ES2902491T3 - Vectores virales recombinantes que contienen una proteína menor de PRRSV y procedimientos de fabricación y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Composición inmunológica o de vacuna segura y eficaz que comprende: a. uno o más vectores virales recombinantes, que comprenden polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más antígenos gp2, gp3, gp4 y E, polipéptidos o ectodominios de los mismos, del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV); en la que las cuatro proteínas se expresan a partir de un único vector; y b. un portador farmacéutica o veterinariamente aceptable; opcionalmente en la que uno o más vectores comprenden además un polinucleótido heterólogo que codifica el o los antígenos gp5a y/o gp5, polipéptido(s) o ectodominio(s) de los mismos de PRRSV.

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores virales recombinantes que contienen una proteína menor de PRRSV y procedimientos de fabricación y uso de los mismos

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud USSN provisional 62/183.410, presentada el 23 de junio de 2015.

DECLARACIÓN SOBRE LA LISTA DE SECUENCIAS

[0002] El Listado de Secuencias asociado con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel, y se incorpora por referencia en la memoria descriptiva. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es MER_15_265_ST25. El archivo de texto tiene 279 KB; fue creado el 13 de junio de 2016; y se envía electrónicamente a través de EFS-Web, al mismo tiempo que se presenta la memoria descriptiva.

CAMPO DE LA PRESENTE INVENCIÓN

[0003] La presente invención abarca vacunas recombinantes contra PRRSV vectorizadas con adenovirus y composiciones y procedimientos de uso.

CARACTERÍSTICAS DE LA PRESENTE INVENCIÓN

[0004] En un aspecto, la presente invención es una composición inmunológica o vacuna segura y eficaz que comprende:

a. uno o más vectores virales recombinantes, que comprenden polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más antígenos gp2, gp3, gp4 y E, polipéptidos o ectodominios de los mismos del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV); en la que las cuatro proteínas se expresan a partir de un único vector; y

b. un portador farmacéutica o veterinariamente aceptable;

opcionalmente en el que el uno o más vectores comprenden además un polinucleótido heterólogo que codifica el o los antígeno(s) gp5a y/o gp5, polipéptido(s) o ectodominio(s) de los mismos del PRRSV.

[0005] En un aspecto adicional, la presente invención es un vector Ad5-PRRSV recombinante que comprende, que consiste esencialmente en o consiste en los polinucleótidos que codifican uno o más antígeno(s) gp2, gp3, gp4 y E, polipéptido(s) o ectodominio (s) de los mismos del PRRSV, en el que las cuatro proteínas se expresan a partir de dicho único vector, además en el que el vector Ad5-PRRSV recombinante comprende opcionalmente un polinucleótido que codifica el o los antígeno(s) gp5a y/o gp5, polipéptido(s) o ectodominio(s) de los mismos del PRRSV, opcionalmente en el que uno o más polinucleótidos codifican uno o más antígenos, polipéptidos o ectodominios que tienen:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58 , 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51 , 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139.

[0006] En un aspecto adicional, la presente invención es un vector Ad5-PRRSV que expresa los antígenos gp2, gp3, gp4, y E, polipéptidos o ectodominios de los mismos, de PRRSV, opcionalmente además en el que el vector Ad5-PRRSV recombinante expresa el o los antígeno(s) gp5a y/o gp5, polipéptido(s) o ectodominio(s) de los mismos, del PRRSV, para su uso en un procedimiento para provocar una respuesta protectora en un animal que lo necesite contra PRRSV, que comprende administrar al animal el vector Ad5-PRRSV recombinante y un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable; opcionalmente en el que:

la administración es por vía oral-nasal, pulverización, agua potable, administración intramuscular o subcutánea, intradérmica, transdérmica; y/o

la administración es de sensibilización-refuerzo; y/o

la primera vacunación es una mezcla de dos vectores de Ad5, el primer vector de Ad5 que expresa proteínas menores de PRRSV redirigidas y el segundo vector de Ad5 que expresa proteínas principales de PRRSV; y en el que el refuerzo comprende o consiste esencialmente en ambos vectores de la primera vacunació, o el vector solo; y/o

el animal es porcino;

además, opcionalmente, en el que se cumple una de las siguientes condiciones:

I. el vector Ad5-PRRSV comprende uno o más polinucleótidos que codifican dos antígenos, polipéptidos o ectodominios de PRRSV que tienen:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 y una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52- 58, o 130-139; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 y una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139;

o

ii. el vector Ad5-PRRSV comprende uno o más polinucleótidos que codifican tres antígenos, polipéptidos o ectodominios de PRRSV que tienen:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52- 58, o 130-139 y una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 5, 18, 40-45 o 90-99; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 y una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 5, 18, 40-45 o 90-99.

El PRRSV es una infección viral devastadora de los cerdos con una enorme importancia económica (Derald J. Holtkamp, 2013). Existe una gran variabilidad en las características antigénicas de los diferentes aislados y las medidas efectivas para prevenir infecciones son limitadas. Hay dos grupos principales de vacunas disponibles para el PRRS, que son virus vivos modificados atenuados (MLV) o vacunas de virus muertos. Las vacunas MLV, aunque efectivas en una exposición a homólogos, no brindan una protección más amplia entre las muchas variantes circulantes y tienen el potencial de revertir al tipo salvaje dando como resultado una infección fulminante. Además, los animales vacunados con vacunas MLV continúan diseminando el virus y las granjas que usan estas vacunas no pueden estar libres de PRRSV. Por otro lado, las vacunas de virus muertos son mucho más seguras, pero menos efectivas que las vacunas MLV. Por lo tanto, las opciones actuales disponibles para prevenir la infección no son ni seguras ni efectivas (Charerntantanakul, 2012) (Tjeerd G. Kimman, 2009). Ha habido un esfuerzo concertado para desarrollar vacunas recombinantes que puedan abordar los principales inconvenientes de las vacunas actuales durante gran parte de las últimas dos décadas (Zhang, 2012). Sin embargo, a pesar de un gran esfuerzo, no existe una sola vacuna recombinante en el mercado con licencia para la prevención de la infección por PRRSV. La mayoría de las vacunas recombinantes que se evaluaron en el pasado se basaron en una o una combinación de proteínas de la envoltura viral que se cree que son dianas de la respuesta de anticuerpos neutralizantes. Sin embargo, la falta de comprensión completa de la interacción funcional entre las proteínas de la envoltura o con el receptor en las células diana obstaculizó el diseño racional de vacunas recombinantes eficaces.

[0007] Las proteínas de la envoltura viral de PRRSV se clasifican generalmente en proteínas principales y menores sobre la base de la abundancia de proteínas en el virión (Dokland, 2010) (Dea S, 2000). Las proteínas principales de la envoltura viral son gp5 (ORF 5) y M (ORF 6) y forman un dímero. Las proteínas menores de la envoltura son gp2 (ORF2), gp3 (ORF3), gp4 (ORF4) y E (ORF2b) y probablemente una proteína viral recientemente identificada gp5a (ORF 5a). Se cree que las proteínas menores de la envoltura existen como multímeros y están implicadas en la interacción directa con el receptor CD163 y median en la entrada viral (Phani B. Das, 2010).

[0008] La mayoría de los intentos anteriores para desarrollar vacunas recombinantes se han centrado en las proteínas principales, gp5, M o una combinación (Dea, 1998). Esto probablemente se deba al hecho de que los anticuerpos contra las proteínas principales se detectan fácilmente en animales infectados con PRRSV y se supone que podrían presentar dianas neutralizantes para el sistema inmunológico. Además, existe un gran grado de variabilidad de secuencia en gp5, lo que indica que estas proteínas están bajo presión de selección inmune. Sin embargo, el agotamiento de los anticuerpos específicos de gp5 de los sueros neutralizantes indicó que estos anticuerpos pertenecen en gran medida a una fracción no neutralizante de los sueros (Juan Li, 2012). Por lo tanto, estos han indicado la presencia de la diana neutralizante primaria en proteínas de la envoltura viral distintas de las proteínas principales y probablemente en las proteínas menores. A pesar de los grandes esfuerzos para desarrollar proteínas principales como antígenos en vacunas recombinantes, que varían desde proteínas recombinantes purificadas a vacunas suministradas utilizando una variedad de plataforma de vectores (Jazmina L.G. Cruza, 2010), ninguna ha llegado al mercado porque no han conseguido una protección robusta.

[0009] Recientemente, el foco en el desarrollo de la vacuna recombinante contra el PRRS se ha desplazado hacia las proteínas menores (Jing-Qiang Ren, 2014) (Sakthivel Subramaniam, 2014) (ZS WANG, 2011). Este cambio ha sido impulsado principalmente por tres hallazgos recientes. En primer lugar, se demostró que dos de las proteínas menores, gp2 y gp4, se unían directamente al receptor CD163. En segundo lugar, un intercambio de proteínas menores, pero no de proteínas principales, con EAV (virus de la arteritis equina), también un arterivirus, alteraba el tropismo del virus, lo que indica la importancia de las proteínas menores en la interacción con el receptor y el direccionamiento del virus a las células diana (Lu Z1, 2012) (Tian D, 2012). Finalmente, los mutantes knock-out de CD163, que es el receptor principal de proteínas menores, evitaban la infección por el virus, mientras que un knock-out similar para CD169, receptor de proteínas principales, no afectaba a la entrada viral (Randall S. Prather, 2013). A pesar del conocimiento creciente en el papel de las proteínas menores en la entrada de virus y como diana relevante para la respuesta a anticuerpo neutralizante, ninguna de las vacunas recombinantes desarrolladas hasta ahora basada en proteínas menores dio lugar a la protección del animal vacunado de la infección por PRRS.

[0010] Aquí, presentamos que la inclusión de otra proteína menor E a esta combinación de proteínas menores resultó en una respuesta protectora drásticamente diferente. Sorprendentemente, la presencia de la proteína E junto con gp2, gp3 y gp4 indujo una fuerte respuesta inmunitaria y redujo la lesión pulmonar de la exposición al PRRs . Esta es la primera vez que se ha demostrado que la proteína E es un componente crítico del complejo proteico que puede inducir una respuesta inmunitaria protectora. Esto se logró no solo identificando la proteína E como el componente esencial del complejo de proteínas menores, sino también expresando las cuatro proteínas a partir de una única plataforma de vector que promovió la formación del complejo proteico. Este nuevo hallazgo no solo servirá para entender adicionalmente las interacciones críticas entre las proteínas virales y el receptor celular, sino que también sentará las bases para conseguir una vacuna contra PRRS recombinante universal que esté realmente libre de PRRSV vivo.

[0011] En nuestras manos, la vacunación de animales con plásmidos combinados que expresan gp2, gp3 y gp4 no generó una respuesta inmunitaria sólida (observación no publicada). La conclusión de este ensayo con animales fue que se presume que estas proteínas existen como multímeros y, por lo tanto, se requiere la expresión de todas las proteínas simultáneamente dentro de una sola célula para promover la multimerización para formar la conformación correcta que presente un epítopo neutralizante al sistema inmunológico. Los ensayos bioquímicos posteriores también indicaron esto y todas las proteínas se colocaron en un solo vector para permitir la expresión simultánea. Sorprendentemente, en el ensayo con animales que se informa aquí, hemos descubierto que esto tampoco es suficiente para inducir una respuesta inmunitaria protectora. En cambio, el factor crítico para la inducción de una respuesta inmunitaria protectora por estos antígenos fue la modificación introducida para reorientar las proteínas desde los compartimentos intracelulares a la superficie de las células. Una diferencia tan drástica entre las proteínas modificadas y no modificadas fue completamente inesperada y abrirá nuevas vías para abordar desafíos similares con una variedad de dianas virales. Esta es también la primera vez, que sepamos, que la inmunogenicidad de las proteínas menores de la envoltura del PRRSV mejoró hasta un grado que puede brindar protección frente a la lesión pulmonar contra la exposición al PRRS y reducir el nivel de viremia sérica al expresar simultáneamente todas las proteínas menores a partir de un solo vector e introducir modificaciones que mejoraban la expresión en la superficie celular.

REFERENCIAS

[0012] Changhee Lee, D. Y. (2006). The small envelope protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus possesses ion channel protein-like properties. Virology , 30-43.

Charerntantanakul, W. (2012). Porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Immunogenicity, efficacy and safety aspects. WorldJournal of Virology, 23-30.

Dea S, G. C. (2000). Current knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolates. Archives of Virology, 659-688.

Dea, B. P. (1998). Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Journal of General Virology, 989-999.

Derald J. Holtkamp, J. K. (2013). Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on united States Pork producers. Journal of Swine Health and production, 72-84.

Dokland, T. (2010). The structural biology of PRRSV. Virus Reserach, 86-97.

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Jazmina L.G. Cruza, S. Z. (2010). Vectored vaccines to protect against PRRSV. Virus Research, 150-160.

Jing-Qiang Ren, W.-C. S.-J.-B.-L.-X.-P.-W.-Y. (2014). Construction and immunogenicity of a DNA vaccine coexpressing GP3 and GP5 of genotype-I porcine reproductive and respiratory syndrome virus. BMC Veterinary Research, 1-11.

Juan Li, M. P. (2012). Dissociation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus neutralization from antibodies specific to major envelope protein surface epitopes. Virology, 367-376.

Lu Zl, Z. J. (2012). Chimeric viruses containing the N-terminal ectodomains of GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus do not change the cellular tropism of equine arteritis virus. Virology, 99­ 109.

Maorong Yua, X. L. (2010). Subcellular localization and topology of porcine reproductive and respiratory syndrome virus E protein. Virus Reserach, 104-114.

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O. J. Lopez, M. F. (2007). Protection against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) Infection through Passive Transfer of PRRSV-Neutralizing Antibodies Is Dose Dependent. linical and Vaccine Immunology, 269­ 275.

Phani B. Das, P. D. (2010). The Minor Envelope Glycoproteins GP2a and GP4 of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Interact with the Receptor CD163. Journal of Virology, 1731-1740.

Randall S. Prather, R. R. (2013). An Intact Sialoadhesin (Sn/SIGLEC1/CD169) Is Not Required for Attachment/Internalization of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus. Journal of Virology, 9538­ 9546.

Sakthivel Subramaniam, P. P. (2014). In vivo targeting of porcine reproductive and respiratory syndrome virus antigen through porcine DC-SIGN to dendritic cells elicits antigen-specific CD4T cell immunity in pigs. Vaccine, 6768-6775. Tian D, W. Z.-D. (2012). Arterivirus minor envelope proteins are a major determinant of viral tropism in cell culture. Journal of Virology, 3701-3712.

Tjeerd G. Kimman, L. A.-Z. (2009). Challenges for porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) vaccinology. Vaccine, 3704-3718.

Yijun Du, F. A. (2010). Myristoylation of the small envelope protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus is non-essential for virus infectivity but promotes its growth. Virus Research, 294-299.

Z.S. WANG, X. X. (2011). Immunogenicity of the envelope GP3 protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus displayed on baculovirus. Acta Virologica, 139-146.

Zhang, J. H. (2012). Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Vaccines: Current Status and Strategies to a Universal Vaccine. Transboundary and Emerging Diseases, 109-120.

