CN110423779A - 同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用，所述病毒采用以下方法制备：A、分别扩增classic RHDV和RHDV2的VP60基因；B、将步骤A得到的VP60基因分别与pEASY‑Vector连接，转化培养后得质粒；C、将步骤B得到的质粒的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，转化感受态细胞，得重组穿梭质粒；D、将步骤C得到的重组穿梭质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得。采用该杆状病毒制备的预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗可以产生高水平的VP60特异性抗体且抗体具有良好的中和病毒能力，IL‑4和IFN‑γ细胞因子水平也显著上升。

Description

同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状 病毒及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用。
背景技术
兔病毒性出血症俗称兔瘟，是由兔病毒性出血症病毒引起的一种急性、热性、败血型和毁灭性的传染病。该病于1984年在我国江苏省无锡地区首次爆发，随后在意大利出现并由此传遍整个欧洲并波及全球，对养兔业造成了巨大的经济损失。2010年研究人员在法国发现了一例非典型兔瘟，其病原被命名为RHDV2，该病原能够引起幼龄兔的死亡并且是唯一能够跨种传播的兔病毒属成员。现如今，RHDV2已经传播到欧洲、非洲和澳洲的许多国家，但国内还没有见到相关报道。RHDV2与classic RHDV相比不仅可以感染成年的新西兰兔也可以感染2～3周龄未成年的新西兰兔，而且其宿主不止局限于新西兰兔还可感染其他种的野兔。RHDV2感染后潜伏期较长，发病率与死亡率相对较低，并且该亚型有取代经典兔瘟的趋势。已爆发新型兔瘟的国家，仍采用经典的灭活疫苗法来防治新型兔瘟，但可能由于新型兔瘟发生了许多重要的抗原变异，经典的灭活疫苗无法对新型兔瘟提供完全保护，且传统的灭活疫苗在灭活过程中可能损害或改变了有效的抗原决定簇，其产生的抗体水平维持时间较短因此免疫效果较差，需要多次重复免疫，成本较高；且组织灭活苗在一定程度上也存在着散毒的潜在风险。衣壳蛋白VP60是兔瘟病毒的主要结构蛋白，也是病毒免疫保护性抗原，可以刺激机体产生针对兔瘟病毒的特异性免疫。且该蛋白可以自我组装形成病毒样颗粒，因为病毒样颗粒不含有病毒核酸，因此不能复制，不具有致病性；病毒样颗粒还可以模拟病毒粒子的天然结构，可以模拟病原刺激机体产生特异性的免疫保护效应。昆虫细胞—杆状病毒表达系统可以对表达的蛋白进行翻译后修饰，使其在结构及功能上与天然蛋白更接近。
欧洲、非洲及澳洲的许多国家被报道有新型兔瘟的爆发。虽然目前为止我国还没有关于新型兔瘟的相关报道，但由于国际贸易往来的日益密切而我国对新型兔瘟尚缺少良好的检测手段，新型兔瘟对我国养兔业仍然具有潜在的巨大风险，制备针对新型兔瘟的亚单位疫苗以及特异性鉴别检测的诊断方法对我国养兔业具有十分重要的意义。构建一个同时针对classic RHDV和RHDV2的二价亚单位疫苗不仅在已有RHDV2爆发的国家和地区有实际的应用价值，同时也可以降低尚未有相关报道的其他国家和地区RHDV2爆发的潜在风险。
发明人前期申请的专利(申请号为201810135244.9)中，已研究了一种表达兔病毒性出血症病毒Ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒。但有研究表明classic RHDV与RHDV2之间交叉免疫原性较差，因此表达单个亚型VP60蛋白的重组杆状病毒制备的疫苗无法提供良好的交叉保护力，因此有必要研制一种可以同时预防classic RHDV和RHDV2感染的新型疫苗。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明参照NCBI公布的兔病毒性出血症病毒经典型及二型的衣壳蛋白(VP60)编码基因开放阅读框，设计了两对含有特异性同源臂及标签蛋白的引物，扩增classicRHDV和RHDV2的衣壳蛋白编码基因，将扩增的基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBac Dual中。
本发明涉及兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白基因重组杆状病毒的制备研究，通过扩增兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白VP60全长片段，通过分子生物学技术构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，获得能够表达衣壳蛋白的杆状病毒，然后将该病毒的表达产物通过相关技术手段进行了鉴定。
本发明还提供了一种可以同时成功表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的方法，表达的衣壳蛋白可以自我包装成病毒样颗粒(virus like particles)，将表达产物经0.1％甲醛灭活后与免疫佐剂乳化免疫SPF新西兰白兔，检测发现免疫组与对照组相比可以产生高水平的VP60特异性抗体且抗体具有良好的中和病毒的能力，IL-4和IFN-γ细胞因子水平也显著上升。该杆状病毒在未来可以用来进行经典型及二型兔病毒性出血症二价亚单位疫苗的研究，以此用来同时预防兔病毒性出血症经典型及二型。
