TWI670373B - 用於有效率地表面呈示抗原蛋白質之新穎表現匣 - Google Patents

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Abstract

一種表現匣，其中該表現匣包含：(a)一個來自白斑症病毒的ie1啟動子或其變異體；(b)一個編碼N端gp64訊息胜肽的核酸序列或其變異體，一個編碼一抗原胜肽的核酸序列，一個編碼一穿膜區域的核酸，以及一個編碼gp64細胞質區域的核酸或其變異體；其中該啟動子係可操作地連接至該核酸序列。

Description

用於有效率地表面呈示抗原蛋白質之新穎表現匣 發明領域
本發明一般而言係有關於生物分子的表面呈示系統，及抗原胜肽的呈示之特定的應用，舉例而言病毒蛋白質，譬如病毒殼體蛋白質使用作為疫苗。特別地，本發明係有關於供用於治療及/或預防病毒感染的方法、疫苗、免疫組成物和套組，以及有關於供用於調整一種免疫反應之關聯的方法。
發明背景
數百個不同已知的病毒感染人類和動物。感染人類和動物的病毒常常經由呼吸的排泄和腸的排泄而散布。舉例而言，腸病毒71(EV71)為小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)家族中的腸病毒屬之單股、RNA病毒。其在遺傳上分類成3組(A、B和C)以及11個基因型(A、B1-B5、C1-C5)。EV71包含4個主要的殼體蛋白質，例如，VP1、VP2、VP3以及VP4。此等之中，VP1被認為是主要負責病毒的附著至標靶細胞以及因此懷有病毒中和之主要的抗原決定位。更確切地，不同的腸病毒菌株之免疫學的研究已經指示出數個的中和性mAbs之優勢抗原決定區座落在VP1上。EV71為手足口病原因的一種病毒。
手足口病已變成為一種主要的新興感染性疾病以及為重要的威脅尤其於亞洲。一次由於EV71感染之HFMD之大 爆發於1998年發生在臺灣，包括129,106個個案報告，405個兒童有嚴重的併發症，以及多於80個死亡。自1997以來，EV71感染已經呈示新的重要性，伴隨增加數目的個案。由各種的EV71菌株所造成之事件已經持續於其他的國家再出現，例如，泰國、中國以及越南。EV71感染之擴展中的地理分佈伴隨於新加坡之近來的爆發指示出更多的人類人口處於危險中。慣用的EV71疫苗係以不活化的病毒為基礎，其等係於細胞株內所生產的以及藉由化學手段來不活化的。然而，病毒之有毒力的本質要求待處理的病毒於生物安全的位準條件之內，從而疫苗候選者使用慣用的技術之生產會要求現行的製造程序之顯著的改變，如果發生爆發其可能會延遲疫苗的生產。
於控制流行病脊髓灰質炎和脊髓灰白質炎病毒之根除之福馬林去活化的和活的減毒疫苗強調了經由群體接種來控制EV71流行病的潛力。根據此，發展福馬林去活化的EV71疫苗是對1975年保加利亞流行病的反應但是不使用來控制流行病以及從那時起還沒有再使用。再者，沒有可得的保加利亞疫苗之效能的數據。
一種有效用於保護對抗病毒感染，例如EV71，之良好的疫苗因而為高度希望的。
發明概要
於第一個態樣中，提供了一種表現匣，其中該表現匣包含： (a)一個來自白斑症(white spot syndrome)病毒之ie1啟動子或其截斷序列；(b)一個編碼N-端gp64訊息胜肽之核酸序列或其變異體，一個編碼抗原胜肽的核酸序列，一個編碼穿膜區域的核酸，以及一個編碼gp64細胞質區域的核酸或其變異體；其中該啟動子係可操作地連接至該核酸序列。
於第二個態樣中，提供了一種表現載體，其包含如本文中所說明之一種表現匣。
於第三個態樣中，提供了一種套組，其包含如本文中所說明的表現匣或是如本文中所說明的表現載體以及為此之包裝材料。
於第四個態樣中，提供了一種宿主細胞，其包含如本文中所說明之一種表現匣或是如本文中所說明的一種表現載體。
於第五個態樣中，提供了一種免疫性組成物，其包含如本文中所說明之一種表現匣，如本文中所說明的一種表現載體，或是如本文中所說明的一種宿主細胞，連同一藥學上可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑。
於第六個態樣中，提供了一種疫苗，其包含如本文中所說明之一種表現匣，如本文中所說明的一種表現載體的或是如本文中所說明之一種宿主細胞，連同一藥學上可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑。
於第七個態樣中，提供了一種抗體，其係由用根據本發明之疫苗予以接種的生物所生產出。
於第八個態樣中，提供了一種抗血清，其含有本發明的一種抗體。
於第九個態樣中，提供了如本文中所說明之一種表現匣，如本文中所說明的一種表現載體，如本文中所說明的一種宿主細胞，如本文中所說明的一種免疫性組成物，如本文中所說明的一種疫苗，如本文中所說明的一種抗體或是如本文中所說明的一種抗血清供使用於一主體內的疾病之治療或預防，其中該抗原胜肽係經由該表現載體來表現於該主體內。
於第十個態樣中，提供了一種供用於調整一免疫反應的方法，其中該方法包含投藥有效量之如本文中所說明的表現匣，如本文中所說明的一種表現載體，如本文中所說明的一種宿主細胞，如本文中所說明的一種免疫性組成物，如本文中所說明的一種疫苗，如本文中所說明的一種抗體，或是如本文中所說明的一種抗血清至一主體。
於第十一個態樣中，提供了一種如本文中所說明之一種表現匣，如本文中所說明的一表現載體，如本文中所說明的一宿主細胞，如本文中所說明的一種免疫性組成物，如本文中所說明的一疫苗，如本文中所說明的一種抗體，或是如本文中所說明的一種抗血清於製造藥物的用途，該藥物係用於調整一主體內之免疫反應。
於(tenth)第十個態樣中，提供了一種用於呈現、生產或呈示一抗原胜肽的方法，其中該方法包含：(a)使編碼該多肽之核酸插入至如本文中所說明的一 表現載體內；(b)用該表現載體來轉染至少一個宿主細胞；以及(c)由該表現載體來表現該多肽其中該多肽係呈現或呈示於一桿狀病毒的表面膜之上。
於第十個(tenth)態樣中，提供一種藉由如本文中所說明的一種方法所獲得的一抗原胜肽。
於第十一個(eleventh)態樣中，提供了一種診斷方法，其包含使用如本文中所說明的一抗原胜肽。
圖式簡單說明
本發明現在將，僅僅作為舉例，參考下列的圖來說明。
第1圖.如實施例1內詳細說明之使用PCR之融合基因的建構。執行3個連續的PCR反應來產生最終的PCR產物，其含有gp64訊息序列、H3N2-HA穿膜領域以及gp64的細胞質領域(CTD)。
第2圖.根據實施例1製造之重組型桿狀病毒載體的圖解。使用EV71基因體作為一模板，表1內所列出之引子係使用來擴增VP1基因，其接而插入至pBac-HTA載體之內。所生成的質體命名為pBac-VP1。
第3圖.rVP1蛋白質於SF-9 II細胞質膜上之表面呈示模式。第3圖闡明該蛋白質之GP64 C-端部分係座落在SF-9 II細胞內部，而H3N2穿膜領域及抗原胜肽係座落在細胞外的培養基內。
第4圖.EV71的rVP1之錨定(放大率x 60)。為了決定是否rVP1蛋白質恰當地移位至細胞表面，細胞係培養於無菌 的蓋玻片之上，以10之感染的多重性(MOI)來感染，以及感染後2天接受共焦顯微鏡之免疫螢光法染色。DAPI染色係使用來偵測細胞核而綠螢光標示的抗-VP1多株抗體係使用來偵測由Bac-VP1重組型桿狀病毒所呈示之rVP1。第4圖清楚地顯示出rVP1係定位於質膜，從而展現出rVP1之錨定於Sf-9細胞的表面之上。關於更多的細節請見實施例1。
第5圖.EV71的rVP1之表現於Bac-VP1被膜上的確認。細胞係以10的MOI予以感染以及感染後3天予以收穫。收集上清液以及接受使用抗-VP1(天竺鼠)多株抗體接著抗天竺鼠HRP標示的二級抗體之西方墨點分析。
rBac-VP11-編碼新穎的“表現匣”之重組型桿狀病毒。
rBac-VP12-編碼帶有全長的gp64作為融合伙伴之表現匣的重組型桿狀病毒。
如同由第5圖可見，於桿狀病毒-WT(野生型)沒有偵測到蛋白質。比較時，由從用rBac-Vp11和rBac-Vp12予以感染的細胞所獲得的上清液看見清晰帶，指示出rVP1成功地表現於Bac-VP1病毒被膜上。
第6圖.純化的桿狀病毒之免疫金電子顯微圖，其係藉由抗-EV71和抗-VP1抗體作為初級抗體以及接合5-nm金顆粒之抗小鼠IgG作為二級抗體來偵測的(放大率200,000×，刻度尺=100 nm)。金顆粒(顯示為黑點)指示出EV71和VP1蛋白質表現的位置。沒有金顆粒呈示於桿狀病毒-WT(對照)的表面之上，反之EV71和VP1係於本發明之重組型桿狀病毒的表面上偵測到。
第7圖.呈示於重組型桿狀病毒的被膜之上之EV71的rVP1之定量。於桿狀病毒被膜上所呈示的rVP1蛋白質係使用抗-VP1單株抗體來探測。於rBac-VP1(107/ml)、rBac-VP12(107/ml)、EV71 WT(B5菌株)(107/ml)、WT桿狀病毒上之VP1的量校正成經純化的重組型VP1蛋白質的量。西方墨點上之帶的強度係予以掃描以及使用ODYSSEY LICOR螢光掃描器和軟體予以分析。數據為3個獨立的實驗之平均值。
rBac-VP11-編碼新穎的“表現匣”之重組型桿狀病毒
rBac-VP12-編碼帶有全長的gp64作為融合伙伴之表現匣的重組型桿狀病毒。
第7圖顯示出rBac-VP11(新穎表現匣)與B5-EV71和rBac-VP12(全長的gp64)比較下具有最高的VP1蛋白質表現，從而展現出新穎表現匣用於生產大量的VP1抗原胜肽之效用。
第8圖.測試血清中和病毒感染性的能力。＊含有100TCID50 EV71病毒之50 μl的病毒懸浮液係在添加至96井平盤內的RD細胞之前與50 μl的連續2倍稀釋的抗體一起預孵育歷時30 min。在在37℃ 3天之後，提供完整的保護免受CPE之中和性抗體之力價讀取為最高的稀釋。
如同由第8圖可見，rBac-VP1與不活化的EV71(B5)病毒比較下導致較高的中和力價。負對照PBS與桿狀病毒-WT(結果為重疊的，桿狀病毒-WT的結果疊加於PBS的結果上方)顯示出如預期之微不足道的中和力價。
第9圖.帶有PCV2核殼體之表面呈示的殼體區域 (rBac-PCV2)之蔗糖梯度純化的桿狀病毒之西方墨點，其係使用8C2(抗ORF2)單株抗體(初級)接著抗小鼠HRP標示的二級抗體。
如同由第9圖可見，於經純化的桿狀病毒內出現大量表現位準之各個殼體蛋白質區域。
第10圖.感染PCV2的PK-15細胞之免疫螢光法分析，其係使用來自用純化的rBac-PCV2予以免疫之天竺鼠的抗體和Alexa Fluor 546標示的抗天竺鼠二級抗體(放大率x 40)。第10圖的淡灰色部份指示出Alexa Fluor 546染色。第10圖因而顯示出感染PCV2的細胞內之PCV2蛋白質的良好表現。
第11圖.PRRSV之蔗糖梯度純化的rBac-ORF7蛋白質之西方墨點，其係使用5H2(ORF7)單株抗體(初級)接著抗小鼠HRP標示的二級抗體。
第11圖清楚地顯示出有PRRSV之ORF7蛋白質的大量表現。
第12圖.感染PRRSV的MARC-145細胞之免疫螢光法分析，其係使用來自用純化的rBac-ORF7蛋白質予以免疫之天竺鼠的抗體，接著Alexa fluor 546標示的抗天竺鼠二級抗體(放大率x 40)。第11圖之淡灰色部份指示出Alexa Fluor 546染色。第11圖因而顯示出感染PRRSV的細胞之ORF蛋白質的良好表現。
第13圖.於白斑症病毒(WSSV)內的ie1啟動子之順式因子之示意圖。
第14圖.桿狀病毒錨定的核殼體α蛋白質之西方墨點分析。Bac-noda、β野田病毒(Betanodavirus)和野生型桿狀病毒接受使用抗野田核殼體多株抗體(天竺鼠)和各別的二級HRP接合抗體之西方墨點。(1)Bac-Noda，(2)β野田病毒，(3)野生型桿狀病毒。
如同由第14圖可見，於桿狀病毒-WT(野生型)內沒有偵測到蛋白質。比較時，由感染rBac-VP11和rBac-VP12之細胞所獲得的上清液看見了清晰帶，指示出rVP1成功地表現於Bac-VP1病毒的被膜之上。
第15圖.noda核殼體α蛋白質(aplha protein)之表現和錨定(放大率x 60)。(a)於感染Bac-noda之Sf9-II的質膜上之α蛋白質的錨定之確認。(b)於感染野生型桿狀病毒之Sf9-II細胞的質膜上觀察到沒有α蛋白質之錨定。細胞係培養於無菌的蓋玻片之上以及以0.1的MOI予以感染。細胞係用4%PFA予以固定以及用2%牛血清白蛋白予以封阻於37℃歷時30 min。α蛋白質係用多株抗天竺鼠抗體(1：300)接著二級的FITC-接合的兔抗天竺鼠Mab(1：100稀釋，Dako)予以染色。
第15圖(a)顯示出rVP1係定位在質膜，從而展現出VP1之錨定於Sf-9細胞的表面之上。
第16圖.VP1於非洲綠猿腎臟細胞(Vero cell)內之轉導和表現(放大率x 40)。非洲綠猿腎臟細胞係與200之感染的多重性(MOI)一起孵育以及於感染後48h用抗-VP1單株抗體接著FITC-接合的二級抗體予以染色(A)活的Bac-VP1- 轉導之非洲綠猿腎臟細胞(B)與不活化的Bac-VP1一起孵育的非洲綠猿腎臟細胞。
第16圖的淡灰色部份指示出表現VP1之處。因此，第16圖顯示出VP1良好地表現於用活的Bac-VP1予以轉導之非洲綠猿腎臟細胞之內，與不活化的Bac-VP1比較下。
第17圖.活體內小鼠肌肉組織之桿狀病毒轉導(放大率x 40)。在第一個免疫作用六天之後，肌肉組織樣品係包埋於石蠟之內以及予以切片的。免疫組織化學染色係使用抗-VP1單株抗體和HRP-接合的兔抗小鼠抗體來進行。顯示出(A)Bac-VP1，(B)WT-Bac(C)PBS注射的小鼠。箭頭指示出表現VP1之處。第17圖因而顯示出VP1表現於來自Bac-VP1轉導的小鼠之小鼠肌肉組織之內，反之負對照內沒有VP1的表現。
