CN112062862B - 疫苗通用载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基于SpyCatcher/SpyTag构建的以乙肝病毒核心蛋白为基础的疫苗通用载体HBc‑S和HBc(1‑183)‑S，SpyCatcher展示于VLPs的主要免疫优势区，可与表位多肽氨基端的SpyTag发生黏合反应，将线性、环形和磷酸化B细胞表位SP展示在VLPs表面，制备了一系列HBc‑S‑P VLPs疫苗。该疫苗免疫小鼠可产生特异性针对表位的抗体；HBc‑S‑pTau422显著改善阿尔兹海默症转基因小鼠的认知及病理变化；HBc(1‑183)‑S诱导Th1型免疫反应，HBc(1‑183)‑S‑OVA疫苗呈VLP结构，能够激活并促进DCs的成熟，显著抑制肿瘤的生长并延长其生存期。

Description

疫苗通用载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及疫苗通用载体及其制备方法和应用，尤其涉及SpyCatcher蛋白和截短乙肝病毒核心蛋白或全长乙肝病毒核心蛋白融合表达的疫苗通用载体蛋白及其制备方法和应用。
背景技术
乙型肝炎病毒核心蛋白是乙肝病毒(Hepatitis B)的核衣壳结构蛋白，能够自组装成粒径约为30nm的病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)，易于进入淋巴结。HBc VLPs颗粒大小适中，易于被抗原呈递细胞以胞吞或胞饮的方式非特异摄取，具有很强的佐剂作用，可以通过T细胞依赖或T细胞非依赖的方式激活免疫系统，并含有丰富的T辅助(Thelper，Th)细胞表位，可以激活Th细胞，介导适应性免疫应答。HBc VLPs还可以通过与BCR交联，以不依赖T细胞的方式激活B细胞，打破机体的免疫耐受。HBc VLPs通过交联作用与IgM和补体结合，促进HBc VLPs被滤泡树突状细胞(Follicular dendritic cell，FDC)捕捉，利用Fc段与补体受体结合形成HBc-VLP/IgM/补体复合体，展示抗原，激活B细胞表达高亲和力抗体，促进抗体的亲和力成熟。HBc VLPs被抗原呈递细胞吞噬后，可以通过交叉呈递的方式激活CD8+T细胞，引起细胞免疫反应。截短的HBc(1-149)可以引发机体的Th2型免疫反应，而全长的HBc(1-183)的鱼精蛋白结构域携带有宿主ssRNA，可以激活TLR7，引发Th1型免疫反应。
HBc的主要免疫优势区(Major immunodominant region，MIR)可以插入外源序列，融合表达构建嵌合VLP疫苗，诱导机体产生针对插入序列的特异性强免疫反应。但是，插入的外源序列可能导致VLP结构不稳定，影响组装和免疫原性。另外，融合表达构建不同的重组蛋白需要消耗大量的时间、人力和物力。化学偶联方法需要大量的偶联试剂，VLPs表面的偶联位点不确定，导致颗粒的均一性弱，影响免疫原性，并且融合表达和化学偶联均不利于多靶点和个性化疫苗的研究和应用。
因此，有必要提供新的策略构建基于乙型肝炎病毒核心蛋白的疫苗，提高疫苗的通用性、安全性和稳定性。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了疫苗通用载体及其制备方法和应用，利用SpyCatcher/SpyTag技术，基于截短HBc或全长HBc构建得到通用Th2型或Th1型疫苗载体蛋白，所述载体蛋白通过简单的混合可以快速粘合B细胞表位或T细胞表位，实现个性化疫苗的快速、简单制备。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种疫苗载体蛋白，所述疫苗载体蛋白包括SpyCatcher蛋白和与所述SpyCatcher蛋白融合表达的乙肝病毒核心蛋白。
乙肝病毒核心蛋白不包含病毒基因组，可以自组装形成病毒样颗粒，安全性高，目前已广泛应用于疫苗制备领域，如流感疫苗ACAM-FLU-ATM和疟疾疫苗ICC-1132即利用乙肝病毒核心蛋白作为疫苗载体；本发明中，将SpyCatcher蛋白插入截短乙肝病毒核心蛋白的主要免疫优势区，形成重组疫苗载体蛋白，通过粘合神经退行性疾病的相关线性、环形或修饰型表位多肽，实现了刺激机体产生高滴度抗体的目的；将SpyCatcher蛋白插入全长乙肝病毒核心蛋白的主要免疫优势区，形成重组疫苗载体蛋白，通过粘合肿瘤的相关抗原，刺激机体产生特异性CD8+T细胞免疫反应。
优选地，所述SpyCatcher蛋白包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
DSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHI
本发明中，如SEQ ID NO:1所示的SpyCatcher蛋白为N端截短的SpyCatcher(ΔN1SpyCatcher)。
优选地，所述乙肝病毒核心蛋白包括截短乙肝病毒核心蛋白和/或全长乙肝病毒核心蛋白。
本发明中，乙肝病毒核心蛋白的前183位氨基酸可组装形成病毒样颗粒，不含病毒基因组DNA，安全性较高，适用于作为疫苗载体以提高表位多肽的抗原性，本发明中，截短乙肝病毒核心蛋白的氨基酸序列优选为N端位于第1位且C端位于第149位，全长乙肝病毒核心蛋白的氨基酸序列优选为N端位于第1位且C端位于第183位。
优选地，所述截短乙肝病毒核心蛋白的分子量为12～15kD，例如可以是12kD、13kD、14kD或15kD，优选为13～14kD，进一步优选为14kD。
优选地，所述截短乙肝病毒核心蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
优选地，所述SpyCatcher蛋白融合表达于所述截短乙肝病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之间。
本发明中，乙肝病毒核心蛋白的第78位Asp和第79位Pro之间为主要免疫优势区，将SpyCatcher蛋白插入该位点，增强了SpyCatcher在VLP表面的展示；同时，为保证HBc的正确自组装以及SpyCatcher在HBc VLPs表面的正确展示，在ΔN1SpyCatcher基因的插入位点的两侧引入GSG linker和两个谷氨酸(E)。
优选地，所述疫苗载体蛋白包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:3：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDEEGSGDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGSGEEPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
优选地，所述全长乙肝病毒核心蛋白的分子量为12～21kD，例如可以是12kD、13kD、14kD、15kD、16kD、17kD、18kD、19kD、20kD或21kD，优选为20～21kD，进一步优选为21kD。
优选地，所述全长乙肝病毒核心蛋白包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:4：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQCHHHHHH
优选地，所述SpyCatcher蛋白融合表达于所述全长乙肝病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之间；同时，为保证HBc的正确自组装以及SpyCatcher在HBc VLPs表面的正确展示，在ΔN1SpyCatcher基因的插入位点的两侧引入GSG linker和两个谷氨酸(E)。
本发明中，乙肝病毒核心蛋白的第78位Asp和第79位Pro之间为主要免疫优势区，将SpyCatcher蛋白插入该位点，增强了SpyCatcher在VLP表面的展示。
优选地，所述疫苗载体蛋白包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:5：
