CN103421117A

CN103421117A - 一种免疫增强型病毒样颗粒、其表达载体及其制备与应用

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Publication number: CN103421117A
Application number: CN2012101530788A
Authority: CN
Inventors: 李岱宗
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: CN103421117B

Abstract

本发明提供了一种免疫增强型病毒样颗粒、其表达载体，以及他们的制备与应用。构成本发明的免疫增强型病毒样颗粒的蛋白质亚基为乙肝病毒核心抗原与氨基酸序列为SEQIDNO:1的多肽的融合蛋白。本发明通过基因工程重组技术，在人乙肝核心抗原病毒样颗粒的基础上，构建了免疫增强型病毒样颗粒表达载体，并利用该表达载体通过形成融合蛋白或通过化学偶联的方法将抗原决定簇递呈在免疫增强型病毒样颗粒表面制成免疫原以激活、提高和调节机体免疫反应，以此来突破自身抗原的免疫耐受性，从而能诱导机体免疫系统产生高亲和力、高滴度的针对自身抗原的抗体。本发明的免疫增强型病毒样颗粒相比现有技术，能最大限度的增强疫苗的免疫原性。

Description

一种免疫增强型病毒样颗粒、其表达载体及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种免疫增强型病毒样颗粒、其表达载体，以及他们的制备与应用。

背景技术

病毒样颗粒（Virus-Like Particles，VLPs）是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸（DNA／RNA），不能自主复制，其在形态上与真正病毒粒子相同或相似，可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。病毒的衣壳蛋白一般具有天然的自我装配能力。近年来发现多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统以及少数病毒的衣壳蛋白基因在原核表达系统中都能够有效地实现自我组装，这为病毒的基础研究（基因治疗、药物治疗等）及疫苗的开发提供了便利条件。由于VLPs没有感染性，作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生强烈的更持久和更强大的免疫保护反应，而宿主、病毒和疫苗因素共同决定VLPs产生的机体防护水平。

乙肝病毒核心抗原(Hepatitis B core，HBc)是乙肝病毒的重要结构蛋白，在细菌、酵母菌及哺乳动物细胞内均能高效表达、自动装配成球形颗粒，并可插入外源短肽，同时保持外源肽或表位正确构象，有强免疫原性。我们以人乙肝病毒核心抗原为基础，通过基因工程技术构建了多功能病毒样颗粒载体，增强了病毒性颗粒的免疫原性，既可插入抗原基因在颗粒表面实现抗原递呈，也可在颗粒表面多位点偶联人工合成多肽抗原，从而实现多价抗原的构建。

免疫耐受是指对抗原特异性应答的T细胞与B细胞，在抗原刺激下，不能被激活，不能产生特异性免疫效应细胞及特异性抗体，从而不能执行免疫应答的现象。对自身抗原耐受是免疫系统的重要特征。

发明内容

本专利的目的是要为如何突破自身抗原的免疫耐受性从而能诱导机体免疫系统产生高亲和力，高滴度，针对自身抗原的抗体提供一种解决方案。

本发明首先提供了一种免疫增强型病毒样颗粒，构成该颗粒的蛋白质亚基为乙肝病毒核心抗原与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的融合蛋白。

Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val GlnSer Ala Asn Gly Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr GlnThr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg SerAsp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu（SEQ ID NO:1）。

SEQ ID NO:1的多肽的存在可增强病毒样颗粒的免疫活性。

所述氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽可连接于所述乙肝病毒核心抗原的C端或N端，优选C端。

所述乙肝病毒核心抗原为乙肝病毒核心抗原全长或其片段，包括主要免疫显性区域和次要免疫显性区域，至少包括乙肝病毒核心抗原全长的第1-140位氨基酸残基以形成病毒样颗粒。乙肝病毒核心抗原全长183个氨基酸，其序列如SEQ ID NO:7所示，研究表明，为了能形成病毒样颗粒，至少应当保留乙肝病毒核心抗原的前140位氨基酸残基，第140位之后可保留原有的全部或部分残基，相比全长乙肝病毒核心抗原，省略140位以后氨基酸残基并不影响其自我装配。如本发明实施例具体列举的，至少保留了乙肝病毒核心抗原全长SEQ ID NO:7的第1-149位氨基酸残基就能产生病毒样颗粒。

