CN112501186A - 猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用 - Google Patents

猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112501186A
CN112501186A CN202011347139.5A CN202011347139A CN112501186A CN 112501186 A CN112501186 A CN 112501186A CN 202011347139 A CN202011347139 A CN 202011347139A CN 112501186 A CN112501186 A CN 112501186A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cap
protein
porcine circovirus
sequence
pcv2d
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011347139.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112501186B (zh
Inventor
刘喜凤
郭兆隆
杨施瑜
韩贤舟
郑杰
马宁宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Dingchi Biotechnology Co ltd
Zhejiang Dingzhi Biological Products Co ltd
Original Assignee
Beijing Dingchi Biotechnology Co ltd
Zhejiang Dingzhi Biological Products Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Dingchi Biotechnology Co ltd, Zhejiang Dingzhi Biological Products Co ltd filed Critical Beijing Dingchi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202011347139.5A priority Critical patent/CN112501186B/zh
Publication of CN112501186A publication Critical patent/CN112501186A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112501186B publication Critical patent/CN112501186B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了猪圆环病毒2d型CAP蛋白以及用该序列编码的CAP蛋白制备的亚单位疫苗及其应用。本发明通过昆虫细胞密码子偏爱性优化合成猪圆环病毒2d型的CAP序列，将该序列构建到杆状病毒表达载体pFastbac11上，通过杆粒制备，杆粒转染SF9细胞，重组杆状病毒收获及H5细胞表达，获得PCV2d的CAP抗原蛋白。该抗原与佐剂ISA206乳化配制成猪圆环CAP‑2d亚单位疫苗。该疫苗免疫猪能产生较高的中和抗体，可抵抗106TCID50/ml PCV2d‑HB强毒株攻击。

Description

猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及猪圆环病毒2d型CAP序列及用该序列编码的CAP蛋白制备的亚单位疫苗及其应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)的感染能够引起猪断奶后多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)。该病多发生在5-12周龄的保育猪，临床主要表现为呼吸困难、喘气、皮肤苍白及消瘦。2005年以前我国流行的毒株主要为PCV2a及PCV2b型，2005年以后PCV2b逐渐增多，导致更严重的PMWS，近年来PCV2d逐渐增多呈流行趋势。
PCV2属于单股负链环状DNA病毒，基因组全长1767bp或者1768bp，其中ORF2 编码大小为233-234个氨基酸病毒的核衣壳蛋白CAP，CAP蛋白是主要的免疫原性蛋白。昆虫杆状病毒表达系统(Insect Baculovirus Expression Vector System，IBEVS)是一种高效的真核表达系统，能进行蛋白质的加工修饰，表达产物与天然蛋白接近，具有很强的生物活性。
目前，市场上PCV2的疫苗主要是针对PCV2a和PCV2b的亚单位疫苗和灭活疫苗，本发明利用分离的PCV2d毒株的CAP序列，利用IBEVS进行表达；CAP-2d抗原与佐剂乳化制备成猪圆环CAP-2d亚单位疫苗，能够抵抗目前流行的猪圆环PCV2d毒株的攻击。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪圆环病毒2d型CAP蛋白，及用该CAP-2d蛋白制备亚单位疫苗及其应用。
本发明提供了一种猪圆环病毒的2d型CAP蛋白，所述2d型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还设计了一种重组杆状病毒的转移载体，所述转移载体包含一个或多个编码 2d型Cap蛋白的基因序列，所述基因序列按照昆虫细胞密码子偏爱性优化合成 PCV2d-CAP-DC核苷酸序列，如SEQ ID NO.3所示。本发明通过将PCV2d-CAP-DC核苷酸序列与杆状病毒表达载体pFastbac11连接，构建能表达猪圆环病毒PCV2d毒株衣壳蛋白 CAP-2d的杆状病毒表达载体pFastbac11-PCV2d-CAP-DC，该载体通过转化DH10Bac制备重组杆粒，杆粒转染SF9，收获重组CAP-2d杆毒PCV2d-CAP-DC-rBV,该毒株的建议分类命名为核型多角体病毒Nucleopolyhedovirus sp.,于2020年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.20712。
