CN103740741B - Hpv18 e6和e7融合基因突变体及其相关生物材料与编码蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了HPV18E6和E7融合基因突变体及其相关生物材料与编码蛋白。本发明所提供的HPV18E6和E7融合基因突变体是a）或b）的DNA分子：a）编码序列是SEQ ID No.1的第15‑806位所示的DNA分子（名称为HPV18‑E6E7‑4基因）；b）编码序列是SEQ ID No.2的第15‑806位所示的DNA分子（名称为HPV18‑E6E7‑3基因）。HPV18‑E6E7‑4基因或HPV18‑E6E7‑3基因不但高表达于哺乳动物细胞，而且不具有致瘤性，具有生物安全性，还可有效地预防和治疗宫颈癌。
Description
技术领域
本发明涉及HPV18E6和E7融合基因突变体及其相关生物材料与编码蛋白。
背景技术
人乳头瘤病毒（Human Papillomavires，HPV）是一类具有严格宿主范围和组织特异性的DNA病毒，主要感染人的皮肤或粘膜上皮细胞，引起感染部位发生良性和恶性病变。HPV除了可以导致各种皮肤、黏膜疣外，更为主要的在于它是宫颈癌的主要致病因子。全球肿瘤统计报告表明估计2008年全球有53万的宫颈癌新发病例，27.5万妇女死于该病，其中85%的宫颈癌发生在发展中国家。研究表明，约99.7%的宫颈癌发病都与HPV感染有关。宫颈癌的传统治疗方法如手术、放疗、化疗等只对早期患者有一定的疗效，且治疗创伤大，不能防止HPV再度感染。随着HPV与宫颈癌间的病因学联系日益明确，研制高效HPV疫苗以治疗HPV感染及其导致的良、恶性病变具有十分重要的意义。
HPV18型是仅次于HPV16型的高危性HPV病毒，HPV18型感染除了与宫颈癌有关外，还发现HPV18型感染与其它多种肿瘤的发生有关，如食管癌，鼻内翻性乳头状瘤，喉癌，复发性呼吸道乳头状瘤病，阴茎癌，乳腺癌等。而HPV18E6E7癌基因在细胞转化中起着重要作用。HPV感染的过程中，E6和E7蛋白的持续表达是宫颈癌产生的重要原因。E6和E7是HPV的主要致癌蛋白，可使宿主细胞永生化并进一步发生恶性转化，HPV相关肿瘤中组成型持续表达E6和E7蛋白，E6和E7基因只存在于癌变组织中，在正常组织中不存在。因此可以选择E6和E7基因为特异性抗原基因构建抗HPV18型阳性肿瘤疫苗，可以特异性地识别并杀伤E6E7阳性的癌细胞，而不会杀伤正常细胞。但是由于HPV18E6和E7基因为癌基因，直接应用于疫苗设计有潜在的危险性。因此需要筛选HPV18E6和E7突变基因，使其保持免疫原性的同时具有去致瘤性。以此改造的基因构建抗HPV18型阳性肿瘤疫苗才能保证安全性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供与野生型HPV18E6和E7融合基因相比，消除致癌性、在哺乳动物细胞中高表达并且抑制肿瘤细胞生长的HPV18E6和E7融合基因突变体及其相关生物材料与编码蛋白。
本发明所提供的HPV18E6和E7融合基因突变体，为a）或b）的DNA分子：
a）编码序列是SEQ ID No.1的第15-806位所示的DNA分子（名称为HPV18-E6E7-4基因）；
b）编码序列是SEQ ID No.2的第15-806位所示的DNA分子（名称为HPV18-E6E7-3基因）。
其中，SEQ ID No.1由816个核苷酸组成，SEQ ID No.2由816个核苷酸组成。
与HPV18-E6E7-4基因和HPV18-E6E7-3基因相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的与HPV18-E6E7-4基因和HPV18-E6E7-3基因相关的生物材料，为下述B1）至B5）中的任一种：
B1）由HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因转录出的RNA分子；
B2）含有HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因的表达盒；
B3）含有HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因的转基因动物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因动物细胞系。
HPV18-E6E7-4基因或其编码蛋白或HPV18-E6E7-3基因或其编码蛋白或其相关生物材料在制备抑制抑制宫颈癌细胞（生长）的产品（如疫苗或药物）中的应用，HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因或其相关生物材料在制备预防和/或治疗宫颈癌产品（如疫苗或药物）也属于本发明的保护范围。
所述抑制抑制宫颈癌细胞的产品和所述预防和/或治疗宫颈癌产品的活性成分可为上述生物材料，具体可为所述重组腺病毒。
以HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因或其相关生物材料为活性成分的下述N1）或N2）也属于本发明的保护范围：
N1）抑制宫颈癌细胞（生长）的产品（如疫苗或药物）；
N2）预防和/或治疗宫颈癌产品（如疫苗或药物）。
N1）或N2）中，所述活性成分可为所述重组腺病毒。
下述c）或d）所示的HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因编码的蛋白质也属于本发明的保护范围。
c）氨基酸序列是SEQ ID No.3所示的蛋白质（HPV18-E6E7-4基因编码的蛋白质）；
d）氨基酸序列是SEQ ID No.4所示的蛋白质（HPV18-E6E7-3基因编码的蛋白质）。
上述生物材料中，B2）所述表达盒，是指能够在宿主细胞中表达HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因的DNA，该DNA不但可包括启动HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因转录的启动子，还可包括终止HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
在本发明的一个实施方式中，含有HPV18-E6E7-4基因的表达盒包括的启动 HPV18-E6E7-4基因转录的启动子为CMV启动子，含有该HPV18-E6E7-4基因的表达盒的重组载体是pcDNA-HPV18-E6E7-4（用SEQ ID No.1所示的HPV18-E6E7-4基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-HPV18-E6E7-4）。在本发明的另一个实施方式中，含有HPV18-E6E7-4基因的表达盒包括的启动HPV18-E6E7-4基因转录的启动子为来自小鼠CMV病毒的立早启动子，终止HPV18-E6E7-4基因转录的终止子为来自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信号（请指明pDC315-HPV18-E6E7-4中的启动子和终止子名称），含有该HPV18-E6E7-4基因的表达盒的重组载体是pDC315-HPV18-E6E7-4（用SEQ ID No.1所示的HPV18-E6E7-4基因替换pDC315的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒）。
