CN111718958B - 一种兔出血症病毒1型和2型vp60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

一种兔出血症病毒1型和2型vp60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明通过反转录PCR分别扩增兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白VP60基因，并将两种PCR产物克隆至具有双启动子的真核表达载体中，获得同时表达兔出血症病毒1型和2型VP60蛋白的重组杆状病毒。以重组杆状病毒表达的兔出血症病毒1型和2型VP60蛋白作为抗原，加入佐剂制成兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗。本发明可以提供一种免疫效果好、工艺简便的兔出血症病毒1型和2型VP60二价基因工程疫苗，用于预防和控制当前流行的兔出血症病毒1型和2型毒株。

Description

一种兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活 疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
兔出血症病毒(rabbithemorrhagic disease virus，RHDV)是无囊膜的单股正链RNA病毒，属于杯状病毒科。病毒衣壳蛋白VP60是病毒的免疫保护性抗原，利用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达衣壳蛋白时，蛋白能够自发地形成形态学上和抗原学上与天然病毒无差异的病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，将其作为免疫原免疫机体后，可以诱导产生中和抗体及有效的细胞免疫应答。兔出血症(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一种家兔急性烈性传染病，感染家兔主要以呼吸系统出血、肝坏死、实质性脏器水肿、淤血出血为特征，致死率高达90％，呈暴发性流行，严重危害养兔业及公共卫生安全。由于RHDV存在不同毒株间的基因重组和高度变异性，因此对该病毒的免疫防控研究应持续加以重视。
当前兔出血症病毒的主要流行毒株分为传统型RHDV1(RHDV GI.1)和变异型RHDV2(RHDV GI.2)，RHDV1毒株的易感家兔为2月龄及以上成年兔，野兔不易感。目前针对RHDV1毒株的防控，已有商品化组织灭活疫苗和基因工程疫苗，疫苗免疫保护效率为100％。2010年法国爆发一种新型兔出血症病毒，命名为RHDV2，属于RHDV GI.2，该变异毒株与经典毒株在遗传特性上具有较大差异，免疫经典毒株疫苗不能对变异毒株产生有效的交叉保护，这导致RHDV2迅速在世界范围内流行。RHDV2感染家兔后死亡率高达90％，且病毒对7-15日龄(未断奶家兔)以上家兔和野兔均易感。
2020年4月我们首次在中国境内四川养殖场发现RHDV2的爆发，死亡率高达70％以上，已造成1300只家兔死亡，经基因测序分析显示病毒属于RHDV GI.2，RHDV2已对我国家兔养殖业具有巨大的危害性。针对当前兔出血症病毒的流行毒株RHDV1和RHDV2型，研制同时可以防控当前流行的两种毒株RHDV1和RHDV2型的二价高效疫苗迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用，兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗对RHDV1和RHDV2型毒株的攻击保护率均为100％，具有良好的免疫效力。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因的重组转移载体，所述重组转移载体以含有双启动子的真核表达载体为基础载体，所述基础载体连接有RHDV1和RHDV2型VP60基因片段。
优选的，所述真核表达载体为质粒pFastBacTMDual；所述RHDV1VP60基因片段连接在所述质粒pFastBacTMDual的P10启动子下游，所述RHDV2型VP60基因片段连接在所述质粒pFastBacTMDual的polyhedrin启动子下游。
优选的，所述RHDV1 VP60基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述RHDV2VP60基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明提供了上述重组转移载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)分别取RHDV1和RHDV2型病毒RNA进行反转录PCR扩增获得RHDV1型病毒的cDNA和RHDV2型病毒的cDNA；
(2)以所述RHDV1型病毒的cDNA为模板，经PCR扩增得到RHDV1型VP60基因片段，测序显示基因序列如SEQ ID NO.5所示；
(3)以所述RHDV2型病毒的cDNA为模板，经PCR扩增得到RHDV2型VP60基因片段，测序显示基因序列如SEQ ID NO.6所示；
(4)将步骤(2)扩增得到的RHDV1 VP60基因片段，经昆虫细胞密码子优化后合成基因，序列如SEQ ID NO.7所示，并克隆至质粒pFastBacTMDual的P10启动子下游，将步骤(3)扩增得到的RHDV2VP60基因片段，经昆虫细胞密码子优化后合成基因，序列如SEQ ID NO.8所示，并克隆至同一质粒pFastBacTMDual的polyhedrin启动子下游，构建得到重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60。
优选的，步骤(1)中反转录PCR扩增RHDV1型VP60基因的上游引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
反转录PCR扩增RHDV2型VP60基因的上游引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60，所述重组杆状病毒包括上述的重组转移载体。
本发明提供了所述重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：
