CN102181406A - 一种重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用。本发明提供了表达序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒。将所述重组腺病毒感染树突状细胞，得到了重组细胞。所述重组细胞和所述的重组腺病毒均可用于制备宫颈癌预防和/或治疗疫苗。本发明人制备的基于HPV16 E6E7重组腺病毒的疫苗，在预防和/或治疗HPV16相关肿瘤中有良好的使用效果，具有很大的临床应用前景。

Description

一种重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和疫苗领域，具体涉及一种重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用。

背景技术

Human papillomavirus病毒(HPV)属于乳多空病毒科(Papovaviridae)的乳头瘤病毒属，是一种嗜上皮细胞的DNA病毒。HPV是宫颈癌的主要致病因子，约99.7％的宫颈癌发病都与HPV感染有关。宫颈癌在全球妇女癌症发病率中居第二位，每年全球大约有50万例。根据致癌性高低，可将HPV分为高危型和低危型两种，其中HPV16属于高危型的代表之一。据统计，大约50％的宫颈癌与HPV16感染相关。宫颈癌的传统治疗方法如手术、放疗、化疗等只对早期患者有一定的疗效，且治疗创伤大，不能防止HPV再度感染。

HPV基因组主要编码2种晚期蛋白(L1和L2)和6种早期蛋白(E1、E2、E4、E5、E6和E7)。晚期蛋白为HPV衣壳结构成分，参与病毒颗粒组装。E6和E7是HPV的主要致癌蛋白，可使宿主细胞永生化并进一步发生恶性转化。E6和E7基因只存在于癌变组织中，在正常组织中不存在。

树突状细胞(DC)在体内分布广泛，膜表面高表达共刺激分子、粘附分子及主要组织相容性复合物分子，是体内功能最强的抗原提呈细胞，也是唯一能激活初始型T细胞的APC，被称为天然“免疫佐剂”，在抗感染、抗肿瘤、移植排斥等过程中发挥重要作用。它的临床试验结果的一个显著特征就是其安全性，除了发烧、局部反应等，极少有副反应，而且没有见到严重威胁生命的副反应。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组腺病毒及其修饰的树突状细胞与它们的应用。

本发明提供的重组腺病毒为表达序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒。

所述蛋白质的编码基因具体可如序列表的序列1所示。

所述重组腺病毒具体可为培养重组细胞甲得到的重组腺病毒；所述重组细胞甲是将重组质粒与骨架质粒pBH GloxΔE1\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒是在pDC315质粒的多克隆位点插入所述蛋白质的编码基因得到的重组质粒。

本发明提供的重组腺病毒可有效的感染树突状细胞，使之表达(E6E7融合蛋白)并提呈，注射到体内后可激发HPV16 E6E7特异性的CTL，可用于HPV16感染的宫颈癌的免疫治疗。

本发明还保护所述的重组腺病毒感染树突状细胞得到的重组细胞乙。

所述树突状细胞可为小鼠树突状细胞。所述树突状细胞具体可为用鼠源GM-CSF诱导来自鼠骨髓的CD34+干细胞得到的树突状细胞。

所述的重组细胞乙和/或所述的重组腺病毒在制备宫颈癌预防和/或治疗疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种宫颈癌预防和/或治疗疫苗，它的活性成分是所述的重组细胞乙和/或所述的重组腺病毒。

本发明提供的疫苗可以采用多种方式进行免疫，如采用皮内注射。采用皮内注射时，对于60Kg左右的成年人，建议每月免疫一次，连续免疫六次，每次免疫剂量为2×10⁵个所述的重组细胞乙。

本发明还保护在pDC315质粒的多克隆位点插入序列表的序列1所示DNA片段得到的重组质粒(pDC315-E6E7-3)。

本发明还保护将所述重组质粒(pDC315-E6E7-3)与骨架质粒pBH Glox ΔE1\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞甲。