在本发明的一个实施方式中，含有HPV18-E6E7-3基因的表达盒包括的启动HPV18-E6E7-3基因转录的启动子为CMV启动子，含有该HPV18-E6E7-3基因的表达盒的重组载体是pcDNA-HPV18-E6E7-3（用SEQ ID No.2所示的HPV18-E6E7-3基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-HPV18-E6E7-3）。在本发明的另一个实施方式中，含有HPV18-E6E7-3基因的表达盒包括的启动HPV18-E6E7-3基因转录的启动子为来自小鼠CMV病毒的立早启动子，终止HPV18-E6E7-3基因转录的终止子为来自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信号（请指明pDC315-HPV18-E6E7-3中的启动子和终止子名称），含有该HPV18-E6E7-3基因的表达盒的重组载体是pDC315-HPV18-E6E7-3（用SEQ ID No.2所示的HPV18-E6E7-3基因替换pDC315的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒）。
上述生物材料中，所述重组微生物具体可为病毒、酵母，细菌，藻和真菌。所述转基因动物细胞系不包括动物的繁殖材料。
在本发明的一个具体实施方式中，所述重组微生物为含有HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因的重组腺病毒。
所述重组腺病毒具体可为将含有HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因的的重组载体和腺病毒骨架载体共转染腺病毒包装细胞，包装得到的重组腺病毒；所述含有HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因的重组载体具体可为将HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因的插入pDC315的多克隆位点得到的重组载体，如上述pDC315-HPV18-E6E7-4或pDC315-HPV18-E6E7-3。
所述腺病毒骨架载体可为pBH Glox△E1\3cre，所述腺病毒包装细胞可为HEK293细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述重组腺病毒是培养重组细胞得到的重组腺病毒，所述重组细胞是将HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因插入pDC315的多克隆位点得到的重组载体（如pDC315-HPV18-E6E7-4或pDC315-HPV18-E6E7-3）和腺病毒 骨架载体pBH Glox△E1\3cre共转染HEK293细胞得到的重组细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述宫颈癌细胞为宫颈癌TC-1细胞。
由于野生型的HPV18E6和E7基因为癌基因，直接应用于疫苗设计有潜在的危险性。本发明在保证HPV18E6和E7融合基因高表达于哺乳动物细胞的同时，为了保证疫苗的安全性，对野生型HPV18的E6和E7基因进行突变以消除其致癌性。实验证明，HPV18-E6E7-4基因或HPV18-E6E7-3基因不但高表达于哺乳动物细胞，而且不具有致瘤性，具有生物安全性，还可有效地预防和治疗宫颈癌。
附图说明
图1显示的是使用Western Blot检测重组质粒pcDNA-HPV18-E6E7-1、pcDNA-HPV18-E6E7-2、pcDNA-HPV18-E6E7-3和pcDNA-HPV18-E6E7-4在293FT细胞瞬时表达融合蛋白。其中泳道1是pcDNA-HPV18-E6E7-1质粒转染的293FT细胞的裂解物，泳道2是对应pcDNA-HPV18-E6E7-1的未优化野生融合pcDNA-wHPV18-E6E7-1质粒转染的293FT细胞的裂解物，泳道3是pcDNA-HPV18-E6E7-2质粒转染的293FT细胞的裂解物，泳道4是pcDNA-HPV18-E6E7-3质粒转染的293FT细胞的裂解物，泳道5是pcDNA-HPV18-E6E7-4质粒转染的293FT细胞的裂解物,泳道6是野生pcDNA-wHPV18-E6E7-2质粒转染的293FT细胞的裂解物，泳道7是野生pcDNA-wHPV18-E6E7-3质粒转染的293FT细胞的裂解物，泳道8是野生pcDNA-wHPV18-E6E7-4质粒转染的293FT细胞的裂解物。泳道9是293FT细胞的裂解物（阴性对照）。
图2显示的是从DNA水平鉴定稳定表达的细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4。其中泳道1是DNA MarkerDL6000，泳道2是NIH3T3细胞的基因组DNA（阴性对照），泳道3是3T3-HPV18-E6E7-1细胞的基因组DNA，泳道4是3T3-HPV18-E6E7-2细胞的基因组DNA，泳道5是3T3-HPV18-E6E7-3细胞的基因组DNA，泳道6是3T3-HPV18-E6E7-4细胞的基因组DNA。
图3显示的是从RNA水平鉴定稳定表达的细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4。其中泳道1是DNA Marker DL6000，泳道2是NIH3T3细胞的总RNA（阴性对照），泳道3是3T3-HPV18-E6E7-1细胞的总RNA，泳道4是3T3-HPV18-E6E7-2细胞的总RNA，泳道5是3T3-HPV18-E6E7-3细胞的总RNA，泳道6是3T3-HPV18-E6E7-4细胞的总RNA。
图4显示的是使用免疫荧光技术检测细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4表达融合蛋白。其中1是NIH3T3细胞（阴性对照），2是3T3-HPV18-E6E7-1细胞，3是3T3-HPV18-E6E7-2细胞，4是3T3-HPV18-E6E7-3细胞，5是3T3-HPV18-E6E7-4细胞。
图5显示的是稳定表达的细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3、3T3-HPV18-E6E7-4以及NIH3T3细胞（阴性对照）在软琼脂中集落的形成情况。其中1是NIH3T3细胞在软琼脂中集落形成情况，2是3T3-HPV18-E6E7-1细胞在软琼脂中集落形成情况，3是3T3-HPV18-E6E7-2细胞在软琼脂中集落形成情况，4是3T3-HPV18-E6E7-3细胞在软琼脂中集落形成情况，5是3T3-HPV18-E6E7-4细胞在软琼脂中集落形成情况。