本发明提供了一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：
A、分别扩增classic RHDV和RHDV2的VP60基因；
B、将步骤A得到的classic RHDV和RHDV2的VP60基因分别与pEASY-Vector连接，转化培养后得质粒pEASY-classic RHDV-VP60、pEASY-RHDV2-VP60；；
C、将步骤B得到的两种质粒的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，转化感受态细胞，得重组穿梭质粒；
D、将步骤C得到的重组穿梭质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒。
优选地，步骤A中，分别扩增classic RHDV及RHDV2的VP60基因采用的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物对、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的引物对所示。本专利采用的引物携带有同源臂，使用同源重组技术与质粒进行连接构建重组质粒，与酶切连接方法相比重组阳性率更高，且不受限制性酶切位点的局限。
优选地，步骤C中，将两种质粒的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体的具体步骤为：先将pEASY-classic RHDV-VP60进行高保真特异性扩增得到的目的片段1与质粒连接，获得pFastBac Dual-classic RHDV VP60；然后将pEASY-RHDV2-VP60进行高保真特异性扩增得到的目的片段2与pFastBac Dual-classic RHDV VP60连接。本发明还提供了一种根据前述方法制备的同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒。
本发明还提供了一种根据前述方法中步骤A-C制备的重组穿梭质粒。
本发明还提供了一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的应用，所述应用包括：采用所述同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒制备预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗。
本发明还提供了一种预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、将同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒感染昆虫细胞后收集，破碎后离心，所得上清液中加入终浓度0.1％的甲醛，孵育以灭活重组杆状病毒；
S2、将步骤S1处理后的上清液等体积加入佐剂中乳化，即得所述疫苗。
采用所述同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白杆状病毒制备预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗，免疫SPF新西兰白兔后检测发现免疫组与对照组相比可以产生高水平的VP60特异性抗体且抗体具有良好的中和病毒的能力，IL-4和IFN-γ细胞因子水平也显著上升。该杆状病毒在未来可以用来进行经典型及新型兔病毒性出血症二价亚单位疫苗的研究，以此用来同时预防兔病毒性出血症经典型及二型。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明基于昆虫杆状病毒表达系统优于原核表达系统的优点—表达外源蛋白时具有与哺乳动物细胞类似的翻译后加工修饰能力，开展了RHDV衣壳蛋白在昆虫细胞上的表达。在表达classic RHDV及RHDV2的衣壳蛋白的过程中，通过免疫印迹、间接免疫荧光等方法表明实验获得了具有生物活性的classic RHDV-VP60及RHDV2-VP60蛋白，并准确地鉴定了同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白杆状病毒。并通过电镜检测发现表达的该重组蛋白可以组装成为病毒样颗粒(virus like particles)，采用同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白杆状病毒制备预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗，免疫SPF新西兰白兔后检测发现免疫组与对照组相比可以产生高水平的VP60特异性抗体且抗体具有良好的中和病毒的能力，IL-4和IFN-γ细胞因子水平也显著上升。目前，基于杆状病毒表达系统生产的疫苗已广泛使用，因为杆状病毒只能感染非脊椎动物，且其感染的宿主昆虫细胞也不能在外界寄生，因此，利用该表达系统表达的VP60蛋白具有较高的生产实践意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1重组质粒pFastBac Dual-classic RHDV VP60-RHDV2VP60构建示意图；
图2classic RHDV-VP60、RHDV2-VP60的PCR扩增图；其中：M为DNA标准Trans2K；1为classic RHDV-VP60F/R扩增片段；2为RHDV-VP60F/R扩增片段；3为阴性对照；