同时本发明设计了上述重组杆状病毒的构建方法，构建方法包括以下步骤，
(1)人工合成一段基因序列PCV2d-CAP-DC，该序列根据昆虫细胞密码子偏爱性进行优化，优化合成的PCV2d-CAP-DC序列如SEQ ID NO.3所示；
(2)BamHI和XbaⅠ酶切上述PCV2d-CAP-DC序列和pFastbac11载体，回收酶切后的PCV2d-CAP-DC序列和pFastbac11载体片段，连接、转化、克隆PCR并进行测序验证，构建pFastbac11-PCV2d-CAP-DC表达载体；
(3)将pFastbac11-PCV2-CAP-2d-DC表达载体转化DH10Bac，通过蓝白斑筛选以及PCR鉴定获得重组杆粒PCV2d-CAP-DC-rBacmid；
(4)将重组杆粒PCV2d-CAP-DC-rBacmid转染SF9细胞，收毒，获得能够高效表达猪圆环病毒2d亚型CAP蛋白的重组杆状病毒，命名为PCV2d-CAP-DC-rBV。
同时本发明专利还将上述PCV2d-CAP-DC-rBV在昆虫细胞H5中高效表达 PCV2d-CAP-DC蛋白，该蛋白用于制备猪圆环CAP-2d亚单位疫苗，其步骤为，将重组 PCV2d-CAP-DC-rBV经H5细胞培养后，离心，收集上清，弃沉淀。测PCV2-2d-CAP-DC 含量，经BEI灭活后，与ISA206佐剂按1:1比例混合乳化，得到猪圆环CAP-2d亚单位疫苗。
所述猪圆环PCV2d-CAP-DC亚单位疫苗CAP蛋白含量为10-50ug/ml，优选的，CAP蛋白含量为25ug/ml。
经上述方法制得的猪圆环PCV2d-CAP-DC亚单位疫苗可用来预防由猪圆环病毒引起的相关疾病。
相对于现有技术，本发明专利的进步之处在于，所选用的序列为PCV2流行毒株2d亚型的CAP全序列，包含了核定位序列，经过昆虫细胞密码子偏爱性优化，该序列在杆状病毒中的表达为可溶性表达，能够更好的在感染的昆虫细胞中高效表达，且表达量可以达到180ug/ml，远高于现有工艺中应用的序列的表达量，能更好的应用于猪圆环病毒亚单位疫苗的生产应用，降低成本，提高产量。配制成的猪圆环CAP-2d亚单位疫苗免疫原好，能产生较高的中和抗体，可抵抗106TCID50/ml PCV2d-HB强毒株攻击。
附图说明
图1质粒pFastbac 11-PCV2d-CAP-DC鉴定结果，其中M为Marker BM8000；泳道 1-3依次为pFastbac 11-PCV2d-CAP-DC质粒、pFastbac 11-PCV2-CAP-2d-DC (BamHI+XbaI)双酶切，PCR扩增CAP序列产物。
图2CAP蛋白在H5中表达的SDS-PAGE检测结果，其中M为Marker，大小依次为100KDa，75KDa，63KDa，48KDa，35KDa。泳道1为CAP蛋白检测结果，泳道2为 H5细胞对照，泳道3为扩增的P3代种毒检测结果。
图3猪圆环CAP-2d在H5中表达量的灰度分析图，其中M为Marker。泳道1-5为CAP 蛋白标准品浓度为150ug/ml，其中泳道1-5上样量分别为0.625ul、1.25ul、2.5ul、5ul、 10ul；泳道6-8为CAP-2d测试样品，上样量为5ul、10ul、15ul。
图4猪圆环CAP-2d免疫仔猪血清抗体ELISA检测结果，其中判定标准为OD450nm≥0.4为阳性，OD450nm<0.3判定为阴性。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的说明。本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施列中所使用的试剂均为市售产品。
本发明试剂、菌株和质粒来源名单如下：
本发明所用pFastbac11杆状病毒表达载体由北京鼎持生物技术有限公司构建和保存；
昆虫细胞SF9和H5购自Invitrogen公司；
昆虫细胞培养基IB905均购自壹生科(深圳)有限公司；
ISA 206 VG佐剂购自于赛彼科(上海)特殊化学品有限公司；；
96孔细胞培养板购自康宁公司；
猪圆环抗体ELISA检测试剂盒购自北京金诺百泰生物技术有限公司；
EasyPfu DNA聚合酶、dNTP以及核酸电泳Marker购于全式金生物技术公司；
感受态细胞DH5α购自于博迈德生物技术有限公司；
质粒小提试剂盒、质粒大提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化公司；
T4 DNA连接酶和各种限制性内切酶购自NEB公司；
PCV2d-CAP-DC基因序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
实施例一
构建表达载体pFastbac11-PCV2d-CAP-DC
1.PCV2d-CAP-DC序列合成
以临床病料中分离的猪圆环病毒基因组为模板，人工合成PCV2-CAP序列，进行测序，其序列如SEQ ID NO.1所示,其所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。根据测序结果和昆虫细胞密码子偏爱性进行PCV2-CAP优化和合成，序列两端添加BamHI和XbaI 酶切位点，序列如SEQ ID NO.3所示。
2.pFastbac11-PCV2d-CAP-DC杆状病毒表达质粒构建
