CN115960259B - 一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学及生物医学技术领域，涉及嵌合猪圆环病毒样颗粒的制备，以及双组分纳米颗粒在疫苗领域的应用。本发明公开了基于PCV2VLP的二联疫苗的制备方法：将SpyCatcher基因融合到PCV2Cap蛋白的C端构建Cap‑SC VLP，同时表达携带SpyTag的CSFV E2蛋白；基于SpyTag和SpyCatcher之间的异肽键形成，ST‑GFP和E2‑ST在体外与Cap‑SC VLP表面暴露的SpyCatcher结合，从而实现ST‑GFP和E2‑ST全长蛋白在PCV2VLP的表面展示。本发明的CSFV‑PCV2二联颗粒疫苗Cap‑E2NPs在细胞免疫方面表现出明显的性能提升。

Description

一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学及生物医学技术领域，涉及嵌合猪圆环病毒样颗粒的制备，以及双组分纳米颗粒在疫苗领域的应用。

背景技术

疫苗免疫失败是猪瘟病毒(CSFV)不断复发和流行的一个重要原因。临床上造成CSFV免疫失败的主要原因除了不合理的免疫程序、母源抗体干扰、持续性感染造成的免疫耐受，还有猪群中其它病原感染造成的免疫抑制。猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)作为免疫抑制性病原，在兽医临床具有很高的检出率。有流行病学调查显示，有15.87％的猪场中存在CSFV-PRRSV共感染，有13.06％的猪场中存在CSFV-PCV2共感染，甚至CSFV-PRRSV-PCV2三重感染的猪场也达到了9.53％，这很可能是PCV2和PRRSV相关的免疫抑制引起的。以PCV2为例，其对淋巴组织具有首选的细胞噬性，从而负调节胸腺中T细胞选择过程，导致病猪明显的淋巴耗竭和免疫抑制。这些免疫抑制性因素的存在使得CSFV的防控和净化更加困难。因此，研发二联疫苗针对CSFV和这些免疫抑制性病原同时免疫，可能是一种可供选择的防控策略。

Cap蛋白是PCV2唯一的衣壳蛋白。PCV2病毒样颗粒(VLPs)由60个Cap单体组装而成，并已成功开发作为商品化疫苗预防PCV2感染。这些疫苗接种后可显著缓解与PCV2相关的临床症状和病理变化。目前，已有研究表明PCV2 VLP可作为有效的抗原载体来递送外源蛋白或表位，从而诱导针对外源性抗原的免疫反应。研究人员通过将外源多肽融合在PCV2Cap的N端或C端，从而构建多种基于Cap融合蛋白的嵌合PCV2 VLPs[191,249]。值得注意的是，这些融合蛋白并未损害PCV2 Cap骨架的自组装能力。然而，由于Cap N端隐藏在衣壳内并参与组装后的病毒基因组包装，融合在PCV2 Cap的N端的外源多肽很可能也被包埋，而不会展示在嵌合PCV2 VLP的表面。外源多肽插入到Cap的C末端构建的嵌合PCV2 VLPs，免疫后可在猪体和小鼠中同时诱导针对PCV2 Cap和外源多肽的抗体。因此，Cap的C端适合插入外源多肽构建嵌合PCV2 VLPs，可应用于开发多联疫苗。

然而，以上嵌合PCV2 VLPs的研究仅限于通过基因融合的方式，递送的外源抗原也仅限于多肽。目前还没有研究报道携带较大外源蛋白的嵌合PCV2 VLPs疫苗。利用基因融合将外源表位或多肽整合到VLPs中很大程度上受限于插入多肽的大小和空间结构，插入分子量大、三维结构复杂的蛋白质往往对VLP组装、溶解性、蛋白质折叠以及VLP稳定性造成负面影响。由于CSFV E2结构复杂，有很多中和表位都是构象依赖的，因此E2的正确折叠直接关系到免疫保护效力。新出现的SpyCatcher/SpyTag技术结合了基因融合和标签偶联的优势，可允许在VLP上展示分子量更大且结构更复杂的蛋白质。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术中的不足，为了更好地防控CSFV和PCV2的混合感染，提出了一种基于PCV2 VLP的二联疫苗研发策略。