图3病毒mBacmid-classic RHDV VP60-RHDV2VP60感染SF9细胞后的病变情况；其中图3A为正常Sf9细胞；图3B为感染mBacmid-classic RHDV VP60-RHDV2VP60的Sf9细胞；
图4病毒mBacmid-classic RHDV VP60-RHDV2VP60感染SF9细胞的western blot检测结果；
图5病毒mBacmid-classic RHDV VP60-RHDV2VP60感染Sf9细胞的间接免疫荧光检测(IFA)；其中：Mock(10×)为正常Sf9细胞10倍荧光显微镜下视野；bacmid-classic RHDVVP60-RHDV2VP60(10×)为感染细胞10倍荧光显微镜下视野；DAPI为Sf9细胞细胞核染色；FITC为重组蛋白表达情况；Merged为重组蛋白表达分布情况；
图6病毒mBacmid-classic RHDV VP60-RHDV2VP60感染Sf9细胞后的电镜检测图；
图7兔抗VP60特异性抗体水平变化；
图8血清中和性抗体水平检测；
图9兔外周淋巴细胞中IL-4水平变化；
图10兔外周淋巴细胞中IFN-γ水平变化。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
实施例1
1.1菌种、质粒、细胞
pJET1.2-RHDV2-VP60质粒由荷兰瓦赫宁根大学病毒学实验室赠送，pBl-classicRHDV质粒由本实验室构建并保存(参见Recovery of Infectious Rabbit HemorrhagicDisease Virus from Rabbits after Direct Inoculation with In Vitro-TranscribedRNA)，pFastBac Dual质粒、DH10bac感受态细胞购于Invitrogen公司，DH5α感受态细胞购于南京诺唯赞有限公司，Sf9昆虫细胞购自于中国典型培养物保藏中心(GDC0008)。
1.2主要试剂
小量凝胶回收试剂盒、ClonExpress II One Step Cloning Kit试剂盒购于南京诺唯赞有限公司，小量质粒提取试剂盒购于Axygen公司，DNAmarker、pEASY-Vector克隆载体购于北京全式金生物有限公司，Phusion DNA-polymerase，SFM900II昆虫培养基，Cellfectin II转染试剂盒购于Thermo-fisher公司；鼠源His标签一抗、鼠源HA标签一抗、HRP标记和FITC标记的羊抗鼠IgG购于CST公司，乙醇、异丙醇等化学试剂均购于上海生工生物有限公司。
1.3引物的设计和合成
根据classic RHDV和RHDV2序列登录号碱基序列设计了两对引物用于VP60基因的扩增和鉴定。
Classic RHDVF(SEQ ID No.1)：5’-AAGCGCGCGGAATTCATGGAGGGCAAAACCCGC-3’；
Classic RHDVR(SEQ ID No.2)：5’-CTTCTCGACAAGCTTTCAATGATGATGATGATGATGGACATAAGAAAAGCC-3’；
RHDV2F(SEQ ID No.3)：5’-ACCCGGGATCTCGAGATGGAGGGCAAAGCCCG-3’；
RHDV2R(SEQ ID No.4)：5’-CCATCTCCCGGTACCTCAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGACATAAGAAAAACC-3’；
1.4目的基因的扩增
以pBl-classic RHDV质粒及pJET1.2-RHDV2-VP60质粒为模板，Classic-RHDVF/Classic-RHDVR、RHDV2F/RHDV2R为引物，利用Phusion DNAPolymerase进行片段的高保真特异性扩增，得两个目的基因片段。如图2所示，在1740bp处均出现单一条带，证明获得所需的目的基因片段。
1.5克隆载体pEASY-classic RHDV-VP60及pEASY-RHDV2-VP60的构建与鉴定
将步骤1.4扩增得到的两个目的基因片段(classic RHDV的VP60基因和RHDV2的VP60基因)分别与pEASY-Vector于室温连接半小时后，将两个连接产物分别转化至DH5α感受态细胞后涂板，倒置平板于37℃的恒温培养箱过夜培养，挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR为阳性即分别得到了克隆载体pEASY-classic RHDV-VP60及pEASY-RHDV2-VP60，将PCR为阳性的菌液分别进行保存。重组质粒用引物Classic-RHDVF/Classic-RHDVR、RHDV2F/RHDV2R分别进行PCR初步鉴定，扩增产物均为1740bp，与理论值相符。
1.6重组质粒pEASY-classic RHDV-VP60及pEASY-RHDV2-VP60的纯化
采用Axygen公司的小提质粒提取步骤1.5的PCR为阳性的菌液，获得纯化的阳性质粒pEASY-classic RHDV-VP60及pEASY-RHDV2-VP60，于-20℃保存。
1.7表达载体pFastBac Dual-classic RHDV VP60-RHDV2VP60的构建与鉴定
1.7.1以步骤1.6得到的pEASY-classic RHDV-VP60采用
Classic-RHDVF/Classic-RHDVR为引物，利用Phusion DNA Polymerase进行片段的高保真特异性扩增，得目的片段1后进行回收。
