(Rocha,E.P.,Genome Res.14,2279-2286,2004；Sharp,P.M.等人，Nucleic Acids Res.33,1141-1153)。若基因含有很少被宿主使用的密码子，则其表达水平将不为最大。此可为异源蛋白表达(Gustafsson,C.等人，Trends Biotechnol.22,346-353,2004)和开发DNA疫苗(Ivory,C.和Chadee,K.,Genet.Vaccines Ther.2,17,2004)的限制之一。大量合成基因已被重新设计以增加其表达水平。合成基因数据库(SGDB)(Wu,G.等人，Nucleic AcidsRes.35,D76-D79,2007)含有来自关于合成基因的超过200次公开实验的信息。在将插入至新宿主中以按最佳量表达某些蛋白的核酸序列的设计方法中，密码子使用优化通常为最初步骤中的一个(Gustafsson,C.,Trends Biotechnol.22,346-353,2004)。密码子使用优化基本上涉及改变目标基因中的罕见密码子，使得其更紧密地反映宿主的密码子使用，并且不改变所编码蛋白的氨基酸序列(Gustafsson,C.,Trends Biotechnol.22,346-353,2004)。因此，通常用于优化程序的信息为待优化的DNA或蛋白序列和宿主的密码子使用表(参考集)。
存在允许几种由任何本领域技术人员优化密码子的数个公共网页服务器和单机应用程序。“GeneDesign”(Richardson,S.M.等人，Genome Res.16,550-556,2006)、“Synthetic Gene Designer”(Wu,G.等人，Protein Expr.Purif.47,441-445,2006)和“Gene Designer”(Villalobos,A.等人，BMC Bioinformatics 7,285,2006)为提供用于合成基因设计的平台(包括密码子优化步骤)的套件。关于可用于每一种服务器或程序的密码子使用优化的方法，最初开发的程序仅使用“一种氨基酸-一种密码子”方法。最新的程序和服务器现包括用于形成一些密码子使用变异性的其他方法。此变异性反映天然高度表达的基因的密码子使用变异性并且允许待引入优化程序中的其他准则(诸如避免限制性位点)。本文所述的大部分应用程序和网页服务器提供三种密码子优化方法：所有密码子的全部优化，基于使用蒙特卡洛(Monte Carlo)方法的参考集的相对密码子使用频率的优化，以及经设计以使优化最大化并且查询与经优化序列之间变化最少的新颖方法。
在一个实施方案中，编码重组PRRSV次要蛋白、抗原、肽、多肽、片段、结构域或表位的核酸序列为经优化以用于在动物中表达的密码子。在另一个实施方案中，密码子优化的序列编码猪PRRSV次要包膜蛋白、抗原、肽、多肽、片段、结构域或表位以用于动物表达。在另一个实施方案中，密码子优化的序列编码PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E蛋白、抗原、肽、多肽、片段、结构域或表位以用于动物表达。
以下为多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的经分离DNA、任何序列的经分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他糖和连接基团，诸如氟核糖和硫醇盐，和核苷酸分支。核苷酸的序列可在聚合之后经进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。包括于此定义中的其他类型的修饰为caps，通过类似物取代天然存在的核苷酸中的一个或多个，和引入将多核苷酸连接至蛋白、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体载体的方法。多核苷酸可通过化学合成获得或衍生自微生物。
术语“基因”广泛用于指与生物功能相关的多核苷酸的任何区段。因此，基因包括内含子和外显子(如在基因组序列中的)，或仅包括编码序列(如对于其表达所需的cDNA和/或调节序列中)。举例而言，基因也指表达mRNA或功能RNA，或编码特定蛋白质，并且包括调节序列的核酸片段。
本发明进一步包含编码PRRSV次要包膜蛋白、抗原、表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为聚合的并且具有任何长度，并且可含有任何组合形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和类似物。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用以指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可为直链或分支链的，其可包含经修饰氨基酸或氨基酸类似物，并且其可杂有除氨基酸以外的化学部分。术语也包括已被天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记或生物活性组分缀合。
“经分离”多核苷酸或多肽为“基本上不含”其天然环境中相关的物质的多核苷酸或多肽。“基本上不含”意指多核苷酸或多肽至少50％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％不含这些物质。若“经分离”多核苷酸或多肽称为“几乎完全不含污染物”，则其意指经分离多核苷酸或多肽至少98％不含这些物质。
本发明进一步包括多核苷酸，其编码PRRSV多肽的功能等效变体和衍生物及其功能等效片段，其可增强、减弱或不显著影响由此编码的多肽的固有特性。这些功能等效变体、衍生物和片段展示保留活性的能力。举例而言，并不改变所编码的氨基酸序列的DNA序列变化、以及引起氨基酸残基的保守取代、一个或几个氨基酸缺失或添加和氨基酸残基经氨基酸类似物取代的DNA序列变化将不显著影响所编码的多肽的特性。在一个实施方案中，变体具有与所关注的PRRSV多核苷酸或多肽至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性。
在一个方面中，本发明提供PRRSV多肽，尤其PRRSV次要包膜多肽。在另一方面中，本发明提供一种多肽，其具有SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列或其变体或片段。
在另一方面中，本发明提供一种多肽，其具有与本发明的PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E多肽、尤其与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列的多肽至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在另一方面中，本发明提供上述经鉴别的PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E多肽(SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139)的片段和变体，其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的同源多肽。
PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列或其变体的PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E多肽的片段包括在全长PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E多肽上发现的特异性抗原的表位。
在另一方面中，本发明提供编码PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E多肽的多核苷酸，诸如编码具有SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中，本发明提供具有SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的核苷酸序列或其变体的多核苷酸。在另一方面中，本发明提供与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的序列或其变体的多核苷酸具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸。
在一个方面中，本发明提供PRRSV多肽，尤其PRRSV E多肽。在另一方面中，本发明提供具有SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中，本发明提供与本发明的PRRSV E多肽、尤其与具有SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。
在另一方面中，本发明提供上述经鉴别的PRRSV E多肽(SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139)的片段和变体，其可由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术常规制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139中所示的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的同源多肽。
PRRSV E多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139中所示的序列或其变体的PRRSV E多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，PRRSV E多肽的片段包括在全长PRRSV E多肽上发现的特异性抗原的表位。
在另一方面中，本发明提供编码PRRSV E多肽的多核苷酸，诸如编码具有SEQ IDNO：7、20、52-58或130-139中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码PRRSV E多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中，本发明提供PRRSV多肽，尤其PRRSV gp2多肽。在另一方面中，本发明提供具有SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中，本发明提供与本发明的PRRSV gp2多肽、尤其与具有SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。
在另一方面中，本发明提供上述经鉴别的PRRSV gp2多肽(SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89)的片段和变体，其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89中所示的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的同源多肽。
PRRSV gp2多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89中所示的序列或其变体的PRRSV gp2多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，PRRSV gp2多肽的片段包括发现于全长PRRSV gp2多肽上的特异性抗原的表位。
在另一方面中，本发明提供编码PRRSV gp2多肽的多核苷酸，诸如编码具有SEQ IDNO：1、14、34-39或80-89中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码PRRSV gp2多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中，本发明提供PRRSV多肽，尤其PRRSV gp3多肽。在另一方面中，本发明提供具有SEQ ID NO：3、16或40-45中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中，本发明提供与本发明的PRRSV gp3多肽、尤其与具有SEQ ID NO：3、16或40-45中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。
在另一方面中，本发明提供上述经鉴别的PRRSV gp3多肽(SEQ ID NO：3、16或40-45)的片段和变体，其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与SEQ ID NO：3、16或40-45中所示的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的同源多肽。
PRRSV gp3多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO：3、16或40-45中所示的序列或其变体的PRRSV gp3多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，PRRSV gp3多肽的片段包括发现于全长PRRSV gp3多肽上的特异性抗原的表位。
在另一方面中，本发明提供编码PRRSV gp3多肽的多核苷酸，诸如编码具有SEQ IDNO：3、16或40-45中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：3、16或40-45中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码PRRSV gp3多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中，本发明提供PRRSV多肽，尤其PRRSV gp4多肽。在另一方面中，本发明提供具有SEQ ID NO：5、18或46-51中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中，本发明提供与本发明的PRRSV gp4多肽、尤其与具有SEQ ID NO：5、18或46-51中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。
在另一方面中，本发明提供上述经鉴别的PRRSV gp4多肽(SEQ ID NO：5、18或46-51)的片段和变体，其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与SEQ ID NO：5、18或46-51中所示的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的同源多肽。
PRRSV gp4多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO：5、18或46-51中所示的序列或其变体的PRRSV gp4多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，PRRSV gp4多肽的片段包括发现于全长PRRSV gp4多肽上的特异性抗原的表位。
在另一方面中，本发明提供编码PRRSV gp4多肽的多核苷酸，诸如编码具有SEQ IDNO：5、18或46-51中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：5、18或46-51中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码PRRSV gp4多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中，本发明提供PRRSV多肽，尤其PRRSV gp5a多肽。在另一方面中，本发明提供具有SEQ ID NO：31或62-65中所示的序列及其变体或片段的多肽。
在另一方面中，本发明提供与本发明的PRRSV gp5a多肽、尤其与具有SEQ ID NO：31或62-65中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。
在另一方面中，本发明提供上述经鉴别的PRRSV gp5a多肽(SEQ ID NO：31或62-65)的片段和变体，其可易于由本领域技术人员使用熟知分子生物学技术制备。
变体为氨基酸序列与本发明的抗原多肽、尤其与SEQ ID NO：31或62-65中所示的氨基酸序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的同源多肽。
PRRSV gp5a多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO：31或62-65中所示的序列或其变体的PRRSV gp5a多肽的至少8、10、15或20个连续氨基酸、至少21个氨基酸、至少23个氨基酸、至少25个氨基酸或至少30个氨基酸。在另一个实施方案中，PRRSV gp5a多肽的片段包括发现于全长PRRSV gp5a多肽上的特异性抗原的表位。
在另一方面中，本发明提供编码PRRSV gp5a多肽的多核苷酸，诸如编码具有SEQID NO：31或62-65中所示的序列的多肽的多核苷酸。在另一方面中，本发明提供编码与具有SEQ ID NO：31或62-65中所示的序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽、或包含这些多肽中的一个的至少八个或至少十个连续氨基酸的保守变体、等位基因变体、同源物或免疫原性片段、或这些多肽的组合的多核苷酸。编码PRRSV gp5a多肽的多核苷酸可经密码子优化以用于在特定动物物种中表达。
在另一方面中，本发明提供具有SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的核苷酸序列或其变体的多核苷酸。在另一方面中，本发明提供与具有SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的序列的多核苷酸中的一个或其变体具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供一种安全并且有效的免疫或疫苗组合物，其包含：一种或多种重组病毒载体，其包含一种或多种异源多核苷酸，其编码一种或多种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E抗原、多肽、胞外结构域或其变体；和药学上或兽医学上可接受的载体。“其变体”意欲包括抗原、多肽和胞外结构域(包括例如，如本文中所公开的蛋白的重新靶向的变体)的免疫等效形式。“免疫等效”意指如与初始比较抗原、多肽或胞外结构域相比，“其变体”能够引发基本上类似的免疫反应，包括保护性免疫反应。
在组合物的一些实施方案中，一种或多种载体包含重组腺病毒5PRRSV(Ad5-PRRSV)载体、重组杆状病毒PRRSV载体、重组猪巨细胞病毒PRRSV载体或重组痘病毒PRRSV载体。
在一些实施方案中，一种或多种载体包含：编码PRRSV E抗原、多肽、胞外结构域或其变体的核苷酸序列；或编码经修饰的PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或M抗原、多肽、胞外结构域或其变体的核苷酸序列，其中gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或M的现有细胞定位序列已被来自异源基因的细胞表面表达决定子序列置换。在一些实施方案中，一种或多种载体包含两种载体的混合物，即表达重新靶向的PRRSV次要蛋白的第一载体和表达重新靶向的PRRSV主要蛋白的第二载体。
在一些实施方案中，重组载体包含编码具有以下特征的抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸：与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中的任何一个或多个至少90％的序列同一性；或与SEQ IDNO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，重组Ad5-PRRSV载体包含具有以下特征的多核苷酸：与SEQ IDNO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78至少90％的序列同一性；或与由SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78的子序列编码的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，组合物或疫苗包含一种或两种Ad5-PRRSV载体。在一些实施方案中，Ad5-PRRSV可表达gp2和E；gp2、gp4和E；gp2、gp3、gp4和E；rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4；rtg-gp2和E；rtg-gp2、rtg-gp4和E；rtg-gp3和E；rtg-gp4和E；单独E；单独rtg-E；rtg-gp5、rtg-M。
在一些实施方案中，Ad5-PRRSV重组载体包含编码与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139具有至少90％的序列同一性的抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸；或包含编码与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139的子序列中所示的胞外结构域具有至少90％的序列同一性的胞外结构域的多核苷酸。
在一些实施方案中，重组Ad5-PRRSV载体包含具有以下特征的多核苷酸：与SEQ IDNO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78至少90％的序列同一性；或包含与由SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78的子序列编码的胞外结构域序列具有至少90％同一性的多核苷酸。
在一些实施方案中，重组Ad5-PRRSV载体包含编码一种或多种PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E抗原、多肽、胞外结构域、或其变体或其组合的一种或多种多核苷酸。
在一些实施方案中，重组Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的一种或多种抗原、多肽或胞外结构域的一种或多种多核苷酸：(a)与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列至少90％的序列同一性；或(b)与由SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列包括的胞外结构域至少90％的序列同一性。“由...包括的胞外结构域”意欲仅给定SEQ ID NO的细胞外部分(即，并非跨膜或细胞质部分)经受序列同一性百分比限制。举例而言，若由200个氨基酸组成的多肽具有跨氨基酸编号20至100的胞外结构域，则比较多肽仅需要跨氨基酸编号20至100具有90％同一性(即在90％的序列同一性措辞的情况下)。现本发明已公开，申请人设想本领域技术人员可常规地自多种TMD和CTD选择以与所公开的保护性PRRSV多肽的个体和组合的胞外结构域组合。
在一些实施方案中，一种或多种多核苷酸与SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的序列具有至少90％的序列同一性；或，多核苷酸跨由SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78的子序列中所示的序列编码的胞外结构域长度具有至少90％的序列同一性。使用常规技术的本领域技术人员可了解或确认哪些多核苷酸序列编码胞外结构域。
在一些实施方案中，Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV gp2多肽的多核苷酸：(a)与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列至少90％的序列同一性；或(b)与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV E多肽的多核苷酸：(a)与SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列至少90％的序列同一性；或(b)与SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV gp3多肽的多核苷酸：(a)与SEQ ID NO：5、18、40-45或90-99(gp3蛋白)中所示的序列至少90％的序列同一性；或(b)与SEQ ID NO：5、18、40-45或90-99的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV gp2和E多肽的两种多核苷酸：(a)与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个和SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列中的一个至少90％的序列同一性；或(b)与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列和SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV gp2、E和gp4多肽的多核苷酸：(a)与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个、SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列中的一个和SEQ ID NO：5、18、40-45、90-99(gp3蛋白)中所示的序列中的一个至少90％的序列同一性；或(b)与由SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个包括的胞外结构域、由SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列中的一个包括的胞外结构域和由SEQ ID NO：5、18、40-45、90-99(gp3蛋白)中所示的序列中的一个包括的胞外结构域至少90％的序列同一性。
在另一方面中，本发明提供一种在有需要的动物中引发针对PRRSV的保护性免疫反应的方法，其包括向动物施用表达至少一种gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E PRRSV抗原的重组Ad5-PRRSV载体和药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物。
在方法的一些实施方案中，Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸：(a)与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)和SEQ IDNO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列中的一个至少90％的序列同一性；或(b)与由相应前述SEQ ID NO包括的gp2蛋白或E蛋白胞外结构域至少90％的序列同一性。
如权利要求24的方法，其中Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的一种或多种多肽的一种或多种多核苷酸：与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个、SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列中的一个和SEQ ID NO：5、18、40-45、90-99(gp3蛋白)中所示的序列中的一个至少90％的序列同一性；或(b)与由相应前述SEQ ID NO包括的gp2、E和gp3胞外结构域至少90％的序列同一性。
在一些实施方案中，施用是通过经口鼻、喷雾剂、饮用水、肌肉内、或皮下施用、皮内、经皮进行。在一些实施方案中，施用为初免-加强。在一些实施方案中，第一接种为两种Ad5载体的混合物，即，表达重新靶向的PRRSV次要蛋白的第一载体和表达PRRSV主要蛋白的第二载体；并且加强包含第一接种的两种载体或任一单独载体，或基本上由其组成。在一些实施方案中，需要保护的动物为猪动物。
一般而言，氨基酸序列的比较通过将已知结构的多肽的氨基酸序列与未知结构的多肽的氨基酸序列比对来实现。接着，比较序列中的氨基酸，并且将同源氨基酸的群分组在一起。此方法检测多肽的保守区并且考虑氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之间的同源性可通过使用市售算法测定(也参见上述同源性的描述)。除了本文中另外提及的那些以外，提及程序BLAST、空隙BLAST、BLASTN、BLASTP和PSI-BLAST，其由国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)提供。这些程序在本领域中广泛用于此目的并且可比对两个氨基酸序列的同源区。
或者或另外，举例而言，相对于核苷酸或氨基酸序列，术语“同源性”或“同一性”可指示两个序列之间的同源性的定量量度。序列同一性百分比可计算为(Nref-Ndif)*100/Nref，其中Ndif为在比对时两个序列中的非相同残基总数，并且其中Nref为序列中的一个中的残基数目。因此，DNA序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC具有75％的序列同一性(Nref＝8；Ndif＝2)。
或者或另外，相对于序列，“同源性”或“同一性”可指具有相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以两个序列中的较短者中的核苷酸或氨基酸数目，其中两个序列的比对可根据威尔伯和利普曼算法(Wi lbur和Lipman algorithm，Wilbur等人，1983)测定，例如使用20个核苷酸的窗口大小，4个核苷酸的字组长度和4的空隙罚分，并且计算机辅助分析和包括比对的序列数据的解释可使用市售程序(例如Vector NTI SoftwareTM，InvitrogenInc.CA,USA)方便地执行。当RNA序列称为与DNA序列类似或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)视为与RNA序列中的尿嘧啶(U)等同。因此，通过将DNA序列中的胸苷(T)视为与RNA序列中的尿嘧啶(U)等同，RNA序列在本发明的范畴内并且可衍生自DNA序列。并且，在无需过度实验的情况下，本领域技术人员可查询许多其他程序或参考文献以用于测定同源性百分比。
本发明另外包括含于载体分子或表达载体中并且可操作地连接于启动子组件并且任选连接于增强子的PRRSV多核苷酸。
“载体”是指包含待在体外或体内递送至靶标细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒、噬菌体或病毒。出于预防或疗法的目的，异源多核苷酸可包含所关注的序列，并且可任选呈表达盒形式。如本文所用，载体不必能够在最终的靶标细胞或个体中复制。术语“载体”包括用于克隆的载体以及病毒载体。
术语“工程化”或“重组”意指多核苷酸半合成或合成来源，其不存在于自然界中或以未发现于自然界中的布置连接至另一多核苷酸。
“异源”意指衍生自与其所比较的实体的其余部分遗传上不同的实体。举例而言，多核苷酸可通过基因工程化技术并入至衍生自不同来源的质粒或载体中，并且由此为异源多核苷酸。自天然编码序列移除并且可操作地连接于除天然序列以外的编码序列的启动子为异源启动子。
本发明的多核苷酸可包含额外序列，诸如相同转录单元内的额外编码序列；控制组件，诸如启动子；核糖体结合位点；5’UTR；3’UTR；转录终止子；聚腺苷酸化位点；相同或不同启动子控制下的额外转录单元；允许宿主细胞的克隆、表达、同源重组和转化的序列；和提供本发明的实施方案可能需要的任何这样的构建体。
用于PRRSV多肽、抗原、表位或免疫原的表达的组件有利地存在于本发明载体中。以最小的方式，此包含起始密码子(ATG)、终止密码子和启动子和此外任选某些载体(诸如质粒和某些病毒载体)的聚腺苷酸化序列，基本上由其组成或由其组成。当多核苷酸编码多肽片段，例如PRRSV肽，有利地在载体中时，ATG放置在阅读框架的5’处并且终止密码子放置在3’处。可存在控制表达的其他组件，诸如增强子序列、稳定序列，诸如内含子和/或非翻译的5’或3’序列以及允许蛋白分泌的信号序列。
制造和/或施用用于在体内或体外表达本发明的基因产物的载体或重组体或质粒的方法可为任何所需方法，例如利用或类似于以下各项中引用的文件中公开的方法的方法：美国专利第4,603,112号、第4,769,330号、第4,394,448号、第4,722,848号、第4,745,051号、第4,769,331号、第4,945,050号、第5,494,807号、第5,514,375号、第5,744,140号、第5,744,141号、第5,756,103号、第5,762,938号、第5,766,599号、第5,990,091号、第5,174,993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号、第5,591,639号、第5,589,466号、第5,677,178号、第5,591,439号、第5,552,143号、第5,580,859号、第6,130,066号、第6,004,777号、第6,130,066号、第6,497,883号、第6,464,984号、第6,451,770号、第6,391,314号、第6,387,376号、第6,376,473号、第6,368,603号、第6,348,196号、第6,306,400号、第6,228,846号、第6,221,362号、第6,217,883号、第6,207,166号、第6,207,165号、第6,159,477号、第6,153,199号、第6,090,393号、第6,074,649号、第6,045,803号、第6,033,670号、第6,485,729号、第6,103,526号、第6,224,882号、第6,312,682号、第6,348,450号、第6,312,683号和第6,596,279号；美国专利申请第12/753,597号；WO 90/01543；W091/11525；WO 94/16716；WO 96/39491；WO 98/33510；EP 265785；EP 0 370 573。
本发明还涉及包含载体、诸如表达载体的组合物或疫苗。组合物或疫苗可包含一种或多种载体(例如表达载体，诸如体内表达载体)，基本上由其组成或由其组成，所述载体包含PRRSV多肽、抗原、表位或免疫原中的一个或多个，基本上由其组成或由其组成(或表达其)。在药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物中，载体含有并且表达多核苷酸，所述多核苷酸包含编码(或表达)PRRSV抗原、表位或免疫原的多核苷酸，基本上由其组成或由其组成。
根据另一个实施方案，组合物或疫苗中的载体包含编码一种或多种蛋白或其片段(PRRSV多肽、抗原、表位或免疫原)的多核苷酸，或基本上由其组成或由其组成。本发明组合物或疫苗包含一种或多种载体，基本上由其组成或由其组成，所述载体包含以下各项、基本上由以下各项组成或由以下各项组成并且有利地也在体内在适当条件或适合的条件下或在适合的宿主细胞中表达以下各项：编码相同蛋白和/或不同蛋白的来自不同PRRSV分离株的多核苷酸。
术语质粒包括包含本发明的多核苷酸及其在所需宿主或目标的细胞中体内表达必需的组件的任何DNA转录单元；并且就此而言，应注意，超螺旋质粒及其拓扑异构体、开环质粒以及质粒的线性形式中的全部均意欲在本发明的范畴内。
除编码重组蛋白、抗原、表位或免疫原的异源多核苷酸以外，各质粒包含或含有编码异源肽序列、变体、类似物或片段的多核苷酸或基本上由其组成，任选与其融合，可操作地连接于启动子或在启动子的控制下或依赖于启动子。一般而言，采用在真核细胞中功能性的强启动子为有利的。优选的强启动子为人类或鼠类来源的即刻早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE)，或任选具有另一来源，诸如大鼠或豚鼠。CMV-IE启动子可包含实际启动子区段，其可或可不与增强子区段结合。可参考EP-A-260 148、EP-A-323 597、美国专利第5,168,062号、第5,385,839号和第4,968,615号以及PCT申请第WO87/03905号。CMV-IE启动子有利地为人类CMV-IE(Boshart等人，1985)或鼠类CMV-IE。