将上述重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60转化至含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac感受态细胞，转染Sf9细胞，得到兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60。
本发明还提供了上述重组杆状病毒表达的重组VP60蛋白及重组VP60蛋白培养物形成的病毒样颗粒。
本发明还提供了上述重组转移载体、重组杆状病毒或重组VP60蛋白及重组VP60蛋白培养物中形成的病毒样颗粒在制备预防、诊断及治疗RHDV1和RHDV2型毒株感染药物的应用。
本发明还提供了一种防治兔出血症1型和2型的二价疫苗，所述二价疫苗包括上述的重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株的重组VP60蛋白和佐剂。
优选的，所述佐剂为氢氧化铝胶，所述RHDV1和RHDV2型VP60蛋白抗原与氢氧化铝胶的质量比为(8.2-9.8)：(1.8-0.2)。
本发明提供了一种兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒以及载体灭活疫苗，本发明将RHDV1和RHDV2型VP60基因克隆至杆状病毒载体中，转染Sf9细胞后获得兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60，重组病毒接种Sf9细胞后诱导表达RHDV1和RHDV2型VP60蛋白，结合佐剂制备成兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒灭活疫苗。利用该疫苗进行免疫效力评价试验，兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒灭活疫苗对RHDV1的攻击保护率为100％，对RHDV2的攻击保护率也为100％，具有良好的免疫效力，对预防和控制当前流行的兔出血症病毒感染具有重大意义，可降低由病毒感染造成的经济损失，维护公共卫生安全，维护我国家兔养殖产业的健康发展，在预防和治疗RHDV1和RHDV2型毒株感染方面具有重要的应用价值。
生物保藏说明
本发明所述的兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60，分类命名：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V202036，保藏日期2020年6月21日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
本发明所述的3D7细胞株，分类命名：杂交瘤细胞株3D7，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020111，保藏日期2020年6月21日，保藏地址：中国武汉武汉大学。
附图说明
图1 VP60基因片段PCR扩增结果；其中，M为DNA分子质量标准(DL2000)；1为RHDV1型VP60扩增产物；2为RHDV2型VP60扩增产物；
图2重组载体Bacmid-RHDV1/RHDV2-VP60的酶切鉴定结果；其中，M为DNA分子质量标准(DL15000)；1为Bacmid-RHDV1/RHDV2-VP60 Kpn I和Xho I双酶切产物；2为Bacmid-RHDV1/RHDV2-VP60 EcoR I和Hind III双酶切产物。
图3重组RHDV1和RHDV2型VP60蛋白的Western blot检测结果，A为检测用单抗为A3C，B检测用单抗为3D7，C检测用单抗为5F3；其中，1为野生型RHDV1病毒；2为野生型RHDV2病毒；3为重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株接种Sf9细胞培养物；4为Sf9细胞培养物。
图4电镜检测野生RHDV1、RHDV2病毒颗粒及重组RHDV1和RHDV2型VP60蛋白培养物中形成的病毒样颗粒结果；其中，A为野生型RHDV1病毒；B为野生型RHDV2病毒；C为重组RHDV1和RHDV2型VP60蛋白培养物病毒样颗粒。
具体实施方式
本发明提供了一种兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因的重组转移载体，所述重组转移载体以含有双启动子的真核表达载体为基础载体，所述基础载体连接有RHDV1和RHDV2型VP60基因片段。
本发明中，用于负载所述RHDV1和RHDV2型VP60基因片段的真核表达载体优选包括pFastBacTMDual。本发明中所述RHDV1型VP60基因片段优选的连接在质粒pFastBacTMDual的P10启动子下游；RHDV2型VP60基因片段优选的连接在质粒pFastBacTMDual的polyhedrin启动子下游。本发明对所述质粒pFastBacTMDual的来源并没有特殊限定，本发明具体实施方式中采用的质粒pFastBacTMDual优选购自Invitrogen公司。本发明中，所述RHDV1型VP60基因片段优选的经过密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述RHDV2型VP60基因片段优选的经过密码子优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明提供了上述重组转移载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)分别取RHDV1和RHDV2型病毒RNA进行反转录PCR扩增获得RHDV1型病毒的cDNA和RHDV2型病毒的cDNA；
(2)以所述RHDV1型病毒的cDNA为模板，经PCR扩增得到RHDV1型VP60基因片段,测序显示基因序列如SEQ ID NO.5所示；
(3)以所述RHDV2型病毒的cDNA为模板，经PCR扩增得到RHDV2型VP60基因片段,测序显示基因序列如SEQ ID NO.6所示；