为解决技术问题，本发明提供一种基于PCV2 VLP的二联疫苗的制备方法：将SpyCatcher(SC，86aa)基因融合到PCV2 Cap蛋白的C端构建Cap-SC VLP，同时表达携带SpyTag(ST，13aa)的CSFV E2蛋白(E2-ST)；基于SpyTag和SpyCatcher之间的异肽键形成，ST-GFP和E2-ST在体外与Cap-SC VLP表面暴露的SpyCatcher结合，从而实现ST-GFP和E2-ST全长蛋白在PCV2 VLP的表面展示；所述目的基因Cap-SC、E2-ST的编码序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了由前所述目的抗原Cap-SC、E2-ST，氨基酸序列分别如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明进一步提供了前述猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒(双组分纳米颗粒Cap-E2NPs)的制备方法，包括以下步骤：

(1)pET28a-Cap-SC原核表达载体构建和蛋白表达。Cap-SpyCatcher(Cap-SC)构建包括N端6×His标签、PCV2 Cap(第16到233位氨基酸)、柔性linker(GGGGS)和截短的SpyCatcher，针对大肠杆菌密码子偏好性进行优化后，采用基因合成合成。然后通过体外同源重组的方法将编码Cap-SC的DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中，构建pET28a-Cap-SC；重组质粒pET28a-Cap-SC转化到大肠杆菌Transetta(DE3)，诱导蛋白表达，并纯化获得Cap-SC融合蛋白；

(2)HTA-E2-ST的构建和蛋白表达。E2-Spytag(E2-ST)构建包括N端分泌信号肽SP23、CSFV E2ZJ蛋白、SpyTag和6His标签，通过融合PCR合成。然后通过体外同源重组的方法将编码E2-ST的DNA序列克隆到杆状病毒表达载体pFastBac HTA构建HTA-E2-ST。HTA-E2-ST转化DH10Bac，随后按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统(Invitrogen，cat.10359016)说明书，经Tn7转座、蓝白斑筛选、杆粒提取和转染获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染足量的昆虫细胞，纯化获得E2-ST融合蛋白；

(3)纯化的E2-ST在体外与Cap-SC VLPs偶联以构建双组分Cap-GFP纳米颗粒(NPs)。Cap-SC VLPs与E2-ST以1:4的摩尔比混合，获得双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs。

在本发明中：

为了探索最优偶联效率，Cap-SC VLP与E2-ST在25℃下以1:3、1:4或1:5的摩尔比混合过夜。使用SDS-PAGE评估偶联效率。对于疫苗的制备和纯化，Cap-SC VLPs与E2-ST以1:4的摩尔比在25℃下混合过夜，以确保反应结束最少的Cap-SC VLP残留。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析这些反应体系。为了评估与E2-ST反应的Cap-SC VLPs的百分比，同时制备相同起始浓度的未反应的Cap-SC VLPs样品。并使用ImageJ软件分析SDS-PAGE结果上各个条带的光密度值。偶联效率定义为100×[1–(偶联反应后的Cap-SC VLPs条带)/(偶联反应前的Cap-SC VLPs条带)]。通过superpose 6分子排阻色谱柱纯化偶联的Cap-E2 NPs，以去除未反应完全的E2-ST。

本发明进一步提供了利用前述双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs进一步制备CSFV-PCV2二联颗粒疫苗的方法，是将Cap-E2 NPs与Seppic 206水佐剂充分混合、乳化，制得纳米颗粒疫苗。

本发明进一步提供了前述方法制备获得的CSFV-PCV2二联颗粒疫苗在小鼠模型的免疫效力评价研究。

目前PCV2 VLP递送疫苗抗原受到PCV2 Cap C端插入容量(100个氨基酸以内)的限制。本发明提出了一种模块化的双组分纳米颗粒制备技术，可容许在PCV2 VLP表面展示接近天然构象的、全长CSFV E2抗原。其优势体现在保留了纳米颗粒骨架(PCV2VLP)的免疫潜能，同时最大化展示抗原的免疫效力。通过这种模块化组装，有望随流行毒株变异，实现快速更新疫苗、提高免疫保护力的目标。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提出了一种纳米疫苗开发平台，可以轻松地在PCV2 VLP表面上展示抗原。与常规的CSFV亚单位疫苗相比，该方法制备的CSFV-PCV2二联颗粒疫苗Cap-E2 NPs在抗原提呈、特异性抗体滴度、抗体亲和力、IgG亚类分布和细胞免疫方面均表现出明显提升的性能。而且，针对Cap VLP骨架的免疫应答与针对展示抗原E2的免疫应答未出现明显干扰(图5、图6)。Cap-E2 NPs诱导了与天然PCV2 VLPs相当的特异性抗体和中和抗体水平。总而言之，Cap-E2 NPs可同时诱导针对CSFV和PCV2的免疫应答，该策略具有开发基于PCV2 VLPs的二价纳米疫苗的巨大潜力。