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDEEGSGDSATHIKFSKRDEDGKELAGATMELRDSSGKTISTWISDGQVKDFYLYPGKYTFVETAAPDGYEVATAITFTVNEQGQVTVNGKATKGDAHIGSGEEPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQCHHHHHH
第二方面，本发明提供了一种编码如第一方面所述的疫苗载体蛋白的核酸分子。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第二方面所述的核酸分子。
优选地，所述表达载体包括PBR327质粒。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的疫苗载体蛋白的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将如第二方面所述的核酸分子插入PBR327质粒中，构建如第三方面所述的表达载体；
(2)将步骤(1)所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行裂解，得到裂解液；
(3)从步骤(2)所述的裂解液中提取和纯化蛋白质，得到所述疫苗载体蛋白。
优选地，步骤(1)所述核酸分子插入PBR327质粒的NcoI和BspTI位点之间。
优选地，步骤(2)所述提取和纯化蛋白质包括将裂解液依次进行硫酸铵沉淀、阴离子交换层析或蔗糖密度梯度离心、羟基磷灰石层析的步骤。
优选地，所述硫酸铵沉淀采用的硫酸铵溶液的浓度为35％～40％，例如可以是35％、36％、37％、38％、39％或40％。
优选地，所述羟基磷灰石层析采用的磷酸盐溶液的浓度为25～75mM，例如可以是25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mM。
在本发明的一个具体实施例中，提取和纯化HBc-S(SEQ ID NO:3)的方法包括将裂解液采用33％～35％硫酸铵进行沉淀，随后进行阴离子交换层析，200～250mM NaCl洗杂，250～300mM NaCl洗脱，最后用羟基磷灰石层析，5～10mM磷酸盐上样，25～40mM磷酸盐洗脱的步骤。
在本发明的另一个具体实施例中，提取和纯化HBc(1-183)-S的方法包括将裂解液采用38％～40％硫酸铵进行沉淀，随后进行蔗糖密度梯度离心，收集40％～50％的组分，最后用羟基磷灰石层析，5～10mM磷酸盐上样，50～75mM磷酸盐洗脱的步骤。
第五方面，本发明提供了一种疫苗表位蛋白，所述疫苗表位蛋白包括SpyTag蛋白和与所述SpyTag蛋白融合表达的抗原表位。
优选地，所述SpyTag蛋白包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:6：AHIVMVDAYKPTK。
优选地，所述疫苗表位蛋白包括如SEQ ID NO:7～17所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7：AHIVMVDAYKPTKGSGDAEFRH；
SEQ ID NO:8：AHIVMVDAYKPTKGSGDAEFRHDAEFRHDAEFRH；
SEQ ID NO:9：AHIVMVDAYKPTKDAEFRHDSGYEVHHQ；
SEQ ID NO:10：AHIVMVDAYKPTKGSGDAEFRHDSGYEVHHQ；
SEQ ID NO:11：AHIVMVDAYKPTKGSGCDAEFRHDC；
SEQ ID NO:12：AHIVMVDAYKPTKGSGCPGQSLSRC；
SEQ ID NO:13：AHIVMVDAYKPTKGSGCAEWNYRNC；
SEQ ID NO:14：AHIVMVDAYKPTKGSGCKDNIKHVPGGGS；
SEQ ID NO:15：
AHIVMVDAYKPTKGSGKS(H3PO4)PVVSGDTS(H3PO4)PR；
SEQ ID NO:16：AHIVMVDAYKPTKGSGVDS(H3PO4)PQLA；
SEQ ID NO:17：AHIVMVDAYKPTKGSSSIINFEKL。
第六方面，本发明提供了一种疫苗，所述疫苗包括如第一方面所述的疫苗载体蛋白。
优选地，所述疫苗还包括如第五方面所述的疫苗表位蛋白，所述疫苗表位蛋白通过SpyCatcher和SpyTag之间的异二肽键连接在所述疫苗载体蛋白上。
根据本发明，SpyCatcher和SpyTag之间可以通过赖氨酸(K，SpyCatcher)和天冬氨酸(D，SpyTag)快速自发形成异二肽键，实现两种蛋白的粘合偶联；本发明利用SpyCatcher/SpyTag技术，基于截短HBc或全长HBc构建得到简单、安全、快速、通用的Th2型或Th1型疫苗载体蛋白。
优选地，所述疫苗还包括佐剂，优选为铝佐剂。
第七方面，本发明提供了一种如第六方面所述的疫苗的制备方法，所述方法包括将如第一方面所述的疫苗载体蛋白和如第五方面所述的疫苗表位蛋白混合后进行粘合反应，并加入佐剂，得到所述疫苗。
优选地，所述粘合反应的温度为20～30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃。
优选地，所述粘合反应的时间为1～3h，例如可以是1h、1.5h、2h、2.5h或3h。
优选地，粘合反应得到的粘合蛋白的浓度为1～3mg/mL，例如可以是1mg/mL、2mg/mL或3mg/mL，优选为1mg/mL；所述粘合反应得到的粘合蛋白与所述佐剂的摩尔比为1:(1～5)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，优选为1:3。
第八方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的疫苗载体蛋白、如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的表达载体、如第五方面所述的疫苗表位蛋白或如第六方面所述的疫苗中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第九方面，本发明提供了一种如第一方面所述的疫苗载体蛋白、如第二方面所述的核酸分子、如第三方面所述的表达载体、如第五方面所述的疫苗表位蛋白、如第六方面所述的疫苗或如第八方面所述的药物组合物在制备神经退行性疾病和/或肿瘤治疗药物中的应用。
优选地，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、皮质基底节变性、皮克氏病或进行性核上性麻痹中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述肿瘤包括黑色素瘤、淋巴瘤或乳腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用SpyCatcher蛋白与截短乙肝病毒核心蛋白或全长乙肝病毒核心蛋白进行融合表达，构建嵌合病毒样颗粒作为疫苗载体蛋白，均一性好、免疫原性强、副作用小、制备方法简单；
(2)本发明的疫苗载体蛋白表面展示有SpyCatcher蛋白，利用SpyCatcher/SpyTag技术粘合不同的表位多肽，实现了多功能疫苗的快捷、简便制备，在神经退行性疾病和/或肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景；
(3)本发明构建的疫苗具有Aβ和Tau表位，可以诱导机体产生高滴度特异性针对致病性蛋白Aβ和Tau的抗体，对Tau.P301S转基因小鼠具有治疗效果，显著提高了小鼠的记忆和认知水平，减少了小鼠脑内磷酸化Tau的水平，降低了小胶质细胞和星形胶质细胞的活化水平；
(4)本发明构建的疫苗具有肿瘤特异性T细胞表位，可以引发机体产生特异性CD8+T细胞免疫反应，具有显著的抗肿瘤效果。
附图说明
图1A为疫苗载体蛋白HBc-S的示意图，图1B为疫苗载体蛋白HBc(1-183)-S的示意图；
图2A为HBc-S的SDS-PAGE图，图2B为HBc-S的透射电镜图；
图3A为HBc(1-183)-S的SDS-PAGE图，图3B为HBc(1-183)-S的透射电镜图；
图4A为HBc-S在PBS(pH＝5)中的组装情况，图4B为HBc-S在PBS(pH＝6.2)中的组装情况，图4C为HBc-S在PBS(pH＝8)中的组装情况，图4D为HBc-S在柠檬酸反应缓冲液(pH＝6.2)中的组装情况，图4E为对照组HBc(1-149)；