第18圖.來自致命的EV71病毒挑戰之小鼠的保護。小鼠組(n=6)係以14天的間隔予以疫苗接種2次。野生型桿狀病毒和PBS免疫的小鼠供使用作為負對照。監控小鼠的存活持續21天的觀察期間。結果係以存活百分率方面來表現。如同由結果可見，EV71-B5和Bac-VP1(結果係重疊於第18圖上)免疫的小鼠在7天之後顯示出100%存活，與對照小鼠的無一者比較下。
第19圖.EV71複本數目之即時RT-PCR定量。RNA係由腦組織萃取以及對照的樣品係於7 dpi收集，以及預防性治療的小鼠樣品係於20 dpi收集。EV71 5` UTR區域之112-bp片段供使用作為qRT-PCR引子的標的。編碼EV71之全長的 基因體之質體係使用來獲得定量病毒複本數目之標準曲線。數據代表3個獨立的分析之平均值±SD。
如同由第19圖可見，來自接種野生型桿狀病毒抗血清和PBS抗血清之小鼠的腦組織，與接種抗-EV71血清和Bac-VP1抗血清的小鼠比較之下，有顯著量的病毒RNA。此因而展示出來自Bac-VP1接種的生物之抗血清用於提供被動式保護對抗VP1的效能。
第20圖.各種表現匣之示意圖。(A)帶有ie1啟動子和gp64訊息胜肽之表現匣；(B)帶有ie1啟動子、gp64啟動子和穿膜區域之表現匣；(C)帶有ie1啟動子、gp64啟動子、穿膜區域以及gp64細胞質區域之表現匣。
表
表1.用於建構重組型的BAC-VP1融合基因之引子序列。
表2.用於建構PCV2的ORF2之重組型的BAC-PCV2核殼體融合基因之引子序列。
表3.用於建構重組型的BAC-PRRSV核殼體蛋白質(ORF7)融合基因之引子序列。
表4.抗原胜肽之實例。
序列
序列辨識編號：1：用於擴增帶有gp64訊息序列之額外的重疊區域之整個全長的VP1基因之順向引子。
序列辨識編號：2：用於擴增帶有H3N2-HA穿膜序列的額外的重疊區域之整個全長的VP1基因之反向引子。
序列辨識編號：3：用於擴增帶有H3N2-HA穿膜序列之 完全序列的C-端VP1之反向引子。
序列辨識編號：4：用於擴增N-端之gp64訊息序列之整個的重疊區域之順向引子。
序列辨識編號：5：用於擴增C-端之gp64細胞質領域(CTD)之整個的重疊區域之反向引子。
序列辨識編號：6：用於擴增ie1啟動子之順向引子。
序列辨識編號：7：用於擴增ie1啟動子之反向引子。
序列辨識編號：8：用於擴增PCV2的殼體76 F區域之順向引子。
序列辨識編號：9：用於擴增PCV2的殼體135 R區域之反向引子。
序列辨識編號：10：用於擴增PCV2的殼體121 F區域之順向引子。
序列辨識編號：11：用於擴增PCV2的殼體180 R區域之反向引子。
序列辨識編號：12：用於擴增PRRSV的殼體ORF 7 F區域之順向引子。
序列辨識編號：13：用於擴增PRRSV的殼體ORF 7 R區域之反向引子。
序列辨識編號：14：N-端gp64訊息胜肽之序列(20個胺基酸)。
序列辨識編號：15：含有7個胺基酸之gp64細胞質領域(CTD)之全長序列。
序列辨識編號：16含有6個胺基酸的gp64細胞質領域之 截斷序列(CTD)
序列辨識編號：17：H3N2-HA穿膜領域之序列。
序列辨識編號：18：白斑症病毒ie1啟動子之序列。
序列辨識編號：19：EV71病毒的VP1之序列。
序列辨識編號：20：PCV2 PRF2殼體蛋白質之序列。
序列辨識編號：21：PRRSV殼體蛋白質的ORF7之序列。
序列辨識編號：22：魚的野田病毒(nodavirus)殼體蛋白質α之序列。
序列辨識編號：23 EV71-VP1-第167個-第178個胺基酸
序列辨識編號：24 EV71-VP1-第209個-第222個胺基酸
序列辨識編號：25 EV71-VP1-第240個-第260個胺基酸
序列辨識編號：26 PCV2-ORF2-第100個至第150個胺基酸
序列辨識編號：27 PCV2-ORF2-第151個至第200個胺基酸
序列辨識編號：28 PRRSV-ORF7-第18個至第57個胺基酸
序列辨識編號：29 PRRSV-ORF7-第58個至第123個胺基酸
序列辨識編號：30 PRRSV-ORF5-第28個至第65個胺基酸
序列辨識編號：31 PRRSV-ORF5-第132個至第200個胺基酸
序列辨識編號：32 PRRSV-ORF 5-第28個至第65個以及132至第200個胺基酸的組合
序列辨識編號：33對應於核酸序列序列辨識編號：19 EV71-VP1之EV71病毒之VP1的胺基酸序列
序列辨識編號：34對應於核酸序列序列辨識編號20 PCV2殼體蛋白質-PCV2 PRF2之序列的PCV2殼體蛋白質之胺基酸序列
序列辨識編號：35對應於核酸序列序列辨識編號：21 PRRSV殼體蛋白質的ORF7-PRRSV ORF7之序列的PRRSV殼體蛋白質之ORF7的胺基酸序列
序列辨識編號：36對應於核酸序列序列辨識編號：22：魚類野田病毒殼體蛋白質-殼體蛋白質α之序列的魚類野田病毒殼體蛋白質的胺基酸序列
序列辨識編號：37用於擴增野田病毒殼體區域之順向引子
序列辨識編號：38用於擴增野田病毒殼體區域之反向引子
序列辨識編號：39用於擴增野田病毒殼體區域之任擇的反向引子
序列辨識編號：40用於偵測VP1 mRNA之順向引子
序列辨識編號：41用於偵測VP1 mRNA之反向引子
較佳實施例之詳細說明 定義
當使用於本文中，術語“包含(comprising)”意指“主要包括，但是不必然唯一”。再者，單字“包含(comprising)”之變化，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，具有對應變化的意義。
當使用於本文中術語治療(treating)”及“治療(treatment)”提及任何的和所有的使用，其等醫治病況或徵狀、預防病況或疾病之建立，或是無論如何不管什麼用其他辦法預防、阻礙、延遲、改善或是倒轉一種病況或疾病或是其他的不合意的徵狀之進展。
當使用於本文中，術語“有效量”在其意義之內包括無毒的但是足夠量的一種製劑或化合物來提供所欲的作用。所需要之確切的量會取決於因子而隨主體而變化，例如，待治療的物種、主體的年齡和一般的病況、待治療的病狀之嚴重性、被投藥之特定的製劑和投藥的模式等等。因而，不可能具體指定確切的“有效量”。然而，對於任何假設的狀況，適當的“有效量”可以僅使用例行的實驗而由熟悉此藝者來決定。
當使用於本文中，術語“多肽”、“胜肽”和“蛋白質”可交換地使用來提及胺基酸殘基之聚合物以及提及其片段、變異體、類似物(analogue)、同系物(orthologues)或是同源物(homologues)。因而，此等術語應用至胺基酸聚合物，其中一個或更多個胺基酸殘基為合成的非天然存在的胺基酸， 例如對應的天然存在的胺基酸之化學類似物，以及應用至天然存在的胺基酸聚合物二者。
當使用於本文中，術語“多核苷酸”或是“核酸之”係可交換地使用以及稱呼一個分子，其包含一個或更多個核苷酸，或是一種寡核苷酸，或是其片段，包括但不限於RNA或DNA核苷酸或是其等之組合。
當使用於本文中術語“蛋白質”、“多肽”、“胜肽”、“多核苷酸”以及“核酸”的範疇之內為片段及其變異體，包括但不限於多核苷酸和核酸之反向互補的形式和反訊息的形式。
術語“片段”提及一種多核苷酸或是多肽序列，其編碼一結構成分或是一種全長的蛋白質或是基因之結構成分。在多肽方面，片段可擁有與全長的蛋白質一樣的定性的生物活性，舉例而言，一片段可以含有或編碼一個或更多個抗原決定區，例如優勢免疫抗原決定區，其允許對該片段，或是由該片段所編碼的序列之待提升的相似的免疫反應，如同全長的序列，或是由該片段所編碼的序列。
當使用於本文中術語“變異體”係提及實質相似的序列。一般而言，核酸序列變異體可以編碼擁有共同的定性的生物活性之多肽。一般而言，多肽序列變異體亦可以擁有共同的定性的生物活性。再者，此等多肽序列變異體可以共有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或是99%序列同一性。
當使用於本文中，術語“表現載體”意指一核酸，其具有賦予其所可操作地連接的一核酸片段，於一細胞或是無 細胞的表現系統內表現之能力。於本發明的上下文中，要了解到包含如本文中所定義的啟動子之一種表現載體可以為一個質體、噬菌體、噬質體(phagemid)、粘接質體(cosmid)、病毒次基因體或基因體片段，或是其他的核酸，能夠維持及或複製可表現的格式之異源的DNA於其應該引導至一細胞之內。
當使用於本文中，術語“表現系統”提及一種表現載體和供用於該載體之宿主的組合，宿主提供了環境允許外來的基因表現於一宿主細胞之內，那就是，使能夠生產可偵測的位準之蛋白質。表現系統之實例包括，但不限於：病毒表現系統，細菌為主的系統，例如大腸桿菌，酵母菌系統，例如啤酒酵母菌，畢赤酵母菌(Pichia pastoris)，昆蟲細胞為主的系統，例如桿狀病毒系統，哺乳動物系統，例如，非洲綠猿腎臟系統，其他的真核系統，例如利什曼(Leishamani)表現系統。
當使用於本文中，術語“宿主細胞”提及一種使用來生產在本發明的表現匣之內所編碼的蛋白質之一種細胞。此等宿主細胞之實例包括一種真核的細胞或更多特定的哺乳動物細胞；昆蟲細胞；魚細胞；酵母菌細胞；或是植物細胞。此等細胞之實例包括，但不限於：人類TK-143b細胞、猴Marc 145細胞、非洲綠猿腎臟細胞和豬PK15細胞、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9和Sf-21細胞、Hink's擬尺蠖(Trichoplusia ni)Tn-368和BTI-TN-5B1-4細胞、鯉魚上皮瘤乳頭狀細胞(epithelioma papillosum cells)(EPC)、 CHSE-214、胖頭鱥(fathead minnow)(FHM)、石紋棕真鮰(brown bullhead)(BB)、藍鰓魚幼魚(bluegill fry)(BF2)，或是白鱘魚皮膚(WSSK-1)。當使用於本文中，術語“匣”提及表現載體的部份，其編碼由載體表現之有興趣的序列。舉例而言，匣可以提及表現載體的部份，其編碼一個N-端gp64訊息胜肽和一抗原胜肽。匣可以進一步包含編碼其他的組份之序列，舉例而言一個C-端血球凝集素(例如H3N2-HA穿膜領域)穿膜領域和一個gp64細胞質領域。
當使用於本文中，術語"可操作地連接"提及轉錄的調節性多核苷酸和轉譯的調節性多核苷酸，其等以使得多核苷酸被轉錄以及多肽被轉譯的方式而座落於相關的編碼多肽之多核苷酸。
當使用於本文中，術語“啟動子”包括一種基因體基因之轉錄調節序列，包括TATA盒或是啟動子因子，其可能是準確的轉錄啟動所需要的，伴隨或是沒有額外的調節性因子，其等對發展及/或外部的刺激的反應而改變基因表現，或是以組織專一性的方式。於本上下文中，術語“啟動子”亦使用來說明一種重組型、合成或融合分子，或是衍生物或片段，舉例而言啟動子之截斷序列，其賦予、活化或是提高其所可操作地連接的一核酸分子之表現，以及其編碼一胜肽。
ie1啟動子內之順式因子係顯示於第13圖中。如同第13圖中所顯示的，可以執行使用螢光素酶報導基因分析之截斷分析來識別最小的啟動子區域。ie1啟動子之最小的區域 係藉由漸進地由5’端刪失啟動子而識別出。於一具體例中，白斑症病毒(WSSV)之ie1啟動子，觀察到的最小的啟動子活性係介於基因之位置-189和+1之間。
當使用於本文中，措辭“與病毒相關的疾病”意指由病毒造成的或是與病毒相關的任何疾病、疾病狀態或是障礙。
當使用於本文中，術語“抗原”提及能夠由一種生物的免疫系統所辨識的一種物質。一種免疫原為當被投藥至一種生物時，能夠刺激一免疫反應的抗原。二個術語都可交換地使用於本文中。當使用於本文中，一種“抗原胜肽”為一種能夠表現於本表現系統之內的胜肽或是多肽序列。
當使用於本文中，術語"調整"當關於一種免疫反應使用時意指不論直接地還是間接地增加或是減少對抗一個抗原之免疫反應。
當使用於本文中，術語“訊息胜肽”提及一種胺基酸序列，其能夠起始其所可操作地連接的一種多肽之通過，至一宿主細胞的內質網(ER)之內。訊息胜肽通常由一種肽鏈內切酶(例如一種特定的位於ER的訊息胜肽酶)分開以釋放(成熟的)多肽，雖然有訊息胜肽可以不分開的例子。一種訊息胜肽的長度典型在由大約10個至大約40個胺基酸的範圍內。於如本文中所說明之具體例中，術語“一核酸序列，其編碼一種訊息胜肽”不包括一種編碼同源的多肽之全長序列之核酸序列在其範疇之內，因一種訊息胜肽天然起始通過至內質網之內。可能的訊息胜肽之實例包括螢光素酶訊息胜肽以及蜜蜂蜂毒肽(honeybee mellittin)訊息胜肽。舉例 而言，於一具體例中，可以使用gp64之訊息胜肽。於一特定的具體例中，gp64之訊息胜肽為由序列辨識編號：14所編碼的蛋白質或其變異體。
如本文中所說明之核酸序列可以視需要包括額外的核苷酸，舉例而言來促進表現。舉例而言，一個連接子序列，設若出現，可以視需要而提供於訊息胜肽與抗原胜肽之間及/或於抗原胜肽與穿膜領域之間。核酸序列可以視需要進一步或是任擇地包含連接子序列於表現匣內所含有之任何其他的序列之間。此等連接子序列可以為異源的或是同源的。連接子序列可以介於1個和40個胺基酸之間，介於10個和25個胺基酸之間，介於6個至10個胺基酸之間或是舉例而言，2、3、4或是5個胺基酸。
當使用於本文中，術語“疫苗”提及一種成為非病原性或較少的病原性之整個的(活的或不活化的)，或是分次的細菌/病毒之懸浮液。疫苗可以概括地分類成3個一般組：減毒的病毒、不活化的(殺死的)的病毒粒子，以及純化的病毒組份(次單元疫苗)。該等的基於本發明的表現匣所獲得之疫苗屬於次單元疫苗組。
當使用於本文中，術語“佐劑”提及一種製劑，其可以刺激免疫系統以及增加對一個抗原或是免疫原之反應。
