CN112940084A

CN112940084A - 一种血清4型禽腺病毒亚单位疫苗及其应用

Info

Publication number: CN112940084A
Application number: CN202110230226.0A
Authority: CN
Inventors: 孟凯; 吴家强; 秦晓冰; 潘静; 徐胜男; 于江; 袁小远; 张玉霞; 杨金兴
Original assignee: Poultry Research Institute Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shandong Agricultural Seed Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2021-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-03-02
Also published as: CN112940084B

Abstract

本发明公开一种血清4型禽腺病毒亚单位疫苗及其应用，属于兽用生物制品技术领域，本发明利用杆状病毒表达系统高效表达血清4型禽腺病毒Fiber‑2蛋白，即在pFastBac^TMDual质粒的p10启动子和PH启动子之后插入含信号肽的Fiber‑2蛋白序列，使得优化的Fiber‑2蛋白能够实现分泌表达且表达量增加，表达的Fiber‑2蛋白保持了其原有的免疫原性。本发明使用昆虫细胞表达血清4型禽腺病毒Fiber‑2蛋白制备的亚单位疫苗，具有抗原表达量高，抗原稳定性高，纯度高，安全性好，免疫原性强，为工业化生产禽腺病毒亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

Description

一种血清4型禽腺病毒亚单位疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别是涉及一种血清4型禽腺病毒亚单位疫苗及其应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是一种全世界范围内流行的家禽和野禽常见的传染病病原。I亚群禽腺病毒分为A、B、C、D、E 5个种，12个血清型，其中8b型禽腺病毒(Fowl avianadenovirus serotype 8b，FAdV-8b)主要引起包涵体肝炎(Inclusion bodyhepatitis，IBH)，禽腺病毒4型(Fowl avianadenovirus serotype4，FAdV-4)主要是以鸡包涵体肝炎和心包内出现淡黄色透明液体为主要临床症状的鸡急性传染病，临床上又称为“鸡心包积水综合症(Hydropericardium-hepatitis syndrome，HHS)”。该病发病急，传播速度快，主要引起4～8周龄肉鸡感染，死亡率可达30％～70％。该病最早于巴基斯坦的安卡拉被报道，由此又称为“安卡拉病”。自2014年秋季后，我国HHS的病例逐渐增加，尤其是在山东省的肉杂鸡(817肉鸡)、柴鸡、商品蛋鸡等鸡群迅速蔓延。2015年6月之后，该病在中国大面积的爆发流行，给养禽业造成了巨大的经济损失。

FAdV-4对肉鸡有很高的致病性，而且已经扩散到亚洲、中美洲和南美洲的广大地区，以及一些欧洲国家。FAdV-4对养禽业造成的经济损失在持续快速的增长；因此，应对房屋和设备进行适当的消毒、通风以及限制家禽饲养员或访客的进入可能有助于防止疾病的发生。然而，目前来说，HHS的疫苗能够为免疫鸡提供广泛保护，并最大限度地减少直接经济损失；因此，它是控制HHS最根本的手段。

Fiber-2蛋白是FAdV-4的衣壳蛋白之一，研究证实Fiber-2蛋白具有很好的抗原性，能够有效刺激机体产生中和抗体。因此，用基因工程的方法制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)疫苗是控制该病的重要途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种血清4型禽腺病毒亚单位疫苗及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种抗原蛋白，所述抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供一种编码权利要求1所述抗原蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

本发明还提供一种包含所述基因的重组杆状病毒载体。

进一步地，在杆状病毒PH和/或P10启动子后插入权利要求2所述基因。

本发明还提供一种包含所述的重组杆状病毒载体的宿主细胞。

进一步地，所述宿主细胞选自昆虫细胞系的Sf9或High Five细胞。

本发明还提供一种血清4型禽腺病毒亚单位疫苗，所述疫苗包含所述抗原蛋白。

进一步地，所述疫苗还包含药学可接受的赋形剂和/或佐剂。

进一步地，所述佐剂是白油佐剂。

本发明还提供一种所述抗原蛋白、所述基因、所述重组杆状病毒载体在制备防治血清4型禽腺病毒引起的鸡心包积水综合症的药物中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明使用昆虫细胞SF9和High five重组表达禽腺病毒Fiber-2蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原表达量高，抗原稳定性高，纯度高，安全性好，免疫原性强。并且，不需纯化即可用于制备基因工程亚单位疫苗等特点，为工业化生产禽腺病毒亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为重组杆状病毒rpFastBac^TMDual-FAdV-4-Fiber-2感染SF9细胞间接免疫荧光检测；其中A是正常SF9细胞，B是转染pFastBac^TMDual空杆粒SF9细胞，C是转染重组杆状病毒rpFastBac^TMDual-FAdV-4-Fiber-2的SF9细胞。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1 Fiber-2基因的克隆及优化