[0013] La presente divulgación proporciona nuevas composiciones de vacuna contra PRRSV y procedimientos de fabricación y uso de la misma.

[0014] Esta divulgación se basa, en parte, en el hallazgo sorprendente e inesperado de que la inclusión de otra proteína menor (E) de PRRSV a otras combinaciones de proteínas menores resultó en una respuesta protectora drásticamente diferente. Tal como se describe en el presente documento, se pueden usar porciones suficientes de la proteína E, por ejemplo, su dominio transmembrana (TM), amino terminal (NT) o carboxi terminal (CT), para provocar dicha respuesta protectora.

[0015] Sorprendentemente, la presencia de la proteína E junto con gp2, gp3 y gp4 indujo una respuesta inmune robusta y redujo la lesión pulmonar de la exposición a PRRS. Esta es la primera vez que se ha demostrado que la proteína E es un componente crítico del complejo proteico que puede inducir una respuesta inmunitaria protectora.

[0016] Como tal, las vacunas descritas fueron no sólo se lograron mediante la identificación de la proteína E como el componente esencial del complejo de proteínas menores, sino también, mediante la expresión de las cuatro proteínas a partir de una única plataforma de vector que promovió la formación del complejo proteico.

[0017] Tal como se describe en el presente documento, la divulgación proporciona vectores virales recombinantes que expresan versiones quiméricas de proteínas menores de PRRSV, que contienen diferentes determinantes de localización celular, en comparación con sus correspondientes genes de tipo salvaje. En particular, se ha añadido una porción de la glicoproteína (G) del VSV y la proteína activadora del plasminógeno tisular (tPA) para provocar que los productos génicos quiméricos resultantes se localicen en la superficie celular. Estos vectores recombinantes provocan respuestas inmunitarias seguras y eficaces en el animal huésped contra PRRSV. Como tal, las modificaciones introducidas en las proteínas menores del PRRSV para lograr su expresión en la superficie produjeron un efecto similar al de la coexpresión de la proteína E junto con gp2, gp3 y gp4.

[0018] Por consiguiente, esta divulgación proporciona de este modo una hoja de ruta para lograr una vacuna contra PRRS recombinante universal que esté 100% libre de PRRSV vivo.

[0019] En el presente documento se describe una vacuna o composición de PRRSV vectorizada por adenovirus que comprende uno o más vectores de adenovirus recombinantes modificados que albergan y expresan ciertos antígenos de PRRSV y, opcionalmente, un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. El PRRSV puede ser cualquier cepa, ya que las composiciones y procedimientos novedosos e inventivos descritos en este documento son universalmente aplicables a todas las cepas de PRRSV conocidas y aún por descubrir, por las razones que se describen con más detalle a continuación.

[0020] El antígeno de PRRSV incluye proteínas menores de PRRSV (por ejemplo gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E), en cualquier combinación, e incluye opcionalmente proteínas principales de PRRSV adicionales (por ejemplo gp5 o M). De manera similar a las otras proteínas menores, la gp5a está relativamente bien conservada y los solicitantes prevén que sea una adición o sustitución eficaz para los vectores virales recombinantes seguros y eficaces de la presente divulgación.

[0021] Los vectores recombinantes de PRRSV pueden contener y expresar en un huésped animal al menos las siguientes combinaciones (en cualquier orden, e impulsadas por cualquier elemento promotor, PE, incluido el indicado, e incluidos elementos tales como iRe S y péptidos 2a ) de genes o componentes (rtg = redirigido; CMV = promotor del citomegalovirus; SV40 = promotor del virus 40 de los simios; IRES = sitio de entrada ribosomal interno, péptidos 2A autoescindibles derivados del virus de la fiebre aftosa (FA), virus A de la rinitis equina, virus Thosea asigna o teschovirus porcino-1): 1) (PE)gp2, (PE)gp3, (PE)gp4, (PE)E; 2) (PE)rtg gp2, (PE)gp3 y (PE)gp4; 3) (PE)rtg gp2, (PE)rtg gp3 y (PE)rtg gp4; 4) (PE)rtg gp2, (PE)rtg gp3, (PE)rtg gp4 y (PE)E; 5) (PE)rtg gp2, (PE)rtg gp3, (PE)rtg gp4 y (PE)rtg E; 6) (PE)rtg gp2, (PE)rtg gp4 y (PE)rtg E; 7) (PE)rtg gp2 y (PE)rtg gp4, 8) (M-(SV40)-(CMV)-gp5-(IRES)-gp5a; 9) gp2-(SV40)-(CMV)-E; 10) rtg gp2-(SV40)-(CMV)-E; 11) rtg gp2-(SV40)-(CMV)-rtg E; 12) (CMV)-E; 11) E-(p2A)-gp2-(SV40)-(CMV)-gp4; 12) rtg E-(p2A)- rtg gp2-(SV40)-(CMV)-rfg gp4; 13) (PE)gp2-(PE)gp4-(PE)E; 14) (PE)gp2-(PE)E; 15) (PE)gp2; 16) (PE)gp2-(PE)gp3; 16) (PE)gp2-(PE)gp4; 17) (PE)gp2-(PE)gp5a; 18) (PE)E; 19) (PE)E-(PE)gp3; 20) (PE)E-(PE)gp4; 19) (PE)E-(PE)gp5a; 20). Tal como se describe en el presente documento, el vector contiene y expresa como mínimo (PE)gp2, (PE)gp4 y (PE)E, ya sea de tipo salvaje o versiones "rtg" de los mismos. El vector también puede comprender ventajosamente gp2 más cualquier otro gen que codifique un polipéptido de PRRSV.

[0022] La reorientación puede lograrse reemplazando los dominios transmembrana (TM) y dominios de cola citoplasmática (CT) existentes de las proteínas gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E por, respectivamente, los dominios TM y CT de VSV. En una realización, las proteínas gp5 y M también pueden someterse al procedimiento de reorientación. Las secuencias de las proteínas de PRRSV nativas también pueden o alternativamente se reemplazan por la secuencia señal de tPA y uno o ambos TM y CT de VSV (o esos mismos elementos de otro polipéptido expresado en superficie adecuado). Alternativamente, la reorientación se puede lograr reemplazando los dominios CT de proteína gp2, gp3, gp4, gp5a, E, gp5 o M existentes por los dominios CT de VSV (es decir, sin cambiar los dominios TM existentes). La reorientación de E también se puede lograr reemplazando sus señales de localización celular por las de una proteína de membrana de Tipo II, o por VSV-G o combinaciones de las mismas, o los dominios TM/CT de otras glicoproteínas de la superficie.

[0023] Los solicitantes también prevén muchos medios alternativos de presentación de los antígenos de PRRSV al sistema inmunitario del animal huésped. Por ejemplo, los antígenos podrían presentarse en la superficie de partículas similares a virus (VLP). En otras realizaciones, las versiones solubles de los antígenos podrían administrarse al animal huésped, en donde la oligomerización (incluida la trimerización) de las proteínas entre sí, o adicionalmente, con componentes de VSV-G u otras proteínas virales o cualquier oligomerización (incluidos motivos de trimerización) (por ejemplo, motivos de GCN4 bacteriano). Además, se prevé que los dominios TM/CT de las glicoproteínas de la superficie viral de Tipo I cumplan el mismo propósito que, y por lo tanto, sean intercambiables con los dominios correspondientes de VSV-G.

[0024] Por consiguiente, ahora que se ha divulgado la presente invención, el experto reconocerá muchas formas alternativas y funcionalmente equivalentes para lograr sustancialmente la misma presentación de proteínas menores de PRRSV, incluyendo E, gp2, gp3, gp4, gp5a, proteínas principales, incluyendo gp5 y M, o combinaciones de proteínas menores y/o principales, al sistema inmunológico de un animal huésped.

[0025] En el presente documento se describe un procedimiento para vacunar a un animal que comprende administrar al animal una cantidad eficaz de una o más vacunas o composiciones que pueden comprender una cantidad eficaz de una vacuna de PRRSV vectorizada por adenovirus y, opcionalmente, un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. La administración puede ser subcutánea, intranasal, intramuscular, transdérmica, intradérmica, mucosa, incluida la oral, o cualquier otra administración.

[0026] En el presente documento se describe la administración de la vacuna o composición usando el protocolo de sensibilización-refuerzo. La presente invención incluye además un kit para realizar un procedimiento de provocar o inducir una respuesta inmunitaria que puede comprender cualquiera de las composiciones inmunológicas o vacunas de Ad5 recombinante, o composiciones inmunológicas o vacunas inactivadas, e instrucciones para realizar el procedimiento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0027] La siguiente descripción detallada se puede comprender mejor en conjunción con los dibujos adjuntos, en los que:

FIG. 1 presenta mapas de los insertos utilizados para producir cuatro vectores virales recombinantes diferentes que expresan proteínas de envoltura viral menores del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). vAD3042 expresa gp2, gp3 y gp4 sin E de PRRSV con codones optimizados (A); v a D3038 expresa rtg-gp2, rtg-gp3 y rtg-gp4 sin E redirigido ("rtg") con codones optimizados (B); vAD3041 expresa gp2, gp3, gp4 con E con codones optimizados (C); vAD3067 expresa rtg-gp2, rtg-gp3, rtg-gp4 con E con codones optimizados (D); vAD3046 expresa hemaglutinina del virus de la gripe porcina (SIV-HA) con codones optimizados (E); vAD3069 expresa nucleoproteína (Np o N), M, gp5 y gp5a con codones optimizados (F); y vAD3064 expresa rtg-M, rtg-gp5 y rtg-gp5a con codones optimizados (G);

FIG. 2 es un esquema que muestra la disposición de las proteínas "principales" y "menores" de PRRSV en la superficie de una membrana viral;

FIG. 3 es un esquema que muestra la disposición y las interacciones de las proteínas "menores" del PRRSV, ya que la evidencia actual y divulgada indica que se entiende que estas proteínas interactúan con los receptores de la superficie de la célula huésped (por ejemplo, CD163);

FIG. 4 es una imagen de gel que muestra el amplicón de PCR de la región de la proteína menor de PRRSV insertada en el pase 3 (A) de vAD3041 y el pas33 (B) de vAD3042;

FIG. 5A presenta el esquema utilizado para redirigir las proteínas de la envoltura del PRRSV a la superficie celular; Figs. 5B-5D presentan mapas de las proteínas rtg-gp2, rtg-gp3 y rtg-gp4, donde los dominios endógenos TM y CT han sido reemplazados por los dominios transmembrana (TM) y de la cola citoplásmica (CT) del virus de la estomatitis vesicular-G (VSV-G), se ha reemplazado la secuencia señal, se han añadido etiquetas de epítopo y se han insertado secuencias enlazadoras;

FIG. 6 presenta imágenes de ensayo de inmunofluorescencia (IFA) de células HEK 293T fijadas que habían sido transfectadas con proteínas rtg-gp2, rtg-gp3 y rtg-gp4 etiquetadas con epítopo;

FIG. 7 muestra un Western Blot (WB) anti-VSVG de lisados coinmunoprecipitados (co-IP) de células HEK 293T transfectadas con plásmidos que codifican cada una de las proteínas de la envoltura redirigidas individuales;

FIG. 8 muestra varias WB de lisados co-IP de células HEK 293T transfectadas con plásmidos que codifican cada una de las proteínas de la envoltura redirigidas individuales o IP CD16 porcino: a-VSV, Wb: a-VSV-HRP (A); IP: a-VSV, Wb: a-CD163 (B); IP: a-CD163, Wb: a-CD163-Biotina (C);

Figs. 9A a 9C presentan imágenes de ensayo de inmunofluorescencia dual (IFA) de células HEK 293 infectadas con vAD3038 (que contiene rtg-gp234 con codones optimizados); y se tiñeron simultáneamente con dos anticuerpos específicos para las proteínas indicadas y diferentes etiquetas de fluoróforo. Las imágenes se tomaron de un campo óptico idéntico utilizando filtros específicos para cada fluoróforo. Las imágenes correspondientes se muestran con una flecha;

FIG. 10 es un cuadro que detalla las muestras recolectadas y el tiempo de recolección a lo largo del estudio;

FIG. 11 es un gráfico que muestra la distribución de las puntuaciones de lesiones pulmonares entre diferentes grupos. vAD3042 (Ad5 que expresa gp2 de tipo salvaje, gp3 de tipo salvaje y gp4 de tipo salvaje con codones optimizados); vAD3041 (Ad5 que expresa gp2 de tipo salvaje, gp3 de tipo salvaje, gp4 de tipo salvaje y E de tipo salvaje con codones optimizados); vAD3038 (Ad5 que expresa rtg-gp2, rtg-gp3 y rtg-gp4 con codones optimizados); y vAD3033 (Ad5 que expresa un gen de hemaglutinina (HA) con codones optimizados del virus de la gripe porcina (SIV), control negativo). La mediana (barra cruzada) y la media (+) y los cuadros representan el rango entre el 1er y el 3er rango intercuartil. Los círculos grises indican las puntuaciones reales de los pulmones de cada animal individual en cada grupo;

FIG. 12 enumera y describe las secuencias presentes en la lista de secuencias;

FIG. 13 es un alineamiento ClustalW de las secuencias del polipéptido gp2 como se establece en las SEQ ID NO: 34­ 39;

FIG. 14 es un alineamiento ClustalW de las secuencias del polipéptido gp3 como se establece en las SEQ ID NO: 40­ 45;

FIG. 15 es un alineamiento ClustalW de las secuencias del polipéptido gp4 como se establece en las SEQ ID NO: 46­ 51;

FIG. 16 es un alineamiento ClustalW de las secuencias del polipéptido E como se establece en las SEQ ID NO: 52­ 58;

FIG. 17 es un alineamiento ClustalW de las secuencias del polipéptido gp5a como se establece en las SEQ ID NO: 62-65;

FIG. 18 es un gráfico que muestra puntuaciones de lesiones pulmonares para porcinos a los que se les administró vAd3038 (Gp234-Rtrg Vacuna muerta) o vAd3046 (SIV-HA);

FIG. 19 es un gráfico que muestra la carga viral en suero para porcinos a los que se les administró vAd3038 (Gp234-Rtrg Vacuna muerta) o vAd3046 (SIV-HA);

FIG. 20 compara las respuestas inmunitarias de los Grupos 1, 2, 4 y 5, antes y después de la exposición. Las transferencias Western (Western blots) se sondaron con anti-V5 para visualizar los niveles de proteína E (arriba a la izquierda); anti-Flag para detectar gp3 (derecha); y anti-HA para visualizar los niveles de proteína gp4 (abajo a la izquierda);

FIG. 21 es un gráfico que muestra puntuaciones de lesiones pulmonares para porcinos a los que se les administró vAD3067 (IM/IM) seguido de vacuna muerta, vAD3067 (IN/IM) seguido de vacuna muerta; vAD3067 vAD3064 (IN/IM) seguido de vacuna muerta; o vAD3046 seguido de placebo. Todas las vacunas muertas se administraron una vez por vía intramuscular;

FIG. 22 es un gráfico de carga viral en suero para porcinos a los que se les administró vAD3067 (IM/IM) seguido de vacuna muerta, vAD3067 (IN/IM) seguido de vacuna muerta; vAD3067 vAD3064 (IN/IM) seguido de Vacuna muerta; o vAD3046 y placebo. Todas las vacunas muertas se administraron una vez por vía intramuscular;

FIG. 23 muestra los resultados del estudio de inmunoprecipitación diseñado para interrogar la posible interacción entre E y gp4 redirigido (no se observó interacción). En la construcción, la etiqueta Flag se une a gp3; la etiqueta V5 se une a E; la etiqueta HA se une a gp4; y la etiqueta Myc se une a gp2. WB (Western blot), IP (inmunoprecipitación), S (gps soluble) y V (gps marcados con VSV);

FIG. 24 muestra los resultados del estudio de IP diseñado para interrogar la posible interacción entre E y gp3 redirigido (no se observó interacción).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0028] Se observa que en esta dvulgación y particularmente en las reivindicaciones y/o los párrafos, los términos tales como “comprende”, “comprendido”, “que comprende” pueden significar “ incluye”, “incluido”, “que incluye”.