當使用於本文中，術語“接種載體”提及一種表現載體，當引導至一種合適的宿主細胞之內時，其會導致抗原胜肽的表現，抗原胜肽的表現可以修改來刺激一系列的免疫反應，包括抗體、T輔助細胞(CD4+ T細胞)，以及胞毒型 T淋巴球(CTL，CD8+ T細胞)媒介的免疫。
當使用於本文中，術語“免疫性組成物”提及一種組成物，當投藥至一人類或是動物時，其導致一免疫反應，包括抗體、T輔助細胞(CD4+ T細胞)，以及胞毒型T淋巴球(CTL，CD8+ T細胞)媒介的免疫。
當使用於本文中，術語“細胞質領域”(或“CTD”)提及一種提供了一錨定領域之胺基酸序列，該錨定領域允許融合蛋白質表現於一重組型病毒，例如桿狀病毒，的被膜表面之上。細胞質領域可以介於5個和40個胺基酸之間，介於10個和25個胺基酸之間，介於6個至10個胺基酸之間或是舉例而言，2、3、4或是5個胺基酸。
當使用於本文中，術語“gp64細胞質領域”為如同序列辨識編號：15中所顯示之7個胺基酸的一區域。於一具體例中，gp64細胞質領域為如同序列辨識編號：16中所顯示之gp64 CTD的一變異體。gp64細胞質領域之變異體之其他的實例可以包含一個gp64細胞質領域，其對序列辨識編號：15具有80%或85%或90%，或是92%，或是95%或96%或98%或99%序列同一性。
當使用於本文中，術語“穿膜領域”提及一種胺基酸序列，其橫跨於一細胞的膜之內。穿膜領域可以為由大約5個至大約60個胺基酸，由大約5個至大約40個胺基酸，由大約10個至大約25個胺基酸，由大約6個至大約10個胺基酸或是舉例而言，序列可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24或25個胺基酸或是由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸所組成。穿膜領域可以為gp64穿膜領域或是可以為適合供使用於此系統內之任何其他的穿膜領域，舉例而言，穿膜領域可以為一醣蛋白穿膜領域，例如一血球凝集素穿膜領域，其為流行性感冒表面上的醣蛋白，其允許病毒結合至細胞的唾液酸以及與宿主膜融合。血球凝集素穿膜領域之實例，包括但不限於：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16。
於一具體例中，血球凝集素穿膜領域為一H3N2穿膜領域或是H5N1穿膜領域。H3N2穿膜領域舉例而言含有半胱胺酸殘基可以經受軟脂醯化(pamitoylation)且藉此成為附接至SF9-II質膜以及使VP1蛋白質能夠定位於表面之上。當使用於本文中，術語“gp64穿膜領域”為如同序列辨識編號：17中所顯示之27個胺基酸的一區域。於一具體例中，gp64細胞質領域為gp64穿膜領域之截斷序列以及包含以下或是由以下所組成：大約10個至大約25個胺基酸，由大約6個至大約10個胺基酸或是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或是25個胺基酸如同序列辨識編號：17中所顯示的。
當使用於本文中，術語“功能性片段”提及一種蛋白質領域的片段，其能夠執行該蛋白質領域之完全的功能。
於本發明中可以使用不同的表現系統來表現本文中所 說明的表現匣。此等表現系統之實例包括，但不限於：病毒表現系統，例如腺病毒、慢病毒(lentivirus)、腺相關病毒、反轉錄病毒和桿狀病毒表現系統，細菌為主的系統，例如大腸桿菌、酵母菌系統，例如啤酒酵母菌、畢赤酵母菌，昆蟲細胞為主的系統，例如InsectSelect Stable表現系統，哺乳動物系統，例如，非洲綠猿腎臟系統，以及其他的真核系統，例如利什曼表現系統，於一實施例中，使用一種桿狀病毒表現系統。
桿狀病毒起初認為只有感染昆蟲和無脊椎動物以及已經廣泛地使用於昆蟲細胞內許多的重組型蛋白質之生產。然而，在1980s年代早期的期間加州苜蓿夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus)(AcMNPV)之發展至一種真核的蛋白質表現系統之內明顯表示開始廣泛的使用此病毒用於使異源的蛋白質表現於昆蟲細胞內。從那時以來，已經做出許多的嘗試來發展桿狀病毒載體，其等可以攜帶哺乳動物表現匣用於活體外和活體內基因療法的研究、藥物篩選，以及重組型蛋白質的表現。桿狀病毒表現系統之主要的優點包括其大的插入容量、其相對容易的建構，以及存在強大的啟動子和轉譯後的加工能力。
使用gp64全長的蛋白質來表現外來的蛋白質於桿狀病毒膜之上(表面呈示)係首先發展於1990s年代中期。典型地，一種“表現載體”，包含編碼一種有興趣的異源的蛋白質或是胜肽之基因，係在多角體蛋白(polyhedrin)或是p10 啟動子的控制之下予以在架構上融合在一種全長的gp64基因之N-端。此等建構物接而使用各種適合的方法來併入至桿狀病毒基因體內，例如Bac-To-Bac系統(Invitrogen)。融合蛋白質，在表現為額外的複本之後，係移位至質膜以及併入至病毒被膜之內，導致異源的蛋白質表現於桿狀病毒膜表面之上。
於一具體例中，本發明係有關於一種表現匣，其包含一個ie1啟動子或其截斷序列、一個N-端gp64訊息胜肽和一抗原胜肽，其中啟動子係可操作地連接至核酸序列(見第20A圖)。於一具體例中，前面提及的gp64訊息胜肽係由序列辨識編號：14或其變異體所編碼。
於另一具體例中，本發明係有關於一種新穎“表現匣”，其包含一個ie1啟動子或其變異體、一個N-端訊息胜肽(例如一個N-端gp64訊息胜肽)、一抗原胜肽，以及一穿膜區域，其中啟動子係可操作地連接至核酸序列(見第20B圖)。於一具體例中，前面提及的穿膜區域為一個H3N2，或是H5N1或H3N2-HA(序列辨識編號：17或其變異體)穿膜區域。
於另一具體例中，本發明係有關於一種表現匣，其包含一個ie1啟動子或其截斷序列、一個N-端訊息胜肽(例如一個N-端gp64訊息胜肽)、一抗原胜肽、一穿膜區域，以及一個gp64細胞質區域，其中啟動子係可操作地連接至核酸序列(見第20C圖)。於一具體例中，前面提及的細胞質區域係由序列辨識編號：15或16或是其變異體所編碼。
於一具體例中，本發明係有關於一種表現匣，其編碼 至少N-端gp64訊息胜肽(20個胺基酸[aa])、一種抗原殼體蛋白質、C-端H3N2-HA-穿膜領域(27 aa)和一種gp64-細胞質領域(6 aa)以及其係由WSSV立即早期ie1啟動子(序列辨識編號：18)或是其片段或截斷型式所轉錄控制。
於一些具體例中，啟動子序列為WSSV ie1啟動子的區域。於一具體例中，啟動子序列為WSSV ie1啟動子的區域，其包含由基因的位置-189至+1之核苷酸的序列或是由基因的位置-189至+1之核苷酸的序列所組成。“表現匣”可以併入至一種適合供使用於一病毒表現系統，例如一種桿狀病毒，內的“表現載體”之內以及隨後使用熟悉此藝者所普遍知道的各種手段予以併入至桿狀病毒基因體之內。
特別地，發明人已經展示出通過抗原胜肽，舉例而言病毒蛋白質，舉例而言病毒殼體蛋白質，之協同的表面呈示和基因轉導而應用一病毒表現系統，例如一種桿狀病毒表現系統，作為一種抗病毒的免疫試劑。有效率地呈示優勢免疫蛋白質於重組型病毒的表面之上，例如一種桿狀病毒，賦予接種之策略方面主要的優點。除了應用此病毒表現系統作為如本文中所說明之EV71、PCV2、PRRSV、野田病毒之一種接種載體之外，病毒膜呈示系統亦可以使用來定特徵廣泛種類的抗原胜肽，舉例而言病毒蛋白質，舉例而言病毒殼體蛋白質，之結構和功能。
舉例而言，在來自白斑症病毒的ie1啟動子之控制之下，VP1病毒殼體基因使用一病毒載體，例如一種桿狀病毒載體而有效率地表現於昆蟲細胞和哺乳動物細胞二者之 內。小鼠體內藉由使用桿狀病毒表面呈示的VP1作為一免疫原所提升的抗體有效率地中和活體外EV71的感染性。因此，此重組型桿狀病毒為一種用於治療，舉例而言，EV71感染之良好的疫苗。
於一例示性具體例中，本發明的表現匣係使用本技藝所知道的標準分子技術而轉殖至一種適合供用於一種選擇的蛋白質表現系統內之表現載體之內，例如Bac-to-Bac桿狀病毒表現系統(Invitrogen)。
多複本的表現載體接而藉由使表現載體轉染至一細胞株，例如大腸桿菌，之內而獲得。然後表現載體係被轉染至一宿主細胞株，例如昆蟲Sf9，之內以及被釋放至宿主細胞株所生長之培養基之內的出芽病毒顆粒係在轉染後4天予以收穫。病毒顆粒接而使用作為小鼠的接種之次單元疫苗。
使用“表現匣”的設計之相同的策略亦應用來產生遺傳工程的病毒以表現豬環狀病毒(Porcine Circovirus 2)(PCV2)和豬呼吸與生殖症候群病毒(PRRSV)之免疫性胜肽或蛋白質。使表現匣插入於病毒基因體之內，例如桿狀病毒基因體以及發現到為大量地表現和呈示於各別的病毒的表面之上。於本文中所說明的一實施例中，基因重組型桿狀病毒呈示來自PCV2或是PRRSV之免疫性胜肽以及使用來免疫天竺鼠以生產有效率地中和各別的病毒之感染性的(中和)抗體。
本文中所提及之重組型桿狀病毒，其表現來自PCV2或是PRRSV之免疫性胜肽和其作為抗各別病毒的感染之免疫 原之效用，的產生顯示出本“表現匣”的設計之廣泛的效用以及展示出其潛力作為用於產生對抗抗原胜肽，舉例而言病毒蛋白質，舉例而言任何病毒的殼體蛋白質，的疫苗之工具以及還有用於生產供使用於一診斷套組內之抗原的工具之潛力。
用於呈現或呈示生物分子之方法、套組及系統
本發明揭示了生物分子的表面呈示系統，連同此等系統之特定的應用來呈示胜肽作為疫苗。如同對熟悉此藝者會為明顯的，此等生物分子的表面呈示系統係不限於本文中所揭示之特定的應用，而是發現於希望呈示一生物分子，以及特別地，一抗原胜肽，舉例而言一病毒蛋白質，舉例而言一種病毒殼體蛋白質，之任何的情況中之廣泛應用。
於是，於一具體例中，本發明揭示了用於涉及胜肽的表面呈示之疫苗生產的方法、套組以及系統。此等方法、套組以及系統舉例而言可以使用本文中所例示之關於生產抗病毒的疫苗之桿狀病毒為主的表面呈示系統。然而，熟悉此藝者會辨識且理解用於涉及胜肽的表面呈示之疫苗生產的方法、套組以及系統不限於本文中所揭示的疫苗之生產。
於是，本發明提供了用於呈現或呈示多肽的方法，其中該方法包含：(a)使編碼該多肽之核酸插入至如同本文中所揭示之表現載體之內；(b)用該表現載體來轉染至少一個宿主細胞；以及(c)由該表現載體來表現該多肽 其中該多肽係呈現或呈示於一種桿狀病毒的表面膜之上。
本發明進一步提供了用於呈現或呈示多肽的系統，其中該等系統包含：(a)使編碼該多肽之核酸插入至一種表現載體之內，其中該表現載體包含來自白斑症病毒的一個ie1啟動子；(b)用來使該表現載體轉染至少一個宿主細胞之構件；以及(c)用來由該表現載體表現該多肽之構件其中該多肽係呈現或呈示於一種病毒，例如桿狀病毒的表面膜之上。
抗原胜肽
當使用於本發明中抗原胜肽包括能夠表現於本表現系統內之多肽或胜肽。當使用於本文中抗原胜肽可以為細菌、病毒或是原蟲抗原，其包括但不限於：病毒被膜、病毒殼體、病毒優勢免疫區或是病毒表面抗原。於一具體例中，抗原為一種病毒殼體胜肽抗原。使用本文中所說明的系統，表現病毒被膜和非被膜蛋白質二者為可能的。當使用於本文中抗原胜肽可以或可以不包括編碼全長的序列之多肽的一核酸序列在其範疇之內。使用於本文中之抗原胜肽可以為一片段，其可以含有或編碼一個或更多個抗原決定區，例如優勢免疫抗原決定區，其允許要被該片段，或是由該片段所編碼的序列，所提升之相似的免疫反應，至於全長的序列或是由該片段所編碼的序列。抗原片段可以 介於1個至500個胺基酸之間，介於20-400個胺基酸之間，介於30-300個胺基酸之間，舉例而言，片段可以為大約100、200、250、300或是350個胺基酸。
抗原胜肽可以為一種病毒、細菌或是原蟲胜肽，舉例而言一種病毒殼體胜肽，其係選自於來自以下的群組之細菌：螺旋體屬、克魯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、細胞巨大病毒、登革熱、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、EV71、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、疱疹、HIV、人類嗜T淋巴球病毒(Human T-lymphotropic virus)(HTLV)、流行性感冒病毒，舉例而言H5N1、H1N1、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)、三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)、麻疹病毒、野田病毒、β野田病毒、PCV2、PRRSV、德國麻疹病毒、SARS冠狀病毒、弓蟲屬、梅毒螺旋體(Treponema pallidum)、西尼羅河熱病毒(West Nile virus)或是水痘病毒。胜肽可以經由病毒、細菌或是原生動物來表現的或衍生自病毒、細菌或是原生動物。胜肽可以為重組型或經純化的。