图5为SDS-PAGE检测HBc-S-P的纯度，其中，线性肽为SAβ(1-6)、SAβ(1-6)3、SAβ(1-15)、SAβ(1-15)nL、ST294，环形肽为ScAβ(1-7)、ScEP1、ScEP2，磷酸化修饰多肽为SpTau396-404、SpTau422；
图6为TEM检测HBc-S-P的组装情况，其中，线性肽为SAβ(1-6)、SAβ(1-6)3、SAβ(1-15)、SAβ(1-15)nL，环形肽为ScAβ(1-7)、ScEP1、ScEP2，磷酸化修饰多肽为SpTau396-404、SpTau422；
图7为展示Aβ表位的HBc-S VLPs免疫产生抗Aβ的抗体；
图8为HBc-S-cEP1和HBc-S-cEP2分别免疫产生针对cEP1和cEP2的抗体滴度；
图9A为HBc-S-pTau396-404和HBc-S-pTau422免疫产生针对磷酸化Tau的总IgG滴度，图9B为由HBc-S-pTau396-404诱导的抗体特异性结合磷酸化pTau396-404，图9C为由HBc-S-pTau422诱导的抗体特异性结合磷酸化pTau422；
图10A为HBc-S-Aβ(1-6)免疫产生的抗体分型，图10B为HBc-S-Aβ(1-6)3免疫产生的抗体分型，图10C为HBc-S-Aβ(1-15)nL免疫产生的抗体分型，图10D为HBc-S-cAβ(1-7)免疫产生的抗体分型，图10E为HBc-S-cEP1免疫产生的抗体分型，图10F为HBc-S-cEP2免疫产生的抗体分型，图10G为HBc-S-pTau396-404免疫产生的抗体分型，图10H为HBc-S-pTau422免疫产生的抗体分型；
图11A为SDS-PAGE检测HBc-S-pTau422的纯度，图11B为TEM分析HBc-S-pTau422的组装情况，标尺为100nm，图11C为HBc-S-pTau422 VLPs的粒径分布(n＝100)；
图12A为HBc-S-pTau422 VLPs免疫产生的针对pTau422的免疫反应变化，图12B为HBc-S-pTau422VLPs免疫四次后，针对pTau422抗体的滴度；
图13A为HBc-S-pTau422免疫产生的抗体特异性结合磷酸化pTau422表位，图13B为抗体分型；
图14A为小鼠在强迫性Y迷宫中进入新臂的时间，图14B为新物体识别(NOR)测试Tau.P301S转基因小鼠的学习和记忆；
图15A为在水迷宫(MWM)训练阶段，小鼠到达隐藏平台的潜伏期(寻找隐藏平台的时间)，图15B为撤掉平台后，小鼠到达平台位置的潜伏期，图15C为检测阶段小鼠穿过平台位置的次数，图15D为检测阶段小鼠在目标象限中的时间；
图16A为小鼠大脑皮层中AT8阳性Tau蛋白的表达，上方图为10倍放大，下方图为40倍放大，图16B为小鼠海马CA1区中AT8阳性Tau蛋白的表达，上方图为10倍放大，下方图为40倍放大，图16C为小鼠大脑皮层区AT8阳性染色统计分析，图16D为小鼠海马CA1区AT8阳性染色统计统计分析，标尺为100μm；
图17A为小鼠大脑皮层中星形胶质细胞的活化水平，上方图为10倍放大，下方图为40倍放大，图17B为小鼠海马CA1区中星形胶质细胞的活化水平，上方图为10倍放大，下方图为40倍放大，图17C为小鼠大脑皮层区GFAP阳性染色统计分析，图17D为小鼠海马CA1区GFAP阳性染色统计分析，标尺为100μm；
图18A为小鼠大脑皮层中小胶质细胞的活化水平，上方图为10倍放大，下方图为40倍放大，图18B为小鼠海马CA1区中小胶质细胞的活化水平，上方图为10倍放大，下方图为40倍放大，图18C为小鼠大脑皮层区Iba1阳性染色统计分析，图18D为小鼠海马CA1区Iba1阳性染色统计分析，标尺为100μm；
图19A为SDS-PAGE检测HBc(1-183)-S和HBc(1-183)-S-OVA的纯度，图19B为TEM分析HBc(1-183)-S的组装情况，图19C为TEM分析HBc(1-183)-S-OVA的组装情况，图19D为HBc(1-183)-SVLPs的粒径分布(n＝100)，图19E为HBc(1-183)-S-OVA VLPs的粒径分布(n＝100)，标尺为200nm；
图20A为BMDCs吞噬HBc(1-183)-S VLPs后的流式细胞荧光强度图，图20B为总平均荧光强度的统计；
图21为激光共聚焦检测BMDCs对HBc(1-183)-S VLPs的吞噬作用；
图22A为HBc(1-183)-S VLPs和HBc(1-183)-S-OVA VLPs促进BMDCs的成熟，CD40、CD80和CD86相对表达量的荧光图，图22B为CD11c+CD40+DCs的百分比统计图，图22C为CD11c+CD80+DCs的百分比统计图，图22D为CD11c+CD86+DCs的百分比统计图；
图23A为HBc(1-183)-S-OVA VLPs刺激BMDCs分泌的IL-6细胞因子水平，图23B为HBc(1-183)-S-OVA VLPs刺激BMDCs分泌的TNF-α细胞因子水平，图23C为HBc(1-183)-S-OVA VLPs刺激BMDCs分泌的IFN-γ细胞因子水平，图23D为HBc(1-183)-S-OVA VLPs刺激BMDCs分泌的IL-12细胞因子水平；
图24A为体外抗原呈递OVA的DCs的荧光图，图24B为体外抗原呈递OVA的DCs的百分比，图24C为体内抗原呈递OVA的DCs的百分比；
图25A为HBc(1-183)-S-OVA VLPs的预防性免疫策略对肿瘤生长的影响，图25B为小鼠的肿瘤生长曲线；
图26A为HBc(1-183)-S-OVA VLPs的预防性免疫策略对小鼠生存期的影响，图26B为小鼠的生存期曲线；
图27A为HBc(1-183)-S-OVA VLPs的治疗性免疫策略对肿瘤生长的影响，图27B为小鼠的肿瘤生长曲线；
图28A为CD8+IFN-γ+T细胞的比例，图28B为细胞培养上清IFN-γ的水平。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例中使用的缓冲液如下：
(1)阴离子交换层析平衡缓冲液：称取24.49g十二水合磷酸氢二钠、4.93g二水合磷酸二氢钠和1.17g氯化钠(10mM)，溶解于2L超纯水中，pH＝7.0；
(2)阴离子交换层析洗脱缓冲液：称取24.49g十二水合磷酸氢二钠、4.93g二水合磷酸二氢钠和116.88g氯化钠(1M)，溶解于2L超纯水中，pH＝7.0；
(3)羟基磷灰石平衡缓冲液：50mM Tris，5mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH＝6.5；
(4)羟基磷灰石洗脱缓冲液：50mM Tris，200mM磷酸二氢钠，150mM氯化钠，pH＝6.5；
(5)羟基磷灰石再生缓冲液：500mM磷酸二氢钠，pH＝7.0；
(6)柠檬酸盐缓冲液：40mM磷酸二氢钠，200mM柠檬酸钠，pH＝6.2；
(7)ACK裂解缓冲液：将ACK裂解液用超纯水稀释10倍备用；
(8)磷酸盐缓冲液(PBS)：称取9g氯化钠、5.73g十二水合磷酸氢二钠和0.62g二水合磷酸二氢钠，溶解于1L去离子水中。
实施例中的所有实验数据表示为Mean±SEM，数据统计分析采用GraphPad Prism软件进行，以P<0.05代表差异具有统计学意义。
实施例中的多肽表位序列如表1所示。
表1多肽表位序列
多肽名称 编号 多肽序列
SAβ(1-6) SEQ ID NO:7 AHIVMVDAYKPTKGSGDAEFRH
SAβ(1-6)3 SEQ ID NO:8 AHIVMVDAYKPTKGSGDAEFRHDAEFRHDAEFRH
SAβ(1-15)nL SEQ ID NO:9 AHIVMVDAYKPTKDAEFRHDSGYEVHHQ
SAβ(1-15) SEQ ID NO:10 AHIVMVDAYKPTKGSGDAEFRHDSGYEVHHQ
ScAβ(1-7) SEQ ID NO:11 AHIVMVDAYKPTKGSGCDAEFRHDC
ScEP1 SEQ ID NO:12 AHIVMVDAYKPTKGSGCPGQSLSRC
ScEP2 SEQ ID NO:13 AHIVMVDAYKPTKGSGCAEWNYRNC
ST294 SEQ ID NO:14 AHIVMVDAYKPTKGSGCKDNIKHVPGGGS