(4)将步骤(2)扩增得到的RHDV1 VP60基因片段，经昆虫细胞密码子优化后合成基因，序列如SEQ ID NO.7所示，并克隆至质粒pFastBacTMDual的P10启动子下游，将步骤(3)扩增得到的RHDV2VP60基因片段，经昆虫细胞密码子优化后合成基因，序列如SEQ ID NO.8所示，并克隆至同一质粒pFastBacTMDual的polyhedrin启动子下游，构建得到重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60。
本发明中，所述RHDV1型病毒RNA优选来源于RHDV WF/China/2007，基因序列号为FJ794180.1；所述RHDV2型病毒RNA优选来源于RHDV2 SC2020/04毒株；所述RHDV2 SC2020/04毒株优选采自四川某兔场送检的急性死亡兔肝、脾等脏器组织，基因序列号为MT383749。本发明对从RHDV1和RHDV2型病毒中提取RNA的方法并没有特殊限定，采用本领域常规的病毒RNA提取方法即可。本发明具体实施过程中，提取RHDV1和RHDV2型病毒RNA优选采用Trizol法。本发明以反转录获得的cDNA为模板，经PCR扩增分别得到RHDV1和RHDV2型VP60基因片段后，优选的将所述RHDV1和RHDV2型VP60基因片段进行核酸电泳鉴定，验证其扩增的RHDV1和RHDV2型VP60基因的核苷酸序列是否正确。
本发明中，扩增获得的RHDV1 VP60基因以及RHDV2 VP60基因序列优选的需要进行密码子优化后合成基因。所述优化具体为：在不改变野生型RHDV1和RHDV2氨基酸序列的前提下，将所有密码子替换为昆虫细胞使用频率最高的密码子，在此基础上，从以下四个方面进行调整：消除12个以上的重复序列；消除潜在的二级结构；避免局部GC和AT含量过高；消除潜在的剪接位点。本发明中，优化后的基因全长1740bp，GC含量52％，RHDV1的优化后基因上游引入Kpn I酶切位点，下游引入Xho I酶切位点；RHDV2的优化后基因上游引入EcoR I酶切位点，下游引入HindIII酶切位点。本发明中，所述全基因合成及序列测定均在金斯瑞生物科技股份有限公司完成，测序结果确证合成无误。本发明中，所述RHDV1 VP60基因以及RHDV2 VP60基因序列经过密码子优化后能够指导蛋白表达的调控，优化表达产量和质量。
本发明中，所述扩增得到的RHDV1 VP60基因片段优选的连接在质粒pFastBacTMDual的Kpn I和Xho I酶切位点之间；所述扩增得到的RHDV2 VP60基因片段优选的连接在质粒pFastBacTMDual的EcoR I和Hind III酶切位点之间。本发明中，构建重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60时，优选的先将扩增得到的RHDV1 VP60基因片段，经密码子优化后克隆至质粒pFastBacTMDual的P10启动子下游，然后将扩增得到的RHDV2VP60基因片段经密码子优化后克隆至同一质粒pFastBacTMDual的polyhedrin启动子下游。本发明中，由于RHDV2型病毒的血凝效价显著低于RHDV1型血凝效价的特性，因此将RHDV2型VP60克隆至polyhedrin强启动子下游，有利于提高RHDV2型VP60的表达量，对提高疫苗成分中RHDV2型VP60组分，发挥疫苗的有效保护作用具有重要意义。
本发明还提供了一种兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60，所述重组杆状病毒包括上述的重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60。
本发明中，所述重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60优选的转化含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac感受态细胞，得到重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RHDV1/RHDV2-VP60。本发明优选的将构建成功的重组杆状病毒穿梭质粒转入大肠杆菌中进行筛选和鉴定。在本发明具体实施过程中，所述筛选优选为蓝白斑筛选，具体的将重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60转入大肠杆菌感受态细胞后，接种于含有卡那霉素、庆大霉素、四环素三抗的LB培养基中进行培养，筛选白色单菌落；进行进一步的扩繁后，提取鉴定为阳性的重组杆状病毒穿梭质粒。本发明中，提取所述重组杆状病毒穿梭质粒所采用的方法和试剂均为本领域常规提取杆状病毒质粒的方法和试剂。在本具体实施方式中优选采用《杆状病毒表达系统手册》所述方法和试剂进行提取。
本发明提供了所述重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：
将重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60转化至含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac感受态细胞，转染Sf9细胞，得到兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60。
本发明中，所述转染Sf9细胞时的转染试剂优选为LipofectaminTM3000。本发明对所述转染试剂的来源并没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。本发明中，重组穿梭质粒Bacmid-RHDV1/RHDV2-VP60转染Sf9细胞后优选的以细胞形态验证转染是否成功，具体的：转染5日后观察到细胞肿大变圆，分裂停止，细胞间紧密连接消失，细胞折光性增强，而正常细胞则无此变化，说明转染成功。本发明对转染后的细胞培养的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转染细胞培养方法即可。
本发明还提供了上述所述重组杆状病毒表达的重组VP60蛋白及重组VP60蛋白培养物中形成的病毒样颗粒。