[0029] A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0030] El término "aproximadamente", tal como se usa en el presente documento, significa aproximadamente, en la región de, aproximadamente o alrededor. Cuando el término "aproximadamente" se usa junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. En general, el término "aproximadamente" se usa en este documento para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor establecido en una variación del 10%. En un aspecto, el término "aproximadamente" significa más o menos el 20% del valor numérico del número con el que se está utilizando. Por lo tanto, aproximadamente el 50% significa en el intervalo del 45% al 55%. Los intervalos numéricos indicados aquí por puntos finales incluyen todos los números y fracciones incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,90, 4 y 5). También debe entenderse que todos los números y fracciones de los mismos se asume que están modificados por el término “aproximadamente”.

[0031] Tal como se describe en el presente documento, adenovirus 5 (Ad5), u otro vector adecuado, se utiliza para administrar y expresar in vivo en un huésped animal proteínas de la envoltura del PRRSV seleccionadas, para provocar en el animal una respuesta inmune segura y eficaz contra la exposición experimental o natural con PRRSV virulento.

[0032] Aunque se utilizó Ad5 para suministrar las proteínas de PRRSV en la presente divulgación, podría utilizarse cualquier otro vector adecuado. Por ejemplo, pueden usarse baculovirus, virus de la viruela, incluyendo virus de la viruela aviar y virus de la viruela del canario para suministrar las combinaciones novedosas e inventivas de genes descritos en el presente documento. Tal como se describe en el presente documento, el citomegalovirus porcino (PCMV), que es un virus del herpes que se encuentra en los tejidos de todo el cuerpo, incluida la nariz de los lechones recién nacidos donde causa inflamación (rinitis), puede usarse como vector.

[0033] En el presente documento se describe una vacuna o composición inmunológica que puede comprender una cantidad eficaz de uno o más vectores Ad5 modificados por ingeniería genética, u otros vectores adecuados y, opcionalmente, un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0034] Por consiguiente, en el presente documento se describe un vector Ad5 modificado, u otro vector adecuado, que expresa la(s) proteína(s), polipéptido(s), antígeno(s), epítopo(s) o inmunógeno(s) de la envoltura del PRRSV, que provocan una respuesta inmunogénica en un animal. La proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV incluye al menos una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno menor de PRRSV, seleccionado entre gp2, gp3, gp4, gp5a y E.

[0035] Tal como se usa en este documento, el término "polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno menor de PRRSV" se refiere a cualquier polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno menor de un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. Actualmente, los polipéptidos menores o componentes de los mismos incluyen proteínas gp2, gp3, gp4, gp5a y E, pero pueden haber otras proteínas asociadas con las proteínas menores conocidas actualmente que también podrían usarse de manera eficaz en la práctica de la presente invención divulgada. En general, y tal como se usa en este documento, el término "ectodominio" se refiere al dominio o dominios de una proteína de membrana que se extiende hacia el espacio extracelular. Como tal, cualquier referencia al porcentaje de identidad con el ectodominio de una proteína determinada no pretende incluir una comparación con los no ectodominios, incluidos los dominios transmembrana (TMD) y los dominios citoplasmáticos (CTD), de dicha proteína.

[0036] Por "animal" se entienden mamíferos, humanos, aves. El animal se puede seleccionar del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otros gatos grandes y otros felinos incluyendo guepardos y lince), ovino (por ejemplo, ovejas), bovino (por ejemplo, ganado, vaca, búfalo), porcino (cerdo), aviar (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tersio, mono, gibón, simio), y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas del desarrollo, incluyendo etapas embrionarias y fetales.

[0037] En la presente invención, la protección inmunológica de los animales porcinos contra el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino es de primordial importancia. Sin embargo, los conceptos descritos en el presente documento se aplicarán igualmente bien a otros virus en los que, como aquí, la expresión relativamente baja o limitada de proteínas de superficie clave "mediadoras de la entrada celular" hace que el desarrollo de vacunas sea especialmente desafiante. Por consiguiente, tal como se describe en el presente documento, la reorientación y/o el acompañamiento de tales "proteínas de la envoltura menores" a la superficie de una célula tiene aplicaciones de amplio alcance para todos los virus con envoltura.

[0038] Tal como se describe en el presente documento, la composición o vacuna inmunológica de Ad5 comprende uno o más de vectores Ad5 modificados y, opcionalmente, un excipiente, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. El vector Ad5 modificado puede comprender un polinucleótido que codifica una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno menor de PRRSV. La proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV puede ser una gp2, gp3, gp4, gp5a, E o cualquier fragmento de la misma.

[0039] Tal como se utiliza en el presente documento, el término “antígeno” o “ inmunógeno” significa una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o porción de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto que expresa un epítopo, polipéptido, péptido, proteína o fragmento del mismo con propiedades inmunogénicas; una pieza o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmunitaria al presentarse a un animal huésped; una proteína, un polipéptido, un péptido, un epítopo, un hapteno o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o una antitoxina.

[0040] El término “proteína o péptido inmunogénico”, tal como se usa en el presente documento, también incluye péptidos y polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez que se administran al huésped, son capaces de evocar una respuesta inmunitaria de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de la proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína nativa intacta completa. Por tanto, un fragmento de proteína, según la presente invención, comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. El término epítopo, también conocido como determinante antigénico, es la parte de una macromolécula reconocida por el sistema inmunitario y es capaz de inducir una reacción inmunitaria del tipo humoral (células B) y/o del tipo celular (células T).

[0041] El término “proteína o péptido inmunogénico” contempla además eliminaciones, adiciones y sustituciones en la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica, tal como se define en este documento. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservadora, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados: glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina y tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican como aminoácidos aromáticos. Es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de leucina por isoleucina o valina, o viceversa; un aspartato por un glutamato o viceversa; una treonina por una serina o viceversa; o un reemplazo conservador similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia.

[0042] El término “epítopo” se refiere a la parte de una macromolécula reconocida por el sistema inmunitario y es capaz de inducir una reacción inmunitaria del tipo humoral (células B) y/o del tipo celular (células T). El término también se usa indistintamente con “determinante antigénico” o “sitio determinante antigénico”. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo se pueden identificar en un inmunoensayo simple que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana.

[0043] Una “respuesta inmunológica” a una composición o una vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmunitaria celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o una vacuna de interés. Normalmente, una “respuesta inmunológica” incluye uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares y/o células T citotóxicas, dirigidos específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o la vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora de tal manera que se potenciará la resistencia a una nueva infección y/o se reducirá la gravedad clínica de la enfermedad. Dicha protección se demostrará mediante una reducción o una ausencia de los síntomas que normalmente presenta un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral reducido en el huésped infectado.

[0044] Los términos proteína o polipéptido “inmunogénico”, tal como se usa en el presente documento, también se refieren a una secuencia de aminoácidos que provoca una respuesta inmunológica, tal como se ha descrito anteriormente. Una proteína polipéptido “inmunogénico”, tal como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, sus análogos o sus fragmentos inmunogénicos. Por “fragmento inmunogénico” se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y, por tanto, provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Dichos fragmentos pueden identificarse usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos bien conocidas en la técnica. Vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996).

[0045] Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando simultáneamente un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, correspondiendo los péptidos a las porciones de la molécula de la proteína y reaccionando los péptidos con los anticuerpos mientras los péptidos todavía están unidos a los soportes. Tales técnicas son conocidas en el sector y se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 4,708,871; Geysen et al. 1984; Geysen et al. 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente determinando la conformación espacial de aminoácidos, tal como, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, por ejejmplo, Epitope Mapping Protocols, supra.

[0046] Los antígenos sintéticos también se incluyen dentro de la definición, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes y otros antígenos recombinantes o derivados sintéticamente. Los fragmentos inmunogénicos, para los propósitos de la presente invención, normalmente incluirán al menos aproximadamente 3 aminoácidos, aproximadamente 5 aminoácidos, aproximadamente 10-15 aminoácidos, aproximadamente 15-25 aminoácidos o más aminoácidos de la molécula. No existe un límite superior crítico para la longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprenda al menos un epítopo de la proteína.

[0047] Por consiguiente, una estructura mínima de un polinucleótido que expresa un epítopo es que comprende o consiste esencialmente en o consiste en nucleótidos para codificar un epítopo o determinante antigénico de la proteína o polipéptido del PRRSV. Un polinucleótido que codifica un fragmento de la proteína o polipéptido total comprende o consiste esencialmente en o consiste en un mínimo de 15 nucleótidos, ventajosamente aproximadamente 30-45 nucleótidos y preferiblemente aproximadamente 45-75, al menos 57, 87 o 150 nucleótidos consecutivos o contiguos de la secuencia que codifica la proteína o polipéptido total. Los procedimientos de determinación de epítopos, tales como la generación de bibliotecas de péptidos superpuestos (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) y algoritmos (De Groot et al., 1999), se pueden usar en la práctica de la invención, sin gran experimentación.

[0048] Un “polinucleótido” es una forma polimérica de los nucleótidos de cualquier longitud, que contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación. Los polinucleótidos pueden tener una estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término “polinucleótido” incluye moléculas helicoidales de doble cadena, una cadena y triple cadena. A menos que se especifique o se requiera lo contrario, cualquier realización de la invención descrita en el presente documento que sea un polinucleótido abarca tanto la forma de doble cadena como cada una de las dos formas complementarias conocidas o previstas para construir la forma de doble cadena del ADN, ARN o la molécula híbrida.

[0049] El término "optimización de codones" se refiere al proceso de configurar óptimamente la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo, dominio o fragmento para la expresión/traducción en un huésped seleccionado. En general, los niveles de expresión génica dependen de muchos factores, tales como las secuencias promotoras y los elementos reguladores. Uno de los factores más importantes es la adaptación del uso de codones del gen de transcripción al uso de codones típico del huésped (Lithwich, G. y Margalit, H., Genome Res.

13, 2665-2673, 2003). Por lo tanto, los genes altamente expresados en genomas procarióticos bajo selección traduccional tienen un pronunciado sesgo de uso de codones. Esto se debe a que utilizan un pequeño subconjunto de codones que son reconocidos por las especies de ARNt más abundantes (Ikemura, T., J. Mol. Biol. 151, 389-409, 1981). La fuerza que modula esta adaptación de codones se llama selección traslacional y su fuerza es importante en bacterias de rápido crecimiento (Rocha, EP, Genome Res. 14, 2279-2286, 2004; Sharp, Pm et al., Nucleic Acids Res.

33, 1141-1153). Si un gen contiene codones que el huésped usa raramente, su nivel de expresión no será máximo. Ésta puede ser una de las limitaciones de la expresión de proteínas heterólogas (Gustafsson, C. et al., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004) y el desarrollo de vacunas de Ad N (Ivory, C. y Chadee, K., Genet. Vaccines Ther.2, 17, 2004). Se ha rediseñado un gran número de genes sintéticos para aumentar su nivel de expresión. La base de datos de genes sintéticos (SGDB) (Wu, G. et al., Nucleic Acids Res. 35, D76-D79, 2007) contiene información de más de 200 experimentos publicados sobre genes sintéticos. En el proceso de diseño de una secuencia de ácido nucleico que se insertará en un nuevo huésped para expresar una determinada proteína en cantidades óptimas, la optimización del uso de codones suele ser uno de los primeros pasos (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004). La optimización del uso de codones básicamente implica alterar los codones raros en el gen diana para que reflejen más estrechamente el uso de codones del huésped sin modificar la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada (Gustafsson, C., Trends Biotechnol. 22, 346-353, 2004). La información que se utiliza habitualmente para el proceso de optimización es, por tanto, la secuencia de ADN o proteína que se va a optimizar y una tabla de uso de codones (conjunto de referencia) del huésped.

[0050] Hay varios servidores web públicos y aplicaciones independientes que permiten algún tipo de optimización de codones por parte de cualquier experto en la materia. 'GeneDesign' (Richardson, SM et al., Genome Res. 16, 550­ 556, 2006), 'Synthetic Gene Designer '(Wu, G. et al., Protein Expr. Purif. 47, 441-445, 2006) y' Gene Designer '(Villalobos, A. et al., BMC Bioinformatics 7, 285, 2006) son paquetes que proporcionar una plataforma para el diseño de genes sintéticos, incluido un paso de optimización de codones. Con respecto a los procedimientos para la optimización del uso de codones disponibles en cada servidor o programa, los primeros programas desarrollados utilizaron solo el enfoque de "un aminoácido-un codón". Los programas y servidores más recientes ahora incluyen procedimientos adicionales para crear cierta variabilidad en el uso de codones. Esta variabilidad refleja la variabilidad del uso de codones de genes naturales altamente expresados y permite introducir criterios adicionales (tal como evitar sitios de restricción) en el proceso de optimización. La mayoría de las aplicaciones y servidores web descritos en este documento proporcionan tres procedimientos de optimización de codones: una optimización completa de todos los codones, una optimización basada en las frecuencias relativas de uso de codones del conjunto de referencia que utiliza un enfoque de Monte Carlo y un enfoque novedoso diseñado para maximizar la optimización con los cambios mínimos entre las secuencias consulta y las secuencias optimizadas.

[0051] En una realización, la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína menor de PRRSV recombinante, antígeno, péptido, polipéptido, fragmento, dominio o epítopo está optimizado en codones para la expresión en animales. En otra realización, las secuencias con codones optimizados codifican proteínas de envoltura menores de PRRSV porcino, antígenos, péptidos, polipéptidos, fragmentos, dominios o epítopos para la expresión animal. En otra realización más, las secuencias optimizadas en codones codifican proteínas, antígenos, péptidos, polipéptidos, fragmentos, dominios o epítopos de gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV para la expresión animal.

[0052] Los siguientes son ejemplos de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ARNsi, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de enlace, tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tales como por conjugación, con un componente de mareaje. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son bloqueantes, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales por un análogo e introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcaje, otros polinucleótidos o soporte sólido. Los polinucleótidos pueden obtenerse mediante síntesis química o derivarse de un microorganismo.