當使用於本文中抗原胜肽可以為一種病毒或反轉錄病毒或是其免疫性片段的殼體蛋白質。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種EV71病毒，舉例而言抗原胜肽係選自於由VP0、VP1以及VP3或是其抗原決定位或片段所構成的群組，舉例而言抗原胜肽可 以包含以下或是由以下所組成：VP1的胺基酸167-178(序列辨識編號：23)；VP1的胺基酸209-222(序列辨識編號：24)；及/或VP1的胺基酸240-260(序列辨識編號：25)或是其免疫性片段。一抗原胜肽的例示性具體例係闡明於第3圖之內。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種PCV2病毒，舉例而言抗原胜肽為由ORF2所編碼的PCV2殼體蛋白質，或是其抗原決定位或片段，舉例而言抗原胜肽可以包含以下或是由以下所組成：ORF2的胺基酸100-150(序列辨識編號：26)及/或ORF2的胺基酸151-200(序列辨識編號：27)或是其免疫性片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種PRRSV病毒，舉例而言抗原胜肽係由選自於以下所構成的群組之ORF所編碼：ORF-4、ORF-5(主要被膜蛋白質)以及ORF-7(核殼體蛋白質)或是其抗原決定位或片段，舉例而言抗原胜肽可以包含以下或是由以下所組成：ORF7的胺基酸18-57(序列辨識編號：28)；ORF7的胺基酸58-123(序列辨識編號：29)；ORF5的胺基酸28-65(序列辨識編號：30)及/或ORF7的胺基酸132-200(序列辨識編號：31)或是其免疫性片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於來自螺旋體屬的細菌，舉例而言抗原胜肽係選自於由p41和C6或是其抗原決定位或片段所構成的群組。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於克魯氏錐蟲，舉例而言抗原胜肽為TcF或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於披衣菌細菌，舉 例而言抗原胜肽為主要外膜蛋白質或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種登革熱病毒，舉例而言抗原胜肽為非結構性蛋白質1或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種艾伯斯坦-巴爾病毒，舉例而言抗原胜肽為非結構性蛋白質1或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎，以及抗原胜肽舉例而言為HBsAg或是E1胜肽，或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種疱疹病毒，舉例而言抗原胜肽為H1或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種HIV病毒，舉例而言抗原胜肽為gp120或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種人類嗜T淋巴球病毒(HTLV)，舉例而言抗原胜肽為gp46或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種流行性感冒病毒，例如H5N1或是H1N1，以及抗原胜肽舉例而言為血球凝集素或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲，以及抗原胜肽為舉例而言抗原胜肽為裂殖子表面蛋白質2(MSP2)或是其抗原 決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種麻疹病毒，舉例而言抗原胜肽為麻疹或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種德國麻疹病毒，舉例而言抗原胜肽為E1或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於一種SARS冠狀病毒，以及抗原胜肽舉例而言為S蛋白質或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於弓蟲屬，以及抗原胜肽舉例而言為SAG-1或P30或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於梅毒螺旋體，以及抗原胜肽舉例而言為主要外鞘蛋白質(Msp)或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於西尼羅河熱病毒，以及抗原胜肽舉例而言為E蛋白質或是其抗原決定位或片段。
當使用於本文中抗原胜肽可以得自於野田病毒，舉例而言抗原胜肽為野田病毒的殼體蛋白質或是其抗原決定位或片段。
可以使用於本發明中的抗原胜肽之實例係顯示於以下的表4中：
本發明亦包括一種抗體，其對於表現於宿主細胞之內的抗原胜肽為專一性的。
免疫性組成物或疫苗
本發明亦提供了如本文中所說明之免疫性組成物或疫苗供用於一主體內之疾病的治療或預防，其中該疾病係與 一種感染相關，舉例而言一種病毒感染，例如EV71、PCV2、PRRSV或是野田病毒，以及其中該疫苗包含有一表現載體，其包含編碼一抗原胜肽的核酸，舉例而言一種病毒殼體蛋白質，以使得在使用中該抗原胜肽係經由該表現載體來表現於該主體內。
主體可以為哺乳動物、禽類動物、甲殼類動物、無顎魚類、硬骨魚、爬蟲類動物或是兩棲動物。主體可以為人類、非人類靈長類動物、禽、魚、蝦、蟹、龍蝦或是豬。
表現載體可以包含一個啟動子。於一具體例中，啟動子包含如本文中所說明之來自白斑症病毒的ie1啟動子或是由如本文中所說明之來自白斑症病毒的ie1啟動子所組成。啟動子可以可操作地連接至編碼一抗原胜肽的核酸序列。
本發明亦提供了如本文中所說明之免疫性組成物或疫苗，其包含有如本文中所說明之表現載體、宿主細胞或是組成物，供用於一主體內之疾病的治療或預防，其中該疾病係與一種病原體相關，舉例而言一細菌、病毒或原蟲，例如腸病毒71(EV71)、豬環狀病毒2(PCV2)、豬呼吸與生殖症候群病毒(PRRSV)、魚類野田病毒或是流行性感冒A(HA，H3N2)。
本發明亦提供了免疫性組成物或疫苗，其包含有如本文中所說明之表現載體、宿主細胞或是組成物，供用於一主體內之疾病的治療或預防，其中該疾病係選自於以下的群組之：手足口病、離乳後多系統消耗性症候群、豬生殖與呼吸症候群、疱疹、流行性感冒、癌症、肝炎、弓蟲症、 梅毒、瘧疾或病毒性神經壞死病、疏螺旋體病(borreliosis)、查加斯氏疾病(chagas disease)、披衣菌、登革熱、腦炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、疱疹、HIV、HTLV、流行性感冒，舉例而言H5N1、H1N1、瘧疾、麻疹、野田病毒相關疾病(nodaviral associated disease)、PCV2-相關疾病、豬生殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)、德國麻疹、SARS、弓蟲症、梅毒、西尼羅河熱，或是水痘(chicken pox)。
表現載體和宿主細胞
本發明亦提供了表現載體，其包含編碼一抗原胜肽的一核酸，舉例而言其中該抗原胜肽包含一種病毒殼體胜肽。
本發明進一步提供了表現載體，其包含編碼一抗原胜肽的一核酸，供用於一主體內之疾病的治療或預防，其中該疾病係與病毒感染相關，以使得在使用中該抗原胜肽的係經由該表現載體來表現於該主體內。適合供用於桿狀病毒內的表現載體之實例，包括但不限於：Bac-to-BacTM(Invitrogen)、BaculoDirectTM(Invitrogen)、BacPAK6/BaculoGoldTM(BD Biosciences/Clonetech)、FlashBACTM(Genway)和ProEasyTM(AB Vector technologies)。
本發明亦提供了宿主細胞，其包含有如本文中所說明之表現載體。於一具體例中，宿主細胞為昆蟲細胞，舉例而言宿主細胞可以為SF9細胞，例如，SF9-II、SF9-III。於另一具體例中，宿主細胞為哺乳動物細胞，舉例而言人類、猴或是豬細胞，例如人類TK-143b細胞、猴Marc145細胞或是非 洲綠猿腎臟細胞，或是豬PK15細胞。於另一具體例中，宿主細胞為魚的細胞，舉例而言鯉魚上皮瘤乳頭狀細胞(EPC)。
組成物和免疫增效劑
本發明進一步預期組成物，其包含一種免疫增效劑的、稀釋劑、佐劑或賦形劑。
免疫增效劑可以予以配方至一組成物之內如同中性的或是鹽的形式。藥學上可接受的鹽類包括酸加成鹽類(用胜肽之游離的胺基團來形成的)以及其等係用無機酸來形成的，例如，舉例而言，鹽酸或磷酸，或是此等有機酸來形成的，例如，醋酸、草酸、酒石酸、順丁烯二酸，以及類似物。用游離的羧基來形成之鹽類亦可以衍生自無機的基礎，例如，舉例而言，鈉、鉀、銨、鈣，或是氫氧化鐵，以及此等有機的基礎如同異丙胺、三甲胺、2-乙胺乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)，以及類似物。
一般而言，適合的組成物可以根據熟悉此藝者所知道的方法來製備以及可以包括藥學上可接受的稀釋劑、佐劑及/或賦形劑。稀釋劑、佐劑和賦形劑在與組成物之其他成分相容方面必須為"可接受的"，以及對其接受者不是有害的。
藥學上可接受的稀釋劑之實例為去礦質水或是蒸餾水；食鹽溶液；蔬菜基礎的油，例如，花生油(peanut oil)、紅花子油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、花生油(arachis oil)、或是椰子油；聚矽氧油，包括聚矽氧烷，例如甲基聚矽氧烷、苯基聚矽氧烷和甲基苯基聚矽氧烷；易揮發的聚 矽氧；礦物油，例如，液態石蠟、軟石蠟或是鯊烷；纖維素衍生物，例如，甲基纖維素、乙基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、或是羥丙基甲基纖維素；低級烷醇，舉例而言乙醇或是異丙醇；低級芳烷醇；低級聚亞烷基二醇(lower polyalkylene glycol)或是低級聚亞烷基二醇，舉例而言聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或是甘油；脂肪酸酯，例如，棕櫚酸異丙酯、肉豆蔻酸異丙酯或是油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrridone)；洋菜；鹿角菜膠；黃蓍膠或是阿拉伯膠，以及石油膠。典型地，載劑(carrier)或是載劑(carriers)會形成由1%至99.9%以組成物的重量計。最佳地，稀釋劑為食鹽水。
為了投藥作為一種可注射溶液或是懸浮液，無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或載劑可以包括，林格溶液(Ringer's solution)、中長鏈三酸甘油酯(MCT)、等張食鹽水、磷酸鹽緩衝食鹽水、乙醇以及1,2丙二醇。
供口腔使用之適合的載劑、稀釋劑、賦形劑以及佐劑之一些實例包括花生油、液態石蠟、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、海藻酸鈉、阿拉伯膠、黃蓍膠、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、明膠以及卵磷脂。另外，此等口服配方可以含有適合的調味劑和著色劑。當使用膠囊形式時，膠囊可以塗覆延遲崩解的化合物，例如，甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
佐劑可以劃分成數個主要的組，包括含有佐劑組成物之礦物、油-乳劑佐劑、皂素佐劑配方、病毒體(virosome) 和類病毒顆粒(VLPs)、細菌或是微生物的衍生物以及免疫刺激性的寡核苷酸。佐劑之共同的實例包括但不限於：Adjuvant 65(含有花生油、去水甘露糖醇一油酸和單硬脂酸鋁)；Montanide佐劑，例如，Montanide Incomplete Seppic Adjuvant(ISA)，舉例而言Montanide ISA 50、51或是720，佛恩得(Freund’s)完全佐劑或是不完全佐劑；礦物凝膠，例如，氫氧化鋁、磷酸鋁和明礬；表面活性劑，例如，十六基胺、十八基胺、脫脂酸卵磷脂、雙十八烷基二甲基溴化銨(dimethyldioctadecyl-ammonium bromide)、N,N-雙十八烷基-N’,N’-雙(2-羥甲基)丙二胺、甲氧基十六基甘油和複合多元醇(pluronic polyol)；多價陰離子，例如，呱喃、硫酸聚葡萄醣、poly IC、聚丙烯酸和卡波姆(carbopol)；胜肽，例如，胞壁醯二肽(muramyl dipeptide)、二甲基甘胺酸和特夫素(tuftsin)；QS-21、Detox-PC、MPL，例如，3D-MPL、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TERamide、PSC97B、Adjumer、PG-026、GSK-1、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax CpG ODN、倍他非丁(Betafectin)、明礬、MF59以及油乳劑，例如油包水乳劑或是水包油乳劑。
用於口服投藥之固體形式可以含有人類和獸醫的藥學實踐方面可以接受的黏合劑、增甜劑、分解劑、稀釋劑、調味劑、塗覆劑、防腐劑、潤滑劑及/或時間延遲劑。適合的黏合劑包括阿拉伯膠、明膠、玉米澱粉、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素或是聚乙二醇。適合的增甜劑包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或是甜精。適合的分解劑包 括玉米澱粉、甲基纖維素、聚乙烯氫吡咯酮、瓜爾膠、三仙膠、膨土、海藻酸或是洋菜。適合的稀釋劑包括乳糖、山梨醇、甘露糖醇、右旋糖、高嶺土、纖維素、碳酸鈣、矽酸鈣、或是磷酸氫鈣。適合的調味劑包括薄荷油、冬青油、櫻桃、柳橙或是樹莓調味劑。適合的塗覆劑包括丙烯酸及/或甲基丙烯酸及/或其等之酯之聚合物或共聚物、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲膠或是麵筋。適合的防腐劑包括苯甲酸鈉、維生素E、α-生育酚、抗壞血酸、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯或是亞硫酸氫鈉。適合的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、油酸鈉、氯化鈉或是滑石。