本发明还提供了上述重组转移载体、重组杆状病毒或重组VP60蛋白及重组VP60蛋白培养物中形成的病毒样颗粒在制备预防、诊断及治疗RHDV1和RHDV2型毒株感染药物中的应用。本发明中，所述重组转移载体和重组杆状病毒通过以其表达的RHDV1和RHDV2型重组VP60蛋白作为免疫原，制备RHDV1和RHDV2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗用于预防、诊断及治疗RHDV1和RHDV2。本发明中，所述重组VP60蛋白培养物形成的病毒样颗粒为直径约32～36nm病毒样粒子，与RHDV1或RHDV2粒子相似，可直接作为免疫原制备RHDV1和RHDV2型VP60二价杆状病毒载体灭活疫苗用于预防、诊断及治疗RHDV1和RHDV2。
本发明还提供了一种防治兔出血症RHDV1和RHDV2型毒株的二价疫苗，所述二价疫苗包括所述重组VP60蛋白和佐剂。
本发明优选的以所述重组VP60蛋白作为免疫原，制备RHDV1和RHDV2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗。本发明中，所述佐剂优选为氢氧化铝胶；所述RHDV1和RHDV2型重组VP60蛋白抗原与氢氧化铝胶的质量比优选为(8.2-9.8):(1.8-0.2)，更优选为9:1。本发明所述的疫苗的注射剂量优选为1ml/只。
本发明分别通过RT-PCR扩增获得RHDV1和RHDV2型VP60基因序列，经昆虫细胞密码子优化后合成基因克隆至杆状病毒表达载体中构建获得兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒作为疫苗毒种，通过接种昆虫细胞表达获得RHDV1和RHDV2型重组VP60蛋白作为免疫原，与佐剂混合后制备获得兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗，通过攻毒免疫保护测定发现，家兔免疫疫苗后分别进行RHDV1和RHDV2攻毒，对照组死亡率100％，免疫组全部存活，保护率达到100％，该疫苗的研制可有效防控RHDV1和RHDV2，维护我国家兔养殖产业的健康发展。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
传统型兔出血症病毒RHDV1毒株的分离与鉴定
2007年，江苏省农业科学院兽医研究所采自江苏某兔场送检的急性死亡兔肝、脾等脏器组织中分离一株传统型兔出血症病毒，命名为RHDV WF/China/2007毒株，基因序列号：FJ794180.1。
新型变异型兔出血症病毒RHDV2毒株的分离与鉴定
2020年4月，江苏省农业科学院兽医研究所采自四川某兔场送检的急性死亡兔肝、脾等脏器组织中分离一株新型变异型兔出血症病毒，命名为RHDV2 SC2020/04毒株，基因序列号：MT383749。
实施例2
兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒的构建及鉴定
(1)RHDV1型VP60基因的扩增
将焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水分别与RHDV1感染致死的肝脏组织按质量比9:1进行混合，研磨成悬液，装入用DEPC处理过的1.5ml EP管中，于-20℃以下反复冻融3次；2～8℃，以7200r/min离心20分钟；取上清200μl，加入Trizol 700μl，振荡混匀后，室温放置10分钟；加入氯仿300μl，剧烈振荡后，室温放置30分钟；2～8℃，10000r/min，离心15分钟；取上层水相750μl，加入750μl异丙醇，混匀，-20℃以下，放置15分钟；2～8℃，10000r/min，离心10分钟；去上清，加入75％乙醇1ml洗涤；2～8℃，8000r/min，离心5分钟，弃上清；室温干燥20分钟，分别得到RHDV1的总RNA，加入DEPC处理过的水10μl，使其充分溶解。
设计合成上游引物P1：
5′-ATAGGTACCATGGAGGGCAAAGCCCGC-3′(SEQ ID NO.1)；
下游引物P2：
5′-GCCTCGAGTCAGACATAAGAAAAG-3′(SEQ ID NO.2)；
在上游引物P1的5'端加入Kpn I酶切位点，下游引物P2的5'端引入Xho I酶切位点。
进行反转录PCR扩增衣壳蛋白VP60基因，反转录体系为：10×Buffer 2μl、10mmol/L dNTPs 2μl、下游引物P21μl、RNA酶抑制剂0.5μl、RNA模板12μl，AMV反转录酶0.5μl，DEPC处理过的H2O 2μl，总体积为20μl，瞬间离心混匀，65℃反应15分钟，42℃孵育60分钟，95℃反应5分钟，-20℃以下保存备用。
PCR反应体系为：10×Reaction buffer 2.5μl、25mmol/L MgCl21.5μl、2.5mmol/LdNTPs 0.5μl、50mmol/L P10.5μl、50mmol/L P20.5μl、模板cDNA4.0μl、ddH2O 15μl、EXTaqTM polymerase 0.5μl，总体积25μl，瞬间离心混匀，采用热盖进行PCR扩增反应：94℃变性3分钟；94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，扩增得到的RHDV1 VP60基因片段大小为1740bp。
(2)RHDV2型VP60基因的扩增
将焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水分别与RHDV2感染致死的肝脏组织按质量比9:1进行混合，研磨成悬液，装入用DEPC处理过的1.5ml EP管中，于-20℃以下反复冻融3次；2～8℃，以7200r/min离心20分钟；取上清200μl，加入Trizol 700μl，振荡混匀后，室温放置10分钟；加入氯仿300μl，剧烈振荡后，室温放置30分钟；2～8℃，10000r/min，离心15分钟；取上层水相750μl，加入750μl异丙醇，混匀，-20℃以下，放置15分钟；2～8℃，10000r/min，离心10分钟；去上清，加入75％乙醇1ml洗涤；2～8℃，8000r/min，离心5分钟，弃上清；室温干燥20分钟，分别得到RHDV2的总RNA，加入DEPC处理过的水10μl，使其充分溶解。
设计合成上游引物P3：
5′-ATAGAATTCATGGAGGGCAAAGCCCGC-3′(SEQ ID NO.3)；
下游引物P4:
5′-GCAAGCTTTCAGACATAAGAAAAC-3′(SEQ ID NO.4)；
在上游引物P3的5'端加入EcoR I酶切位点，下游引物P4的5'端引入HindIII酶切位点。