[0053] El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por tanto, los genes incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o simplemente las secuencias codificantes como en los ADNc y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Por ejemplo, gen también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.

[0054] La presente invención comprende además una cadena complementaria a un polinucleótido que codifica una proteína de la envoltura menor de PRRSV, antígeno, epítopo o inmunógeno. La cadena complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud, y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación de los mismos.

[0055] Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos y puede estar interrumpido por restos químicos distintos de los aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un marcaje o componente bioactivo.

[0056] Un polinucleótido o polipéptido “aislado” es uno que es "sustancialmente libre" de los materiales con los que está asociado en su entorno nativo. Por "sustancialmente libre" se entiende que el polinucleótido o polipéptido está al menos 50%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95% libre de estos materiales. Si el polinucleótido o polipéptido "aislado" se designa como "casi completamente libre de contaminantes", significa que el polinucleótido o polipéptido aislado está al menos en un 98% libre de estos materiales.

[0057] En el presente documento se describen polinucleótidos que codifican variantes y derivados de los polipéptidos del PRRSV funcionalmente equivalentes y fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que pueden potenciar, disminuir o no afectar significativamente las propiedades inherentes de los polipéptidos codificados por los mismos. Estas variantes, derivados y fragmentos funcionalmente equivalentes muestran la capacidad de retener la actividad. Por ejemplo, los cambios en una secuencia de ADN que no cambian la secuencia de aminoácidos codificada, así como aquellos que resultan en sustituciones conservadoras de residuos de aminoácidos, una o unas pocas deleciones o adiciones de aminoácidos, y sustitución de residuos de aminoácidos por análogos de aminoácidos, son aquellos que no afectarán significativamente en las propiedades del polipéptido codificado. Tal como se describe en el presente documento, las variantes tienen al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de homología o identidad con el polinucleótido o polipéptido de PRRSV de interés.

[0058] En el presente documento se describen polipéptidos de PRRSV, particularmente polipéptidos de la envoltura menores de PRRSV. En el presente documento se describe un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139, o variantes o fragmentos del mismo.

[0059] En el presente documento se describe un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con el polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV de la presente invención, particularmente con el polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20 ,31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139.

[0060] En el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E del PRRSV identificados anteriormente (SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34 -39, 40-45, 46-51, 52-58, 59­ 61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139) que pueden prepararse fácilmente por un experto en la técnica utilizando técnicas de biología molecular conocidas. Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con los polipéptidos antigénicos de la presente invención, particularmente con la secuencia de aminoácidos como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139.

[0061] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos del polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E del PRRSV que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139, o variantes del mismo. Tal como se describe en el presente documento, un fragmento del polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E del PRRSV incluye un epítopo antigénico específico que se encuentra en un polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E del PRRSV de longitud completa.

[0062] En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E de PRRSV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16 , 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139. En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E del PRRSV puede estar optimizado en codones para la expresión en una especie animal específica.

[0063] En el presente documento se describe un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78, o una variante del mismo. En el presente documento se describe un polinucleótido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78, o una variante del mismo.

[0064] En el presente documento se describen polipéptidos de PRRSV, particularmente polipéptido E de PRRSV. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139, y una variante o fragmento del mismo.

[0065] En el presente documento se describe un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identidad de secuencia con un polipéptido E de PRRSV como se describe en el presente documento, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139.

[0066] En el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos E de PRRSV identificados anteriormente (SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139) que pueden prepararse fácilmente por un experto en la técnica utilizando técnicas de biología molecular conocidas.

[0067] Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con los polipéptidos antigénicos descritos en este documento, particularmente con la secuencia de aminoácidos que se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139.

[0068] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido E de PRRSV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos del polipéptido E de PRRSV que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139, o variantes del mismo. Tal como se describe en el presente documento, un fragmento de un polipéptido E de PRRSV incluye un epítopo antigénico específico que se encuentra en un polipéptido de PRRSV E de longitud completa.

[0069] En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido E de PRRSV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139. En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido E de PRRSV puede estar optimizados en codones para la expresión en una especie animal específica.

[0070] En el presente documento se describen polipéptidos de PRRSV, particularmente polipéptido gp2 de PRRSV. En el presente documento se describe un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, y una variante o fragmento del mismo.

[0071] En el presente documento se describe un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identidad de secuencia con un polipéptido gp2 de PRRSV como se describe en el presente documento, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89.

[0072] En el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos gp2 de PRRSV identificados anteriormente (SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89) que pueden prepararse fácilmente por un experto en la técnica usando bien técnicas de biología molecular conocidas.

[0073] Las variantes son polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con los polipéptidos antigénicos descritos en este documento, particularmente con la secuencia de aminoácidos que se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89.

[0074] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gp2 de PRRSV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos del polipéptido gp2 de PRRSV que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, o variantes de la misma. Tal como se describe en el presente documento, un fragmento de un polipéptido gp2 de PRRSV incluye un epítopo antigénico específico que se encuentra en un polipéptido gp2 de PRRSV de longitud completa.

[0075] En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido gp2 de PRRSV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89. En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp2 de PRRSV puede tener estar optimizado en codones para la expresión en una especie animal específica.

[0076] En el presente documento se describen polipéptidos de PRRSV, particularmente el polipéptido gp3 de PRRSV. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45, y una variante o fragmento de la misma.

[0077] En el presente documento se describe un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identidad de secuencia con un polipéptido gp3 de PRRSV descrito en este documento, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45.

[0078] En el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos gp3 de PRRSV identificados anteriormente (SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45) que pueden ser preparados fácilmente por un experto en la técnica usando técnicas de biología molecular bien conocidas.

[0079] Las variantes son polipéptidos homólogos tienen una secuencia de amino ácido de al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con los polipéptidos antigénicos descritos en este documento, particularmente a la secuencia de aminoácidos que se establece en SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45.

[0080] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gp3 de PRRSV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos del polipéptido gp3 de PRRSV que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 3, 16 o 40­ 45, o variantes de la misma. Tal como se describe en el presente documento, un fragmento de un polipéptido gp3 de PRRSV incluye un epítopo antigénico específico que se encuentra en un polipéptido gp3 de PRRSV de longitud completa.

[0081] En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido gp3 de PRRSV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 3, 16 o 40­ 45. En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 3, 16 o 40-45, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp3 de PRRSV puede tener codones optimizados para la expresión en una especie animal específica.

[0082] En el presente documento se describen polipéptidos de PRRSV, particularmente polipéptido gp4 de PRRSV. En otro aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51, y una variante o fragmento de la misma.

[0083] En el presente documento se describe un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido gp4 de PRRSV descrito en este documento, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51.

[0084] En el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos gp4 de PRRSV identificados anteriormente (SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51) que pueden ser preparados fácilmente por un experto en la técnica usando técnicas de biología molecular bien conocidas.

[0085] Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con los polipéptidos antigénicos tal como se describe en el presente documento, particularmente a la secuencia de aminoácidos que se establece en SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51.

[0086] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gp4 de PRRSV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos del polipéptido gp4 de PRRSV que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 5, 18 o 46­ 51, o variantes de la misma. En el presente documento se describe un fragmento de un polipéptido gp4 de PRRSV que incluye un epítopo antigénico específico que se encuentra en un polipéptido gp4 de PRRSV de longitud completa.

[0087] En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido gp4 de PRRSV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 5, 18 o 46­ 51. En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99 % de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 5, 18 o 46-51, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp4 de PRRSV puede estar optimizado en codones para la expresión en una especie animal específica.

[0088] En el presente documento se describen polipéptidos de PRRSV, particularmente polipéptido gp5a de PRRSV. En el presente documento se describe un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 31 o 62-65, y una variante o fragmento del mismo.

[0089] En el presente documento se describe un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido gp5a de PRRSV tal como se describe en el presente documento, particularmente con los polipéptidos que tienen una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 31 o 62-65.

[0090] En el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos gp5a de PRRSV identificados anteriormente (SEQ ID NO: 31 o 62-65) que pueden prepararse fácilmente por un experto en la técnica usando técnicas de biología molecular bien conocidas.

[0091] Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con los polipéptidos antigénicos como se describe en el presente documento, particularmente con la secuencia de aminoácidos que se establece en SEQ ID NO: 31 o 62-65.

[0092] Un fragmento inmunogénico de un polipéptido gp5a de PRRSV incluye al menos 8, 10, 15, o 20 aminoácidos consecutivos, al menos 21 aminoácidos, al menos 23 aminoácidos, al menos 25 aminoácidos, o al menos 30 aminoácidos del polipéptido gp5a de PRRSV que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 31 o 62-65, o variantes del mismo. En el presente documento se describe un fragmento de un polipéptido gp5a de PRRSV que incluye un epítopo antigénico específico que se encuentra en un polipéptido gp5a de PRRSV de longitud completa.

[0093] En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido gp5a de PRRSV, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 31 o 62­ 65. En el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 31 o 62-65, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos. El polinucleótido que codifica el polipéptido gp5a de PRRSV puede estar optimizado en codones para la expresión en una especie animal específica.

[0094] En el presente documento se describe un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78, o una variante de los mismos. En el presente documento se describe un polinucleótido que tiene al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno de un polinucleótido que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78, o una variante de las mismas.

[0095] En el presente documento se describe una composición inmunológica o de vacuna segura y eficaz que comprende: uno o más vectores virales recombinantes, que comprenden uno o más polinucleótidos heterólogos, que codifican uno o más antígeno, polipéptido, ectodominio gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E o variante del mismo del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV); y un portador farmacéutica o veterinariamente aceptable. "Variante del mismo" pretende abarcar versiones inmunológicamente equivalentes de los antígenos, polipéptidos y ectodominios, incluidas, por ejemplo, variantes reorientadas de las proteínas descritas en el presente documento. "Inmunológicamente equivalente" significa que la "variante del mismo" es capaz de provocar una respuesta inmunitaria sustancialmente similar, en comparación con el antígeno, polipéptido o ectodominio que incluye una respuesta inmunitaria protectora.

[0096] En algunas realizaciones de la composición de la presente invención, el uno o más vectores comprenden un vector de adenovirus 5 PRRSV recombinante (Ad5-PRRSV), un vector de baculovirus PRRSV recombinante, un vector de citomegalovirus porcino PRRSV o un vector de virus de la viruela PRRSV recombinante.

[0097] Tal como se describe en el presente documento, el uno o más vectores comprenden: una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno, polipéptido, ectodominio E o variante del mismo de PRRSV; o, una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno, polipéptido, ectodominio gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o M o variante del mismo de PRRSV modificado, en el que una secuencia de localización celular existente de gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o M ha sido reemplazado por una secuencia determinante de la expresión de la superficie celular de un gen heterólogo. Tal como se describe en el presente documento, el uno o más vectores comprenden una mezcla de dos vectores, un primer vector que expresa proteínas menores de PRRSV redirigidas y un segundo vector que expresa proteínas principales de PRRSV redirigidas.

[0098] En algunas realizaciones, el vector o vectores recombinantes de acuerdo con la presente invención comprenden un polinucleótido que codifica un antígeno, polipéptido o ectodominio que tiene: al menos 90% de identidad de secuencia con una cualquiera o más de SEQ ID No : 1, 3, 5 ,7 , 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139; o, al menos el 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46 -51, 52-58, 59­ 61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139.

[0099] En algunas realizaciones, el vector Ad5-PRRSV recombinante de acuerdo con la presente invención comprende un polinucleótido que tiene: al menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID n O: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78; o, al menos el 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio codificada por una subsecuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30 ,67 , 69, 70, 72, 74, 76 o 78.

[0100] En algunas realizaciones, la composición o vacuna de acuerdo con la presente invención comprende uno o dos vectores de Ad5-PRRSV. Tal como se describe en el presente documento, el Ad5-PRRSV puede expresar gp2 y E; gp2, gp4 y E; gp2, gp3, gp4 y E; rtg-gp2, rtg-gp3 y rtg-gp4; rtg-gp2 y E; rtg-gp2, rtg-gp4 y E; rtg-gp3 y E; rtg-gp4 y E; E solo; rtg-E solo; rtg-gp5, rtg-M.

[0101] En algunas realizaciones, el vector de Ad5-PRRSV recombinante de acuerdo con la presente invención comprende un polinucleótido que codifica un antígeno, polipéptido o ectodominio que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16 , 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139; o comprende un polinucleótido que codifica un ectodominio que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39,40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139.

[0102] En algunas realizaciones, el vector de Ad5-PRRSV recombinante de acuerdo con la presente invención comprende un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78; o comprende un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad con una secuencia de ectodominio codificada por una subsecuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78.

[0103] Tal como se describe en el presente documento, el vector de Ad5-PRRSV recombinante comprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más antígeno E, polipéptido, ectodominio gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E PRRSV, o variantes del mismo, o combinaciones de los mismos.

[0104] En algunas realizaciones, el vector de Ad5-PRRSV recombinante de acuerdo con la presente invención comprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más antígenos, polipéptidos o ectodominios que tienen: (a) al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 , o 79-139; o, (b) al menos un 90% de identidad de secuencia con el ectodominio o ectodominios abarcados por una secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139. Por "ectodominio(s) abarcado(s) por", se entiende que solo la porción extracelular (es decir, no la porción transmembrana o citoplásmica) de una SEQ ID NO dada se somete a la limitación de identidad de secuencia porcentual. Por ejemplo, si un polipéptido que consiste en 200 aminoácidos tiene un ectodominio que abarca los aminoácidos # 20 a 100, un polipéptido de comparación solo debe ser idéntico en un 90% (es decir, en el caso de un lenguaje de identidad de secuencia del 90%) en los aminoácidos 20 a 100. Ahora que la invención ha sido divulgada, los solicitantes prevén que la persona experta puede seleccionar rutinariamente entre una amplia variedad de TMD y CTD para combinar con los ectodominios de los polipéptidos de PRRSV protectores individuales y combinados descritos.

[0105] En algunas realizaciones, el uno o más polinucleótidos tienen al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en la SEQ iD NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78; o, los polinucleótidos tienen al menos un 90% de identidad de secuencia a lo largo de un ectodominio codificado por una secuencia como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78. El experto en la materia que utilice técnicas de rutina puede comprender o determinar qué secuencias de polinucleótidos codifican ectodominios.

[0106] En algunas realizaciones, el vector de Ad5-PRRSV de acuerdo con la presente invención comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido gp2 de PRRSV que tiene: (a) al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 (proteína gp2); o (b) al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89.

[0107] En algunas realizaciones, el vector de Ad5-PRRSV de acuerdo con la presente invención comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido E de PRRSV que tiene: (a) al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteína E); o (b) al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139.

[0108] En algunas realizaciones, el vector de Ad5-PRRSV de acuerdo con la presente invención comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido gp3 de PRRSV que tiene: (a) al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en la SEQ ID NO: 5, 18, 40-45 o 90-99 (proteína gp3); o (b) al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 5, 18, 40-45 o 90-99.