图6显示的是稳定表达的细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3、3T3-HPV18-E6E7-4以及NIH3T3细胞（阴性对照）对BALB/c裸鼠的致瘤情况。其中1是3T3-HPV18-E6E7-1细胞在裸鼠中的致瘤情况，2是3T3-HPV18-E6E7-2细胞在裸鼠中的致瘤情况，3是3T3-HPV18-E6E7-3细胞在裸鼠中的致瘤情况，4是3T3-HPV18-E6E7-4细胞在裸鼠中的致瘤情况，5是NIH3T3细胞在裸鼠中的致瘤情况。
图7A显示的是3T3-HPV18-E6E7-1细胞在裸鼠中形成的肿瘤的切片，显示所形成的是纤维瘤或纤维肉瘤。
图7B显示的是3T3-HPV18-E6E7-2细胞在裸鼠中形成的肿瘤的切片，显示所形成的是纤维瘤或纤维肉瘤。
图8显示的是pDC315-HPV18-E6E7-3和pDC315-HPV18-E6E7-4双酶切电泳鉴定结果。其中泳道1是DNA Marker DL6000，泳道2是pDC315-HPV18-E6E7-3的EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切产物，泳道3是pDC315-HPV18-E6E7-4的EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切产物。
图9为重组腺病毒作为治疗性疫苗对肿瘤的抑制作用的结果。
图10为重组腺病毒作为预防性疫苗对肿瘤的抑制作用的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
材料和方法
采用Primer，DNAMAN软件进行引物设计及分析，引物合成及基因测序由上海生物工程有限公司和上海英骏生物技术公司完成。克隆鉴定使用质粒pGEM-T购自Promega公司。G418、质粒转化真核细胞时所用的转染试剂Lipofectamine2000、DMEM培养基、进口胎牛血清、胰酶购自Invitrogen公司。限制性内切酶EcoRⅠ﹑BamH I，PCR反应使用的DNA聚合酶Taq、连接DNA片段使用的T4DNA连接酶、DNA Marker、DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0以及DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒等均购自大连宝生物工程 有限公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞，细胞基因组DNA小量提取试剂盒，Reverse Transcription Kit（M-MLV），质粒提取试剂盒，软琼脂Sofe Agarose、青链霉素溶液、L-谷氨酰胺溶液均购自北京庄盟生物技术有限公司。QIAGEN Plasmid Midi Purification Kit购自德国Qiaqen公司。蛋白胨、酵母提取物、琼脂粉、琼脂糖等购自北京欣经科公司。彩虹蛋白Marker购自Promega公司。其它分析纯试剂购自国药集团化学试剂有限公司。羊抗HPV18E6单抗、鼠抗HPV18E7多抗购自Santa cruz biotechnology公司。C57BL/6小鼠购自中国医学科学院实验动物所。pDC315质粒：来自加拿大Microbix Biosystems Inc.公司销售的Admax kitD(PD-01-64)。骨架质粒pBH Glox△E1\3cre：来自加拿大Microbix Biosystems Inc.公司销售的Admax kitD(PD-01-64)。HEK293细胞：购买自美国ATCC（CRL-1573）。小鼠宫颈癌TC-1细胞（Treatment of Established Tumors with a Novel Vaccine That Enhances Major Histocompatibility Class II Presentation of Tumor Antigen,1996,Cancer research），由约翰霍普金斯大学的Tzyy-Choou Wu教授惠赠；公众可从北京工业大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
pcDNA3.1(+)（Xia Cui,etal.Toxoplasma gondii immune mapped protein-1(TgIMP1)is a novel vaccine candidate against toxoplasmosis.Vaccine30(2012)2282–2287）公众可从北京工业大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
人胚肾细胞-293FT细胞（美国ATCC）。NIH3T3细胞（美国ATCC）。
本发明所涉及到的分子生物学相关技术如核酸分子克隆技术，蛋白质表达检测等在科学文献中都已经有充分的描述（如参见J.萨姆布鲁克、E.F弗里奇、T.曼尼要蒂斯，分子克隆实验指南（第二版））。涉及到各种试剂盒的具体操作，按照其相应说明书进行。
实施例1、消除野生型HPV18E6E7融合蛋白的致癌性并在哺乳动物细胞中高表达的野生型HPV18E6E7蛋白突变体及其编码基因的制备
1、野生型HPV18E6E7蛋白突变体编码基因的制备
为了提高HPV18E6E7基因在哺乳动物细胞特别是人类细胞中的表达，本实施例对野生型HPV18E6E7基因进行密码子优化，得到密码子优化型HPV18E6E7融合基因，命名为HPV18-E6E7-1基因。
为了消除野生型HPV18E6E7蛋白（命名为wHPV18-E6E7-1）的潜在致癌性，对wHPV18-E6E7-1基因编码的氨基酸序列包括下列位点突变：E6蛋白的第52位和第138位氨基酸分别由亮氨酸和半胱氨酸突变为甘氨酸（L52G和C138G）和E7蛋白第27位 和第98位都由半氨酸突变为甘氨酸（C27G和C98G）。有选择地只突变E6第52位氨基酸和同时突变E7第27位氨基酸（即L52G和C27G），或有选择地只突变E6第138位氨基酸和同时突变E7第98位氨基酸（即C138G和C98G），或有选择地只突变E6第52位氨基酸和同时突变E7第98位氨基酸（即C52G和C98G）。具体的野生型HPV18E6E7蛋白突变体分别为HPV18-E6E7-2、HPV18-E6E7-3和HPV18-E6E7-4，具体的蛋白突变位点如表1所示。本实施例共制备三种定点诱变或的密码子优化融合基因：1）突变E6蛋白的第52位（L52G）和E7蛋白第27位（C27G），命名为HPV18-E6E7-2；2）突变E6蛋白第138位（C138G）和E7蛋白的第98位（C98G），命名为HPV18-E6E7-3；3）突变E6蛋白的第52位（L52G）和E7蛋白的第98位（C98G），命名为HPV18-E6E7-4。
表1、HPV18E6E7基因定点突变设计
| 名称 | 突变位点 |
| HPV18-E6E7-2 | E6/52｛L亮氨酸-G甘氨酸｝，E7/27｛C半胱氨酸-G甘氨酸｝ |
| HPV18-E6E7-3 | E6/138｛C/半胱氨酸-G甘氨酸｝,E7/98｛C/半胱氨酸-G甘氨酸｝ |
| HPV18-E6E7-4 | E6/52｛L亮氨酸-G甘氨酸｝，E7/98｛C/半胱氨酸-G甘氨酸｝ |
合成SEQ ID No.5所示的wHPV18-E6E7-1（野生型HPV18E6E7蛋白）基因，其编码序列是SEQ ID No.5的第15-806位所示，编码SEQ ID No.6的蛋白质wHPV18-E6E7-1（野生型HPV18E6E7蛋白）。