1.7.2昆虫杆状病毒表达载体pFastBac Dual质粒用限制性内切酶EcoRI以及HindIII于37℃进行双酶切，酶切后回收，采用诺唯赞公司的ClonExpress II One StepCloning Kit试剂盒将目的片段1与pFastBac Dual质粒于37℃连接30min，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，倒置平板在37℃恒温培养箱过夜培养。挑菌进行菌落PCR鉴定，并送上海生工生物测序。采用Axygen公司的小提质粒提取阳性菌液，获得纯化的阳性质粒pFastBac Dual-classic RHDV VP60。
1.7.3以步骤1.6得到的pEASY-RHDV2-VP60采用RHDV2F/RHDV2R为引物，利用Phusion DNA Polymerase进行片段的高保真特异性扩增，得目的片段2后进行回收。
1.7.4阳性质粒pFastBac Dual-classic RHDV VP60用限制性内切酶XhoI以及KpnI于37℃进行双酶切，酶切后回收，采用诺唯赞公司的ClonExpress II One StepCloning Kit试剂盒将目的片段2与pFastBac Dual-classic RHDV VP60质粒于37℃连接30min，将连接产物转化至DH5α感受态细胞，倒置平板在37℃恒温培养箱过夜培养。挑菌进行菌落PCR鉴定，并送上海生工生物测序。采用Axygen公司的小提质粒提取阳性菌液，获得纯化的阳性质粒pFastBac Dual-classic RHDV VP60-RHDV2VP60。测序结果证实成功插入外源基因，且阅读框正确，证明成功构建了重组质粒pFastBac Dual-classic RHDVVP60-RHDV2VP60(构建示意图如图1)。
1.8重组穿梭质粒Bacmid-classic RHDV VP60-RHDV2VP60的构建和鉴定
将步骤1.7鉴定正确的重组表达载体pFastBac Dual-classic RHDV VP60-RHDV2VP60转化DH10bac感受态细胞，涂于含有卡那霉素、四环素、庆大霉素三种抗生素的平板上，平板上同时涂布X-gal和IPTG，37℃培养36-48h，培养可见的白色菌落稀释后再次涂布于有卡那霉素、四环素、庆大霉素三种抗生素的平板上，平板上同时涂布X-gal和IPTG，再次37℃培养36-48h。挑取单菌落，以Classic-RHDVF/Classic-RHDVR、RHDV2F/RHDV2R进行菌落PCR鉴定，获得鉴定正确的阳性菌。
1.9重组穿梭质粒的提取
参考《分子克隆手册》采用异丙醇-醋酸钠法(碱提法)提取步骤1.8得到的阳性菌的重组质粒，再次使用Classic-RHDVF/Classic-RHDVR、RHDV2F/RHDV2R进行PCR鉴定，扩增产物为1740bp，该结果证明目的基因已转座成功，重组穿梭质粒Bacmid-classic RHDVVP60-RHDV2VP60构建成功。
1.10重组穿梭质粒在昆虫细胞中的表达
Sf9昆虫细胞在28℃培养箱使用SFM900II昆虫培养基进行培养，参照Invitrogenbac-to-bac Baculovirus Expression system在Cellfectin脂质体(Thermo-fisher)介导下将得到的重组穿梭质粒Bacmid-classic RHDV VP60-RHDV2VP60进行转染Sf9昆虫细胞，以未转染细胞为阴性对照。每隔24h观察一次在28℃培养箱中的细胞生长情况，于72h-96h左右收取细胞培养液，3000rpm离心10min,上清液即为重组杆状病毒液，保存于4℃，命名为mBacmid-classic RHDV VP60-RHDV2VP60。经传代得到第三代重组病毒，进行Western-blot分析其表达产物，结果为阳性时，将其分装冻存于-80℃作为种毒。
1.11表达产物的鉴定
1)Western-blot鉴定
将步骤1.10中传代得到的第三代病毒mBacmid-classic RHDV VP60-RHDV2VP60按照1:10～1:100的比例感染Sf9昆虫细胞，28℃培养72-96小时后，取病毒感染的细胞的上清进行鉴定，使用Bio-Rad电泳仪，将样品进行SDS-PAGE电泳，后用Bio-Rad半干转转膜仪将凝胶上的各条带转移至硝酸纤维素膜(NC)上，以鼠源抗HA标签和His标签的单抗为一抗(1:1000倍稀释)，HRP标记的羊抗鼠IgG(1；10000倍稀释为二抗)进行Western blot分析鉴定。如图3所示，28℃培养48h-60h可在倒置显微镜下观察到细胞病变(图3B)，与正常对照SF9细胞(图3A)相比转染细胞变大变圆，细胞核增大，细胞核内出现多角体，转染96h左右约90％细胞出现感染现象。如图4所示，蛋白质分子量在65KDa处出现一条特征性的条带。
2)间接免疫荧光检测(IFA)
在6孔板上，将第五代重组病毒接种对数生长期的Sf9细胞，培养至发生病变约感染后48h用间接免疫荧光法检测重组蛋白的表达，使用鼠源VP60特异性单抗为一抗(1:200倍稀释)，FITC标记的羊抗鼠IgG(1；1000倍稀释为二抗)进行鉴定。结果如图5所示，感染病毒成功表达重组蛋白的细胞出现荧光，而空白对照的正常Sf9细胞无荧光。
Western blot以及IFA均证明该重组病毒能够成功表达重组蛋白。
3)重组蛋白的电镜检测
将步骤1.10收集重组杆状病毒感染72h后的Sf9细胞培养上清液(含重组蛋白)，用超声波破碎仪破碎细胞两分钟(作用5s，停顿5s)后差速离心纯化后，用1M磷钨酸进行负染制片后，透射电镜检测(图6)可发现大小约为35-40nm，多面体对称的病毒样颗粒，并符合典型的杯状病毒科病毒样颗粒的形态。