用於口服投藥的液體形式除以上的製劑之外還可以含有液體載劑。適合的液體載劑包括水、油，例如，橄欖油、花生油(peanut oil)、芝麻油、葵花子油、紅花子油、花生油(arachis oil)、椰子油、液態石蠟、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、三酸甘油酯或是其混合物。
用於口服投藥的懸浮液可以進一步包含分散劑及/或懸浮劑。適合的懸浮劑包括羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙甲基纖維素、聚乙烯氫吡咯酮、海藻酸鈉或是乙醯醇(acetyl alcohol)。適合的分散劑包括卵磷脂、脂肪酸之聚氧乙烯酯，例如，硬脂酸、聚氧乙烯山梨醇單-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或是-月桂酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇單-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或是-月桂酸酯以及類似物。
用於口服投藥的乳劑可以進一步包含一個或更多個乳 化劑。適合的乳化劑包括如同以上所例示的分散劑或天然的膠，例如，瓜爾膠、阿拉伯膠或是黃蓍膠。
用於製備腸胃外可投藥的組成物之方法對熟悉此藝者為明顯的，以及更詳細地說明於，舉例而言，Remington's Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.，藉此併入本文以作為參考。
組成物可以併入任何適合的表面活性劑，例如，陰離子、陽離子或是非離子表面活性劑，例如，去水山梨醇酯或是其聚氧乙烯的衍生物。亦可以包括懸浮劑，例如，天然的膠，纖維素衍生物或無機的材料，例如，矽酸鹽質氧化矽(silicaceous silicas)，以及其他的成分，例如，羊毛脂。
如同本文中所揭示的或是以上的一個或更多個製劑可以包括於本發明的組成物之製劑內。此等製劑使用熟悉此藝者所知道之例行的方法。典型地，此等組成物係製備為注射劑，不論為液體溶液還是懸浮液；適合用於溶液中(solution in)，或是懸浮液中(suspension in)之固體的形式，亦可以製備在注射之前的液體。製劑亦可以為乳化的。活性的免疫性成分常常混合以藥學上可接受的且與活性成分相容的賦形劑。
投藥的途徑
根據本發明的方法、疫苗以及組成物可以藉由任何適合的途徑予以投藥，不論為全身性地、區域性地還是局部性地。要使用於任何假設情况之內之特定的投藥途徑會取決於一些因子，包括要治療的疾病之本質、疾病的嚴重性 和程度、要遞送之特定的化合物所需要的劑量以及所欲的疫苗或組成物可能的副作用。
舉例而言，於需要將適當濃度之所欲的疫苗或組成物直接遞送到待治療的位址之情况下，投藥可以為區域性的而不是全身性的。區域的投藥提供了遞送非常高的局部濃度之所欲的疫苗或組成物至所需要的位址處的能力以及從而適合用於達到所欲的治療作用或是預防作用而避免身體的其他器官暴露至疫苗或是組成物以及藉此潛在地減少副作用。
舉例來說，根據本發明的具體例之投藥可以藉由任何標準的途徑來達成，包括體腔內的、膀胱內的、肌肉內的、動脈內的、靜脈內的、皮下的、局部的或是口部的。體腔投藥可以為腹膜內或胸膜內的。
設若希望，適合用於持續的釋放或是間歇性的釋放之包含如本文中所說明的表現匣之裝置或是組成物可以，實際上，被植入於身體之內或是向該處局部地施用供用於相對緩慢的釋放此等材料至身體之內。
一表現載體或是宿主細胞之投藥可以包括經由直接的口部攝取、全身性注射，或是遞送至選擇的組織或是細胞而遞送，或是經由遞送至由一主體單離或是相容的供體的細胞而間接地遞送。
關於核酸為主的組成物，此等組成物之所有的遞送模式為本發明所預期的。遞送此等組成物至一動物的細胞或是組織可以，舉例而言藉由微發射體撞擊(microprojectile bombardment)、脂質體媒介的轉染(例如，脂染素(lipofectin)或是lipofectamine)、電穿孔、磷酸鈣或是DEAE-聚葡萄醣-媒介的轉染而促進。於一任擇的具體例中，一合成的建構物可以以如本技藝所知道的"裸露的DNA"組成物之形式而使用作為一治療或是預防性組成物。適合的遞送方法之討論可以於CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY第9章(Eds.Ausubel等人；John Wiley & Sons Inc.,1997 Edition)或是於網址DNAvaccine.com.找到。組成物可以藉由皮內的(例如，使用panjetTM delivery)或是肌肉內的途徑來投藥。
引導合成的多核苷酸至一標靶細胞之內的步驟會取決於預期的用途和物種而不同，以及可以牽涉到非病毒和病毒載體、陽離子脂質體、反轉錄病毒，和桿狀病毒的一者或更多者，例如，舉例而言，於Mulligan,R.C.,(1993 Science 260 926-932)之內說明的，其係藉此併入以作為參考。此等方法可以包括，舉例而言：
A.經由注射(Wolff等人，1990,Science 247 1465-1468，其係藉此併入以作為參考)、外科植入、滴入或是任何其他的手段之合成的多核苷酸之局部應用。此方法亦可以組合以經由對合成的多核苷酸所編碼之蛋白質有反應的細胞之注射、外科植入、滴入或是任何其他手段的局部應用來使用以便增加該治療的有效性。此方法亦可以組合以該蛋白質的活性所需要之另一個因子(factor)或是因子(factors)之注射、外科植入、滴入或是任何其他手段的局部 應用來使用。
B.經由單獨地注射DNA、(Calabretta等人，1993,Cancer Treat.Rev.19 169-179，其係併入本文以作為參考)，或RNA，或是組合以脂質體(Zhu等人，1993,Science 261 209-212，其係併入本文以作為參考)、病毒殼體或是奈米粒子(Bertling等人，1991,Biotech.Appl.Biochem.13 390-405，其係併入本文以作為參考)或是任何其他的遞送媒介者之普遍的全身性遞送。改善的定標可以藉由連接合成的多核苷酸至一標靶分子(使用，舉例而言，一種抗體之所謂的"魔彈"方法)，或是藉由編碼合成的多核苷酸之蛋白質的活性所需要的另一個因子(factor)或是因子(factors)，或是對該蛋白質反應的細胞之注射、外科植入或是任何其他的手段的局部應用來達到。
C.已經於活體外藉由轉染(舉例而言，於磷酸鈣存在下：Chen等人，1987,Mole.Cell Biochem.7 2745-2752，或是陽離子脂質和多胺存在下：Rose等人，1991,BioTech.10 520-525，該等文章係併入本文以作為參考)、感染、注射、電穿孔(Shigekawa等人，1988,BioTech.6 742-751，其係併入本文以作為參考)或是任何其他的方式而修飾的細胞之注射或植入或是藉由任何手段的遞送以便增加細胞內之合成的多核苷酸之表現。修飾可以藉由質體、噬菌體、粘接質體、病毒(例如腺病毒或反轉錄病毒；Mulligan,1993,Science 260 926-932；Miller,1992,Nature 357 455-460；Salmons等人，1993,Hum.Gen.Ther.4 129-141，該等文章係 併入本文以作為參考)或其他的載體，或是其他的修飾製劑，例如，脂質體(Zhu等人，1993,Science 261 209-212，其係併入本文以作為參考)、病毒殼體或奈米粒子(Bertling等人，1991,Biotech.Appl.Biochem.13 390-405，其係併入本文以作為參考)，或是任何其他的修飾媒介者來媒介。使用細胞作為基因或基因產物之遞送載體已經由Barr等人，1991,Science 254 1507-1512和Dhawan等人，1991,Science 254 1509-1512，所說明，該等文章係併入本文內以作為參考。處理的細胞可以組合以會促進其等於治療的主體內之存活之任何的營養素、生長因子、基質或是其他的製劑來遞送。
組成物亦可以以脂質體的形式予以投藥。脂質體通常衍生自磷脂質或是其他的脂質物質，以及係由分散於含水培養基內之單層狀或是多層狀水合液晶所形成的。可以使用任何無毒的、生理上可以接受的且可代謝的脂質能夠形成脂質體。脂質體形式內之組成物可以含有安定劑、防腐劑、賦形劑以及類似物。較佳的脂質為磷脂質及磷脂醯膽鹼(卵磷脂)，天然的和合成的二者。來形成脂質體的方法為本技藝所知道的，以及關於此特定的參考：Prescott,Ed.,方法s in Cell Biology,Volume XIV,Academic Press,New York,N.Y.(1976),p.33以及下列等等，其內容係併入本文以作為參考。
劑量
用於任何特定的主體之投藥的化合物之有效劑量位準 會取決於各種各樣的因子包括：待治療的疾病類型和疾病的階段；使用的化合物之活性；使用的藥學組成物；主體之年齡、體重、一般的健康、性別和飲食；投藥的時間；投藥的途徑；化合物之螯合率；治療的持續時間；與治療組合或是偶然一致使用的藥物，連同本技藝所熟知的其他相關因子。
熟悉此藝者藉由例行的實驗會能夠決定治療可適用的病況所需要之有效的、無毒的劑量。此等最常會逐一地決定。
在重量方面，一種供用於投藥至一病人之組成物的治療有效劑量預期會在每24小時每公斤體重大約0.01mg至大約150mg的範圍內；典型地，每24小時每公斤體重大約0.1mg至大約150mg；每24小時每公斤體重大約0.1mg至大約100mg；每24小時每公斤體重大約0.5mg至大約100mg；或是每24小時每公斤體重大約1.0mg至大約100mg。更典型地，有效的劑量範圍預期會在每24小時每公斤體重大約5mg至大約50mg的範圍內。
任擇地，一有效劑量可以高至大約5000mg/m2。一般而言，一有效劑量預期為在大約10至大約5000 mg/m2的範圍內，典型地大約10至大約2500 mg/m2，大約25至大約2000 mg/m2，大約50至大約1500 mg/m2，大約50至大約1000 mg/m2，或是大約75至大約600 mg/m2。
再者，最理想的量和個別的劑量之間隔會藉由待治療的病況之本質和程度、形式、投藥的途徑和位置，以及待治療的特定個體之本質來決定對於熟悉此藝者會是明顯 的。並且，此等最理想的條件可以經由慣用的技術來決定。
治療之最理想的過程，例如，每單位時間給予的組成物之劑量的數量，可以由熟悉此藝者係使用治療決定試驗之慣用的過程來確定對於熟悉此藝者亦為明顯的。
免疫作用的效能之評估
根據本發明的方法進行之免疫作用的有效性可以使用任何適合的技術來評估。舉例而言，可以使用CTL溶解分析，其係運用利用51Cr標示的標靶細胞之經刺激的脾細胞或是末梢血液單核細胞(PBMC)於胜肽塗覆的或是重組型病毒感染的細胞上。此等分析可以使用，舉例而言，靈長類動物、豬、天竺鼠、小鼠或是人類細胞(Allen等人，2000,J.Immunol.164(9)：4968-4978還有Woodberry等人，以下)予以執行。任擇地，免疫作用的效能可以使用一個或更多個技術予以監控，包括，但不限於：新鮮的和經刺激的PBMCs二者之第I類HLA四聚體染色(見舉例而言Allen等人，在前)、增殖分析(Allen等人，在前)、ElispotTM分析；直接的或是間接的免疫螢光法分析和細胞內的IFN-γ染色(Allen等人，在前)、線性B細胞反應之ELISA分析，以及表現如本文中所說明之抗原胜肽的細胞樣品之西方墨點。可以任擇地或是額外地使用免疫金電子顯微鏡技術。
套組
本發明提供了供使用於治療或預防一主體內的疾病之套組，其中該疾病係與一種病毒相關，以及其中該套組包含如本文中所說明之疫苗、表現載體、宿主細胞或是組成物。
於本發明的上下文中，一種間隔化的套組包括任何的套組，其中於各自的容器內含有試劑，以及可以包括小的玻璃容器、塑膠容器或是塑膠或紙的帶狀物。此等容器可以允許有效率的轉移試劑由一個隔間至另一個隔間而避免樣品和試劑之交叉污染，以及以定量的方式由一個隔間至另一個隔間添加各個容器的製劑或溶液。
典型地，本發明的方法之套組也會包括用於使用套組組份來實施適當的方法之用法說明。
本發明現在會參考下列的實施例來說明，其無論如何不應該解釋為本發明的範圍之限制。
實施例 實施例1-重組型Bac-VP1之建構
EV71病毒(C4菌株)的VP1基因之全長的開放讀框(ORF)係予以擴增以及轉殖至pFASTBacHT A質體(Invitrogen,SanDiego,CA)之內。為了有效率地呈示VP1於桿狀病毒被膜上，使一種gp64之額外的訊息序列遺傳地融合至VP1的N端，而H3N2-HA穿膜領域和gp64之CTD位於C端的側面用於辨識核殼體以及隨後的蛋白質併入至出芽的病毒粒子之內。設計了總計5個引子(列於表1內)來建構融合基因。