SpTau396-404 SEQ ID NO:15 AHIVMVDAYKPTKGSGKS(H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>)PVVSGDTS(H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>)PR
SpTau422 SEQ ID NO:16 AHIVMVDAYKPTKGSGVDS(H<sub>3</sub>PO<sub>4</sub>)PQLA
SOVA SEQ ID NO:17 AHIVMVDAYKPTKGSSSIINFEKL
实施例1HBc-S和HBc(1-183)-S疫苗载体蛋白的制备
氨基端截短的ΔN1SpyCatcher的编码基因融合插入到截短HBc(1-149)的主要免疫优势区的第78和第79位氨基酸之间，构建如图1A所示的疫苗载体蛋白HBc-S；氨基端截短的ΔN1SpyCatcher的编码基因融合插入到全长HBc(1-183)的主要免疫优势区的第78和第79位氨基酸之间，构建如图1B所示的疫苗载体蛋白HBc(1-183)-S；为保证HBc的正确自组装以及SpyCatcher在HBc VLPs表面的正确展示，在ΔN1SpyCatcher基因的插入位点的两侧引入GSG linker和两个谷氨酸(E)，HBc-S-pBR和HBc(1-183)-S-pBR由生工生物工程(上海)构建。
将HBc-S-pBR或HBc(1-183)-S-pBR转化入BL21感受态细胞，挑选3～4株单克隆，M9培养基内小规模诱导蛋白表达，超声破碎裂解菌体；HBc-S采用35％硫酸铵进行沉淀，随后进行阴离子交换层析，200mM NaCl洗杂，300mM NaCl洗脱，最后用羟基磷灰石层析，5mM磷酸盐上样，25mM磷酸盐洗脱，得到HBc-S；HBc(1-183)-S采用38％硫酸铵进行沉淀，随后进行蔗糖密度梯度离心，收集40％和50％的组分，最后用羟基磷灰石层析，5mM磷酸盐上样，75mM磷酸盐洗脱，得到HBc(1-183)-S。
图2A为制备得到的HBc-S的SDS-PAGE结果，图2B为HBc-S的透射电镜图；图3A为制备得到的HBc(1-183)-S的SDS-PAGE结果，图3B为HBc(1-183)-S的透射电镜图。可以看出，HBc-S和HBc(1-183)-S的纯度大于95％。
实施例2应用HBc-S制备展示线性、环形和修饰型表位的嵌合病毒样颗粒疫苗
(1)HBc-S的组装特性
将纯化的HBc-S浓缩至3mg/mL，分别用20mM PBS(pH＝5)、20mM PBS(pH＝6.2)、20mM PBS(pH＝8)和柠檬酸反应缓冲液(Citrate Buffer，pH＝6.2)稀释至0.2mg/mL，加入
Figure BDA0002680491000000061
蛋白凝胶染色剂(250×稀释)；以截短HBc(1-149)作为对照，使用实时荧光定量PCR仪从20℃加热至95℃，升温速率为1℃/min。
结果如图4A、图4B、图4C、图4D和图4E所示，截短HBc VLPs只有一个Tm值，为83℃，表明VLP结构的存在；而HBc-S只有在柠檬酸反应缓冲液中呈现出83℃的Tm值，表明HBc-S在柠檬酸溶液中稳定组装为VLP。
(2)HBc-S-P VLPs的制备
将阿尔兹海默症的致病性蛋白Aβ和Tau的B细胞表位与HBc-S进行粘合反应。表位包括Aβ单体和截短Tau蛋白的线性表位、通过噬菌体展示技术筛选获得的Aβ寡聚体的环形表位，以及过度磷酸化Tau蛋白的磷酸化修饰型表位，这些表位与SpyTag的氨基端通过多肽合成偶联在一起。
将HBc-S VLPs与如SEQ ID NO:7～16之一所示的多肽表位Speptide以摩尔比为1:3的比例混合，加入3倍体积的柠檬酸盐缓冲液，在室温下放置1～3h；随后将混合物用100kDa截留膜超滤，除去未反应的多肽Speptide(柠檬酸反应缓冲液作为超滤液体)；取20μL纯化后的蛋白样品(0.05～0.1mg/mL)滴于200目铜网上，室温放置5min，用滤纸吸走剩余液体，室温放置1min；取10μL醋酸双氧铀滴加到铜网上，染色2min，用滤纸吸走醋酸双氧铀，室温晾干；在HT7700透射电镜下，80KV放大20K或40K观察。
如图5所示，HBc-S单体的大小约为27kDa，与多肽粘合后，HBc-S-P略大于HBc-S单体，表明各个多肽均粘合至HBc-S载体蛋白表面；另外，所有HBc-S-P的条带全部上移，表明HBc-S粘合制备的疫苗纯度高。
随后，利用透射电镜检测了HBc-S-P的组装情况，结果如图6所示，HBc-S-P均呈现出VLP结构，表明表位粘合反应不影响HBc-S本身的结构。因此，HBc-S作为疫苗载体蛋白可以成功粘合负载线性表位、环形表位以及磷酸化修饰型表位。
(3)HBc-S-P VLPs的免疫原性
将HBc-S-P VLPs粘合蛋白的浓度调节至1.33mg/mL，按照蛋白:铝佐剂的体积比为3:1的比例配制疫苗，用移液枪吹打30min，使铝佐剂吸附在粘合蛋白上；
选择6～8周的雌性Balb/c小鼠，随机分为佐剂组、HBc-S组(空载体组)和HBc-S-P组，每组5只；进行皮下注射，每只小鼠的注射量为3.61nmol抗原表位(含有100μg HBc-S)；共免疫三次，每次间隔两周，免疫10天后采血，收集血清；3次免疫后，采用ELISA检测血清抗体滴度。
如图7所示，Aβ的线性表位肽Aβ(1-6)、Aβ(1-6)3、Aβ(1-15)nL和Aβ(1-15)与HBc-S粘合后均可以刺激机体产生与Aβ特异性结合的抗体，抗体滴度(Total IgG titre)在第二次免疫后达到峰值；Aβ(1-7)通过首尾两个半胱氨酸形成二硫键成环，并与HBc-S粘合，HBc-S-cAβ(1-7)免疫小鼠产生的抗Aβ的抗体滴度比负载线性表位Aβ(1-6)的HBc-S-Aβ(1-6)低10倍左右。如图8所示，噬菌体展示技术获得的Aβ寡聚体的环形表位cEP1和cEP2，与HBc-S粘合后免疫小鼠后，可以刺激机体产生特异性针对环形多肽的抗体。以上结果说明，HBc-S可以向免疫系统呈递环形多肽并刺激机体产生特异性抗环形多肽的抗体。
如图9A、图9B和图9C所示，HBc-S负载病理性磷酸化Tau蛋白表位pTau396-404和pTau422，均可以刺激机体产生抗体，且产生的抗体只与磷酸化表位结合，与非磷酸化表位无结合，表明磷酸化表位在HBc-S载体表面正确展示。
利用ELISA检测HBc-S-P免疫产生的抗体的分型，将稀释的血清加入到包被有对应抗原或多肽的96孔板中，随后加入抗小鼠亚类特异性的HRP标记的二抗。结果如图10A、图10B、图10C、图10D、图10E、图10F、图10G和图10H所示，线性表位[HBc-S-Aβ(1-6)、HBc-S-Aβ(1-6)3、HBc-S-Aβ(1-15)nL和HBc-S-Aβ(1-15)nL]、环形表位[HBc-S-cAβ(1-7)、HBc-S-cEP1和HBc-S-cEP2]以及磷酸化表位[HBc-S-pTau396-404和HBc-S-pTau422]免疫产生的抗体均为IgG1型，IgG1代表了Th2型体液免疫反应，而IgG2a代表了Th1型免疫反应。由此说明，HBc-S-P刺激机体主要产生Th2型免疫反应，提示HBc-S-P可以避免炎症反应等副作用的产生。
实施例3应用HBc-S-pTau422疫苗治疗Tau.P301S转基因小鼠
(1)HBc-S-pTau422疫苗的制备
将HBc-S VLPs与SpTau422以摩尔比为1:3的比例混合，加入3倍体积的柠檬酸盐粘合反应缓冲液，在室温下放置1～3h；随后将混合物用100kDa截留膜超滤，除去未反应的多肽SpTau422(柠檬酸反应缓冲液作为超滤液体)。
图11A为SDS-PAGE检测结果，HBc-S-pTau422的电泳条带上移，略大于HBc-S，且纯度较高，表明SpTau422多肽与HBc-S发生了粘合反应，实现了HBc-S的全修饰；图11B为透射电镜结果图，HBc-S-pTau422保持完好的VLP结构；图11C显示为粒径分布图，VLP的粒径为32.8±2.41nm。
(2)HBc-S-pTau422疫苗对Tau.P301S转基因小鼠的免疫效果研究
将6月龄的Tau.P301S转基因小鼠随机分为佐剂组、HBc-S组(空载体组)和HBc-S-pTau422实验组，每组6只，对Tau.P301S转基因小鼠皮下免疫HBc-S-pTau422疫苗，每只3.61nmol pTau422表位多肽(相当于100μg HBc-S)；共注射四次，每次间隔两周，同窝野生型作为对照；在每次免疫后的第10天，采集免疫小鼠的血清，用ELISA检测小鼠血清的抗体滴度。