合成SEQ ID No.7所示的HPV18-E6E7-1基因，其编码序列是SEQ ID No.7的第15-806位所示，编码SEQ ID No.6的蛋白质wHPV18-E6E7-1（野生型HPV18E6E7蛋白）。
合成SEQ ID No.1所示的HPV18-E6E7-4基因，其编码序列是SEQ ID No.1的第15-806位所示，编码SEQ ID No.3的蛋白质HPV18-E6E7-4。HPV18-E6E7-4是将wHPV18-E6E7-1的第52位氨基酸残基由Leu取代为Gly和将wHPV18-E6E7-1的第256位氨基酸残基由Cys取代为Gly，其它氨基酸残基不变得到的野生型HPV18E6E7蛋白突变体。
合成SEQ ID No.2所示的HPV18-E6E7-3基因，其编码序列是SEQ ID No.2的第15-806位所示，编码SEQ ID No.4的蛋白质HPV18-E6E7-3。HPV18-E6E7-3是将wHPV18-E6E7-1的第138位氨基酸残基由Cys取代为Gly和将wHPV18-E6E7-1的第256位氨基酸残基由Cys取代为Gly，其它氨基酸残基不变得到的野生型HPV18E6E7蛋白突变体。
合成HPV18-E6E7-2基因，其全长为816bp，除将SEQ ID No.1的第567-569位由tgc替换为gga、将SEQ ID No.1的第780-782位由gga替换为tgc外，其它核苷酸与SEQ ID No.1的其它核苷酸完全相同。HPV18-E6E7-2基因编码的蛋白质HPV18-E6E7-2 的氨基酸序列由263个氨基酸残基组成，除将SEQ ID No.3的第185位氨基酸残基由Cys取代为Gly和将SEQ ID No.3的第256位氨基酸残基由Gly取代为Cys，其它氨基酸残基与SEQ ID No.3的其它氨基酸残基完全相同。
合成HPV18-E6E7-2的野生型基因wHPV18-E6E7-2基因，其全长为816bp，除将SEQID No.5的第168-170位由tta（Leu的密码子）替换为gga（Gly密码子）和将SEQ ID No.5的第567-569位由tgt（Cys的密码子）替换为gga（Gly密码子），其它核苷酸与SEQ ID No.5的其它核苷酸完全相同。
合成HPV18-E6E7-3的野生型基因wHPV18-E6E7-3基因，其全长为816bp，除将SEQ ID No.5的第426-428位由tgc（Cys的密码子）替换为gga（Gly密码子）、将SEQ ID No.5的第780-782位由tgt（Cys的密码子）替换为gga（Gly密码子），其它核苷酸与SEQ ID No.5的其它核苷酸完全相同。
合成HPV18-E6E7-4的野生型基因wHPV18-E6E7-4基因，其全长为816bp，除将SEQ ID No.5的第168-170位由tta（Leu的密码子）替换为gga（Gly密码子）和将SEQ ID No.5的第780-782位由tgt（Cys的密码子）替换为gga（Gly密码子），其它核苷酸与SEQ ID No.5的其它核苷酸完全相同。
将上述HPV18-E6E7-1基因、HPV18-E6E7-2基因、HPV18-E6E7-3基因、HPV18-E6E7-4基因、wHPV18-E6E7-1基因、wHPV18-E6E7-2基因、wHPV18-E6E7-3基因和wHPV18-E6E7-4基因这8个基因中的每个基因分别单独与pGEM-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选带有目的基因片段的转化子，分别提取重组质粒。对质粒进行BamH I和EcoR I双酶切鉴定。将双酶切鉴定正确的阳性克隆再次进行测序鉴定。将测序结果表明含有HPV18-E6E7-1基因的重组质粒命名为pGEM-HPV18-E6E7-1，将测序结果表明含有HPV18-E6E7-2基因的重组质粒命名为pGEM-HPV18-E6E7-2，将测序结果表明含有HPV18-E6E7-3基因的重组质粒命名为pGEM-HPV18-E6E7-3，将测序结果表明含有HPV18-E6E7-4基因的重组质粒命名为pGEM-HPV18-E6E7-4，将测序结果表明含有wHPV18-E6E7-1基因的重组质粒命名为pGEM-wHPV18-E6E7-1，将测序结果表明含有wHPV18-E6E7-2基因的重组质粒命名为pGEM-wHPV18-E6E7-2，将测序结果表明含有wHPV18-E6E7-3基因的重组质粒命名为pGEM-wHPV18-E6E7-3，将测序结果表明含有wHPV18-E6E7-4基因的重组质粒命名为pGEM-wHPV18-E6E7-4。
2、HPV18E6E7及蛋白突变体的表达
2.1、野生型HPV18E6E7蛋白及其突变体表达质粒的构建
分别以步骤1的pGEM-HPV18-E6E7-1、pGEM-HPV18-E6E7-2、pGEM-HPV18-E6E7-3、pGEM-HPV18-E6E7-4、pGEM-wHPV18-E6E7-1、pGEM-wHPV18-E6E7-2、pGEM-wHPV18-E6E7-3和pGEM-wHPV18-E6E7-4这8个质粒中的每个质粒为模板，使用引物1：
5'-aaggatccgccaccatg-3'和引物2：5'-CCGGAATTCTTCACTGCTGG-3'分别扩增HPV18-E6E7-1基因、HPV18-E6E7-2基因、HPV18-E6E7-3基因、HPV18-E6E7-4基因、wHPV18-E6E7-1基因、wHPV18-E6E7-2基因、wHPV18-E6E7-3基因和wHPV18-E6E7-4基因。PCR产物用DNA Fragment Purification Kit试剂盒进行纯化。
PCR产物HPV18-E6E7-1基因、HPV18-E6E7-2基因、HPV18-E6E7-3基因、HPV18-E6E7-4基因、wHPV18-E6E7-1基因、wHPV18-E6E7-2基因、wHPV18-E6E7-3基因和wHPV18-E6E7-4基因分别进行BamH I和EcoR I双酶切，酶切产物纯化后分别连接同样进行双酶切的pcDNA3.1(+)质粒，转化DH5α感受态细胞，用酶切鉴定法挑选阳性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，将测序结果表明是用SEQ ID No.1所示的HPV18-E6E7-4基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-HPV18-E6E7-4，将测序结果表明是用SEQ ID No.2所示的HPV18-E6E7-3基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-HPV18-E6E7-3，将测序结果表明是用HPV18-E6E7-2基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-HPV18-E6E7-2，将测序结果表明是用HPV18-E6E7-1基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-HPV18-E6E7-1，将测序结果表明是用wHPV18-E6E7-4基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-wHPV18-E6E7-4，将测序结果表明是用wHPV18-E6E7-3基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-wHPV18-E6E7-3，将测序结果表明是用wHPV18-E6E7-2基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-wHPV18-E6E7-2，将测序结果表明是用wHPV18-E6E7-1基因替换pcDNA3.1(+)的BamH I和EcoR I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pcDNA-wHPV18-E6E7-1。