第1圖闡明用於產生融合基因之整個的方法。引子A(序列辨識編號：1)和B(序列辨識編號：2)係使用來擴增整個全長之VP1基因連同各別地於VP1的N端和C端之gp64訊息序列之額外的重疊區域、H3N2-HA穿膜區域。使用上面純化的反應混合物作為模板，引子A(序列辨識編號：1)和C(序 列辨識編號：3)係使用來使VP1的C端與H3N2-HA穿膜領域之完全的序列重疊。最後，使用上面純化的反應混合物作為一模板，引子D(序列辨識編號：4)和E(序列辨識編號：5)係使用來使gp64訊息序列的整個區域、gp64 CTD區域各別於N端和C端重疊。所生成的PCR產物係予以純化以及轉殖至帶有適當的限制位置之質體pFASTBacHT之內。引子D(序列辨識編號：4)和引子E(序列辨識編號：5)係設計來添加限制酶位置RsrII和Hind III在二個末端。ie1啟動子係使用引子F(序列辨識編號：6)和引子G(序列辨識編號：7)而由WSSV DNA來擴增以及接而使用AccI和Rsr II限制位置而插入至pFASTBac HTA之內。第2圖顯示出完全建構的重組型桿狀病毒載體。
於表1內，注意到下列的序列辨識編號：識別子適用：
引子A：序列辨識編號：1
引子B：序列辨識編號：2
引子C：序列辨識編號：3
引子D：序列辨識編號：4
引子E：序列辨識編號：5
引子F：序列辨識編號：6
引子G：序列辨識編號：7
重組型桿狀病毒的產生
於重組型桿狀病毒的產生方面，建構物係透過使用Bac-To-Bac系統(Invitrogen)之位址專一性轉位作用而併入至DH10Bac(Invitrogen)之內的桿狀病毒基因體內。重組型穿梭載體(bacmids)接而予以轉染至Sf9細胞之內，以及釋放至培養基之內的出芽病毒顆粒係在轉染後4天予以收穫。隨後的病毒擴增和溶菌斑純化係於補充以Sf9-II無血清培養基之昆蟲的Sf9-II細胞株內執行。TCID50係藉由終點稀釋法方法來決定。理想地，在病毒複製的期間gp64訊息序列指導嵌合蛋白質的移位至昆蟲細胞質膜之內以及在蛋白質固定之後被分開從而向外表面暴露VP1 N-端。H3N2-HA穿膜領域使蛋白質能夠錨定於質膜上，而gp64 CTD媒介(1)辨識出芽的桿狀病毒核殼體連同膜結合蛋白質以及(2)併入錨定的蛋白質至病毒被膜之內。
Sf9-II細胞內之重組型蛋白質(rVP1)表現之確認
為了確認rVP1於昆蟲的Sf9-II細胞內的表現，細胞係予以感染，使用作為對照，以及如以上所提及的予以感染。rVP1呈示於SF9-II細胞表面上之模式係顯示於第3圖中。為了確認是否rVP1恰當地移位於質膜上的表面之上，細胞係 予以培養於無菌的蓋玻片之上，感染rBac-VP11，野生型桿狀病毒(WT-Bac)以及在2 dpi接受免疫螢光法標示/共焦顯微鏡的視像化(第4圖)。在感染之後2天，移去上清液，以及細胞係藉由4%PFA在4℃予以固定歷時1h，用1 ml的PBS予以沖洗以及接而用配於PBS(1ml)內的2%BSA在37℃封阻歷時30 min。細胞接而與初級抗體(抗-VP1，多株抗天竺鼠(1：500)於37℃一起孵育歷時1 h，接著PBS清洗3次。細胞接而與二級抗體(FITC-接合的山羊抗天竺鼠抗體，1：100)於37℃一起孵育歷時1 h接著3次PBS清洗。蛋白質定位係藉由一共焦顯微鏡(Leica)來顯現。合併的照片闡明rVP1與質膜之共定位。rBac-VP11表現蛋白質，其等係藉由多株抗-VP1天竺鼠(1：500)抗體予以偵測。根據rVP1與質膜之共定位，確認了rVP1係移位且錨定於質膜上。
rVP1之呈示於桿狀病毒被膜上
為了檢查是否錨定於質膜上的rVP1成功地呈示於桿狀病毒被膜之上，rBac-VP11 rBac-VP12和WTBac係藉由蔗糖梯度離心予以純化以及接受西方墨點，其係使用多株抗-VP1(天竺鼠)抗體作為初級抗體接著抗天竺鼠HRP標示的作為二級抗體(第5圖)。所獲得的rVP1如同第5圖中所顯示的，重組型病毒係藉由以MOI 0.1來感染細胞所生產出以及在感染後4天收穫。病毒上清液分別藉由蔗糖梯度超速離心(O` Reilly,1992)予以純化。總計200 ml病毒係藉由以90,000xg(Beckman coulter)來超速離心歷時2 hr而成丸狀，以及集合沉澱丸且再懸浮於2 ml PBS之內。為了進一步的 病毒純化，將濃縮的病毒(1ml)裝載於20、35、50和60%(wt/wt)蔗糖溶液所組成的蔗糖梯度(10ml)之上。在以90,000xg離心歷時2.5 hrs之後，沈積在接近50%蔗糖的桿狀病毒係藉由注射器予以收集稀釋於8 PBS內以及以90,000xg超速離心歷時2h。純化的病毒沉澱丸係再懸浮於0.5 ml PBS之內以及接而接受如下的免疫金電子顯微鏡。塗碳的銅網係漂浮於微量的(drop)封阻溶液(PBS含有1% BSA和25 mM甘胺酸pH 6.2)的頂部上歷時30 min以及用PBS 3 X 5 min清洗。在清洗以後，將網轉移至微量的(drop)(各25μl)抗小鼠VP1 pAb溶液(1：500)的滴劑(drop)之上以及於室溫下孵育歷時30 min。在用PBS的3次清洗之後，網接而漂浮於接合5-nm金顆粒(1：25)之山羊抗小鼠Ab上於室溫下歷時30 min。在用PBS清洗之後，網係用2%磷鎢酸(PTA,Sigma)予以負染色歷時2 min以及於室溫下風乾。網接而在穿透式電子顯微鏡之下檢查。第6圖顯露出於WT-Bac的表面之上沒有金顆粒，反之於rBac-VP11的表面之上觀察到金顆粒，指示出rVP1的併入且呈示於病毒被膜上。
rVP1的併入至純化的桿狀病毒(rBac-VP11，rBACVP12)之內係藉由SDS-PAGE/西方墨點來顯現以及藉由紅外線掃描密度測定法予以定量(第7圖)，併入至病毒之內的rVP1的量係根據純化的蛋白質Vs併入的rVP1之強度之間的比較來定量。當比較時，於桿狀病毒被膜rBac-VP11上的rVP1之表現位準比野生型EV71病毒(B5菌株)更高~2倍以及比rBac-VP12更高~14倍。如同第5圖中所顯示的，純化的病毒 接受SDS-PAGE以及使用抗-VP1 mAb作為初級抗體和二級的驢抗小鼠IRdye800(1：5000)之西方墨點。蛋白質定量使用Odyssey v1.1 IR成像系統(LI-COR)來完成。
VP1-重組型桿狀病毒(Bac-VP1)之免疫原激發性質
為了檢查是否呈示於桿狀病毒之上的VP1可以供使用作為活體內激發抗-VP1抗體之免疫原，各包含8隻雌性BALB/c小鼠(6週大，NUS Animal care購買的)的2組小鼠係各別地用1.2x107 PFU純化的Bac-VP1予以皮下免疫。5隻小鼠係用純化的野生型桿狀病毒WT或是PBS之予以注射作為負對照。化學不活化的EV71(B5)病毒(107)係注射作為正對照。各個小鼠係用純化的病毒(200μl)連同200μl完全佛恩得佐劑(Freund’s adjuvant)予以注射。在初級注射之後2週小鼠接受使用等量的純化病毒連同不完全佛恩得佐劑之一次補強注射9。血液樣品於第6週從尾部靜脈取得以及予以熱不活化。
EV71菌株係生長於RD細胞內。個別的病毒(100 TCID50單位)於連續稀釋的測試或是對照血清(熱不活化的於56℃歷時30 min)內在37℃孵育歷時1 h。在3天之後，EV71感染的單層係用95%乙醇和5%丙酮於-20℃固定歷時20 min以及抗-EV71(天竺鼠)抗體作為第一個抗體且FITC-接合的山羊抗天竺鼠IgG作為第二個抗體。細胞係使用一螢光顯微鏡來觀察以及判定測試血清中和病毒感染性的能力。螢光為50%或比病毒感染的對照井更少之測試血清之最高稀釋的倒數採取作為病毒中和力價。如同第8圖中所顯示的，負對 照野生型桿狀病毒和PBS誘導沒有中和作用，而rBac-VP11誘導高至27.2的中和力價，反之不活化的EV71誘導高至24.9的中和力價。
此等數據指示出併入的rVP1成功地誘導功能性抗體。雖然已經提出呈示免疫原作為疫苗候選者之桿狀病毒，但是此為展示出具有大量的表現免疫原(殼體蛋白質VP1)於其表面上的重組型桿狀病毒之第一個報告。編碼包含gp64(全長)作為融合伙伴的表現匣之桿狀病毒不會有效率地呈示免疫原於其表面上，其係藉由VP1定量分析和病毒中和分析而確認的。然而對抗暴露的融合gp64配對物之免疫反應的可能性可能阻礙疫苗的效率。
於本實施例中，訊息胜肽序列只含有來自gp64基因之訊息序列(序列辨識編號：14)，反之全長的gp64基因含有gp64訊息序列、胞外領域、穿膜領域(TMD)以及細胞質領域(CTD)。當使VP1表現於具有gp64訊息序列、H3N2-HA穿膜領域和gp64 CTD之本新穎的表現匣內時，最終表現的蛋白質會或多或少相似於天然的VP1分子量，而於正常表現匣的狀況，VP1插入於gp64訊息序列和成熟的gp64領域(包括gp64胞外領域、穿膜領域、細胞質領域)之間，所以最終的總體表現的蛋白質會比VP1蛋白質之正常大小為更高(見第5圖)
因而，於此發明中所產生的重組型桿狀病毒(rBac-VP11)，其編碼包含gp64訊息胜肽(20 aa)、H3N2-HA穿膜領域(27 aa)和gp64細胞質領域(6 aa)作為融合伙伴之新 穎的“表現匣”，呈示更多的rVP1於桿狀病毒被膜上以及當與rBac-VP12和不活化的EV71(B5)病毒比較時賦予較高的抗VP1免疫反應。當EV71感染變成感染世界各地，尤其於亞洲國家，的嬰兒和兒童之主要的感染性疾病之一者時，EV71疫苗的發展已變成危急的。此新穎疫苗之認可可以開啟了EV71疫苗發展的新途徑以及也提供了任擇的方法給現存的疫苗技術。
此實施例因而清楚地展示出本發明的表現匣之用途，其不需要全長的gp64序列，用於表現一標靶抗原(於此特定的實施例內為VP1)於桿狀病毒的表面上以及桿狀病毒成功地激發一種免疫反應之隨後的用途，藉此作用為對抗一標靶病原體的疫苗。
實施例2-表現匣用於呈示其他的免疫性蛋白質/胜肽於桿狀病毒的表面上之用途
根據本發明，“表現匣”用於呈示其他的免疫性蛋白質/胜肽於桿狀病毒的表面上之應用性以及其作為一免疫原之效用係藉由使來自豬環狀病毒2(PCV2)、豬呼吸與生殖症候群病毒(PRRSV)及β野田病毒之免疫性胜肽/蛋白質表現來確定。PCV2和PRRSV為感染豬之主要的病原體以及其等使豬生產工業遭受沈重的經濟損失。PCV2為一種具一單一的結構性蛋白質之無被膜病毒以及PRRSV為一種具多結構性組份之被膜病毒。β野田病毒屬於野田病毒(Nodaviridae)家族的成員，為魚之病毒性神經壞死病的病原體以及其感染造成於亞洲、歐洲、澳洲、馬丁尼克島(Martinique)，和大 溪地(Tahit)之廣泛範圍的海水魚物種之幼體和稚體之高的死亡率。重組型桿狀病毒，其等係藉由ie1啟動子所驅動而由“表現匣”來表現PCV2、PRRSV和β野田病毒免疫性胜肽/蛋白質，顯示出大量的表現以及表面呈示於桿狀病毒被膜上。表現PCV2、PRRSV和β野田病毒免疫性區域於重組型桿狀病毒之表面上的重組型桿狀病毒可以使用作為對抗此等豬的病原體之疫苗。
建構PCV2和PRRSV免疫性區域至表現匣之內. PCV2殼體蛋白質：
PCV2的殼體蛋白質，ORF-2，為主要的免疫性蛋白質。使用前面提及的表現匣而呈示於桿狀病毒表面之上的殼體區域係由PCV2菌株BJW(GenBank：AY847748.1)來獲得。胺基酸76至135、121至180以及76至180係與介於N-端gp64訊息序列和C端H3N2-HA穿膜領域，gp64細胞質領域，之間的“表現匣”的組份在架構上融合。下列的引子係使用來擴增PCV2的殼體區域(表2)。
於表2內，注意到下列的序列辨識編號：識別子適用：
引子核殼體76 F：序列辨識編號：8
引子核殼體135 R：序列辨識編號：9
引子核殼體121 F：序列辨識編號：10
引子核殼體180 R：序列辨識編號：11
於“表現匣”內懷有以上所提及的PCV2殼體蛋白質之區域的桿狀病毒基因體係如早先所說明的予以建構以及病毒係予以再生。PCV2殼體蛋白質區域之表現和併入於桿狀病毒表面上係如早先關於rBac-VP1建構物所說明的藉由西方墨點和電子顯微鏡來檢查。觀察顯示出確實殼體蛋白質區域係呈示於桿狀病毒表面上以及表現位準係如同使用構形專一性單株抗體8C2之西方墨點分析(第9圖)和免疫螢光法分析內所觀察到的一樣為大量的。再者由用以上的重組型桿狀病毒予以接種之天竺鼠所獲得的抗體能夠藉由免疫螢光法分析而於PCV2感染的PK-15細胞單層偵測到PCV2抗原(第10圖)。
PRRSV核殼體蛋白質(ORF7)：
PRRSV之ORF5和ORF7編碼PRRSV之主要的免疫性蛋白質。主要被膜蛋白質(由ORF5所編碼的)和核殼體蛋白質(由ORF7所編碼的)係使用前面提及的表現匣而呈示於桿狀病毒表面上。在PRRSV主要被膜蛋白質(ORF5)方面，其3個穿膜的橫跨胺基酸之刪失助長了由桿狀病毒之有效率地表面呈示。主要被膜蛋白質不需要核殼體蛋白質的共表現因其要以此方式被表面呈示於桿狀病毒上。ORF7和ORF5為不同的ORFs，以及分別地轉錄。免疫性區域係由PRRSV菌株JK100(GenBank：AF332732.1)來擴增。有興趣的蛋白質係於N-端gp64和C端H3N2-HA穿膜領域之間而在架構上與 “表現匣”的組份融合。下列的引子係使用來擴增PRRSV的殼體區域(表3)。
於表1內，注意到下列的序列辨識編號：識別子適用：
引子ORF7 F：序列辨識編號：12
引子ORF7 R：序列辨識編號：13
於“表現匣”內懷有以上所提及的PRRSV之蛋白質的桿狀病毒基因體係如早先所說明的予以建構以及病毒係予以再生。PRRSV蛋白質之表現和併入於桿狀病毒表面上係如早先關於rBac-VP11建構物所說明的藉由西方墨點和電子顯微鏡來檢查。觀察顯示出確實蛋白質係有效率地呈示於桿狀病毒表面上以及表現位準係如同使用構形專一性單株抗體專一性的ORF7(5H2)之西方墨點分析(第11圖)和免疫螢光法分析內所觀察到的一樣為大量的。再者由用以上的重組型桿狀病毒予以接種之天竺鼠所獲得的抗體能夠藉由免疫螢光法分析而於PRRSV感染的MARC-145細胞單層偵測到PRRSV抗原(第12圖)。
β野田病毒殼體蛋白質之建構至表現匣之內.