更一般而言，启动子具有病毒或细胞来源。可有用地用于本发明的实践中的除CMV-IE以外的强病毒启动子为SV40病毒的早期/晚期启动子或劳斯(Rous)肉瘤病毒的LTR启动子。可有效用于本发明的实践中的强细胞启动子为细胞骨架的基因的启动子，诸如结蛋白启动子(Kwissa等人，2000)或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人，1989)。
这些启动子的功能子片段(即，这些启动子中维持足够促进活性的部分)包括在本发明内，例如根据PCT申请第WO98/00166号或美国专利第6,156,567号的截短CMV-IE启动子。本发明的实践中的启动子因此包括维持足够促进活性的全长启动子的衍生物和子片段并且因此充当启动子，优选地，促进活性与衍生物或子片段所衍生自的实际或全长启动子的活性基本上相似，例如与美国专利第6,156,567号的截短CMV-IE启动子活性、与全长CMV-IE启动子的活性类似。由此，本发明的实践中的CMV-IE启动子可包含全长启动子的启动子部分和/或全长启动子的增强子部分以及衍生物和子片段，或基本上由其组成或由其组成。
优选地，质粒包含其他表达控制组件或基本上由其组成。尤其有利的为，并入稳定序列，例如内含子序列，优选地，hCMV-IE的第一内含子(PCT申请第WO89/01036号)、兔β-球蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人，1979)。
至于除痘病毒以外的质粒和病毒载体的聚腺苷酸化信号(polyA)，可更多使用牛生长激素(bGH)基因的聚(A)信号(参见美国专利第5,122,458号)或兔β-球蛋白基因的聚(A)信号或SV40病毒的聚(A)信号。
根据本发明的另一个实施方案，表达载体为用于蛋白在适当细胞系统中体外表达的表达载体。在分泌之后或不在分泌之后(若不存在分泌，细胞裂解典型地发生或得以执行)，任选通过浓缩方法(诸如超滤)浓缩和/或通过纯化手段(诸如亲和力、离子交换或凝胶过滤型层析方法)纯化，可在培养物上清液中或自培养物上清液收集所表达蛋白。
“宿主细胞”指示已遗传改变，或能够通过施用外源多核苷酸，诸如重组质粒或载体遗传改变的原核或真核细胞。当指遗传改变细胞时，术语是指初始改变细胞及其后代两者。宿主细胞包括(但不限于)幼仓鼠肾(BHK)细胞、结肠癌(Caco-2)细胞、COS7细胞、HEK293细胞、MCF-7细胞、MCF-10A细胞、马丁-达比犬肾(Madin-Darby canine kidney，MDCK)细胞系、貂肺(Mv1Lu)细胞、MRC-5细胞、U937细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴Vero细胞(具有非洲绿猴肾脏来源的细胞系)、鹌鹑(鹌鹑肌肉细胞系QM7)、鸡细胞系DF1和VERO细胞。包含所需序列的多核苷酸可插入至适合的克隆或表达载体中，并且载体又可引入至适合的宿主细胞中以用于复制和扩增。多核苷酸可通过本领域中已知的任何方式引入至宿主细胞中。含有所关注的多核苷酸的载体可通过许多适当方式中的任一个引入至宿主细胞中，包括直接摄取、内饮作用、转染、f配对、电穿孔、采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微弹轰击；脂质体转染；和感染(其中载体为感染性的，例如逆转录病毒载体)。引入载体或多核苷酸的选择将常常视宿主细胞的特征而定。
在本发明的一个实施方案中，载体为如US 2010/0255029(以全文引用的方式并入本文中)中所述的Ad5载体。
基于Ad5载体的PRRSV疫苗的优点包括(但不限于)(1)诱导广泛免疫性，包括体液、细胞和黏膜反应；(2)并不表达所有PRRSV蛋白，并且因此与DIVA(在经感染与经接种动物之间进行区分)策略兼容；(3)诱导免疫性的快速起效；和(4)在偶然释放的情况下与灭活疫苗相比，生产对环境造成的风险较小。
本发明的一个方面涉及表达PRRSV抗原的工程化或重组Ad5载体。抗原可为PRRSV次要包膜蛋白，诸如上述gp2、gp3、gp4、gp5a或E蛋白。工程化Ad5载体可包含编码一种或多种PRRSV抗原的一种或多种多核苷酸。在另一方面中，工程化Ad5载体包含一种或多种多核苷酸，一种或多种多核苷酸编码PRRSV gp2抗原或其变体、PRRSV E抗原或其变体、PRRSVgp3抗原或其变体、PRRSV抗原或其变体、gp4抗原或其变体或其组合。
在一个实施方案中，本发明提供施用治疗有效量的制剂以用于在靶标细胞中递送和表达蛋白、抗原表位或免疫原。预防或治疗有效量的测定对于本领域技术人员为常规实验。在另一个实施方案中，制剂包含表达载体，表达载体包含表达PRRSV次要包膜抗原、表位或免疫原的多核苷酸；和药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物、佐剂或赋形剂。在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载体、媒介物、佐剂或赋形剂有助于转染和/或改良载体或蛋白的保存。
药学上或兽医学上可接受的载剂或媒介物或佐剂或赋形剂已为本领域技术人员所熟知。举例而言，药学上或兽医学上可接受的载剂或媒介物或佐剂或赋形剂可为无菌水、0.9％NaCl(例如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。可用于本发明的方法的其他药学上或兽医学上可接受的载剂或媒介物或佐剂或赋形剂包括(但不限于)聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯啶酮。药学上或兽医学上可接受的载剂或媒介物或佐剂或赋形剂可为任何促进载体(或体外表达自本发明载体的蛋白)施用的化合物或化合物组合；有利地，载剂、媒介物或佐剂或赋形剂可促进转染和/或改良载体(或蛋白质)的保存。剂量和剂量体积在本文中论述于一般描述中并且也可由本领域技术人员自本发明阅读以及本领域中的知识而在无任何过度实验的情况下确定。
非排他地适用于质粒的含有季铵盐的阳离子脂质为具有下式的那些：
其中R1为具有12至18个碳原子的饱和或不饱和直链脂族基团，R2为含有2或3个碳原子的另一脂族基团，并且X为氨基或羟基，例如DMRIE。在另一个实施方案中，阳离子脂质可与中性脂质，例如DOPE缔合。
在这些阳离子脂质中，优选为DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，有利地与中性脂质，有利地DOPE(二油酰基-磷脂酰基-乙醇胺；Behr,1994)缔合以形成DMRIE-DOPE。
与佐剂的质粒混合物即时地和/或与施用制剂同时或在施用制剂之前不久形成；例如在施用之前不久形成质粒-佐剂混合物，有利地以便给予足够施用前时间以使得混合物形成复合物，例如施用之前约10与约60分钟之间，诸如施用之前大致30分钟。
当DOPE存在时，DMRIE：DOPE摩尔比可为约95：约5至约5：约95，或约1：约1，例如1：1。DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂：质粒重量比可为约50：约1至约1：约10，诸如约10：约1至约1：约5，和有利地约1：约1至约1：约2，例如1：1至1：2。
在另一个实施方案中，药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物可为油包水乳液。适合的油包水乳液的实例包括油基油包水疫苗乳液，其在4℃下稳定并且为流体，含有：6至50v/v％，优选12至25v/v％含抗原水相，总计或部分含有非可代谢油(例如矿物油，诸如石蜡油)和/或可代谢油(例如植物油或脂肪酸、多元醇或醇酯)的50至94v/v％油相，0.2至20p/v％，优选3至8p/v％表面活性剂，后者为总计或部分的，或在聚甘油酯(所述聚甘油酯优选为聚丙三醇(聚)蓖麻酸酯)或聚氧乙烯蓖麻毒素油或氢化聚氧乙烯蓖麻毒素油的混合物中。可用于油包水乳液中的表面活性剂的实例包括乙氧基化脱水山梨糖醇酯(例如聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(TWEEN)，购自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT)和脱水山梨糖醇酯(例如脱水山梨糖醇单油酸酯(SPAN)，购自SigmaAldrich,St.Louis,MO)。另外，就油包水乳液而言，也参见美国专利第6,919,084号。在一些实施方案中，含抗原水相包含含一种或多种缓冲剂的盐水溶液。适合的缓冲溶液的实例为磷酸盐缓冲盐水。在一个实施方案中，油包水乳液可为水/油/水(W/O/W)三重乳液(参见例如美国专利第6,358,500号)。其他适合的乳液的实例描述于美国专利第7,371,395号中。
本发明的免疫组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由其组成。用于本发明的实践中的适合的佐剂为(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，顺丁烯二酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，诸如具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核苷酸序列(Klinman等人，1996；WO98/16247)，(3)水包油乳液，诸如M.Powell,M.Newman,PlenumPress 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach”的第147页上描述的SPT乳液，和相同作品的第183页上描述的乳液MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂素或(8)所引用和以引用的方式并入本申请中的任何文献中论述的其他佐剂，或(9)其任何组合或混合物。
尤其适合于病毒载体的水包油乳液(3)可基于：轻液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，诸如角鲨烷、角鲨烯；产生于烯烃的寡聚的油，例如异丁烯或癸烯；具有直链烷基的酸或醇的酯，诸如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯；或分支链、脂肪醇或酸的酯，尤其异硬脂酸酯。
油与乳化剂组合使用以形成乳液。乳化剂可为非离子表面活性剂，诸如：一方面，脱水山梨糖醇、甘露糖醇(例如无水甘露糖醇油酸酯)、甘油、聚丙三醇或丙二醇和另一方面，油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，所述酯任选经乙氧基化，或聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，诸如Pluronic，例如L121。
在类型(1)佐剂聚合物中，优选为交联丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其通过糖或多元醇的聚烯基醚交联。这些化合物以名称carbomer已知(Pharmeuropa，第8卷，第2期，1996年6月)。本领域技术人员也可参考美国专利第2,909,462号，其提供通过具有至少三个羟基，优选不超过八个这样的基团的聚羟基化合物交联的这样的丙烯酸聚合物，至少三个羟基的氢原子经具有至少两个碳原子的不饱和脂族基团置换。优选基团为含有2至4个碳原子的那些基团，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不饱和基团。不饱和基团也可含有其他取代基，诸如甲基。以名称Carbopol销售的产品(BF Goodrich,Ohio,USA)尤其适合。其通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基异戊四醇交联。其中，提及Carbopol 974P、934P和971P。
关于顺丁烯二酸酐-烯基衍生物共聚物，优选为EMA(Monsanto)，其为直链或交联乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物并且其例如通过二乙烯醚交联。也参考J.Fields等人，1960。
关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有下式的基本单元形成：
其中：
可相同或不同的R1和R2表示H或CH3
x＝0或1，优选x＝1
y＝1或2，x+y＝2。
就EMA而言，x＝0并且y＝2并且就carbomer而言，x＝y＝1。
这些聚合物可溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)中并且pH可调节至7.3至7.4，例如通过钠碱(NaOH)，以提供可并入表达载体的佐剂溶液。最终免疫或疫苗组合物中的聚合物浓度可在0.01至1.5％w/v、0.05至1％w/v和0.1至0.4％w/v之间的范围内。
细胞因子(5)可在免疫或疫苗组合物中呈蛋白质形式，或可与其免疫原或表位共表达于宿主中。优选为细胞因子的共表达，此通过与表达其免疫原或表位相同的载体，或通过其独立载体。
本发明包含制备这样的组合组合物；例如通过掺合活性组分，有利地掺合在一起并且与佐剂、载体、细胞因子和/或稀释剂一起。
可用于本发明中的细胞因子包括(但不限于)粒细胞群落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(IFNγ)、介白素-1α(IL-1α)、介白素-1β(IL-1β)、介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-4(IL-4)、介白素-5(IL-5)、介白素-6(IL-6)、介白素-7(IL-7)、介白素-8(IL-8)、介白素-9(IL-9)、介白素-10(IL-10)、介白素-11(IL-11)、介白素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)和转化生长因子β(TGFβ)。应理解，细胞因子可与本发明的免疫或疫苗组合物共施用和/或依序施用。因此，举例而言，本发明的疫苗也可含有体内表达适合的细胞因子的外源性核酸分子，例如与待接种或在其中引发免疫反应的此宿主匹配的细胞因子(例如用于待向猫类动物施用的制剂的猫类动物细胞因子)。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可使用如由Stauffer等人(RecentPatents on Anti-Infective Drug Discovery,1,291-296,2006)所述的化学品或物理程序制备。一些灭活技术概述在下表中。
表1：灭活技术
本发明的免疫组合物和/或疫苗包含有效引发保护或治疗反应的量的一种或多种如本文所论述的表达载体和/或多肽或基本上由其组成或由其组成；并且有效量可在无过度实验的情况下自本发明测定，包括并入本文中的文件和在本领域中的知识。
本发明的组合物或疫苗可经由饮用水、经口鼻、喷雾剂、气雾剂、鼻内滴注、经皮、皮下或肌肉内注射施用至动物。有利地，疫苗通过经皮、经口鼻、皮下、肌肉内、喷雾剂或饮用水施用。
本发明包括至少一次向动物施用有效量的根据本发明制得的治疗组合物。本发明的治疗组合物可通过无针设备(如通过Pigjet、Dermojet、Biojector、Vetjet或Vitajet设备(Bioject,Oregon,USA))施用。
在本发明的一个实施方案中，可采用初免-加强(prime-boost)方案，其包括使用至少一种常用蛋白、多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初步施用和至少一次加强施用。用于初步施用的免疫组合物或疫苗与用作加强施用的那些在性质上不同。然而，应注意，相同组合物可用作初免施用和加强施用。此施用方案称作“初免-加强”。
在本发明的初免-加强方案的另一方面中，施用包含工程化Ad5PRRSV疫苗或组合物的组合物，随后施用包含含有并且在体内表达PRRSV抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物、或包含PRRSV抗原的灭活病毒疫苗或组合物、或包含PRRSV子单元(蛋白)的疫苗或组合物、或含有或表达PRRSV抗原的DNA质粒疫苗或组合物。同样地，初免-加强方案可包含施用包含含有并且在体内表达PRRSV抗原的重组病毒载体、或包含PRRSV抗原的灭活病毒疫苗或组合物、或包含PRRSV子单元(蛋白)的疫苗或组合物、或含有或表达PRRSV抗原的DNA质粒疫苗或组合物，随后施用包含工程化Ad5PRRSV疫苗或组合物的组合物。应注意，初步和二次给药均可包含含工程化Ad5PRRSV疫苗或组合物的组合物。另外注意，初步和二次给药均可包含含本发明的工程化载体的一种或多种组合物。
初免-加强方案包含使用至少一种常见抗原的至少一次初免-施用和至少一次加强施用。用于初免-施用的疫苗或组合物可与用作稍后加强疫苗或组合物的那些在性质上不同。初免-施用可包含一次或多次施用。类似地，加强施用可包含一次或多次施用。
各种施用优选相隔约1至约6周、或相隔约2至约4周进行。也包括每2至6周重复加强或每年加强。在首次施用时，动物年龄优选为至少一天。
免疫组合物和/或疫苗每剂量含有约104至约1011个、有利地约105至约1010个并且更有利地约106至约109个表达PRRSV抗原、表位或免疫原的重组腺病毒的病毒粒子。在基于痘病毒的免疫组合物和/或疫苗的情况下，剂量可在约102pfu与约109pfu之间。免疫组合物和/或疫苗每剂量含有约102至约107、有利地约103至约105pfu表达PRRSV抗原、表位或免疫原的痘病毒或疱疹病毒重组体。
病毒载体可为减毒禽痘表达载体。在一个实施方案中，禽痘表达载体可为禽痘载体，例如在另一个实施方案中，禽痘表达载体可为金丝雀痘载体，诸如在再一实施方案中，可使用杆状病毒表达平台。举例而言，抗原可使用昆虫细胞培养物作为宿主在杆状病毒表达系统中产生，并且所得重组多肽可施用动物。或者，整个重组杆状病毒可以疫苗形式施用。一般而言，PRRSV抗原、表位或免疫原可为PRRSV次要包膜蛋白，诸如gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E。可用于本发明方法的其他病毒包括(但不限于)牛痘病毒，诸如减毒牛痘病毒(例如NYVAC)、腺病毒和疱疹病毒(包括猪CMV)。
疫苗的功效可在通过用有毒性的PRRSV病毒株攻击动物而在最后一次免疫接种之后约2至4周测试。同源和异源病毒株均可用于攻击以测试疫苗功效。动物可通过喷雾剂、经鼻内、IM、气管内和/或经口攻击。视施用途径而定，在一定体积中，攻击病毒攻击可为每剂量约103至约109个病毒粒子或感染单位。举例而言，若通过喷雾剂施用，则将病毒悬浮液雾化以产生约1至200μm液滴，若施用为经鼻内、气管内或经口施用，则攻击病毒的体积为约0.05至约5ml。在攻击之后14天，可每天观察动物的临床征象和死亡率。另外，动物组可经安乐死并且针对病理性发现进行评估。攻击后可自所有动物收集口咽、气管或泄殖腔拭子以用于病毒检测。组织中存在或不存在病毒抗原可通过免疫组织化学、病毒分离或滴定或核酸检测(诸如逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR))来评估。血液样品可在攻击后收集并且可分析抗PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、E病毒特异性抗体的存在。或者，当工程化载体含有表位标记时，标记特异性抗体可以用于检测重组疫苗多肽的存在和位置。
本领域技术人员应理解，本文中的公开内容以举例方式提供并且本发明不限于此。自本文中的公开内容和本领域中的知识，本领域技术人员可在无任何过度实验的情况下确定用于各免疫接种方案的施用次数、施用途径和剂量。
本发明的另一个实施方案为一种进行诱发针对动物中的PRRSV的免疫或保护反应的方法的试剂盒，其包含含重组Ad5免疫组合物或疫苗或灭活PRRSV免疫组合物或疫苗，和进行以有效量递送以引发动物中的免疫反应的方法的说明书。
除非另外专门叙述，否则核酸插入序列、质粒和重组病毒载体的构建使用本领域中已知的标准分子生物学技术进行，例如由J.Sambrook等人(Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NewYork,1989)描述。
尤其关于主题合格性，本文公开的载体并不在经接种动物中引起天然产生量的PRRSV蛋白的表达。每一基因的表达由非天然异源启动子组件驱动，并且因此，所表达的每一同源蛋白的最终量将不等于在天然PRRSV感染期间产生的量。此外，所公开的表达系统的一个重要目的为产生相对较高含量的PRRSV次要包膜蛋白(天然、经修饰或工程化)，和将次要蛋白恰当地呈现至宿主动物的免疫系统，在动物中引发安全并且保护性的免疫反应。天然PRRSV感染典型的PRRSV次要包膜蛋白的含量和呈现无法引发安全并且有效的针对PRRSV次要蛋白的免疫反应。因此，所公开的疫苗组合物及其经接种动物内的最终处置当与其最接近的天然产生的对应物比较时在结构和功能方面显著不同。
通过以下非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例
实施例1-表达PRRSV基因的质粒的构建和测试
为了增加免疫系统的可视性，通过引入多种变化同时维持细胞外结构域(推定的抗体结合位点)，使PRRSV包膜蛋白自细胞内区室重新靶向至细胞表面。包膜基因的重新靶向最初试图通过以下方式进行：移除天然蛋白的细胞质和跨膜结构域(其为驻留信号的可能的位点)，并且用来自水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)(已知用于细胞表面表达的另一病毒蛋白)的类似结构域将其置换。天然包膜基因的信号序列也用来自组织纤维蛋白溶酶原活化因子(tPA，一种充分表征的分泌蛋白)的信号序列置换，以促进经修饰蛋白进入分泌路径并且最终表达在细胞表面上。特异性表位标记也插入至重新靶向的蛋白中的每一个中以追踪蛋白在细胞内的表达和易位。将侧接接头序列的表位标记Myc、Flag和HA分别插入至gp2、gp3和gp4中(图5A-5D)。
重新靶向的蛋白的表面表达。重新靶向的基因中的每一个以其整体合成并且克隆至具有CMV启动子的表达质粒中。质粒转染至HEK293T细胞中，并且通过免疫荧光分析(IFA)在固定的细胞中检测其表达(图6)。细胞表面和总蛋白表达易于在经gp3-Flag-VSV和gp4-HA-VSV转染的细胞中检测。然而，gp2-Myc-VSV转染的细胞中的表达仅在细胞透化之后检测到，指示引入gp2中的修饰不足以使蛋白重新靶向细胞表面。此外，在透化后，对gp2-Myc-VSV的染色与对gp3或gp4修饰(重新靶向)的蛋白的染色明显不同。在gp2-myc-VSV的情况下，染色更局部并且强烈，而在gp3-Flag-VSV和gp4-HA-VSV中，其在整个细胞中扩散。此指示gp2-VSV-Myc蛋白经表达，但可能不恰当地折叠，变得滞留在一些亚细胞室中。经修饰的gp2不能恰当折叠可能存在数种原因。首先，这些可为蛋白中在针对表面表达修饰的方法中移除的其他部分(诸如信号序列、跨膜或细胞质尾)恰当折叠的要求。第二，其也可归因于仍含有驻留信号的gp2结构域的不完全移除。第三，错误折叠可能已因存在myc标记(其在经修饰的gp3或gp4中不存在)而经诱导。第四，已显示，缺少次要蛋白中的一个的表达会消除所有次要蛋白并入至病毒粒子中；因此，gp2可能需要gp3和gp4的存在以获得恰当折叠。
重新靶向的蛋白相互作用以形成寡聚物。次要蛋白之间的相互作用已利用功能分析而被表明并且利用生物化学分析而直接被证明。将编码重新靶向的蛋白中的每一个的质粒共转染至HEK-293T细胞中，并且次要蛋白之间的相互作用利用免疫共沉淀(Co-IP)分析测试。如图7中所示，抗HA抗体特异性地向下拉动gp4-HA-VSV(泳道3)而非gp3-flag-VSV(泳道2)或gp2-myc-VSV(泳道1)。然而，当所有经修饰的蛋白共转染时，除gp4-HA-VSV以外，相同抗HA抗体向下拉动其他蛋白条带(泳道4，红点)，指示其他蛋白具有与gp4-HA-VSV而非抗HA抗体的直接相互作用。此条带的大小与gp2-Myc-VSV(泳道6)或gp3-Flag-VSV(泳道7)相似，指示与gp4相互作用的此蛋白可为gp2、gp3或二者。co-IP中使用抗Flag或抗Myc抗体的其他条带(泳道4)的后续探针结果为对二者均为阳性(未图标)，指示此条带含有gp2和gp3蛋白二者。因此，来自此实验及其他实验的结论为针对gp表面表达引入的修饰不改变其四级结构。
在修饰之后重新靶向的蛋白维持与CD163受体的相互作用。确保重新靶向蛋白的恰当折叠的下一步骤展示出其仍然维持其与受体(猪CD163)相互作用的能力。表达重新靶向的蛋白的质粒中的每一个与表达CD163(结构域4-9)的质粒一起共转染，先前展示为足以介导病毒进入靶标细胞。细胞裂解物的一个部分与抗VSV抗体(对包膜蛋白具有特异性)一起免疫沉淀，并且其他部分与抗CD163抗体一起免疫沉淀。与抗CD163抗体一起沉淀的裂解物用与生物素缀合的抗CD163抗体探测以控制CD163输入至每一co-IP反应中(图8C)。与抗VSV一起免疫沉淀的裂解物一式两份地运行，并且一个膜用抗VSV-HRP探测(图8A)以测量经修饰的gp的量，并且另一膜用抗CD163探测(图8B)以测量与经修饰的包膜糖蛋白免疫共沉淀的CD163的量。
所有经修饰的次要包膜糖蛋白均与CD163相互作用，而经修饰的gp5(用作阴性对照的主要糖蛋白)与CD163的相互作用弱得多或不可检测。
实施例2-用汇集的表达PRRSV包膜基因的质粒接种动物
将三十二只3周龄的猪分成4组，每组8只动物(表2)。
表2：研究细节
野生型组接受表达非靶向gp的3种质粒的汇集，重组组接受表达重新靶向的gp的三种质粒的汇集(即图5B至5D)，模拟组接受编码狂犬病糖蛋白的质粒，而未经接种的组仅接受Tris-EDTA缓冲液。每一质粒的浓度为约1μg/μL，并且约400μg每一质粒以每耳垂200μl施用。在4次免疫接种之后，将每一组进一步划分并且加强含经杀死的疫苗的TS6佐剂(US7,371,395B2，授予Merial，并且以全文引用的方式并入本文中)，或接受第5轮DNA免疫接种。
虽然当与狂犬病-G或未经接种的组比较时，在经汇集的质粒中的任一个接种的动物中呈现出针对肺损伤的保护提高的趋势，但所有组之间的平均值无统计学上显著差异。接受靶向与重新靶向的质粒的组之间也无显著差异。
因此，申请人接着进行将所有基因放在单一载体内以实现在单一细胞内的同时表达，以促进PRRSV包膜蛋白的相互作用/寡聚化。
实施例3-表达PRRSV基因的病毒载体的构建和测试
细胞和培养基。将HEK 293细胞(ATCC)在37℃下在5％CO2中维持在具有10％胎牛血清(Moregate批号81827101)的MEM(Gibco编号11095)中。这些细胞用于复苏重组腺病毒(vAD3041、vAD3042、vAD3038、vAD3033和vAD3067)和制备病毒储备液。
病毒载体和免疫原的构建。PRRSV的次要包膜蛋白包括gp2(ORF2)、gp3(ORF3)、gp4(ORF4)和E(ORF2b)。这些蛋白中的每一个的DNA序列获自Genbank登录号U87392(VR2332、PRRSV II型)。VR2332(北美病毒株)表示PRRSV的两种已知主要血清型中的一个(Done等人，1996)。另一个原型Lelystad代表已在西欧分离的至少大部分病毒株。每一蛋白的经密码子优化的序列当与适当启动子一起构建时以自单一病毒载体表达所有蛋白(图1)。在各种情况下，SV40(猴病毒40)和CMV(巨细胞病毒)启动子分别驱动gp2和gp4的表达，在对置方向上，如由箭头所指示。设想这些启动子可交换，使得SV40可驱动gp4的表达，并且CMV可驱动gp2的表达。这样的变化形式对本领域技术人员将为明显的。重要的是，由于所公开的PRRSV次要蛋白在引发安全并且保护性的免疫反应中起到的至关重要的作用，申请人充分期望以下方法同样很好地适用于所有PRRSV病毒株。因此Lelys tad次要蛋白的经密码子优化的形式可利用常规方法制备，并且所得序列克隆至本发明的重组载体中。
在所有Ad5PRRSV构建体中，次要包膜糖蛋白gp3的表达利用内部核糖体入口位点(IRES)促进。次要包膜糖蛋白E在vAD3041和vAD3067中的表达(图1C和1D)通过位于Ad5构建体中紧随gp2编码区的自切割肽(p2A)的存在来实现。
另外，来自SV40和CMV启动子的转录物的半衰期通过添加来自SV40或胸苷激酶(TK)的聚A尾(pA)来增强。attL1和attL2位点(图1中所展示的每一插入序列的最左边和右边)用于利用LR重组Gateway Technology(Invitrogen)将整个合成片段插入至腺病毒基因组中(由此形成vAD3042、vAD3038、vAD3041和vAD3067)。图1的插入序列以化学方式合成(Genscript)以含有用于克隆至表达克隆中以产生重组Ad5的适当限制位点(GatewayTechnology，Invitrogen)。再一次，设想到关于哪些组件促进哪些具体PRRSV基因表达的变化形式，并且完全在阅读本发明的本领域技术人员的技能范围内。
因此，组装次要蛋白的多种组合以便重组至Ad5载体中：一个仅含有三种次要蛋白而不含E(vAD3042)(图1A；SEQ ID NO：2)；一个含有rtg-gp2、rtg-gp3、rtg-gp4蛋白而不含E(vAD3038)(图1B；SEQ ID NO：3)；一个含有所有四种经密码子优化的次要蛋白gp2、gp3、gp4和E(vAD3041)(图1C；SEQ ID NO：3)；并且一个含有所有四种经密码子优化的次要蛋白rtg-gp2、rtg-gp3、rtg-gp4和E(vAD3067)(图1D；SEQ ID NO：4)。
表3：构建体内的特征的位置
产生病毒。表达克隆通过使用Gateway Technology(Invitrogen)用目的载体对进入载体进行LR重组产生。重组腺病毒vAD3041、vAD3042和vAD3038通过用转染试剂转染HEK293细胞中的线性化表达克隆产生。在复苏之后，各病毒通过冻融循环和通过离心澄清细胞残渣进行收集。对于传代，各病毒接种至HEK 293细胞的单层中并且在感染后大致3-4天，病毒通过冻融循环和通过离心澄清进行收集。进行三个传代以制备病毒储备液，其储存于-80℃。作为阴性对照，猪流感病毒(SIV)的经密码子优化的血球凝集素(HA)基因在Ad5病毒载体(vAD3033)中类似地组装。
病毒效价。HEK 293细胞以每板7×105个细胞的密度接种在具有含2％FBS(Moregate批号81827101)、非必需氨基酸(Gibco编号11140)、抗生素-抗霉剂(Gibco编号15240)的MEM(Gibco编号11095)培养基的三个96孔板中。在感染当天，各板用100μL/孔10-3至10-10稀释的病毒感染。感染后第10天读取病毒效价，并且三个板的平均值用于计算效价。vAD3041P.3的第3次传代储备液效价为109.03TCID50/ml，并且vAD3042P.3为108.90TCID50/ml。vAD3038P.3的第3次传代储备液效价为109.93TCID50/ml，并且vAD3042P.3的另一批次为109.97TCID50/ml。
从每一病毒储备液提取病毒DNA，并且如指导使用铂PCR supermix HighFidelity(Invitrogen编号12532)用引物pAd正向(5’-GAC TTT GAC CGT TTA CGT GGAGAC-3’)(SEQ ID NO：26)和pAd反向(5’-CCT TAA GCC ACG CCC ACA CAT TTC-3’)(SEQ IDNO：27)扩增。PCR扩增子为预期的相同的尺寸：例如对于vAD3041，4709bp；对于vAD3042，4408bp(图4)。来自每一重组腺病毒的PCR扩增子的核苷酸序列与进入载体中所构建的一致(描述在图1中)，并且转基因盒的核苷酸序列中无变化(PRRSV基因和启动子和多聚A尾)。
来自重组腺病毒的重新靶向的次要包膜蛋白的表达。来自重组腺病毒的经修饰的包膜蛋白中的每一个在单一细胞内的同时表达通过使用双重免疫荧光分析证实。重组vAD3038用于以高MOI感染汇合HEK293单层，并且在48小时之后固定细胞并利用IFA观测重组抗原的表达。所有蛋白均展示出很好地表达，包括在细胞表面上(图9A和9B)。
重要的是，先前展示为强烈局部胞内表达并且无可检测的表面表达的gp2(其当单独表达时有缺陷)的表达已改进，具有弥散的胞内表达和明晰的细胞表面表达(图9C)。这指示经修饰的gp2的恰当折叠和转运可能依赖于gp3和/或gp4的共表达。此结果提示中和表位的形成需要利用次要蛋白之间的相互作用形成高阶结构。
实施例4-测试Ad5PRRSV疫苗的安全性和功效的临床试验
六十(60)只猪随机分成4组，每组含有15只动物(表3)。第1组接受仅表达gp2、gp3和gp3的vAD3038，而第2组接受进一步表达E的vAD3041。第3组接受表达重新靶向的gp2、gp3和gp4的vAD3042，并且第4组接受表达SIV HA的vAD3033(阴性对照)。接受腺病毒疫苗的组通过在每一鼻孔中施用浓度约108-9TCID50/mL的1ml制剂(总共2mL)来进行初免。这些组在21天之后利用肌肉内施用的相同制剂加强。在实验启动42天之后，所有动物均用PRRSVNADC20病毒株经鼻内攻击。所有动物在攻击2周之后处死，并且检查肺损伤，并且收集样品用于分析组织和血清中的病毒效价，如图9中所指示。
表3：接种试验方案
一般而言，数据展现出，虽然使用编码次要包膜蛋白gp2、gp3和gp4的单一载体(vAD3042)的接种与阴性对照相比不赋予任何显著优点，但添加E次要蛋白(vAD3041)在针对来自PRRSV攻击的肺损伤的保护方面产生显著差异。此外，次要蛋白(vAD3038)的重新靶向也产生显著差异(图11)。
因此，本文公开的数据和结果支持通常可适用的模型，其中针对PRRSV攻击的保护由针对表面蛋白中的一个(例如gp2)或利用蛋白的三级/四级结构/布置形成和呈现的表面的寡聚结构的抗体提供。照此，这些保护抗体至少部分地通过干扰病毒蛋白与细胞受体的结合从而阻断PRRSV感染来起作用。
在本发明之前，尚不知E蛋白与病毒粒子中的其余次要蛋白或其他蛋白的相互作用为诱发保护性免疫的先决条件。本发明的接种试验由此已揭露，单独或与gp2、gp3和gp4中的一个或多个组合的次要蛋白E在自猪科动物引发针对有毒性的PRRSV攻击的显著较高保护方面的惊人并且出人意料的作用。
申请人设想，例如，中和表位可例如直接位于E蛋白上，或其可在E蛋白存在下利用次要蛋白中的任一个或组合来诱导。考虑到现有技术参考文献，此发现为完全出人意料的并且惊人的。因此，此偶然发现不仅鉴别出PRRSV保护性抗原组合物，其充当开发不含活PRRSV的疫苗的基础，而且打开用以阐明蛋白-蛋白/病毒-细胞受体相互作用的PRRSV研究的新领域。
考虑到数据和结果，申请人设想E+次要蛋白的其他组合(例如E+gp2；E+gp2+gp3；E+gp2+gp4；及其类似组合)将类似地克服将“中和表位”(本文定义为能够在动物中引发保护性免疫反应，包括产生病毒中和抗体的表位)呈现至动物免疫系统的问题。此外，结果指示PRRSV次要蛋白的重新靶向引发类似惊人的安全并且保护性的免疫。
申请人由此已揭露用于克服单独表达的gp2、gp3和gp4不能将病毒中和表位呈现至宿主动物免疫系统并且引发针对有毒性的PRRSV攻击的保护性免疫反应的两种主要但相关的方法。
此外，本申请首次公开PRRSV包膜次要蛋白的免疫原性可充分增强以引发保护性免疫反应。设想这些本发明方法可广泛应用于其他病毒，尤其细胞定位在妨碍病毒中和表位呈现至宿主免疫系统方面起作用的情况。
实施例4-测试Ad5PRRSV疫苗的安全性和功效的临床试验
另一研究使用实施例3中所公开的方法进行，并且表4提供概览。腺病毒载体具有根据以下的插入序列：vAD3038(Gp234-Rtrg)；vAD3067(Gp234-Rtrg+E-opt)；vAD3064(M-gp5-gp5a-Rtrg)；vAD3041(Gp234E)；vAD3069(Np-M-gp5-gp5a)；vAD3046(SIV-HA)。
表4：接种试验方案(IM＝肌内；IN＝鼻内)
总结。数据显示用经杀死的疫苗加强的载体表达的重新靶向的PRRSV次要包膜蛋白降低猪中血清病毒负载并且引起免遭肺损伤的显著保护(图18和19)。即使考虑到实施例3中呈现的数据，在此研究之前也尚未有预测到这些数据。现已进行此项研究，申请人设想免遭肺损伤的惊人的保护以及血清病毒负荷的减少可归因于重新靶向的次要包膜蛋白的强预致敏作用(图20)。也不可预知的为以下发现：与实施例3中所公开的相反结果(即，施用含有E+Wt次要包膜蛋白的腺构建体显著减少肺损伤)对比，将E添加至重新靶向的次要包膜蛋白未展示出免遭肺损伤的显著保护(图21和22)。考虑到图23和24中所描绘的相互作用数据，申请人设想此免遭肺损伤的保护的缺失可能由野生型E与重新靶向的次要包膜蛋白的不利相互作用(即由于重新靶向的蛋白中存在的改变的TM和CT结构域)引起。
如上详细描述本发明的优选实施方案，应理解，由以上段落定义的本发明不限于以上说明中所述的特定细节，因为许多明显变化可在不偏离本发明的精神或范畴的情况下进行。
申请引用的文件中所引用或参考的所有文件、和本文中所引用或参考的所有文件(“本文中所引用的文件”)和本文中所引用的文件中所引用或参考的所有文件以及本文中或以引用的方式并入本文中的任何文件中所提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格和产品薄页皆以引用的方式并入本文中，并且可用于本发明的实践。
序列表
<110> Merial, Inc.