本发明的优点如下：

(1)选用的抗原是高危HPV16型的两个癌基因E6和E7的融合基因，相比只做单个基因的研究，包含了更多的表位。

(2)选用了突变的E6和E7融合基因包装腺病毒，去除了其致癌性，安全性大大提高。

(3)包装了表达HPV16E6E7基因的腺病毒，可用来高效感染树突状细胞和其他细胞或直接用来注射人体；相比而言，包装了HPV16 E6E7基因的腺病毒可能是目前最有效的给树突状细胞负载HPV16 E6E7抗原的方法。

(4)目前国内还没有使用腺病毒载体来使树突状细胞负载高危型HPV16抗原的研究，更没有相关的临床研究，本发明使用腺病毒载体使树突状细胞负载HPV16E6E7抗原的细胞疫苗填补国内空白。

发明人使用HPV16 E6E7作为HPV16相关肿瘤基因治疗的目的基因，并利用AdMax系统构建了HPV16 E6E7重组腺病毒(Ad-HPV16E6E7-3)。同时，选择DC作为抗原提呈细胞，用HPV16 E6E7重组腺病毒修饰DC后将其作为抗肿瘤疫苗。该疫苗在体外具有诱导HPV16 E6E7特异性CTL的能力，并且通过临床前小鼠实验检测了此疫苗体外活化的CTL对肿瘤细胞的抑制作用。结果证实，本发明人制备的基于HPV16 E6E7重组腺病毒的疫苗，在预防和/或治疗HPV16相关肿瘤中有良好的使用效果，具有很大的临床应用前景。

附图说明

图1为重组腺病毒RCA电泳检测结果；1：pXC-1质粒的PCR产物；2：pXC-1质粒的PCR产物的10倍稀释液；3：pXC-1质粒的PCR产物的100倍稀释液；4：病毒上清的PCR产物；5：病毒上清的PCR产物的10倍稀释液；6：病毒上清的PCR产物的100倍稀释液；7：WideRange DNA Marker(100-6000)。

图2为重组腺病毒中目的基因PCR电泳鉴定结果；1：病毒上清的PCR产物；2：病毒上清的PCR产物的10倍稀释液；3：病毒上清的PCR产物的100倍稀释液；4：WideRange DNA Marker(100-6000)。

图3为重组腺病毒感染细胞后表达的目的蛋白的Western blot结果；1为蛋白Marker；2：重组腺病毒，一抗为E6山羊多抗；3：重组腺病毒，一抗为E7小鼠单抗；4：重组腺病毒，一抗为E7小鼠单抗；5：对照腺病毒，一抗为E6山羊多抗；对照腺病毒，一抗为E7小鼠单抗。

图4为树突状细胞的流式细胞仪表面分子标记鉴定。

图5为ELISpot实验结果；每个柱子代表一只小鼠。

图6为体外杀伤实验的结果；纵坐标为待测细胞的信号值与1640培养基孔的信号值的差值，单位为RLU(Relative Light Unit，横坐标为淋巴细胞与靶细胞TC-1的比例。