进行反转录PCR扩增衣壳蛋白VP60基因，反转录体系为：10×Buffer 2μl、10mmol/L dNTPs 2μl、下游引物P41μl、RNA酶抑制剂0.5μl、RNA模板12μl，AMV反转录酶0.5μl，DEPC处理过的H2O 2μl，总体积为20μl，瞬间离心混匀，65℃反应15分钟，42℃孵育60分钟，95℃反应5分钟，-20℃以下保存备用。
PCR反应体系为：10×Reaction buffer 2.5μl、25mmol/L MgCl21.5μl、2.5mmol/LdNTPs 0.5μl、50mmol/L P10.5μl、50mmol/L P2 0.5μl、模板cDNA4.0μl、ddH2O 15μl、EXTaqTM polymerase 0.5μl，总体积25μl，瞬间离心混匀，采用热盖进行PCR扩增反应：94℃变性3分钟；94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，扩增得到的RHDV2 VP60基因片段大小为1740bp。
(3)重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60的构建
用限制性内切酶Kpn I和Xho I分别消化供体质粒pFastBacTMDual和密码子优化后的RHDV1 VP60基因片段，回收目的片段，用T4 DNALigase，2～8℃，连接12小时，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。筛选阳性克隆，得到重组载体pFastBacTMDual-RHDV1-VP60。
用限制性内切酶EcoR I和Hind III分别消化上述重组载体pFastBacTMDual-RHDV1-VP60和步骤(2)扩增得到的RHDV2 VP60基因片段，回收目的片段，用T4 DNALigase，2～8℃，连接12小时，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。筛选阳性克隆，得到重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60。
(4)重组杆状病毒穿梭质粒的构建及鉴定
将重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60转化含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac感受态细胞，于LB液体培养基中37℃培养4小时后，取100μl转化产物涂于含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素以及100μg/ml X-gal和20μg/mlIPTG的LB平板上，37℃培养48小时后，挑选白色菌落，在同样的含三种抗生素的LB平板上继续接种传代一次，获得纯培养，接种含有三种抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇(180r/min)培养24小时，用BAC/PAC大型质粒提取试剂盒提取Bacmid质粒得到重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RHDV1/RHDV2-VP60。重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RHDV1/RHDV2-VP60经KpnI和Xho I双酶切消化RHDV1 VP60基因后，经琼脂糖凝胶电泳验证结果如图2，可见两条大小分别为4800bp和1740bp左右的片段。重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RHDV1/RHDV2-VP60经EcoR I和Hind III双酶切消化RHDV2 VP60基因后，经琼脂糖凝胶电泳验证结果如图2，可见两条大小分别为4800bp和1740bp的片段。
(5)兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒的获得
以LipofectaminTM3000为共转染试剂，按照LipofectaminTM3000试剂转染方法将Bacmid-RHDV1/RHDV2-VP60转染Sf9单层细胞。转染后每12小时观察一次，直到细胞病变明显时，收集细胞及上清液，作为重组杆状病毒原液-20℃以下保存。将含有RHDV1和RHDV2型VP60基因的重组杆状病毒命名为rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株。
(6)重组病毒的传代与VP60基因的测序鉴定
收集第2代接种重组病毒的Sf9细胞培养物，将兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒按BAC/PAC大型质粒提取试剂盒提取重组病毒DNA，以核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示的RHDV1 VP60全长基因上游引物P5，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物P6，扩增RHDV1 VP60基因。以核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的RHDV2 VP60全长基因上游引物P7，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物P8，扩增RHDV2 VP60基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，分别显示电泳条带为1740bp，说明RHDV1和RHDV2型VP60目的基因已经在Sf9细胞中得到表达，重组杆状病毒构建成功。将获得的重组杆状病毒命名为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏CCTCC，保藏号为CCTCC NO：V202036。
实施例3
单克隆抗体5F3、A3C和3D7的制备及鉴定