Mebatsion, Teshome
Kassa, Aemro
Kim, Taejoong
<120> 含PRRSV次要蛋白的重组病毒载体及其制造方法与用途
<130> MER 15-265
<150> USSN 62/183,410
<151> 2015-06-23
<160> 139
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRRS gp2
<400> 1
Met Lys Trp Gly Pro Cys Lys Ala Phe Leu Thr Lys Leu Ala Asn Phe
1 5 10 15
Leu Trp Met Leu Ser Arg Ser Ser Trp Cys Pro Leu Leu Ile Ser Leu
20 25 30
Tyr Phe Trp Pro Phe Cys Leu Ala Ser Pro Ser Pro Val Gly Trp Trp
35 40 45
Ser Phe Ala Ser Asp Trp Phe Ala Pro Arg Tyr Ser Val Arg Ala Leu
50 55 60
Pro Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Ala Phe Leu Ser
65 70 75 80
Gln Cys Gln Val Asp Ile Pro Thr Trp Gly Thr Lys His Pro Leu Gly
85 90 95
Met Leu Trp His His Lys Val Ser Thr Leu Ile Asp Glu Met Val Ser
100 105 110
Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala Trp Lys
115 120 125
Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu Ser Arg Ile Ser Ser Leu Asp Val
130 135 140
Val Ala His Phe Gln His Leu Ala Ala Ile Glu Ala Glu Thr Cys Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Pro Met Leu His Asn Leu Arg Met Thr Gly
165 170 175
Ser Asn Val Thr Ile Val Tyr Asn Ser Thr Leu Asn Gln Val Phe Ala
180 185 190
Ile Phe Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Lys Leu His Asp Phe Gln Gln
195 200 205
Trp Leu Ile Ala Val His Ser Ser Ile Phe Ser Ser Val Ala Ala Ser
210 215 220
Cys Thr Leu Phe Val Val Leu Trp Leu Arg Val Pro Ile Leu Arg Thr
225 230 235 240
Val Phe Gly Phe Arg Trp Leu Gly Ala Ile Phe Leu Ser Asn Ser Gln
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<210> 2
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV gp2
<400> 2
atgaaatggg gtccatgcaa agcctttttg acaaaattgg ccaacttttt gtggatgctt 60
tcacggagtt cttggtgtcc attgttgata tcattatatt tttggccatt ttgtttggct 120
tcaccatcgc cggttggctg gtggtctttt gcatcagatt ggtttgctcc gcgatactcc 180
gtacgcgccc tgccattcac tctgagcaat tacagaagat cttatgaggc ctttctttcc 240
cagtgccaag tggacattcc cacctgggga actaaacatc ctttggggat gctttggcac 300
cataaggtgt caaccctgat tgatgaaatg gtgtcgcgtc gaatgtaccg catcatggaa 360
aaagcagggc aggctgcctg gaaacaggtg gtgagcgagg ctacgctgtc tcgcattagt 420
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<212> PRT
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<223> PRRSV gp3
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cgatgtgggg aggacgatca tgacgagcta gggtttatga taccgcctgg cctctccagc 300
gaaggccact tgactggtgt ttacgcctgg ttggcgttct tgtccttcag ctacacggcc 360
cagttccatc ccgagatatt cgggataggg aatgtgagtc gagtttatgt tgacatcaaa 420
catcaactca tctgcgccga acatgacggg cagaacacca ccttgcctcg tcatgacaac 480
atttcagccg tgtttcagac ctattaccaa catcaagtcg acggcggcaa ttggtttcac 540
ctagaatggc ttcgtccctt cttttcctcg tggttggttt taaatgtctc ttggtttctc 600
aggcgttcgc ctgcaaacca tgtttcagtt cgagtcttgc agatattaag accaacacca 660
ccgcagcggc aagctttgct gtcctccaag acatcagttg ccttaggcat cgcgactcgg 720
cctctgaggc gattcgcaaa atccctcagt gccgtacggc ga 762
<210> 5
<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRRSV gp4多肽 (VR2332)
<400> 5
Met Ala Ser Ser Leu Leu Phe Leu Val Val Gly Phe Lys Cys Leu Leu
1 5 10 15
Val Ser Gln Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Ser Ser Leu Ala
20 25 30
Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Ala Ala Ala Ser Phe Ala Val Leu Gln
35 40 45
Asp Ile Ser Cys Leu Arg His Arg Asp Ser Ala Ser Glu Ala Ile Arg
50 55 60
Lys Ile Pro Gln Cys Arg Thr Ala Ile Gly Thr Pro Val Tyr Val Thr
65 70 75 80
Ile Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp Leu
85 90 95
Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys
100 105 110
Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn Val Ser Gly Ile Val Ala Val Cys
115 120 125
Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gln His Val Lys Glu Phe Thr Gln Arg
130 135 140
Ser Leu Val Val Asp His Val Arg Leu Leu His Phe Met Thr Pro Glu
145 150 155 160
Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu Ala Cys Leu Phe Ala Ile Leu Leu
165 170 175
Ala Ile
<210> 6
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV gp4 (VR2332的13241..13777)
<400> 6
atggcttcgt cccttctttt cctcgtggtt ggttttaaat gtctcttggt ttctcaggcg 60
ttcgcctgca aaccatgttt cagttcgagt cttgcagata ttaagaccaa caccaccgca 120
gcggcaagct ttgctgtcct ccaagacatc agttgcctta ggcatcgcga ctcggcctct 180
gaggcgattc gcaaaatccc tcagtgccgt acggcgatag ggacacccgt gtatgttacc 240
atcacagcca atgtgacaga tgagaattat ttacattctt ctgatctcct catgctttct 300
tcttgccttt tctatgcttc tgagatgagt gaaaagggat ttaaggtggt atttggcaat 360
gtgtcaggca tcgtggctgt gtgtgtcaat tttaccagct acgtccaaca tgtcaaggag 420
tttacccaac gctccctggt ggtcgaccat gtgcggttgc tccatttcat gacacctgag 480
accatgaggt gggcaactgt tttagcctgt ctttttgcca ttctgttggc aatt 534
<210> 7
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRRSV E多肽 (VR2332)
<400> 7
Met Gly Ser Met Gln Ser Leu Phe Asp Lys Ile Gly Gln Leu Phe Val
1 5 10 15
Asp Ala Phe Thr Glu Phe Leu Val Ser Ile Val Asp Ile Ile Ile Phe
20 25 30
Leu Ala Ile Leu Phe Gly Phe Thr Ile Ala Gly Trp Leu Val Val Phe
35 40 45
Cys Ile Arg Leu Val Cys Ser Ala Ile Leu Arg Thr Arg Pro Ala Ile
50 55 60
His Ser Glu Gln Leu Gln Lys Ile Leu
65 70
<210> 8
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV E (VR2332的12078..12299)
<400> 8
atggggtcca tgcaaagcct ttttgacaaa attggccaac tttttgtgga tgctttcacg 60
gagttcttgg tgtccattgt tgatatcatt atatttttgg ccattttgtt tggcttcacc 120
atcgccggtt ggctggtggt cttttgcatc agattggttt gctccgcgat actccgtacg 180
cgccctgcca ttcactctga gcaattacag aagatctta 219
<210> 9
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV gp2 (经密码子优化的)
<400> 9
atgaaatggg gaccctgtaa ggctttcctg actaaactcg caaacttcct ctggatgctc 60
tcacgatctt cctggtgccc tctgctcatc tctctctact tctggccatt ttgcctggcc 120
tccccctctc cagtgggatg gtggtcattc gccagtgact ggtttgctcc ccgatattca 180
gtgcgggctc tcccattcac tctgagcaac taccggcgct cctatgaggc atttctgagc 240
cagtgtcagg tggacatccc aacctggggc acaaagcacc ctctgggaat gctctggcac 300
cataaagtga gtacactgat cgatgagatg gtcagcagga gaatgtacag aattatggaa 360
aaggctggcc aggccgcttg gaaacaggtg gtctctgaag caaccctctc acgaatcagc 420
tccctggacg tggtcgccca cttccagcat ctcgcagcca ttgaggcaga aacatgcaag 480
tacctggcca gccgcctgcc tatgctccat aacctgagga tgactgggtc caatgtgacc 540
atcgtctata actctacact gaatcaggtg ttcgctattt ttcctactcc cggcagcagg 600
cccaaactcc acgatttcca gcagtggctg atcgccgtgc attcttcaat tttcagtagc 660
gtcgctgcat cctgtaccct gtttgtggtc ctgtggctcc gggtgcccat cctccgcaca 720
gtgttcgggt ttcggtggct gggggctatt ttcctctcca actcacag 768
<210> 10
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV gp3 (经密码子优化的)
<400> 10
atggtcaatt cctgtacctt cctccacatc ttcctctgtt gttcattcct ctattccttc 60
tgttgcgctg tcgtcgctgg gtcaaacacc acatactgct tctggtttcc actggtgaga 120
ggaaacttct cctttgagct cacagtcaat tataccgtgt gccctccatg tctgacccga 180
caggcagcta cagaaatcta cgaacctggc aggtctctgt ggtgcagaat tggctatgac 240
cgatgtggag aggacgatca cgatgaactg gggttcatga tccctcccgg cctgagctcc 300
gaaggacatc tcacaggggt ctacgcatgg ctggccttcc tctccttttc ttatactgcc 360
cagttccacc ccgaaatctt cgggattggc aacgtgtcca gggtgtacgt cgacatcaag 420
caccagctga tttgtgccga acatgacggc cagaacacta ccctgcctcg gcatgataat 480
atcagcgccg tgttccagac ctactatcag caccaggtgg atggcggaaa ttggtttcat 540
ctggagtggc tccggccctt cttttcttca tggctggtcc tcaacgtgtc atggttcctg 600
cggcgcagtc ccgccaatca cgtgagcgtc cgggtgctgc agattctccg cccaactcca 660
cctcagaggc aggctctgct cagtagcaaa acctcagtgg cactgggcat cgctacacga 720
cctctcagac ggttcgctaa gtccctctca gcagtcagaa gg 762
<210> 11
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV gp4 (经密码子优化的)
<400> 11
atggcttcat ctctcctctt cctcgtcgtg ggattcaaat gtctgctcgt gtctcaggcc 60
ttcgcttgta aaccctgctt ttccagtagc ctggctgaca tcaagactaa caccacagcc 120
gctgcatcat tcgcagtgct gcaggacatt agttgcctcc gacaccgaga tagtgccagc 180
gaggctatca ggaaaattcc ccagtgtaga acagcaatcg ggactccagt gtacgtcact 240
attaccgcca acgtgacaga cgaaaattat ctgcatagct ccgatctgct catgctgtct 300
tcatgcctct tctacgcttc cgagatgtct gaaaagggct tcaaagtggt ctttggcaac 360
gtctctggaa tcgtggccgt gtgcgtgaat ttcaccagct atgtccagca cgtgaaggag 420
tttacacagc gatccctggt ggtcgatcac gtgcgcctgc tccacttcat gacccctgaa 480
accatgcggt gggctactgt cctcgcctgc ctgttcgcca ttctcctcgc tatt 534
<210> 12
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV E (经密码子优化的)
<400> 12
atggggtcta tgcagtcact gtttgataag attgggcagc tctttgtgga cgcctttacc 60
gagttcctgg tcagcattgt ggacatcatc attttcctgg ccatcctctt cggctttacc 120
attgctggat ggctggtggt cttttgcatc cggctcgtgt gtagcgccat cctcagaaca 180
agacctgcca tccactccga acagctccag aaaatcctc 219
<210> 13
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV rtg-gp2 DNA (经密码子优化的, 重新靶向)
<400> 13
atggatgcta tgaaacgggg actctgttgc gtgctgctgc tgtgcggagc cgtctttgtc 60
tcaccttcct caccaagccc tgtcgggtgg tggtcctttg cttctgactg gttcgcacca 120
cgatactccg tgcgggcact gccttttact ctctccaact accggcgctc ttatgaggcc 180
ttcctgtctc agtgccaggt ggacatccct acctggggaa caaagcaccc cctcgggatg 240
ctgtggcacc ataaagtgtc tacactgatc gatgagatgg tctcaaggag aatgtataga 300
attatggaaa aggcaggcca ggccgcttgg aaacaggtgg tctcagaagc caccctgagt 360
cgaatcagct ccctcgatgt ggtcgctcac tttcagcatc tggcagccat tgaggccgaa 420
acctgtaagt acctcgctag ccgcctcccc atgctgcaca acctcaggat gactggcagt 480
aatgtgacca tcgtctataa cagcacactg aatcaggtgt ttgctatttt ccccactcca 540
ggaagcaggc caaagctgca tgacttccag ggcggaagcg agcagaaact gatctccgag 600
gaggacctgg gaggatcagg aggaagtgga ggatccgagc tggtggaagg gtggttttct 660
tcatggaaga gtagcatcgc ctccttcttt ttcatcattg ggctgatcat tggcctgttc 720
ctcgtgctgc gggtcggaat ccatctgtgc atcaagctga aacatacaaa gaaacgacag 780
atttacactg acattgagat gaatagactg ggcaaa 816
<210> 14
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV rtg-gp2多肽 (gp2-myc-VSV)
<400> 14
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ser Pro Ser Pro Val Gly Trp Trp Ser
20 25 30
Phe Ala Ser Asp Trp Phe Ala Pro Arg Tyr Ser Val Arg Ala Leu Pro
35 40 45
Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Ala Phe Leu Ser Gln
50 55 60
Cys Gln Val Asp Ile Pro Thr Trp Gly Thr Lys His Pro Leu Gly Met
65 70 75 80
Leu Trp His His Lys Val Ser Thr Leu Ile Asp Glu Met Val Ser Arg
85 90 95
Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala Trp Lys Gln
100 105 110
Val Val Ser Glu Ala Thr Leu Ser Arg Ile Ser Ser Leu Asp Val Val
115 120 125
Ala His Phe Gln His Leu Ala Ala Ile Glu Ala Glu Thr Cys Lys Tyr
130 135 140
Leu Ala Ser Arg Leu Pro Met Leu His Asn Leu Arg Met Thr Gly Ser
145 150 155 160
Asn Val Thr Ile Val Tyr Asn Ser Thr Leu Asn Gln Val Phe Ala Ile
165 170 175
Phe Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Lys Leu His Asp Phe Gln Gly Gly
180 185 190
Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Ser Gly Gly
195 200 205
Ser Gly Gly Ser Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser
210 215 220
Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe
225 230 235 240
Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr
245 250 255
Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
260 265 270
<210> 15
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV rtg-gp3 DNA (经密码子优化的, 重新靶向)
<400> 15
atggatgcta tgaaacgggg gctctgctgc gtcctcctcc tgtgcggggc tgtcttcgtc 60
tcaccctcct caaatacaac ctactgcttt tggttcccac tcgtgagagg caactttagc 120
ttcgagctga ctgtgaatta caccgtctgc cctccatgtc tgacccgaca ggccgctgca 180
gaaatctacg aacctggacg gtccctgtgg tgccgcattg ggtatgacag gtgtgaggaa 240
gacgatcacg atgagctggg ctttatggtg cctcctggac tcagctccga aggacatctg 300
acatcagtct acgcctggct cgcttttctg tccttctctt atactgctca gtttcacccc 360
gaaatcttcg gaattgggaa cgtgtctcgg gtgtacgtcg acatcaagca ccagctcatt 420
tgcgcagaac atgacggcca gaacaccaca ctgccaaggc acgataatat ctccgccgtg 480
ttccagacat actatcagca tcaggtcgac ggcggagggg gctctgatta taaggacgat 540
gacgataaag gagggtcagg cggaagtggg ggatccgagc tggtggaagg ctggttttct 600
tcatggaaga gtagcatcgc cagcttcttt ttcatcattg gcctcatcat tggactgttc 660
ctcgtgctgc gcgtcggaat ccacctgtgc atcaagctga agcatactaa gaagcggcag 720
atttacaccg acattgagat gaacagactg gggaaatga 759
<210> 16
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV rtg-gp3多肽 (gp3-Flag-VSV)
<400> 16
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Ser Asn Thr Thr Tyr Cys Phe Trp Phe
20 25 30
Pro Leu Val Arg Gly Asn Phe Ser Phe Glu Leu Thr Val Asn Tyr Thr
35 40 45
Val Cys Pro Pro Cys Leu Thr Arg Gln Ala Ala Ala Glu Ile Tyr Glu
50 55 60
Pro Gly Arg Ser Leu Trp Cys Arg Ile Gly Tyr Asp Arg Cys Glu Glu
65 70 75 80
Asp Asp His Asp Glu Leu Gly Phe Met Val Pro Pro Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Glu Gly His Leu Thr Ser Val Tyr Ala Trp Leu Ala Phe Leu Ser Phe
100 105 110
Ser Tyr Thr Ala Gln Phe His Pro Glu Ile Phe Gly Ile Gly Asn Val
115 120 125
Ser Arg Val Tyr Val Asp Ile Lys His Gln Leu Ile Cys Ala Glu His
130 135 140
Asp Gly Gln Asn Thr Thr Leu Pro Arg His Asp Asn Ile Ser Ala Val
145 150 155 160
Phe Gln Thr Tyr Tyr Gln His Gln Val Asp Gly Gly Gly Gly Ser Asp
165 170 175
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
180 185 190
Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser
195 200 205
Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg
210 215 220
Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln
225 230 235 240
Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
245 250
<210> 17
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV rtg-gp4 DNA (经密码子优化的, 重新靶向)
<400> 17
atggatgcta tgaaacgggg actgtgctgc gtgctgctgc tctgtggggc tgtcttcgtg 60
tcaccttctt gtaaaccttg cttttccagc tccctggctg acatcaagac taacaccaca 120
gccgctgcat cttttgcagt gctccaggac atttcatgcc tgcgacaccg agatagcgcc 180
tccgaggcta tcaggaaaat tcctcagtgt agaacagcaa tcggcactcc cgtgtacgtc 240
actattaccg ccaacgtgac agacgaaaat tatctgcatt ctagcgacct gctcatgctc 300
agtagctgcc tgttctacgc ctctgagatg tcagaaaagg gctttaaagt ggtcttcggg 360
aacgtgagcg gcatcgtggc cgtgtgcgtg aacttcacca gctatgtcca gcacgtgaag 420
gagttcacac agcgatccct ggtggtcgat cacgtccgcc tgctccatgg cggatcttac 480
ccctatgacg tgccagatta cgcaggagga agtggaggaa gcggaggatc cgagctggtg 540
gaaggatggt tttcctcttg gaagtcaagt atcgccagct tctttttcat cattggactc 600
atcattgggc tgttcctcgt cctgcgggtg ggaatccatc tgtgcatcaa gctgaagcat 660
acaaagaagc ggcagattta cactgacatt gagatgaata gactgggcaa atga 714
<210> 18
<211> 237
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV rtg-gp4多肽 (gp4-HA-VSV)
<400> 18
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Cys Lys Pro Cys Phe Ser Ser Ser Leu
20 25 30
Ala Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Ala Ala Ala Ser Phe Ala Val Leu
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Cys Leu Arg His Arg Asp Ser Ala Ser Glu Ala Ile
50 55 60
Arg Lys Ile Pro Gln Cys Arg Thr Ala Ile Gly Thr Pro Val Tyr Val
65 70 75 80
Thr Ile Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu Asn Tyr Leu His Ser Ser Asp
85 90 95
Leu Leu Met Leu Ser Ser Cys Leu Phe Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu
100 105 110
Lys Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn Val Ser Gly Ile Val Ala Val
115 120 125
Cys Val Asn Phe Thr Ser Tyr Val Gln His Val Lys Glu Phe Thr Gln
130 135 140
Arg Ser Leu Val Val Asp His Val Arg Leu Leu His Gly Gly Ser Tyr
145 150 155 160
Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
165 170 175
Ser Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala
180 185 190
Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu
195 200 205
Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg
210 215 220
Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
225 230 235
<210> 19
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 以下的替代符号: VR2332 PRRSV rtg-E (经密码子优化的, 重新靶向)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> n是a, c, g, t或u
<400> 19
nnnnnnnnnn 10
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 以下的替代符号: VR2332 PRRSV rtg-E多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 20
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 21
<211> 4566
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vAD3038插入序列盒
<400> 21
aaataatgat tttattttga ctgatagtga cctgttcgtt gcaacacatt gatgagcaat 60
gcttttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggtcg actctagagg atccgaaaaa 120
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 180
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 240
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 300
atgtctggat ccccaagctt ctcgagaccg gttcatttgc ccagtctatt catctcaatg 360
tcagtgtaaa tctgtcgttt ctttgtatgt ttcagcttga tgcacagatg gattccgacc 420
cgcagcacga ggaacaggcc aatgatcagc ccaatgatga aaaagaagga ggcgatgcta 480
ctcttccatg aagaaaacca cccttccacc agctcggatc ctccacttcc tcctgatcct 540
cccaggtcct cctcggagat cagtttctgc tcgcttccgc cctggaagtc atgcagcttt 600
ggcctgcttc ctggagtggg gaaaatagca aacacctgat tcagtgtgct gttatagacg 660
atggtcacat tactgccagt catcctgagg ttgtgcagca tggggaggcg gctagcgagg 720
tacttacagg tttcggcctc aatggctgcc agatgctgaa agtgagcgac cacatcgagg 780
gagctgattc gactcagggt ggcttctgag accacctgtt tccaagcggc ctggcctgcc 840
ttttccataa ttctatacat tctccttgag accatctcat cgatcagtgt agacacttta 900
tggtgccaca gcatcccgag ggggtgcttt gttccccagg tagggatgtc cacctggcac 960
tgagacagga aggcctcata agagcgccgg tagttggaga gagtaaaagg cagtgcccgc 1020
acggagtatc gtggtgcgaa ccagtcagaa gcaaaggacc accacccgac agggcttggt 1080
gaggaaggtg agacaaagac ggctccgcac agcagcagca cgcaacagag tccccgtttc 1140
atagcatcca tggtttaatt aaagcttttt gcaaaagcct aggcctccaa aaaagcctcc 1200
tcactacttc tggaatagct cagaggccga ggcggcctcg gcctctgcat aaataaaaaa 1260
aattagtcag ccatggggcg gagaatgggc ggaactgggc ggagttaggg gcgggatggg 1320
cggagttagg ggcgggacta tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct 1380
gcctgctggg gagcctgggg actttccaca cctggttgct gactaattga gatgcatgct 1440
ttgcatactt ctgcctgctg gggagcctgg ggactttcca caccctaact gacacacatt 1500
ccacagccaa gctgtaccga gctcgaattc gctagcatcg atgcggccgc gttgacattg 1560
attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 1620
ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 1680
ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 1740
ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 1800
tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 1860
tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 1920
cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 1980
ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 2040
aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 2100
taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tagaaccatg gatgctatga 2160
aacggggact gtgctgcgtg ctgctgctct gtggggctgt cttcgtgtca ccttcttgta 2220
aaccttgctt ttccagctcc ctggctgaca tcaagactaa caccacagcc gctgcatctt 2280
ttgcagtgct ccaggacatt tcatgcctgc gacaccgaga tagcgcctcc gaggctatca 2340
ggaaaattcc tcagtgtaga acagcaatcg gcactcccgt gtacgtcact attaccgcca 2400
acgtgacaga cgaaaattat ctgcattcta gcgacctgct catgctcagt agctgcctgt 2460
tctacgcctc tgagatgtca gaaaagggct ttaaagtggt cttcgggaac gtgagcggca 2520
tcgtggccgt gtgcgtgaac ttcaccagct atgtccagca cgtgaaggag ttcacacagc 2580
gatccctggt ggtcgatcac gtccgcctgc tccatggcgg atcttacccc tatgacgtgc 2640
cagattacgc aggaggaagt ggaggaagcg gaggatccga gctggtggaa ggatggtttt 2700
cctcttggaa gtcaagtatc gccagcttct ttttcatcat tggactcatc attgggctgt 2760
tcctcgtcct gcgggtggga atccatctgt gcatcaagct gaagcataca aagaagcggc 2820
agatttacac tgacattgag atgaatagac tgggcaaatg atgacccccc cccctaacgt 2880
tactggccga agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac 2940
catattgccg tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag 3000
cattcctagg ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa 3060
ggaagcagtt cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag 3120
gcagcggaac cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga 3180
tacacctgca aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag 3240
agtcaaatgg ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc 3300
ccattgtatg ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag 3360
gttaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga 3420
tgataatacc atggatgcta tgaaacgggg gctctgctgc gtcctcctcc tgtgcggggc 3480
tgtcttcgtc tcaccctcct caaatacaac ctactgcttt tggttcccac tcgtgagagg 3540
caactttagc ttcgagctga ctgtgaatta caccgtctgc cctccatgtc tgacccgaca 3600
ggccgctgca gaaatctacg aacctggacg gtccctgtgg tgccgcattg ggtatgacag 3660
gtgtgaggaa gacgatcacg atgagctggg ctttatggtg cctcctggac tcagctccga 3720
aggacatctg acatcagtct acgcctggct cgcttttctg tccttctctt atactgctca 3780
gtttcacccc gaaatcttcg gaattgggaa cgtgtctcgg gtgtacgtcg acatcaagca 3840
ccagctcatt tgcgcagaac atgacggcca gaacaccaca ctgccaaggc acgataatat 3900
ctccgccgtg ttccagacat actatcagca tcaggtcgac ggcggagggg gctctgatta 3960
taaggacgat gacgataaag gagggtcagg cggaagtggg ggatccgagc tggtggaagg 4020
ctggttttct tcatggaaga gtagcatcgc cagcttcttt ttcatcattg gcctcatcat 4080
tggactgttc ctcgtgctgc gcgtcggaat ccacctgtgc atcaagctga agcatactaa 4140
gaagcggcag atttacaccg acattgagat gaacagactg gggaaatgat gaggtaccgg 4200
gggaggctaa ctgaaacacg gaaggagaca ataccggaag gaacccgcgc tatgacggca 4260
ataaaaagac agaataaaac gcacgggtgt tgggtcgttt gttcataaac gcggggttcg 4320
gtcccagggc tggcactctg tcgatacccc accgagaccc cattggggcc aatacgcccg 4380
cgtttcttcc ttttccccac cccacccccc aagttcgggt gaaggcccag ggctcgcagc 4440
caacgtcggg gcggcaggcc ctgccatagc cagctttctt gtacaaagtt ggcattataa 4500
gaaagcattg cttatcaatt tgttgcaacg aacaggtcac tatcagtcaa aataaaatca 4560
ttattt 4566
<210> 22
<211> 4662
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAD3041转基因盒
<400> 22
aaataatgat tttattttga ctgatagtga cctgttcgtt gcaacacatt gatgagcaat 60
gcttttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggtcg actctagagg atccgaaaaa 120