图7为体内抗瘤实验结果；横坐标的单位为周，从小鼠接种肿瘤细胞两周后2周后对照组体表肿瘤可见，所以从接种肿瘤细胞开始第15天开始记，每7天为一周；纵坐标的小鼠的存活率。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。本发明所涉及到的分子生物学相关技术如核酸分子克隆技术、蛋白质表达检测等在科学文献中都已经有充分的描述(如参见J.萨姆布鲁克、E.F弗里奇、T.曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南(第二版))，涉及到各种试剂盒的具体操作，按照其相应说明书进行。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。限制性内切酶HindⅢ、EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ，T4连接酶，PCR EXTaq酶均购自日本TAKARA公司。质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京天根公司。FuGENE-HD(转染试剂)购自Roch公司。鼠源GM-CSF(细胞因子)和鼠源TNF-α(细胞因子)购自PeproTech公司。检测小鼠MHC-II的抗体、检测小鼠CD11c的抗体、检测小鼠CD86的抗体、Elispot set购买自BD公司。E6山羊多抗和E7小鼠单抗购自santa cruz公司。山羊二抗和小鼠二抗购自rockland公司。引物均由上海生工合成。C57BL/6小鼠购自中国医学科学院实验动物所。CTL杀伤检测试剂盒为CytoTox-ONE^TM Homogeneous Membrane Integrity Assay购自promega公司。pDC315质粒：来自加拿大Microbix Biosystems Inc.公司销售的Admax kitD(PD-01-64)。骨架质粒pBH Glox ΔE1\3cre：来自加拿大MicrobixBiosystems Inc.公司销售的Admax kitD(PD-01-64)。HEK 293细胞：购买自美国ATCC(CRL-1573)。pXC-1质粒(含有腺病毒E1基因)：购自加拿大Microbix Biosystems Inc.公司(PD-01-03)。

TC-1肿瘤细胞：由约翰霍普金斯大学的Tzyy-Choou Wu教授惠赠；参考文献： Treatment of Established Tumors with a Novel Vaccine That Enhances MajorHistocompatibility Class II

实施例1、重组腺病毒的制备、鉴定和纯化

一、用于腺病毒包装的重组穿梭质粒的构建

1、合成序列表的序列1所示的E6E7-3融合基因(序列表的序列1所示的E6E7-3融合基因是将野生型HPV16 E6E7的融合基因进行密码子优化得到的，编码序列表的序列2所示的蛋白质；参见专利“经修饰的HPV E6-E7融合基因及其编码蛋白”，申请号为200710100262.5，专利授权公告号为CN 101100672B)。

2、以步骤1合成的E6E7-3融合基因为模板，用E67-5’端引物(下划线标注EcoR Ⅰ识别序列)和E67-3’端引物(下划线标注BamH Ⅰ识别序列)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

E67-5’端引物：5’-GCGAATTCGCCACCATGCACCAGAA-3’；

E67-3’端引物：5’-GCGGATCCTTCAGGGCTTCTGGCT-3’。

PCR扩增的热循环条件为：95℃1分钟，54℃30秒，72℃1分钟。

3、回收步骤2的PCR扩增产物，用限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ进行双酶切，得到酶切产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切pDC315质粒，回收载体骨架(约3900bp)。

5、用T4DNA连接酶连接步骤3回收的酶切产物与步骤4回收的载体骨架，得到连接产物。

6、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取重组菌提质粒测序，测序结果表明，得到了重组质粒pDC315-E6E7-3，即为用于腺病毒包装的重组穿梭质粒。

重组质粒pDC315-E6E7-3的结构描述：在pDC315质粒的EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点之间插入序列表的序列1所示DNA片段得到的重组质粒。

二、制备重组腺病毒

1、将重组质粒pDC315-E6E7-3与骨架质粒pBH Glox ΔE1\3cre按照摩尔比1∶1混合，借助FuGENE-HD(转染试剂)转染6孔板中的HEK293细胞(配比为4ug质粒DNA：12ul转染试剂)。

2、约2周后除去细胞培养液，用PBS缓冲液收获细胞。

3、将收获的溶于PBS缓冲液的细胞使用-70℃冰箱和37℃水浴锅反复冻融3-5次，得到原代病毒液。

4、用原代病毒液感染新的HEK293细胞，在发生细胞病变效应(CPE)时收获病毒，重复几次(用病毒液感染新的HEK293细胞)，扩大病毒量和提高病毒滴度，得到重组腺病毒Ad-E6E7-3的病毒液(粗制腺病毒)。