1 MDIDPYKEFG ASVELLSFLP SDFFPSIRDL LDTASALYRE ALESPEHCSP HHTALRQAIL

61 CWGELMNLAT WVGSNLEDPA SRELVVSYVN VNMGLKIRQL LWFHISCLTF GRETVLEYLV

121 SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVVR RRGRSPRRRT PSPRRRRSQS PRRRRSQSRE

181 SQC（SEQ ID NO:7）

为了能以融合表达的方式在病毒样颗粒表面呈递目标抗原，所述乙肝病毒核心抗原的主要免疫显性区域（MIR）和/或次要免疫显性区域可设有多克隆位点编码的氨基酸残基。所述主要免疫显性区域（MIR）对应乙肝病毒核心抗原原始序列SEQ ID NO:7第76-81位氨基酸，所述次要免疫显性区域对应乙肝病毒核心抗原原始序列SEQ ID NO:7第127-134位氨基酸。

主要免疫显性区域（MIR）和次要免疫显性区域可均含多克隆位点编码的氨基酸残基，也可仅在主要免疫显性区域（MIR）或次要免疫显性区域含有多克隆位点编码的氨基酸残基。设置多克隆位点的方式即可以是直接增加多克隆位点编码的氨基酸残基，也可以将部分氨基酸残基用多克隆位点编码的氨基酸残基替换。如本发明实施例具体列举的，在对应乙肝病毒核心抗原原始序列第78-81位氨基酸之间，以及在对应乙肝病毒核心抗原原始序列第130-134位氨基酸之间的序列被替换，插入有多克隆位点编码的氨基酸残基。

进一步改良的，可在主要免疫显性区域（MIR）和次要免疫显性区域所设的多克隆位点编码的氨基酸残基旁再增设柔性氨基酸短肽铰链。所述柔性氨基酸短肽铰链可设于所述多克隆位点编码的氨基酸残基的一侧或两侧。如实施例具体列举的，在主要免疫显性区域（MIR）增设的多克隆位点两侧增设了序列为：Ser Gly Gly Ser Gly Gly（SEQ ID NO:3）和Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly(SEQ ID NO:4)的柔性氨基酸短肽铰链。

为了能以化学偶联的方式在病毒样颗粒表面呈递目标抗原，所述乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域（MIR）和/或次要免疫显性区域插入有赖氨酸。一般情况下，插入赖氨酸的数量可以是一个或若干个。

主要免疫显性区域（MIR）和次要免疫显性区域可均插入赖氨酸，也可仅在主要免疫显性区域（MIR）或次要免疫显性区域插入赖氨酸。插入赖氨酸的方式即可以是直接增加赖氨酸，也可以将部分氨基酸残基用赖氨酸替换。如本发明实施例具体列举的，在对应乙肝病毒核心抗原原始序列第78-81位氨基酸之间的序列被替换，插入有赖氨酸，以及在对应乙肝病毒核心抗原原始序列第131位氨基酸残基替换为赖氨酸。

最优选的，所述乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域（MIR）同时含有多克隆位点编码的氨基酸残基、柔性氨基酸短肽铰链和赖氨酸。如实施例所列举的，所述乙肝病毒核心抗原氨基酸序列为SEQ ID NO:5：

1 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro 20

21 Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu 40

41 Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu 60

61 Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Ser Gly 80

81 Gly Ser Gly Gly Lys Val Asp Lys Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Arg Glu Leu Val 100

101 Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile 120

121 Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp 140

141 Ile Arg Thr Pro Pro Lys Leu Glu Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu 160

161 Thr Thr Val Val（SEQ ID NO:5氨基酸）

进一步改良的，所述乙肝病毒核心抗原以及氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽之间也设有多克隆位点编码的氨基酸残基。

为了便于实验室纯化，所述乙肝病毒核心抗原与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的融合蛋白之后还可增设用于纯化的Histag。

进一步的，所述Histag之前还设有多克隆位点编码的氨基酸残基。

所述多克隆位点编码的氨基酸残基可以是各种载体中常见的由一个或多个酶切识别位点编码的氨基酸残基，如SalI、XhoI、KpnI位点等。

本发明第二方面，提供了一种表达产生前述免疫增强型病毒样颗粒的表达载体，为多克隆位点插入有乙肝病毒核心抗原编码基因与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽编码基因的融合基因的表达载体。