附图说明

图1为该二联疫苗制备原理图；

图1中：

A为表达载体构建图，B为模块化疫苗组装示意图，C为SpyCatcher与SpyTag结合示意图；

图2为Cap-E2 NPs制备和表征图；

图2中：

A为Cap-E2 NPs制备SDS-PAGE电泳图、B为Cap-E2 NPs的透射电镜分析、C为动态光散射分析图；

图3为抗原提呈细胞对SP-E2-mi3 NPs内化效率分析；

图4为免疫实验分组和抗原剂量设置；

图5为Cap-E2 NPs诱导的PCV2特异性免疫应答；

图5中：

A为免疫后14天和28天时，Cap-E2 NPs诱导的PCV2 Cap特异性IgG水平，B为免疫后28天时，Cap-E2 NPs诱导的PCV2 Cap特异性IgG的相对亲和力分析，C为免疫后28天时，Cap-E2 NPs诱导的PCV2特异性中和抗体水平；

图6为Cap-E2 NPs诱导的CSFV特异性体液免疫应答；

图6中：

A为免疫后14天时，Cap-E2 NPs诱导的CSFV E2特异性IgG水平，B为免疫后28天时，Cap-E2 NPs诱导的CSFV E2特异性IgG水平，C为免疫后28天时，Cap-E2 NPs诱导的CSFV E2特异性IgG的相对亲和力分析，D为免疫后28天时，Cap-E2 NPs诱导的CSFV特异性中和抗体水平；

图7为Cap-E2 NPs诱导的CSFV特异性细胞免疫应答；免疫后28天处死小鼠，无菌采集脾脏，分离脾淋巴细胞。将重组E2蛋白用RPMI 1640完全培养基调整为10μg/mL，添加到淋巴细胞中。在37℃、5％CO2的条件下继续孵育2天后，每孔加入20μL终浓度为5mg/mL的MTS溶液。37℃孵育4小时后，按照公式计算刺激指数(SI)：SI＝(免疫组OD值-空白对照OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照OD值)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，而不意图限制本发明的范围。

实施例1、-双组分Cap-GFP NPs(即，双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs)的制备

1)目的基因的合成

原理如图1B所示，根据设计的序列，按照昆虫细胞密码子偏好性进行核苷酸序列优化，并交由基因合成公司合成(质粒构建如图1A所示)。

具体如下：

1.1)、如图1A所示：

Cap-SpyCatcher(Cap-SC)构建包括N端6×His标签、PCV2 Cap(第16到233位氨基酸)、柔性linker(GGGGS)和截短的SpyCatcher，针对大肠杆菌密码子偏好性进行优化后，采用基因合成的方式合成；从而获得Cap-SC基因(其编码序列如SEQ ID NO.1所示)，并通过同源重组的方式，插入到表达载体pET28a中，得到pET28a-Cap-SC原核表达载体。

SP-E2-Spytag(E2-ST)构建包括N端分泌信号肽SP23、CSFV E2ZJ蛋白、SpyTag和6His标签，通过融合PCR合成，从而得到E2-ST基因(其编码序列如SEQ ID NO.2所示)。然后通过体外同源重组的方法将编码E2-ST基因克隆到杆状病毒表达载体pFastBac HTA，从而获得HTA-E2-ST载体。

1.2)、如图1B所示：

疫苗装配原理为Cap-SC基因编码的蛋白Cap-SC与E2-ST基因编码的蛋白在体外简单混合，即可获得双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs。化学反应机制如图1C所示，SC中的赖氨酸与ST中的天冬氨酸可自发形成异肽键。