用pDC315质粒代替重组质粒pDC315-E6E7-3，进行步骤1至4，得到对照腺病毒的病毒液(粗制腺病毒)。

三、检测包装的重组腺病毒的复制缺陷型

本发明使用的腺病毒载体是复制缺陷的，其基因组不含复制所需的腺病毒E1基因。而在制备复制缺陷型的腺病毒的过程中，腺病毒的复制是依赖于包装细胞系HEK293表达的腺病毒E1基因的。然而，存在HEK293细胞表达的腺病毒E1基因重组到包装腺病毒基因组的可能性，从而产生可自主复制的腺病毒。因此，需要检测制备的复制缺陷型腺病毒中是否含有复制型腺病毒(RCA)。RCA的检测的方法是用PCR的方法检测制备的腺病毒DNA中是否有腺病毒E1的存在。

1、25ul步骤二得到的重组腺病毒Ad-E6E7-3的病毒液加入1ul蛋白酶K(10mg)，55℃水浴1h。

2、煮沸5min。

3、10000rpm离心5min，取上清。

4、分别以上清、上清的10倍稀释液和上清的100倍稀释液为模板(以pXC-1质粒为阳性对照)，用RCA-up和RCA-down组成的引物对(RCA-up和RCA-down的靶序列是腺病毒E1基因中的部分区域，靶序列长度为1.2kb)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

RCA-up：5’-CACAAGGGCGTCTCCAAGTT-3’；

RCA-down：5’-CCTGCGAGTGTGGCGGTAAA-3’。

5、将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，见图1。

四、检测包装的重组腺病毒的目的基因

包装的腺病毒要求是含有目的基因的DNA并在感染细胞后会表达目的蛋白(E6E7融合蛋白)，因此需要检测重组腺病毒中目的基因DNA的存在和转染细胞后目的蛋白的表达。用E6E7特异的引物PCR扩增腺病毒DNA中目的DNA是否存在；用制备的腺病毒感染HEK293细胞24小时后收细胞，用Western Blot的方法检测目的蛋白的表达。

1、检测腺病毒DNA中目的基因的存在

(1)25ul步骤二得到的重组腺病毒Ad-E6E7-3的病毒液加入1ul蛋白酶K(10mg)，55℃水浴1h。

(2)煮沸5min.

(3)10000rpm离心5min，取上清。

(4)分别以上清、上清的10倍稀释液和上清的100倍稀释液为模板，用E6E7-up和E6E7-down组成的引物对(靶序列长度约为780bp)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

E6E7-up：5’-ATGCACCAGAAGAGAACCGCCAT-3’；

E6E7-down：5’-TCAGGGCTTCTGGCTGCAGAT-3’。

(5)将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，见图2。

2、检测重组腺病毒感染细胞后目的蛋白的表达

(1)用HEK293细胞铺6孔板，在感染时使其覆盖率大于90％。

(2)将新鲜培养液与步骤二得到的重组腺病毒Ad-E6E7-3的病毒液混匀，得到腺病毒稀释液(每孔份的量为200ul新鲜培养液与1×10⁷pfu重组腺病毒Ad-E6E7-3的病毒液混匀)；将步骤二得到的对照腺病毒的病毒液作为重组腺病毒Ad-E6E7-3的病毒液的对照。

(3)吸去步骤(1)的6孔板中细胞表面的培养液，每孔加入1孔份步骤(2)的腺病毒稀释液，37℃，5％CO₂培养箱中静置2小时。

(4)吸去病毒稀释液，加入新鲜培养液在37℃，5％CO₂培养箱中培养24-48小时；吸去培养液，加入预冷的PBS缓冲液，吹打细胞层，将细胞收集到离心管中；1000转/分离心5分钟沉淀细胞。