β野田病毒的核殼體α蛋白質為主要的免疫性蛋白質之。全長的野田核殼體α蛋白質係於N-端gp64訊息序列和C端H3N2穿膜領域，gp64細胞質領域之間而在架構上與“表現匣”的組份融合。下列的引子係使用來擴增野田病毒的殼 體區域。NodaR1係使用來加入H3N2領域，反之NodaR2係使用來加入gp64細胞質領域。
NodaF-5`-(序列辨識編號：37)AATCGGTCCGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGTACGCAAAGGTGAGAAGAAATTGG
NodaR1-5`-(序列辨識編號：38)TGGCAAAGGAAATCCATAGGATCCAGTTTCCCGAGTCAACCCTGGTGCAG
NodaR2-(序列辨識編號：39)AAGCTTATTTTAATATTGTCTATTACGGTTTTGGCAGGCCCACATGATGAACCCCAACAAAGCAACACAAAGCAAAAAACATGATATGGCAAAGGAAATCCATAGGA
於“表現匣”內懷有以上所提及的β野田病毒的核殼體α蛋白質之桿狀病毒基因體係如早先所說明的予以建構以及病毒係予以再生。殼體蛋白質之表現和併入於桿狀病毒表面上係如早先關於rBac-VP1建構物所說明的藉由西方墨點和共焦顯微鏡分析來檢查。觀察顯示出確實蛋白質係有效率地呈示於桿狀病毒表面上以及表現位準係如同使用抗β野田病毒之專一性抗天竺鼠多株抗體之西方墨點分析(第14圖)和共焦分析(第15圖)內所觀察到的一樣為大量的。有效的殼體區域之桿狀病毒的表面呈示顯示出“表現匣”用於來自除了EV71之被膜與無被膜病毒二者的蛋白質/胜肽之表面呈示的廣泛效用。而且此等表面呈示的區域/蛋白質之 免疫原性的保留以及辨識經感染的細胞內之天然的抗原之抗體的能力，對抗天竺鼠體內之表面呈示的區域/蛋白質而提升的，顯示出其等作為疫苗的效用。
此實施例從而清楚地展示出表現匣供用於表現各種各樣不同的標靶抗原於桿狀病毒的表面上的可使用性。
實施例3-表現匣用於表現VP1於非洲綠猿腎臟細胞內之用途(活體外轉導分析)
非洲綠猿腎臟細胞係以2 x 105細胞的濃度播種至六井平盤之內。在細胞達到70-80%群集之後，移去培養基以及細胞用PBS(pH 7.4)清洗3次。細胞接而於含有重組型桿狀病毒(Bac-VP1)之培養基內於27℃孵育歷時6 h。作為負對照非洲綠猿腎臟細胞係與BEI不活化的Bac-VP1在於27℃一起孵育歷時6 h。在移去病毒之後，添加新鮮的培養基以及培養物係在37℃予以孵育。在轉導後48 h，細胞係藉由間接免疫螢光法分析(IFA)來分析VP1殼體蛋白質的表現。簡單地說細胞係用4%三聚甲醛予以固定以及加工用於IFA，其係使用抗-VP1單株抗體接著用PBS-Tween-20(0.1%)的3次清洗接著與FITC接合的二級的抗小鼠抗體一起孵育。未結合的抗體係用PBS-Tween-20(0.1%)清洗3次以及在螢光顯微鏡之下顯現。所獲得的影像係顯示於第16圖中。
此實施例清楚地展示出其他任擇的宿主細胞(例如哺乳動物非洲綠猿腎臟細胞)而不是Sf9-II昆蟲細胞可以用本發明的表現匣來使用。
實施例4-表現匣用於表現VP1於一完整的生物內之用途 (活體內轉導分析)
在活體內轉導分析方面，使來自Bac-VP1，野生型桿狀病毒和PBS免疫組的3隻小鼠於第6天安樂死，以及肌肉組織係收集於10%(wt/vol)緩衝的福馬林內、包埋於石蠟之內，且予以切片。切片接而使用Histo-choice(Amersco)予以脫蠟以及於連續分級的乙醇浴內復水。載玻片係於PBS內之0.3%脫脂奶封阻歷時30 min，接著與抗-VP1單株抗體在37℃一起孵育歷時1 h。載玻片接而於PBS內清洗3次以及與1：50的稀釋之HRP-接合的兔抗小鼠(Dako Cytomation,Denmark)一起孵育歷時30 min.。在清洗之後，載玻片係與蘇木精一起孵育歷時2-5 min且載玻片用無菌水清洗3次以及切片係使用封固劑予以封固。在顯微鏡(Olympus,UK)下觀察載玻片以及影像係藉由數位的成像系統(Nikon,USA)來捕獲(第17圖)。
如同由第16圖可見，抗-VP1之陽性染色只有於用Bac-VP1予以接種之小鼠的肌肉組織內觀察到。此實施例因而清楚地展示出接種含有本發明的表現匣的桿狀病毒之完整的生物可以隨後表現本發明的表現匣之標靶抗原。
實施例5-由用接種含有表現匣的桿狀病毒之一完整的生物所獲得的抗血清可以賦予另一個完整的生物之被動式保護(組織病理學分析)
在此實驗方面，所獲得的BALB/c小鼠係住且飼養在無特定病原體的條件下於個別通風的籠子中。為了測試由Bac-VP1免疫的小鼠之抗血清的效能，1週大的BALB/c小鼠 (n=6)係在用5 MLD50的EV71 B4菌株HFM 41(5865/SIN/00009)經由ip.途徑之致命的挑戰之前一天用抗血清予以腹膜內(ip.)投藥。來自正對照組之小鼠(n=6)在致命的病毒挑戰之前一天提供了來自福馬林活化的EV71病毒等量的抗血清。遵循相同的程序用於來自野生型桿狀病毒和PBS對照小鼠組(n=6)之抗血清。小鼠之存活率和臨床的評分係每日監控。總體的肢體癱瘓係使用作為早期的安樂死之判定標準(第18圖)。
如同由第18圖可見，用由Bac-VP1免疫的小鼠所獲得的抗血清予以投藥之BALB/c小鼠與用來自野生型桿狀病毒和PBS對照小鼠組之抗血清予以投藥的對照小鼠比較顯示出存活率之顯著的差異。
此實驗從而清楚地展示出由用含有表現匣的桿狀病毒予以接種之完整的生物所獲得的抗血清(其因而含有對抗一標靶抗原的抗體)可以賦予另一個完整的生物之被動式保護。
定量反轉錄聚合酶連鎖反應(qRT-PCR)分析
作為先前實驗的追蹤，來自對照組(用來自野生型桿狀病毒和PBS免疫的小鼠之抗血清來治療的小鼠)和預防性保護的小鼠之腦組織係藉由Trizol試劑(Invitrogen)予以均質化用於總RNA萃取。萃取的RNA(1μg)係利用Quantifast SYBR Green RT-PCR套組(Qiagen,Hilden,Germany)根據製造商的協定而使用於qRT-PCR。
5` UTR專一性引子，亦即 UTR-F-5`-TCCTCCGGCCCCTGAATG-3`(序列辨識編號：40)和UTR-R-5`-GGACACCCAAAGTAGTCGGTTC-3`(序列辨識編號：41)係使用於擴增。qRT-PCR熱循環條件為起始的孵育歷時於50℃歷時12 min(反轉錄)，95℃歷時6 min(起始的PCR活化步驟)，接著95℃歷時12 s(變性)，60℃歷時30 s(組合的退火和延伸)，以及77℃歷時15s之各者40個週期。以1℃/5 s的升溫收集50-95℃之熔化曲線數據，以及於40℃執行最後的冷卻。反應的進行係使用一種Rotor-Gene-Q即時PCR循環器(Qiagen)。相對的表現值係予以常態化成β-微管蛋白管家基因之表現值。含有全長的EV71基因體之重組型質體DNA之連續10倍稀釋係含括來產生用於定量分析之標準曲線。
第19圖顯示出對照小鼠的腦組織內與預防性保護的小鼠比較之下有高表現的EV71 mRNA，藉此顯示出預防性保護的小鼠之腦組織內沒有EV71病毒的證據以及本發明的表現匣可以使用來成功地賦予被動式保護對抗一種病原生物。
EV71胜肽、PCV2殼體區域以及PRRSV核殼體蛋白質(ORF7)之有效的病毒表面呈示顯示出一種“表現匣”之廣泛的效用，該“表現匣”包含ie1啟動子以及gp64的訊息胜肽用於來自除了EV71之被膜與無被膜病毒二者的殼體蛋白質/胜肽之表面呈示。而且此等表面呈示的區域/蛋白質之免疫原性的保留以及辨識經感染的細胞內之天然的抗原之抗體的能力，對抗天竺鼠體內之表面呈示的區域/蛋白質而提升的，顯示出其等作為疫苗的效用。此外，與包含全長的gp64 的表現匣比較下，包含ie1啟動子和gp64的訊息胜肽的胜肽型式表現匣之表現位準的增加顯示出本揭示之另外的效用。
第1圖.如實施例1內詳細說明之使用PCR之融合基因的建構。執行3個連續的PCR反應來產生最終的PCR產物，其含有gp64訊息序列、H3N2-HA穿膜領域以及gp64的細胞質領域(CTD)。
第2圖.根據實施例1製造之重組型桿狀病毒載體的圖解。使用EV71基因體作為一模板，表1內所列出之引子係使用來擴增VP1基因，其接而插入至pBac-HTA載體之內。所生成的質體命名為pBac-VP1。
第3圖.rVP1蛋白質於SF-9 II細胞質膜上之表面呈示模式。第3圖闡明該蛋白質之GP64 C-端部分係座落在SF-9 II細胞內部，而H3N2穿膜領域及抗原胜肽係座落在細胞外的培養基內。
第4圖.EV71的rVP1之錨定(放大率x 60)。為了決定是否rVP1蛋白質恰當地移位至細胞表面，細胞係培養於無菌的蓋玻片之上，以10之感染的多重性(MOI)來感染，以及感染後2天接受共焦顯微鏡之免疫螢光法染色。DAPI染色係使用來偵測細胞核而綠螢光標示的抗-VP1多株抗體係使用來偵測由Bac-VP1重組型桿狀病毒所呈示之rVP1。第4圖清楚地顯示出rVP1係定位於質膜，從而展現出rVP1之錨定於Sf-9細胞的表面之上。關於更多的細節請見實施例1。
第5圖.EV71的rVP1之表現於Bac-VP1被膜上的確認。 細胞係以10的MOI予以感染以及感染後3天予以收穫。收集上清液以及接受使用抗-VP1(天竺鼠)多株抗體接著抗天竺鼠HRP標示的二級抗體之西方墨點分析。
rBac-VP11-編碼新穎的“表現匣”之重組型桿狀病毒。
rBac-VP12-編碼帶有全長的gp64作為融合伙伴之表現匣的重組型桿狀病毒。
如同由第5圖可見，於桿狀病毒-WT(野生型)沒有偵測到蛋白質。比較時，由從用rBac-Vp11和rBac-Vp12予以感染的細胞所獲得的上清液看見清晰帶，指示出rVP1成功地表現於Bac-VP1病毒被膜上。
第6圖.純化的桿狀病毒之免疫金電子顯微圖，其係藉由抗-EV71和抗-VP1抗體作為初級抗體以及接合5-nm金顆粒之抗小鼠IgG作為二級抗體來偵測的(放大率200,000×，刻度尺=100 nm)。金顆粒(顯示為黑點)指示出EV71和VP1蛋白質表現的位置。沒有金顆粒呈示於桿狀病毒-WT(對照)的表面之上，反之EV71和VP1係於本發明之重組型桿狀病毒的表面上偵測到。
第7圖.呈示於重組型桿狀病毒的被膜之上之EV71的rVP1之定量。於桿狀病毒被膜上所呈示的rVP1蛋白質係使用抗-VP1單株抗體來探測。於rBac-VP1(107/ml)、rBac-VP12(107/ml)、EV71 WT(B5菌株)(107/ml)、WT桿狀病毒上之VP1的量校正成經純化的重組型VP1蛋白質的量。西方墨點上之帶的強度係予以掃描以及使用ODYSSEY LICOR螢光掃描器和軟體予以分析。數據為3個獨立的實驗之平均值。
rBac-VP11-編碼新穎的“表現匣”之重組型桿狀病毒
rBac-VP12-編碼帶有全長的gp64作為融合伙伴之表現匣的重組型桿狀病毒。
第7圖顯示出rBac-VP11(新穎表現匣)與B5-EV71和rBac-VP12(全長的gp64)比較下具有最高的VP1蛋白質表現，從而展現出新穎表現匣用於生產大量的VP1抗原胜肽之效用。
第8圖.測試血清中和病毒感染性的能力。＊含有100TCID50 EV71病毒之50 μl的病毒懸浮液係在添加至96井平盤內的RD細胞之前與50 μl的連續2倍稀釋的抗體一起預孵育歷時30 min。在在37℃ 3天之後，提供完整的保護免受CPE之中和性抗體之力價讀取為最高的稀釋。
如同由第8圖可見，rBac-VP1與不活化的EV71(B5)病毒比較下導致較高的中和力價。負對照PBS與桿狀病毒-WT(結果為重疊的，桿狀病毒-WT的結果疊加於PBS的結果上方)顯示出如預期之微不足道的中和力價。
第9圖.帶有PCV2核殼體之表面呈示的殼體區域(rBac-PCV2)之蔗糖梯度純化的桿狀病毒之西方墨點，其係使用8C2(抗ORF2)單株抗體(初級)接著抗小鼠HRP標示的二級抗體。
如同由第9圖可見，於經純化的桿狀病毒內出現大量表現位準之各個殼體蛋白質區域。
第10圖.感染PCV2的PK-15細胞之免疫螢光法分析，其係使用來自用純化的rBac-PCV2予以免疫之天竺鼠的抗體 和Alexa Fluor 546標示的抗天竺鼠二級抗體(放大率x 40)。第10圖的淡灰色部份指示出Alexa Fluor 546染色。第10圖因而顯示出感染PCV2的細胞內之PCV2蛋白質的良好表現。
第11圖.PRRSV之蔗糖梯度純化的rBac-ORF7蛋白質之西方墨點，其係使用5H2(ORF7)單株抗體(初級)接著抗小鼠HRP標示的二級抗體。
第11圖清楚地顯示出有PRRSV之ORF7蛋白質的大量表現。
第12圖.感染PRRSV的MARC-145細胞之免疫螢光法分析，其係使用來自用純化的rBac-ORF7蛋白質予以免疫之天竺鼠的抗體，接著Alexa fluor 546標示的抗天竺鼠二級抗體(放大率x 40)。第11圖之淡灰色部份指示出Alexa Fluor 546染色。第11圖因而顯示出感染PRRSV的細胞之ORF蛋白質的良好表現。
第13圖.於白斑症病毒(WSSV)內的ie1啟動子之順式因子之示意圖。
第14圖.桿狀病毒錨定的核殼體α蛋白質之西方墨點分析。Bac-noda、β野田病毒(Betanodavirus)和野生型桿狀病毒接受使用抗野田核殼體多株抗體(天竺鼠)和各別的二級HRP接合抗體之西方墨點。(1)Bac-Noda，(2)β野田病毒，(3)野生型桿狀病毒。
如同由第14圖可見，於桿狀病毒-WT(野生型)內沒有偵測到蛋白質。比較時，由感染rBac-VP11和rBac-VP12之細胞 所獲得的上清液看見了清晰帶，指示出rVP1成功地表現於Bac-VP1病毒的被膜之上。
第15圖.noda核殼體α蛋白質(aplha protein)之表現和錨定(放大率x 60)。(a)於感染Bac-noda之Sf9-II的質膜上之α蛋白質的錨定之確認。(b)於感染野生型桿狀病毒之Sf9-II細胞的質膜上觀察到沒有α蛋白質之錨定。細胞係培養於無菌的蓋玻片之上以及以0.1的MOI予以感染。細胞係用4%PFA予以固定以及用2%牛血清白蛋白予以封阻於37℃歷時30 min。α蛋白質係用多株抗天竺鼠抗體(1：300)接著二級的FITC-接合的兔抗天竺鼠Mab(1：100稀釋，Dako)予以染色。
第15圖(a)顯示出rVP1係定位在質膜，從而展現出VP1之錨定於Sf-9細胞的表面之上。
第16圖.VP1於非洲綠猿腎臟細胞(Vero cell)內之轉導和表現(放大率x 40)。非洲綠猿腎臟細胞係與200之感染的多重性(MOI)一起孵育以及於感染後48 h用抗-VP1單株抗體接著FITC-接合的二級抗體予以染色(A)活的Bac-VP1-轉導之非洲綠猿腎臟細胞(B)與不活化的Bac-VP1一起孵育的非洲綠猿腎臟細胞。
第16圖的淡灰色部份指示出表現VP1之處。因此，第16圖顯示出VP1良好地表現於用活的Bac-VP1予以轉導之非洲綠猿腎臟細胞之內，與不活化的Bac-VP1比較下。
第17圖.活體內小鼠肌肉組織之桿狀病毒轉導(放大率x 40)。在第一個免疫作用六天之後，肌肉組織樣品係包埋 於石蠟之內以及予以切片的。免疫組織化學染色係使用抗-VP1單株抗體和HRP-接合的兔抗小鼠抗體來進行。顯示出(A)Bac-VP1，(B)WT-Bac(C)PBS注射的小鼠。箭頭指示出表現VP1之處。第17圖因而顯示出VP1表現於來自Bac-VP1轉導的小鼠之小鼠肌肉組織之內，反之負對照內沒有VP1的表現。
第18圖.來自致命的EV71病毒挑戰之小鼠的保護。小鼠組(n=6)係以14天的間隔予以疫苗接種2次。野生型桿狀病毒和PBS免疫的小鼠供使用作為負對照。監控小鼠的存活持續21天的觀察期間。結果係以存活百分率方面來表現。如同由結果可見，EV71-B5和Bac-VP1(結果係重疊於第18圖上)免疫的小鼠在7天之後顯示出100%存活，與對照小鼠的無一者比較下。
第19圖.EV71複本數目之即時RT-PCR定量。RNA係由腦組織萃取以及對照的樣品係於7 dpi收集，以及預防性治療的小鼠樣品係於20 dpi收集。EV71 5` UTR區域之112-bp片段供使用作為qRT-PCR引子的標的。編碼EV71之全長的基因體之質體係使用來獲得定量病毒複本數目之標準曲線。數據代表3個獨立的分析之平均值±SD。
如同由第19圖可見，來自接種野生型桿狀病毒抗血清和PBS抗血清之小鼠的腦組織，與接種抗-EV71血清和Bac-VP1抗血清的小鼠比較之下，有顯著量的病毒RNA。此因而展示出來自Bac-VP1接種的生物之抗血清用於提供被動式保護對抗VP1的效能。
第20圖.各種表現匣之示意圖。(A)帶有ie1啟動子和gp64訊息胜肽之表現匣；(B)帶有ie1啟動子、gp64啟動子和穿膜區域之表現匣；(C)帶有ie1啟動子、gp64啟動子、穿膜區域以及gp64細胞質區域之表現匣。
<110> 淡馬錫生命科學實驗室有限公司
<120> 用於有效率地表面呈現抗原蛋白質之新穎表現匣
<130> 10925SG32
<150> 61/462,878
<151> 2011-08-02
<160> 41
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子A-順向引子
<400> 1
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子B-反向引子
<400> 2
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<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子C-反向引子
<400> 3
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子D-順向引子
<400> 4
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子E-反向引子
<400> 5
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子F-順向引子
<400> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子G-反向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 殼體76 F-順向引子