2.2、野生型HPV18E6E7蛋白及其突变体的瞬时表达
使用Western Blot检测野生型HPV18E6E7蛋白及其突变体在293FT细胞中的表达，方法如下所述：
用QIAGEN Plasmid Midi Purification Kit质粒纯化试剂盒分别纯化pcDNA-HPV18-E6E7-4、pcDNA-HPV18-E6E7-3、pcDNA-HPV18-E6E7-2、pcDNA-HPV18-E6E7-1、pcDNA-wHPV18-E6E7-4、pcDNA-wHPV18-E6E7-3、pcDNA-wHPV18-E6E7-2、pcDNA-wHPV18-E6E7-1。将这8个重组质粒中的每个重组质粒分别使用脂质体法转染293FT细胞，转染方法按Lipofectamine2000使用说明书进行操作。转染48小时后裂解所转染细胞，将裂解液与适当的5×SDS上样缓冲液混匀后进行SDS聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），其中浓缩胶为5%，分离胶为12%，在110V 条件下电泳1.5小时。电泳结束后，采用半干转恒流将蛋白转至硝酸纤维素膜（电流大小为1mA/cm2膜面积，约45min），将膜置于含有5%脱脂奶粉的PBS中室温摇床封闭2h；弃封闭液，加入1:200的羊抗HPV18E6单抗（Santa Cruz,USA）室温摇床孵育1.5h；以含有0.05%Tween-20的PBS洗膜3次，每次10min；加入1:10000稀释的鼠抗羊IgG抗体(Rockland,Pennsylvania,USA)室温摇床孵育45min；以含有0.05%Tween-20的PBS洗膜3次，每次10min；将膜置于PBS中，Odssey远红外影像分析仪扫膜。该Western blot免疫印迹实验中，以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）为内参。检测GAPDH的一抗为兔抗GAPDH单克隆抗体（Bioworld,Minnesota,USA），二抗为羊抗兔IgG抗体(Rockland,Pennsylvania,USA)。
结果如图1所示，结果表明：HPV18-E6E7-1基因、HPV18-E6E7-2基因、HPV18-E6E7-3基因和HPV18-E6E7-4基因都可以在293FT中表达出与理论值大小相同的36KD大小的目的蛋白，与野生型wHPV18-E6E7-1基因相比，HPV18-E6E7-1基因的平均表达量是野生型wHPV18-E6E7-1基因的10倍，HPV18-E6E7-2基因的平均表达量是野生型wHPV18-E6E7-1基因的20倍，HPV18-E6E7-3基因的平均表达量是野生型wHPV18-E6E7-1基因的15倍，HPV18-E6E7-4基因的表达量是野生型wHPV18-E6E7-1基因的15倍。其中，HPV18-E6E7-2基因的平均表达量是野生型wHPV18-E6E7-2基因的20倍，HPV18-E6E7-3基因的平均表达量是野生型wHPV18-E6E7-3基因的20倍，HPV18-E6E7-4基因的表达量是野生型wHPV18-E6E7-4基因的20倍。
说明密码子优化的HPV18E6E7各融合基因在293FT中表达量的到非常显著的提高，从而说明基因优化后对重组HPV18E6E7基因在哺乳动物细胞中表达效果提高显著有效。
2.3、野生型HPV18E6E7蛋白突变体的稳定表达
该步骤所用的细胞培养体系包括：DMEM培养基、进口胎牛血清、胰酶、L-谷氨酰胺、丙酮酸盐和非必需氨基酸均购自Invitrogen公司；青链霉素溶液、3%谷氨酰胺溶液均由病毒药理室配制；25cm2和75cm2细胞培养瓶，移液管等购自美国的Corning公司。
用QIAGEN Plasmid Midi Purification Kit质粒纯化试剂盒分别纯化pcDNA-HPV18-E6E7-4、pcDNA-HPV18-E6E7-3、pcDNA-HPV18-E6E7-2、pcDNA-HPV18-E6E7-1。将这4个重组质粒分别使用脂质体法转染NIH3T3细胞，转染方法按Lipofectamine2000使用说明书进行操作。转染24h时将细胞按1:20传代于一新的六孔板中，每种转染的细胞传6孔，继续培养至48h时换为含500μg/ml G418的细胞培养液培养。此后每隔2天补充一次G418至终浓度为500μg/ml，连续培养三周后换为含300μg/ml G418的细胞培养液，继续培养至第四周(共28天)，此时各组 均可见抗性细胞克隆的形成。将pcDNA-HPV18-E6E7-4转染NIH3T3细胞得到的抗性细胞克隆命名为3T3-HPV18-E6E7-4，将pcDNA-HPV18-E6E7-3转染NIH3T3细胞得到的抗性细胞克隆命名为3T3-HPV18-E6E7-3，将pcDNA-HPV18-E6E7-2转染NIH3T3细胞得到的抗性细胞克隆命名为3T3-HPV18-E6E7-2，将pcDNA-HPV18-E6E7-1转染NIH3T3细胞得到的抗性细胞克隆命名为3T3-HPV18-E6E7-1。显微镜下观察细胞克隆生长情况，并标记其位置。每组各挑取5个细胞克隆，吸取转移到24孔板中进行扩大培养。
使用细胞基因组DNA小量提取试剂盒分别提取细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4的基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用引物1：5'-cggaattcgccaccatggccagat-3'和引物2：5'-CCATATGTTCACTGCTGGCTGGC-3'分别扩HPV18-E6E7-1、HPV18-E6E7-2、HPV18-E6E7-3和HPV18-E6E7-4基因。PCR产物用DNA Fragment Purification Kit试剂盒进行纯化。进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2，细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4中均扩增出了750-1000bp的条带。说明从DNA水平来看，筛选出了正确的细胞克隆。