BamHI和XbaⅠ酶切PCV2-CAP序列以及pFastbac11表达载体，回收酶切片段，然后连接，转化DH5α，克隆挑选，酶切验证构建的pFastbac11-PCV2d-CAP-DC载体,图1为质粒pFastbac11-PCV2d-CAP-DC鉴定结果。PCR、酶切、连接、转化、测序等均为分子生物学常规方法，具体请参考《分子克隆试验操作手册》。图1的结果表明 pFastbac11-PCV2d-CAP-DC表达载体构建成功。
实施例二
杆粒制备
将实施例1制备的pFastbac11-PCV2d-CAP-DC杆状病毒重组表达载体转化感受态细胞DH10Bac，37℃培养后，使用蓝白斑筛选法并进行PCR鉴定，获得PCV2d-CAP-DC-rBacmid重组杆粒。杆粒转化和筛选方法参考Invitrogen公司Bac-to-BacTM杆状病毒表达系统用户指南进行操作。
实施例三
1.重组杆状病毒收获及PCV2d-CAP-DC蛋白表达鉴定
将实施例二中获得的PCV2d-CAP-DC-rBacmid重组杆粒利用转染试剂ExpiFectamine SF，转染处于对数生长期的sf9细胞，6孔板中27℃静止贴壁培养72h后，收获P1代的重组杆状病毒PCV2d-CAP-DC-rBV。其中PCV2d-CAP-DC-rBV毒株于2020年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.20712。
将收获的P1代重组杆状病毒继续在sf9细胞上进行传代，T25细胞瓶27℃静止贴壁培养72h后，收P2代毒，按10％的接毒量接P3代毒，27℃悬浮培养72h后收P3代毒，上清为病毒液，通过间接免疫荧光测病毒液毒价。按照接毒量为0.01MOI，用P3代重组杆毒感染H5细胞，细胞密度为2ⅹ106cells/ml，培养温度为27℃，转速为120r/min，培养7d，细胞自然破碎，离心，上清为抗原液。同时对抗原液、H5细胞对照及P3代病毒液进行SDS-PAGE检测，结果如图2所示。同时对蛋白表达量进行了灰度分析，结果如图3所示，PCV2蛋白表达量为180μg/ml。
实施例四
1.猪圆环CAP-2d亚单位疫苗制备
将实施例3制备的抗原液加入灭活剂BEI，BEI终浓度为1mmol/L，置37℃灭活48 小时。然后将抗原液用PBS稀释后与佐剂ISA206以1:1混合乳化，制成猪圆环CAP-2d 亚单位疫苗，疫苗抗原含量为25μg/mL。
2.猪圆环CAP-2d亚单位疫苗靶动物评价试验
用28日龄健康易感仔猪10头，随机分成2组，每组5头。免疫组颈部肌肉注射疫苗，2.0ml/头；对照组各颈部肌肉注射生理盐水，2.0ml/头，隔离饲养。免后21日、35 日采血，分离血清，用ELISA法检测血清抗体效价。于免后35日用检验用强毒PCV2-HB 株攻击，攻毒剂量为106.0TCID50/ml,每头滴鼻1ml,肌肉注射2ml，隔离饲养，攻毒后临床观察28日，并于攻毒后28日称量体重，计算相对增重率，其计算公式如下。
相对增重率(％)＝(免疫攻毒组平均日增重-对照攻毒组平均日增重)/对照攻毒组平均日增重ⅹ100％
增重统计结果如表1所示，
表1
Figure BDA0002800260850000061
免疫后35天观察期内免疫猪健康状况良好，与非免疫猪一致，未出现因疫苗注射引起的任何局部或全身不良反应，此结果表明该疫苗对靶动物猪是安全的。同时用ELISA方法测定免疫后21日和35日免疫组和对照组仔猪血清中中和抗体效价。如图4所示，免疫组 5头试验猪ELISA抗体检测均为阳性，对照组均为阴性。
攻毒后，攻毒对照组仔猪主要表现为一过性食欲减退、被毛粗糙等，7日后基本恢复正常；而疫苗免疫组攻毒后，采食、饮水、精神、粪便未见异常。如表1所示试验免疫组仔猪日增重率为12.79％，表明通过疫苗免疫可有效抵御强毒攻击引起的猪只增重率下降。
本发明专利提供了一种猪圆环流行毒株PCV2d亚型的CAP序列及该序列在制备CAP-2d亚单位疫苗方面的应用。本发明制备的亚单位疫苗能够产生较高的中和抗体，同时能够抵抗PCV2强毒攻击。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。
序列表
<110> 浙江鼎持生物制品有限公司 北京鼎持生物技术有限公司
<120> 猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用
<141> 2020-11-26
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
atgacttatc ctcgccgtcg ctttcgccgc cgtcgtcatc gtcctcgttc ccatctgggt 60
cagattctgc gtcgccgtcc ttggctggtt catcctcgtc atcgttatcg ttggcgtcgc 120
aaaaatggta ttttcaacac ccgcctgtcc cgcaccatcg gttacactgt gaaaaagacc 180
accgtgcgca ccccttcctg gaacgtggat atgatgcgct tcaacatcaa cgacttcctg 240
cctcctggtg gtggttccaa ccctctgact gtgcctttcg agtactaccg catccgcaag 300
gtgaaggtgg agttctggcc ttgctcccct atcacccagg gtgaccgtgg tgtgggttcc 360
actgctgtta ttctggacga caacttcgtg accaaggcta acgctctgac ctacgaccct 420
tacgtgaact actcctcccg ccacaccatc acccagcctt tttcctacca ctcccgctac 480
ttcaccccta agcctgtgct ggaccgcacc attgactact tccagcctaa caacaagcgc 540
aaccagctgt ggctgcgcct gcaaactact ggtaacgtgg atcacgtggg tctgggcacc 600