单克隆抗体5F3和A3C由前期实验室制备获得，由传统型RHDV1 VP60基因制备的重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，收获细胞培养物作为免疫原与等量弗氏佐剂乳化，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经3次亚克隆后，获得5F3和A3C细胞株，两细胞株均能稳定分泌抗RHDV1的抗体。Western Blot鉴定结果表明，5F3单克隆抗体能够特异地识别RHDV1，但对RHDV2无特异性结合反应(图3C)，A3C可以特异性识别RHDV1和RHDV2(图3A)。
单克隆抗体3D7由前期实验室制备获得，基因合成RHDV2 VP60基因P2高变区克隆至pET28a中，将构建好的表达载体转化入BL21(DE3)感受态中，挑取单克隆进行诱导表达，37℃0.5mM IPTG诱导表达4小时，镍柱纯化后蛋白作为免疫原与等量弗氏佐剂乳化，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经3次亚克隆后，获得3D7细胞株，所述3D7细胞株命名为杂交瘤细胞株3D7，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C2020111。该细胞株能稳定分泌抗RHDV2的抗体。Western Blot鉴定结果表明，3D7单克隆抗体能够特异地识别RHDV2，但对RHDV1无特异性结合反应(图3B)。
实施例4
重组RHDV1和RHDV2型VP60蛋白的表达及鉴定
(1)Westernblot鉴定表达产物
设置实验组接种杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株细胞培养物，同时设置阴性对照Sf9细胞培养物组，阳性对照野生型RHDV1和RHDV2病毒组，将实验组和Sf9细胞培养物分别分装于1.5ml离心管中，以3000r/min离心5分钟，弃上清，用0.01mol/L，pH值为7.0～7.2的PBS溶液重悬细胞，洗涤2次后，溶于500μlPBS，反复冻融3次后，超声裂解，以3000r/min离心5分钟，取上清，加入上样缓冲液。野生型RHDV1和RHDV2病毒悬液，加入上样缓冲液，煮沸5分钟，以11000r/min离心1分钟，取上清20μl进行SDS-PAGE电泳。免疫转印采用半干转印法。分别以抗兔出血症病毒RHDV1单克隆抗体5F3为一抗，以抗兔出血症病毒RHDV2单克隆抗体3D7为一抗，以同时可以结合RHDV1和RHDV2的单抗A3C为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Westernblot鉴定，结果如图3。
以A3C为检测用单抗，Western blot结果显示杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株接种昆虫细胞培养物中显示出大小约为60kDa的特异性条带，阳性对照组野生型RHDV1和RHDV2病毒也显示出大小为60kDa的特异性条带。以5F3为检测用单抗，结果显示重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株接种昆虫细胞培养物中显示出大小约为60kDa的特异性条带，阳性对照野生型RHDV1病毒组显示出大小为60kDa的特异性条带，RHDV2病毒组未显示特异性条带。以3D7为检测用单抗，结果显示重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株接种昆虫细胞培养物中显示出大小约为60kDa的特异性条带，阳性对照野生型RHDV1病毒组未显示出特异性条带，RHDV2病毒组显示大小为60kDa的特异性条带。同时3种抗体检测结果中阴性对照Sf9细胞培养物组均未显示相应的条带。结果表明重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株接种昆虫细胞培养物中RHDV1和RHDV2 VP60蛋白均得到高效表达。
(2)血凝效价测定
将重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株接种昆虫细胞培养物，反复冻融3次后，以1000g离心5分钟，上清即为重组RHDV1和RHDV2 VP60蛋白。按照红细胞凝集试验法中50孔板法。取重组VP60蛋白50μl于反应板，用0.01mol/L，pH值7.0～7.2的PBS溶液作2倍比稀释，加入等体积1％人“O”型红细胞悬液，振荡均匀，置2～8℃作用45分钟，观察结果。将反应板倾斜后判定结果，结果显示重组VP60蛋白对人“O”型红细胞凝集效价≥1:1024。
(3)电镜观察
将重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株接种昆虫细胞培养物，反复冻融3次后，以3000r/min离心5分钟，弃去上清培养液，底部细胞用PBS重悬，洗两次，以3000r/min离心5分钟，PBS重悬，-20℃以下冻融3次后，以11000r/min离心3分钟，取上清滴于铜网上，吸附2分钟，用滤纸吸去多余样品，然后滴2％的磷钨酸染液于铜网上，固定2分钟，最后除去多余的磷钨酸染液，室温干燥5分钟后于透射电镜上进行观察，结果如图4。
由图4的电镜结果可知，重组病毒接种Sf9细胞，目的基因得到表达，且表达的蛋白可以形成直径约32～36nm的病毒样粒子，与野生型RHDV1和RHDV2病毒粒子相似。
实施例5
1、兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗的制备
用SF-SFM培养基悬浮培养细胞，培养24小时后，待细胞浓度约为2×106个/ml，按总体积的1％接种杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60株，以相同条件继续培养，连续观察5日，待细胞病变达约85％以上时，收获细胞培养物。细胞培养物即表达重组RHDV1和RHDV2型VP60蛋白抗原，测定血凝效价，抗原对人“O”型红细胞凝集效价均不低于1:1024，经0.2％甲醛溶液灭活后，将抗原和氢氧化铝胶按质量比9:1进行混合，制备得到兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒灭活疫苗。
2、兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒灭活疫苗的应用