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 180
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 240
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 300
atgtctggat ccccaagctt ctcgagaccg gtcctgcagg tcagaggatt ttctggagct 360
gttcggagtg gatggcaggt cttgttctga ggatggcgct acacacgagc cggatgcaaa 420
agaccaccag ccatccagca atggtaaagc cgaagaggat ggccaggaaa atgatgatgt 480
ccacaatgct gaccaggaac tcggtaaagg cgtccacaaa gagctgccca atcttatcaa 540
acagtgactg catagacccc atggtggagg tccagggttc tcctccacgt ctccagcctg 600
cttcagcagg ctgaagttag tagctccgct tcccctgcag gtcactgtga gttggagagg 660
aaaatagccc ccagccaccg aaacccgaac actgtgcgga ggatgggcac ccggagccac 720
aggaccacaa acagggtaca ggatgcagcg acgctactga aaattgaaga atgcacggcg 780
atcagccact gctggaaatc gtggagtttg ggcctgctgc cgggagtagg aaaaatagcg 840
aacacctgat tcagtgtaga gttatagacg atggtcacat tggacccagt catcctcagg 900
ttatggagca taggcaggcg gctggccagg tacttgcatg tttctgcctc aatggctgcg 960
agatgctgga agtgggcgac cacgtccagg gagctgattc gtgagagggt tgcttcagag 1020
accacctgtt tccaagcggc ctggccagcc ttttccataa ttctgtacat tctcctgctg 1080
accatctcat cgatcagtgt actcacttta tggtgccaga gcattcccag agggtgcttt 1140
gtgccccagg ttgggatgtc cacctgacac tggctcagaa atgcctcata ggagcgccgg 1200
tagttgctca gagtgaatgg gagagcccgc actgaatatc ggggagcaaa ccagtcactg 1260
gcgaatgacc accatcccac tggagagggg gaggccaggc aaaatggcca gaagtagaga 1320
gagatgagca gagggcacca ggaagatcgt gagagcatcc agaggaagtt tgcgagttta 1380
gtcaggaaag ccttacaggg tccccatttc atggtggagc tttttgcaaa agcctaggcc 1440
tccaaaaaag cctcctcact acttctggaa tagctcagag gccgaggcgg cctcggcctc 1500
tgcataaata aaaaaaatta gtcagccatg gggcggagaa tgggcggaac tgggcggagt 1560
taggggcggg atgggcggag ttaggggcgg gactatggtt gctgactaat tgagatgcat 1620
gctttgcata cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacctgg ttgctgacta 1680
attgagatgc atgctttgca tacttctgcc tgctggggag cctggggact ttccacaccc 1740
taactgacac acattccaca gccaagctgt accgagctcg aattcgctag catcgatgcg 1800
gccgcgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt 1860
tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg 1920
accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc 1980
aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggactattta cggtaaactg cccacttggc 2040
agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg 2100
gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat 2160
ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg 2220
tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag 2280
tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt 2340
gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctctctagaa 2400
ccaccatggc ttcatctctc ctcttcctcg tcgtgggatt caaatgtctg ctcgtgtctc 2460
aggccttcgc ttgtaaaccc tgcttttcca gtagcctggc tgacatcaag actaacacca 2520
cagccgctgc atcattcgca gtgctgcagg acattagttg cctccgacac cgagatagtg 2580
ccagcgaggc tatcaggaaa attccccagt gtagaacagc aatcgggact ccagtgtacg 2640
tcactattac cgccaacgtg acagacgaaa attatctgca tagctccgat ctgctcatgc 2700
tgtcttcatg cctcttctac gcttccgaga tgtctgaaaa gggcttcaaa gtggtctttg 2760
gcaacgtctc tggaatcgtg gccgtgtgcg tgaatttcac cagctatgtc cagcacgtga 2820
aggagtttac acagcgatcc ctggtggtcg atcacgtgcg cctgctccac ttcatgaccc 2880
ctgaaaccat gcggtgggct actgtcctcg cctgcctgtt cgccattctc ctcgctattt 2940
gaagatctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc 3000
gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa 3060
acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat 3120
gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac 3180
aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg 3240
cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt 3300
tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg 3360
gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac 3420
atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac 3480
gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa taccaccatg gtcaattcct gtaccttcct 3540
ccacatcttc ctctgttgtt cattcctcta ttccttctgt tgcgctgtcg tcgctgggtc 3600
aaacaccaca tactgcttct ggtttccact ggtgagagga aacttctcct ttgagctcac 3660
agtcaattat accgtgtgcc ctccatgtct gacccgacag gcagctacag aaatctacga 3720
acctggcagg tctctgtggt gcagaattgg ctatgaccga tgtggagagg acgatcacga 3780
tgaactgggg ttcatgatcc ctcccggcct gagctccgaa ggacatctca caggggtcta 3840
cgcatggctg gccttcctct ccttttctta tactgcccag ttccaccccg aaatcttcgg 3900
gattggcaac gtgtccaggg tgtacgtcga catcaagcac cagctgattt gtgccgaaca 3960
tgacggccag aacactaccc tgcctcggca tgataatatc agcgccgtgt tccagaccta 4020
ctatcagcac caggtggatg gcggaaattg gtttcatctg gagtggctcc ggcccttctt 4080
ttcttcatgg ctggtcctca acgtgtcatg gttcctgcgg cgcagtcccg ccaatcacgt 4140
gagcgtccgg gtgctgcaga ttctccgccc aactccacct cagaggcagg ctctgctcag 4200
tagcaaaacc tcagtggcac tgggcatcgc tacacgacct ctcagacggt tcgctaagtc 4260
cctctcagca gtcagaaggt gaagatctgg taccggggga ggctaactga aacacggaag 4320
gagacaatac cggaaggaac ccgcgctatg acggcaataa aaagacagaa taaaacgcac 4380
gggtgttggg tcgtttgttc ataaacgcgg ggttcggtcc cagggctggc actctgtcga 4440
taccccaccg agaccccatt ggggccaata cgcccgcgtt tcttcctttt ccccacccca 4500
ccccccaagt tcgggtgaag gcccagggct cgcagccaac gtcggggcgg caggccctgc 4560
catagccagc tttcttgtac aaagttggca ttataagaaa gcattgctta tcaatttgtt 4620
gcaacgaaca ggtcactatc agtcaaaata aaatcattat tt 4662
<210> 23
<211> 4361
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> vAD3042转基因盒
<400> 23
aaataatgat tttattttga ctgatagtga cctgttcgtt gcaacacatt gatgagcaat 60
gcttttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggtcg actctagagg atccgaaaaa 120
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 180
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 240
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 300
atgtctggat ccccaagctt ctcgagaccg gtcctgcagg tcactgtgag ttggagagga 360
aaatagcccc cagccaccga aacccgaaca ctgtgcggag gatgggcacc cggagccaca 420
ggaccacaaa cagggtacag gatgcagcga cgctactgaa aattgaagaa tgcacggcga 480
tcagccactg ctggaaatcg tggagtttgg gcctgctgcc gggagtagga aaaatagcga 540
acacctgatt cagtgtagag ttatagacga tggtcacatt ggacccagtc atcctcaggt 600
tatggagcat aggcaggcgg ctggccaggt acttgcatgt ttctgcctca atggctgcga 660
gatgctggaa gtgggcgacc acgtccaggg agctgattcg tgagagggtt gcttcagaga 720
ccacctgttt ccaagcggcc tggccagcct tttccataat tctgtacatt ctcctgctga 780
ccatctcatc gatcagtgta ctcactttat ggtgccagag cattcccaga gggtgctttg 840
tgccccaggt tgggatgtcc acctgacact ggctcagaaa tgcctcatag gagcgccggt 900
agttgctcag agtgaatggg agagcccgca ctgaatatcg gggagcaaac cagtcactgg 960
cgaatgacca ccatcccact ggagaggggg aggccaggca aaatggccag aagtagagag 1020
agatgagcag agggcaccag gaagatcgtg agagcatcca gaggaagttt gcgagtttag 1080
tcaggaaagc cttacagggt ccccatttca tggtggagct ttttgcaaaa gcctaggcct 1140
ccaaaaaagc ctcctcacta cttctggaat agctcagagg ccgaggcggc ctcggcctct 1200
gcataaataa aaaaaattag tcagccatgg ggcggagaat gggcggaact gggcggagtt 1260
aggggcggga tgggcggagt taggggcggg actatggttg ctgactaatt gagatgcatg 1320
ctttgcatac ttctgcctgc tggggagcct ggggactttc cacacctggt tgctgactaa 1380
ttgagatgca tgctttgcat acttctgcct gctggggagc ctggggactt tccacaccct 1440
aactgacaca cattccacag ccaagctgta ccgagctcga attcgctagc atcgatgcgg 1500
ccgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt 1560
catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga 1620
ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca 1680
atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca 1740
gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg 1800
cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc 1860
tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt 1920
ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt 1980
ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg 2040
acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tctctagaac 2100
caccatggct tcatctctcc tcttcctcgt cgtgggattc aaatgtctgc tcgtgtctca 2160
ggccttcgct tgtaaaccct gcttttccag tagcctggct gacatcaaga ctaacaccac 2220
agccgctgca tcattcgcag tgctgcagga cattagttgc ctccgacacc gagatagtgc 2280
cagcgaggct atcaggaaaa ttccccagtg tagaacagca atcgggactc cagtgtacgt 2340
cactattacc gccaacgtga cagacgaaaa ttatctgcat agctccgatc tgctcatgct 2400
gtcttcatgc ctcttctacg cttccgagat gtctgaaaag ggcttcaaag tggtctttgg 2460
caacgtctct ggaatcgtgg ccgtgtgcgt gaatttcacc agctatgtcc agcacgtgaa 2520
ggagtttaca cagcgatccc tggtggtcga tcacgtgcgc ctgctccact tcatgacccc 2580
tgaaaccatg cggtgggcta ctgtcctcgc ctgcctgttc gccattctcc tcgctatttg 2640
aagatctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg 2700
tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa 2760
cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg 2820
caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca 2880
acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc 2940
ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt 3000
gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt caacaagggg 3060
ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca 3120
tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg 3180
tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat accaccatgg tcaattcctg taccttcctc 3240
cacatcttcc tctgttgttc attcctctat tccttctgtt gcgctgtcgt cgctgggtca 3300
aacaccacat actgcttctg gtttccactg gtgagaggaa acttctcctt tgagctcaca 3360
gtcaattata ccgtgtgccc tccatgtctg acccgacagg cagctacaga aatctacgaa 3420
cctggcaggt ctctgtggtg cagaattggc tatgaccgat gtggagagga cgatcacgat 3480
gaactggggt tcatgatccc tcccggcctg agctccgaag gacatctcac aggggtctac 3540
gcatggctgg ccttcctctc cttttcttat actgcccagt tccaccccga aatcttcggg 3600
attggcaacg tgtccagggt gtacgtcgac atcaagcacc agctgatttg tgccgaacat 3660
gacggccaga acactaccct gcctcggcat gataatatca gcgccgtgtt ccagacctac 3720
tatcagcacc aggtggatgg cggaaattgg tttcatctgg agtggctccg gcccttcttt 3780
tcttcatggc tggtcctcaa cgtgtcatgg ttcctgcggc gcagtcccgc caatcacgtg 3840
agcgtccggg tgctgcagat tctccgccca actccacctc agaggcaggc tctgctcagt 3900
agcaaaacct cagtggcact gggcatcgct acacgacctc tcagacggtt cgctaagtcc 3960
ctctcagcag tcagaaggtg aagatctggt accgggggag gctaactgaa acacggaagg 4020
agacaatacc ggaaggaacc cgcgctatga cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg 4080
ggtgttgggt cgtttgttca taaacgcggg gttcggtccc agggctggca ctctgtcgat 4140
accccaccga gaccccattg gggccaatac gcccgcgttt cttccttttc cccaccccac 4200
cccccaagtt cgggtgaagg cccagggctc gcagccaacg tcggggcggc aggccctgcc 4260
atagccagct ttcttgtaca aagttggcat tataagaaag cattgcttat caatttgttg 4320
caacgaacag gtcactatca gtcaaaataa aatcattatt t 4361
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 以下的替代符号: vAD-rtg-gp234-E重组前插入序列
<400> 24
Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 以下的替代符号: vAD3033重组前插入序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> n是a, c, g, t或u
<400> 25
nnnnnnnnnn 10
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAd5正向引物
<400> 26
gactttgacc gtttacgtgg agac 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAd5反向引物
<400> 27
ccttaagcca cgcccacaca tttc 24
<210> 28
<211> 15411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 整个VR2332, PRRSV II型序列
<400> 28
atgacgtata ggtgttggct ctatgccttg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60
ggcacagccc aaaacttgct gcacagaaac acccttctgt gatagcctcc ttcaggggag 120
cttagggttt gtccctagca ccttgcttcc ggagttgcac tgctttacgg tctctccacc 180
cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc cagggtgttt 240
atggcggagg gccaagtcta ctgcacacga tgcctcagtg cacggtctct ccttcccctg 300
aacctccaag tttctgagct cggggtgcta ggcctattct acaggcccga agagccactc 360
cggtggacgt tgccacgtgc attccccact gttgagtgct cccccgccgg ggcctgctgg 420
ctttctgcaa tctttccaat cgcacgaatg accagtggaa acctgaactt ccaacaaaga 480
atggtacggg tcgcagctga gctttacaga gccggccagc tcacccctgc agtcttgaag 540
gctctacaag tttatgaacg gggttgccgc tggtacccca ttgttggacc tgtccctgga 600
gtggccgttt tcgccaattc cctacatgtg agtgataaac ctttcccggg agcaactcac 660
gtgttgacca acctgccgct cccgcagaga cccaagcctg aagacttttg cccctttgag 720
tgtgctatgg ctactgtcta tgacattggt catgacgccg tcatgtatgt ggccgaaagg 780
aaagtctcct gggcccctcg tggcggggat gaagtgaaat ttgaagctgt ccccggggag 840
ttgaagttga ttgcgaaccg gctccgcacc tccttcccgc cccaccacac agtggacatg 900
tctaagttcg ccttcacagc ccctgggtgt ggtgtttcta tgcgggtcga acgccaacac 960
ggctgccttc ccgctgacac tgtccctgaa ggcaactgct ggtggagctt gtttgacttg 1020
cttccactgg aagttcagaa caaagaaatt cgccatgcta accaatttgg ctaccagacc 1080
aagcatggtg tctctggcaa gtacctacag cggaggctgc aagttaatgg tctccgagca 1140
gtaactgacc taaacggacc tatcgtcgta cagtacttct ccgttaagga gagttggatc 1200
cgccatttga aactggcggg agaacccagc tactctgggt ttgaggacct cctcagaata 1260
agggttgagc ctaacacgtc gccattggct gacaaggaag aaaaaatttt ccggtttggc 1320
agtcacaagt ggtacggcgc tggaaagaga gcaagaaaag cacgctcttg tgcgactgct 1380
acagtcgctg gccgcgcttt gtccgttcgt gaaacccggc aggccaagga gcacgaggtt 1440
gccggcgcca acaaggctga gcacctcaaa cactactccc cgcctgccga agggaattgt 1500
ggttggcact gcatttccgc catcgccaac cggatggtga attccaaatt tgaaaccacc 1560
cttcccgaaa gagtgagacc tccagatgac tgggctactg acgaggatct tgtgaatgcc 1620
atccaaatcc tcagactccc tgcggcctta gacaggaacg gtgcttgtac tagcgccaag 1680
tacgtactta agctggaagg tgagcattgg actgtcactg tgacccctgg gatgtcccct 1740
tctttgctcc ctcttgaatg tgttcagggc tgttgtgggc acaagggcgg tcttggttcc 1800
ccagatgcag tcgaggtctc cggatttgac cctgcctgcc ttgaccggct ggctgaggtg 1860
atgcacctgc ctagcagtgc tatcccagcc gctctggccg aaatgtctgg cgattccgat 1920
cgttcggctt ctccggtcac caccgtgtgg actgtttcgc agttctttgc ccgtcacagc 1980
ggagggaatc accctgacca agtgcgctta gggaaaatta tcagcctttg tcaggtgatt 2040
gaggactgct gctgttccca gaacaaaacc aaccgggtca ccccggagga ggtcgcagca 2100
aagattgacc tgtacctccg tggtgcaaca aatcttgaag aatgcttggc caggcttgag 2160
aaagcgcgcc cgccacgcgt aatcgacacc tcctttgatt gggatgttgt gctccctggg 2220
gttgaggcgg caacccagac gatcaagctg ccccaggtca accagtgtcg tgctctggtc 2280
cctgttgtga ctcaaaagtc cttggacaac aactcggtcc ccctgaccgc cttttcactg 2340
gctaactact actaccgtgc gcaaggtgac gaagttcgtc accgtgaaag actaaccgcc 2400
gtgctctcca agttggaaaa ggttgttcga gaagaatatg ggctcatgcc aaccgagcct 2460
ggtccacggc ccacactgcc acgcgggctc gacgaactca aagaccagat ggaggaggac 2520
ttgctgaaac tggctaacgc ccagacgact tcggacatga tggcctgggc agtcgagcag 2580
gttgacctaa aaacttgggt caagaactac ccgcggtgga caccaccacc ccctccgcca 2640
aaagttcagc ctcgaaaaac gaagcctgtc aagagcttgc cggagagaaa gcctgtcccc 2700
gccccgcgca ggaaggttgg gtccgattgt ggcagcccgg tttcattagg cggcgatgtc 2760
cctaacagtt gggaagattt ggctgttagt agcccctttg atctcccgac cccacctgag 2820
ccggcaacac cttcaagtga gctggtgatt gtgtcctcac cgcaatgcat cttcaggccg 2880
gcgacaccct tgagtgagcc ggctccaatt cccgcacctc gcggaactgt gtctcgaccg 2940
gtgacaccct tgagtgagcc gatccctgtg cccgcaccgc ggcgtaagtt tcagcaggtg 3000
aaaagattga gttcggcggc ggcaatccca ccgtaccagg acgagcccct ggatttgtct 3060
gcttcctcac agactgaata tgaggcctct cccccagcac cgccgcagag cgggggcgtt 3120
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aacattaaac ctgcgtccgt gtcatcaagc agctccttgt ccagcgtgag aatcacacgc 3240
ccaaaatact cagctcaagc catcatcgac tcgggcgggc cctgcagtgg gcatctccaa 3300
gaggtaaagg aaacatgcct tagtgtcatg cgcgaggcat gtgatgcgac taagcttgat 3360
gaccctgcta cgcaggaatg gctttctcgc atgtgggatc gggtggacat gctgacttgg 3420
cgcaacacgt ctgtttacca ggcgatttgc accttagatg gcaggttaaa gttcctccca 3480
aaaatgatac tcgagacacc gccgccctat ccgtgtgagt ttgtgatgat gcctcacacg 3540
cctgcacctt ccgtaggtgc ggagagcgac cttaccattg gctcagttgc tactgaagat 3600
gttccacgca tcctcgagaa aatagaaaat gtcggcgaga tggccaacca gggacccttg 3660
gccttctccg aggataaacc ggtagatgac caacttgtca acgacccccg gatatcgtcg 3720
cggaggcctg acgagagcac atcagctccg tccgcaggca caggtggcgc cggctctttt 3780
accgatttgc cgccttcaga tggcgcggat gcggacgggg gggggccgtt tcggacggta 3840
aaaagaaaag ctgaaaggct ctttgaccaa ctgagccgtc aggtttttga cctcgtctcc 3900
catctccctg ttttcttctc acgccttttc taccctggcg gtggttattc tccgggtgat 3960
tggggttttg cagcttttac tctattgtgc ctctttttat gttacagtta cccagccttt 4020
ggtattgctc ccctcttggg tgtgttttct gggtcttctc ggcgcgttcg aatgggggtt 4080
tttggctgct ggttggcttt tgctgttggt ctgttcaagc ctgtgtccga cccagtcggc 4140
gctgcttgtg agtttgactc gccagagtgt agaaacatcc ttcattcttt tgagcttctc 4200
aaaccttggg accctgttcg cagccttgtt gtgggccccg tcggtctcgg tcttgccatt 4260
cttggcaggt tactgggcgg ggcacgctgc atctggcact ttttgcttag gcttggcatt 4320
gttgcagact gtatcttggc tggagcttac gtgctttctc aaggtaggtg taaaaagtgc 4380
tggggatctt gtataagaac tgctcctaat gaggtcgctt ttaacgtgtt tcctttcaca 4440
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gaccccattt ttctcgccac tgggtggcgc gggtgctggg ccggccgaag ccccattgag 4560
caaccctctg aaaaacccat cgcgtttgcc caattggatg aaaagaagat tacggctagg 4620
actgtggtcg cccagcctta tgaccccaac caagccgtaa agtgcttgcg ggtattgcag 4680
tcgggtgggg cgatggtggc taaggcggtc ccaaaagtgg tcaaggtttc cgctgttcca 4740
ttccgagccc ccttctttcc cactggagtg aaagttgacc ctgattgcag ggtcgtggtt 4800
gaccctgaca ctttcactgc agctctccgg tctggctact ccaccacaaa cctcgtcctt 4860
ggtgtagggg actttgccca gctgaatgga ttaaaaatca ggcaaatttc caagccttca 4920
gggggaggcc cacatctcat ggctgccctg catgttgcct gctcgatggc tctgcacatg 4980
cttgctggga tttatgtgac tgcggtgggt tcttgcggca ccggcaccaa cgacccgtgg 5040
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tgcatttccc aacacggcct taccctgccc ttgacagcac ttgtggcggg attcggtatt 5160
caagaaattg ccttggtcgt tttgattttt gtttccatcg gaggcatggc tcataggttg 5220
agctgtaagg ctgacatgct gtgtgttttg cttgcaattg ccagctatgt ttgggtacct 5280
cttacctggt tgctttgtgt gtttccttgc tggttgcgct gtttttcttt gcaccccctc 5340
accatcctat ggttggtgtt tttcttgatt tctgtgaata tgccttcagg aatcttggcc 5400
atggtgttgt tggtttctct ttggcttctt ggtcgttata ctaatgttgc tggccttgtc 5460
accccctacg acattcatca ttacaccagt ggcccccgcg gtgttgccgc cttggctacc 5520
gcaccagatg ggacctactt ggccgctgtc cgccgcgctg cgttgactgg ccgcaccatg 5580
ctgtttaccc cgtcccagct tgggtctctt cttgagggtg ctttcagaac tcgaaagccc 5640
tcactgaaca ccgtcaatgt gatcgggtcc tccatgggct ctggcggggt gtttaccatc 5700
gacgggaaag tcaagtgcgt aactgccgca catgtcctta cgggcaattc agctcgggtt 5760
tccggggtcg gcttcaatca aatgcttgac tttgacgtaa agggagattt cgctatagct 5820
gattgcccga attggcaagg ggctgccccc aagacccaat tctgcacgga tggatggact 5880
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gccttctgct tcaccgcatg tggcgattcc gggtccccag tgatcaccga ggccggtgag 6000
cttgtcggcg ttcacacggg atcgaataaa caaggggggg gcattgttac gcgcccctca 6060
ggccagtttt gtaatgtggc acccatcaag ctaagcgaat taagtgaatt ctttgctggg 6120
cctaaggtcc cgctcggtga tgtgaaggtc ggcagccaca taattaaaga cataagcgag 6180
gtgccttcag atctttgtgc cttgcttgct gccaaacctg aactggaagg aggcctctcc 6240
accgtccaac ttctttgtgt gttttttctc ctgtggagaa tgatgggaca tgcctggacg 6300
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caggcagtga tgaatttgag cacctatgca ttcctgcctc ggatgatggt tgtgacctca 6600
ccagtcccag tgatcacgtg tggtgtcgtg cacctacttg ccatcatttt gtacttgttt 6660
aagtaccgtg gcccgcacca tatccttgtt ggcgatggag tgttctctgc ggctttcttc 6720
ttgagatact ttgccgaggg aaagttgagg gaaggggtgt cgcaatcctg cggaatgaat 6780
catgagtctc tgactggtgc cctcgctatg agactcaatg acgaggactt ggatttcctt 6840
atgaaatgga ctgattttaa gtgctttgtt tctgcgtcca acatgaggaa tgcagcgggt 6900
caatttatcg aggctgccta tgctaaagca cttagagtag aactggccca gttggtgcag 6960
gttgataaag ttcgaggtac tttggccaaa cttgaagctt ttgctgatac cgtggcacct 7020
caactctcgc ccggtgacat tgttgtcgct ctcggccaca cgcctgttgg cagtatcttc 7080
gacctaaagg ttggtagcac caagcatacc ctccaagcca ttgagaccag agtccttgct 7140
gggtccaaaa tgaccgtggc gcgcgtcgtc gacccgaccc ccacgccccc acccgcaccc 7200
gtgcccatcc ccctcccacc gaaagttctg gagaatggcc ccaacgcttg gggggatgag 7260
gaccgtttga ataagaagaa gaggcgcagg atggaagccc tcggcatcta tgttatgggc 7320
gggaaaaagt accagaaatt ttgggacaag aattccggtg atgtgtttta tgaggaggtc 7380
cataataaca cagatgagtg ggagtgtctc agagttggcg accctgccga ctttgaccct 7440
gagaagggaa ctctgtgtgg acatgtcacc attgaaaaca aggcttacca tgtttacacc 7500
tccccatctg gtaagaagtt cttggtcccc gtcaacccag agaatggaag agttcaatgg 7560
gaagctgcaa agctttccgt ggagcaggcc ctaggtatga tgaatgtcga cggcgaactg 7620
actgccaaag aactggagaa actgaaaaga ataattgaca aactccaggg cctgactaag 7680
gagcagtgtt taaactgcta gccgccagcg acttgacccg ctgtggtcgc ggcggcttgg 7740
ttgttactga aacagcggta aaaatagtca aatttcacaa ccggaccttc accctgggac 7800
ctgtgaattt aaaagtggcc agtgaggttg agctaaaaga cgcggttgag cacaaccaac 7860
acccggttgc gagaccgatc gatggtggag ttgtgctcct gcgttccgcg gttccttcgc 7920
ttatagacgt cttgatctcc ggtgctgatg catctcccaa gttacttgcc catcacgggc 7980
cgggaaacac tgggatcgat ggcacgctct gggattttga gtccgaagcc actaaagagg 8040
aagtcgcact cagtgcgcaa ataatacagg cttgtgacat taggcgcggc gacgctcctg 8100
aaattggtct cccttacaag ctgtaccctg ttaggggtaa ccctgagcgg gtgaaaggag 8160
ttctgcagaa tacaaggttt ggagacatac cttacaaaac ccccagtgac actggaagcc 8220
cagtgcacgc ggctgcctgc cttacgccca acgccactcc ggtgactgat gggcgctccg 8280
tcttggccac gaccatgccc cccgggtttg agttatatgt accgaccata ccagcgtctg 8340
tccttgatta ccttgactct aggcctgact gccctaaaca gctgacagag cacggctgcg 8400
aagatgccgc actgaaagac ctctctaaat atgacttgtc cacccaaggc tttgttttac 8460
ctggagttct tcgccttgtg cggaaatacc tgtttgccca tgtaggtaag tgcccacccg 8520
ttcatcggcc ttctacttac cctgctaaga attctatggc tggaataaat gggaacaggt 8580
tcccaaccaa ggacattcag agcgtccctg aaatcgacgt tctgtgcgca caggctgtgc 8640
gagaaaactg gcaaactgtc accccttgta ctcttaagaa acagtattgc gggaagaaga 8700
agactaggac catactcggc accaataact tcatcgcact agcccaccga gcagtgttga 8760
gtggtgttac ccagggcttc atgaaaaagg cgtttaactc gcccatcgcc ctcggaaaga 8820
acaagtttaa ggagctacag actccggtcc tgggcaggtg ccttgaagct gatctcgcat 8880
cctgcgatcg atccacgcct gcaattgtcc gctggtttgc cgccaacctt ctttatgaac 8940
ttgcctgtgc tgaagagcat ctaccgtcgt acgtgctgaa ctgctgccac gacttactgg 9000