[0109] En algunas realizaciones, el vector de Ad5-PRRSV según la presente invención comprende dos polinucleótidos que codifican los polipéptidos gp2 y E de PRRSV que tiene: (a) al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1 , 14, 34-39 u 80-89 (proteína gp2) y una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteína E); o (b) al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 (proteína gp2) y una secuencia de ectodominio como se establece en un subsecuencia de SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteína E).

[0110] En algunas realizaciones, el vector de Ad5-PRRSV de acuerdo con la presente invención comprende polinucleótidos que codifican los polipéptidos gp2, E y gp4 de PRRSV que tienen: (a) al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 14,34-39 u 80-89 (proteína gp2), una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 (proteína E) y una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 5, 18, 40-45, 90-99 (proteína gp3); o (b) al menos un 90% de identidad de secuencia con un ectodominio abarcado por una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 (proteína gp2), un ectodominio abarcado por uno de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58, o 130-139 (proteína E) y un ectodominio abarcado por una de las secuencias como se indica en SEQ ID NO: 5, 18, 40-45,90-99 (proteína gp3).

[0111] En el presente documento se describe un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria protectora en un animal que lo necesite contra el PRRSV que comprende administrar al animal un vector Ad5-PRRSV recombinante que expresa al menos un antígeno gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E del PRRSV y un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0112] El procedimiento descrito en el presente documento el vector Ad5-PRRSV comprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos que tienen: (a) al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID No : 1, 14, 34-39 u 80-89 (proteína gp2) y SEQ ID NO: 7, 20, 52­ 58 o 130-139 (proteína E); o (b) al menos un 90% de identidad de secuencia con el ectodominio o ectodominios de la proteína gp2 o o la proteína E abarcados por las SEQ ID NO anteriores correspondientes.

[0113] El procedimiento de la reivindicación 24, en el que el vector Ad5-PRRSV comprende uno o más polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos que tienen al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34 -39, o 80-89 (proteína gp2), una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58, o 130-139 (proteína E) y una de las secuencias como se indica en SEQ ID NO: 5, 18, 40­ 45, 90-99 (proteína gp3); o (b) al menos un 90% de identidad de secuencia con los ectodominios de gp2, E y gp3 abarcados por las SEQ ID NO anteriores correspondientes.

[0114] Tal como se describe en el presente documento, la administración es por vía oro-nasal, aerosol, agua potable, administración intramuscular, o subcutánea, intradérmica, transdérmica. En algunas realizaciones, la administración es de sensibilización-refuerzo. Tal como se describe en el presente documento, la primera vacunación es una mezcla de dos vectores Ad5, el primero que expresa proteínas menores de PRRSV redirigidas y el segundo que expresa proteínas principales de PRRSV; y el refuerzo comprende o consiste esencialmente en ambos vectores de la primera vacunación o en cualquier vector solo. Tal como se describe en el presente documento, el animal que necesita protección es un animal porcino.

[0115] En general, la comparación de las secuencias de aminoácidos se lleva a cabo alineando una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de una estructura conocida con la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de estructura desconocida. A continuación, se comparan los aminoácidos en las secuencias y se agrupan los grupos de aminoácidos que son homólogos. Este procedimiento detecta regiones conservadas de los polipéptidos y tiene en cuenta las inserciones y las deleciones de los aminoácidos. La homología entre las secuencias de aminoácidos se puede determinar usando los algoritmos disponibles comercialmente (ver también la descripción de homología anterior). Además de los mencionados de otro modo en el presente documento, también se mencionan los programas BLAST, gapped BLAST, BLASTN, BLASTP y PSI-BLAST, proporcionados por el Centro Nacional para la Información Biotecnológica. Estos programas se utilizan ampliamente en la técnica para este propósito y pueden alinear regiones homólogas de dos secuencias de aminoácidos.

[0116] Alternativamente o adicionalmente, el término “homología” o "identidad", por ejemplo, con respecto a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos, puede indicar una medida cuantitativa de homología entre dos secuencias. El porcentaje de identidad de secuencias puede calcularse como: (N e - Nd/r)*100/Nref, en la que Ndf es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en la que N e es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia del 75% con la secuencia AATCAATC (N e = 8; Ndf = 2).

[0117] Alternativa o adicionalmente, la “homología” o "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en que la alineación de las dos secuencias puede determinarse de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur & Lipman, 1983), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalización por hueco de 4, y se puede realizar convenientemente un análisis asistido por ordenador e interpretación de los datos de secuencia que incluyen alineación utilizando programas disponibles comercialmente (por ejemplo, Vector NTI software™, Invitrogen Inc. CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden derivarse de secuencias de ADN, considerándose timidina (T) en la secuencia de ADN igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN. Y, sin demasiada experimentación, el experto puede consultar muchos otros programas o referencias para determinar el porcentaje de la homología.

[0118] En el presente documento se describen los polinucleótidos de PRRSV contenidos en una molécula de vector o un vector de expresión y unidos operativamente a un elemento promotor y opcionalmente a un potenciador.

[0119] Un “vector” se refiere a un plásmido, bacteriófago o un virus de ADN o ARN recombinante que comprende un polinucleótido heterólogo para ser suministrado a una célula diana, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para fines de prevención o terapia y, opcionalmente, puede estar en forma de un casete de expresión. Tal como se usa en este documento, un vector no necesita ser capaz de replicarse en la célula diana o el sujeto final. El término “vector” incluye los vectores de clonación, así como los vectores virales.

[0120] El término “modificado” o “recombinante” significa un polinucleótido de origen semisintético o de origen sintético que o bien no se produce en la naturaleza o está ligado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.

[0121] “Heterólogo” significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad a la que se está comparando. Por ejemplo, un polinucleótido puede incorporarse mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o un vector derivado de una fuente diferente y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y unido operativamente a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

[0122] Los polinucleótidos, tal como se describen en el presente documento, pueden comprender secuencias adicionales, tales como secuencias de codificación adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control, tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, 5'UTR, 3'UTR, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o un promotor diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquiera de dichas construcciones puede ser deseable para proporcionar realizaciones de la presente invención.

[0123] Los elementos para la expresión de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV están presentes de manera ventajosa en un vector de la invención. De manera mínima, comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un codón de iniciación (ATG), un codón de terminación y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores, tales como plásmidos y ciertos vectores virales. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de polipéptido, por ejemplo, un péptido de PRRSV, ventajosamente en el vector, se coloca un ATG en 5' del marco de la lectura y un codón de terminación en 3'. Pueden estar presentes otros elementos para controlar la expresión, tales como secuencias potenciadoras, secuencias estabilizadoras, tales como secuencias de intrones y/o 5' o 3' no traducidas y secuencias señal que permiten la secreción de la proteína.

[0124] Los procedimientos para fabricar y/o administrar un vector o recombinantes o plásmidos para la expresión de productos génicos de la presente invención in vivo o in vitro pueden ser cualquier procedimiento deseado, por ejemplo, un procedimiento que sea similar o análogo a los procedimientos descritos en los documentos citados en : Patentes de Estados Unidos N° 4,603,112; 4,769,330; 4,394,448; 4,722,848; 4,745,051; 4,769,331; 4.945.050; 5,494,807; 5,514,375; 5,744,140; 5,744,141; 5,756,103; 5,762,938; 5,766,599; 5,990,091; 5,174,993; 5,505,941; 5,338,683; 5,494,807; 5,591,639; 5,589,466; 5,677,178; 5,591,439; 5,552,143; 5,580,859; 6,130,066; 6,004,777; 6,130,066; 6,497,883; 6,464,984; 6,451,770; 6,391,314; 6,387,376; 6,376,473; 6,368,603; 6,348,196; 6,306,400; 6,228,846; 6,221,362; 6,217,883; 6,207,166; 6,207,165; 6,159,477; 6,153,199; 6,090,393; 6,074,649; 6.045.803; 6,033,670; 6,485,729; 6,103,526; 6,224,882; 6,312,682; 6, 348.450; 6.312.683 y 6.596.279; Solicitud de patente de Estados Unidos número de serie 12/753,597; WO 90/01543; WO91/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0370573.

[0125] La presente invención se refiere también a una composición o vacuna que comprende vectores, tales como vectores de expresión. La composición o vacuna como se describe en el presente documento puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión, tales como vectores de expresión in vivo, que comprenden, consisten esencialmente en o consisten en (o expresan) uno o más de polipéptidos, antígenos, epítopos o inmunógenos de PRRSV. El vector contiene y expresa un polinucleótido que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en un polinucleótido que codifica (o expresa) un antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV, en un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable.

[0126] Tal como se describe en el presente documento, el vector o vectores en la composición o vacuna comprenden, o consisten esencialmente en, o consisten en un polinucleótido o polinucleótidos que codifican una o más proteínas o fragmento(s) de las mismas de un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV. La composición o vacuna de la presente invención comprende, consiste esencialmente en, o consiste en, uno o más vectores que comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en, y ventajosamente también expresan, in vivo en condiciones apropiadas o condiciones adecuadas o en una célula huésped adecuada, polinucleótidos de diferentes aislados de PRRSV que codifican las mismas proteínas y/o proteínas diferentes.

[0127] El término plásmido cubre cualquier unidad de transcripción de ADN que comprende un polinucleótido de acuerdo con la presente invención y los elementos necesarios para su expresión in vivo en una célula o células del huésped o diana deseada; y, a este respecto, se observa que se pretende que un plásmido superenrollado y todos sus topoisómeros, plásmido circular abierto, así como formas lineales del plásmido, estén dentro del alcance de la presente invención.

[0128] Cada plásmido comprende o contiene o consiste esencialmente en, además del polinucleótido heterólogo que codifica una proteína, antígeno, epítopo o inmunógeno recombinante, opcionalmente fusionado con un polinucleótido que codifica una secuencia, variante, análogo o fragmento de péptido heterólogo, unido operativamente a un promotor o bajo el control de un promotor o dependiente de un promotor. En general, es ventajoso emplear un promotor fuerte que sea funcional en células eucariotas. El promotor fuerte preferido es el promotor de citomegalovirus temprano inmediato (CMV-IE) de origen humano o murino, u opcionalmente que tiene otro origen tal como rata o cobaya. El promotor CMV-IE puede comprender el segmento promotor real, que puede estar asociado o no con el segmento potenciador. Se puede hacer referencia a los documentos EP-A-260 148, EP-A-323597, Patentes de Estados Unidos Nos. 5,168,062, 5,385,839 y 4,968,615, así como a la Solicitud PCT N° WO87/03905. El promotor CMV-IE es ventajosamente un CMV-IE humano (Boshart et al., 1985) o CMV-IE murino.

[0129] En términos más generales, el promotor tiene un origen viral o un origen celular. Un promotor viral fuerte distinto del CMV-IE que puede emplearse de forma útil en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que puede emplearse de forma útil en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto, tal como, por ejemplo, el promotor de desmina (Kwissa et al., 2000), o el promotor de actina (Miyazaki et al., 1989).

[0130] Los subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, porciones de estos promotores que mantienen una actividad promotora adecuada, se incluyen dentro de la presente invención, por ejemplo, promotores CMV-IE truncados según la solicitud PCT No. WO98/00166 o la patente de Estados Unidos No. 6,156,567. En consecuencia, un promotor en la práctica de la presente invención incluye derivados y subfragmentos de un promotor de longitud completa que mantienen una actividad promotora adecuada y, por lo tanto, funcionan como promotores, preferiblemente promoviendo una actividad sustancialmente similar a la del promotor real o de longitud completa a partir del cual se deriva el derivado o subfragmento, por ejemplo, de manera similar a la actividad de los promotores CMV-IE truncados de la patente de Estados Unidos No.6,156,567 a la actividad de los promotores CMV-IE de longitud completa. Por lo tanto, un promotor CMV-IE en la práctica de la presente invención puede comprender o consistir esencialmente en o consistir en la porción de promotor del promotor de longitud completa y/o la porción de potenciador del promotor de longitud completa, así como derivados y subfragmentos.

[0131] Preferiblemente, los plásmidos comprenden o consisten esencialmente en otros elementos de control de expresión. Es particularmente ventajoso incorporar secuencia(s) estabilizadora(s), por ejemplo, secuencia(s) de intrón, preferiblemente el primer intrón del hCMV-IE (Solicitud PCT No. WO89/01036), el intrón II del gen de la p-globina de conejo (van Ooyen et al., 1979).

[0132] En cuanto a la señal de poliadenilación (poliA) para los plásmidos y vectores virales distintos de virus de la viruela, puede usarse la señal de poli(A) del gen de la hormona de crecimiento bovina (bGH) (véase la patente de Estados Unidos 5,122,458), o la señal de poli(A) del gen de beta-globina de conejo o la señal de poli(A) del virus SV40.

[0133] De acuerdo con otra realización de la presente invención, los vectores de expresión son vectores de expresión usados para la expresión in vitro de proteínas en un sistema celular apropiado. Las proteínas expresadas pueden recolectarse en o del sobrenadante del cultivo después, o no después, de la secreción (si no hay secreción, típicamente ocurre o se realiza una lisis celular), opcionalmente se concentran mediante procedimientos de concentración tales como ultrafiltración y/o se purifican mediante medios de purificación, tales como procedimientos de cromatografía de afinidad, de intercambio iónico o de filtración en gel.

[0134] Una "célula huésped" indica una célula procariota o eucariota que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se refiere a células genéticamente alteradas, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada como a la progenie de la misma. Las células huésped incluyen células de riñón de cría de hámster (BHK), células de carcinoma de colon (Caco-2), células COS7, células HEK 293, células MCF-7, células MCF-10A, líneas de riñón canino Madin-Darby (MDCK), células de pulmón de visón (Mv1Lu), células MRC-5, células U937, células de ovario de hásmter chino (CHO), células Vero de mono (línea celular con el origen del riñón de un mono verde africano), codorniz (línea celular QM7 del músculo de codorniz), línea celular de pollo DF1 y células VERO. Los polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada pueden insertarse en un vector de clonación o expresión adecuado, y el vector, a su vez, puede introducirse en una célula huésped adecuada para su replicación y amplificación. Los polinucleótidos pueden introducirse en las células huésped mediante cualquier medio conocido en la técnica. Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped mediante cualquiera de varios medios apropiados, incluyendo absorción directa, endocitosis, transfección, apareamiento f, electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (donde el vector es infeccioso, por ejemplo, un vector retroviral). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula huésped.

[0135] En una realización de la presente invención, el vector es un vector Ad5 como se describe en el documento US 2010/0255029.

[0136] Las ventajas de las vacunas de PRRSV basadas en el vector de Ad5 incluyen (1) inducir una amplia inmunidad, que incluye respuestas humorales, celulares y mucosas (2) no expresan todas las proteínas de PRRSV y, por lo tanto, son compatibles con estrategia DIVA (diferenciar los animales infectados de los vacunados), (3) inducir un rápido inicio de la inmunidad, y (4) la producción presenta menos riesgo para el medio ambiente que las vacunas inactivadas en caso de liberación accidental.