(5)在沉淀的细胞中加入细胞裂解液，冰上裂解细胞(细胞裂解液的加入量为每孔细胞100ul细胞裂解液)。

(6)蜗旋震荡5min，14000rpm 4℃离心10min，取上清进行SDS-PAGE。

(7)转膜后，5％脱脂奶粉封闭过夜。

(8)以E6山羊多抗(或E7小鼠单抗)(1∶200)室温摇床孵育60min。

(9)以PBST洗膜3次，10min/次。

(10)分别以山羊二抗(或小鼠二抗)(1∶1000)室温避光孵育45min。

(11)以PBST洗膜3次，10min/次。

(12)将膜置于PBS中，红外扫描仪机检，结果见图3。

五、纯化包装的重组腺病毒

收获的粗制腺病毒，用氯化铯不连续密度梯度法进行纯化以除掉其中混杂的细胞碎片和其他生物大分子，离心完毕后吸去乳白色的腺病毒层。由于离心过程和回收腺病毒液时均会吸入氯化铯，因此还需除去腺病毒液中的氯化铯。将离心后的病毒液加入到100KD的超滤管中，再补加足量的PBS缓冲液，离心除去含氯化铯的液体，反复2次后剩下的即为纯化的腺病毒。

1、在离心管下层加入4M的氯化铯7ml(67g CsCl溶于100ml 10mM HEPES，pH7.4)，中间加上2.2M的氯化铯10ml(38g CsCl溶于100ml 10mM HEPES，pH7.4；10mM HEPES：1.3g HEPES溶于500ml双蒸水)，上面加入20ml步骤二得到的重组腺病毒Ad-E6E7-3的病毒液。

2、4℃下100 000g离心12小时，中间形成的一层乳白色的腺病毒层，用注射器收集该乳白色的腺病毒层。

3、收集的腺病毒液加入到规格100KD的超滤管中，2500rpm离心30分钟。

4、加入足量的PBS缓冲液，2500rpm离心30分钟，重复2次。

5、加入含10％甘油的PBS缓冲液，即为纯化后重组腺病毒Ad-E6E7-3病毒液，-70℃保存。

用步骤二得到的对照腺病毒的病毒液代替步骤二得到的重组腺病毒Ad-E6E7-3的病毒液，进行步骤1至5，得到纯化后对照腺病毒病毒液。

六、测定包装腺病毒的滴度

利用CELL BIOLABS，INC.公司的QuickTiter Adenovirus Titer Immunoassay Kit试剂盒测定包装腺病毒的滴度，具体操作步骤如下：

1、按照2.5×10⁵细胞/孔的量将HEK293细胞铺于24孔板，1ml/孔，于37℃，5％CO₂恒温培养箱孵育1h。

2、将步骤五得到的纯化后重组腺病毒Ad-E6E7-3病毒液用培养基做10倍比稀释，并将稀释后的病毒样品按照100ul/孔的用量加入24孔板；将步骤五得到的纯化后对照腺病毒病毒液作为纯化后重组腺病毒Ad-E6E7-3病毒液的对照。