2)E2-ST蛋白表达

将步骤1.1)所得的阳性质粒(HTA-E2-ST载体)转化DH10Bac感受态细胞，48h后挑选白斑，提取相应的杆粒，然后按照Invitrogen说明书，用脂质体转染试剂Reagent转染昆虫的SF9细胞；27℃培养96h，细胞出现病变，收集P1代病毒液，将P1代病毒液重新感染High Five细胞，27℃培养96h后收获P2代病毒液，同样的方法获取P3代病毒液。用300mL昆虫细胞培养基在250mL摇瓶里培养Sf9细胞，当细胞密度到达2.5×10⁶个/ml时，用所得的P3代病毒液以MOI＝5感染Sf9细胞，27℃，115rpm培养96h，超声破碎，然后4000rpm离心10min，收集上清，用镍柱纯化E2-ST蛋白，从而获得纯化的E2-ST。

3)Cap-SC蛋白的表达及纯化

步骤1.1)所得的重组质粒pET28a-Cap-SC转化到大肠杆菌Transetta(DE3)，使用优化的IPTG浓度诱导蛋白表达，并纯化获得Cap-SC融合蛋白。

具体如下：将10mL重组质粒pET28a-Cap-SC过夜培养物接种到含有100μg/mL卡那霉素的400mL LB培养基中，并在37℃，220rpm下扩大培养。当OD600达到0.6–0.8时，添加终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。在16℃下继续诱导20小时后，4℃下高速离心收集细菌菌体，菌体使用平衡缓冲液(200mM NaCl，50mM Tris，10mM咪唑，1mM PMSF，pH 8.0)重悬。在冰浴上使用超声波裂解菌体直至澄清。然后经高速离心后收集上清液，并通过0.22μm过滤除去杂质。然后，将上清液加入到预先平衡的Ni-NTA琼脂糖凝胶中后，4℃摇床结合过夜。随后将结合蛋白的琼脂糖凝胶加入到重力型蛋白纯化空柱中，收集流出液后续鉴定纯度，并通过线性梯度缓冲液(200mM NaCl，50mM Tris，10mM-500mM咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白；经SDS-PAGE电泳鉴定纯度后，纯度较高的Cap-SC蛋白，收集在一起，经体外组装后所得为Cap-SC VLPs。

4)Cap-E2 NPs的制备和纯化

纯化的E2-ST在体外与Cap-SC VLPs偶联以构建Cap-E2 NPs。为了探索最优偶联效率，Cap-SC VLP与E2-ST在25℃下以1:3、1:4或1:5的摩尔比混合过夜。使用SDS-PAGE评估偶联效率。对于疫苗的制备和纯化，Cap-SC VLPs与E2-ST以1:4的摩尔比在25℃下混合过夜，以确保反应结束最少的Cap-SC VLP残留。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析这些反应体系。E2-ST反应的CapSC VLPs的百分比，同时制备相同起始浓度的未反应的Cap-SC VLPs样品。并使用ImageJ软件分析SDS-PAGE结果上各个条带的光密度值。偶联效率定义为100×[1–(偶联反应后的Cap-SC VLPs条带)/(偶联反应前的Cap-SC VLPs条带)]。通过superpose6分子排阻色谱柱纯化偶联的Cap-E2 NPs，以去除未反应完全的E2-ST。使用SDS-PAGE检测步骤2)制备E2-ST蛋白的和步骤3)制备的Cap-SC融合蛋白，以及本步骤获得的Cap-E2 NPs的大小和纯度。结果如图2A所示。

根据图2A可得知：第1泳道(最左边)为蛋白Marker，第2泳道为蛋白Cap-SC，第3泳道为蛋白E2-ST，第4泳道为蛋白Cap-E2 NPs。

5)纳米颗粒自装配表征

使用负染色透射电子显微镜(TEM)分析NP的自组装情况。简而言之，首先将样品(Cap-E2 NPs)滴加到碳涂层包被的铜网上吸附60秒。PBS轻轻洗掉多余的样品后，用滤纸吸干多余的PBS。然后滴加2％(w/v)PTA(磷钨酸)到铜网上染色60秒。滤纸吸干多余的染色液，然后将负染色样品的样品置于干燥箱中烘干。随后使用配备Gatan OneView相机的透射电子显微镜在80kV的加速电压下收集图像。同时，使用NicompTM380粒度分级系统(SantaBarbara)上在25℃下，通过动态光散射(DLS)分析纳米颗粒的直径和粒径分布范围。结果如图2B所示，TEM分析证显示大小均一的Cap-E2 NPs，并且经图2C结果证实，动态光散射验证，Cap-E2 NPs平均直径为33.4nm。这进一步确认了E2-ST在Cap-SC VLPs上的表面展示。