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cggacccaaa gaagacagca ataacagact cgccatcatt tctaggctgt agaataataa 9360
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aggcgagtaa tgtttctgaa tactatgcct cagcggctgc aatactcatg gacagctgtg 9480
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gtccagtcac aatctggtgt ggccatccag cgggttctgg ttcttgtagt gagtgcaaat 9780
cccctgtagg gaaaggcaca agccctttag acgaggtgct ggaacaagtc ccgtataagc 9840
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accaaactcg ccgcggatta gtctctgtca ggcgtggaat taggggaaat gaagttggac 9960
taccagacgg tgattatgct agcaccgcct tgctccctac ctgcaaagag atcaacatgg 10020
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tgagaattat ttacattctt ctgatctcct catgctttct tcttgccttt tctatgcttc 13560
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tcatgatagc acggctccac aaaaggtgct tttggcgttt tctattacct acacgccagt 14460
gatgatatat gccctaaagg tgagtcgcgg ccgactgcta gggcttctgc accttttgat 14520
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tctggcccct gcccaccacg ttgaaagtgc cgcacggttt catccgattg cggcaaatga 14760
taaccacgca tttgtcgtcc ggcgtcccgg ctccactacg gtcaacggca cattggtgcc 14820
cgggttaaaa agcctcgtgt tgggtggcag aaaagctgtt aaacagggag tggtaaacct 14880
tgtcaaatat gccaaataac aacggcaagc agcagaagag aaagaagggg gatggccagc 14940
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gcaagggacc gggaaagaaa aataagaaga aaaacccgga gaagccccat tttcctctag 15060
cgactgaaga tgatgtcaga catcacttta cccctagtga gcggcaattg tgtctgtcgt 15120
caatccagac cgcctttaat caaggcgctg ggacttgcac cctgtcagat tcagggagga 15180
taagttacac tgtggagttt agtttgccta cgcatcatac tgtgcgcctg atccgcgtca 15240
cagcatcacc ctcagcatga tgggctggca ttcttgaggc atctcagtgt ttgaattgga 15300
agaatgtgtg gtgaatggca ctgattgaca ttgtgcctct aagtcaccta ttcaattagg 15360
gcgaccgtgt gggggtgaga tttaattggc gagaaccatg cggccgaaat t 15411
<210> 29
<211> 15108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 整个Lelystad PRRSV 序列(GenBank: A26843.1)
<400> 29
gggtattccc cctacataca cgacacttct agtgtttgtg taccttggag gcgtgggtac 60
agccccgccc caccccttgg cccctgttct agcccaacag gtatccttct ctctcggggc 120
gagtgcgccg cctgctgctc ccttgcagcg ggaaggacct cccgagtatt tccggagagc 180
acctgcttta cgggatctcc accctttaac catgtctggg acgttctccc ggtgcatgtg 240
caccccggct gcccgggtat tttggaacgc cggccaagtc ttttgcacac ggtgtctcag 300
tgcgcggtct cttctctctc cagagcttca ggacactgac ctcggtgcag ttggcttgtt 360
ttacaagcct agggacaagc ttcactggaa agtccctatc ggcatccctc aggtggaatg 420
tactccatcc gggtgctgtt ggctctcagc tgttttccct ttggcgcgta tgacctccgg 480
caatcacaac ttcctccaac gacttgtgaa ggttgctgat gttttgtacc gtgacggttg 540
cttggcacct cgacaccttc gtgaactcca agtttacgag cgcggctgca actggtaccc 600
gatcacgggg cccgtgcccg ggatgggttt gtttgcgaac tccatgcacg tatccgacca 660
gccgttccct ggtgccaccc atgtgttgac taactcgcct ttgcctcaac aggcttgtcg 720
gcagccgttc tgtccatttg aggaggctca ttctagcgtg tacaggtgga agaaatttgt 780
ggttttcacg gactcctccc tcaacggtcg atctcgcatg atgtggacgc cggaatccga 840
tgattcagcc gccctggagg tactaccgcc tgagttagaa cgtcaggtcg aaatcctcat 900
tcggagtttt cctgctcatc accctgtcga cctggccgac tgggagctca ctgagtcccc 960
tgagaacggt ttttccttca acacgtctca ttcttgcggt caccttgtcc agaaccccga 1020
cgtgtttgat ggcaagtgct ggctctcctg ctttttgggc cagtcggtcg aagtgcgctg 1080
ccatgaggaa catctagctg acgccttcgg ttaccaaacc aagtggggcg tgcatggtaa 1140
gtacctccag cgcaggcttc aagttcgcgg cattcgtgct gtagtcgatc ctgatggtcc 1200
cattcacgtt gaagcgctgt cttgccccca gtcttggatc aggcacctga ctctggatga 1260
tgatgtcacc ccaggattcg ttcgcctgac atcccttcgc attgtgccga acacagagcc 1320
taccacttcc cggatctttc ggtttggagc gcataagtgg tatggcgctg ccggcaaacg 1380
ggctcgtgct aagcgtgccg ctaaaagtga gaaggattcg gctcccaccc ccaaggttgc 1440
cctgccggtc cccacctgtg gaattaccac ctactctcca ccgacagacg ggtcttgtgg 1500
ttggcatgtc cttgccgcca taatgaaccg gatgataaat ggtgacttca cgtcccctct 1560
gactcagtac aacagaccag aggatgattg ggcttctgat tatgatcttg ttcaggcgat 1620
tcaatgtcta cgactgcctg ctaccgtggt tcggaatcgc gcctgtccta acgccaagta 1680
ccttataaaa cttaacggag ttcactggga ggtagaggtg aggtctggaa tggctcctcg 1740
ctccctttct cgtgaatgtg tggttggcgt ttgctctgaa ggctgtgtcg caccgcctta 1800
tccagcagac gggctaccta aacgtgcact cgaggccttg gcgtctgctt acagactacc 1860
ctccgattgt gttagctctg gtattgctga ctttcttgct aatccacctc ctcaggaatt 1920
ctggaccctc gacaaaatgt tgacctcccc gtcaccagag cggtccggct tctctagttt 1980
gtataaatta ctattagagg ttgttccgca aaaatgcggt gccacggaag gggctttcat 2040
ctatgctgtt gagaggatgt tgaaggattg tccgagctcc aaacaggcca tggcccttct 2100
ggcaaaaatt aaagttccat cctcaaaggc cccgtctgtg tccctggacg agtgtttccc 2160
tacggatgtt ttagccgact tcgagccagc atctcaggaa aggccccaaa gttccggcgc 2220
tgctgttgtc ctgtgttcac cggatgcaaa agagttcgag gaagcagccc cggaagaagt 2280
tcaagagagt ggccacaagg ccgtccactc tgcactcctt gccgagggtc ctaacaatga 2340
gcaggtacag gtggttgccg gtgagcaact gaagctcggc ggttgtggtt tggcagtcgg 2400
gaatgctcat gaaggtgctc tggtctcagc tggtctaatt aacctggtag gcgggaattt 2460
gtccccctca gaccccatga aagaaaacat gctcaatagc cgggaagacg aaccactgga 2520
tttgtcccaa ccagcaccag cttccacaac gacccttgtg agagagcaaa cacccgacaa 2580
cccaggttct gatgccggtg ccctccccgt caccgttcga gaatttgtcc cgacggggcc 2640
tatactctgt catgttgagc actgcggcac ggagtcgggc gacagcagtt cgcctttgga 2700
tctatctgat gcgcaaaccc tggaccagcc tttaaatcta tccctggccg cttggccagt 2760
gagggccacc gcgtctgacc ctggctgggt ccacggtagg cgcgagcctg tctttgtaaa 2820
gcctcgaaat gctttctctg atggcgattc agcccttcag ttcggggagc tttctgaatc 2880
cagctctgtc atcgagtttg accggacaaa agatgctccg gtggttgacg cccctgtcga 2940
cttgacgact tcgaacgagg ccctctctgt agtcgatcct ttcgaatttg ccgaactcaa 3000
gcgcccgcgt ttctccgcac aagccttaat tgaccgaggc ggtccacttg ccgatgtcca 3060
tgcaaaaata aagaaccggg tatatgaaca gtgcctccaa gcttgtgagc ccggtagtcg 3120
tgcaacccca gccaccaggg agtggctcga caaaatgtgg gatagggtgg acatgaaaac 3180
ttggcgctgc acctcgcagt tccaagctgg tcgcattctt gcgtccctca aattcctccc 3240
tgacatgatt caagacacac cgcctcctgt tcccaggaag aaccgagcta gtgacaatgc 3300
cggcctgaag caactggtgg cacagtggga taaggaaatt gagtgtgacc cccccccaaa 3360
accggttggg ccagtgcttg accagatcgt ccctccgcct acggatatcc agcaagaaga 3420
tgtcaccccc tccgatgggc caccccatgc gccggatttt cctagtcgag tgagcacggg 3480
cgggagttgg aaaggcctta tgctttccgg cacccgtctc gcggggtcta tcagccagcg 3540
ccttatgaca tgggtttttg aagttttctc ccacctccca gcttttatgc tcacactttt 3600
ctcgccgcgg ggctctatgg ctccaggtga ttggttgttt gcaggtgtcg ttttacttgc 3660
tctcttgctc tgtcgttctt acccgatact cggatgcctt cccttattgg gtgtcttttc 3720
tggttctttg cggcgtgttc gtctgggtgt ttttggttct tggatggctt ttgctgtatt 3780
tttattctcg actccatcca acccagtcgg ttcttcttgt gaccacgatt cgccggagtg 3840
tcatgctgag cttttggctc ttgagcagcg ccaactttgg gaacctgtgc gcggccttgt 3900
ggtcggcccc tcaggcctct tatgtgtcat tcttggcaag ttactcggtg ggtcacgtta 3960
tctctggcat gttctcctac gtttatgcat gcttgcagat ttggcccttt ctcttgttta 4020
tgtggtgtcc caggggcgtt gtcacaagtg ttggggaaag tgtataagga cagctcctgc 4080
ggaggtggct cttaatgtat ttcctttctc gcgcgccacc cgtgtctctc ttgtatcctt 4140
gtgtgatcga ttccaaacgc caaaaggggt tgatcctgtg cacttggcaa cgggttggcg 4200
cgggtgctgg cgtggtgaga gccccatcca tcaaccacac caaaagccca tagcttatgc 4260
caatttggat gaaaagaaaa tgtctgccca aacggtggtt gctgtcccat acgatcccag 4320
tcaggctatc aaatgcctga aagttctgca ggcgggaggg gccatcgtgg accagcctac 4380
acctgaggtc gttcgtgtgt ccgagatccc cttctcagcc ccatttttcc caaaagttcc 4440
agtcaaccca gattgcaggg ttgtggtaga ttcggacact tttgtggctg cggttcgctg 4500
cggttactcg acagcacaac tggttctggg ccggggcaac tttgccaagt taaatcagac 4560
cccccccagg aactctatct ccaccaaaac gactggtggg gcctcttaca cccttgctgt 4620
ggctcaagtg tctgcgtgga ctcttgttca tttcatcctc ggtctttggt tcacatcacc 4680
tcaagtgtgt ggccgaggaa ccgctgaccc atggtgttca aatccttttt catatcctac 4740
ctatggcccc ggagttgtgt gctcctctcg actttgtgtg tctgccgacg gggtcaccct 4800
gccattgttc tcagccgtgg cacaactctc cggtagagag gtggggattt ttattttggt 4860
gctcgtctcc ttgactgctt tggcccaccg catggctctt aaggcagaca tgttagtggt 4920
cttttcggct ttttgtgctt acgcctggcc catgagctcc tggttaatct gcttctttcc 4980
tatactcttg aagtgggtta cccttcaccc tcttactatg ctttgggtgc actcattctt 5040
ggtgttttgt ctgccagcag ccggcatcct ctcactaggg ataactggcc ttctttgggc 5100
aattggccgc tttacccagg ttgccggaat tattacacct tatgacatcc accagtacac 5160
ctctgggcca cgtggtgcag ctgctgtggc cacagcccca gaaggcactt atatggccgc 5220
cgtccggaga gctgctttaa ctgggcgaac tttaatcttc accccgtctg cagttggatc 5280
ccttctcgaa ggtgctttca ggactcataa accctgcctt aacaccgtga atgttgtagg 5340
ctcttccctt ggttccggag gggttttcac cattgatggc agaagaactg tcgtcactgc 5400
tgcccatgtg ttgaacggcg acacagctag agtcaccggc gactcctaca accgcatgca 5460
cactttcaag accaatggtg attatgcctg gtcccatgct gatgactggc agggcgttgc 5520
ccctgtggtc aaggttgcga aggggtaccg cggtcgtgcc tactggcaaa catcaactgg 5580
tgtcgaaccc ggtatcattg gggaagggtt cgccttctgt tttactaact gcggcgattc 5640
ggggtcaccc gtcatctcag aatctggtga tcttattgga atccacaccg gttcaaacaa 5700
acttggttct ggtcttgtga caacccctga aggggagacc tgcaccatca aagaaaccaa 5760
gctctctgac ctttccagac attttgcagg cccaagcgtt cctcttgggg acattaaatt 5820
gagtccggcc atcatccctg atgtaacatc cattccgagt gacttggcat cgctcctagc 5880
ctccgtccct gtagtggaag gcggcctctc gaccgttcaa cttttgtgtg tctttttcct 5940
tctctggcgc atgatgggcc atgcctggac acccattgtt gccgtgggct tctttttgct 6000
gaatgaaatt cttccagcag ttttggtccg agccgtgttt tcttttgcac tctttgtgct 6060
tgcatgggcc accccctggt ctgcacaggt gttgatgatt agactcctca cggcatctct 6120
caaccgcaac aagctttctc tggcgttcta cgcactcggg ggtgtcgtcg gtttggcagc 6180
tgaaatcggg acttttgctg gcagattgtc tgaattgtct caagctcttt cgacatactg 6240
cttcttacct agggtccttg ctatgaccag ttgtgttccc accatcatca ttggtggact 6300
ccataccctc ggtgtgattc tgtggttatt caaataccgg tgcctccaca acatgctggt 6360
tggtgatggg agtttttcaa gcgccttctt cctacggtat tttgcagagg gtaatctcag 6420
aaaaggtgtt tcacagtcct gtggcatgaa taacgagtcc ctaacggctg ctttagcttg 6480
caagttgtca caggctgacc ttgatttttt gtccagctta acgaacttca agtgctttgt 6540
atctgcttca aacatgaaaa atgctgccgg ccagtacatt gaagcagcgt atgccaaggc 6600
cctgcgccaa gagttggcct ctctagttca gattgacaaa atgaaaggag ttttgtccaa 6660
gctcgaggcc tttgctgaaa cagccacccc gtcccttgac ataggtgacg tgattgttct 6720
gcttgggcaa catcctcacg gatccatcct cgatattaat gtggggactg aaaggaaaac 6780
tgtgtccgtg caagagaccc ggagcctagg cggctccaaa ttcagtgttt gtactgtcgt 6840
gtccaacaca cccgtggacg ccttgaccgg catcccactc cagacaccaa cccctctttt 6900
tgagaatggt ccgcgtcatc gcagcgagga agacgatctt aaagtcgaga ggatgaagaa 6960
acactgtgta tccctcggct tccacaacat caatggcaaa gtttactgca aaatttggga 7020
caagtctacc ggtgacacct tttacacgga tgattcccgg tacacccaag accatgcttt 7080
tcaggacagg tcagccgact acagagacag ggactatgag ggtgtgcaaa ccacccccca 7140
acagggattt gatccaaagt ctgaaacccc tgttggcact gttgtgatcg gcggtattac 7200
gtataacagg tatctgatca aaggtaagga ggttctggtc cccaagcctg acaactgcct 7260
tgaagctgcc aagctgtccc ttgagcaagc tctcgctggg atgggccaaa cttgcgacct 7320
tacagctgcc gaggtggaaa agctaaagcg catcattagt caactccaag gtttgaccac 7380
tgaacaggct ttaaactgtt agccgccagc ggcttgaccc gctgtggccg cggcggccta 7440
gttgtgactg aaacggcggt aaaaattata aaataccaca gcagaacttt caccttaggc 7500
cctttagacc taaaagtcac ttccgaggtg gaggtaaaga aatcaactga gcagggccac 7560
gctgttgtgg caaacttatg ttccggtgtc atcttgatga gacctcaccc accgtccctt 7620
gtcgacgttc ttctgaaacc cggacttgac acaatacccg gcattcaacc agggcatggg 7680
gccgggaata tgggcgtgga cggttctatt tgggattttg aaaccgcacc cacaaaggca 7740
gaactcgagt tatccaagca aataatccaa gcatgtgaag ttaggcgcgg ggacgccccg 7800
aacctccaac tcccttacaa gctctatcct gttagggggg atcctgagcg gcataaaggc 7860
cgccttatca ataccaggtt tggagattta ccttacaaaa ctcctcaaga caccaagtcc 7920
gcaatccacg cggcttgttg cctgcacccc aacggggccc ccgtgtctga tggtaaatcc 7980
acactaggta ccactcttca acatggtttc gagctttatg tccctactgt gccctatagt 8040
gtcatggagt accttgattc acgccctgac acccctttta tgtgtactaa acatggcact 8100
tccaaggctg ctgcagagga cctccaaaaa tacgacctat ccacccaagg atttgtcctg 8160
cctggggtcc tacgcctagt acgcagattc atctttggcc atattggtaa ggcgccgcca 8220
ttgttcctcc catcaaccta tcccgccaag aactctatgg cagggatcaa tggccagagg 8280
ttcccaacaa aggacgttca gagcatacct gaaattgatg aaatgtgtgc ccgcgctgtc 8340
aaggagaatt ggcaaactgt gacaccttgc accctcaaga aacagtactg ttccaagccc 8400
aaaaccagga ccatcctggg caccaacaac tttattgcct tggctcacag atcggcgctc 8460
agtggtgtca cccaggcatt catgaagaag gcttggaagt ccccaattgc cttggggaaa 8520
aacaaattca aggagctgca ttgcactgtc gccggcaggt gtcttgaggc cgacttggcc 8580
tcctgtgacc gcagcacccc cgccattgta agatggtttg ttgccaacct cctgtatgaa 8640
cttgcaggat gtgaagagta cttgcctagc tatgtgctta attgctgcca tgacctcgtg 8700
gcaacacagg atggtgcctt cacaaaacgc ggtggcctgt cgtccgggga ccccgtcacc 8760
agtgtgtcca acaccgtata ttcactggta atttatgccc agcacatggt attgtcggcc 8820
ttgaaaatgg gtcatgaaat tggtcttaag ttcctcgagg aacagctcaa gttcgaggac 8880
ctccttgaaa ttcagcctat gttggtatac tctgatgatc ttgtcttgta cgctgaaaga 8940
cccacatttc ccaattacca ctggtgggtc gagcaccttg acctgatgct gggtttcaga 9000
acggacccaa agaaaaccgt cataactgat aaacccagct tcctcggctg cagaattgag 9060
gcagggcgac agctagtccc caatcgcgac cgcatcctgg ctgctcttgc atatcacatg 9120
aaggcgcaga acgcctcaga gtattatgcg tctgctgccg caatcctgat ggattcatgt 9180
gcttgcattg accatgaccc tgagtggtat gaggacctca tctgcggtat tgcccggtgc 9240
gcccgccagg atggttatag cttcccaggt ccggcatttt tcatgtccat gtgggagaag 9300
ctgagaagtc ataatgaagg gaagaaattc cgccactgcg gcatctgcga cgccaaagcc 9360
gactatgcgt ccgcctgtgg gcttgatttg tgtttgttcc attcgcactt tcatcaacac 9420
tgccctgtca ctctgagctg cggtcaccat gccggttcaa aggaatgttc gcagtgtcag 9480
tcacctgttg gggctggcag atcccctctt gatgccgtgc taaaacaaat tccatacaaa 9540
cctcctcgta ctgtcatcat gaaggtgggt aataaaacaa cggccctcga tccggggagg 9600
taccagtccc gtcgaggtct cgttgcagtc aagaggggta ttgcaggcaa tgaagttgat 9660
ctttctgatg gggactacca agtggtgcct cttttgccga cttgcaaaga cataaacatg 9720
gtgaaggtgg cttgcaatgt actactcagc aagttcatag tagggccacc aggttccgga 9780
aagaccacct ggctactgag tcaagtccag gacgatgatg tcatttacac acccacccat 9840
cagactatgt ttgatatagt cagtgctctc aaagtttgca ggtattccat tccaggagcc 9900
tcaggactcc ctttcccacc acctgccagg tccgggccgt gggttaggct tattgccagc 9960
gggcacgtcc ctggccgagt atcatacctc gatgaggctg gatattgtaa tcatctggac 10020
attcttagac tgctttccaa aacacccctt gtgtgtttgg gtgaccttca gcaacttcac 10080
cctgtcggct ttgattccta ctgttatgtg ttcgatcaga tgcctcagaa gcagctgacc 10140
actatttaca gatttggccc taacatctgc gcacgcatcc agccttgtta cagggagaaa 10200
cttgaatcta aggctaggaa cactagggtg gtttttacca cccggcctgt ggcctttggt 10260
caggtgctga caccatacca taaagatcgc atcggctctg cgataaccat agattcatcc 10320
cagggggcca cctttgatat tgtgacattg catctaccat cgccaaagtc cctaaataaa 10380
tcccgagcac ttgtagccat cactcgggca agacacgggt tgttcattta tgaccctcat 10440
aaccagctcc aggagttttt caacttaacc cctgagcgca ctgattgtaa ccttgtgttc 10500
agccgtgggg atgagctggt agttctgaat gcggataatg cagtcacaac tgtagcgaag 10560
gcccttgaga caggtccatc tcgatttcga gtatcagacc cgaggtgcaa gtctctctta 10620
gccgcttgtt cggccagtct ggaagggagc tgtatgccac taccgcaagt ggcacataac 10680
ctggggtttt acttttcccc ggacagtcca acatttgcac ctctgccaaa agagttggcg 10740
ccacattggc cagtggttac ccaccagaat aatcgggcgt ggcctgatcg acttgtcgct 10800
agtatgcgcc caattgatgc ccgctacagc aagccaatgg tcggtgcagg gtatgtggtc 10860
agtatgcgcc caattgatgc ccgctacagc aagccaatgg tcggtgcagg gtatgtggtc 10920
aggggtgagc cccaggcctt gccagaaaca ctcgtttcaa cagggcgtat agccacagat 10980
tgtcgggagt atctcgacgc ggctgaggaa gaggcagcaa aagaactccc ccacgcattc 11040
attggcgatg tcaaaggtac cacggttggg gggtgtcatc acattacatc aaaataccta 11100
cctaggtccc tgcctaagga ctctgttgcc gtagttggag taagttcgcc cggcagggct 11160
gctaaagccg tgtgcactct caccgatgtg tacctccccg aactccggcc atatctgcaa 11220
cctgagacgg catcaaaatg ctggaaactc aaattagact tcagggacgt ccgactaatg 11280
gtctggaaag gagccaccgc ctatttccag ttggaagggc ttacatggtc ggcgctgccc 11340
gactatgcca ggtttattca gctgcccaag gatgccgttg tatacattga tccgtgtata 11400
ggaccggcaa cagccaaccg taaggtcgtg cgaaccacag actggcgggc cgacctggca 11460
gtgacaccgt atgattacgg tgcccagaac attttgacaa cagcctggtt cgaggacctc 11520
gggccgcagt ggaagatttt ggggttgcag ccctttaggc gagcatttgg ctttgaaaac 11580
actgaggatt gggcaatcct tgcacgccgt atgaatgacg gcaaggacta cactgactat 11640
aactggaact gtgttcgaga acgcccacac gccatctacg ggcgtgctcg tgaccatacg 11700
tatcattttg cccctggcac agaattgcag gtagagctag gtaaaccccg gctgccgcct 11760
gggcaagtgc cgtgaattcg gggtgatgca atggggtcac tgtggagtaa aatcagccag 11820
ctgttcgtgg acgccttcac tgagttcctt gttagtgtgg ttgatattgc cattttcctt 11880
gccatactgt ttgggttcac cgtcgcagga tggttactgg tctttcttct cagagtggtt 11940
tgctccgcgc ttctccgttc gcgctctgcc attcactctc ccgaactatc gaaggtccta 12000
tgaaggcttg ttgcccaact gcagaccgga tgtcccacaa tttgcagtca agcacccatt 12060
gggyatgttt tggcacatgc gagtttccca cttgattgat gagatggtct ctcgtcgcat 12120
ttaccagacc atggaacatt caggtcaagc ggcctggaag caggtggttg gtgaggccac 12180
tctcacgaag ctgtcagggc tcgatatagt tactcatttc caacacctgg ccgcagtgga 12240
ggcggattct tgccgctttc tcagctcacg actcgtgatg ctaaaaaatc ttgccgttgg 12300
caatgtgagc ctacagtaca acaccacgtt ggaccgcgtt gagctcatct tccccacgcc 12360
aggtacgagg cccaagttga ccgatttcag acaatggctc atcagtgtgc acgcttccat 12420
tttttcctct gtggcttcat ctgttacctt gttcatagtg ctttggcttc gaattccagc 12480
tctacgctat gtttttggtt tccattggcc cacggcaaca catcattcga gctgaccatc 12540
aactacacca tatgcatgcc ctgttctacc agtcaagcgg ctcgccaaag gctcgagccc 12600
ggtcgtaaca tgtggtgcaa aatagggcat gacaggtgtg aggagcgtga ccatgatgag 12660
ttgttaatgt ccatcccgtc cgggtacgga caactcaaac ttgagggtta ttatgcttgg 12720
ctggcttttt tgtccttttc ctacgcggcc caattccatc cggagttgtt cgggataggg 12780
aatgtgtcgc gcgtcttcgt ggacaagcga caccagttca tttgtgccga gcatgatgga 12840
cacaattcaa ccgtatctac cggacacaac atctccgcat tatatgcggc atattaccac 12900
caccaaatag acgggggcaa ttggttccat ttggaatggc tgcggccact cttttcttcc 12960
tggctggtgc tcaacatatc atggtttctg aggcgttcgc ctgtaagccc tgtttctcga 13020
cgcatctatc agatattgag accaacacga ccgcggctgc cggtttcatg gtccttcagg 13080
acatcaattg tttccgacct cacggggtct cagcagcgca agagaaaatt tccttcggaa 13140
agtcgtccca atgtcgtgaa gccgtcggta ctccccagta catcacgata acggctaacg 13200
tgaccgacga atcatacttg tacaacgcgg acctgctgat gctttctgcg tgccttttct 13260
acgcctcaga aatgagcgag aaaggcttca aagtcatctt tgggaatgtc tctggcgttg 13320
tttctgcttg tgtcaatttc acagattatg tggcccatgt gacccaacat acccagcagc 13380
atcatctggt aattgatcac attcggttgc tgcatttcct gacaccatct gcaatgaggt 13440
gggctacaac cattgcttgt ttgttcgcca ttctcttggc aatatgagat gttctcacaa 13500
attggggcgt ttcttgactc cgcactcttg cttctggtgg ctttttttgc tgtgtaccgg 13560
cttgtcctgg tcctttgccg atggcaacgg cgacagctcg acataccaat acatatataa 13620
cttgacgata tgcgagctga atgggaccga ctggttgtcc agccattttg gttgggcagt 13680
cgagaccttt gtgctttacc cggttgccac tcatatcctc tcactgggtt ttctcacaac 13740
aagccatttt tttgacgcgc tcggtctcgg cgctgtatcc actgcaggat ttgttggcgg 13800
gcggtacgta ctctgcagcg tctacggcgc ttgtgctttc gcagcgttcg tatgttttgt 13860
catccgtgct gctaaaaatt gcatggcctg ccgctatgcc cgtacccggt ttaccaactt 13920
cattgtggac gaccggggga gagttcatcg atggaagtct ccaatagtgg tagaaaaatt 13980
gggcaaagcc gaagtcgatg gcaacctcgt caccatcaaa catgtcgtcc tcgaaggggt 14040
taaagctcaa cccttgacga ggacttcggc tgagcaatgg gaggcctaga cgatttttgc 14100
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tagatggaag acgtacgcgc aggagcacag ggacgtgcca ggcccgcgcc cgcccacccg 12660
tcgtcaaagg cacgaccgtc agcggggtct ggtgtgggag gacgatgact cggcagacga 12720
cagcagcgtc ctggatttgg gagggagtgg caacccgttt gcgcaccttc gccccaggct 12780
ggggagaatg ttttaaaaaa aaaaaagcat gatgcaaaat aaaaaactca ccaaggccat 12840
ggcaccgagc gttggttttc ttgtattccc cttagtatgc ggcgcgcggc gatgtatgag 12900
gaaggtcctc ctccctccta cgagagtgtg gtgagcgcgg cgccagtggc ggcggcgctg 12960
ggttctccct tcgatgctcc cctggacccg ccgtttgtgc ctccgcggta cctgcggcct 13020
accgggggga gaaacagcat ccgttactct gagttggcac ccctattcga caccacccgt 13080
gtgtacctgg tggacaacaa gtcaacggat gtggcatccc tgaactacca gaacgaccac 13140
agcaactttc tgaccacggt cattcaaaac aatgactaca gcccggggga ggcaagcaca 13200
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cgcacttttt gagcaagcat gtccatcctt atatcgccca gcaataacac aggctggggc 14640
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tacagtgaag atgtagatat agaaacccca gacactcata tttcttacat gcccactatt 18480
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gttctggcgg gccaagcatc gcagttgaat gctgttgtag atttgcaaga cagaaacaca 18660
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accaaggtaa aacctaaaac aggtcaggaa aatggatggg aaaaagatgc tacagaattt 18900
tcagataaaa atgaaataag agttggaaat aattttgcca tggaaatcaa tctaaatgcc 18960
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cctacttccg cagccacagt gcgcagatta ggagcgccac ttctttttgt cacttgaaaa 21060
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ccaccgaaac cgaattctct tggaacaggc ggctattacc accacacctc gtaataacct 26100
taatccccgt agttggcccg ctgccctggt gtaccaggaa agtcccgctc ccaccactgt 26160
ggtacttccc agagacgccc aggccgaagt tcagatgact aactcagggg cgcagcttgc 26220
gggcggcttt cgtcacaggg tgcggtcgcc cgggcagggt ataactcacc tgacaatcag 26280
agggcgaggt attcagctca acgacgagtc ggtgagctcc tcgcttggtc tccgtccgga 26340
cgggacattt cagatcggcg gcgccggccg tccttcattc acgcctcgtc aggcaatcct 26400
aactctgcag acctcgtcct ctgagccgcg ctctggaggc attggaactc tgcaatttat 26460
tgaggagttt gtgccatcgg tctactttaa ccccttctcg ggacctcccg gccactatcc 26520
ggatcaattt attcctaact ttgacgcggt aaaggactcg gcggacggct acgactgaat 26580
gttaagtgga gaggcagagc aactgcgcct gaaacacctg gtccactgtc gccgccacaa 26640
gtgctttgcc cgcgactccg gtgagttttg ctactttgaa ttgcccgagg atcatatcga 26700
gggcccggcg cacggcgtcc ggcttaccgc ccagggagag cttgcccgta gcctgattcg 26760
ggagtttacc cagcgccccc tgctagttga gcgggacagg ggaccctgtg ttctcactgt 26820
gatttgcaac tgtcctaacc ttggattaca tcaagatctt tgttgccatc tctgtgctga 26880
gtataataaa tacagaaatt aaaatatact ggggctccta tcgccatcct gtaaacgcca 26940
ccgtcttcac ccgcccaagc aaaccaaggc gaaccttacc tggtactttt aacatctctc 27000