gctttcgaaa actccatcta cgaccaggac tacaacatcc gcatcaccat gtacgtgcag 660
ttccgcgagt tcaacctgaa ggaccctcct ctgaacccta agtaa 705
<210> 2
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys
225 230
<210> 3
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggatccgcca ccatgactta tcctcgccgt cgctttcgcc gccgtcgtca tcgtcctcgt 60
tcccatctgg gtcagattct gcgtcgccgt ccttggctgg ttcatcctcg tcatcgttat 120
cgttggcgtc gcaaaaatgg tattttcaac acccgcctgt cccgcaccat cggttacact 180
gtgaaaaaga ccaccgtgcg caccccttcc tggaacgtgg atatgatgcg cttcaacatc 240
aacgacttcc tgcctcctgg tggtggttcc aaccctctga ctgtgccttt cgagtactac 300
cgcatccgca aggtgaaggt ggagttctgg ccttgctccc ctatcaccca gggtgaccgt 360
ggtgtgggtt ccactgctgt tattctggac gacaacttcg tgaccaaggc taacgctctg 420
acctacgacc cttacgtgaa ctactcctcc cgccacacca tcacccagcc tttttcctac 480
cactcccgct acttcacccc taagcctgtg ctggaccgca ccattgacta cttccagcct 540
aacaacaagc gcaaccagct gtggctgcgc ctgcaaacta ctggtaacgt ggatcacgtg 600
ggtctgggca ccgctttcga aaactccatc tacgaccagg actacaacat ccgcatcacc 660
atgtacgtgc agttccgcga gttcaacctg aaggaccctc ctctgaaccc taagtaatct 720
aga 723
<210> 4
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
atgacttatc ctcgccgtcg ctttcgccgc cgtcgtcatc gtcctcgttc ccatctgggt 60
cagattctgc gtcgccgtcc ttggctggtt catcctcgtc atcgttatcg ttggcgtcgc 120
aaaaatggta ttttcaacac ccgcctgtcc cgcaccatcg gttacactgt gaaaaagacc 180
accgtgcgca ccccttcctg gaacgtggat atgatgcgct tcaacatcaa cgacttcctg 240
cctcctggtg gtggttccaa ccctctgact gtgcctttcg agtactaccg catccgcaag 300
gtgaaggtgg agttctggcc ttgctcccct atcacccagg gtgaccgtgg tgtgggttcc 360
actgctgtta ttctggacga caacttcgtg accaaggcta acgctctgac ctacgaccct 420
tacgtgaact actcctcccg ccacaccatc acccagcctt tttcctacca ctcccgctac 480
ttcaccccta agcctgtgct ggaccgcacc attgactact tccagcctaa caacaagcgc 540
aaccagctgt ggctgcgcct gcaaactact ggtaacgtgg atcacgtggg tctgggcacc 600
gctttcgaaa actccatcta cgaccaggac tacaacatcc gcatcaccat gtacgtgcag 660
ttccgcgagt tcaacctgaa ggaccctcct ctgaacccta agtaa 705

Claims (8)

1.猪圆环病毒2d型Cap蛋白，其特征在于，所述2d型Cap蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，编码该Cap蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组杆状病毒的转移载体，其特征在于，所述转移载体包含一个或多个编码2d型Cap蛋白的基因序列，所述基因序列按照昆虫细胞密码子偏爱性优化，如SEQ ID NO.3所示。
3.一种表达权利要求1所述的猪圆环病毒2d型Cap蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，含有猪圆环病毒2d型Cap蛋白基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述重组杆状病毒为PCV2d-CAP-DC-rBV株，该毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.20712。
4.一种如权利要求1所述的2d型CAP蛋白的抗原原液制备方法，其特征在于，包括以下步骤；