6)BM-DCs内化实验

BM-DCs细胞对Cap-E2 NPs的内化实验按照以下步骤进行：

将BM-DCs细胞以2×10⁵个/mL的密度预接种在6孔细胞培养板中并培养过夜。然后加入E2-ST或Cap-E2 NPs(相同的E2-ST摩尔数)，并在37℃下孵育6小时。细胞经4％多聚甲醛固定后，使用CSFV E2单克隆抗体3C12和FITC标记的驴抗鼠IgG对内化的E2-ST进行标记。最后使用DAPI溶液(1μg/mL)对细胞核染色5分钟，并通过激光共聚焦显微镜记录E2-ST的细胞内化情况。结果如图3所示，Cap-E2 NPs与BM-DCs一起孵育后，通过IFA和激光共聚焦显微镜证实，与可溶性E2-ST组相比，Cap-E2 NPs组显示出更高的荧光强度。这些结果表明，Cap-SC VLPs展示的抗原可利用PCV2 VLP的固有优势，能够更有效地被BM-DCs摄取并内化。

实施例2、-Cap-E2 NPs纳米颗粒疫苗的制备及动物免疫实验

将实施例1表达的Cap-E2 NPs与Seppic 206佐剂以1：1的体积比，按照350rpm混匀10min，成苗4℃保存。

试验例1

雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)随机分入笼中，每组5只动物，经适应性饲养14天后注射疫苗并进行后续实验。抗原设置如图4示，并与等体积的ISA-206佐剂一起乳化配制疫苗。每种疫苗均采用单剂量的对小鼠进行皮下免疫。各分组中待测抗原剂量和动物分组如图4所示。

即I组对小鼠免疫时的Cap剂量分别为：3.5μg，E2剂量为10μg，总剂量为14.6μg；II组对小鼠免疫时的Cap剂量分别为：3.5μg，E2剂量为10μg，总剂量为13.5μg；III组对小鼠免疫时的Cap剂量分别为：0μg，E2剂量为10μg；VI组对小鼠免疫时的仅免疫PBS作为安慰剂对照。特别注意，以上分组中为了方便比较，剂量均根据偶联效率来确定。总剂量中，I组中1.1μg SC和ST由于分子量较小且根据以上报道，其引起的免疫应答，不考虑进去。

实验1：

本发明首先使用间接ELISA评估了与天然的Cap VLPs相比，偶联E2-ST的Cap-SCVLPs(Cap-E2 NPs)在免疫后第14天和28天时诱导的Cap特异性IgG水平(图5A)。在14天和28天时，在接种PBS的对照小鼠Cap特异性IgG呈阴性。接种天然Cap VLPs或Cap-E2 NPs的小鼠产生了强烈的Cap特异性IgG反应。而且，在天然Cap VLP或Cap-E2 NPs免疫组中使用相同量的Cap蛋白，Cap VLPs和Cap-E2 NPs组之间的Cap特异性IgG反应在14dpi或28dpi均没有显著差异(P>0.05)。

同样，在免疫后第28天时，本发明按照常规的8M尿素洗脱低亲和力抗体的方法评估了抗体亲和力。

如图5B所示，亲和力ELISA显示，天然Cap VLPs诱导的IgG具有比Cap-E2 NPs诱导的IgG更高的相对亲和力(0.33vs 0.3)，但在28dpi时没有达到显著差异(图5B，P>0.05)。通过测量免疫血清对同源PCV2d JH毒株的阻断活性来检测抗体中和水平。并且，在免疫后第28天时，本发明评估了中和抗体水平，如图5C所示，在28dpi时，接种天然Cap VLPs的小鼠产生平均滴度为1:20的中和抗体，而接种Cap-E2 NPs的小鼠产生平均滴度为1:16的中和抗体。两组中和抗体滴度差异无统计学意义(P>0.05)。接受PBS的对照小鼠对PCV2特异性中和抗体反应呈阴性。基于这些结果，通过SpyTag/Catcher技术在Cap-SC VLP上偶联E2-ST抗原构建的Cap-E2 NPs诱导Cap特异性抗体和PCV2特异性中和抗体的能力与天然的Cap VLPs相比，没有受到明显影响。

