CN108101967A

CN108101967A - Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、制备方法及其应用

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Publication number: CN108101967A
Application number: CN201711447068.4A
Authority: CN
Inventors: 梅梅; 唐应华; 陆吉虎; 张雪花; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2018-06-01
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN108101967B

Abstract

本发明提供Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、制备方法及其应用，属于基因工程领域。Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，所述疫苗的抗原是序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。本发明还提供含有序列如SEQ ID NO:2所示多肽的多联苗。本发明基因工程亚单位疫苗，针对Ⅰ群血清4型禽腺病毒感染具有较好的预防和控制效果。

Description

Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，主要分为5 个种(A-E)，12个血清型。禽腺病毒感染于1963年首次在美国发生，随后扩散至世界各地。世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床症状，而急性感染会引发肌胃糜烂、心包积液及包涵体肝炎等。近年来，我国鸡群由FAdV引起的心包积液、包涵体肝炎临床病例逐渐增多。至2015年，FAdV感染鸡群的疫情在我国多个省份暴发，而发病鸡除3-4周龄的肉鸡外，10-20周龄的蛋鸡也可被FAdV 感染，而目前高致病性Ⅰ群血清4型禽腺病毒(FAdV-4)在国内鸡群流行相当广泛，给国内养鸡业造成了严重的经济损失。

迄今为止，临床上尚未出现针对FAdV-4的有效疫苗，而疫苗免疫是目前防控传染性疾病的最有效手段，最常用的是灭活疫苗和弱毒疫苗，然而灭活苗存在灭活不完全、弱毒苗存在毒力返强的潜在危险，而亚单位疫苗克服了灭活苗和弱毒苗的这些缺陷；此外，目前通过接种鸡胚、原代鸡胚肝肾细胞或鸡肝癌细胞系 (LMH)来繁殖I群4型禽腺病毒以制备疫苗，然而鸡胚繁殖病毒的毒价低，病毒需要高倍浓缩，成本较高；原代肝肾细胞制备过程繁琐、易污染，且在制备过程中易混入鸡胚成纤维细胞(CEF)，不利于试验操作；鸡肝癌细胞系致瘤性较强，利用其扩增的病毒存在潜在的致瘤风险。因此急需开发安全有效的新型基因工程亚单位疫苗。但是，现有技术中缺少有效的Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，针对 Ⅰ群血清4型禽腺病毒感染具有较好的预防和控制效果。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，所述疫苗的抗原是序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。

在本发明中，所述抗原通过如下方法制备的：采用昆虫细胞繁殖携带所述多肽编码基因的重组杆状病毒，裂解细胞，取上清液作为所述抗原。

在本发明中，携带所述多肽编码基因的重组杆状病毒采用如下方法构建：将所述多肽编码基因插入杆状病毒转移载体pFastBac^TM-1中，得到重组杆状病毒转移质粒；将所述重组杆状病毒转移质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭质粒；将所述重组杆状病毒穿梭质粒转染昆虫细胞，获得表达所述多肽的重组杆状病毒。

优选的技术方案中，所述多肽编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明中，所述昆虫细胞为Sf9或High Five细胞。

优选的技术方案中，所述疫苗的剂型为油佐剂。

本发明还提供含有序列如SEQ ID NO:2所示多肽的多联苗。

本发明将fiber和hexon蛋白重要抗原表位基因进行基因合成并克隆进杆状病毒表达系统(Invitrogen)，融合表达F-H蛋白，获得能显著提高免疫原性并产生高效免疫保护的疫苗抗原，制备Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗。该疫苗对Ⅰ群血清4型禽腺病毒具有良好的预防和控制效果，能对Ⅰ群血清4 型禽腺病毒提供安全、有效的免疫保护。

附图说明

图1为Fiber基因的PCR扩增结果示意图，M：200bp DNA Ladder；1：Fiber基因片段。

图2为Hexon基因的PCR扩增结果示意图，M：200bp DNA Ladder；1：Hexon基因片段。

图3为重组杆状病毒转移质粒pFastBac^TM1-F-H酶切鉴定结果示意图，1：DL5,000DNA Marker；2：pFastBac^TM1-F-H双酶切结果。