cctctgtgat ttacaacagt ttcaacccag acggagtgag tctacgagag aacctctccg 27060
agctcagcta ctccatcaga aaaaacacca ccctccttac ctgccgggaa cgtacgagtg 27120
cgtcaccggc cgctgcacca cacctaccgc ctgaccgtaa accagacttt ttccggacag 27180
acctcaataa ctctgtttac cagaacagga ggtgagctta gaaaaccctt agggtattag 27240
gccaaaggcg cagctactgt ggggtttatg aacaattcaa gcaactctac gggctattct 27300
aattcaggtt tctctagaaa tggacggaat tattacagag cagcgcctgc tagaaagacg 27360
cagggcagcg gccgagcaac agcgcatgaa tcaagagctc caagacatgg ttaacttgca 27420
ccagtgcaaa aggggtatct tttgtctggt aaagcaggcc aaagtcacct acgacagtaa 27480
taccaccgga caccgcctta gctacaagtt gccaaccaag cgtcagaaat tggtggtcat 27540
ggtgggagaa aagcccatta ccataactca gcactcggta gaaaccgaag gctgcattca 27600
ctcaccttgt caaggacctg aggatctctg cacccttatt aagaccctgt gcggtctcaa 27660
agatcttatt ccctttaact aataaaaaaa aataataaag catcacttac ttaaaatcag 27720
ttagcaaatt tctgtccagt ttattcagca gcacctcctt gccctcctcc cagctctggt 27780
attgcagctt cctcctggct gcaaactttc tccacaatct aaatggaatg tcagtttcct 27840
cctgttcctg tccatccgca cccactatct tcatgttgtt gcagatgaag cgcgcaagac 27900
cgtctgaaga taccttcaac cccgtgtatc catatgacac ggaaaccggt cctccaactg 27960
tgccttttct tactcctccc tttgtatccc ccaatgggtt tcaagagagt ccccctgggg 28020
tactctcttt gcgcctatcc gaacctctag ttacctccaa tggcatgctt gcgctcaaaa 28080
tgggcaacgg cctctctctg gacgaggccg gcaaccttac ctcccaaaat gtaaccactg 28140
tgagcccacc tctcaaaaaa accaagtcaa acataaacct ggaaatatct gcacccctca 28200
cagttacctc agaagcccta actgtggctg ccgccgcacc tctaatggtc gcgggcaaca 28260
cactcaccat gcaatcacag gccccgctaa ccgtgcacga ctccaaactt agcattgcca 28320
cccaaggacc cctcacagtg tcagaaggaa agctagccct gcaaacatca ggccccctca 28380
ccaccaccga tagcagtacc cttactatca ctgcctcacc ccctctaact actgccactg 28440
gtagcttggg cattgacttg aaagagccca tttatacaca aaatggaaaa ctaggactaa 28500
agtacggggc tcctttgcat gtaacagacg acctaaacac tttgaccgta gcaactggtc 28560
caggtgtgac tattaataat acttccttgc aaactaaagt tactggagcc ttgggttttg 28620
attcacaagg caatatgcaa cttaatgtag caggaggact aaggattgat tctcaaaaca 28680
gacgccttat acttgatgtt agttatccgt ttgatgctca aaaccaacta aatctaagac 28740
taggacaggg ccctcttttt ataaactcag cccacaactt ggatattaac tacaacaaag 28800
gcctttactt gtttacagct tcaaacaatt ccaaaaagct tgaggttaac ctaagcactg 28860
ccaaggggtt gatgtttgac gctacagcca tagccattaa tgcaggagat gggcttgaat 28920
ttggttcacc taatgcacca aacacaaatc ccctcaaaac aaaaattggc catggcctag 28980
aatttgattc aaacaaggct atggttccta aactaggaac tggccttagt tttgacagca 29040
caggtgccat tacagtagga aacaaaaata atgataagct aactttgtgg accacaccag 29100
ctccatctcc taactgtaga ctaaatgcag agaaagatgc taaactcact ttggtcttaa 29160
caaaatgtgg cagtcaaata cttgctacag tttcagtttt ggctgttaaa ggcagtttgg 29220
ctccaatatc tggaacagtt caaagtgctc atcttattat aagatttgac gaaaatggag 29280
tgctactaaa caattccttc ctggacccag aatattggaa ctttagaaat ggagatctta 29340
ctgaaggcac agcctataca aacgctgttg gatttatgcc taacctatca gcttatccaa 29400
aatctcacgg taaaactgcc aaaagtaaca ttgtcagtca agtttactta aacggagaca 29460
aaactaaacc tgtaacacta accattacac taaacggtac acaggaaaca ggagacacaa 29520
ctccaagtgc atactctatg tcattttcat gggactggtc tggccacaac tacattaatg 29580
aaatatttgc cacatcctct tacacttttt catacattgc ccaagaataa agaatcgttt 29640
gtgttatgtt tcaacgtgtt tatttttcaa ttgcagaaaa tttcgaatca tttttcattc 29700
agtagtatag ccccaccacc acatagctta tacagatcac cgtaccttaa tcaaactcac 29760
agaaccctag tattcaacct gccacctccc tcccaacaca cagagtacac agtcctttct 29820
ccccggctgg ccttaaaaag catcatatca tgggtaacag acatattctt aggtgttata 29880
ttccacacgg tttcctgtcg agccaaacgc tcatcagtga tattaataaa ctccccgggc 29940
agctcactta agttcatgtc gctgtccagc tgctgagcca caggctgctg tccaacttgc 30000
ggttgcttaa cgggcggcga aggagaagtc cacgcctaca tgggggtaga gtcataatcg 30060
tgcatcagga tagggcggtg gtgctgcagc agcgcgcgaa taaactgctg ccgccgccgc 30120
tccgtcctgc aggaatacaa catggcagtg gtctcctcag cgatgattcg caccgcccgc 30180
agcataaggc gccttgtcct ccgggcacag cagcgcaccc tgatctcact taaatcagca 30240
cagtaactgc agcacagcac cacaatattg ttcaaaatcc cacagtgcaa ggcgctgtat 30300
ccaaagctca tggcggggac cacagaaccc acgtggccat cataccacaa gcgcaggtag 30360
attaagtggc gacccctcat aaacacgctg gacataaaca ttacctcttt tggcatgttg 30420
taattcacca cctcccggta ccatataaac ctctgattaa acatggcgcc atccaccacc 30480
atcctaaacc agctggccaa aacctgcccg ccggctatac actgcaggga accgggactg 30540
gaacaatgac agtggagagc ccaggactcg taaccatgga tcatcatgct cgtcatgata 30600
tcaatgttgg cacaacacag gcacacgtgc atacacttcc tcaggattac aagctcctcc 30660
cgcgttagaa ccatatccca gggaacaacc cattcctgaa tcagcgtaaa tcccacactg 30720
cagggaagac ctcgcacgta actcacgttg tgcattgtca aagtgttaca ttcgggcagc 30780
agcggatgat cctccagtat ggtagcgcgg gtttctgtct caaaaggagg tagacgatcc 30840
ctactgtacg gagtgcgccg agacaaccga gatcgtgttg gtcgtagtgt catgccaaat 30900
ggaacgccgg acgtagtcat atttcctgaa gcaaaaccag gtgcgggcgt gacaaacaga 30960
tctgcgtctc cggtctcgcc gcttagatcg ctctgtgtag tagttgtagt atatccactc 31020
tctcaaagca tccaggcgcc ccctggcttc gggttctatg taaactcctt catgcgccgc 31080
tgccctgata acatccacca ccgcagaata agccacaccc agccaaccta cacattcgtt 31140
ctgcgagtca cacacgggag gagcgggaag agctggaaga accatgtttt tttttttatt 31200
ccaaaagatt atccaaaacc tcaaaatgaa gatctattaa gtgaacgcgc tcccctccgg 31260
tggcgtggtc aaactctaca gccaaagaac agataatggc atttgtaaga tgttgcacaa 31320
tggcttccaa aaggcaaacg gccctcacgt ccaagtggac gtaaaggcta aacccttcag 31380
ggtgaatctc ctctataaac attccagcac cttcaaccat gcccaaataa ttctcatctc 31440
gccaccttct caatatatct ctaagcaaat cccgaatatt aagtccggcc attgtaaaaa 31500
tctgctccag agcgccctcc accttcagcc tcaagcagcg aatcatgatt gcaaaaattc 31560
aggttcctca cagacctgta taagattcaa aagcggaaca ttaacaaaaa taccgcgatc 31620
ccgtaggtcc cttcgcaggg ccagctgaac ataatcgtgc aggtctgcac ggaccagcgc 31680
ggccacttcc ccgccaggaa ccttgacaaa agaacccaca ctgattatga cacgcatact 31740
cggagctatg ctaaccagcg tagccccgat gtaagctttg ttgcatgggc ggcgatataa 31800
aatgcaaggt gctgctcaaa aaatcaggca aagcctcgcg caaaaaagaa agcacatcgt 31860
agtcatgctc atgcagataa aggcaggtaa gctccggaac caccacagaa aaagacacca 31920
tttttctctc aaacatgtct gcgggtttct gcataaacac aaaataaaat aacaaaaaaa 31980
catttaaaca ttagaagcct gtcttacaac aggaaaaaca acccttataa gcataagacg 32040
gactacggcc atgccggcgt gaccgtaaaa aaactggtca ccgtgattaa aaagcaccac 32100
cgacagctcc tcggtcatgt ccggagtcat aatgtaagac tcggtaaaca catcaggttg 32160
attcacatcg gtcagtgcta aaaagcgacc gaaatagccc gggggaatac atacccgcag 32220
gcgtagagac aacattacag cccccatagg aggtataaca aaattaatag gagagaaaaa 32280
cacataaaca cctgaaaaac cctcctgcct aggcaaaata gcaccctccc gctccagaac 32340
aacatacagc gcttccacag cggcagccat aacagtcagc cttaccagta aaaaagaaaa 32400
cctattaaaa aaacaccact cgacacggca ccagctcaat cagtcacagt gtaaaaaagg 32460
gccaagtgca gagcgagtat atataggact aaaaaatgac gtaacggtta aagtccacaa 32520
aaaacaccca gaaaaccgca cgcgaaccta cgcccagaaa cgaaagccaa aaaacccaca 32580
acttcctcaa atcgtcactt ccgttttccc acgttacgtc acttcccatt ttaagaaaac 32640
tacaattccc aacacataca agttactccg ccctaaaacc tacgtcaccc gccccgttcc 32700
cacgccccgc gccacgtcac aaactccacc ccctcattat catattggct tcaatccaaa 32760
ataaggtata ttattgatga tgttaattaa tttaaatccg catgcgatat cgagctctcc 32820
cgggaattcg gatctgcgac gcgaggctgg atggccttcc ccattatgat tcttctcgct 32880
tccggcggca tcgggatgcc cgcgttgcag gccatgctgt ccaggcaggt agatgacgac 32940
catcagggac agcttcacgg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 33000
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 33060
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 33120
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 33180
ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 33240
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 33300
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 33360
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 33420
tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 33480
gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 33540
ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 33600
cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 33660
ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatca atctaaagta 33720
tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 33780
cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 33840
tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 33900
cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 33960
ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 34020
gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgn tgcaggcatc gtggtgtcac 34080
gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 34140
gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 34200
gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 34260
tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 34320
aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc 34380
cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 34440
caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 34500
cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 34560
ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 34620
aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 34680
tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 34740
tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 34800
ttcgtcttca aggatccgaa ttcccgggag agctcgatat cgcatgcgga tttaaattaa 34860
ttaa 34864
<210> 31
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PRRSV gp5a
<400> 31
Met Phe Lys Tyr Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Val Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Phe Phe Val Val Tyr Arg Ala Val Leu Ser Cys Cys Ala Arg
20 25 30
Gln Arg Gln Gln Gln Gln Gln Leu Ser Tyr Ser Val Asp Leu
35 40 45
<210> 32
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV M (基质蛋白)
<400> 32
Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro Gln
1 5 10 15
Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile Tyr
20 25 30
Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu Leu
35 40 45
Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Ala His
50 55 60
Phe Gln Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val Ala
65 70 75 80
Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile Thr
85 90 95
Ser Arg Cys Arg Leu Cys Leu Leu Gly Arg Lys Tyr Ile Leu Ala Pro
100 105 110
Ala His His Val Glu Ser Ala Ala Arg Phe His Pro Ile Ala Ala Asn
115 120 125
Asp Asn His Ala Phe Val Val Arg Arg Pro Gly Ser Thr Thr Val Asn
130 135 140
Gly Thr Leu Val Pro Gly Leu Lys Ser Leu Val Leu Gly Gly Arg Lys
145 150 155 160
Ala Val Lys Gln Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala Lys
165 170
<210> 33
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV N (核衣壳蛋白)
<400> 33
Met Pro Asn Asn Asn Gly Lys Gln Gln Lys Arg Lys Lys Gly Asp Gly
1 5 10 15
Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Met Leu Gly Lys Ile Ile Ala Gln
20 25 30
Gln Asn Gln Ser Arg Gly Lys Gly Pro Gly Lys Lys Asn Lys Lys Lys
35 40 45
Asn Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Thr Glu Asp Asp Val Arg
50 55 60
His His Phe Thr Pro Ser Glu Arg Gln Leu Cys Leu Ser Ser Ile Gln
65 70 75 80
Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Cys Thr Leu Ser Asp Ser Gly
85 90 95
Arg Ile Ser Tyr Thr Val Glu Phe Ser Leu Pro Thr His His Thr Val
100 105 110
Arg Leu Ile Arg Val Thr Ala Ser Pro Ser Ala
115 120
<210> 34
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ABO40192.1 PRRSV gp2
<400> 34
Met Lys Trp Gly Leu Cys Lys Ala Phe Ser Thr Lys Leu Ala Asn Phe
1 5 10 15
Leu Trp Met Leu Ser Arg Asn Phe Trp Cys Pro Leu Leu Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe Trp Pro Phe Cys Leu Ala Ser Gln Ser Gln Val Gly Trp Trp
35 40 45
Ser Ser Val Ser Asp Trp Phe Ala Pro Arg Tyr Ser Val Arg Ala Leu
50 55 60
Pro Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Ala Phe Leu Ser
65 70 75 80
Gln Cys Gln Val Asp Ile Pro Thr Trp Gly Thr Lys His Pro Leu Gly
85 90 95
Met Phe Trp His His Lys Val Ser Thr Leu Ile Asp Glu Met Val Ser
100 105 110
Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala Trp Lys
115 120 125
Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu Ser Arg Ile Ser Ser Leu Asp Val
130 135 140
Val Ala His Phe Gln His Leu Ala Ala Ile Glu Ala Glu Thr Cys Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Pro Met Leu His Asn Leu Arg Met Thr Gly
165 170 175
Ser Asn Val Thr Ile Val Tyr Asn Ser Thr Leu Glu Gln Val Val Ala
180 185 190
Ile Phe Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Lys Leu His Asp Phe Gln Gln
195 200 205
Trp Leu Ile Ala Val His Ser Ser Ile Phe Ser Ser Val Ala Ala Ser
210 215 220
Cys Thr Leu Phe Val Val Leu Trp Leu Arg Ile Pro Met Leu Arg Thr
225 230 235 240
Val Phe Gly Phe His Trp Leu Gly Ala Ile Phe Leu Ser Asn Ser Gln
245 250 255
<210> 35
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ACF93748.1 PRRSV gp2
<400> 35
Met Lys Trp Gly Leu Cys Lys Ala Ser Leu Thr Lys Leu Ala Asn Phe
1 5 10 15
Leu Trp Met Leu Ser Arg Asn Phe Trp Cys Pro Leu Leu Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe Trp Pro Phe Cys Leu Ala Ser Pro Ser Pro Val Gly Trp Trp
35 40 45
Ser Phe Ala Ser Asp Trp Phe Ala Pro Arg Tyr Ser Val Arg Ala Leu
50 55 60
Pro Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Ala Phe Leu Ser
65 70 75 80
Gln Cys Gln Val Asp Ile Pro Thr Trp Gly Phe Lys His Pro Leu Gly
85 90 95
Met Leu Trp His His Lys Val Ser Thr Leu Ile Asp Glu Met Val Ser
100 105 110
Arg Arg Met Tyr Arg Thr Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala Trp Lys
115 120 125
Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu Ser Arg Ile Ser Gly Leu Asp Val
130 135 140
Val Ala His Phe Gln His Leu Ala Ala Ile Glu Ala Glu Thr Cys Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Pro Met Leu His Asn Leu Arg Met Thr Gly
165 170 175
Ser Asn Val Thr Ile Val Tyr Asn Ser Thr Ser Asn Gln Val Phe Ala
180 185 190
Ile Phe Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Lys Arg His Asp Phe Gln Gln
195 200 205
Trp Leu Ile Ala Val His Ser Ser Ile Phe Ser Ser Val Ala Ala Ser
210 215 220
Cys Thr Leu Phe Val Val Leu Trp Leu Arg Ile Pro Met Leu Arg Ser
225 230 235 240
Val Phe Gly Phe Arg Trp Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Asn Ser Arg
245 250 255
<210> 36
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AHA83141.1 PRRSV gp2
<400> 36
Met Lys Trp Gly Pro Tyr Lys Ala Phe Leu Thr Lys Leu Ala Asn Phe
1 5 10 15
Leu Trp Met Leu Ser Arg Ser Ser Trp Cys Pro Leu Leu Ile Ser Leu
20 25 30
Tyr Phe Trp Pro Phe Cys Leu Ala Ser Pro Ser Pro Val Gly Trp Trp
35 40 45
Ser Phe Ala Ser Asp Trp Phe Ala Pro Arg Tyr Ser Val Arg Ala Leu
50 55 60
Pro Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Ala Phe Leu Ser
65 70 75 80
Gln Cys Gln Val Asp Ile Pro Thr Trp Gly Thr Lys His Pro Leu Gly
85 90 95
Met Phe Trp His His Lys Val Ser Thr Leu Ile Asp Glu Met Val Ser
100 105 110
Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala Trp Lys
115 120 125
Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu Ser Arg Ile Ser Ser Leu Asp Val
130 135 140
Val Ala His Phe Gln His Leu Ala Ala Ile Glu Ala Glu Thr Cys Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Pro Met Leu His Asn Leu Arg Met Thr Gly
165 170 175
Ser Asn Val Thr Ile Val Tyr Asn Ser Thr Leu Ser Gln Val Phe Ala
180 185 190
Ile Phe Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Lys Leu His Asp Phe Gln Gln
195 200 205
Trp Leu Ile Ala Val His Ser Ser Ile Phe Ser Ser Val Ala Ala Ser
210 215 220
Cys Thr Leu Phe Val Val Leu Trp Leu Arg Val Pro Ile Leu His Thr
225 230 235 240
Val Phe Gly Phe Arg Trp Leu Gly Ala Ile Phe Leu Ser Asn Ser Gln
245 250 255
<210> 37
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAA01838.1 Lelystad PRRSV gp2
<400> 37
Met Gln Trp Gly His Cys Gly Val Lys Ser Ala Ser Cys Ser Trp Thr
1 5 10 15
Pro Ser Leu Ser Ser Leu Leu Val Trp Leu Ile Leu Pro Phe Ser Leu
20 25 30
Pro Tyr Cys Leu Gly Ser Pro Ser Gln Asp Gly Tyr Trp Ser Phe Phe
35 40 45
Ser Glu Trp Phe Ala Pro Arg Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Phe Thr
50 55 60
Leu Pro Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Gly Leu Leu Pro Asn Cys Arg
65 70 75 80
Pro Asp Val Pro Gln Phe Ala Val Lys His Pro Leu Gly Met Phe Trp
85 90 95
His Met Arg Val Ser His Leu Ile Asp Glu Met Val Ser Arg Arg Ile
100 105 110
Tyr Gln Thr Met Glu His Ser Gly Gln Ala Ala Trp Lys Gln Val Val
115 120 125
Gly Glu Ala Thr Leu Thr Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ile Val Thr His
130 135 140
Phe Gln His Leu Ala Ala Val Glu Ala Asp Ser Cys Arg Phe Leu Ser
145 150 155 160
Ser Arg Leu Val Met Leu Lys Asn Leu Ala Val Gly Asn Val Ser Leu
165 170 175
Gln Tyr Asn Thr Thr Leu Asp Arg Val Glu Leu Ile Phe Pro Thr Pro
180 185 190
Gly Thr Arg Pro Lys Leu Thr Asp Phe Arg Gln Trp Leu Ile Ser Val
195 200 205
His Ala Ser Ile Phe Ser Ser Val Ala Ser Ser Val Thr Leu Phe Ile
210 215 220
Val Leu Trp Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Tyr Val Phe Gly Phe His
225 230 235 240
Trp Pro Thr Ala Thr His His Ser Ser
245
<210> 38
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAE74522.1 gp2
<400> 38
Met Gln Trp Gly Pro Cys Lys Ala Phe Leu Thr Arg Ser Val Asn Phe
1 5 10 15
Leu Trp Met Leu Ser Arg Ser Ser Trp Cys Pro Leu Leu Ile Ser Ser
20 25 30
Tyr Phe Trp Pro Phe Cys Leu Ala Ser Pro Leu Pro Ala Gly Trp Trp
35 40 45
Ser Phe Ala Ser Asp Trp Phe Ala Pro Arg Tyr Ser Val Arg Ala Leu
50 55 60
Pro Phe Thr Leu Ser Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Ala Phe Leu Ser
65 70 75 80
Gln Cys Gln Val Asp Ile Pro Ala Trp Gly Thr Arg His Pro Leu Gly
85 90 95
Met Leu Trp His His Lys Val Ser Thr Leu Ile Asp Glu Met Val Ser
100 105 110
Arg Arg Met Tyr Arg Ile Met Glu Lys Ala Gly Gln Ala Ala Trp Lys
115 120 125
Gln Val Val Ser Glu Ala Thr Leu Ser Arg Ile Ser Gly Leu Asp Val
130 135 140
Val Ala His Phe Gln His Leu Ala Ala Ile Glu Ala Glu Thr Cys Lys
145 150 155 160
Tyr Leu Ala Ser Arg Leu Pro Met Leu His Asn Leu Arg Ile Thr Gly
165 170 175
Ser Asn Val Thr Ile Val His Asn Ser Thr Leu Asn Gln Val Phe Ala
180 185 190
Ile Phe Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Lys Leu His Asp Phe Gln Gln
195 200 205
Trp Leu Ile Ala Val His Ser Ser Ile Ser Ser Ser Val Ala Ala Ser
210 215 220
Cys Thr Leu Phe Val Val Leu Trp Leu Arg Met Pro Met Leu Arg Ser
225 230 235 240
Val Phe Gly Phe Arg Trp Leu Gly Ala Ile Phe Pro Ser Ser Ser Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAB54503.1 PRRSV gp2
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (107)..(107)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 39
Met Gln Trp Gly His Cys Gly Val Lys Ser Ala Ser Cys Ser Trp Thr
1 5 10 15
Pro Ser Leu Ser Ser Leu Leu Val Trp Leu Ile Leu Xaa Phe Ser Leu
20 25 30
Pro Tyr Cys Leu Gly Ser Pro Ser Gln Asp Gly Tyr Trp Ser Phe Phe
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Ser Glu Trp Phe Ala Pro Arg Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Phe Thr
50 55 60
Leu Pro Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Gly Leu Leu Pro Asn Cys Arg
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Pro Asp Val Pro Gln Phe Ala Val Lys His Pro Leu Xaa Met Phe Trp
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His Met Arg Val Ser His Leu Ile Asp Glu Xaa Val Ser Arg Arg Ile
100 105 110
Tyr Gln Thr Met Glu His Ser Gly Gln Ala Ala Trp Lys Gln Val Val
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Gly Glu Ala Thr Leu Thr Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ile Val Thr His
130 135 140
Phe Gln His Leu Ala Ala Val Glu Ala Asp Ser Cys Arg Phe Leu Ser
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Ser Arg Leu Val Met Leu Lys Asn Leu Ala Val Gly Asn Val Ser Leu
165 170 175
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Gly Thr Arg Pro Lys Leu Thr Asp Phe Arg Gln Trp Leu Ile Ser Val
195 200 205
His Ala Ser Ile Phe Ser Ser Val Ala Ser Ser Val Thr Leu Phe Ile
210 215 220
Val Leu Trp Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Tyr Val Phe Gly Phe His
225 230 235 240
Trp Pro Thr Ala Thr His His Ser Ser
245
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<213> 人工序列
<220>
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Leu Tyr Ser Leu Cys Cys Ala Val Val Ala Gly Ser Asn Thr Thr Tyr
20 25 30
Cys Phe Trp Phe Pro Leu Val Arg Gly Asn Phe Ser Phe Glu Leu Thr
35 40 45
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50 55 60
Glu Ala Tyr Glu Pro Gly Arg Ser Leu Trp Cys Arg Ile Gly Tyr Asp
65 70 75 80
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85 90 95
Gly Leu Ser Ser Glu Gly His Leu Thr Ser Val Tyr Ala Trp Leu Ala
100 105 110
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115 120 125
Ile Gly Asn Val Ser Arg Val Tyr Val Asp Ile Glu His Gln Leu Ile
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Ile Ser Ala Val Phe Gln Thr Tyr Tyr Gln His Gln Val Asp Gly Gly
165 170 175
Asn Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu
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Val Leu Asn Val Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Ala Asn His Val
195 200 205
Ser Val Arg Val Leu Gln Thr Leu Arg Pro Thr Pro Pro Gln Arg Gln
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Ala Leu Leu Ser Ser Lys Thr Ser Val Ala Leu Gly Ile Ala Thr Arg
225 230 235 240
Pro Leu Arg Arg Phe Ala Lys Ser Leu Ser Ala Val Arg Arg
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<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Met Ala Asn Ser Cys Thr Phe Leu Tyr Ile Phe Leu Cys Cys Ser Phe
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Leu Tyr Ser Phe Cys Cys Ala Val Val Ala Gly Ser Asn Ala Thr Tyr
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Cys Phe Trp Phe Pro Leu Val Arg Gly Asn Phe Ser Phe Glu Leu Thr