ELISA板每孔包被BSA-pTau422(1μg/100μL)，在检测小鼠的抗体滴度变化时，血清稀释比为1:100；在检测小鼠血清的抗体滴度时，血清稀释比为1:100～1:25600，两倍倍比稀释；在检测抗体分型时，血清稀释比为1:200。
如图12A所示，HBc-S-pTau422疫苗在小鼠体内引发了强烈的免疫反应，刺激机体产生了与pTau422表位多肽结合的抗体，抗体的滴度随着免疫次数的增加而增加，在第三次免疫后到达峰值，抗体的几何平均滴度为2600；如图12B所示，HBc-S对照组不能刺激机体产生针对pTau422的抗体，由此表明HBc-S-pTau422疫苗具有较高的免疫原性。
利用ELISA检测血清中抗体与pTau422和Tau422结合的能力。如图13A所示，抗体与磷酸化表位多肽pTau422结合，而不与非磷酸化表位多肽Tau422结合，HBc-S-pTau422疫苗在小鼠体内免疫产生的抗体能够特异性识别磷酸化pTau422表位多肽，由此说明pTau422在HBc-S VLPs颗粒的表面得到正确展示。
利用ELISA检测HBc-S-pTau422疫苗免疫Tau.P301S转基因小鼠产生的抗体IgG分型。如图13B所示，HBc-S-pTau422免疫产生的抗体主要是IgG1，表明疫苗刺激Tau.P301S转基因小鼠主要产生了Th2型免疫反应，疫苗具有较好的安全性。
(3)HBc-S-pTau422疫苗对Tau.P301S转基因小鼠的治疗效果研究
在采用HBc-S-pTau422疫苗免疫治疗30天后，通过强迫性Y迷宫、水迷宫和新事物识别对治疗后的小鼠的认知和记忆能力进行检测。
利用强迫性Y迷宫检测HBc-S-pTau422疫苗免疫治疗对Tau.P301S转基因小鼠的短期记忆的影响。如图14A所示，与佐剂组和HBc-S对照组相比，HBc-S-pTau422免疫治疗组的小鼠在新臂的停留时间(Time in new arm)显著提高(P<0.05)，表明HBc-S-pTau422改善了Tau.P301S转基因小鼠的短期记忆能力。
在新事物识别测试(NOR)实验中，采用NOR识别指数表征Tau.P301S转基因小鼠的学习和记忆能力，NOR识别指数(Discrimination index)通过计算(Timenovel-Timeold)/(Timenovel+Timeold)确定，其中0表示对新旧事物没有偏好；如图14B所示，与佐剂组和HBc-S对照组相比，HBc-S-pTau422免疫治疗组的小鼠探索新事物的次数显著增多(P<0.05)，进一步表明HBc-S-pTau422改善了Tau.P301S转基因小鼠的认知能力。
在水迷宫实验中，通过连续5天的训练，小鼠不断学习和记忆隐藏平台的位置，对数据进行记录并分析其潜伏期的变化，通过two-way ANOVA分析进行统计学分析，如图15A所示，与佐剂组和HBc-S对照组相比，HBc-S-pTau422免疫治疗组的小鼠找到平台的潜伏时间(Escape latency)随着学习天数的增加而明显减少，在训练两天后就可以找到隐藏平台的位置；
如图15B、图15C和图15D所示，在撤掉平台后的探索实验中，与佐剂组和HBc-S对照组相比，HBc-S-pTau422免疫治疗组的小鼠第一次到达平台区域的潜伏时间显著降低(使用one-way ANOVA和Tukey's Multiple Comparison Test进行统计分析)，穿越平台区域的次数(#of Target crossing)显著增多(通过Mann-Whitney U检验分析统计学)，在目标象限(平台所在象限)的时间(Time in target quadrant)显著增多(通过one-way ANOVA和Tukey's Multiple Comparison Test进行统计分析)，但是各组小鼠的游泳速度没有明显的区别。由此说明，HBc-S-pTau422改善了Tau.P301S转基因小鼠的空间记忆和学习能力。
利用AT8抗体检测HBc-S-pTau422疫苗免疫治疗对Tau.P301S转基因小鼠脑内AT8阳性的磷酸化Tau蛋白水平的影响。如图16A、图16B、图16C和图16D所示，野生型(WT)小鼠脑内没有AT8阳性Tau蛋白，而Tau.P301S转基因小鼠的大脑皮层和海马CA1区均存在有大量的AT8阳性磷酸化Tau蛋白，表明Tau.P301S转基因小鼠脑内有大量的Tau病变；经HBc-S-pTau422免疫治疗后，Tau.P301S转基因小鼠的大脑皮层和海马CA1区的AT8阳性Tau蛋白显著降低，表明HBc-S-pTau422 VLPs改善了小鼠脑内的Tau病理。
利用免疫组织化学分析小鼠脑内胶质细胞的活化水平。如图17A、图17B、图17C和图17D所示，HBc-S-pTau422免疫治疗显著减少了Tau.P301S转基因小鼠大脑皮层和海马CA1区的星形胶质细胞的数量，表明HBc-S-pTau422疫苗能够有效减少Tau.P301S转基因小鼠脑内星形胶质细胞的过度活化。
利用Iba1抗体检测小鼠脑内小胶质细胞的活化水平。如图18A、图18B、图18C和图18D所示，Tau.P301S转基因小鼠的大脑皮层和海马CA1区出现了小胶质细胞的过度活化，经过HBc-S-pTau422疫苗免疫治疗后，小胶质细胞的活化水平显著降低。
实施例4应用HBc(1-183)-S制备展示T细胞表位的抗肿瘤疫苗
(1)HBc(1-183)-S-OVA疫苗的制备
以OVA的MHC I类分子限制性表位SIINFEKL(以OVA代称，SEQ ID NO:18)验证HBc(1-183)-S作为疫苗载体蛋白向免疫系统递送T细胞表位，进行肿瘤治疗的效果。
将HBc(1-183)-S VLPs和S-OVA以摩尔比为3:1的比例室温混合3h，利用超滤管超滤除去未反应的多肽，通过SDS-PAGE和透射电镜对HBc(1-183)-S和HBc(1-183)-S-OVA进行检测。
如图19A所示，HBc(1-183)-S-OVA的电泳条带略大于HBc(1-183)-S，且纯度较高，表明S-OVA多肽与HBc(1-183)-S发生了粘合反应，实现了HBc(1-183)-S的全修饰；如图19B和图19C所示，HBc(1-183)-S-OVA与HBc(1-183)-S VLPs一样，保持完好的VLP结构；如图19D和图19E所示，两者的粒径分别为35.37±2.09nm(HBc(1-183)-S VLPs)和35.79±2.41nm(HBc(1-183)-S-OVAVLPs)，表明OVA表位与HBc(1-183)-S VLPs偶联不影响VLP的结构。
(2)BMDCs对HBc(1-183)-S VLPs的吞噬作用
用荧光染料Cy5标记HBc(1-183)-S VLPs，与BMDCs共孵育0、1、4或12h，流式细胞术的检测结果如图20A所示，随着与HBc(1-183)-S孵育时间的增加，BMDCs的红色荧光信号逐渐增强；如图20B所示，对Cy5的平均荧光强度进行量化分析，发现BMDCs对HBc(1-183)-S的摄取呈时间依赖性；用激光共聚焦扫描显微镜进一步检测BMDCs对HBc(1-183)-S的吞噬情况，如图21所示，与流式结果相一致，BMDCs对HBc(1-183)-S VLPs的吞噬具有时间依赖性。
(3)HBc(1-183)-S VLPs和HBc(1-183)-S-OVA VLPs影响BMDCs细胞表面抗原的表达
BMDCs分别与PBS、OVA、S-OVA、HBc(1-183)-S VLPs或HBc(1-183)-S-OVA VLPs孵育24h，用荧光标记的抗CD11c、CD40、CD80和CD86单克隆抗体标记细胞，进行流式细胞仪检测分析。
如图22A所示，HBc(1-183)-S VLPs和HBc(1-183)-S-OVA VLPs促进了CD40、CD80和CD86表达。
对CD40、CD80和CD86阳性的CD11c+细胞比例进行统计分析，如图22B、图22C和图22D所示，与PBS组相比，OVA多肽刺激后，CD11c+细胞中CD40+、CD80+和CD86+细胞比例没有显著变化；S-OVA多肽刺激后，CD11c+细胞中CD40+、CD80+和CD86+细胞比例没有显著变化；与OVA和S-OVA多肽相比，HBc(1-183)-S VLPs和HBc(1-183)-S-OVA VLPs组CD11c+细胞中CD40+、CD80+和CD86+细胞比例均显著增多；表明单独的OVA多肽不能够激活DCs促进其成熟，而HBc(1-183)-S VLPs和HBc(1-183)-S-OVA VLPs具有和HBc VLPs相同的佐剂特性，能够促进DCs的吞噬和成熟。