实验2：

为了研究Cap-E2 NPs和E2-ST在诱导CSFV特异性体液免疫上的差异，本发明首先评估了抗原特异性IgG。单剂量的每种疫苗接种小鼠后，收集14dpi和28dpi的血清用于间接ELISA分析。结果显示，无论是在14dpi还是28dpi，Cap-E2 NPs免疫诱导了最高的E2特异性IgG水平，显著高于Cap plus E2组(Cap VLP混合E2-SpyTag)和单独E2组(E2-SpyTag)(图6A-B，p<0.01)。而Cap plus E2组和单独E2组之间没有观察到显著差异。除了E2特异性IgG水平，我们还在28dpi评估了E2特异性IgG的相对亲和力。如图6C所示，与Cap plus E2组和单独E2组相比，Cap-E2 NPs免疫组中E2特异性IgG的相对亲和力显著提高(p<0.05)。

实验3：

由于中和抗体在CSFV体内免疫保护中起重要作用，因此本发明进一步测定针对CSFV Shimen强毒株的VNT滴度。在免疫后第28天，与PBS对照组相比，所有免疫组的VNT滴度显著增加，Cap-E2 NPs组的平均滴度为1:572，Cap plus E2组的平均滴度为1:101，单独E2组的平均滴度为1:72(图6D)。Cap-E2 NPs组的VNT滴度显著高于Cap plus E2组(p<0.05)和单独E2组(p<0.01)。基于这些结果，与可溶性E2亚单位疫苗相比，Cap-E2 NPs接种产生了更高水平和亲和力的特异性IgG，以及更高的中和抗体水平，表明Cap-SC NPs具有增强免疫保护的潜力。

实验4：

为了评估Cap-E2 NPs在诱导CSFV特异性细胞免疫上的优势，本发明分离来自各免疫组的脾脏淋巴细胞，检测淋巴细胞增殖活性。如图7所示，增殖试验表明，经重组E2抗原刺激后，Cap-E2 NPs组比Cap plus E2组和单独E2组具有显著增强的淋巴细胞刺激指数SI(与Cap plus E2组相比，p<0.05；与单独E2组相比，p<0.01)。Cap plus E2组和单独E2组之间未检测到显著差异。相对于单独E2组，Cap plus E2组的SI略有增加，这可能是由Cap VLPs的佐剂效应引起的。

以上所述仅是本发明的实施方式，应当指出，对于本技术邻域的技术人员，在不脱离本法名技术原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）pET28a-Cap-SC原核表达载体构建和蛋白表达：

Cap-SpyCatcher构建包括N端6×His标签、PCV2 Cap、柔性linker和截短的SpyCatcher，针对大肠杆菌密码子偏好性进行优化后，采用基因合成的方式合成，从而获得Cap-SC基因，所述Cap-SC基因编码序列如SEQ ID NO.1所示，然后通过体外同源重组的方法将编码Cap-SC的DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中，构建pET28a-Cap-SC；重组质粒pET28a-Cap-SC转化到大肠杆菌 Transetta，诱导蛋白表达，并纯化获得Cap-SC融合蛋白；

（2）HTA-E2-ST的构建和蛋白表达：

SP-E2-Spytag构建包括N端分泌信号肽SP23、CSFV E2ZJ蛋白、SpyTag和6xHis标签，通过融合PCR合成，从而得到E2-ST基因，所述E2-ST基因编码序列如SEQ ID NO.2所示；然后通过体外同源重组的方法将编码E2-ST的DNA序列克隆到杆状病毒表达载体pFastBac HTA构建HTA-E2-ST；HTA-E2-ST转化DH10Bac，随后按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书，经Tn7转座、蓝白斑筛选、杆粒提取和转染获得重组杆状病毒；将重组杆状病毒感染足量的昆虫细胞，纯化获得E2-ST融合蛋白；

（3）纯化的E2-ST在体外与Cap-SC VLPs偶联以构建双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs：

Cap-SC VLPs与E2-ST以1:4的摩尔比混合，获得双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs。

2.CSFV-PCV2二联颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：利用权利要求1所述方法制备获得的双组分纳米颗粒Cap-E2 NPs，将Cap-E2 NPs与Seppic 206水佐剂充分混合、乳化，制得CSFV-PCV2二联颗粒疫苗。

3.如权利要求2所述方法制备获得的CSFV-PCV2二联颗粒疫苗在制备防治猪瘟病毒感染药物中的应用。