[0137] Un aspecto de la presente invención se refiere a vectores de Ad5 modificados o recombinantes de acuerdo con la presente invención que expresan antígenos de PRRSV. El antígeno puede ser proteínas menores de la envoltura de PRRSV, tales como gp2, gp3, gp4, gp5a o proteína E, mencionadas anteriormente. El vector de Ad5 modificado de acuerdo con la presente invención puede comprender uno o más polinucleótidos que codifican antígenos de PRRSV. En otro aspecto, el vector de Ad5 modificado según la presente invención comprende uno o más polinucleótidos que codifican un antígeno gp2 del PRRSV o una variante del mismo, un antígeno E del PRRSV o una variante del mismo, un antígeno gp3 del PRRSV o una variante del mismo, un antígeno del PRRSV o una variante del mismo, un antígeno gp4 o variante del mismo, o una combinación de los mismos.

[0138] En el presente documento se describe la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación para la administración y expresión de una proteína, antígeno, epítopo o inmunógeno en una célula diana.

La determinación de la cantidad profilácticamente o terapéuticamente eficaz es una experimentación de rutina para un experto en la técnica. Tal como se describe en el presente documento, la formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa un antígeno, epítopo o inmunógeno de la envoltura menor de PRRSV y un portador, vehículo, adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización ventajosa, el portador, vehículo, adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección y/o mejora la conservación del vector o proteína.

[0139] Los portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables son bien conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, un portador o vehículo o adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser agua estéril, una solución de NaCl al 0,9% (por ejemplo, solución salina) o un tampón fosfato. Otros portadores o vehículos o adyuvantes o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden usar para los procedimientos de la presente invención incluyen poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El portador o vehículo o adyuvante o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que faciliten la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector de la invención in vitro); ventajosamente, el portador, vehículo o adyuvante o excipiente pueden facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y los volúmenes de dosis se discuten en el presente documento en la descripción general y también pueden ser determinados por el experto en la materia a partir de esta descripción leída junto con el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.

[0140] Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario que son, pero no exclusivamente, adecuados para plásmidos, son aquellos que tienen la siguiente fórmula:

en la que R1 es un radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado que tiene de 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 o 3 átomos de carbono y X es un grupo amina o hidroxilo, por ejemplo, DMRIE. En otra realización, el lípido catiónico puede estar asociado con un lípido neutro, por ejemplo DOPE.

[0141] Entre estos lípidos catiónicos, se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propano amonio; WO96/34109), ventajosamente asociado con un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoilfosfatidil-etanolamina; Behr, 1994), para formar DMRIE-DOPE.

[0142] La mezcla de plásmido con el adyuvante se forma de manera extemporánea y/o simultánea con la administración de la preparación o poco antes de la administración de la preparación; por ejemplo, poco antes o antes de la administración, se forma la mezcla de plásmido-adyuvante, ventajosamente para dar tiempo suficiente antes de la administración para que la mezcla forme un complejo, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 minutos antes de la administración, tal como aproximadamente 30 minutos antes de la administración.

[0143] Cuando DOPE está presente, la relación molar de DMRIE:DOPE puede ser de aproximadamente 95:aproximadamente 5 a aproximadamente 5:aproximadamente 95, o de aproximadamente 1:aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1. La relación en peso de adyuvante DMRIE o DMRIE-DOPE:plásmido puede ser de entre aproximadamente 50:aproximadamente 1 y aproximadamente 1:aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 5, y ventajosamente de aproximadamente 1: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2.

[0144] En otra realización, el portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de agua-en-aceite. Ejemplos de emulsiones de agua-en-aceite adecuados incluyen emulsiones vacunales de agua-en-aceite de base aceite que son estables y fluidas a 4° C que contienen: de 6 a 50% v/v de una fase acuosa que contiene el antígeno, preferiblemente de 12 a 25% v/v, de 50 a 94% v/v de una fase oleosa que contiene en total o en parte un aceite no metabolizable (por ejemplo, aceite mineral, tal como aceite de parafina) y/o aceite metabolizable (por ejemplo, aceite vegetal, o ácido graso, un poliol o ésteres de alcohol), de 0,2 a 20% p/v de tensioactivos, preferiblemente de 3 a 8% p/v, estando el último en total o en parte, o en una mezcla, ya sea de ésteres de poliglicerol, siendo dichos ésteres de poliglicerol preferiblemente (poli)ricinoleatos de poliglicerol, o aceites de ricino polioxietilenados u otros aceites de ricino polioxietilenados hidrogenados. Ejemplos de tensioactivos que pueden usarse en una emulsión de agua-en-aceite incluyen ésteres de sorbitán etoxilados (por ejemplo, monooleato de sorbitán polioxietilenado (20) (TWEEN 80®), disponible de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y ésteres de sorbitán (por ejemplo, monooleato de sorbitán (SPAN 80®, disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Además, con respecto a una emulsión de agua-en-aceite, véase también la patente de Estados Unidos 6,919,084. En algunas realizaciones, la fase acuosa que contiene antígeno comprende una solución salina que comprende uno o más agentes tamponantes.

Un ejemplo de una solución tampón adecuada es solución salina tamponada con fosfato. En una realización, la emulsión de agua-en-aceite puede ser una emulsión triple agua/aceite/agua (W/O/W) (véase la patente de Estados Unidos No. 6,358,500). Ejemplos de otras emulsiones adecuadas se describen en la patente de Estados Unidos No.

7,371,395.

[0145] Las composiciones inmunológicas y vacunas de acuerdo con la invención pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para usar en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades CpG no metiladas (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como una emulsión SPT descrita en la pág. 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la pág. 183 del mismo trabajo, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citoquinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) otros adyuvantes descritos en cualquier documento citado e incorporado por referencia en la presente solicitud, o (9) cualquier combinación o mezcla de los mismos.

[0146] La emulsión de aceite en agua (3), que es especialmente apropiada para vectores virales, puede basarse en: aceite de parafina líquido ligero (tipo farmacopea europea), aceite de isoprenoide, tal como escualano, escualeno, aceite resultante de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, ésteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol, o ésteres de alcoholes o ácidos grasos ramificados, especialmente ésteres de ácido isoesteárico.

[0147] El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar una emulsión. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como: ésteres de, por una parte, sorbitán, manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otra parte, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, estando dichos ésteres opcionalmente etoxilados, o bloques de copolímero de polioxipropilenopolioxietileno, tal como Pluronic, por ejemplo, L121.

[0148] Entre los polímeros adyuvantes de tipo (1), se prefieren los polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulado por polialquenil éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el nombre de carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, junio de 1996). Un experto en la técnica también puede hacer referencia a la patente de Estados Unidos 2,909,462, que proporciona tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxílico que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de ocho de tales grupos, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilo sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.) son especialmente adecuados. Se reticulan por alil sacarosa o por alilpentaeritritol. Entre ellos, se hace referencia a Carbopol 974P, 934P y 971P.

[0149] En cuanto a los copolímeros derivados de anhídrido maleico-alquenilo, se da preferencia a EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o reticulados y están, por ejemplo, reticulados por divinil éter. Se hace referencia también a J. Fields et al., 1960.

[0150] Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA están formados preferiblemente por unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:

en la que:

- R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3

- x = 0 o 1, preferiblemente x = 1

- y = 1 o 2, con x y = 2.

Para EMA, x = 0 e y = 2 y para carbómeros x = y = 1.

[0151] Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/l de NaCI) y el pH se puede ajustar a de 7,3 a 7,4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la solución adyuvante en la que se puede incorporar el vector o vectores de expresión. La concentración de polímero en la composición inmunológica o de vacuna final puede oscilar entre 0,01 y 1,5% p/v, de 0,05 a 1% p/v, o de 0,1 a 0,4% p/v.

[0152] La citoquina o citoquinas (5) pueden estar en forma de proteína en la composición inmunológica o de vacuna, o pueden coexpresarse en el huésped con el inmunógeno o inmunógenos o epítopo o epítopos de los mismos. Se da preferencia a la coexpresión de la citoquina o citoquinas, ya sea por el mismo vector que el que expresa el inmunógeno o inmunógenos, o epítopo o epítopos del mismo, o por un vector separado del mismo.

[0153] La presente invención comprende la preparación de tales composiciones de combinación; por ejemplo mezclando los componentes activos, de forma ventajosa, juntos y con un adyuvante, portador, citoquina, y/o diluyente.

[0154] Las citoquinas que se pueden usar en la presente invención incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), interferón a (IFNa), interferón p (IFN-P), interferón y (IFN-y), interleuquina-1a (IL-1a), interleuquina-1p (IL-1P), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-3 (IL-3), interleuquina-4 (IL-4), interleuquina-5 (IL-5), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-7 (IL-7), interleuquina-8 (IL-8), interleuquina-9 (IL-9) , interleuquina-10 (IL-10), interleuquina-11 (IL-11), interleuquina-12 (IL-12), factor de necrosis tumoral a (TNF-a), factor de necrosis tumoral p (TNF-P) y factor de crecimiento transformante p (TGF-P). Se entiende que las citoquinas se pueden coadministrar y/o administrar de manera secuencial con la composición inmunológica o de vacuna según la presente invención. De este modo, por ejemplo, la vacuna según la presente invención puede también contener una molécula de ácido nucleico exógena que expresa in vivo una citoquina adecuada, por ejemplo, una citoquina emparejada a este huésped a vacunar o en el que debe provocarse una respuesta inmunológica (por ejemplo, una citoquina felina para las preparaciones a administrar a felinos).

[0155] En otra realización, la composición de la presente invención se puede preparar usando el procedimiento químico o físico como se describe por Stauffer et al. (Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 1, 291-296, 2006). Algunas de las técnicas de inactivación se resumen en la siguiente tabla.

Tabla 1. Técnicas de inactivación

[0156] La composición inmunológica y/o vacuna de acuerdo con la presente invención comprenden o consisten esencialmente en o consisten en una cantidad eficaz para provocar una respuesta protectora o terapéutica de uno o más vectores de expresión y/o polipéptidos tal como se describe en el presente documento; y se puede determinar una cantidad eficaz a partir de esta descripción y el conocimiento en la técnica, sin gran experimentación.

[0157] Las composiciones o vacunas de la presente invención se pueden administrar a un animal a través de agua potable, oro-nasal, pulverizaciones, aerosoles, instilación intranasal, transdérmica, subcutánea, o inyección intramuscular. Ventajosamente, las vacunas se administran por vía transdérmica, oro-nasal, subcutánea, intramuscular, pulverización o agua potable.

[0158] En el presente documento se describe al menos una administración a un animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica preparada según la presente invención. La composición terapéutica según la presente invención se puede administrar mediante un aparato sin aguja (como, por ejemplo, con un aparato Pigjet, Dermojet, Biojector, Vetjet o Vitajet (Bioject, Oregon, EE. UU.)).

[0159] En una realización de la presente invención, se puede emplear un régimen de sensibilización-refuerzo, que se compone de al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo usando al menos una proteína, polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición inmunológica o vacuna utilizada en la administración primaria es de naturaleza diferente a las utilizadas como refuerzo. Sin embargo, se observa que se puede usar la misma composición como administración primaria y administración de refuerzo. Este protocolo de administración se llama "sensibilización-refuerzo".

[0160] En el protocolo de sensibilización-refuerzo descrito en este documento, se administra una composición que comprende la vacuna o composición de Ad5 de PRRSV modificada seguida de la administración de la vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antígeno de PRRSV in vivo, o una vacuna o composición viral inactivada que comprende el antígeno del PRRSV, o una vacuna o composición que comprende una subunidad (proteína) del PRRSV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa un antígeno del PRRSV. Asimismo, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una vacuna o composición que comprende un vector viral recombinante que contiene y expresa un antígeno de PRRSV in vivo, o una vacuna o composición viral inactivada que comprende el antígeno de PRRSV, o una vacuna o composición que comprende una subunidad (proteína) del PRRSV, o una vacuna o composición de plásmido de ADN que contiene o expresa un antígeno de PRRSV, seguida de la administración de una composición que comprende la vacuna o composición de Ad5 de PRRSV modificada. Se observa que tanto la administración primaria como la secundaria pueden comprender la composición que comprende la composición o la vacuna de Ad5 de PRRSV modificada. Se observa además que tanto la administración primaria como la secundaria pueden comprender una o más composiciones que comprenden los vectores modificados de la presente invención.

[0161] Un protocolo de sensibilización-refuerzo comprende al menos una administración de sensibilización y al menos una administración de refuerzo usando al menos un antígeno común. La vacuna o composición utilizada en la administración de sensibilización puede ser de naturaleza diferente a la utilizada como vacuna o composición de refuerzo posterior. La administración de sensibilización puede comprender una o más administraciones. De manera similar, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones.

[0162] Las diversas administraciones se realizan preferiblemente con de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 semanas de diferencia, o de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 semanas de diferencia. También se contempla un refuerzo repetido cada 2 a 6 semanas o un refuerzo anual. Los animales tienen preferiblemente al menos un día de edad en el momento de la primera administración.

[0163] La composición inmunológica y/o vacuna contiene por dosis de aproximadamente 104 a aproximadamente 1011, ventajosamente de aproximadamente 105 a aproximadamente 1010 y más ventajosamente de aproximadamente 106 a aproximadamente 109 partículas virales del adenovirus recombinante que expresa un antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV. En el caso de la composición inmunológica y/o vacuna basado en un virus de la viruela, una dosis puede estar entre aproximadamente 102 ufp y aproximadamente 109 ufp. La composición inmunológica y/o vacuna contiene por dosis de aproximadamente 102 a aproximadamente 107, ventajosamente de aproximadamente 103 a aproximadamente 105 ufp de recombinante de virus de la viruela o virus del herpes del antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV.

[0164] El vector viral puede ser un vector de expresión de la viruela aviar atenuada. Tal como se describe en el presente documento, el vector de expresión de la viruela aviar “avipox” puede ser un vector de la viruela aviar “fowlpox”, por ejemplo, TROVAC®. Tal como se describe en el presente documento, el vector de expresión avipox puede ser un vector de viruela aviar de canario “canarypox”, por ejemplo, ALVAC®. Tal como se describe en el presente documento, se puede usar una plataforma de expresión de baculovirus. Por ejemplo, los antígenos se pueden producir en un sistema de expresión de baculovirus usando cultivos de células de insectos como huéspedes, y los polipéptidos recombinantes resultantes se pueden administrar a los animales. Alternativamente, el baculovirus recombinante completo puede administrarse como vacuna. En general, el antígeno, epítopo o inmunógeno de PRRSV puede ser una proteína de la envoltura menor de PRRSV, tal como gp2, gp3, gp4, gp5a, gp5 o E. Otros virus que pueden usarse en procedimientos como los descritos en el presente documento incluyen virus vaccinia, tales como un virus vaccinia atenuado, por ejemplo NYVAC, adenovirus y virus del herpes, incluyendo CMV porcino.