筛选出的细胞克隆进一步从RNA水平进行鉴定，使用mirVana miRNA Isolation kit分别提取细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4的总RNA，用Reverse Transcription Kit（M-MLV）进行分转录合成cDNA第一链，以合成的cDNA为模板，使用引物1：5'-cggaattcgccaccatggccagat-3'和引物2：5'-CCATATGTTCACTGCTGGCTGGC-3'分别扩增HPV18-E6E7-1、HPV18-E6E7-2、HPV18-E6E7-3和HPV18-E6E7-4基因。PCR仪上进行如下反应：95℃5分钟（1个循环）；95℃30秒，58℃30秒，72℃45秒（30个循环）；72℃10分钟。PCR产物用DNA Fragment Purification Kit试剂盒进行纯化。进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图3，细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4中均扩增出了750-1000bp的条带。说明从RNA水平来看，细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4都转录了HPV18E6E7基因。
筛选出的细胞克隆进一步从蛋白质水平进行鉴定，应用免疫荧光法。将细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4以及NIH3T3细胞传代到96孔板。吸弃细胞培养液，用37℃预热的1×PBS清洗细胞表面两次，依次加入37℃预热的4%多聚甲醛37℃放置20min、0.2%Triton X-100室温放置20min、0.1%BSA室温封闭30min、1:50的鼠抗HPV18E7多抗湿盒中室温放置1h、1:12的FITC标记的羊抗小鼠IgG37℃，避光放置30min。最后加入1×PBS，在荧光显微镜下观察，结果如图4。免疫荧光检测结果表明，筛选出的细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、 3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4中均有荧光信号，均表达出相应的HPV18E6E7融合蛋白。
3、野生型HPV18E6E7蛋白突变体的致癌性
3.1软琼脂集落形成实验
为检测优化型重组基因的安全性，对经密码子优化的重组HPV18E6E7基因进行软琼脂集落形成实验。
制备1.2%的底层琼脂糖溶液，消化离心并收集2.3的细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4和NIH3T3细胞（阴性对照）于含20%小牛血清的2×DMEM细胞培养液中。与等量的在40℃水浴的0.7%的琼脂混匀，快速加入到六孔板中，1ml/孔，使每孔最终的细胞数为1500个，每种细胞接种三个孔，常温下自然凝固后置于37℃、5%CO2孵箱中培养，连续培养21天，细胞系在软琼脂中形成的集落如图5。结果表明：3T3-HPV18-E6E7-1细胞和3T3-HPV18-E6E7-2具有在软琼脂上形成克隆的能力，而3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4没有在软琼脂上形成克隆的能力，没有表现出恶性转化的性质。说明密码子优化的野生型HPV18E6E7蛋白的编码基因HPV18-E6E7-1基因对NIH3T3细胞具有转化作用，并且HPV18-E6E7-2基因仍存在致癌性。而HPV18-E6E7-3和HPV18-E6E7-4基因消除了潜在致癌性，有良好的生物安全性。
3.2裸鼠致瘤实验
为进一步检测优化型重组基因的安全性，对经密码子优化的重组HPV18E6E7基因进行裸鼠致瘤实验。
收集2.3的细胞克隆3T3-HPV18-E6E7-1、3T3-HPV18-E6E7-2、3T3-HPV18-E6E7-3、3T3-HPV18-E6E7-4和NIH3T3细胞（阴性对照），1×PBS清洗三次，调整细胞浓度接种于BALB/c裸鼠右前肢腋下皮下，1×106个细胞/鼠，每组5只BALB/c裸鼠，培养25天后，观察有无移植瘤的形成，如图6。结果表明：在动物实验中，3T3-HPV18-E6E7-1和3T3-HPV18-E6E7-2对5只BALB/c裸鼠均具有致瘤能力，而3T3-HPV18-E6E7-3和3T3-HPV18-E6E7-4对5只BALB/c裸鼠均具没有致瘤能力。取出裸鼠的肿瘤组织，HE染色镜检并照相，如图7A和图7B。HE染色后显微镜下可见：3T3-HPV18-E6E7-1的肿瘤切片细胞富集区可见大量的梭型细胞，胞质窄至丰富，瘤细胞呈束状，核成杆状或椭圆状，大小不等，核内染色质粗糙分布不均匀，有较明显的异型性，鉴定为纤维瘤或纤维肉瘤。3T3-HPV18-E6E7-2的肿瘤切片瘤细胞圆形呈弥漫状分布，核大小不等，染色不均，核仁清楚，具有较明显的异性性，并可见巨核细胞和多核细胞，鉴定为纤维肉瘤。
实施例2、预防和治疗宫颈癌的疫苗
本实施例提供了两种预防和治疗宫颈癌的疫苗，名称分别为E6E7-3和E6E7-4。E6E7-3的活性成分是重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3。E6E7-4的活性成分是重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4。
重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3是将含有实施例1的HPV18-E6E7-3基因的重组载体和腺病毒骨架载体共转染腺病毒包装细胞，包装得到的重组腺病毒；该含有实施例1的HPV18-E6E7-3基因的重组载体是将实施例1的HPV18-E6E7-3基因插入pDC315的多克隆位点得到的重组载体pDC315-HPV18-E6E7-3。该腺病毒骨架载体是pBH Glox△E1\3cre。
重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4是将含有实施例1的HPV18-E6E7-4基因的重组载体和腺病毒骨架载体共转染腺病毒包装细胞，包装得到的重组腺病毒；该含有实施例1的HPV18-E6E7-4基因的重组载体是将实施例1的HPV18-E6E7-4基因插入pDC315的多克隆位点得到的重组载体pDC315-HPV18-E6E7-4。该腺病毒骨架载体是pBH Glox△E1\3cre。
1、重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3和重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4的具体制备方法如下：
1.1用于腺病毒包装的重组表达质粒的构建