图4为重组杆状病毒转移质粒pFastBac^TM1-F酶切鉴定结果示意图，1：200bp DNALadder；2：DL5,000DNA Marker；3：pFastBac^TM1-F双酶切结果。

图5为重组杆状病毒转移质粒pFastBac^TM1-H酶切鉴定结果示意图，1：DL5,000DNAMarker；2：200bp DNA Ladder；3：pFastBac^TM1-H双酶切结果。

图6为重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F-H的PCR检测结果示意图，1：DL10,000DNAMarker；2：rBacmid-F-H经M13上下游引物扩增结果；3：rBacmid-F-H经F-H融合基因特异性上下游引物扩增结果。

图7为重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F的PCR检测结果示意图，1：rBacmid-F经Fiber 基因特异性上下游引物扩增结果；2：200bp DNA Ladder；3：rBacmid-F经M13上下游引物扩增结果。

图8为重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-H的PCR检测结果示意图，1：rBacmid-H经Hexon 基因特异性上下游引物扩增结果；2：200bp DNA Ladder；3：DL10,000DNA Marker；4：rBacmid-H经M13上下游引物扩增结果。

图9为重组杆状病毒rBV-F-H蛋白表达情况的免疫印迹试验结果示意图，1：蛋白预染 Marker；2：rBV-F-H感染的Sf9细胞免疫印迹结果；3：野生杆状病毒感染的Sf9细胞免疫印迹结果。

图10为重组杆状病毒rBV-F蛋白表达情况的免疫印迹试验结果示意图，1：蛋白预染 Marker；2：rBV-F感染的Sf9细胞免疫印迹结果；3：野生杆状病毒感染的Sf9细胞免疫印迹结果。

图11为重组杆状病毒rBV-H蛋白表达情况的免疫印迹试验结果示意图，1：蛋白预染 Marker；2：rBV-H感染的Sf9细胞免疫印迹结果；3：野生杆状病毒感染的Sf9细胞免疫印迹结果。

图12为攻毒对照组剖检病变。

具体实施方式

通过以下实验的具体实施方式可更进一步地理解本发明。

实施例1重组杆状病毒的构建及制备

1.基因片段的获得

(1)合成融合基因片段

分析Ⅰ群血清4型禽腺病毒fiber和hexon的重要抗原位点，设计了亚单位疫苗抗原(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的融合基因，并进行密码子优化，序列如SEQ ID NO:1所示。在核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的融合基因(记为 FH)的5’端添加BamH I酶切位点(GGATCC)，在3’端添加Hind III酶切位点 (AAGCTT)，由华大基因公司合成。

(2)扩增hexon蛋白和fiber蛋白编码基因

①根据Genbank公布的Ⅰ群血清4型禽腺病毒hexon蛋白编码基因 (Genebank登录号：EU938324.1)和fiber蛋白编码基因(Genebank登录号： HE649966.1)，由金斯瑞公司设计、合成用于扩增hexon蛋白编码基因的引物H-F 和H-R，用于扩增fiber蛋白编码基因的引物F-F和F-R(具体见表1)。

②采用常规方法从Ⅰ群4型禽腺病毒SD2015株中抽提基因组DNA。

③扩增fiber蛋白编码基因和hexon蛋白编码基因

PCR反应体系(50μL)如下：10×PCR buffer 5μL，MgCl₂2μL，dNTPs 2μL，DNA 模板(即基因组DNA)1μL，上、下游引物各1μL，Taq酶1μL，灭菌双蒸水补足体积至50μL。PCR反应体系中的试剂购自Takara公司。

PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃60s，64℃60s，72℃90s，10个循环；95℃60s，62℃60s，72℃90s，10个循环；95℃60s，60℃60s，72℃90s， 10个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，从图1和图2可以看到扩增获得了长度约为1455bp的fiber蛋白基因片段，长度约为2844bp的hexon蛋白基因片段。