将80只2月龄健康易感家兔于免疫前测定兔出血症病毒抗体HI效价，所得效价不高于1:2。
将40只2月龄健康易感家兔分为免疫组和对照组，其中免疫组分为4组，每组5只，对照组分为4组，每组5只，免疫组接种本发明所述兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒灭活疫苗1ml/只，对照组接种等体积生理盐水，两组分别于免疫3天、7天、14天和21天后于家兔颈部皮下注射RHDV1肝毒1ml进行攻毒试验，观察21天，并记录结果得到表1。
将40只2月龄健康易感家兔分为免疫组和对照组，其中免疫组分为4组，每组5只，对照组分为4组，每组5只，免疫组接种本发明所述兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒灭活疫苗1ml/只，对照组接种等体积生理盐水，两组分别于免疫3天、7天、14天和21天后于家兔颈部皮下注射RHDV2肝毒1ml进行攻毒试验，观察21天，并记录结果得到表2。
表1兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗免疫保护效果检测
Figure BDA0002560124420000161
表2兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗免疫保护效果检测
Figure BDA0002560124420000171
由上表1和2可知，利用本发明疫苗免疫后7日、14日和21日攻毒RHDV1型毒株，对照组兔全部死亡，免疫兔全部健康存活。免疫后7日、14日和21日攻毒RHDV2型毒株，对照组兔全部死亡，免疫兔全部健康存活。其中，对照组死亡兔出现兔出血症典型的病理变化，对死亡兔肝脏悬液进行人“O”型红细胞凝集试验，均为阳性。
由以上实施例可知，本发明通过分子生物学技术构建重组RHDV1和RHDV2 VP60杆状病毒，以传统型RHDV1和新发变异型RHDV2为疫苗毒种的目的基因序列来源，首次制备得到了重组RHDV1和RHDV2二价杆状病毒载体灭活疫苗，利用该二价疫苗进行免疫效力评价试验，兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒灭活疫苗对RHDV1和RHDV2的攻击保护率均为100％，具有良好的免疫效力，在预防和治疗RHDV1和RHDV2方面具有重要的应用价值。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种兔出血症病毒1型和2型VP60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataggtacca tggagggcaa agcccgc 27
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcctcgagtc agacataaga aaag 24
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atagaattca tggagggcaa agcccgc 27
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaagctttc agacataaga aaac 24
<210> 5
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggagggca aagcccgcac agcgccgcaa ggcgaagcag caggcactgc taccacagca 60
tcagttcccg gaaccacgac cgacggcatg gatcctggtg tagtggccgc aactagtgtg 120
gtcactgcag aaaattcatc cgcatcggtt gcaacggcgg ggattggcgg tccaccccaa 180
caggtggacc aacaagaaac atggaggaca aacttctact acaatgatgt tttcacttgg 240
tccgtcgcgg acgcacccgg cagcattctc tacactgtcc aacactctcc acagaacaac 300
ccattcacag ctgtactgag ccagatgtac gctggctggg ctggtggcat gcagttccgc 360
ttcatagttg ctggatcagg tgtgtttggt gggcgactgg tcgcggctgt gataccacca 420
ggcatcgaga ttgggccagg gttggaggtc aggcaatttc ctcatgttgt tatcgacgcc 480
cgttcactcg aacctgttac catcaccatg ccagacttgc gtcccaacat gtaccatcca 540
actggtgacc ctggccttgt ccccacacta gtccttagtg tttacaacaa cctcatcaac 600
ccgtttggtg gatccaccaa cgcaatccag gtgacagtgg aaacgaggcc gagtgatgac 660
tttgagttcg tgatgattag agccccctcc agcaaaactg ttgactcaat ctcacccgca 720
ggccttctca cgaccccagt cctcactggt gttggcaatg acaacaggtg gaacggccaa 780
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aacggcagca catatggctg gtcaagccct cggtttgccg acattgacca tcgaagaggc 900
agtgcaagtt attctgggaa caactccacc aacgtgcttc agttttggta cgctaatgct 960
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tcaaccacgc tcattgactt gactgaactc attgacgtac gccccgtggg acccaggccg 1680
tccaaaagca cactcgtgtt caacctgggg ggcacaacca atggcttttc ttatgtctga 1740