3、于37℃，5％CO₂恒温培养箱孵育2天。

4、缓慢去除孔内培养基，每孔加入0.5ml预冷的甲醇，-20℃孵育20min，固定HEK293细胞。

5、用1×PBS缓冲液洗固定好的细胞三次，5min/次。

6、每孔加入适量含有1％BSA的PBS缓冲液，置于摇床上室温封闭1h。

7、每孔加入0.25ml 1×anti-Hexon antibody，置于摇床上室温孵育1h。

8、用1×PBS缓冲液洗固定好的细胞三次，5min/次。

9、每孔加入0.25ml 1×二抗(HRP-conjugated)，置于摇床上室温孵育1h。

10、用1×PBS缓冲液洗固定好的细胞五次，5min/次。

11、每孔加入0.25ml新鲜配制的1×DAB工作液，置于摇床上室温孵育10min。

12、吸除DAB，用1×PBS缓冲液洗涤两次，并将每孔加入1ml 1×PBS缓冲液。

13、光镜下，10倍镜对阳性细胞(棕色)计数，每孔至少计5个视野。

14、计算每孔的阳性细胞平均数以及病毒滴度。

病毒滴度＝(每个视野平均阳性细胞数×每个孔的视野数×稀释倍数)/0.1；病毒滴度单位为pfu/ml。

实施例2、重组腺病毒Ad-E6E7-3致敏的树突状细胞的制备

一、体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞

小鼠骨髓中的CD34+干细胞是树突状细胞的前体，在含GM-CSF的诱导培养基作用下会分化成树突状细胞。

1、取断颈法处死的C57BL/6小鼠，70％乙醇灭菌5min。

2、解剖取股骨，去除附着肌肉，保持骨的完整性，70％乙醇浸泡1分钟，PBS缓冲液冲洗两次。

3、剪断股骨两端，注射器冲洗髓腔三次至股骨变白，200目不锈钢网研磨过滤。

4、400g(1200-1500rpm)离心5分钟，收集沉淀(细胞)。

5、1mL 1640培养基悬浮细胞，加入红细胞裂解液5mL室温裂解红细胞2-3分钟，400g(1200-1500rpm)离心5分钟，收集沉淀(细胞)。

6、1640培养基洗2次。

7、细胞计数，按1-2×10⁶/ml接种6孔板和24孔板。

8、鼠源GM-CSF(购买自peprotech公司)按500U/ml的浓度加入到培养基中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

9、2天后除去一半的旧诱导培养基，加入新的含500U/ml鼠源GM-CSF的诱导培养基。

10、在第4、6天进行步骤9的半量换液。

11、在第7天加入鼠源TNF-α，浓度为200U/ml。

12、2天后收获细胞，用流式细胞仪检测细胞表面CD11c、MHC-II和CD86的表达，结果见图4。实验结果显示，细胞的CD11c、MHCII和CD86表达阳性率均超过80％，可以认定为树突状细胞。

二、重组腺病毒Ad-E6E7-3致敏的树突状细胞的制备

重组腺病毒感染树突状细胞后，可在细胞内表达E6E7融合蛋白，并被树突状细胞经MHC-I途径提呈到细胞表面，从而可刺激特异的CD8+T细胞激活。

1、收获未成熟的树突状细胞，计数调整细胞浓度为5×10⁶/ml。

2、按照MOI(有感染能力的病毒数量与细胞数量的比值，病毒数量以pfu计)＝100加入实施例1的步骤五得到的纯化后重组腺病毒Ad-E6E7-3病毒液，37℃，5％CO₂培养箱中培养2小时。

3、离心除去含病毒液的培养基，加入含200U/ml鼠源TNF-α的RPMI1640培养基。

4、2天后收获细胞，用PBS缓冲液漂洗3次，调整细胞浓度为1×10⁷/ml，即为重组腺病毒Ad-E6E7-3致敏的树突状细胞细胞液。

用实施例1的步骤五得到的纯化后对照腺病毒病毒液代替实施例1的步骤五得到的纯化后重组腺病毒Ad-E6E7-3病毒液，进行步骤1至4，得到对照腺病毒致敏的树突状细胞细胞液。

实施例3、用重组腺病毒Ad-E6E7-3致敏的树突状细胞免疫小鼠

一、分组处理

C57BL/6小鼠随机分为4组，每组30只，分别进行如下处理：

第一组(DC-E6E7-3)：腹腔注射实施例2制备的重组腺病毒Ad-E6E7-3致敏的树突状细胞细胞液；共免疫三次，每次间隔一周；每只小鼠每次免疫100μl细胞液(含1×10⁶细胞)；

第二组(DC-Ad)：腹腔注射实施例2制备的对照腺病毒致敏的树突状细胞细胞液；共免疫三次，每次间隔一周；每只小鼠每次免疫100μl细胞液(含1×10⁶细胞)；

第三组(DC)：腹腔注射实施例2的步骤一制备的树突状细胞细胞液；共免疫三次，每次间隔一周；每只小鼠每次免疫100μl细胞液(含1×10⁶细胞)；

第四组(PBS)：腹腔注射生理盐水；共免疫三次，每次间隔一周；每只小鼠每次免疫100μl生理盐水。

二、小鼠脾细胞分泌IFN-γ的能力

免疫的小鼠脾脏细胞激活后会分泌IFN-γ，通过检测细胞分泌的IFN-γ可反应脾脏T淋巴细胞的激活状态。自第一次免疫开始第21天，每组随机取4只小鼠，采用ELISpotSet检测IFN-γ的分泌。