(1)合成权利要求1所述的2d型核衣壳蛋白序列，按照昆虫细胞密码子优化后序列如SEQ ID NO.3所示，该序列通过人工合成后连接到杆状病毒表达载体pFastbac11的p10启动子下游，构建pFastbac11-PCV2d-CAP-DC表达载体；
(2)将pFastbac11-PCV2-CAP-DC表达载体转化DH10Bac，通过蓝白斑筛选以及PCR鉴定获得重组杆粒PCV2d-CAP-DC-rBacmid
(3)将重组杆粒PCV2d-CAP-DC-rBacmid转染SF9细胞，27℃，静置培养96h，收获P1代毒，10％接毒量接P2和P3代毒；
(4)P3代毒测毒价，按MOI为0.01-0.1的接毒量接H5细胞进行蛋白表达；
(5)细胞培养7-9d，待细胞完全破碎后，离心，取上清，即为2d型CAP蛋白抗原原液；
(6)2d型CAP蛋白抗原通过SDS-PAGE及灰度分析进行定量。
5.如权利要求3所述的重组杆状病毒在制备猪圆环CAP-2d亚单位疫苗中的应用。
6.如权利要求3所述的重组杆状病毒用于制备猪圆环亚单位疫苗的方法，其特征在于将权利要求3中制备的CAP-2d抗原定量，并与疫苗佐剂ISA206按1:1比例混合乳化，得到猪圆环CAP-2d亚单位疫苗。
7.根据权利要求6所述的重组杆状病毒用于制备猪圆环亚单位疫苗的方法，其特征在于，所述亚单位疫苗CAP-2d蛋白含量为10-50μg/ml。
8.如权利要求6所述的猪圆环CAP-2d亚单位疫苗在预防猪圆环病毒引起的相关疾病中的应用。
CN202011347139.5A 2020-11-26 2020-11-26 猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用 Active CN112501186B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011347139.5A CN112501186B (zh) 2020-11-26 2020-11-26 猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011347139.5A CN112501186B (zh) 2020-11-26 2020-11-26 猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112501186A true CN112501186A (zh) 2021-03-16
CN112501186B CN112501186B (zh) 2023-04-07

Family

ID=74967885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011347139.5A Active CN112501186B (zh) 2020-11-26 2020-11-26 猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112501186B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114315983A (zh) * 2022-01-07 2022-04-12 河南兴华生物技术有限公司 猪圆环病毒亚单位疫苗
CN114480439A (zh) * 2022-02-23 2022-05-13 成都史纪生物制药有限公司 一种猪细小病毒vp2蛋白基因及其应用
CN114805600A (zh) * 2022-03-29 2022-07-29 华南农业大学 猪圆环2d型框架嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及其制备方法与应用
CN114805501A (zh) * 2022-03-24 2022-07-29 中牧实业股份有限公司 一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用
CN115960259A (zh) * 2022-10-07 2023-04-14 浙江大学 一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用
CN117143888A (zh) * 2023-08-29 2023-12-01 上海杰威医药科技有限公司 一种猪圆环病毒2a、2b、2d型三价病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839195A (zh) * 2012-07-18 2012-12-26 华南农业大学 利用pFast Bac Dual杆状病毒表达PCV 2 Cap蛋白的方法
CN103122352A (zh) * 2012-09-27 2013-05-29 华中农业大学 一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用
CN103255171A (zh) * 2013-03-07 2013-08-21 江苏省农业科学院 猪圆环病毒2型密码子优化的orf2基因的重组病毒样粒子
CN105999255A (zh) * 2016-05-19 2016-10-12 华南农业大学 一种猪圆环病毒ii型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN106399350A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 复旦大学 一种猪圆环病毒ii型病毒样颗粒疫苗及其制备方法