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcggtccccg gaaccacaac cgacggtatg gaccctggtg ttgtggccac caccagcgtg 120
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caaatggacc aacaagagac ttggaggaca aatttctact ataatgatgt ttttacatgg 240
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ccgttcacag ctgttctaag tcaaatgtac gctggctggg caggtggcat gcagttccgg 360
ttcatagttg ctgggtcagg tgtcttcggt gggcgtctgg tcgcagcggt tataccaccg 420
ggcattgaga ttgggccagg tttggaagtc agacaattcc ctcatgttgt cattgacgct 480
cgttcactcg aaccagtcac catcaccatg ccggacttgc gccccaacat gtaccaccca 540
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ccatttggtg gatccacgag cgcaatccag gtcacggtgg aaacaaggcc cagtgaggac 660
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aacgcaagtt tccctggaag cagttcgtca aacgtgcttg agctttggta tgctagtgcc 960
gggtctgcag ctgacaaccc catctcccaa attgctccag atggtttccc tgacatgtca 1020
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaagctttc atacgtaact aaaa 24

Claims (7)

1.一种兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因的重组转移载体，其特征在于，所述重组转移载体以含有双启动子的真核表达载体为基础载体，所述基础载体连接有RHDV1和RHDV2型VP60基因片段；
所述真核表达载体为质粒pFastBacTMDual；所述RHDV1 VP60基因片段连接在所述质粒pFastBacTMDual的P10启动子下游，所述RHDV2型VP60基因片段连接在所述质粒pFastBacTMDual的polyhedrin启动子下游；所述RHDV1 VP60基因片段的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，所述RHDV2 VP60基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述重组转移载体的构建方法包括以下步骤：
（1）分别取RHDV1和RHDV2型病毒RNA进行反转录PCR扩增获得RHDV1型病毒的cDNA和RHDV2型病毒的cDNA；所述RHDV2型病毒RNA来源于RHDV2 SC2020/04毒株；
（2）以所述RHDV1型病毒的cDNA为模板，经PCR扩增得到RHDV1型VP60基因片段，测序显示基因序列如SEQ ID NO.5所示；
（3）以所述RHDV2型病毒的cDNA为模板，经PCR扩增得到RHDV2型VP60基因片段，测序显示基因序列如SEQ ID NO.6所示；
（4）将步骤（2）扩增得到的RHDV1 VP60基因片段，经昆虫细胞密码子优化后合成基因，序列如SEQ ID NO.7所示，并克隆至质粒pFastBacTMDual的 P10启动子下游，将步骤（3）扩增得到的RHDV2 VP60基因片段，经昆虫细胞密码子优化后合成基因，序列如SEQ ID NO.8所示，并克隆至同一质粒pFastBacTMDual的polyhedrin启动子下游，构建得到重组转移载体pFastBacTMDual-RHDV1/RHDV2-VP60；
步骤（2）和步骤（3）之间无时间顺序限定。
2.根据权利要求1所述的重组转移载体，其特征在于，步骤（1）中反转录PCR扩增RHDV1型VP60基因的上游引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
反转录PCR扩增RHDV2型VP60基因的上游引物P3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物P4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60，其特征在于，所述重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60包括权利要求1所述的重组转移载体。
4.权利要求3所述重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：
将权利要求1所述重组转移载体转化至含有穿梭载体Bacmid的E.coli DH10Bac感受态细胞，转染Sf9细胞，得到兔出血症病毒1型和2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒rBAC-RHDV1/RHDV2-VP60。
5.权利要求3所述杆状病毒表达的重组VP60蛋白及重组VP60蛋白培养物形成的病毒样颗粒。
6.权利要求1所述的重组转移载体、权利要求3所述的重组杆状病毒或权利要求5所述的重组VP60蛋白及重组VP60蛋白培养物形成的病毒样颗粒在制备预防、诊断及治疗RHDV1和RHDV2毒株感染药物中的应用。
7.一种防治兔出血症1型和2型的二价疫苗，其特征在于，所述二价疫苗包括权利要求5所述的重组VP60蛋白和佐剂；所述佐剂为氢氧化铝胶，所述重组VP60蛋白抗原与氢氧化铝胶的质量比为（8.2-9.8）：（1.8-0.2）。
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