[0165] La eficacia de las vacunas puede ser probada aproximadamente 2 a 4 semanas después de la última inmunización mediante la exposición de los animales con una cepa virulenta del PRRSV. Pueden usarse cepas homólogas y heterólogas para la exposición para probar la eficacia de la vacuna. El animal puede exponerse mediante pulverización, intranasal, intramuscular, intratraqueal y/u oral. La exposición viral puede ser de aproximadamente 103 a aproximadamente 109 viriones o unidades infecciosas por dosis, en un volumen que depende de la vía de administración. Por ejemplo, si la administración es por pulverización, se aerosoliza una suspensión de virus para generar gotas de aproximadamente 1 a 200 pm, si la administración es intranasal, intratraqueal u oral, el volumen del virus de exposición es de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 5 ml. Los animales pueden observarse diariamente durante 14 días después de la exposición para detectar signos clínicos y mortalidad. Además, los grupos de animales pueden ser sacrificados y evaluados para detectar hallazgos patológicos. Se pueden recolectar hisopos orofaríngeos, traqueales o cloacales de todos los animales después de la exposición para la detección del virus. La presencia o ausencia de antígenos virales en los tejidos puede evaluarse mediante inmunohistoquímica, aislamiento o titulación viral o detección de ácidos nucleicos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Se pueden recolectar muestras de sangre después de la exposición y se pueden analizar para detectar la presencia de anticuerpos específicos del virus gp2, gp3, gp4, gp5a, E anti-PRRSV. Alternativamente, cuando los vectores modificados contienen etiquetas de epítopo, pueden usarse anticuerpos específicos de etiqueta para detectar la presencia y ubicación de polipéptidos de vacuna recombinantes.

[0166] A partir de la presente descripción y el conocimiento en la técnica, el experto en la materia puede determinar el número de administraciones, la vía de administración, y las dosis a utilizar para cada protocolo de inmunización, sin gran experimentación.

[0167] En el presente documento se describe un kit para realizar un procedimiento de inducción de una respuesta inmunológica o protectora contra PRRSV en un animal que comprende una composición inmunológica o vacuna de Ad5 recombinante o una composición inmunológica o vacuna de PRRSV inactivado e instrucciones para realizar el procedimiento de administración en un cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria en el animal.

[0168] A menos que se indique específicamente de otro modo, la construcción de insertos de ácido nucleico, plásmidos y vectores virales recombinantes se llevó a cabo utilizando las técnicas estándar de biología molecular conocidas en la técnica, por ejemplo, descritas por J. Sambrook et al. (Clonación molecular: Manual de laboratorio, 2a edición, Laboratorio de Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

[0169] Particularmente en cuanto a la elegibilidad de la materia, los vectores descritos en este documento no dan como resultado la expresión en el animal vacunado de niveles naturales de proteínas del PRRSV. La expresión de cada gen está impulsada por elementos promotores heterólogos no nativos, por lo que la cantidad final de cada proteína afín expresada no será equivalente a la producida durante la infección natural por PRRSV. Además, un propósito importante del sistema de expresión descrito es producir niveles relativamente altos de proteínas menores de la envoltura del PRRSV (nativas, modificadas o manipuladas) y presentar adecuadamente las proteínas menores al sistema inmunológico del animal huésped, para provocar en los animales una respuesta inmunitaria segura y protectora. Los niveles y la presentación de las proteínas menores de la envoltura del PRRSV típicas de la infección natural por PRRSV no logran provocar una respuesta inmunitaria segura y eficaz contra las proteínas menores del PRRSV. Por consiguiente, tanto las composiciones de vacuna descritas como su disposición final dentro del animal vacunado difieren significativamente en estructura y función cuando se comparan con sus homólogos naturales más cercanos.

[0170] La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Construcción y prueba de plásmidos que expresan genes de PRRSV

[0171] Con el fin de aumentar la visibilidad para el sistema inmunológico, las proteínas de la envoltura del PRRSV se redirigieron a la superficie celular desde los compartimentos intracelulares mediante la introducción de múltiples cambios mientras se mantenía el dominio extracelular (sitio de unión al posible anticuerpo). La reorientación de los genes de la envoltura se intentó inicialmente eliminando los dominios citoplasmático y transmembrana de la proteína nativa, que es el sitio probable para la señal de retención, y reemplazándolos por dominios similares de la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), otra proteína viral conocida por su expresión en la superficie celular. La secuencia señal de los genes de la envoltura nativa también se reemplazó por la secuencia señal del activador del plasminógeno tisular (tPA), una proteína secretora bien caracterizada, para promover la entrada de las proteínas modificadas a la vía secretora y su expresión final en la superficie celular. También se insertaron etiquetas de epítopos específicos en cada una de las proteínas redirigidas para rastrear la expresión y translocación de las proteínas dentro de la célula. Las etiquetas de epítopo Myc, Flag y HA flanqueadas por secuencias enlazadoras se insertaron en gp2, gp3 y gp4, respectivamente (Figuras 5A-5D).

[0172] Expresión en superficie de proteínas redirigidas. Cada uno de los genes redirigidos se sintetizó en su totalidad y se clonó en el plásmido de expresión con el promotor de CMV. Los plásmidos se transfectaron en células HEK 293T y se detectó la expresión en células fijadas mediante ensayo de inmunofluorescencia (IFA) (Figura 6). La expresión en la superficie celular y la expresión de proteína total se detectaron fácilmente en células transfectadas tanto con gp3-Flag-VSV como con gp4-HA-VSV. Sin embargo, la expresión en células transfectadas con gp2-Myc-VSV se detectó solo después de la permeabilización de las células, lo que indica que las modificaciones introducidas en gp2 no fueron suficientes para reorientar la proteína a la superficie de las células. Además, tras la permeabilización, la tinción para gp2-Myc-VSV fue claramente diferente de la de las proteínas modificadas (redirigidas) gp3 o gp4. En el caso de gp2-myc-VSV, la tinción fue más focal e intensa, mientras que en gp3-Flag-VSV y gp4-HA-VSV fue difusa por toda la célula. Esto indicó que la proteína gp2-VSV-Myc se expresó, pero podría haberse plegado incorrectamente, quedando atrapada en algún compartimento subcelular. Puede haber varias razones por las que la gp2 modificada no puede plegarse correctamente. En primer lugar, pueden ser el requisito de otras partes de la proteína para un plegado adecuado, tal como la secuencia señal, transmembrana o la cola citoplasmática que se eliminaron en el proceso de modificación para la expresión superficial. En segundo lugar, también puede deberse a la eliminación incompleta de los dominios de gp2 que todavía contenían la señal de retención. En tercer lugar, el plegamiento incorrecto podría haber sido inducido debido a la presencia de etiqueta myc, que no está presente ni en gp3 ni en gp4 modificadas. En cuarto lugar, se ha demostrado que la falta de expresión de una de las proteínas menores anula la incorporación de todas las proteínas menores en el virión; por lo tanto, gp2 puede requerir la presencia de gp3 y gp4 para lograr un plegado adecuado.

[0173] Las proteínas redirigidas interactúan para formar oligómeros. La interacción entre proteínas menores se ha implicado mediante un ensayo funcional y se ha demostrado directamente mediante un ensayo bioquímico. Los plásmidos que codifican para cada una de las proteínas redirigidas se cotransfectaron a células HEK-293T y se ensayó la interacción entre las proteínas menores mediante ensayo de coinmunoprecipitación (Co-IP). Tal como se muestra en la FIG. 7, el anticuerpo anti-HA captura específicamente gp4-HA-VSV (carril 3) pero no gp3-flag-VSV (carril 2) o gp2-myc-VSV (carril 1). Sin embargo, cuando todas las proteínas modificadas se cotransfectaron, el mismo anticuerpo anti-HA capturó una banda de proteína adicional distinta de gp4-HA-VSV (carril 4, punto rojo), lo que indica que la proteína adicional tiene interacción directa con gp4-HA -VSV, pero no el anticuerpo anti-HA. El tamaño de esta banda es similar al gp2-Myc-VSV (carril 6) o gp3-Flag-VSV (carril 7), lo que indica que esta proteína que interactúa con gp4 puede ser gp2, gp3 o ambas. Una sonda posterior de la banda adicional en el co-IP (carril 4) con anticuerpo anti-Flag o anti-Myc resultó ser positiva para ambos (no mostrados), lo que indica que esta banda contiene proteínas gp2 y gp3. Por tanto, la conclusión de este y otros experimentos es que las modificaciones introducidas para la expresión superficial de los gps no alteraron su estructura cuaternaria.

[0174] Las proteínas redirigidas mantienen la interacción con el receptor CD163 después de la modificación. El siguiente paso para asegurar el plegamiento adecuado de la proteína redirigida fue demostrar que aún mantienen su capacidad para interactuar con el receptor, el CD163 porcino. Cada uno de los plásmidos que expresan las proteínas redirigidas se cotransfectó con el plásmido que expresa CD163 (dominios 4-9), que se demostró previamente que es suficiente para mediar la entrada del virus en las células diana. Una porción del lisado celular se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-VSV (específico para las proteínas de la envoltura) y la otra porción se inmunoprecipitó con anticuerpo anti-CD163. El lisado precipitado con anticuerpo anti-CD163 se sondeó con anticuerpo anti-CD163 conjugado con biotina para controlar el CD163 de entrada en cada reacción de co-IP (Figura 8C). El lisado inmunoprecipitado con anti-VSV se ejecutó por duplicado y una membrana se sondó con anti-VSV-HRP (Figura 8A), para medir la cantidad de gp modificado, y la otra membrana se sondó con anti-CD163 (figura 8B) para medir la cantidad de CD163 conimunoprecipitado con las glicoproteínas de la envoltura modificadas.

[0175] Todas las glicoproteínas de la envoltura menores modificadas interactúan con CD163, mientras que la gp5 modificada, una glicoproteína importante utilizada como control negativo, tenía una interacción mucho más débil o indetectable con CD163.

Ejemplo 2 - Vacunación animal con plásmidos que expresan el gen de la envoltura del PRRSV combinados

[0176] Treinta y dos cerdos de 3 semanas se dividieron en 4 grupos, de 8 animales cada uno (Tabla 2).

Tabla 2. Detalles del estudio.

[0177] El grupo de tipo salvaje recibií la combinación de 3 plásmidos que expresan los gps no dirigidos, el grupo recombinante recibió la combinación de tres plásmidos que expresan los gps redirigidos (es decir, las Figs. 5B a 5D), el grupo de simulación recibió el plásmido que codifica la glicoproteína de la rabia, mientras que el grupo no vacunado recibió sólo tampón Tris-EDTA. Cada plásmido estaba a una concentración de aproximadamente 1 |jg/|jl y se administraron aproximadamente 400 jg de cada plásmido a 200 j l por cada lóbulo de la oreja. Después de 4 inmunizaciones, cada grupo se dividió adicionalmente y se reforzó con la vacuna muerta, en adyuvante TS6 (US 7.371.395 B2, de Merial), o recibió una quinta ronda de inmunización con ADN.

[0178] Aunque parecía que había una tendencia hacia una mayor protección contra las lesiones pulmonares en los animales vacunados con cualquiera de los plásmidos agrupados, en comparación con los grupos no vacunados o con rabia-G, la media entre todos los grupos no fue estadísticamente diferente. Tampoco hubo una diferencia significativa entre los grupos que recibieron plásmidos dirigidos frente a los redirigidos.

[0179] Por lo tanto, los solicitantes se dispusieron a continuación a poner todos los genes dentro de un único vector, para permitir la expresión simultánea dentro de una sola célula, para facilitar la interacción/oligomerización de las proteínas de la envoltura PRRSV.

Ejemplo 3: Construcción y prueba de vectores virales que expresan genes de PRRSV

[0180] Células y medios. Las células HEK 293 (ATCC) se mantuvieron en MEM (Gibco n° 11095) con suero bovino fetal al 10% (Moregate Batch n° 81827101) a 37° C en CO2 al 5%. Estas células se utilizaron para rescatar el adenovirus recombinante (vAD3041, vAD3042, vAD3038, vAD3033 y vAD3067) y preparar reservas de virus.

[0181] Construcción de vectores virales e inmunógenos. Las proteínas menores de la envoltura del PRRSV incluyen gp2 (ORF2), gp3 (ORF3), gp4 (ORF4) y E (ORF2b). La secuencia de ADN de cada una de estas proteínas se obtuvo de GenBank Accession # U87392 (VR2332, Pr Rs V Tipo II). VR2332 (cepa norteamericana) representa uno de los dos serotipos principales conocidos de PRRSV (Done et al., 1996). El otro, el prototipo Lelystad, es representativo de al menos la mayoría de las cepas que se han aislado en Europa occidental. Las secuencias de codones optimizados de cada proteína se construyeron con el promotor apropiado para expresar todas las proteínas a partir de un solo vector viral (Figura 1). En cada caso, los promotores de SV40 (virus de simio 40) y CMV (citomegalovirus) dirigen la expresión de gp2 y gp4, respectivamente, en direcciones opuestas, tal como se indica mediante flechas. Se prevé que estos promotores puedan intercambiarse, de manera que SV40 podría impulsar la expresión de gp4 y CMV podría impulsar la expresión de gp2. Tales variaciones resultarán obvias para el experto en la materia. Es importante destacar que, debido al papel crítico revelado que desempeñan las proteínas menores de PRRSV en la obtención de una respuesta inmunitaria segura y protectora, los solicitantes esperan que los siguientes enfoques se apliquen igualmente bien a todas las cepas de PRRSV. Por consiguiente, pueden prepararse versiones con codones optimizados de las proteínas menores de Lelystad mediante procedimientos de rutina, y las secuencias resultantes pueden clonarse en los vectores recombinantes de la presente divulgación.

[0182] En todas las construcciones de Ad5 de PRRSV, la expresión de la glicoproteína de la envoltura menor gp3 está promovida por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, del inglés Internal Ribsome Entry Site). La expresión de la glicoproteína E de la envuelta menor en vAD3041 y vAD3067 (Figuras 1C y 1D) está habilitada por la presencia del péptido de autoescisión (p2A), situado en las construcciones de Ad5 inmediatamente después de la región codificante de gp2.

[0183] Además, la semivida de las transcripciones de los promotores SV40 y CMV se ve reforzada por la adición de colas de poli (PA) de SV40 o timidina quinasa (TK). Los sitios attL1 y attL2 (extremo izquierdo y derecho de cada inserto que se muestra en la Figura 1) se usaron para insertar los fragmentos sintéticos completos en el genoma adenoviral por recombinación LR, Gateway Technology (Invitrogen) (creando así vAD3042, vAD3038, vAD3041 y vAD3067). Los insertos de la Figura 1 se sintetizaron químicamente (Genscript) para contener los sitios de restricción apropiados para la clonación en el clon de expresión para generar Ad5 recombinante (Gateway Technology, Invitrogen). Una vez más, se contemplan las variaciones en cuanto a qué elemento promueve la expresión de qué gen de PRRSV particular, y están dentro del alcance del experto en la materia que lea esta divulgación.

[0184] Por consiguiente, se ensamblaron múltiples combinaciones de proteínas menores para la recombinación en el vector Ad5: una que contenía solo tres de las proteínas menores sin E (vAD3042) (Figura 1A; SEQ ID NO: 2); uno que contenía las proteínas rtg-gp2, rtg-gp3, rtg-gp4 sin E (vAD3038) (Figura 1B; SEQ ID NO: 3); una que contenía las cuatro proteínas menores de codón optimizado gp2, gp3, gp4 y E (vAD3041) (Figura 1C; SEQ ID NO: 3); y una que contenía las cuatro proteínas menores con codones optimizados rtg-gp2, rtg-gp3, rtg-gp4 y E (vAD3067) (FIG. ID; SEQ ID NO: 4).