CN106399138A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 复旦大学 猪圆环病毒ii型口服病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN108159409A (zh) * 2017-12-25 2018-06-15 南京大爻网络科技有限公司 一种猪圆环病毒3型Cap蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN108355131A (zh) * 2018-02-12 2018-08-03 江苏南农高科技股份有限公司 猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗及其制备方法
CN109810179A (zh) * 2019-02-21 2019-05-28 成都天邦生物制品有限公司 一种分离的核酸分子以及制备猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法
CN109852622A (zh) * 2019-01-18 2019-06-07 南京农业大学 一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用
CN110423269A (zh) * 2019-07-08 2019-11-08 华南农业大学 一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用
CN110893234A (zh) * 2019-12-06 2020-03-20 江苏省农业科学院 一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗
CN110974951A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种二联灭活疫苗及其制备方法
CN111253477A (zh) * 2020-03-10 2020-06-09 天康生物(上海)有限公司 猪圆环病毒3型Cap蛋白、核酸、病毒样颗粒、疫苗及制备方法和应用
CN111647609A (zh) * 2019-03-04 2020-09-11 上海市农业科学院 一种优化的PCV2d ORF2基因及病毒样颗粒的制备方法

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102839195A (zh) * 2012-07-18 2012-12-26 华南农业大学 利用pFast Bac Dual杆状病毒表达PCV 2 Cap蛋白的方法
CN103122352A (zh) * 2012-09-27 2013-05-29 华中农业大学 一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用
CN103255171A (zh) * 2013-03-07 2013-08-21 江苏省农业科学院 猪圆环病毒2型密码子优化的orf2基因的重组病毒样粒子
CN105999255A (zh) * 2016-05-19 2016-10-12 华南农业大学 一种猪圆环病毒ii型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN106399350A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 复旦大学 一种猪圆环病毒ii型病毒样颗粒疫苗及其制备方法
CN106399138A (zh) * 2016-09-07 2017-02-15 复旦大学 猪圆环病毒ii型口服病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN108159409A (zh) * 2017-12-25 2018-06-15 南京大爻网络科技有限公司 一种猪圆环病毒3型Cap蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN108355131A (zh) * 2018-02-12 2018-08-03 江苏南农高科技股份有限公司 猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗及其制备方法
CN109852622A (zh) * 2019-01-18 2019-06-07 南京农业大学 一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用
CN109810179A (zh) * 2019-02-21 2019-05-28 成都天邦生物制品有限公司 一种分离的核酸分子以及制备猪圆环病毒2型Cap蛋白的方法
CN111647609A (zh) * 2019-03-04 2020-09-11 上海市农业科学院 一种优化的PCV2d ORF2基因及病毒样颗粒的制备方法
CN110423269A (zh) * 2019-07-08 2019-11-08 华南农业大学 一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用
CN110893234A (zh) * 2019-12-06 2020-03-20 江苏省农业科学院 一种犬瘟热、犬细小病毒病、狂犬病三联亚单位疫苗
CN110974951A (zh) * 2019-12-31 2020-04-10 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种二联灭活疫苗及其制备方法
CN111253477A (zh) * 2020-03-10 2020-06-09 天康生物(上海)有限公司 猪圆环病毒3型Cap蛋白、核酸、病毒样颗粒、疫苗及制备方法和应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
侯强等: "猪圆环病毒2d亚型病毒样颗粒的制备与鉴定", 《中国兽医科学》 *