本发明于2017年在山东济南某养鸡场分离到一株高致病性血清4型禽腺病毒毒株，命名为禽腺病毒4型FAdV-4SDJN0105(SDJN0105 FAdv-4 SDJN0105)株，于2021年1月29日保藏于中国武汉武汉大学菌种保藏中心，保藏号为：CCTCC No：V202114；将其作为扩增的模板。

1、血清4型禽腺病毒Fiber-2基因的克隆

(1)制备禽腺病毒基因组，将血清4型禽腺病毒分离毒株病毒经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30μL灭菌超纯水，即得血清4型禽腺病毒基因组，置-20℃备用。

(2)根据NCBI(登录号：MH006602)中发表的血清4型禽腺病毒Fiber-2基因序列，设计并合成引物，引物的序列信息如下：

FAdV-4-F(如SEQ ID NO.1所示)：5’-atgctccgggcccctaaaagaaga-3’；

FAdV-4-R(如SEQ ID NO.2所示)：5’-ttacgggagggaggccgctggaca-3’。

(3)取1μL步骤(1)提取的血清4型禽腺病毒核酸作为模板，用步骤(2)所述引物对进行PCR扩增，经序列测定，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3，根据测序结果推导其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

2、Fiber-2基因的优化

为了使Fiber-2抗原蛋白能够在昆虫细胞中分泌表达，将GP67信号肽添加到步骤1得到的Fiber-2序列的N端，同时将密码子进行优化，提高抗原蛋白在昆虫细胞中的表达效率。优化后的Fiber-2基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，优化修饰后的氨基酸序列为SEQID NO.6，优化修饰后的序列能很好的表达出抗原位点。

实施例2：表达Fiber-2基因的重组杆状病毒的构建

本发明分别针对pFastBac^TMDual载体的PH和p10启动子设计引物并插入重组片段，应用表达系统构建双启动子的目的基因的重组供体质粒。

所述针对PH启动子设计的引物序列为：

PH-FAdV-4-F(如SEQ ID NO.7所示)：

CGGTCCGAAGCGCGCGGAATTCATGCTGCTCGTGAACCAGTCCCACCAG；

PH-FAdV-4-R(如SEQ ID NO.8所示)：

TATGATCCTCTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTAGGGCAGGGAGGCAGCTGGAC；

所述针对p10启动子设计的引物序列为：

P10-FAdV-4-F(如SEQ ID NO.9所示)：

ACCCGGGATCTCGAGCCATGGATGCTGCTCGTGAACCAGTCCCACCAG；

P10-FAdV-4-R(如SEQ ID NO.10所示)：

GCTGATGCATAGCATGCGGTACCTTAGGGCAGGGAGGCAGCTGGAC。

1、将pFastBac^TMDual载体用限制性内切酶EcoRI和Hind III对载体的PH启动子下游序列进行酶切，标记好需要用到的1.5ml离心管，在离心管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为20μL，加样如下表1所示：

表1

将离心管置于37℃恒温水浴锅中，水浴15min-20min。之后将双酶切产物进行胶回收

2、按照步骤1所述的方法，将限制性内切酶改为Nco I和Kpn I对pFastBac^TMDual载体的P10启动子下游序列进行双酶切，之后将酶切产物进行胶回收。

3、无缝克隆

用无缝连接试剂盒按照表2所示体系配置并进行载体与重组序列的连接。

表2

成分	用量
		pFastBac<sup>TM</sup>Dual线性化载体	60ng-80ng
2×HIFI Onestep Assembly Cloning Mix	5μL
		实施例1步骤2中优化后的Fiber-2的基因	1μL
ddH<sub>2</sub>O	补足10μL

轻轻混匀，50℃反应30min，反应结束后置于冰上。

4、转化反应

(1)取DH5α感受态细胞放置于冰上，避免剧烈晃动，将10μL连接反应液加入感受态细胞中，在冰上静置30min；

(2)将其42℃热激90s之后立即冰浴2min；

(3)向混合物中加入900μL的无抗性LB液体培养基，37℃，120rpm振荡培养1h；

(4)将菌液10000rpm离心90s，弃去上清，加100μL无抗性LB液体培养基重悬菌沉淀，取50μL重悬液均匀涂布在Amp⁺抗性的LB固体培养基上，37℃温箱中倒置过夜培养；

(5)待平板中长出单菌落，挑取后接种至含Amp⁺抗性的LB液体培养基中，37℃，120rpm过夜摇菌，菌液离心后用质粒小提试剂盒提取质粒，并将重组质粒送测序公司进行测序。

5、转化反应与重组杆粒的制备

重组质粒鉴定正确后，将其转化到DH10Bac感受态细胞中，方法同步骤4，先在不含抗生素的液体培养基中37℃摇床培养4h后，取离心后的菌液均匀涂布于LB蓝白斑三抗筛选固体培养基，37℃倒置培养48h。随后进行蓝白斑筛选，挑取白斑菌落于LB固体培养基划线涂布进行纯化筛选，重复筛选一次后，挑取白色菌斑于相同抗性的液体培养基中，37℃振荡培养16h，用杆粒小提试剂盒提取重组杆粒。

(7)PCR鉴定

将提取的杆粒DNA进行PCR鉴定，鉴定阳性的质粒送测序公司进行测序，测序阳性的用于SF9细胞转染。

所述鉴定引物序列为：

Fiber-2-F(如SEQ ID NO.11所示)：

ATGCTGCTCGTGAACCAGTCCCACCAG；

Fiber-2-R(如SEQ ID NO.12所示)：

TTAGGGCAGGGAGGCAGCTGGAC；

实施例3重组质粒在SF9细胞中的表达

1、SF9细胞的培养

贴壁培养SF9细胞，将细胞铺于6孔板中，确保细胞生长状态良好并处于对数生长期，用含1％双抗的SF900II培养基27℃培养，细胞培养48-72h左右传代。细胞计数板控制细胞培养密度(1×10⁶-2×10⁶细胞/mL)，27℃培养1h使细胞贴壁。

2、重组杆粒DNA转染SF9细胞

使用昆虫细胞专用的Cellfectin II Reagent转染试剂按说明书所提供的方法进行重组杆粒DNA转染：

(1)用2％FBS-sf900 II培养基将SF9细胞铺在6孔板中，每孔2mL细胞悬液(1×10⁶细胞/孔)，室温下使细胞贴壁60min；

(2)向100μL无血清细胞培养基中加入Cellfectin II Reagent转染试剂8μL，轻摇混匀，放置在室温下30min；

(3)测定待转染的杆粒浓度，吸取2μg重组杆粒DNA与100μL无血清细胞培养基混合均匀，室温下静置；

(4)混合上述两种混合物，放置室温下静置约30min后形成重组杆粒-脂质体复合物；

(5)向6孔板培养细胞缓慢的加入混合好的重组杆粒-脂质体复合物，27℃孵育3-5h；

(6)孵育完成后，小心吸除上清并加入10％FBS-SF900 II培养基，27℃条件下静止培养5-6天，在此期间仔细观察细胞状态；

(7)待细胞肿胀，体积变大，脱落后，收集上清液，标记为P1代重组杆状病毒；

(8)用P1代重组杆状病毒rpFastBac^TMDual-FAdV-4-Fiber-2感染新培养的SF9细胞，提高重组杆状病毒含量，传至第3代，收取培养上清液，-80℃保存备用。

3、表达产物的鉴定

间接免疫荧光检测(IFA)

(1)SF9细胞在6孔板中培养48h，将第3代重组杆状病毒rpFastBac^TMDual-FAdV-4-Fiber-2感染昆虫细胞SF9，27℃培养72h，同时以转染pFastBac^TMDual载体的对照细胞和正常SF9细胞作为阴性对照组。

(2)将细胞培养72h后吸取上清，PBS洗涤。

(3)每孔加入200μL预冷4％多聚甲醛溶液固定10min，PBS洗涤3次，每次静置2min。

(4)每孔加入200μL 0.2％Triton X-100(用PBS稀释)，室温静置15min，完成对细胞的通透，PBS洗3次。

(5)以His标签小鼠单抗为一抗，稀释度为1：2000，每孔200μL，37℃作用1h；弃去一抗，用PBS清洗3遍。

(6)加入1：2000稀释的羊抗鼠FITC标记的二抗200μL，37℃作用1h；弃去二抗，用PBS清洗3遍。

(7)每孔100μL加入DAPI，室温作用5-15min，PBS避光洗涤3次，用锡纸包裹，每孔留100μL PBS，置于倒置荧光显微镜观察并拍照。结果如图1所示，在转染了重组杆状病毒rpFastBac^TMDual-FAdV-4-Fiber-2的SF9细胞中均可观察到特异性荧光荧光，转染pFastBac^TMDual载体的对照细胞和正常SF9细胞中未见特异性的荧光，说明说明目的抗原蛋白在Sf9细胞中得到正确表达，重组杆状病毒构建正确。