表1显示了各引物的具体序列

2.构建重组杆状病毒转移质粒

将合成的融合基因片段、fiber蛋白基因片段和hexon蛋白基因片段分别插入杆状病毒转移载体pFastBac^TM1(Invitrogen公司)中，得到重组杆状病毒转移质粒pFastBac^TM1-F-H(插入了融合基因片段)、pFastBac^TM1-F(插入了fiber蛋白基因片段)和pFastBac^TM1-H(插入了hexon蛋白基因片段)。具体包括以下几个步骤：

(1)用内切酶在37℃分别酶切载体pFastBac^TM1、融合基因片段、fiber蛋白基因片段PCR回收产物和hexon蛋白基因片段PCR回收产物，电泳，并回收各片段的酶切产物；在T4连接酶的作用下，将pFastBac^TM1酶切产物分别与融合基因片段、fiber蛋白基因片段和hexon蛋白基因片段的酶切产物进行连接，4℃ 连接过夜；

(2)将各连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经Amp抗性筛选，获得插入有目的基因的单克隆菌落，将含有目的基因的单克隆菌液小提质粒、酶切鉴定，并测序。

(3)将酶切鉴定正确(图3-5)、测序正确的重组杆状病毒转移质粒分别命名为pFastBac^TM1-F-H(插入了融合基因片段)，pFastBac^TM1-F(插入了fiber蛋白基因片段)和pFastBac^TM1-H(插入了hexon蛋白基因片段)。

3.构建重组杆状病毒穿梭质粒

将重组杆状病毒转移质粒pFastBac^TM1-F-H、pFastBac^TM1-F和pFastBac^TM1-H 分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选3代，并用各目的基因特异性引物和M13通用引物(M13-F和M13-R，见表1)分别进行PCR鉴定，筛选在Bacmid载体中成功插入了融合基因片段、fiber蛋白基因片段或hexon蛋白基因片段的阳性重组杆状病毒穿梭质粒：rBacmid-F-H(插入了融合基因片段)、 rBacmid-F(插入了fiber蛋白基因片段)和rBacmid-H(插入了hexon蛋白基因片段)。PCR反应体系和程序同本实施例标题1中(2)，从图6-8可见，从rBacmid-F-H、 rBacmid-F和rBacmid-H中成功扩增了目的基因。

4.重组杆状病毒的获得与鉴定

(1)重组杆状病毒的获得

将重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-F-H、rBacmid-F和rBacmid-H分别转染sf9 细胞，获得重组杆状病毒rBV-F-H、rBV-F和rBV-H。具体方法如下：转染前24h，将sf9细胞接种6孔板，每孔加入1×10⁶个细胞，27℃培养箱培养。采用脂质体转染法，将重组杆状病毒穿梭质粒与脂质体轻柔混匀，转染Sf9细胞中，转染后在27℃培养箱中继续培养96-120h，收集细胞培养物于4℃、3000rpm离心5min，取上清作为第一代重组杆状病毒。用第一代重组杆状病毒感染新鲜培养的sf9细胞，4-5天后，将培养物离心取上清，为第二代重组杆状病毒。将收获的重组杆状病毒继续传代，得到第三代重组杆状病毒。将第三代重组杆状病毒分别命名为 rBV-F-H、rBV-F和rBV-H，并作为种毒。种毒分装后，保存于-80℃。