秦浚川、胡敏: "以杆状病毒为载体在昆虫细胞中高效表达外源基因", 《国外医学(分子生物学分册)》 *
黄娟等: "猪圆环病毒2d亚型衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达", 《农业生物技术学报》 *
黄辰等: "《医学实验研究概论》", 31 July 2014, 西安交通大学出版社 *
龙子江等: "《生物化学与分子生物学实验技术教程》", 31 January 2020, 中国科学技术大学出版社 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114315983A (zh) * 2022-01-07 2022-04-12 河南兴华生物技术有限公司 猪圆环病毒亚单位疫苗
CN114315983B (zh) * 2022-01-07 2023-07-25 河南兴华生物技术有限公司 猪圆环病毒亚单位疫苗
CN114480439A (zh) * 2022-02-23 2022-05-13 成都史纪生物制药有限公司 一种猪细小病毒vp2蛋白基因及其应用
CN114805501A (zh) * 2022-03-24 2022-07-29 中牧实业股份有限公司 一种猪圆环病毒2型抗原组合物及其在抗原定量方法中的应用
CN114805600A (zh) * 2022-03-29 2022-07-29 华南农业大学 猪圆环2d型框架嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及其制备方法与应用
CN114805600B (zh) * 2022-03-29 2024-03-29 华南农业大学 猪圆环2d型框架嵌合猪O型口蹄疫病毒抗原表位的VLPs及其制备方法与应用
CN115960259A (zh) * 2022-10-07 2023-04-14 浙江大学 一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用
CN115960259B (zh) * 2022-10-07 2023-11-24 浙江大学 一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用
CN117143888A (zh) * 2023-08-29 2023-12-01 上海杰威医药科技有限公司 一种猪圆环病毒2a、2b、2d型三价病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112501186B (zh) 2023-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112501186B (zh) 猪圆环病毒2d型CAP蛋白及其在亚单位疫苗制备中的应用
CN104248762B (zh) 一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用
CN110317278B (zh) Svv和fmdv的融合蛋白及其编码基因、表达载体、细胞系、工程菌和疫苗与应用
CN110423269B (zh) 一种串联优势表位的重组猪圆环病毒2型Cap蛋白及其应用
CN107841507A (zh) 一种高效表达的猪圆环病毒2型Cap‑穿膜肽融合蛋白基因及其应用
CN110327461B (zh) 一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用
CN111808176B (zh) 牛疱疹病毒抗原组合物及其应用
CN108101967B (zh) Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、制备方法及其应用
CN114163505B (zh) 猪瘟、猪伪狂犬病毒二联亚单位疫苗及其制备方法
CN113862284B (zh) 一种编码重组禽流感病毒ha蛋白的基因、病毒样颗粒、疫苗及制备与应用
CN112940084B (zh) 一种血清4型禽腺病毒亚单位疫苗及其应用
CN110358741A (zh) 一种表达猪塞内卡病毒vp2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用
CN114524862A (zh) 禽流感(h5+h7)三价dna疫苗的构建及其应用
CN112386685A (zh) 一种pcv2型杆状病毒、猪肺炎支原体、猪流感病毒、副猪嗜血杆菌四联灭活疫苗
CN112294953A (zh) 一种pcv2型杆状病毒载体、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌三联灭活疫苗及制备方法
CN109021115A (zh) 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗
CN112442131B (zh) 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的传染性法氏囊病疫苗和应用
CN107868131A (zh) 一种猪细小病毒病亚单位疫苗及其制备方法
CN114767845B (zh) 一种重组流感亚单位疫苗
CN116102660B (zh) 一种猪细小病毒基因工程表位疫苗及其制备方法
CN115044562B (zh) 一种嵌合表达分子佐剂的重组狂犬病病毒及其制备方法与应用
CN107779457A (zh) 疫苗组合物及其制备方法和应用
CN113827714B (zh) 一种h7n9亚型禽流感病毒样颗粒疫苗制剂及制备和应用
CN112891528B (zh) 一种鸡传染性支气管炎疫苗株
CN112439057B (zh) 基于自组装铁蛋白纳米抗原颗粒及由其制备的猪瘟疫苗和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant