CN107513536A - 一种利用真核表达系统制备HIV‑1gp120的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用真核表达系统制备HIV‑1gp120的方法，步骤如下：利用大肠杆菌体外表达系统，获得pFastBac‑Ysgp3质粒；利用上述灭活质粒转染昆虫sf9细胞，待细胞病变后收集P1代病毒上清；利用P1代病毒上清再次感染昆虫sf9细胞，获得P2代病毒上清；重复C步骤，依次获得P3、P4代病毒上清；用P4代病毒上清感染昆虫sf9细胞，在gp120表达量出现峰值的时候收集细胞，获得gp120蛋白；纯化gp120蛋白；本发明具有以下优点：通过基因重组的方法获得gp120的重组抗原，该重组抗原编码基因能够在昆虫细胞中表达，解决了现有HIV‑1检测试剂研发过程中存在的无法获得高纯度、高灵敏度的gp120抗原的问题。

Description

一种利用真核表达系统制备HIV-1gp120的方法
技术领域
本发明属于生物医学检验领域，涉及针对于HIV的重组抗原、昆虫杆状细胞表达及其用于HIV抗体快速诊断试剂盒的研发，具体涉及一种利用真核表达系统制备HIV-1gp120的方法。
背景技术
获得性免疫缺陷综合征（AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）引起的，人体感染HIV病毒后会引起机体产生免疫反应，产生相应的抗体。通过检测血液或体液中是否存在HIV抗体，可判断该标本是否感染了HIV病毒。HIV外膜蛋白Env，包括外膜蛋白gp120和穿膜蛋白gp41。Gp120位于HIV包膜表面，不但是病毒粒子的主要结构蛋白之一，也是HIV-1侵袭其靶细胞即人体CD4＋细胞第一步的物质基础，与HIV-1的吸附、穿入、细胞嗜性、免疫中和、免疫逃避等密切相关。同时gp120上有CD4结合位点和多个抗原决定簇，以及对巨噬细胞和脑组织纤维的特异性识别区，与HIV-1中和抗体应答、特异性细胞毒反应及分子致病机制密切相关，成为AIDS疫苗开发研究的重点。
现有的免疫学诊断技术一般利用抗原—抗体反应来检测抗evn去抗体，这些可与evn区抗体结合的抗原主要是从血液提取、大肠杆菌基因工程表达系统、化学方法多肽合成等方法中获取。
首先，从HIV感染者血液中或从HIV感染后的淋巴细胞裂解液中分离获取的HIV抗原，由于对HIV灭活工艺能否始终保持100%有效性的担忧，无论是对抗原的制备者，还是对抗原的使用者来说，都存在现实或潜在的致病危险性，这一点严重限制了该技术的使用。
其次，通过大肠杆菌表达系统来制备HIV抗原，虽然大肠杆菌表达系统具有很高的表达效率，获得HIV抗原的成本低、安全性好，但该抗原与天然抗原相比较，缺少转录后糖基化修饰，而且通过包涵体方式获得的抗原的空间结构，特别是二硫键位置与天然抗原存在着显著差异，造成抗原活性下降和非特异性上升。而且大肠杆菌表达系统如果表达分子量超过十万道尔顿的蛋白质，会存在表达量低、质粒不稳定的可能。
再者，用合成多肽的化学方法合成HIV抗原，虽然该方法技术成熟、可以大规模的、重复性的生产抗原，但受反应效率和得率的限制，片段长度只能十几个氨基酸残基，无法包括更多的抗原决定簇。同时也无法实现必要的转录后修饰，免疫学活性会受到很大的限制，可能诊断时会对阳性标本有检漏的可能。
而真核表达系统是获取糖基化修饰抗原的主要途径。目前使用比较多的就是杆状病毒表达系统在昆虫细胞内的表达。昆虫细胞作为宿主细胞表达高度特异性的病毒，这些病毒可以引起昆虫流行病，但对脊椎动物是无害的。并且昆虫细胞培养简单，可以高水平的表达蛋白。
因此本发明提供了一种无致病危险、有糖基化修饰和正确空间构象、高水平表达抗原的制备方法，解决了上述不同方面的局限性。
发明内容
本发明为了解决上述问题，提供一种获得gp120抗原纯度高、灵敏度高的利用真核表达系统的备方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种利用真核表达系统制备HIV-1gp120的方法，步骤如下：
A、利用大肠杆菌体外表达系统，获得pFastBac-Ysgp3质粒；
B、利用上述灭活质粒转染昆虫sf9细胞，待细胞病变后收集P1代病毒上清；
C、利用P1代病毒上清再次感染昆虫sf9细胞，获得P2代病毒上清；
D、重复C步骤，依次获得P3、P4代病毒上清；
E、用P4代病毒上清感染昆虫sf9细胞，在gp120表达量出现峰值的时候收集细胞，获得gp120蛋白；
F、纯化gp120蛋白。
优选的是，步骤A中大肠杆菌为DH10Bac细胞，HIV-1gp120杆状病毒体积与细胞数之比为1:100~1:25。
优选的是，步骤F中纯化方法为Ni柱亲和层析法。
本发明具有以下优点：通过基因重组的方法获得gp120的重组抗原，该重组抗原编码基因能够在昆虫细胞中表达，解决了现有HIV-1检测试剂研发过程中存在的无法获得高纯度、高灵敏度的gp120抗原的问题。
具体实施方式
为了加深对发明的理解，下面将结合实施例和对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
一种HIV-1gp120膜蛋白在大肠杆菌内完成Bac to Bac。
本实施例描述了通过宿主菌大肠杆菌构建能表达HIV-1gp120外膜蛋白。