实施例4亚单位疫苗的制备及免疫原性试验

1、亚单位疫苗的制备

将第3代重组杆状病毒储液按照1：100的体积比接种到High Five细胞中，接种24h左右收获细胞培养上清，经过透析后，参照碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒方法进行蛋白定量。经测定，Fiber-2蛋白表达量为6.0mg/ml；

将分泌表达的禽腺病毒Fiber-2蛋白与白油佐剂按体积比3：5混匀制成三种规格亚单位疫苗。三种规格亚单位疫苗中Fiber-2蛋白含量分别为25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml。

2、亚单位疫苗免疫原性试验

取21日龄的SPF鸡40只，分成4组，每组10只，疫苗免疫组经颈部皮下注射上述步骤1制成的Fiber-2亚单位疫苗，免疫剂量分别为5μg/0.2ml、10μg/0.2ml和20μg/0.2ml，空白对照组颈部皮下注射0.2ml生理盐水作为攻毒对照。所有试验鸡均在隔离器中饲养，免疫后21天，用本实验室保存的禽腺病毒4型FAdV-4SDJN0105(SDJN0105 FAdv-4 SDJN0105)株病毒液通过肌肉注射攻毒，观察14天，记录发病、死亡及保护数，结果见表3。

表3 Fiber-2蛋白亚单位疫苗免疫原性试验结果

结果显示，攻毒对照组全部发病死亡，而第1组-第3组免疫组对免疫剂均产生了较好的免疫保护，免疫效果良好，并且当免疫剂量为5μg/0.2ml时就能够给鸡只提供完全的保护，效果显著。因此，本发明方法制备的禽腺病毒Fiber-2蛋白亚单位疫苗可对鸡群提供有效的免疫保护。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 山东省农业科学院家禽研究所（山东省无特定病原鸡研究中心）

<120> 一种血清4型禽腺病毒亚单位疫苗及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgctccggg cccctaaaag aaga 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttacgggagg gaggccgctg gaca 24

<210> 3

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctccggg cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60

ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240

atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac 780

actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840

acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900

gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtg gaacatacag 960

gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020

ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080

caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140

gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200

tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260

aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga 1320

tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380

agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440

<210> 4

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Leu Arg Ala Pro Lys Arg Arg His Ser Glu Asn Gly Lys Pro Glu

1 5 10 15

Thr Glu Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Ile Lys Arg Ala Lys Arg Met

20 25 30

Val Arg Ala Ser Gln Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Val Ala

35 40 45

Asp Pro Val Gly Gly Leu Asn Pro Pro Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro

50 55 60

Leu Val Asp Gln Gly Gly Gln Leu Thr Leu Asn Val Thr Asp Pro Ile

65 70 75 80

Ile Ile Lys Asn Arg Ser Val Asp Leu Ala His Asp Pro Ser Leu Asp

85 90 95

Val Asn Ala Gln Gly Gln Leu Ala Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Ala

100 105 110

Leu Asp Ile Thr Pro Asp Gly Leu Asp Val Lys Val Asp Gly Val Thr

115 120 125

Val Met Val Asn Asp Asp Trp Glu Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Ser

130 135 140

Gly Gly Leu Asp Ser Thr Ala Gly Gly Leu Gly Val Ser Val Asp Asp

145 150 155 160

Thr Leu Leu Val Asp Gln Gly Glu Leu Gly Val His Leu Asn Gln Gln

165 170 175

Gly Pro Ile Thr Ala Asp Ser Ser Gly Ile Asp Leu Glu Ile Asn Pro

180 185 190

Asn Met Phe Thr Val Asn Thr Ser Thr Gly Ser Gly Val Leu Glu Leu

195 200 205

Asn Leu Lys Ala Gln Gly Gly Ile Gln Ala Asp Ser Ser Gly Val Gly

210 215 220

Val Ser Val Asp Glu Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val

225 230 235 240

Lys Pro Asp Pro Ser Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly

245 250 255

Leu Lys Tyr Asp Thr Asn Thr Leu Ala Val Thr Ala Gly Ala Leu Thr

260 265 270

Val Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe Val Ser

275 280 285

Gly Ser Pro Ser Leu Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Thr Val Asn Ser Ser