(2)间接免疫荧光试验(IFA)鉴定

采用间接免疫荧光试验(IFA)鉴定重组杆状病毒rBV-F-H、rBV-F和rBV-H中目的蛋白的表达，以野生杆状病毒作为对照。

按照如下方法培养各重组杆状病毒表达目的蛋白：将重组杆状病毒以MOI＝1 接种处于对数生长期的sf9细胞，27℃培养72-96h，弃去细胞培养上清，用PBS清洗细胞，4％多聚甲醛室温固定细胞30min，自然吹干。向感染重组杆状病毒rBV-F-H 的细胞中加入抗FAdV-4fiber单抗(王萍，王伟康，梁广成，等.抗血清4型禽腺病毒纤突蛋白2的单克隆抗体研制及其部分特性研究[J].中国家禽,2017,39(19):27～31)，37℃孵育 45min，PBS清洗三次；向细胞中加入TRITC标记的羊抗鼠荧光二抗 (SouthernBiotech公司)，37℃孵育45min，PBS清洗二次；向细胞中加入FAdV-4 阳性血清，37℃孵育45min，PBS清洗三次；向细胞中加入FITC标记的羊抗鸡荧光二抗(SouthernBiotech公司)，37℃孵育45min，PBS清洗三次；荧光显微镜观察结果。IFA结果显示，重组杆状病毒rBV-F-H可与抗fiber蛋白单抗和FAdV-4阳性血清发生反应，而野生杆状病毒不能产生特异反应，表明插入的目的基因在Sf9细胞中获得很好的表达。另外，通过IFA鉴定发现，培养重组杆状病毒rBV-F后的细胞可以和抗fiber蛋白单抗发生反应，培养重组杆状病毒rBV-H后的细胞可以和 FAdV-4阳性血清发生反应，表明各目的基因均成功插入并表达。

(3)免疫印迹法(Western-blot)鉴定

采用免疫印迹法(Western-blot)鉴定重组杆状病毒rBV-F-H、rBV-F和rBV-H 中重组蛋白的表达。

将重组杆状病毒以MOI＝1接种处于对数生长期的sf9细胞，27℃培养72-96h，离心后分别收集细胞和上清。超声波超声破碎细胞，4℃、5000rpm离心10min，取细胞裂解液上清，加入上样缓冲液，煮沸5min，然后进行SDS-PAGE电泳，同时设野生杆状病毒(Invitrogen公司)感染的sf9细胞作为阴性对照。SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移至NC膜上，转膜完成后，用TBST洗涤液洗膜一次；5％脱脂乳于4℃封闭过夜；TBST洗涤液洗膜3次，每次5min；加入FAdV-4阳性血清，37℃孵育1h，TBST洗涤液洗膜3次，每次5min；加入HRP标记的羊抗鸡IgY(SouthernBiotech 公司)，37℃孵育1h，TBST洗涤液洗膜3次，每次5min；DAB显色液显色，拍照。从图9-11可以看到表达的目的蛋白均能与阳性血清发生特异性反应，其中fiber蛋白分子量约62Kd，hexon蛋白分子量约110Kd，融合蛋白分子量约60Kd，与预期大小相符，表明目的蛋白在昆虫细胞中得到良好的表达。

实施例2重组杆状病毒的细胞培养及效价测定

1.疫苗抗原的制备

在生物反应器中以无血清培养基悬浮培养High Five细胞，用来制备疫苗病毒液。当High Five细胞密度达到2×10⁶cell/mL时，将重组杆状病毒rBV-F-H种毒按照 MOI＝1加入细胞中进行培养，反应器饱和溶氧度为40～60％，搅拌速度为100rpm， pH为6.0-6.5，温度为27℃。接毒后每隔24h取样观察细胞病变情况，当培养时间达到72～96h，大部分细胞出现病变(肿胀、破碎)，且溶氧值呈现明显上升趋势，停止培养，将细胞培养物采用超声波进行裂解，离心，取上清，即得到由SEQ ID NO:1所示核苷酸序列编码的融合蛋白，命名为F-H融合蛋白。

另外，采用上述相同方法制备由rBV-F病毒表达的重组fiber蛋白，由rBV-H病毒表达的重组hexon蛋白。

2.抗原琼扩效价测定

将本实施例标题1制备的各重组蛋白采用琼脂扩散试验测定效价，具体方法如下：在琼脂糖凝胶板上打梅花孔(7孔)，在梅花孔的中间孔内加入FAdV-4阳性血清，周围6孔分别加入倍比稀释(2^-1、2^-2、2^-3、2^-4、2^-5、2^-6……)的病毒液和 PBS(对照)，倒置，37℃孵育24-48h后观察沉淀线，出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。不同批次重组蛋白琼扩效价检测结果如表2。由表2可见，重组fiber 蛋白琼扩效价为3-4，重组hexon蛋白琼扩效价为1-2，F-H融合蛋白琼扩效价为6-7。

表2不同批次重组蛋白的琼扩效价(nLog2)检测结果

3.病毒细胞半数感染量(TCID₅₀/mL)测定

测定重组杆状病毒TCID₅₀，具体步骤如下：

a.将处于对数生长期的sf9细胞接种于96孔板，每孔加入100μL，细胞在27℃ 培养箱中培养12-24h；

b.用不含血清的Grace’s培养基将重组病毒进行梯度稀释，稀释度为 10^-1～10^-9；

c.弃96孔板中的培养液，将稀释好的重组病毒依次缓缓加入细胞表面， 100μL/孔，每个稀释度做8个重复，并设正常细胞对照，27℃培养箱培养4-5天；

d.弃去96孔板中的细胞上清，PBS洗一次，4％多聚甲醛固定30min，弃去固定液，吹干；

e.向细胞中加入FAdV-4阳性血清，37℃孵育45min，PBS清洗三次；

f.向细胞中加入FITC标记的羊抗鸡IgY(SouthernBiotech公司)，37℃孵育45min，PBS清洗三次。

荧光显微镜观察实验结果，通过Reed-Muench法计算重组病毒TCID₅₀/mL。测得rBV-F-H的病毒滴度为5×10⁸TCID₅₀/mL，测得rBV-F的病毒滴度为5.8× 10⁸TCID₅₀/mL，测得rBV-H的病毒滴度为5.6×10⁸TCID₅₀/mL。

4.蛋白含量测定

使用BCA蛋白定量分析试剂盒(Thermo公司)，检测采用本实施例标题1中方法制备的各重组蛋白的浓度，结果如表3。由表3可见，三批次蛋白浓度平均值约为2-3mg/L。

表3.不同批次重组蛋白的含量测定结果

实施例3油佐剂疫苗的制备

按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页分别对实施例2 制备的F-H融合蛋白、重组fiber蛋白和重组hexon蛋白进行无菌检测。结果：均无细菌生长。

制备以F-H融合蛋白为抗原的油佐剂疫苗(缩写为F-H疫苗)，包括如下步骤：

(1)制备油相。按照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录343 页中方法制备油相。油相是由96质量份注射用白油、4质量份司本-80、2质量份硬脂酸铝配制而成的。取硬脂酸铝，用少量注射用白油混合后，加热融化至半透明状，再与全量司本-80及余量注射用白油混合均匀，经121℃灭菌15min，冷却至室温备用。

(2)制备水相。将2.8 mg/L的F-H融合蛋白(实施例2标题1中方法制备)与吐温-80按照体积比为96:4混合，乳化1min，得到水相。

(3)油相、水相混合。将水相和油相按照体积比1:3混合，1000rpm搅拌乳化3～5min得到均一体系，即得油佐剂疫苗。4℃保存备用。

另外，采用F-H疫苗的制备方法制备以重组fiber蛋白为抗原的油佐剂疫苗(缩写为对照疫苗1)，以重组hexon蛋白为抗原的油佐剂疫苗(缩写为对照疫苗2)，以及以Ⅰ群4型禽腺病毒SD2015株(公开于申请号为2016108768206、名称为“一种I群4型禽腺病毒、灭活疫苗及其制备方法”)灭活病毒液为抗原的油佐剂疫苗 (缩写为对照疫苗3)。

实施例4油佐剂疫苗的免疫和攻毒试验

165只SPF鸡胚购自北京维通梅里亚实验动物有限公司，于本实验室孵化器孵化，动物实验中心隔离器中饲养。

(1)试验方法

免疫：将2日龄的SPF鸡随机分成11个试验组，每组15只。第1～3组均免疫对照疫苗1，免疫剂量分别为0.1mL/只、0.3mL/只和0.5mL/只；第4～6组均免疫对照疫苗2，免疫剂量分别为0.1mL/只、0.3mL/只和0.5mL/只；第7～9组均免疫F-H 疫苗，免疫剂量分别为0.1mL/只、0.3mL/只和0.5mL/只；第10组免疫对照疫苗3，免疫剂量0.5mL/只；第11组为阴性对照组。各疫苗均采用颈部皮下注射方式进行免疫，并于免疫后14d、21d、28d采血测定血清琼扩效价，具体分组及免疫方法见表4。

表4鸡只的分组及免疫实验方案

攻毒：各试验组鸡免疫后28天进行攻毒，对各试验组的每只鸡用100ELD₅₀剂量的Ⅰ群4型禽腺病毒SD2015株病毒液，通过胸部肌肉注射进行攻毒试验，攻毒后连续观察14日，记录各组试验鸡的发病和死亡情况，统计免疫保护率。

(2)试验结果

免疫后抗体检测结果见表5。从免疫剂量来看，0.3mL/只剂量组与0.5mL/只剂量组间差异不显著，且血清效价均显著高于0.1mL/只剂量组，因此各疫苗的最佳免疫剂量均为0.3mL/只。比较F-H疫苗与对照疫苗1、对照疫苗2和对照疫苗3在最佳免疫剂量下的抗体效价，可以发现F-H疫苗免疫后的抗体效价显著高于其他各组。

攻毒结果显示，阴性对照组的鸡100％死亡，观察期内发病鸡多表现羽毛粗乱、食欲不振、精神沉郁，剖检可见心包积液、肝脏病变(见图12)。从攻毒保护效力看(见表6)，F-H疫苗免疫组保护效果显著优于其它对照组。结果表明，

F-H疫苗免疫后能够产生较高的抗体水平，能够完全保护Ⅰ型4型禽腺病毒的攻毒。

表5各组免疫后血清琼扩效价

表6各组攻毒保护结果

实施例5鸡新城疫、禽流感、重组4型禽腺病毒三联灭活苗

45只SPF鸡胚购自北京维通梅里亚实验动物有限公司，于本实验室孵化器孵化，动物实验中心隔离器中饲养。

鸡新城疫、禽流感、重组4型禽腺病毒三联灭活苗缩写为新流腺三联灭活苗。

(1)新流腺三联灭活苗的制备

将鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株(公开于专利号为ZL201210320725.X的发明专利，保藏登记号为：CGMCC NO：6258)分别接种易感鸡胚，收获鸡新城疫病毒液(10^9.0EID₅₀/mL)和禽流感病毒液(10^9.25EID₅₀/mL)。另外，采用实施例2标题1中方法制备F-H融合蛋白，浓缩至9mg/L。

按照实施例3中方法制备新流腺三联灭活苗，剂型为油佐剂。不同之处在于水相采用如下方法制备：将鸡新城疫病毒液、禽流感病毒液和F-H融合蛋白分别采用甲醛灭活，然后按体积比为1:1:1混合均匀，与吐温-80按照体积比为96:4 混合，充分搅拌，得到水相。

(2)免疫试验

免疫：将2日龄的SPF鸡随机分成3个试验组，每组15只。第一组免疫F-H疫苗 (实施例3制备)，第二组免疫新流腺三联灭活苗，第三组为阴性对照组。疫苗采用胸部肌肉注射的方式进行接种，接种剂量0.3mL/只；免疫后14d、21d、28d采血，测定血清抗体琼扩效价(AGP效价)和血凝抑制效价，具体免疫方式见表7。

表7分组及免疫实验方案

(3)试验结果

免疫后14d、21d、28d采血、分离血清，分别测定新城疫抗体HI效价、禽流感H9亚型抗体HI效价和血清4型禽腺病毒抗体AGP效价。结果显示(见表8)，免疫鸡产生了较高抗体效价，免疫后28d血清中抗H9亚型禽流感抗体HI效价平均值最高达到1:512(9Log2)，新城疫抗体HI效价平均值达最高到1:128(7Log2)，I群血清4型禽腺病毒血清抗体琼扩效价最高达到1:128(7Log2)。

表8免疫后血清抗体效价

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、制备方法及其应用

<130> 20171226

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1743

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 融合基因

<400> 1

atgctccgag cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60

ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240

atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac 780

actaataccc tagcgcaaaa cacagctacg gcaacagctg cagcaatcgc cagcgtttca 840

ggctcttatc ctaaccctaa cgtggggctg gccattagcg aagtgggagc cctcaccccg 900

acactagcag cacaggtcgg tctggccggt cggtttgcca aggtgtccaa tgagaacacg 960

cgcctggctt atggagcgta tgtgaagcct ctaaaagacg acggctctca gtcacttgga 1020

acaacgcctt actacgtgtt agacaccaca gcacagaaat acttgggcgt catgggggta 1080

gaagacttta cgcaaagtct tacctaccca gacagtctgt taatcccccc tccttctgag 1140

tacggagagg ttaacagcgg ggtgatgaaa gcgaacagac ccaactacat cgggttccgt 1200

gacaatttca tcaacctcct gtaccacgat accggcgtgt gctccgggac cctcaactcc 1260

gaacggtcag gcatgaacgt ggtggtggaa ttgcaggacc gaaacaccga actcagctac 1320

cagtacatgc tcgccgatat gatgtccagg catcactatt tcgctctctg gaaccaggcc 1380

gtggatcagt acgaccacga cgtgcgcgtg tttaacaacg acggctacga ggagggcgtg 1440

cccacgtacg ccttctcgcc cgagggtaca ggacagggtc ccatcagttc ggcaaatatc 1500

acgctttctg gtgtcaaggt gtacactaac ggtcagaacg acaagggcac cgaagtcaca 1560

aatcttacaa cgtacctcaa tgccggcgcc gtgccttcct acgagatcga tctggcggcc 1620

tcccagcggc gtaattttat catcaccaac atcgccgact acctgcccga taagtacaag 1680

tacaacattt ccgggttcaa ccccgaaacc gataacgtgg accccaccac ttacgcgtac 1740

taa 1743

<210> 2

<211> 580

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> F-H融合蛋白

<400> 2

Met Leu Arg Ala Pro Lys Arg Arg His Ser Glu Asn Gly Lys Pro Glu

1 5 10 15

Thr Glu Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Ile Lys Arg Ala Lys Arg Met

20 25 30

Val Arg Ala Ser Gln Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Val Ala

35 40 45

Asp Pro Val Gly Gly Leu Asn Pro Pro Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro

50 55 60

Leu Val Asp Gln Gly Gly Gln Leu Thr Leu Asn Val Thr Asp Pro Ile

65 70 75 80

Ile Ile Lys Asn Arg Ser Val Asp Leu Ala His Asp Pro Ser Leu Asp

85 90 95

Val Asn Ala Gln Gly Gln Leu Ala Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Ala

100 105 110

Leu Asp Ile Thr Pro Asp Gly Leu Asp Val Lys Val Asp Gly Val Thr

115 120 125

Val Met Val Asn Asp Asp Trp Glu Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Ser