1、收获小鼠脾细胞

①眼球取血(一只正常大小的小鼠可取0.7ml的血液)，小鼠血尽而亡。

②将小鼠放在75％的酒精中消毒2min后取脾脏，加入4ml淋巴细胞分离液，用注射器内芯压脾脏过400目钢网，收集滤过的脾细胞。

③在含有脾细胞的淋巴细胞分离液上层小心的加入0.5ml的含2％FBS的1640培养基，2500rpm离心30min，之后取出淋巴细胞层。

④加入10ml的含2％FBS的1640培养基，1500rpm离心5min，将沉淀(细胞)用2ml PBS缓冲液重悬，计数，一部分进行ELISpot试验，其余的冻存起来。

2、进行ELIpot检测

①用PBS缓冲液100倍稀释包被抗体，在ELISpot96孔板中每孔加入100ul，4℃过夜。

②弃包被抗体液，用1640完全培养基洗孔。

③室温下每孔加200ul的1640完全培养基进行封闭2h。

④弃封闭液，每孔加入2×的混合多肽液(多肽E6 18-26、多肽E6 37-45、多肽E6 48-57、多肽E7 7-15、多肽E7 49-57和多肽E7 79-87，各多肽的浓度均为4uM；E6 18-26的氨基酸序列为KLPQLCTEL，E6 37-45的氨基酸序列为CVYCKQQLL，E6 48-57的氨基酸序列为EVYDFAFRDL，E7 7-15的氨基酸序列为TLHEYMLDL，E7 49-57的氨基酸序列为RAHYNIVTF、E7 79-87的氨基酸序列为LEDLLMGTL)100ul。

⑤每孔加入4×10⁶/ml待测细胞液共100ul，放入孵箱培养24小时。

⑥吸去细胞悬液，用去离子水洗2次，每次浸泡3-5min。

⑦每孔用200ul PBST(0.05％)洗3次。

⑧用含10％FBS的PBS缓冲液10ml稀释50ul的检测抗体，每孔加100ul，室温静置2h。

⑨弃检测抗体，每孔200ul PBST洗三次，每次浸泡1-2分钟。

⑩用含10％FBS的PBS缓冲液10ml稀释100ul的酶联物(链亲和素-HRP)，每孔100ul，室温静置1h。

弃酶联物，每孔200ul PBST洗四次，每次浸泡1-2分钟。

每孔200ul PBS缓冲液洗两次。

每1ml的底物稀释液加1滴的染料配成显色液，每孔加100ul显色，看颜色变化用去离子水洗以终止反应。

室温避光晾干板并用读板仪检测。

ELISpot结果见图5。分泌IFN-γ的能力自高至低依次为：重组腺病毒Ad-E6E7-3致敏的树突状细胞免疫的小鼠体内的淋巴细胞＞树突状细胞免疫的小鼠体内的淋巴细胞＞生理盐水免疫的小鼠体内的淋巴细胞，三者有显著差异。树突状细胞免疫的小鼠体内的淋巴细胞与对照腺病毒致敏的树突状细胞免疫的小鼠体内的淋巴细胞分泌IFN-γ的能力基本相同，没有显著差异。