290 295 300

Ala Asn Ala Phe Ser Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Ile Gln

305 310 315 320

Gly Leu Leu Val Thr Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Ala Thr Met

325 330 335

Gly Asn Arg Pro Gly Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Trp Phe Thr

340 345 350

Phe Trp Val Ser Ala Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly Ile Gln

355 360 365

Ala Gly Thr Val Ser Pro Ser Thr Ala Thr Leu Thr Asp Phe Glu Pro

370 375 380

Met Ala Asn Arg Ser Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Gly

385 390 395 400

Tyr Tyr Glu Pro Ser Ile Gly Glu Phe Gln Val Phe Ser Pro Val Val

405 410 415

Thr Gly Ala Trp Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu Pro Val

420 425 430

Pro Val Ser Ala Ser Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ser Leu

435 440 445

Gln Cys Thr Asn Ala Ser Ile Phe Asn Pro Asn Asn Ser Gly Thr Met

450 455 460

Ile Val Gly Pro Val Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Leu Pro

465 470 475

<210> 5

<211> 1569

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgctgctcg tgaaccagtc ccaccagggt ttcaacaagg agcacacaag caagatggtg 60

agcgccatcg tgctgtacgt gctgctggcc gctgccgccc acagcgcttt cgctcaccac 120

caccaccatc acctccgtgc ccctaagcgt cgccacagcg aaaacggcaa gcctgaaact 180

gaagctggtc ctagccctgc tcccatcaag cgcgctaagc gcatggtgcg cgcctcccaa 240

ctggacctcg tgtacccctt cgactacgtg gctgacccag tcggcggtct gaaccctcca 300

ttcctgggtg gctccggccc cctggttgac cagggcggcc agctgaccct gaacgtgact 360

gaccctatca tcatcaagaa ccgttcagtc gacctcgccc acgaccctag cctggacgtg 420

aacgctcagg gccagctcgc tgtggccgtg gaccctgagg gcgctctgga catcacccca 480

gacggcctgg acgtcaaggt tgacggcgtg accgtcatgg tgaacgacga ctgggaactg 540

gctgtgaagg ttgacccttc cggcggactg gactccaccg ccggaggact cggcgtgagc 600

gttgacgaca ccctgctcgt cgaccagggt gaactgggcg tgcacctgaa ccagcagggt 660

cccatcaccg ctgacagctc cggtatcgac ctcgaaatca acccaaacat gttcacagtg 720

aacacctcca ccggctccgg cgttctcgag ctcaacctga aggcccaggg tggtatccag 780

gctgactcca gcggtgtcgg cgtgtccgtt gacgagagcc tgcagatcgt taacaacacc 840

ctggaggtga agcctgaccc atccggtcct ctgacagtta gcgctaacgg actcggcctg 900

aagtacgaca ctaacaccct cgccgttacc gccggcgccc tgaccgtcgt gggcggcggt 960

agcgtgtcca cccccatcgc caccttcgtg agcggctccc catctctgaa cacatacaac 1020

gctaccaccg tgaacagctc cgctaacgct ttcagctgtg cctactactt gcagcagtgg 1080

aacatccagg gcctgctcgt gactagcctg tacctgaagc tggacagcgc taccatgggc 1140

aaccgtcccg gtgacctgaa cagcgccaac gctaagtggt tcacattctg ggtcagcgct 1200

tacctgcagc agtgcaaccc ctccggtatc caggccggta ccgtttcccc tagcacagct 1260

accctgactg acttcgagcc tatggccaac aggtctgtga ctagcccctg gacctactcc 1320

gctaacggat actacgagcc tagcatcggt gaattccagg tcttcagccc agtggtgaca 1380

ggcgcctgga acccaggtaa catcggcatc cgcgtgctgc ccgtgcctgt gagcgcctca 1440

ggtgagcgct acacactgct ctgctactcc ctgcagtgca ctaacgcctc catcttcaac 1500

cctaacaaca gcggtaccat gatcgtgggt ccagtgctgt actcctgtcc agctgcctcc 1560

ctgccctaa 1569

<210> 6

<211> 522

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala His His His His His His Leu Arg Ala Pro