BMDCs分别与PBS、OVA、S-OVA、HBc(1-183)-S VLPs或HBc(1-183)-S-OVA VLPs孵育24h，收集细胞上清，通过炎症因子ELISA试剂盒检测BMDCs炎症因子分泌情况。
如图23A、图23B、图23C和图23D所示，HBc(1-183)-S VLPs和HBc(1-183)-S-OVA VLPs促进了BMDCs分泌IL-6、TNF-α、IFN-γ和IL-12；IL-6和TNF-α可以促进T辅助细胞的激活和成熟，而IFN-γ和IL-12可以促进T辅助细胞向Th1型细胞分化。
(4)BMDCs对HBc(1-183)-S-OVA的抗原呈递
BMDCs分别与PBS、OVA、S-OVA、HBc(1-183)-S VLPs或HBc(1-183)-S-OVA VLPs孵育24h，收集细胞，用荧光标记的抗小鼠H-2Kb MHC I-SIINFEKL复合物抗体检测呈递OVA的树突状细胞的比例。同时将OVA、S-OVA、HBc(1-183)-S VLPs或HBc(1-183)-S-OVA VLPs注射到小鼠体内，分离淋巴结，检测小鼠体内呈递OVA的树突状细胞的比例。
如图24A和图24B所示，多肽OVA和S-OVA均能实现高效率的抗原提呈，表明SpyTag序列不影响OVA的抗原提呈，HBc(1-183)-S-OVA VLPs可以实现抗原提呈，但是效率明显低于多肽OVA和S-OVA。但是体内的结果如图24C所示，HBc(1-183)-S-OVA VLPs呈递效率最高，表明VLPs有助于OVA摄取并呈递。
(5)HBc(1-183)-S-OVA预防性免疫策略的肿瘤抑制效果
根据图25A所示的预防性免疫策略，选择6～8周的C57BL/6雌性小鼠随机分为5组，每组6只，在小鼠的腹股沟两侧分别皮下注射PBS、OVA、S-OVA、HBc(1-183)-S或HBc(1-183)-S-OVA，多肽和蛋白的注射含量为2nmol，每周注射一次，注射三次后，剃除小鼠胸前偏右侧的毛发，在此处皮下注射1×106个E.G7-OVA淋巴瘤细胞(第0天)，从第10天起，隔天通过游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积(Tumor volume)的计算公式为肿瘤体积＝0.5×最短直径2×最长直径。
如图25B所示，与PBS对照组相比，多肽OVA和S-OVA对肿瘤有一定的抑制效果，但是没有显著性差异；HBc(1-183)-S VLPs对肿瘤生长没有抑制作用，提示HBc(1-183)-S VLPs引起的天然免疫对E.G7-OVA没有杀伤作用；与PBS、OVA、S-OVA和HBc(1-183)-S VLPs相比，HBc(1-183)-S-OVA显著抑制了肿瘤的生长。以上结果提示HBc(1-183)-S-OVA VLPs刺激机体产生了OVA特异性的杀伤性T细胞，抑制了肿瘤的生长。
根据如图26A所示的策略探究HBc(1-183)-S-OVA预防免疫对荷瘤小鼠的生存率的影响；结果如图26B所示，PBS、OVA、S-OVA和HBc(1-183)-S VLPs治疗的小鼠的平均生存期(Percent survival)分别为27.5天、28天、29.5天和27天，而HBc(1-183)-S-OVA免疫治疗组的小鼠的平均生存期为37.5天，明显高于PBS、OVA、S-OVA和HBc(1-183)-S VLPs组，表明HBc(1-183)-S-OVA显著提高了荷瘤小鼠的生存率，与肿瘤生长抑制实验结果相一致。
(6)HBc(1-183)-S-OVA治疗性免疫策略的肿瘤抑制效果
根据图27A所示的治疗性免疫策略，选择6～8周的C57BL/6雌性小鼠，剃除小鼠胸前偏右侧的毛发，在此处皮下注射1×106个E.G7-OVA淋巴瘤细胞(第0天)；将荷瘤小鼠随机分为5组，每组6只，在第4天和第11天在小鼠的腹股沟两侧皮下注射PBS、OVA、S-OVA、HBc(1-183)-S或HBc(1-183)-S-OVA，多肽和蛋白的注射含量为2nmol，每周注射一次，注射两次；在荷瘤第10天起用游标卡尺隔天测量肿瘤大小，肿瘤体积的计算公式为肿瘤体积＝0.5×最短直径2×最长直径。
如图27B所示，多肽OVA和S-OVA对肿瘤生长具有一定的抑制效果，HBc(1-183)-S-OVAVLPs对肿瘤生长的抑制效果显著优于OVA和S-OVA，而HBc(1-183)-S VLPs载体本身不能抑制肿瘤生长。
为验证HBc(1-183)-S-OVA VLPs诱导机体产生了OVA特异性杀伤T细胞反应，将免疫小鼠的脾细胞进行体外培养，并进行OVA多肽刺激，流式检测CD8+IFN-γ+细胞的比例。
如图28A所示，HBc(1-183)-S-OVA VLPs组的CD8+IFN-γ+细胞比例显著高于其他组；随后，通过ELISA试剂盒对脾细胞培养上清中的IFN-γ水平进行检测，结果如图28B所示，与流式相一致，HBc(1-183)-S-OVA VLPs组的IFN-γ水平显著高于其他组。以上结果提示HBc(1-183)-S-OVA VLPs通过诱导OVA的特异性杀伤T细胞反应抑制肿瘤生长。
综上所述，本发明提供了基于SpyCatcher/SpyTag技术构建的以乙肝病毒核心蛋白为基础的疫苗通用载体HBc-S和HBc(1-183)-S，SpyCatcher展示于HBc-S VLPs的主要免疫优势区，可与表位多肽氨基端的SpyTag发生黏合反应，将线性、环形和磷酸化B细胞表位SP(SpyTag-peptide)展示在VLPs表面，制备了一系列HBc-S-P VLPs疫苗。HBc-S-P VLPs疫苗免疫小鼠后产生了特异性针对表位的抗体；HBc-S-pTau422可以显著改善阿尔兹海默症转基因小鼠的认知及病理变化；HBc(1-183)-S诱导Th1型免疫反应，以OVA为模式表位构建的HBc(1-183)-S-OVA疫苗呈现VLP结构，粒径为35.79±2.41nm，能够激活DCs，并促进DCs的成熟，在预防性和治疗性免疫策略中，HBc(1-183)-S-OVA能够显著抑制肿瘤的生长，延长了荷瘤小鼠的生存时间。HBc-S和HBc(1-183)-S可分别作为较好的AD与肿瘤治疗性表位疫苗的通用载体平台。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院过程工程研究所
<120> 疫苗通用载体及其制备方法和应用
<130> 20200911
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys
1 5 10 15
Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr
20 25 30
Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr
35 40 45
Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp Gly Tyr Glu
50 55 60
Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly Gln Val Thr
65 70 75 80
Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile
85 90
<210> 2
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val
145
<210> 3
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Glu Glu
65 70 75 80
Gly Ser Gly Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu
85 90 95
Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser
100 105 110
Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe
115 120 125
Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp
130 135 140
Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly
145 150 155 160
Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Gly
165 170 175
Ser Gly Glu Glu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn
180 185 190
Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser
195 200 205
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210 215 220
Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro
225 230 235 240
Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val
245 250
<210> 4
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
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100 105 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
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145 150 155 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
165 170 175
Gln Ser Arg Glu Pro Gln Cys His His His His His His
180 185
<210> 5
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
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20 25 30
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Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Glu Glu
65 70 75 80
Gly Ser Gly Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu
85 90 95
Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser
100 105 110
Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe
115 120 125
Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp
130 135 140
Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly
145 150 155 160
Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Gly
165 170 175
Ser Gly Glu Glu Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn
180 185 190
Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser
195 200 205
Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe
210 215 220
Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro
225 230 235 240
Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg
245 250 255
Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser
260 265 270
Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Pro Gln Cys His His His
275 280 285
His His His
290
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Ser Gly
1 5 10 15
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20
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<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Ser Gly
1 5 10 15
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Glu Phe
20 25 30
Arg His
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
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20 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
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<210> 11
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<213> 人工序列
<400> 11
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1 5 10 15
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<211> 25
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<213> 人工序列
<400> 12
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Cys Pro Gly Gln Ser Leu Ser Arg Cys
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<213> 人工序列
<400> 13
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20 25
<210> 14
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<213> 人工序列
<400> 14
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20 25
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
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20
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
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1 5 10 15
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
20
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1 5

Claims (25)