TABLA 3 Localizaciones de las características dentro de las construcciones

[0185] Producción de virus. Los clones de expresión se generaron mediante recombinación LR del vector de entrada con el vector de destino utilizando tecnología Gateway (Invitrogen). Los adenovirus recombinantes vAD3041, vAD3042 y vAD3038 se generaron por transfección de clones de expresión linealizados en células HEK 293 con reactivo de transfección. Después del rescate, se recogió cada virus mediante un ciclo de congelación-descongelación y se depuraron los restos celulares mediante centrifugación. Para el pase, cada virus se inoculó en una monocapa de células HEK 293 y aproximadamente 3-4 días después de la infección, el virus se recogió mediante un ciclo de congelación-descongelación y depuración por centrifugación. Se realizaron tres pases para preparar una reserva de virus, que se almacenó a -80 ° C. Como control negativo, el gen de hemaglutinina (HA) de codón optimizado del virus de la gripe porcina (VIS) se ensambló de manera similar en vectores virales de Ad5 (vAD3033).

[0186] Título Viral. Se cultivaron células HEK 293 en placas a una densidad de 7 x 105 células por placa en tres placas de 96 pocillos con medio MEM (Gibco # 11095) que contenía FBS al 2% (Moregate Lote # 81827101), aminoácidos no esenciales (Gibco # 11140) , antibióticos-antimicóticos (Gibco # 15240). El día de la infección, cada placa se infectó con 100 |jl por pocillo de virus diluido de 10'3 a 10'1° Los títulos de virus se leyeron el día 10 después de la infección y se usó el promedio de tres placas para calcular el título. El título de la reserva del Pase 3 de vAD3041 P.3 fue 10903 TCID50 por ml, y el de vAD3042 P.3 fue 10890 TCID50por ml. El título de reserva del Pase 3 de vAD3038 P.3 fue 10993 TCID50 por ml, y el de otro lote de vAD3042 P.3 fue 10997 TCID50 por ml.

[0187] El ADN viral se extrajo de cada reserva de virus y se amplificó con los cebadores pAd directo (5 'GAC TTT GAC CGT TTA CGT GGA GAC-3') (SEQ ID NO: 26) y pAd inverso (5' CCT TAA GCC ACG CCC ACA CAT TTC-3 ') (SEQ ID NO: 27) usando la supermezcla de PCR de platino High Fidelity (Invitrogen # 12532) como se indica. Los amplicones de PCR tenían el mismo tamaño que el esperado: por ejemplo, 4709 pb para vAD3041; 4408 pb para vAD3042 (FIG.

4). Las secuencias de nucleótidos de los amplicones de PCR de cada adenovirus recombinante fueron idénticas a las construidas en los vectores de entrada (descritos en la Figura 1), y no hubo cambio en la secuencia de nucleótidos de los casetes transgénicos (genes de PRRSV y promotor y colas de poli A).

[0188] La expresión de proteínas de la envoltura menores redirigidas de adenovirus recombinante. La expresión simultánea de cada una de las proteínas de la envoltura modificadas del adenovirus recombinante dentro de una sola célula se confirmó usando un ensayo de inmunofluorescencia dual. El vAD3038 recombinante se usó para infectar la monocapa de HEK293 confluente a una MOI alta y las células se fijaron después de 48 horas y se visualizaron mediante IFA para la expresión de los antígenos recombinantes. Se demostró que todas las proteínas se expresan bien incluso en la superficie celular (Figuras 9A y 9B).

[0189] Es importante destacar que la expresión de la gp2, que era defectuosa cuando se expresa sola, mostrada anteriormente como expresión intracelular focal intensa sin expresión en la superficie detectable, ha mejorado con expresión intracelular difusa y la expresión de la superficie celular distinta (Fig. 9C). Esto indicó que el plegamiento y transporte adecuados de gp2 modificada podría depender de la coexpresión de gp3 y/o gp4. Este resultado sugiere que la formación del epítopo neutralizante requiere la formación de una estructura de orden superior mediante la interacción entre las proteínas menores.

Ejemplo 4: Seguridad y eficacia de las pruebas de ensayos clínicos de las vacunas Ad5 contra el PRRSV

[0190] Sesenta (60) cerdos fueron divididos al azar en 4 grupos, cada uno con 15 animales (Tabla 3). El grupo 1 recibió vAD3038, que expresa solo gp2, gp3 y gp3, mientras que el grupo 2 recibió vAD3041, que expresa además E. El grupo 3 recibió vAD3042, que expresa gp2, gp3 y gp4 redirigidos, y el grupo 4 recibió vAD3033 que expresa HA de SIV (control negativo). Los grupos que recibieron las vacunas adenovirales se cebaron mediante la administración de 1 ml de la preparación en cada fosa nasal, un total de 2 ml, aproximadamente a una concentración de 108­ 9 TCID50/ml. Estos grupos fueron reforzados después de 21 días con la misma preparación administrada por vía intramuscular. Después de 42 días del inicio del experimento, todos los animales se expusieron a la cepa de PRRSV NADC20 por vía intranasal. Todos los animales se sacrificaron después de 2 semanas de exposición y se examinaron en busca de lesiones en el pulmón y se recolectaron muestras para el análisis del título de virus en tejidos y sueros, tal como se indica en la FIG. 9.

[0191] En general, los datos demuestran que aunque la vacunación con un único vector que codifica las proteínas de la envoltura menores gp2, gp3 y gp4 (vAD3042) no confiere ninguna ventaja significativa en comparación con el control negativo, la adición de la proteína menor E (vAD3041) marca una diferencia significativa en la protección contra la lesión pulmonar de una exposición a PRRSV. Además, la reorientación de las proteínas menores (vAD3038) también marca una diferencia significativa (Fig. 11).

[0192] En consecuencia, los datos y resultados descritos en este documento respaldan un modelo de aplicación general, en el que la protección contra la exposición al PRRSV la proporcionan anticuerpos dirigidos contra una de las proteínas de superficie (por ejemplo, gp2) o la estructura oligomérica de la superficie formada y presentada por la estructura/disposición ternaria/cuaternaria de las proteínas. Como tales, estos anticuerpos protectores funcionan, al menos en parte, bloqueando la infección por PRRSV al interferir con la unión de las proteínas virales al receptor o receptores celulares.

[0193] Antes de esta divulgación, la interacción de la proteína E con el resto de las proteínas menores u otras proteínas en el virión no era conocida como requisito previo para la provocación de la inmunidad protectora. El presente ensayo de vacunación ha revelado así un papel sorprendente e inesperado para la proteína menor E, ya sea sola o en combinación con una o más de gp2, gp3 y gp4, para obtener de los animales porcinos una protección significativamente mayor contra la exposición al PRRSV virulento.

[0194] Se contempla por los solicitantes, por ejemplo, que un epítopo neutralizante puede estar, por ejemplo, situado directamente en la proteína E, o puede inducirse por cualquiera o una combinación de proteínas menores en presencia de proteína E. En vista de las referencias de la técnica anterior, este hallazgo es completamente inesperado y sorprendente. En consecuencia, este descubrimiento fortuito no solo ha identificado una composición de antígeno protector de PRRSV, que sirve como base para desarrollar una vacuna libre de PRRSV vivo, sino que también abre nuevas áreas de investigación de PRRSV para dilucidar las interacciones proteína-proteína/virus-receptor celular.

[0195] En vista de los datos y resultados, los solicitantes prevén que otras combinaciones de E proteína menor (por ejemplo, E gp2; E gp2 gp3; E gp2 gp4; y similares) de manera similar superararán el problema de presentar un "epítopo neutralizante" (definido en el presente documento como un epítopo que es capaz de provocar en un animal una respuesta inmune protectora, que incluye la producción de anticuerpos neutralizantes de virus) al sistema inmune de un animal. Además, los resultados indican que la reorientación de las proteínas menores del PRRSV provoca una inmunidad segura y protectora igualmente sorprendente.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Composición inmunológica o de vacuna segura y eficaz que comprende:

a. uno o más vectores virales recombinantes, que comprenden polinucleótidos heterólogos que codifican uno o más antígenos gp2, gp3, gp4 y E, polipéptidos o ectodominios de los mismos, del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV); en la que las cuatro proteínas se expresan a partir de un único vector; y

b. un portador farmacéutica o veterinariamente aceptable;

opcionalmente en la que uno o más vectores comprenden además un polinucleótido heterólogo que codifica el o los antígenos gp5a y/o gp5, polipéptido(s) o ectodominio(s) de los mismos de PRRSV.

2. Composición, según la reivindicación 1, en la que uno o más vectores comprenden un vector de PRRSV de adenovirus 5 recombinante (Ad5-PRRSV), un vector de PRRSV de baculovirus recombinante, un vector de PRRSV de citomegalovirus porcino recombinante o un vector de PRRSV de virus de la viruela (“poxvirus”) recombinante.

3. Composición, según la reivindicación 2, en la que dicha composición comprende una mezcla de dos vectores, un primer vector que expresa proteínas menores de PRRSV redirigidas y un segundo vector que expresa proteínas principales de PRRSV redirigidas, en la que las proteínas son redirigidas mediante el reemplazo de una secuencia de localización celular existente de las correspondientes proteínas de tipo salvaje por una secuencia determinante de la expresión en la superficie celular de un gen heterólogo.

4. Composición, según la reivindicación 2, en la que el vector o los vectores recombinantes comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58 , 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51 , 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139.

5. Composición, según la reivindicación 4, en la que el vector de PRRSV recombinante es un vector Ad5-PRRSV, que comprende un polinucleótido que tiene:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con un ectodominio codificado por una secuencia como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78.

6. Composición, según la reivindicación 1 o 5, en la que la composición o vacuna comprende uno o dos vectores Ad5-PRRSV recombinantes, en la que opcionalmente se cumple una de las siguientes condiciones:

i. el vector Ad5-PRRSV recombinante comprende un polinucleótido que codifica un antígeno, polipéptido o ectodominio que tiene:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61,62 -66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139, o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia que codifica una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46 -51, 52-58, 59-61,62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139;

o

i. el vector Ad5-PRRSV recombinante comprende un polinucleótido que tiene:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia que codifica una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78.

7. Vector Ad5-PRRSV recombinante que comprende, o consiste en, polinucleótidos que codifican uno o más antígenos gp2, gp3, gp4 y E, polipéptido(s) o ectodominio(s) de los mismos de PRRSV, en el que las cuatro proteínas se expresan a partir de dicho único vector, en el que además el vector Ad5-PRRSV recombinante comprende opcionalmente un polinucleótido que codifica el o los antígenos gp5a y/o gp5, polipéptido(s) o ectodominio(s) de los mismos del PRRSV, opcionalmente en el que el uno o más polinucleótidos codifican uno o más antígeno(s), polipéptido(s) o ectodominio(s) que tienen:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51, 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 14, 16, 18, 20, 31, 34-39, 40-45, 46-51 , 52-58, 59-61, 62-66, 68, 71, 73, 75, 77 o 79-139.

8. Vector Ad5-PRRSV recombinante, según la reivindicación 7, en el que el uno o más polinucleótidos tienen: a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30, 67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78, 67, 69, 70, 72, 74, 76, 78; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 19, 21-24, 30,67, 69, 70, 72, 74, 76 o 78.

9. Vector Ad5-PRRSV recombinante, según la reivindicación 7, en el que el vector Ad5-PRRSV comprende un polinucleótido que codifica un antígeno, polipéptido o ectodominio gp2 del PRRSV que tiene:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89.

10. Vector Ad5-PRRSV recombinante, según la reivindicación 7, en el que el vector Ad5-PRRSV comprende un polinucleótido que codifica un antígeno, polipéptido o ectodominio E de PRRSV que tiene:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139.

11. Vector Ad5-PRRSV recombinante, según la reivindicación 7, en el que el vector Ad5-PRRSV comprende un polinucleótido que codifica un antígeno, polipéptido o ectodominio gp3 del PRRSV que tiene:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia como se establece en cualquiera de SEQ ID NO: 5, 18, 40-45, 90-99; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una secuencia de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 5, 18, 40-45, 90-99.

12. Vector Ad5-PRRSV recombinante, según la reivindicación 7, en el que el vector Ad5-PRRSV comprende polinucleótidos que codifican antígenos, polipéptidos o ectodominios gp2 y E de PRRSV que tienen:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 y una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58, o 130-139; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 y una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139.

13. Vector Ad5-PRRSV recombinante, según la reivindicación 7, en el que el vector Ad5-PRRSV comprende polinucleótidos que codifican antígenos, polipéptidos o ectodominios gp2, E y gp3 de PRRSV que tienen:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58, o 130-139 y una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 5, 18, 40-45, 90-99; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 y una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 5, 18, 40-45 o 90-99.

14. Vector Ad5-PRRSV que expresa los antígenos gp2, gp3, gp4, y E, polipéptidos o ectodominios de los mismos, de PRRSV, opcionalmente además en el que el vector Ad5-PRRSV recombinante expresa el o los antígeno(s) gp5a y/o gp5, polipéptido(s) o ectodominio(s) de los mismos, del PRRSV, para su uso en un procedimiento para provocar una respuesta protectora en un animal que lo necesite contra PRRSV, que comprende administrar al animal el vector Ad5-PRRSV recombinante y un portador, adyuvante, excipiente o vehículo farmacéuticamente o veterinariamente aceptable; opcionalmente en el que:

la administración es por vía oral-nasal, pulverización, agua potable, administración intramuscular o subcutánea, intradérmica, transdérmica; y/o

la administración es de sensibilización-refuerzo; y/o

la primera vacunación es una mezcla de dos vectores de Ad5, el primer vector de Ad5 que expresa proteínas menores de PRRSV redirigidas y el segundo vector de Ad5 que expresa proteínas principales de PRRSV; y en el que el refuerzo comprende o consiste esencialmente en ambos vectores de la primera vacunación, o el vector solo; y/o el animal es porcino;

además, opcionalmente, en el que se cumple una de las siguientes condiciones:

I. el vector Ad5-PRRSV comprende uno o más polinucleótidos que codifican dos antígenos, polipéptidos o ectodominios de PRRSV que tienen:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 y una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52- 58, o 130-139; o b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89 y una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139;

o

i. el vector Ad5-PRRSV comprende uno o más polinucleótidos que codifican tres antígenos, polipéptidos o ectodominios de PRRSV que tienen:

a. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 7, 20, 52-58, o 130-139 y una de las secuencias como se establece en SEQ ID NO: 5, 18, 40-45 o 90-99; o

b. al menos un 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 1, 14, 34-39 u 80-89, una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 7, 20, 52-58 o 130-139 y una de las secuencias de ectodominio como se establece en una subsecuencia de SEQ ID NO: 5, 18, 40-45 o 90-99.