130 135 140

Gly Gly Leu Asp Ser Thr Ala Gly Gly Leu Gly Val Ser Val Asp Asp

145 150 155 160

Thr Leu Leu Val Asp Gln Gly Glu Leu Gly Val His Leu Asn Gln Gln

165 170 175

Gly Pro Ile Thr Ala Asp Ser Ser Gly Ile Asp Leu Glu Ile Asn Pro

180 185 190

Asn Met Phe Thr Val Asn Thr Ser Thr Gly Ser Gly Val Leu Glu Leu

195 200 205

Asn Leu Lys Ala Gln Gly Gly Ile Gln Ala Asp Ser Ser Gly Val Gly

210 215 220

Val Ser Val Asp Glu Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val

225 230 235 240

Lys Pro Asp Pro Ser Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly

245 250 255

Leu Lys Tyr Asp Thr Asn Thr Leu Ala Gln Asn Thr Ala Thr Ala Thr

260 265 270

Ala Ala Ala Ile Ala Ser Val Ser Gly Ser Tyr Pro Asn Pro Asn Val

275 280 285

Gly Leu Ala Ile Ser Glu Val Gly Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala

290 295 300

Gln Val Gly Leu Ala Gly Arg Phe Ala Lys Val Ser Asn Glu Asn Thr

305 310 315 320

Arg Leu Ala Tyr Gly Ala Tyr Val Lys Pro Leu Lys Asp Asp Gly Ser

325 330 335

Gln Ser Leu Gly Thr Thr Pro Tyr Tyr Val Leu Asp Thr Thr Ala Gln

340 345 350

Lys Tyr Leu Gly Val Met Gly Val Glu Asp Phe Thr Gln Ser Leu Thr

355 360 365

Tyr Pro Asp Ser Leu Leu Ile Pro Pro Pro Ser Glu Tyr Gly Glu Val

370 375 380

Asn Ser Gly Val Met Lys Ala Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg

385 390 395 400

Asp Asn Phe Ile Asn Leu Leu Tyr His Asp Thr Gly Val Cys Ser Gly

405 410 415

Thr Leu Asn Ser Glu Arg Ser Gly Met Asn Val Val Val Glu Leu Gln

420 425 430

Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Tyr Met Leu Ala Asp Met Met

435 440 445

Ser Arg His His Tyr Phe Ala Leu Trp Asn Gln Ala Val Asp Gln Tyr

450 455 460

Asp His Asp Val Arg Val Phe Asn Asn Asp Gly Tyr Glu Glu Gly Val

465 470 475 480

Pro Thr Tyr Ala Phe Ser Pro Glu Gly Thr Gly Gln Gly Pro Ile Ser

485 490 495

Ser Ala Asn Ile Thr Leu Ser Gly Val Lys Val Tyr Thr Asn Gly Gln

500 505 510

Asn Asp Lys Gly Thr Glu Val Thr Asn Leu Thr Thr Tyr Leu Asn Ala

515 520 525

Gly Ala Val Pro Ser Tyr Glu Ile Asp Leu Ala Ala Ser Gln Arg Arg

530 535 540

Asn Phe Ile Ile Thr Asn Ile Ala Asp Tyr Leu Pro Asp Lys Tyr Lys

545 550 555 560

Tyr Asn Ile Ser Gly Phe Asn Pro Glu Thr Asp Asn Val Asp Pro Thr

565 570 575

Thr Tyr Ala Tyr

580

Claims

1.Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗的抗原是序列如SEQ ID NO:2所示的多肽。

2.根据权利要求1所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述抗原通过如下方法制备的：采用昆虫细胞繁殖携带所述多肽编码基因的重组杆状病毒，裂解细胞，取上清液作为所述抗原。

3.根据权利要求2所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于携带所述多肽编码基因的重组杆状病毒采用如下方法构建：将所述多肽编码基因插入杆状病毒转移载体pFastBac^TM-1中，得到重组杆状病毒转移质粒；将所述重组杆状病毒转移质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，获得重组杆状病毒穿梭质粒；将所述重组杆状病毒穿梭质粒转染昆虫细胞，获得表达所述多肽的重组杆状病毒。

4.根据权利要求2或3所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述多肽编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求4所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述昆虫细胞为Sf9或High Five细胞。

6.根据权利要求5所述Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于所述疫苗的剂型为油佐剂。

7.含有序列如SEQ ID NO:2所示多肽的多联苗。