1.11经典型及新型兔病毒性出血症二价亚单位疫苗的制备及免疫原性检测
1)疫苗的制备
将步骤1.10收集重组杆状病毒感染72h后的Sf9细胞培养上清液(含重组蛋白)，用超声波破碎仪破碎细胞两分钟(作用5s，停顿5s)后离心收集上清，加入0.1％甲醛4℃孵育12h灭活重组杆状病毒，将灭活的重组杆状病毒感染sf9细胞72h后无细胞病变，证明灭活完全。将灭活后的上清按照1：1比例与MontaindeTM ISA201VG佐剂乳化，同时制备对照组的安慰剂。
2)免疫原性检测
将20只SPF新西兰白兔分为高剂量免疫组H-VLPs(4mL，6只)、低剂量免疫组L-VLPs(1mL，6只)及对照组Control(4mL，8只)，在免疫前及免疫后1、2、3周采集凝血分离血清，采用原核表达制备的VP60蛋白作为包被抗原，实验室保存的兔抗RHDV阳性血清和阴性血清建立的间接ELISA检测试剂盒检测VP60特异性抗体水平的变化，采用血凝及血凝抑制实验检测抗体的中和效价，采用商品化的ELISA检测试剂盒检测IL-4和IFN-γ细胞因子的水平的变化。结果如图7-10所示，检测发现免疫组(H-VLPs和L-VLPs)与对照组相比可以产生高水平的VP60特异性抗体且抗体具有良好的中和病毒的能力，IL-4和IFN-γ细胞因子水平也显著上升。且高剂量免疫组H-VLPs的效果最佳。
综上所述，本发明成功构建了同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒，并使其在昆虫细胞上成功表达，通过蛋白电泳，免疫印迹、IFA、电镜检测进行了病毒表达产物的鉴定，将表达产物经甲醛灭活后与免疫佐剂乳化免疫SPF新西兰白兔，检测发现免疫组与对照组相比可以产生高水平的VP60特异性抗体且抗体具有良好的中和病毒的能力，IL-4和IFN-γ细胞因子水平也显著上升。该杆状病毒在未来可以用来进行预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗的研究，以此用来同时预防经典型及二型兔病毒性出血症病毒。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒及其制备和应用
<130> DD5595
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagcgcgcgg aattcatgga gggcaaaacc cgc 33
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttctcgaca agctttcaat gatgatgatg atgatggaca taagaaaagc c 51
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acccgggatc tcgagatgga gggcaaagcc cg 32
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatctcccg gtacctcaag cgtaatctgg aacatcgtat gggtagacat aagaaaaacc 60

Claims (7)

1.一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、分别扩增classic RHDV和RHDV2的VP60基因；
B、将步骤A得到的classic RHDV和RHDV2的VP60基因分别与pEASY-Vector连接，转化培养后得质粒pEASY-classic RHDV-VP60、pEASY-RHDV2-VP60；
C、将步骤B得到的两种质粒的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体中，然后转化感受态细胞，得重组穿梭质粒；
D、将步骤C得到的重组穿梭质粒在脂质体介导下转染昆虫细胞，即得所述同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒。
2.根据权利要求1所述的同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤A中，分别扩增classic RHDV及RHDV2的VP60基因采用的引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物对、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的引物对所示。
3.根据权利要求1所述的同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤C中，将两种质粒的VP60基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体的具体步骤为：先将pEASY-classic RHDV-VP60进行高保真特异性扩增得到的目的片段1与质粒连接，获得pFastBac Dual-classic RHDV VP60；然后将pEASY-RHDV2-VP60进行高保真特异性扩增得到的目的片段2与pFastBac Dual-classic RHDV VP60连接。
4.一种根据权利要求1所述方法制备的同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒。
5.一种根据权利要求1所述方法制备的重组穿梭质粒。