通过查阅国内外相关文献以及相关网站的分析，得到以是以国际标准株HBX2为模板，设计了一段截断的gp120抗原序列，总长度430个氨基酸，命名为Ysgp3。
体外用PCR的方法基因合成HIV-1gp120 Ysgp3膜蛋白序列，经过1%琼脂糖胶回收获得Ysgp3基因，通过克隆到载体pUC57，测序获得正确序列的pUC57-Ysgp3。从上述测序正确的pUC57-Ysgp3质粒中扩增出编码Ysgp3的基因，将其插入载体pFastBac-1，经筛选和鉴定得到重组质粒pFastBac-Ysgp3。
为了获得能够转染昆虫细胞的穿梭质粒，将上述重组质粒pFastBac-Ysgp3转座DH10Bac E.coli，经筛选和鉴定获得新的重组穿梭质粒pFastBac to Bac-Ysgp3，该质粒通过65℃水浴灭活1h后可用于细胞转染。
用昆虫细胞sf9制备HIV-1gp120膜蛋白。
昆虫sf9细胞株一般保存在液氮罐中。使用时从液氮罐中取出，迅速于37℃水浴锅中晃动融化，移入15ml离心管中，加入10mlSF900II完全培养基（含1%青链霉素），1000rpm离心5min去上清。
加适量上述完全培养基，均匀悬浮后接种到50ml三角锥形瓶中，于恒温摇床27℃,120rpm培养。每当细胞密度达到8×106个/ml，存活率大于90%时，将细胞传代扩增。
当传代至P2或P3时，培养细胞至对数期生长（约2×106个/ml）。在35mm细胞培养皿中，加入3ml的完全培养基，每皿接入3×106个细胞。27℃贴壁生长，直至完全贴壁后，将完全生长培养基换成Grace insect medium先洗２遍，再加入３ml race insect medium。
取两个灭菌管，准备脂质体转染混合物：在100ul Grace insect medium中加入1ug pFastBac to Bac-Ysgp3灭活质粒，温和混匀，同时100ul Grace insect medium中加入8ul脂质体转染试剂CellfectinⅡ，温和混匀。分别室温孵育５min后，将两者充分混匀，室温孵育15-30,min。将上述混合物逐渐滴加到sf9细胞中，27℃，培养3-5h后除去培养基，加入2ml完全生长培养基。27℃,培养72ｈ或更长时间直至观察到细胞出现病变。细胞出现病变的现象为：在早期表现为细胞直径增大，细胞核变大；晚期表现为细胞停止生长，病毒出芽，细胞不再贴壁；感染很晚期后细胞裂解。
一旦细胞出现晚期感染特征，将细胞核包含病毒的培养基收集到灭菌的离心管中，1500rpm离心10min，去除细胞和细胞碎片。将上清用0.22um的滤器过滤，可以提高病毒的滴度。最后获得的上清液即重组杆状病毒P1样品，可加入2%FBS来减少蛋白酶对病毒活力的损害。常用的放置于4℃避光保存，不常用的放置于-80℃避光保存。
将获得的P1病毒样品按照以下公式来扩增，产生滴度更高的P2、P3病毒。
Xml（需要的病毒量）＝
一般P1病毒样品的滴度在1×106到1×107pfu／ml。式中MOI叫做感染系数，单位为每个细胞感染的病毒颗粒数，一般选择为0.05～0.1。以同样的方法制备P2、P3病毒样品，P3病毒样品可以用于蛋白表达。
不同蛋白质的最佳表达条件和病毒侵染条件都会有所不同，需要进行预实验来摸索最佳的MOI和侵染时间。一般蛋白的表达峰值出现的时间在感染后48-72h。MOI可以设置1、2、5、10，侵染时间可以设置为24h、48h、72h、96h。收获细胞，昆虫细胞一般使用较温和的冻融破碎，用缓冲液重悬细胞后，加入蛋白酶抑制剂，分装到15ml离心管中，在液氮中速冻后水浴融化，重复三次，14000rpm离心30min，收集上清作为蛋白粗提液。
HIV-1 gp120膜蛋白的纯化利用Ni柱亲和层析法纯化HIV-1gp120蛋白的方法。
序列表：
ATHACVPTDPNPQEVVLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNTNSSSGRMIMEKGEIKNCSFNISTSIRDKIQKENALFRNLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDNAKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIDSKLREQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRIKQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPT。
序列表
<110> 南通伊仕生物技术股份有限公司
<120> 一种利用真核表达系统制备HIV-1 gp120的方法及其应用
<130> 2017.9.14
<141> 2017-05-24
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val
1 5 10 15
Leu Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asp Met Val
20 25 30
Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys
35 40 45
Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser Leu Lys Cys Thr Asp