本实施例分别以实施例1的pGEM-HPV18-E6E7-3和pGEM-HPV18-E6E7-4为模板，使用引物1：5'-cggaattcgccaccatggccagat-3'和引物2：5'-CGGGATCCTTCACTGCTGGCTGG-3'分别PCR扩增HPV18-E6E7-3基因和HPV18-E6E7-4基因。PCR产物用DNA Fragment Purification Kit试剂盒进行纯化。PCR产物HPV18-E6E7-3基因和HPV18-E6E7-4基因分别进行EcoR I和BamH I双酶切，酶切产物纯化后连接同样进行双酶切的pDC315质粒，转化DH5α感受态细胞，用EcoR I和BamH I酶切鉴定法挑选阳性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行测序验证，将测序结果表明是用SEQ ID No.1所示的HPV18-E6E7-4基因替换pDC315的EcoR I和BamH I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pDC315-HPV18-E6E7-4，将测序结果表明是用SEQ ID No.2所示的HPV18-E6E7-3基因替换pDC315的EcoR I和BamH I识别位点间的片段得到的重组质粒命名为pDC315-HPV18-E6E7-3。pDC315-HPV18-E6E7-3和pDC315-HPV18-E6E7-4的酶切鉴定结果如图8所示。
1.2制备重组腺病毒
1.2.1、将重组质粒pDC315-HPV18-E6E7-3与骨架质粒pBH Glox△E1\3cre按照摩尔比1：1混合，借助转染试剂Lipofectamine2000转染6孔板中的HEK293细胞（配比为4ug质粒DNA：12ul转染试剂）。
1.2.2、约2周后除去细胞培养液，用PBS缓冲液收获细胞。
1.2.3、将收获的溶于PBS的细胞使用-70℃冰箱和37℃水浴锅反复冻融3-5次，得到原代病毒液。
1.2.4、用原代病毒液感染新的HEK293细胞，在发生细胞病变效应（CPE）时收获病毒，重复几次（用病毒液感染新的HEK293细胞），扩大病毒量和提高病毒滴度，得到重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3的病毒液（粗制腺病毒）。
用pDC315-HPV18-E6E7-4质粒代替重组质粒pDC315-HPV18-E6E7-3，进行步骤1.2.1至1.2.4，得到重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4的病毒液（粗制腺病毒）。
用pDC315质粒代替重组质粒pDC315-HPV18-E6E7-3，进行步骤1.2.1至1.2.4，得到重组腺病毒rAd-pDC315的病毒液（粗制腺病毒），作为对照。
1.3纯化包装的重组腺病毒
将步骤1.2收获的粗制腺病毒，用氯化铯不连续密度梯度法进行纯化以除掉其中混杂的细胞碎片和其他生物大分子，离心完毕后吸去乳白色的腺病毒层。由于离心后回收腺病毒液时会吸入氯化铯，因此还需除去腺病毒液中的氯化铯。将离心后的病毒液加入到100KD的超滤管中，再补加足量的PBS缓冲液，离心除去含氯化铯的液体，反复2次后剩下的即为纯化的腺病毒。按照下述方法得到纯化的重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3病毒液、纯化的重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4病毒液和纯化的重组腺病毒rAd-pDC315病毒液。
1.3.1、在离心管下层加入4M的氯化铯7ml（67g CsCl溶于100ml10mM HEPES，pH7.4），中间加上2.2M的氯化铯10ml（38g CsCl溶于100ml10mM HEPES，pH7.4；10mM HEPES：1.3g HEPES溶于500ml双蒸水），上面加入20ml步骤1.2得到的重组腺病毒的病毒液。
1.3.2、4℃下100 000g离心12小时，中间形成的一层乳白色的腺病毒层，用注射器收集该乳白色的腺病毒层。
1.3.3、收集的腺病毒液加入到100KD的超滤管中，2500rpm离心30分钟。
1.3.4、加入足量的PBS缓冲液，2500rpm离心30分钟，重复2次。
1.3.5、加入含10%甘油的PBS缓冲液，即为纯化后重组腺病毒的病毒液，-70℃保存。
1.4、测定纯化后重组腺病毒的病毒液的滴度
利用CELL BIOLABS,INC.公司的QuickTiter Adenovirus Titer Immunoassay Kit试剂盒测定1.3的纯化后重组腺病毒的病毒液的滴度，具体操作步骤如下：
1.4.1、按照2.5×105细胞/孔的量将HEK293细胞铺于24孔板，1ml/孔，于37℃，5%CO2恒温培养箱孵育1h。
1.4.2、将1.3的纯化后重组腺病毒的病毒液分别用培养基做10倍比稀释，并将稀 释后的病毒样品按照100ul/孔的用量加入24孔板。
1.4.3、于37℃，5%CO2恒温培养箱孵育2天。
1.4.4、缓慢去除孔内培养基，每孔加入0.5ml预冷的甲醇，-20℃孵育20min，固定HEK293细胞。
1.4.5、用1×PBS缓冲液洗固定好的细胞三次，5min/次。
1.4.6、每孔加入适量含有1%BSA的PBS缓冲液，置于摇床上室温封闭1h。
1.4.7、每孔加入0.25ml1×anti-Hexon antibody，置于摇床上室温孵育1h。
1.4.8、用1×PBS缓冲液洗固定好的细胞三次，5min/次。
1.4.9、每孔加入0.25ml1×二抗（HRP-conjugated），置于摇床上室温孵育1h。
1.4.10、用1×PBS缓冲液洗固定好的细胞五次，5min/次。
1.4.11、每孔加入0.25ml新鲜配制的1×DAB工作液，置于摇床上室温孵育10min。
1.4.12、吸除DAB，用1×PBS缓冲液洗涤两次，并将每孔加入1ml1×PBS缓冲液。
1.4.13、光镜下，10倍镜对阳性细胞（棕色）计数，每孔至少计5个视野。
1.4.14、计算每孔的阳性细胞平均数以及病毒滴度。
病毒滴度=（每个视野平均阳性细胞数×每个孔的视野数×稀释倍数）/0.1；单位为pfu/ml。
2、重组腺病毒对肿瘤的抑制作用
2.1、重组腺病毒作为治疗性疫苗对肿瘤的抑制作用
实验动物为C57BL/6小鼠，雌性，4～6周龄。将实验动物随机分成三组（每组10只），即AAT（E6E7-3）组、AAT（E6E7-4）组和PPT组（对照组），分别进行如下处理：
AAT（E6E7-3）组：实验第1天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞（100ul），第2天进行初次免疫，第15天（2周）进行加强免疫。其中，初次免疫为：大腿肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3病毒液，加强免疫为：大腿再次肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3病毒液，每次免疫每只小鼠5×107pfu（100ul）。
AAT（E6E7-4组）：实验第1天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞（100ul），第2天进行初次免疫，第15天（2周）进行加强免疫。其中，初次免疫为：大腿肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4病毒液，加强免疫为：大腿再次肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4病毒液，每次免疫每只小鼠5×107pfu（100ul）。