6.一种同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒的应用，其特征在于，所述应用包括：采用所述同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒制备预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗。
7.一种预防兔病毒性出血症经典型及二型的二价亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将同时表达兔病毒性出血症病毒经典型及二型衣壳蛋白的杆状病毒感染昆虫细胞后收集，破碎后离心，所得上清液中加入终浓度0.1％的甲醛，孵育以灭活重组杆状病毒；
S2、将步骤S1处理后的上清液等体积加入佐剂中乳化，即得所述疫苗。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111705083A (zh) * 2020-06-29 2020-09-25 江苏省农业科学院 一种兔出血症病毒2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒、疫苗及其制备方法和应用
CN111718958A (zh) * 2020-06-29 2020-09-29 江苏省农业科学院 一种兔出血症病毒1型和2型vp60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103789274A (zh) * 2014-02-17 2014-05-14 齐鲁动物保健品有限公司 一种兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗及其制备方法
CN108359645A (zh) * 2018-02-09 2018-08-03 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用
CN108474004A (zh) * 2015-09-17 2018-08-31 替代基因公司 重组蛋白在粉纹夜蛾蛹中的表达
WO2018225917A1 (ko) * 2017-06-08 2018-12-13 전정배 명나방류 알, 이를 생산하는 방법, 및 명나방류 알을 이용하여 재조합단백질을 생산하는 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103789274A (zh) * 2014-02-17 2014-05-14 齐鲁动物保健品有限公司 一种兔病毒性出血症病毒重组亚单位疫苗及其制备方法
CN108474004A (zh) * 2015-09-17 2018-08-31 替代基因公司 重组蛋白在粉纹夜蛾蛹中的表达
WO2018225917A1 (ko) * 2017-06-08 2018-12-13 전정배 명나방류 알, 이를 생산하는 방법, 및 명나방류 알을 이용하여 재조합단백질을 생산하는 방법
CN108359645A (zh) * 2018-02-09 2018-08-03 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 一种表达兔病毒性出血症病毒ⅱ型衣壳蛋白杆状病毒的制备及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLAUDIA MÜLLER ET AL.: ""Characterization of protective humoral and cellular immune responses against RHDV2 induced by a new vaccine based on recombinant baculovirus"", 《VACCINE》 *
QIUHONG MIAO ET AL.: ""Immunogenicity in Rabbits of Virus-Like Particles from a Contemporary Rabbit Haemorrhagic Disease Virus Type 2 (GI.2/RHDV2/b) Isolated in The Netherlands"", 《VIRUSES》 *
孔德生: ""不同亚型兔出血症病毒单克隆抗体的制备及抗原表位鉴定"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
王旻: "《生物工程》", 31 August 2009, 中国医药科技出版社 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111705083A (zh) * 2020-06-29 2020-09-25 江苏省农业科学院 一种兔出血症病毒2型衣壳蛋白基因重组杆状病毒、疫苗及其制备方法和应用
CN111718958A (zh) * 2020-06-29 2020-09-29 江苏省农业科学院 一种兔出血症病毒1型和2型vp60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用
CN111718958B (zh) * 2020-06-29 2022-06-03 江苏省农业科学院 一种兔出血症病毒1型和2型vp60二价重组杆状病毒载体灭活疫苗及其制备方法和应用

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