三、测定免疫小鼠脾细胞中CTL对宫颈癌靶细胞的体外杀伤

免疫过的小鼠的脾细胞中会刺激产生HPV16E6E7特异性的CTL，这是体内消除HPV16+宫颈癌细胞所必须的。通过检测小鼠脾细胞对HPV16+宫颈癌鼠源模型TC-1的杀伤可反应本发明所制备的疫苗激起HPV16E6E7特异型CTL的能力。本实验采用CTL杀伤检测试剂盒，流程概述如下：将免疫过的小鼠的脾细胞取出，在体外用HPV16E6E7感染的树突状细胞刺激3-5天后，将脾细胞与靶细胞TC-1共培养4-6小时看免疫小鼠的脾细胞中CTL对宫颈癌鼠源靶细胞的杀伤。

自第一次免疫开始第21天，每组随机取4只小鼠，分别进行如下实验：

1、取脾细胞(淋巴细胞)，计数。

2、将淋巴细胞与实施例2制备的重组腺病毒Ad-E6E7-3致敏的树突状细胞细胞液(用重组腺病毒病毒感染树突状细胞并在48小时收获的树突状细胞)按10∶1的比例共孵育3-5天。

3、96孔板每孔加2×10⁴个TC-1肿瘤细胞(50ul)，再按不同比例分别加入步骤2处理后的淋巴细胞(淋巴细胞与靶细胞TC-1的比例分别为0.1∶1，1∶1，5∶1，10∶1或25∶1)。

4、37℃，5％CO₂培养箱中培养4-6小时。

5、每孔加入100ul显色液CytoTox-ONE，摇板混匀30秒；

6.每孔加50ul的终止液(试剂盒自带)，摇板混匀10秒。

7.上机用560/590进行荧光检测。

体外杀伤的结果见图6。PBS对照组小鼠的淋巴细胞对TC-1肿瘤细胞未见有效杀伤。对照腺病毒致敏的树突状细胞免疫的小鼠体内的淋巴细胞和树突状细胞免疫的小鼠体内的淋巴细胞对TC-1肿瘤细胞有一定程度的杀伤，但不显著。重组腺病毒Ad-E6E7-3致敏的树突状细胞免疫的小鼠体内的淋巴细胞对TC-1肿瘤细胞则有较强的杀伤。

四、测定免疫小鼠对宫颈癌细胞攻击的抵抗作用

自第一次免疫开始第21天，每组取20只小鼠，分别在起右侧腹股沟注射100ul TC-1肿瘤细胞(2×10⁵个)，每周观察小鼠成瘤状况，并记录小鼠在接种肿瘤后的存活时间，结果见图7。

免疫生理盐水、免疫对照腺病毒致敏的树突状细胞和免疫树突状细胞的小鼠全部成瘤。在小鼠成瘤后开始记录其存活时间，在成瘤的数周内全部死亡。而免疫了重组腺病毒Ad-E6E7-3致敏的树突状细胞的小鼠在接种宫颈癌肿瘤TC-1后未见成瘤，在记录时间内也未死亡。

Claims (9)

1.表达序列表的序列2所示蛋白质的重组腺病毒。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于：所述蛋白质的编码基因如序列表的序列1所示。

3.如权利要求2所述的重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病毒是培养重组细胞甲得到的重组腺病毒；所述重组细胞甲是将重组质粒与骨架质粒pBH Glox ΔE1\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞；所述重组质粒是在pDC315质粒的多克隆位点插入权利要求2所述编码基因得到的重组质粒。

4.将权利要求1至3中任一所述的重组腺病毒感染树突状细胞得到的重组细胞乙。

5.如权利要求4所述的重组细胞乙，其特征在于：所述树突状细胞为小鼠树突状细胞。

6.权利要求4或5所述的重组细胞乙和/或权利要求1至3中任一所述的重组腺病毒在制备宫颈癌预防和/或治疗疫苗中的应用。

7.一种宫颈癌预防和/或治疗疫苗，它的活性成分是权利要求4或5所述的重组细胞乙和/或权利要求1至3中任一所述的重组腺病毒。

8.在pDC315质粒的多克隆位点插入序列表的序列1所示DNA片段得到的重组质粒。

9.将权利要求8所述重组质粒与骨架质粒pBH Glox ΔE1\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞甲。

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