50 55 60
Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser Gly Arg Met Ile Met
65 70 75 80
Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Ser Thr Ser Ile
85 90 95
Arg Asp Lys Ile Gln Lys Glu Asn Ala Leu Phe Arg Asn Leu Asp Ile
100 105 110
Ile Pro Ile Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Lys Leu Thr Ser Cys Asn
115 120 125
Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile
130 135 140
Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn
145 150 155 160
Asn Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val
165 170 175
Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu
180 185 190
Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg Ser Val Asn Phe
195 200 205
Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn Thr Ser Val Glu
210 215 220
Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Arg Ile Arg Ile
225 230 235 240
Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Gly Asn
245 250 255
Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Lys Gln Ile Asp Ser Lys Leu Arg Glu Gln Phe Gly Asn Asn Lys
275 280 285
Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr
290 295 300
His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Gln
305 310 315 320
Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp Ser Thr Glu Gly Ser
325 330 335
Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys
340 345 350
Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro
355 360 365
Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu
370 375 380
Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Ser Asn Asn Glu Ser Glu Ile Phe Arg
385 390 395 400
Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys
405 410 415
Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr
420 425 430

Claims (3)

1.一种利用真核表达系统制备HIV-1gp120的方法，其特征在于：步骤如下：
A、利用大肠杆菌体外表达系统，获得pFastBac-Ysgp3质粒；
B、利用上述灭活质粒转染昆虫sf9细胞，待细胞病变后收集P1代病毒上清；
C、利用P1代病毒上清再次感染昆虫sf9细胞，获得P2代病毒上清；
D、重复C步骤，依次获得P3、P4代病毒上清；
E、用P4代病毒上清感染昆虫sf9细胞，在gp120表达量出现峰值的时候收集细胞，获得gp120蛋白；
F、纯化gp120蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种利用真核表达系统制备HIV-1gp120的方法，其特征在于：步骤A中大肠杆菌为DH10Bac细胞，HIV-1gp120杆状病毒体积与细胞数之比为1:100~1:25。
3.根据权利要求1所述的一种利用真核表达系统制备HIV-1gp120的方法，其特征在于：步骤F中纯化方法为Ni柱亲和层析法。
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