PPT组：实验第1天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞（100ul），第2天进行初次免疫，第15天（2周）进行加强免疫。其中，初次免疫为： 大腿肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-pDC315病毒液，加强免疫为：大腿再次肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-pDC315病毒液，每次免疫每只小鼠5×107pfu（100ul）。
自注射TC-1肿瘤细胞开始，第8天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天测小鼠的肿瘤大小（以体积计，单位为立方厘米）。结果见图9（该组的平均值）。结果显示在注射TC-1肿瘤细胞的第42天，AAT（E6E7-3）组的肿瘤体积是18立方厘米，AAT（E6E7-4）组的肿瘤体积是23立方厘米，PPT组的肿瘤体积是30立方厘米，AAT（E6E7-3）组的肿瘤体积是PPT组的0.60倍，AAT（E6E7-4）组的肿瘤体积是PPT组的0.77倍。说明步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4和步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3对宫颈癌具有显著的治疗效果，且重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3对宫颈癌的治疗效果好于重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4。
2.2、重组腺病毒作为预防性疫苗对肿瘤的抑制作用
实验动物为C57BL/6小鼠，雌性，4～6周龄。将实验动物随机分成三组（每组10只），即TAA（E6E7-3）组、TAA（E6E7-4）组和TPP组（对照组），分别进行如下处理：
TAA（E6E7-3）组：实验第1天进行初次免疫，第14天（2周）进行加强免疫，第21天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞（100ul）。其中，初次免疫为：大腿肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3病毒液，加强免疫为：大腿再次肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3病毒液，每次免疫每只小鼠5×107pfu（100ul）。
TAA（E6E7-4）组：实验第1天进行初次免疫，第14天（2周）进行加强免疫，第21天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞（100ul）。其中，初次免疫为：大腿肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4病毒液，加强免疫为：大腿再次肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4病毒液，每次免疫每只小鼠5×107pfu（100ul）。
TPP组：实验第1天进行初次免疫，第14天（2周）进行加强免疫，第21天右侧腹股沟皮下注射TC-1肿瘤细胞，每只小鼠2×105个细胞（100ul）。其中，初次免疫为：大腿肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-pDC315病毒液，加强免疫为：大腿再次肌肉注射步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-pDC315病毒液，每次免疫每只小鼠5×107pfu（100ul）。
自注射TC-1肿瘤细胞开始，第8天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天测小鼠的肿瘤大小（以体积计，单位为立方厘米）。结果见图10（该组的平均值）。结果显示在注射TC-1肿瘤细胞的第42天，TAA（E6E7-3）组的肿瘤体积是15立方厘 米，TAA（E6E7-4）组的肿瘤体积是11立方厘米，TPP组的肿瘤体积是23立方厘米，TAA（E6E7-3）组的肿瘤体积是PPT组的0.65倍，TAA（E6E7-4）组的肿瘤体积是PPT组的0.48倍。说明步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4和步骤1.3纯化后重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3对宫颈癌具有显著的预防效果，且重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-4对宫颈癌的预防效果好于重组腺病毒rAd-HPV18omfE6E7-3。
Claims (6)
1.M1)至M3)中任一种用途：
M1)DNA分子在制备治疗宫颈癌产品中的应用；所述DNA分子为a)或b)：
a)编码序列是SEQ ID No.1的第15-806位所示的DNA分子；
b)编码序列是SEQ ID No.2的第15-806位所示的DNA分子；
M2)生物材料在制备治疗宫颈癌产品中的应用；所述生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：
B1)由DNA分子转录出的RNA分子；
B2)含有所述DNA分子的表达盒；
B3)含有所述DNA分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有所述DNA分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有所述DNA分子的转基因动物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；
其中，所述DNA分子为M1)中的所述DNA分子；
M3)蛋白质在制备治疗宫颈癌产品中的应用；所述蛋白质，为下述c)或d)：
c)氨基酸序列是SEQ ID No.3所示的蛋白质；
d)氨基酸序列是SEQ ID No.4所示的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：B4)所述重组微生物为含有M1)中的所述DNA分子的重组腺病毒。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述重组腺病毒是将含有所述DNA分子的重组载体和腺病毒骨架载体共转染腺病毒包装细胞，包装得到的重组腺病毒；所述重组载体是将所述DNA分子插入pDC315的多克隆位点得到的重组载体。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述腺病毒骨架载体是pBH Glox△E1\3cre。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述治疗宫颈癌产品的活性成分为所述重组腺病毒。
6.治疗宫颈癌产品，它的活性成分为权利要求2-4中任一所述的重组腺病毒。
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