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Val Asn Tyr Thr Val Cys Pro Pro Cys Leu Thr Arg Gln Ala Ala Ala
50 55 60
Glu Ala Tyr Glu Pro Gly Arg Ser Leu Trp Cys Arg Ile Gly His Asp
65 70 75 80
Arg Cys Gly Glu Asp Asp His Asp Glu Leu Gly Phe Val Val Pro Ser
85 90 95
Gly Leu Ser Ser Glu Gly His Leu Thr Ser Ala Tyr Ala Trp Leu Ala
100 105 110
Ser Leu Ser Phe Ser Tyr Thr Ala Gln Phe His Pro Glu Ile Phe Gly
115 120 125
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Cys Ala Val His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Leu Pro His His Asp Asn
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Ile Ser Ala Val Leu Gln Thr Tyr Tyr Gln His Gln Val Asp Gly Gly
165 170 175
Asn Trp Phe His Leu Glu Trp Val Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu
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Val Leu Asn Val Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Ala Ser His Val
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Pro Leu Arg Arg Phe Ala Lys Ser Leu Ser Ala Ala Arg Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Met Ala Asn Ser Cys Thr Phe Leu His Ile Leu Leu Cys Cys Ser Phe
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Leu Tyr Ser Phe Cys Cys Val Val Val Thr Asp Ala Asn Ala Thr Phe
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Cys Phe Trp Phe Pro Leu Val Arg Gly Asn Phe Ser Phe Glu Leu Met
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Gly Leu Ser Lys Glu Val His Leu Thr Ser Val Tyr Ala Trp Leu Ala
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Ile Gly Asn Val Ser Lys Val Tyr Val Asp Ile Asn His Gln Leu Ile
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Cys Ala Val His Asp Gly Gln Asn Thr Thr Leu Pro Arg His Asp Asn
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Ile Ser Ala Val Phe Gln Thr Tyr Tyr Gln His Gln Val Asp Gly Gly
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Asn Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu
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Ile Ser Leu Ser Ser Arg Thr Ser Ala Ala Leu Gly Met Ala Thr Arg
225 230 235 240
Pro Leu Arg Arg Phe Ala Lys Ser Leu Ser Ala Ala Arg Arg
245 250
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAA01839.1 PRRSV gp3
<400> 43
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50 55 60
Gln Arg Leu Glu Pro Gly Arg Asn Met Trp Cys Lys Ile Gly His Asp
65 70 75 80
Arg Cys Glu Glu Arg Asp His Asp Glu Leu Leu Met Ser Ile Pro Ser
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Gly Tyr Gly Gln Leu Lys Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Trp Leu Ala Phe
100 105 110
Leu Ser Phe Ser Tyr Ala Ala Gln Phe His Pro Glu Leu Phe Gly Ile
115 120 125
Gly Asn Val Ser Arg Val Phe Val Asp Lys Arg His Gln Phe Ile Cys
130 135 140
Ala Glu His Asp Gly His Asn Ser Thr Val Ser Thr Gly His Asn Ile
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Ser Ala Leu Tyr Ala Ala Tyr Tyr His His Gln Ile Asp Gly Gly Asn
165 170 175
Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Leu Phe Ser Ser Trp Leu Val
180 185 190
Leu Asn Ile Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Val Ser Pro Val Ser
195 200 205
Arg Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Pro Thr Arg Pro Arg Leu Pro Val
210 215 220
Ser Trp Ser Phe Arg Thr Ser Ile Val Ser Asp Leu Thr Gly Ser Gln
225 230 235 240
Gln Arg Lys Arg Lys Phe Pro Ser Glu Ser Arg Pro Asn Val Val Lys
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Pro Ser Val Leu Pro Ser Thr Ser Arg
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<210> 44
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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Met Ala His Gln Cys Ala Arg Phe His Phe Phe Leu Cys Gly Phe Ile
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Cys Phe Trp Phe Pro Leu Ala His Gly Asn Thr Ser Phe Glu Leu Thr
35 40 45
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Gln Arg Leu Glu Pro Gly Arg Asn Met Trp Cys Lys Ile Gly His Asp
65 70 75 80
Arg Cys Glu Glu Arg Asp Gln Asp Glu Leu Leu Met Ser Ile Pro Ser
85 90 95
Gly Tyr Asp Asn Leu Lys Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Trp Leu Ala Phe
100 105 110
Leu Ser Phe Ser Tyr Ala Ala Gln Phe His Pro Glu Leu Phe Gly Ile
115 120 125
Gly Asn Val Ser Arg Val Phe Val Asp Lys Trp His Gln Phe Ile Cys
130 135 140
Ala Glu His Asp Gly Ser Asn Ser Thr Val Ser Thr Gly His Asn Ile
145 150 155 160
Ser Ala Leu Tyr Ala Ala Tyr Tyr His His Gln Ile Asp Gly Gly Asn
165 170 175
Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu Val
180 185 190
Leu Asn Ile Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Val Ser Pro Val Ser
195 200 205
Arg Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Pro Thr Arg Pro Gln Leu Pro Val
210 215 220
Ser Trp Ser Phe Arg Thr Ser Ile Val Ser Asp Leu Met Arg Ser Gln
225 230 235 240
Gln Arg Lys Gly Lys Phe Pro Ser Gly Ser Arg Pro Asn Ala Val Lys
245 250 255
Pro Ser Ala Leu Pro Asn Ile Ser Arg
260 265
<210> 45
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAE74526.1 PRRSV gp3
<400> 45
Met Ala Asn Ser Cys Thr Phe Leu Tyr Ile Phe Leu Cys Cys Ser Phe
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Leu Tyr Ser Phe Cys Cys Ala Val Val Ala Gly Ser Asn Ala Thr Tyr
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Cys Phe Trp Phe Pro Leu Val Arg Gly Asn Phe Ser Phe Glu Leu Thr
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Val Asn Tyr Thr Val Cys Pro Pro Cys Leu Thr Arg Gln Ala Ala Thr
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Glu Ala Tyr Glu Pro Gly Arg Ser Leu Trp Cys Arg Ile Gly Tyr Asp
65 70 75 80
Arg Cys Gly Glu Asp Asp His Asp Glu Leu Gly Phe Val Val Pro Ser
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Gly Leu Ser Ser Glu Gly His Leu Thr Ser Val Tyr Ala Trp Leu Ala
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Phe Leu Ser Phe Ser Tyr Thr Ala Gln Phe His Pro Glu Ile Phe Gly
115 120 125
Ile Gly Asn Val Ser Gln Val Tyr Val Asp Ile Arg His Gln Phe Ile
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Cys Ala Val His Asp Gly Gln Asn Ala Thr Leu Pro Arg His Asp Asn
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Ile Ser Ala Val Phe Gln Thr Tyr Tyr Gln His Gln Val Asp Gly Gly
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Asn Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu
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Val Leu Asn Val Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Ala Ser His Val
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Ser Val Arg Val Leu Gln Thr Leu Arg Pro Thr Pro Pro Gln Arg Gln
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Ala Leu Leu Ser Ser Lys Thr Ser Val Ala Leu Gly Ile Ala Thr Arg
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Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn Val Ser Gly Ile Val Ala Val Cys
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Ser Leu Val Val Asp His Val Arg Leu Leu His Phe Met Thr Pro Glu
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Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu Ala Cys Leu Phe Ala Ile Leu Leu
165 170 175
Ala Ile
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<213> 人工序列
<220>
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Ser Leu Met Val Asp His Val Arg Leu Leu His Phe Met Thr Pro Glu
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Thr Met Arg Trp Ala Thr Val Leu Ala Cys Leu Phe Ala Ile Leu Leu
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Ala Ile
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAE74533.1 PRRSV gp4
<400> 48
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100 105 110
Gly Phe Lys Val Val Phe Gly Asn Val Ser Gly Ile Val Ala Val Cys
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<213> 人工序列
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165 170 175
Phe Ala Ile Leu Leu Ala Ile
180
<210> 50
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ABH73415.1 PRRSV gp4
<400> 50
Met Ala Ala Ala Ile Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln His Ile Met
1 5 10 15
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Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Ala Ala Ala Gly Phe Met Val Leu Gln
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Ile Phe Gly Asn Val Ser Gly Val
115 120 125
Val Ser Ala Cys Val Asn Phe Thr Asp Tyr Val Ala His Val Thr Gln
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His Thr Gln Gln His His Leu Val Ile Asp His Ile Arg Leu Leu His
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Phe Ala Ile Leu Leu Ala Ile
180
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<211> 178
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AAE68462.1 PRRSV gp4
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> AED17148.1 PRRSV E
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His Pro Glu Gln Leu Gln Lys Ile Leu
65 70
<210> 55
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AGX46783.1 PRRSV E
<400> 55
Met Gly Ser Met Gln Ser Leu Phe Asp Lys Ile Gly Gln Leu Phe Val
1 5 10 15
Asp Ala Phe Thr Glu Phe Leu Val Ser Ile Val Asp Ile Ile Ile Phe
20 25 30
Leu Ala Ile Leu Phe Gly Phe Thr Ile Ala Gly Trp Leu Val Val Phe
35 40 45
Cys Ile Arg Leu Val Cys Ser Ala Leu Arg Arg Pro Ala His Glu Gln
50 55 60
Leu Gln Lys Ile Leu
65
<210> 56
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AED17156.1 PRRSV E
<400> 56
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Ser Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Ala Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Leu Val Phe Leu Leu Arg
35 40 45
Val Val Cys Ser Ala Leu Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile His Ser Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Val Leu
65 70
<210> 57
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AIS76359.1 PRRSV E
<400> 57
Met Gly Ser Met Gln Ser Leu Phe Asp Lys Ile Gly Gln Leu Phe Val
1 5 10 15
Asp Ala Phe Thr Glu Phe Leu Val Ser Ile Val Asp Ile Ile Ile Phe
20 25 30
Leu Ala Ile Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Val Val Phe
35 40 45
Cys Ile Arg Leu Val Phe Ser Ala Val Leu Arg Ala Arg Ser Thr Val
50 55 60
His Pro Glu Gln Leu Gln Lys Ile Leu
65 70
<210> 58
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ABU49670.1 PRRSV E
<400> 58
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Ser Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Val Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Gly Leu Leu Val Phe Phe Leu Arg
35 40 45
Val Val Cys Ser Ala Ile Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile His Ser Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Ile Leu
65 70
<210> 59
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VR2332 PRRSV gp5
<400> 59
Met Leu Glu Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Val Leu Ala Asn Ala Ser
20 25 30
Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys
35 40 45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp Trp Ala Val
50 55 60
Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Ala Leu Val Thr Val
85 90 95
Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr
100 105 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile Arg Phe Ala
115 120 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ala Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
130 135 140
Leu Leu Asp Thr Lys Gly Arg Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145 150 155 160
Ile Glu Lys Arg Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu
165 170 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Ile Thr Arg Val
180 185 190
Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Pro
195 200
<210> 60
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 60
Met Arg Cys Ser His Lys Leu Gly Arg Phe Leu Thr Pro His Ser Cys
1 5 10 15
Phe Trp Trp Leu Phe Leu Leu Cys Thr Gly Leu Ser Trp Ser Phe Ala
20 25 30
Asp Gly Asn Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr
35 40 45
Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Ser His Phe Gly Trp
50 55 60
Ala Val Glu Thr Phe Val Leu Tyr Pro Val Ala Thr His Ile Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Phe Asp Ala Leu Gly Leu Gly
85 90 95
Ala Val Ser Thr Ala Gly Phe Val Gly Gly Arg Tyr Val Leu Cys Ser
100 105 110
Val Tyr Gly Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe Val Cys Phe Val Ile Arg
115 120 125
Ala Ala Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe Thr
130 135 140
Asn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Val His Arg Trp Lys Ser Pro
145 150 155 160
Ile Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Asp Gly Asn Leu Val
165 170 175
Thr Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Gln Pro Leu Thr
180 185 190
Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala
195 200
<210> 61
<211> 200
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ADA15222.1 PRRSV gp5
<400> 61
Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Gln Leu Pro Phe
1 5 10 15
Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Cys Phe Ala Ala Leu Val Asn Ala Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Ser Ser Gln Leu Gln Ser Ile Tyr Asn Leu Thr Ile Cys
35 40 45
Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Asn Lys Asn Phe Asp Trp Ala Val
50 55 60
Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly
65 70 75 80
Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Ala Val Gly Leu Ile Thr Val
85 90 95
Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Gly Arg Ser Val Leu Ser Ser Val Tyr
100 105 110
Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Thr
115 120 125
Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe
130 135 140
Leu Leu Asp Ser Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile
145 150 155 160
Ile Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Asp Gly His Leu Ile Asp Leu
165 170 175
Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Ala Ala Thr Pro Val Thr Lys Val
180 185 190
Ser Ala Glu Gln Trp Cys Arg Pro
195 200
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<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
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Met Phe Lys Tyr Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Val Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Phe Phe Val Val Tyr Arg Ala Val Leu Ser Cys Cys Ala Arg
20 25 30
Gln Arg Gln Gln Gln Gln Gln Leu Ser Tyr Ser Val Asp Leu
35 40 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AGK45334.1 PRRSV gp5a
<400> 63
Met Phe Lys Tyr Val Gly Glu Leu Leu Asp Arg Gly Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Phe Phe Val Val Tyr Arg Ala Val Leu Phe Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
Gln Arg Gln Arg Lys Gln Gln Leu Leu Leu Pro Val Asp Leu Gln Leu
35 40 45
Asp Ala Met
50
<210> 64
<211> 51
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AFU75332.1 PRRSV gp5a
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Met Phe Lys Tyr Val Gly Glu Met Leu Asp Arg Gly Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ile Ala Phe Phe Val Val Tyr Arg Ala Val Leu Phe His Cys Ala Arg
20 25 30
Arg Arg Gln Arg Gln Gln Gln Leu Ser Ser Ala Ile Asp Leu Gln Leu
35 40 45
Asp Ala Met
50
<210> 65
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> AGW23843.1 PRRSV gp5a
<400> 65
Met Phe Lys Tyr Val Gly Glu Met Leu Asp Arg Gly Leu Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ile Ala Phe Phe Val Val Tyr Arg Ala Val Leu Val Cys Cys Ala Arg
20 25 30
Gln Ser Arg Lys Arg Gln Gln Leu Pro Leu Thr Val Asp Ile
35 40 45
<210> 66
<211> 152
<212> PRT
<213> PRRSV VR2332
<400> 66
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly
20 25 30
Gly Ser Ser Asn Asp Ser Ser Ser His Leu Gln Leu Ile Tyr Asn Leu
35 40 45
Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Asn Lys Phe Asp
50 55 60
Trp Ala Val Glu Ser Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val
65 70 75 80
Ser Tyr Gly Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Ala Leu
85 90 95
Val Thr Val Ser Thr Ala Gly Phe Val His Gly Arg Tyr Val Leu Ser
100 105 110
Ser Ile Tyr Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Thr Cys Phe Val Ile
115 120 125
Arg Phe Ala Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp
130 135 140
Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
145 150
<210> 67
<211> 459
<212> DNA
<213> PRRSV VR2332
<400> 67
atggatgcta tgaaacgggg actgtgctgc gtgctgctgc tctgtggggc tgtcttcgtg 60
tcaccttctg attataagga cgatgacgat aaaggaggaa gtagcaatga cagctcctct 120
cacctgcagc tcatctacaa cctgaccctc tgcgagctga atggaacaga ctggctcgct 180
aacaagttcg attgggcagt ggaatccttc gtcatctttc ccgtgctgac tcacattgtg 240
agctatgggg ccctgaccac atcccatttc ctggatacag tggccctcgt gactgtctct 300
accgctggct ttgtccatgg acgctacgtg ctgtcaagta tctatgcagt ctgcgccctg 360
gccgctctca cctgtttcgt gattagattt gcaaagctga agcatacaaa gaagcggcag 420
atttacactg acattgagat gaatagactg ggcaaatga 459
<210> 68
<211> 155
<212> PRT
<213> PRRSV VR2332
<400> 68
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Ser Ser Leu Asp Asp Phe Cys His Asp Ser Thr Ala Pro
35 40 45
Gln Lys Val Leu Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Val Met Ile
50 55 60
Tyr Ala Leu Lys Val Ser Arg Gly Arg Leu Leu Gly Leu Leu His Leu
65 70 75 80
Leu Ile Phe Leu Asn Cys Ala Phe Thr Phe Gly Tyr Met Thr Phe Ala
85 90 95
His Phe Gln Ser Thr Asn Lys Val Ala Leu Thr Met Gly Ala Val Val
100 105 110
Ala Leu Leu Trp Gly Val Tyr Ser Ala Ile Glu Thr Trp Lys Phe Ile
115 120 125
Thr Ser Arg Cys Arg Leu Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile
130 135 140
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
145 150 155
<210> 69
<211> 468
<212> DNA
<213> PRRSV VR2332
<400> 69
atggatgcta tgaaacgggg actgtgctgc gtgctgctgc tctgtggggc tgtcttcgtg 60
tcaccttacc cctatgacgt gccagattac gcaggaggaa gtgggtcaag cctcgacgat 120
ttttgtcacg attcaacagc acctcagaaa gtcctcctcg ccttcagcat cacatacact 180
ccagtcatga tctacgccct gaaggtgagt aggggcagac tgctcggact gctccacctg 240
ctcattttcc tgaactgcgc attcactttt ggctatatga ccttcgccca ttttcagtcc 300
accaacaagg tggctctgac aatgggagca gtggtcgctc tgctctgggg ggtctacagc 360
gccatcgaga catggaagtt tattacttcc cgatgccgac tgaagctgaa gcatacaaag 420
aagcggcaga tttacactga cattgagatg aatagactgg gcaaatga 468
<210> 70
<211> 747
<212> DNA
<213> PRRSV
<400> 70
atgcaatggg gtcactgtgg agtaaaatca gccagctgtt cgtggacgcc ttcactgagt 60
tccttgttag tgtggttgat attgccattt tccttgccat actgtttggg ttcaccgtcg 120
caggatggtt actggtcttt cttctcagag tggtttgctc cgcgcttctc cgttcgcgct 180
ctgccattca ctctcccgaa ctatcgaagg tcctatgaag gcttgttgcc caactgcaga 240
ccggatgtcc cacaatttgc agtcaagcac ccattgggta tgttttggca catgcgagtt 300
tcccacttga ttgatgagat ggtctctcgt cgcatttacc agaccatgga acattcaggt 360
caagcggcct ggaagcaggt ggttggtgag gccactctca cgaagctgtc agggctcgat 420
atagttactc atttccaaca cctggccgca gtggaggcgg attcttgccg ctttctcagc 480
tcacgactcg tgatgctaaa aaatcttgcc gttggcaatg tgagcctaca gtacaacacc 540
acgttggacc gcgttgagct catcttcccc acgccaggta cgaggcccaa gttgaccgat 600
ttcagacaat ggctcatcag tgtgcacgct tccatttttt cctctgtggc ttcatctgtt 660
accttgttca tagtgctttg gcttcgaatt ccagctctac gctatgtttt tggtttccat 720
tggcccacgg caacacatca ttcgagc 747
<210> 71
<211> 249
<212> PRT
<213> PRRSV
<400> 71
Met Gln Trp Gly His Cys Gly Val Lys Ser Ala Ser Cys Ser Trp Thr
1 5 10 15
Pro Ser Leu Ser Ser Leu Leu Val Trp Leu Ile Leu Pro Phe Ser Leu
20 25 30
Pro Tyr Cys Leu Gly Ser Pro Ser Gln Asp Gly Tyr Trp Ser Phe Phe
35 40 45
Ser Glu Trp Phe Ala Pro Arg Phe Ser Val Arg Ala Leu Pro Phe Thr
50 55 60
Leu Pro Asn Tyr Arg Arg Ser Tyr Glu Gly Leu Leu Pro Asn Cys Arg
65 70 75 80
Pro Asp Val Pro Gln Phe Ala Val Lys His Pro Leu Gly Met Phe Trp
85 90 95
His Met Arg Val Ser His Leu Ile Asp Glu Met Val Ser Arg Arg Ile
100 105 110
Tyr Gln Thr Met Glu His Ser Gly Gln Ala Ala Trp Lys Gln Val Val
115 120 125
Gly Glu Ala Thr Leu Thr Lys Leu Ser Gly Leu Asp Ile Val Thr His
130 135 140
Phe Gln His Leu Ala Ala Val Glu Ala Asp Ser Cys Arg Phe Leu Ser
145 150 155 160
Ser Arg Leu Val Met Leu Lys Asn Leu Ala Val Gly Asn Val Ser Leu
165 170 175
Gln Tyr Asn Thr Thr Leu Asp Arg Val Glu Leu Ile Phe Pro Thr Pro
180 185 190
Gly Thr Arg Pro Lys Leu Thr Asp Phe Arg Gln Trp Leu Ile Ser Val
195 200 205
His Ala Ser Ile Phe Ser Ser Val Ala Ser Ser Val Thr Leu Phe Ile
210 215 220
Val Leu Trp Leu Arg Ile Pro Ala Leu Arg Tyr Val Phe Gly Phe His
225 230 235 240
Trp Pro Thr Ala Thr His His Ser Ser
245
<210> 72
<211> 795
<212> DNA
<213> PRRSV
<400> 72
atggctcatc agtgtgcacg cttccatttt ttcctctgtg gcttcatctg ttaccttgtt 60
catagtgctt tggcttcgaa ttccagctct acgctatgtt tttggtttcc attggcccac 120
ggcaacacat cattcgagct gaccatcaac tacaccatat gcatgccctg ttctaccagt 180
caagcggctc gccaaaggct cgagcccggt cgtaacatgt ggtgcaaaat agggcatgac 240
aggtgtgagg agcgtgacca tgatgagttg ttaatgtcca tcccgtccgg gtacgacaac 300
ctcaaacttg agggttatta tgcttggctg gcttttttgt ccttttccta cgcggcccaa 360
ttccatccgg agttgttcgg gatagggaat gtgtcgcgcg tcttcgtgga caagcgacac 420
cagttcattt gtgccgagca tgatggacac aattcaaccg tatctaccgg acacaacatc 480
tccgcattat atgcggcata ttaccaccac caaatagacg ggggcaattg gttccatttg 540
gaatggctgc ggccactctt ttcttcctgg ctggtgctca acatatcatg gtttctgagg 600
cgttcgcctg taagccctgt ttctcgacgc atctatcaga tattgagacc aacacgaccg 660
cggctgccgg tttcatggtc cttcaggaca tcaattgttt ccgacctcac ggggtctcag 720
cagcgcaaga gaaaatttcc ttcggaaagt cgtcccaatg tcgtgaagcc gtcggtactc 780
cccagtacat cacga 795
<210> 73
<211> 158
<212> PRT
<213> PRRSV
<400> 73
Met Ala His Gln Cys Ala Arg Phe His Phe Phe Leu Cys Gly Phe Ile
1 5 10 15