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<213> 人工序列
<220>
<223> 殼體135 R-反向引子
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 殼體121 F-順向引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 殼體180 R-反向引子
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ORF7 F-順向引子
<400> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ORF7 R-反向引子
<400> 13
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 腸病毒71
<220>
<221> 訊息
<222> (1)..(20)
<220>
<221> 訊息
<222> (1)..(20)
<223> gp64訊息胜肽序列
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 桿狀病毒
<220>
<221> 領域
<222> (1)..(7)
<220>
<221> 領域
<222> (1)..(7)
<223> gp64細胞質領域(CTD)之全長序列
<400> 15
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 桿狀病毒
<220>
<221> 含有6個胺基酸的gp64細胞質領域
之截斷序列(CTD)
<222> (1)..(6)
<220>
<221> 領域
<222> (1)..(6)
<400> 16
<210> 17
<211> 27
<212> PRT
<213> 流行性感冒病毒
<220>
<221> TRANSMEM
<222> (1)..(27)
<223> H3N2-Ha穿膜領域之序列
<220>
<221> TRANSMEM
<222> (1)..(27)
<223> H3N2-HA穿膜領域之序列
<400> 17
<210> 18
<211> 501
<212> DNA
<213> 白斑症桿狀病毒
<220>
<221> 啟動子
<222> (1)..(501)
<223> 白斑症病毒ie1啟動子之序列
<400> 18
<210> 19
<211> 897
<212> DNA
<213> 腸病毒71
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(897)
<223> EV71病毒的VP1之序列
<400> 19
<210> 20
<211> 702
<212> DNA
<213> 豬環狀病毒
<220>
<221> PCV2殼體蛋白質之序列
<222> (1)..(702)
<400> 20
<210> 21
<211> 372
<212> DNA
<213> 豬生殖與呼吸症候群病毒
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(372)
<223> PRRSV殼體蛋白質的ORF7之序列
<400> 21
<210> 22
<211> 1017
<212> DNA
<213> 魚類野田病毒
<220>
<221> 基因
<222> (1)..(1017)
<223> 魚類野田病毒殼體蛋白質α之序列
<400> 22
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 腸病毒71
<220>
<221> 其他特徵
<223> EV71-VP1-第167個至第178個胺基酸
<400> 23
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 腸病毒71
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(14)
<223> EV71-VP1-第209個至第222個胺基酸
<400> 24
<210> 25
<211> 21
<212> PRT
<213> 腸病毒71
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(21)
<223> EV71-VP1-第240個至第260個胺基酸
<400> 25
<210> 26
<211> 51
<212> PRT
<213> 豬環狀病毒
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(51)
<223> PCV2-ORF2-第100個至第150個胺基酸
<400> 26
<210> 27
<211> 50
<212> PRT
<213> 豬環狀病毒
<400> 27
<210> 28
<211> 40
<212> PRT
<213> 豬生殖與呼吸症候群病毒
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(40)
<223> PRRSV-ORF7-第18個至第57個胺基酸
<400> 28
<210> 29
<211> 66
<212> PRT
<213> 豬生殖與呼吸症候群病毒
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(66)
<223> PRRSV-ORF7-第58個至第123個胺基酸
<400> 29
<210> 30
<211> 38
<212> PRT
<213> 豬生殖與呼吸症候群病毒
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(38)
<223> PRRSV-ORF5-第28個至第65個胺基酸
<400> 30
<210> 31
<211> 69
<212> PRT
<213> 豬生殖與呼吸症候群病毒
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(69)
<223> PRRSV-ORF5-第132個至第200個胺基酸
<400> 31
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 豬生殖與呼吸症候群病毒
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(107)
<223> PRRSV-ORF5-第28個至第65個以及第13個至第200個胺基酸的組合
<400> 32
<210> 33
<211> 298
<212> PRT
<213> 腸病毒71
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(298)
<223> 對應於核酸序列序列辨識編號：19，EV71-VP1之EV71病毒之VP1的胺基酸序列
<400> 33
<210> 34
<211> 233
<212> PRT
<213> 豬環狀病毒
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(233)
<223> 對應於核酸序列序列辨識編號：20，PCV2殼體蛋白質-PCV2 PRF2之序列的PCV2殼體蛋白質之胺基酸序列
<400> 34
<210> 35
<211> 123
<212> PRT
<213> 豬生殖與呼吸症候群病毒
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(123)
<223> 對應於核酸序列序列辨識編號：21，PRRSV殼體蛋白質的ORF7-PRRSV ORF7之序列的PRRSV殼體蛋白質的ORF7之胺基酸序列
<400> 35
<210> 36
<211> 338
<212> PRT
<213> 魚類野田病毒
<220>
<221> 其他特徵
<222> (1)..(338)
<223> 對應於核酸序列序列辨識編號：22：魚類野田病毒殼體蛋白質-殼體蛋白質α之序列的魚類野田病毒殼體蛋白質之胺基酸序列
<400> 36
<210> 37
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Noda F-順向引子
<400> 37
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NodaR1-反向引子
<400> 38
<210> 39
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NodaR2-反向引子
<400> 39
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UTR-F-順向引子
<400> 40
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UTR-R-反向引子
<400> 41

Claims (40)

  1. 一種表現匣，其中該表現匣包含：(a)一個來自白斑症(white spot syndrome)病毒之立即早期ie1啟動子；(b)一個編碼N端gp64訊息胜肽的核酸序列，一個編碼一抗原胜肽的核酸序列，一個編碼一穿膜區域的核酸序列，以及一個編碼gp64細胞質區域的核酸序列；其中該啟動子係可操作地連接至該編碼N端gp64訊息胜肽的核酸序列，且其中由該編碼gp64細胞質區域的核酸序列所編碼的gp64細胞質領域係由序列辨識編號：16所構成。
  2. 如申請專利範圍第1項之表現匣，其中該抗原胜肽係來自一病毒，或一反轉錄病毒，或一細菌，或一原蟲，或是其等之免疫性片段。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之表現匣，其中該抗原胜肽係來自於下列的胜肽：螺旋體屬之細菌，或克魯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)，或披衣菌屬(Chlamydia)，或細胞巨大病毒，或登革熱病毒，或EV71，或PCV2，或PRRSV，或HSV-1，或HSV-2，或艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)，或脊髓灰白質炎病毒，或A型肝炎病毒，或B型肝炎病毒，或C型肝炎病毒，或D型肝炎病毒，或E型肝炎病毒(HEV)，或β野田病毒(Betanodavirus)，或疱疹病毒，或HIV，或HTLV，或流行性感冒病毒，例如H5N1、H1N1，或麻疹病毒，或野 田病毒(Nodavirus)，或德國麻疹病毒，或SARS病毒，或西尼羅河熱病毒(West Nile virus)，或水痘病毒，或弓蟲屬，或螺旋體屬(Treponema)，或惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)，或間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)，或卵形瘧原蟲(Plasmodium ovale)，或三日瘧原蟲(Plasmodium malariae)。
  4. 如申請專利範圍第2項之表現匣，其中該抗原胜肽係選自於由以下所構成的群組：p41、C6、TcF、主要外膜蛋白質、非結構性蛋白質1、HBsAg、E1、H1、gp120、gp46、血球凝集素、裂殖子表面蛋白質2(MSP2)、S蛋白質、SAG-1、P30、主要外鞘蛋白質(Msp)以及E蛋白質。
  5. 如申請專利範圍第3項之表現匣，其中該病毒為EV71以及該抗原胜肽係選自於以下所構成的群組：VP0、VP1、VP3和其等之片段。
  6. 如申請專利範圍第3項之表現匣，其中該病毒為PCV2且該抗原胜肽為由ORF-2所編碼的PCV2殼體胜肽或其片段。
  7. 如申請專利範圍第3項之表現匣，其中該病毒為PRRSV且該抗原胜肽為由選自於以下所構成的群組之ORF所編碼者：ORF-4、ORF-5(主要被膜蛋白質)、ORF-7(核殼體蛋白質)和其等之片段。
  8. 如申請專利範圍第3項之表現匣，其中該病毒為野田病毒且該抗原胜肽係選自於野田病毒的殼體胜肽和其片段所構成的群組。
  9. 如申請專利範圍第3項之表現匣，其中該病毒為β野田病毒且該抗原胜肽係選自於β野田病毒的殼體胜肽和其等之片段所構成的群組。
  10. 如申請專利範圍第1項之表現匣，其中該穿膜區域為一醣蛋白穿膜區域。
  11. 如申請專利範圍第10項之表現匣，其中該醣蛋白穿膜區域為一血球凝集素穿膜區域。
  12. 如申請專利範圍第11項之表現匣，其中該血球凝集素穿膜區域係選自於以下所構成的群組：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15以及H16。
  13. 如申請專利範圍第12項之表現匣，其中該血球凝集素穿膜區域係選自於H3N2、H5N1以及H3N2-HA所構成的群組。
  14. 如申請專利範圍第13項之表現匣，其中該H3N2穿膜區域係由序列辨識編號：17所編碼。
  15. 如申請專利範圍第1項之表現匣，其中該N端gp64訊息胜肽係由序列辨識編號：14所編碼。
  16. 如申請專利範圍第1項之表現匣，其中該ie1啟動子為序列辨識編號：18。
  17. 如申請專利範圍第1項之表現匣，其係用於一主體內的疾病之治療或預防，其中該抗原胜肽係經由該表現載體來表現於該主體內。
  18. 如申請專利範圍第17項之表現匣，其中該主體為哺乳動物，或禽類，或甲殼類動物，或無顎魚類，或硬骨魚， 或爬蟲類動物或是兩棲動物。
  19. 如申請專利範圍第17項之表現匣，其適合用於口服投藥。
  20. 如申請專利範圍第17項之表現匣，其中該疾病係選自於以下所構成的群組：手足口病、離乳後多系統消耗性症候群、豬生殖與呼吸症候群、疱疹、流行性感冒、癌症、肝炎、弓蟲症、梅毒、瘧疾以及病毒性神經壞死病。
  21. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第1項之表現匣。
  22. 如申請專利範圍第21項之表現載體，其中該載體係與一個蛋白質表現系統相容，該蛋白質表現系統包含選自於以下所構成的群組之宿主細胞：細菌細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、魚細胞、酵母菌細胞以及植物細胞。
  23. 如申請專利範圍第22項之表現載體，其中該宿主細胞為Sf9-II。
  24. 如申請專利範圍第22-23項中任一項之表現載體，其中該表現載體係適合供使用於一病毒表現系統內。
  25. 如申請專利範圍第24項之表現載體，其中該病毒表現系統係選自於以下所構成的群組：腺病毒、慢病毒(lentivirus)、腺相關病毒、反轉錄病毒以及桿狀病毒。
  26. 如申請專利範圍第25項之表現載體，其中該病毒表現系統為桿狀病毒表現系統。
  27. 如申請專利範圍第21項之表現載體，其係用於一主體內的疾病之治療或預防，其中該抗原胜肽係經由該表現載體來表現於該主體內。
  28. 如申請專利範圍第27項之表現載體，其中該主體為哺乳動物，或禽類，或甲殼類動物，或無顎魚類，或硬骨魚，或爬蟲類動物或是兩棲動物。
  29. 如申請專利範圍第27項之表現載體，其適合用於口服投藥。
  30. 如申請專利範圍第27項之表現載體，其中該疾病係選自於以下所構成的群組：手足口病、離乳後多系統消耗性症候群、豬生殖與呼吸症候群、疱疹、流行性感冒、癌症、肝炎、弓蟲症、梅毒、瘧疾以及病毒性神經壞死病。
  31. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1-20項中任一項之表現匣或是如申請專利範圍第21-30項中任一項之表現載體以及為此之包裝材料。
  32. 一種經單離的宿主細胞，其包含如申請專利範圍第1-20項中任一項之表現匣或是如申請專利範圍第21-30項中任一項之表現載體。
  33. 一種免疫性組成物，其包含如申請專利範圍第1-20項中任一項之表現匣，或是如申請專利範圍第21-30項中任一項之表現載體，連同藥學上可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑之任一者或更多者。
  34. 如申請專利範圍第33項之免疫性組成物，其係用於一主體內的疾病之治療或預防，其中該抗原胜肽係經由該表現載體來表現於該主體內。
  35. 如申請專利範圍第34項之免疫性組成物，其中該主體為哺乳動物，或禽類，或甲殼類動物，或無顎魚類，或硬 骨魚，或爬蟲類動物或是兩棲動物。
  36. 如申請專利範圍第34項之免疫性組成物，其適合用於口服投藥。
  37. 如申請專利範圍第34項之免疫性組成物，其中該疾病係選自於以下所構成的群組：手足口病、離乳後多系統消耗性症候群、豬生殖與呼吸症候群、疱疹、流行性感冒、癌症、肝炎、弓蟲症、梅毒、瘧疾以及病毒性神經壞死病。
  38. 一種疫苗，其包含如申請專利範圍第1-20項中任一項之表現匣、如申請專利範圍第21-30項中任一項之表現載體，連同藥學上可接受的載劑、佐劑、稀釋劑或賦形劑之任一者或更多者。
  39. 一種如申請專利範圍第1-20項中任一項之表現匣、或是如申請專利範圍第21-30項中任一項之表現載體、或是如申請專利範圍第33項之免疫性組成物、或是如申請專利範圍第38項之疫苗於製造一藥物的用途，該藥物係用於調整一主體內之免疫反應。
  40. 一種用於呈現、生產或呈示一抗原胜肽的方法，其中該方法包含：(a)使編碼該抗原胜肽的核酸插入至如申請專利範圍第21-30項中任一項之表現載體之內；(b)用該表現載體來轉染至少一個宿主細胞；以及(c)由該表現載體來表現該抗原胜肽；其中該抗原胜肽係呈現或呈示於一桿狀病毒的表 面膜之上。
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