35 40 45

Lys Arg Arg His Ser Glu Asn Gly Lys Pro Glu Thr Glu Ala Gly Pro

50 55 60

Ser Pro Ala Pro Ile Lys Arg Ala Lys Arg Met Val Arg Ala Ser Gln

65 70 75 80

Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Val Ala Asp Pro Val Gly Gly

85 90 95

Leu Asn Pro Pro Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro Leu Val Asp Gln Gly

100 105 110

Gly Gln Leu Thr Leu Asn Val Thr Asp Pro Ile Ile Ile Lys Asn Arg

115 120 125

Ser Val Asp Leu Ala His Asp Pro Ser Leu Asp Val Asn Ala Gln Gly

130 135 140

Gln Leu Ala Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Ala Leu Asp Ile Thr Pro

145 150 155 160

Asp Gly Leu Asp Val Lys Val Asp Gly Val Thr Val Met Val Asn Asp

165 170 175

Asp Trp Glu Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Ser Gly Gly Leu Asp Ser

180 185 190

Thr Ala Gly Gly Leu Gly Val Ser Val Asp Asp Thr Leu Leu Val Asp

195 200 205

Gln Gly Glu Leu Gly Val His Leu Asn Gln Gln Gly Pro Ile Thr Ala

210 215 220

Asp Ser Ser Gly Ile Asp Leu Glu Ile Asn Pro Asn Met Phe Thr Val

225 230 235 240

Asn Thr Ser Thr Gly Ser Gly Val Leu Glu Leu Asn Leu Lys Ala Gln

245 250 255

Gly Gly Ile Gln Ala Asp Ser Ser Gly Val Gly Val Ser Val Asp Glu

260 265 270

Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val Lys Pro Asp Pro Ser

275 280 285

Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly Leu Lys Tyr Asp Thr

290 295 300

Asn Thr Leu Ala Val Thr Ala Gly Ala Leu Thr Val Val Gly Gly Gly

305 310 315 320

Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe Val Ser Gly Ser Pro Ser Leu

325 330 335

Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Thr Val Asn Ser Ser Ala Asn Ala Phe Ser

340 345 350

Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Ile Gln Gly Leu Leu Val Thr

355 360 365

Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Ala Thr Met Gly Asn Arg Pro Gly

370 375 380

Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Trp Phe Thr Phe Trp Val Ser Ala

385 390 395 400

Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly Ile Gln Ala Gly Thr Val Ser

405 410 415

Pro Ser Thr Ala Thr Leu Thr Asp Phe Glu Pro Met Ala Asn Arg Ser

420 425 430

Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Gly Tyr Tyr Glu Pro Ser

435 440 445

Ile Gly Glu Phe Gln Val Phe Ser Pro Val Val Thr Gly Ala Trp Asn

450 455 460

Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu Pro Val Pro Val Ser Ala Ser

465 470 475 480

Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ser Leu Gln Cys Thr Asn Ala

485 490 495

Ser Ile Phe Asn Pro Asn Asn Ser Gly Thr Met Ile Val Gly Pro Val

500 505 510

Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Leu Pro

515 520

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggtccgaag cgcgcggaat tcatgctgct cgtgaaccag tcccaccag 49

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tatgatcctc tagtacttct cgacaagctt ttagggcagg gaggcagctg gac 53

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acccgggatc tcgagccatg gatgctgctc gtgaaccagt cccaccag 48

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gctgatgcat agcatgcggt accttagggc agggaggcag ctggac 46

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgctgctcg tgaaccagtc ccaccag 27

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttagggcagg gaggcagctg gac 23

Claims

1.一种抗原蛋白，其特征在于，所述抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.一种编码权利要求1所述抗原蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

3.一种包含权利要求2所述基因的重组杆状病毒载体。

4.根据权利要求3所述的重组杆状病毒载体，其特征在于，在杆状病毒PH和/或P10启动子后插入权利要求2所述基因。

5.一种含有权利要求3～4任一项所述的重组杆状病毒载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自昆虫细胞系的Sf9或High Five细胞。

7.一种血清4型禽腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求1所述抗原蛋白。

8.根据权利要求7所述的血清4型禽腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含药学可接受的赋形剂和/或佐剂。

9.根据权利要求8所述的血清4型禽腺病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂是白油佐剂。

10.一种权利要求1所述抗原蛋白、权利要求2所述基因、权利要求3～4任一项所述重组杆状病毒载体在制备防治血清4型禽腺病毒引起的鸡心包积水综合症的药物中的应用。