Cys Tyr Leu Val His Ser Ala Leu Ala Ser Asn Ser Ser Ser Thr Leu
20 25 30
Cys Phe Trp Phe Pro Leu Ala His Gly Asn Thr Ser Phe Glu Leu Thr
35 40 45
Ile Asn Tyr Thr Ile Cys Met Pro Cys Ser Thr Ser Gln Ala Ala Arg
50 55 60
Gln Arg Leu Glu Pro Gly Arg Asn Met Trp Cys Lys Ile Gly His Asp
65 70 75 80
Arg Cys Glu Glu Arg Asp His Asp Glu Leu Leu Met Ser Ile Pro Ser
85 90 95
Gly Tyr Asp Asn Leu Lys Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Trp Leu Ala Phe
100 105 110
Leu Ser Phe Ser Tyr Ala Ala Gln Phe His Pro Glu Leu Phe Gly Ile
115 120 125
Gly Asn Val Ser Arg Val Phe Val Asp Lys Arg His Gln Phe Ile Cys
130 135 140
Ala Glu His Asp Gly His Asn Ser Thr Val Ser Thr Gly His
145 150 155
<210> 74
<211> 549
<212> DNA
<213> PRRSV
<400> 74
atggctgcgg ccactctttt cttcctggct ggtgctcaac atatcatggt ttctgaggcg 60
ttcgcctgta agccctgttt ctcgacgcat ctatcagata ttgagaccaa cacgaccgcg 120
gctgccggtt tcatggtcct tcaggacatc aattgtttcc gacctcacgg ggtctcagca 180
gcgcaagaga aaatttcctt cggaaagtcg tcccaatgtc gtgaagccgt cggtactccc 240
cagtacatca cgataacggc taacgtgacc gacgaatcat acttgtacaa cgcggacctg 300
ctgatgcttt ctgcgtgcct tttctacgcc tcagaaatga gcgagaaagg cttcaaagtc 360
atctttggga atgtctctgg cgttgtttct gcttgtgtca atttcacaga ttatgtggcc 420
catgtgaccc aacataccca gcagcatcat ctggtaattg atcacattcg gttgctgcat 480
ttcctgacac catctgcaat gaggtgggct acaaccattg cttgtttgtt cgccattctc 540
ttggcaata 549
<210> 75
<211> 183
<212> PRT
<213> PRRSV
<400> 75
Met Ala Ala Ala Thr Leu Phe Phe Leu Ala Gly Ala Gln His Ile Met
1 5 10 15
Val Ser Glu Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Thr His Leu Ser
20 25 30
Asp Ile Glu Thr Asn Thr Thr Ala Ala Ala Gly Phe Met Val Leu Gln
35 40 45
Asp Ile Asn Cys Phe Arg Pro His Gly Val Ser Ala Ala Gln Glu Lys
50 55 60
Ile Ser Phe Gly Lys Ser Ser Gln Cys Arg Glu Ala Val Gly Thr Pro
65 70 75 80
Gln Tyr Ile Thr Ile Thr Ala Asn Val Thr Asp Glu Ser Tyr Leu Tyr
85 90 95
Asn Ala Asp Leu Leu Met Leu Ser Ala Cys Leu Phe Tyr Ala Ser Glu
100 105 110
Met Ser Glu Lys Gly Phe Lys Val Ile Phe Gly Asn Val Ser Gly Val
115 120 125
Val Ser Ala Cys Val Asn Phe Thr Asp Tyr Val Ala His Val Thr Gln
130 135 140
His Thr Gln Gln His His Leu Val Ile Asp His Ile Arg Leu Leu His
145 150 155 160
Phe Leu Thr Pro Ser Ala Met Arg Trp Ala Thr Thr Ile Ala Cys Leu
165 170 175
Phe Ala Ile Leu Leu Ala Ile
180
<210> 76
<211> 603
<212> DNA
<213> PRRSV
<400> 76
atgagatgtt ctcacaaatt ggggcgtttc ttgactccgc actcttgctt ctggtggctt 60
tttttgctgt gtaccggctt gtcctggtcc tttgccgatg gcaacggcga cagctcgaca 120
taccaataca tatataactt gacgatatgc gagctgaatg ggaccgactg gttgtccagc 180
cattttggtt gggcagtcga gacctttgtg ctttacccgg ttgccactca tatcctctca 240
ctgggttttc tcacaacaag ccattttttt gacgcgctcg gtctcggcgc tgtatccact 300
gcaggatttg ttggcgggcg gtacgtactc tgcagcgtct acggcgcttg tgctttcgca 360
gcgttcgtat gttttgtcat ccgtgctgct aaaaattgca tggcctgccg ctatgcccgt 420
acccggttta ccaacttcat tgtggacgac cgggggagag ttcatcgatg gaagtctcca 480
atagtggtag aaaaattggg caaagccgaa gtcgatggca acctcgtcac catcaaacat 540
gtcgtcctcg aaggggttaa agctcaaccc ttgacgagga cttcggctga gcaatgggag 600
gcc 603
<210> 77
<211> 201
<212> PRT
<213> PRRSV
<400> 77
Met Arg Cys Ser His Lys Leu Gly Arg Phe Leu Thr Pro His Ser Cys
1 5 10 15
Phe Trp Trp Leu Phe Leu Leu Cys Thr Gly Leu Ser Trp Ser Phe Ala
20 25 30
Asp Gly Asn Gly Asp Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr
35 40 45
Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ser Ser His Phe Gly Trp
50 55 60
Ala Val Glu Thr Phe Val Leu Tyr Pro Val Ala Thr His Ile Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Phe Asp Ala Leu Gly Leu Gly
85 90 95
Ala Val Ser Thr Ala Gly Phe Val Gly Gly Arg Tyr Val Leu Cys Ser
100 105 110
Val Tyr Gly Ala Cys Ala Phe Ala Ala Phe Val Cys Phe Val Ile Arg
115 120 125
Ala Ala Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe Thr
130 135 140
Asn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Val His Arg Trp Lys Ser Pro
145 150 155 160
Ile Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Asp Gly Asn Leu Val
165 170 175
Thr Ile Lys His Val Val Leu Glu Gly Val Lys Ala Gln Pro Leu Thr
180 185 190
Arg Thr Ser Ala Glu Gln Trp Glu Ala
195 200
<210> 78
<211> 519
<212> DNA
<213> PRRSV
<400> 78
atgggaggcc tagacgattt ttgcaacgat cctatcgccg cacaaaagct cgtgctagcc 60
tttagcatca catacacacc tataatgata tacgccctta aggtgtcacg cggccgactc 120
ctggggctgt tgcacatcct aatatttctg aactgttcct ttacattcgg atacatgaca 180
tatgtgcatt ttcaatccac caaccgtgtc gcacttaccc tgggggctgt tgtcgccctt 240
ctgtggggtg tttacagctt cacagagtca tggaagttta tcacttccag atgcagattg 300
tgttgccttg gccggcgata cattctggcc cctgcccatc acgtagaaag tgctgcaggt 360
ctccattcaa tctcagcgtc tggtaaccga gcatacgctg tgagaaagcc cggactaaca 420
tcagtgaacg gcactctagt accaggactt cggagcctcg tgctgggcgg caaacgagct 480
gttaaacgag gagtggttaa cctcgtcaag tatggccgg 519
<210> 79
<211> 173
<212> PRT
<213> PRRSV
<400> 79
Met Gly Gly Leu Asp Asp Phe Cys Asn Asp Pro Ile Ala Ala Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Leu Ala Phe Ser Ile Thr Tyr Thr Pro Ile Met Ile Tyr Ala
20 25 30
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Ile Asn Tyr Thr Ile Cys Met Pro Cys Ser Thr Ser His Ala Ala Arg
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Arg Cys Glu Glu Arg Asp His Asp Glu Leu Leu Met Pro Ile Pro Pro
85 90 95
Gly Tyr Asp Asn Leu Lys Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Trp Leu Ala Phe
100 105 110
Leu Ser Phe Ser Tyr Ala Ala Gln Phe His Pro Glu Leu Phe Gly Ile
115 120 125
Gly Asn Val Ser Arg Val Phe Val Asp Lys Gln His Gln Phe Ile Cys
130 135 140
Ala Glu His Asp Gly Gln Asn Ser Thr Val Ser Thr Gly His Asn Ile
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Ser Ala Leu Tyr Ala Ala Tyr Tyr His His Gln Ile Asp Gly Gly Asn
165 170 175
Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Leu Phe Ser Ser Trp Leu Val
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Leu Asn Ile Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Val Ser Pro Val Ser
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Arg Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gln Thr Arg Pro Arg Leu Pro Val
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Ser Trp Ser Phe Arg Thr Ser Ile Val Ser Asp Leu Thr Arg Ser Gln
225 230 235 240
Gln Arg Lys Arg Lys Phe Pro Ser Glu Ser Arg Pro Asn Val Val Lys
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Pro Ser Val Leu Pro Ser Thr Ser Arg
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<210> 95
<211> 265
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
<220>
<221> misc_feature
<222> (60)..(60)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 95
Met Ala His Gln Cys Ala Arg Phe His Phe Phe Leu Cys Gly Phe Ile
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Cys Tyr Leu Val His Ser Thr Leu Ala Ser Asn Ser Ser Phe Thr Leu
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Lys Cys Glu Glu Arg Asp His Asn Glu Leu Leu Met Pro Ile Pro Pro
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Gly Tyr Asp Asn Leu Lys Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Trp Leu Ala Phe
100 105 110
Leu Ser Phe Ser Tyr Ala Ala Gln Phe His Pro Glu Leu Phe Gly Ile
115 120 125
Gly Asn Val Ser Arg Val Phe Val Asp Lys Arg His Gln Phe Ile Cys
130 135 140
Ala Glu His Asp Gly Leu Asn Ser Thr Val Ser Thr Gly His Asn Ile
145 150 155 160
Ser Ala Leu Tyr Ala Ala Tyr Tyr His His Gln Ile Asp Gly Gly Asn
165 170 175
Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Leu Phe Ser Ser Trp Leu Val
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Leu Asn Ile Ser Trp Phe Leu Arg Arg Ser Pro Val Ser Pro Val Ser
195 200 205
Arg Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Pro Thr Arg Pro Gln Leu Pro Val
210 215 220
Ser Trp Ser Phe Arg Thr Ser Ile Val Ser Asp Leu Thr Arg Tyr Gln
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<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
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Trp Phe His Leu Glu Trp Leu Arg Pro Phe Phe Ser Ser Trp Leu Val
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195 200 205
Arg Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Pro Thr Arg Pro Gln Leu Pro Val
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Ser Trp Ser Phe Arg Thr Ser Ile Val Ser Asp Leu Met Arg Ser Gln
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
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Met Ala His Gln Cys Ala Arg Phe His Phe Phe Leu Cys Gly Phe Ile
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Met Ala His Gln Cys Ala Arg Phe His Leu Phe Leu Cys Gly Phe Ile
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 99
Met Ala His Gln Cys Ala Arg Leu His Phe Phe Leu Cys Gly Phe Val
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Ser Tyr Leu Val His Ser Ser Leu Ala Ser Asn Ser Ser Tyr Thr Leu
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<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
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Met Ala Ala Ala Thr Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln His Ile Met
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<211> 183
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
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Met Ala Ala Ala Ile Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln His Ile Met
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<211> 183
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
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Met Ala Ala Ala Thr Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln Tyr Ile Met
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Val Ser Glu Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Thr His Leu Ser
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<211> 183
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 103
Met Ala Ala Ala Thr Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln Tyr Ile Met
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Val Ser Glu Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Thr His Leu Ser
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Phe Ala Ile Leu Leu Ala Ile
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<210> 104
<211> 183
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 104
Met Ala Ala Ala Thr Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln Tyr Ile Met
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Val Ser Glu Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Thr His Leu Ser
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Phe Ala Ile Leu Leu Ala Ile
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<211> 183
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 105
Met Ala Ala Ala Ile Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln His Ile Met
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Val Ser Glu Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Thr His Leu Ser
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<211> 183
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 106
Met Ala Ala Ala Ile Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln Tyr Leu Met
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<211> 183
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 107
Met Ala Thr Ala Ile Leu Phe Leu Leu Ala Ser Ala Gln His Leu Val
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<211> 183
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 108
Met Ala Ala Ala Phe Leu Phe Leu Leu Val Gly Ala Gln Tyr Phe Met
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<211> 183
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 109
Met Ala Thr Ala Val Leu Phe Leu Leu Ala Gly Ala Gln His Leu Met
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<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 110
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 111
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<211> 173
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 122
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 123
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
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<400> 126
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<211> 173
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 127
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<211> 173
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 128
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 129
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<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 130
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<400> 131
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<211> 70
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 132
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Ser Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Val Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Leu Val Phe Leu Leu Arg
35 40 45
Val Val Cys Ser Ala Leu Leu Arg Ser Arg Ser Ala Val His Ser Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Val Leu
65 70
<210> 133
<211> 70
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 133
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Ser Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Val Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Leu Val Phe Leu Leu Arg
35 40 45
Val Val Cys Ser Ala Ile Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile His Ser Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Val Leu
65 70
<210> 134
<211> 70
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 134
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Ser Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Val Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Leu Val Phe Leu Leu Arg
35 40 45
Val Val Cys Ser Ala Phe Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile His Ser Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Val Leu
65 70
<210> 135
<211> 70
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 135
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Thr Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Ile Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Leu Val Phe Leu Leu Arg
35 40 45
Val Val Cys Ser Ala Ile Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile His Ser Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Val Leu
65 70
<210> 136
<211> 70
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 136
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Ser Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Val Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Leu Val Phe Leu Leu Arg
35 40 45
Leu Val Cys Ser Ala Ile Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile His Ser Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Val Leu
65 70
<210> 137
<211> 70
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 137
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Ser Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Val Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Leu Val Phe Leu Leu Arg
35 40 45
Val Val Cys Ser Ala Leu Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile His Pro Pro
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Ile Leu
65 70
<210> 138
<211> 70
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 138
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Ser Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Val Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Leu Val Phe Leu Phe Arg
35 40 45
Leu Val Cys Ser Ala Ile Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile His Ser Ser
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Val Leu
65 70
<210> 139
<211> 70
<212> PRT
<213> 与Lelystad PRRSV相关
<400> 139
Met Gly Ser Leu Trp Ser Lys Ile Ser Gln Leu Phe Val Asp Ala Phe
1 5 10 15
Thr Glu Phe Leu Val Ser Val Val Asp Ile Val Ile Phe Leu Ala Ile
20 25 30
Leu Phe Gly Phe Thr Val Ala Gly Trp Leu Leu Val Phe Leu Leu Arg
35 40 45
Val Val Cys Ser Ala Phe Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile His Ser Ser
50 55 60
Glu Leu Ser Lys Val Leu
65 70

Claims (20)

1.一种安全并且有效的免疫或疫苗组合物，其包含：
a.一种或多种重组病毒载体，其包含一种或多种异源多核苷酸，其编码一种或多种猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E抗原、多肽、胞外结构域或其变体；和
b.药学上或兽医学上可接受的载体。
2.权利要求1的组合物，其中所述一种或多种载体包含重组腺病毒5PRRSV(Ad5-PRRSV)载体、重组杆状病毒PRRSV载体、重组猪巨细胞病毒PRRSV载体或重组痘病毒PRRSV载体。
3.权利要求2的组合物，其中所述一种或多种载体包含：
a.编码PRRSV E抗原、多肽、胞外结构域或其变体的核苷酸序列；或
b.编码经修饰的PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或M抗原、多肽、胞外结构域或其变体的核苷酸序列，其中相应的野生型PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或M抗原、多肽、胞外结构域或其变体的现有细胞定位序列已被来自异源基因的细胞表面表达决定子序列置换。
4.权利要求3的组合物，其中所述一种或多种载体包含两种载体的混合物，第一种载体表达重新靶向的PRRSV次要蛋白质，并且第二种载体表达重新靶向的PRRSV主要蛋白质。
5.权利要求3的组合物，其中所述重组载体包含编码具有以下特征的多肽的多核苷酸：
a.与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
6.权利要求5的组合物，其中所述重组PRRSV载体为Ad5-PRRSV载体，其包含具有以下特征的多核苷酸：
a.与SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的序列至少90％的序列同一性；或
b.与由SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78的子序列中所示的序列编码的胞外结构域至少90％的序列同一性。
7.权利要求1或6的组合物，其中所述组合物或疫苗包含一种或两种重组Ad5-PRRSV载体。
8.权利要求7的组合物，其中所述重组Ad5-PRRSV载体表达一种或多种PRRSV抗原、多肽、胞外结构域或其变体的以下个体或组合中的一个：
a.gp2和E；
b.gp2、gp4和E；
c.gp2、gp3、gp4和E；
d.rtg-gp2、rtg-gp3和rtg-gp4；
e.rtg-gp2和E；
f.rtg-gp2、rtg-gp4和E；
g.rtg-gp3和E；
h.rtg-gp4和E；
i.rtg-gp5和rtg-M；
j.rtg-E；
k.E；
l.rtg-gp5；和
m.rtg-M。
9.权利要求7的组合物，其中：
a.所述重组Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸：
i.与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139至少90％的序列同一性，或
ii.与编码SEQ ID NO1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139的子序列中所示的胞外结构域序列的序列至少90％的序列同一性；或
b.所述重组Ad5-PRRSV载体包含具有以下特征的多核苷酸：
i.与SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78中所示的序列至少90％的序列同一性；或
ii.与编码SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78的子序列中所示的胞外结构域序列的序列至少90％的序列同一性。
10.一种重组Ad5-PRRSV载体，其包含编码一种或多种PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E抗原、多肽、胞外结构域或其变体或其组合的一种或多种多核苷酸，基本上由编码一种或多种PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E抗原、多肽、胞外结构域或其变体或其组合的一种或多种多核苷酸组成，或由编码一种或多种PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E抗原、多肽、胞外结构域或其变体或其组合的一种或多种多核苷酸组成。
11.权利要求10的重组Ad5-PRRSV载体，其中所述一种或多种多核苷酸编码一种或多种具有以下特征的抗原、多肽或胞外结构域：
a.与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139中所示的序列至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：1、3、5、7、14、16、18、20、31、34-39、40-45、46-51、52-58、59-61、62-66、68、71、73、75、77或79-139的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
12.权利要求10或11的重组Ad5-PRRSV载体，其中所述一种或多种多核苷酸具有：
a.与SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78、67、69、70、72、74、76、78中所示的序列至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：2、4、6、8、9、10、11、12、13、15、17、19、21-24、30、67、69、70、72、74、76或78的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
13.权利要求10或11的重组Ad5-PRRSV载体，其中所述Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV gp2抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸：
a.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
14.权利要求10或11的重组Ad5-PRRSV载体，其中所述Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV E抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸：
a.与SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
15.权利要求10或11的重组Ad5-PRRSV载体，其中所述Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV gp3抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸：
a.与SEQ ID NO：5、18、40-45、90-99(gp3蛋白)中的任一个中所示的序列至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：5、18、40-45、90-99的子序列中所示的胞外结构域序列至少90％的序列同一性。
16.权利要求10或11的重组Ad5-PRRSV载体，其中所述Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV gp2和E抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸：
a.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个和SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列中的一个至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个和SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个至少90％的序列同一性。
17.权利要求10或11的重组Ad5-PRRSV载体，其中所述Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的PRRSV gp2、E和gp3抗原、多肽或胞外结构域的多核苷酸：
a.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个、SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列中的一个和SEQ ID NO：5、18、40-45、90-99(gp3蛋白)中所示的序列中的一个至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个、SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个和SEQ ID NO：5、18、40-45或90-99(gp3蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个至少90％的序列同一性。
18.一种在有需要的动物中引发针对PRRSV的保护性应答的方法，包括向所述动物施用表达至少一种PRRSV gp2、gp3、gp4、gp5a、gp5或E抗原、多肽、胞外结构域或其变体的重组Ad5-PRRSV载体，以及药学上或兽医学上可接受的载剂、佐剂、赋形剂或媒介物；和/或
其中所述施用是通过口鼻、喷雾剂、饮用水、肌肉内、或皮下施用、皮内、经皮；和/或
其中所述施用是初免-加强；和/或
其中第一次接种是两种Ad5载体的混合物，第一种Ad5载体表达重新靶向的PRRSV次要蛋白质，并且第二种Ad5载体表达PRRSV主要蛋白质；并且其中所述加强包括下列或基本上由下列组成：第一次接种的两种载体或单独的一种载体；和/或
其中所述动物是猪。
19.权利要求18的方法，其中所述Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的两种PRRSV抗原、多肽或胞外结构域的一种或多种多核苷酸：
a.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个和SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列中的一个至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个和SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个至少90％的序列同一性。
20.权利要求18的方法，其中所述Ad5-PRRSV载体包含编码具有以下特征的三种PRRSV抗原、多肽或胞外结构域的一种或多种多核苷酸：
a.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)中所示的序列中的一个、SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)中所示的序列中的一个和SEQ ID NO：5、18、40-45、90-99(gp3蛋白)中所示的序列中的一个至少90％的序列同一性；或
b.与SEQ ID NO：1、14、34-39或80-89(gp2蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个、SEQ ID NO：7、20、52-58或130-139(E蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个和SEQ ID NO：5、18、40-45或90-99(gp3蛋白)的子序列中所示的胞外结构域序列中的一个至少90％的序列同一性。
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