1.一种疫苗载体蛋白，其特征在于，所述疫苗载体蛋白为SpyCatcher蛋白和与所述SpyCatcher蛋白融合表达的乙肝病毒核心蛋白；
所述SpyCatcher蛋白包括如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；
所述乙肝病毒核心蛋白包括截短乙肝病毒核心蛋白和/或全长乙肝病毒核心蛋白；
所述截短乙肝病毒核心蛋白包括如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列；
所述SpyCatcher蛋白融合表达于所述截短乙肝病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之间；
所述疫苗载体蛋白为SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列；
所述全长乙肝病毒核心蛋白包括如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列；
所述SpyCatcher蛋白融合表达于所述全长乙肝病毒核心蛋白的第78位和第79位氨基酸之间；
所述疫苗载体蛋白为SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的疫苗载体蛋白，其特征在于，所述截短乙肝病毒核心蛋白的分子量为12~15 kD。
3.根据权利要求2所述的疫苗载体蛋白，其特征在于，所述截短乙肝病毒核心蛋白的分子量为13~14 kD。
4.根据权利要求1所述的疫苗载体蛋白，其特征在于，所述全长乙肝病毒核心蛋白的分子量为12~21 kD。
5.根据权利要求4所述的疫苗载体蛋白，其特征在于，所述全长乙肝病毒核心蛋白的分子量为20~21 kD。
6.一种编码如权利要求1~5任一项所述的疫苗载体蛋白的核酸分子。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求6所述的核酸分子。
8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括PBR327质粒。
9.一种如权利要求1~5任一项所述的疫苗载体蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将如权利要求6所述的核酸分子插入PBR327质粒中，构建如权利要求7或8所述的表达载体；
（2）将步骤（1）所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行裂解，得到裂解液；
（3）从步骤（2）所述的裂解液中提取和纯化蛋白质，得到所述疫苗载体蛋白。
10.根据权利要求9所述的疫苗载体蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述核酸分子插入PBR327质粒的NcoI和BspTI位点之间。
11.根据权利要求9所述的疫苗载体蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述提取和纯化蛋白质包括将裂解液依次进行硫酸铵沉淀、阴离子交换层析或蔗糖密度梯度离心、羟基磷灰石层析的步骤。
12.根据权利要求11所述的疫苗载体蛋白的制备方法，其特征在于，所述硫酸铵沉淀采用的硫酸铵溶液的浓度为35%~40%。
13.根据权利要求11所述的疫苗载体蛋白的制备方法，其特征在于，所述羟基磷灰石层析采用的磷酸盐溶液的浓度为25~75 mM。
14.根据权利要求11所述的疫苗载体蛋白的制备方法，其特征在于，所述提取和纯化蛋白质包括将裂解液采用33%~35%硫酸铵进行沉淀，随后进行阴离子交换层析，200~250 mMNaCl洗杂，250~300 mM NaCl洗脱，最后用羟基磷灰石层析，5~10 mM磷酸盐上样，25~40 mM磷酸盐洗脱的步骤。
15.根据权利要求11所述的疫苗载体蛋白的制备方法，其特征在于，所述提取和纯化蛋白质包括将裂解液采用38%~40%硫酸铵进行沉淀，随后进行蔗糖密度梯度离心，收集40%~50%的组分，最后用羟基磷灰石层析，5~10 mM磷酸盐上样，50~75 mM磷酸盐洗脱的步骤。
16.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括如权利要求1~5任一项所述的疫苗载体蛋白；
所述疫苗还包括疫苗表位蛋白，所述疫苗表位蛋白包括SpyTag蛋白和与所述SpyTag蛋白融合表达的抗原表位；
所述疫苗表位蛋白通过SpyCatcher和SpyTag之间的异二肽键连接在所述疫苗载体蛋白上；
所述SpyTag蛋白为SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列；
所述疫苗表位蛋白为SEQ ID NO: 7~17所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂。
18.根据权利要求17所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂为铝佐剂。
19.一种如权利要求16~18任一项所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求1~5任一项所述的疫苗载体蛋白和疫苗表位蛋白混合后进行粘合反应，并加入佐剂，得到所述疫苗。
20.根据权利要求19所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述粘合反应的温度为20~30℃。
21.根据权利要求19所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述粘合反应的时间为1~3h。
22.根据权利要求19所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述粘合反应得到的粘合蛋白与所述佐剂的摩尔比为1:(1~5)。
23.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求16~18任一项所述的疫苗。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
25.一种如权利要求16~18任一项所述的疫苗或如权利要求23或24所述的药物组合物在制备神经退行性疾病和/或肿瘤治疗药物中的应用；
所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、皮质基底节变性、皮克氏病或进行性核上性麻痹中的任意一种或至少两种的组合；
所述肿瘤包括黑色素瘤、淋巴瘤或乳腺癌中的任意一种或至少两种的组合。
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Hepatitis B core VLP-based mis-disordered tau vaccine elicits strong immune response and alleviates cognitive deficits and neuropathology progression in Tau.P301S mouse model of Alzheimer"s disease and frontotemporal dementia;Mei Ji，等;《Alzheimer’s Research ＆ Therapy》;20180619;第10卷(第1期);全文 *
Improving the malaria transmission-blocking activity of a Plasmodium falciparum 48/45 based vaccine antigen by SpyTag/SpyCatcher mediated virus-like display;Susheel K Singh，等;《Vaccine》;20170627;第35卷(第30期);全文 *
以人乳头瘤病毒（HPV）病毒样颗粒（VLP）为基础的预防性疫苗的研究;谢喜秀;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)》;20140515;全文 *

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