所述表达载体可以选自但不限于原核表达载体如大肠杆菌或芽孢杆菌的表达载体，真核表达载体如酵母菌表达载体，哺乳动物细胞病毒如腺病毒、植物细胞病毒、动物细胞表达载体、植物细胞表达载体、噬菌体、逆转录病毒或其他表达载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。具体的，如大肠杆菌表达载体pET5b。

所述氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的编码基因可连接于所述乙肝病毒核心抗原编码基因的3’端或5’端，优选3’端。

所述氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的编码基因的序列优选为：GGT GCG CTG AAC GAAATC AAC AAC AAC CTG CAG CGT GTT CGT GAA CTG GCG GTT CAG TCT GCG AAC GGC ACC AACTCT CAG TCT GAC CTG GAC TCT ATC CAG GCG GAA ATC ACC CAG ACC GAA AAC CCG CTG CAGAAA ATC GAC GCG GCG CTG GCG CAG GTT GAC ACC CTG CGT TCT GAC CTG GGT GCG GTT CAGAAC CGT TTC AAC TCT GCG ATC ACC AAC CTG（SEQ ID NO:2）。该序列的存在可增强病毒样颗粒的免疫活性。

进一步的，所述乙肝病毒核心抗原编码基因为乙肝病毒核心抗原全长或其片段的编码基因，包括主要免疫显性区域和次要免疫显性区域，至少包括乙肝病毒核心抗原全长的第1-140位氨基酸残基的编码基因以形成病毒样颗粒。如本发明实施例具体列举的，产生病毒样颗粒的表达载体中，至少保留乙肝病毒核心抗原全长的第1-149位氨基酸残基的编码基因。

为了能以融合表达的方式在病毒样颗粒表面呈递目标抗原，所述乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域（MIR）和/或次要免疫显性区域设有多克隆位点。主要免疫显性区域（MIR）和次要免疫显性区域可均设多克隆位点，也可仅在主要免疫显性区域（MIR）或次要免疫显性区域设多克隆位点。设置多克隆位点的方式即可以是直接插入多克隆位点，也可以将部分基因用多克隆位点的基因替换。如本发明实施例具体列举的，在对应乙肝病毒核心抗原原始序列第78-81位氨基酸的编码基因之间，以及在对应乙肝病毒核心抗原原始序列第130-134位氨基酸的编码基因之间的序列被替换，插入有多克隆位点。

进一步改良的，可在主要免疫显性区域（MIR）和次要免疫显性区域所设的多克隆位点旁再增设柔性氨基酸短肽铰链顺序的编码基因。所述柔性氨基酸短肽铰链顺序的编码基因可设于所述增设的多克隆位点的一侧或两侧。如实施例具体列举的，在主要免疫显性区域（MIR）增设的多克隆位点两侧增设了序列为：Ser Gly Gly Ser Gly Gly（SEQ ID NO:3）和Leu Glu Gly Gly Ser Gly Gly(SEQ ID NO:4)的柔性氨基酸短肽铰链顺序的编码基因。

为了能以化学偶联的方式在病毒样颗粒表面呈递目标抗原，所述乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域（MIR）和/或次要免疫显性区域插入有赖氨酸的编码基因。

主要免疫显性区域（MIR）和次要免疫显性区域可均插入赖氨酸的编码基因，也可仅在主要免疫显性区域（MIR）或次要免疫显性区域插入赖氨酸的编码基因。插入赖氨酸编码基因的方式即可以是直接增加赖氨酸编码基因，也可以将部分基因用赖氨酸编码基因替换。如本发明实施例具体列举的，在对应乙肝病毒核心抗原原始序列第78-81位氨基酸的编码基因之间的序列被替换，插入有赖氨酸编码基因，以及在对应乙肝病毒核心抗原原始序列第131位氨基酸的编码基因替换为赖氨酸的编码基因。

一般情况下，主要免疫显性区域（MIR）或次要免疫显性区域插入赖氨酸可插入赖氨酸的编码基因。赖氨酸编码基因的数量可以是一个或若干个。

最优选的，所述乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域（MIR）同时设有多克隆位点、柔性氨基酸短肽铰链顺序的编码基因和赖氨酸的编码基因。如实施例所列举的，所述乙肝病毒核心抗原编码基因为SEQ ID NO:6：

1ATG GAC ATC GAC CCGTAC AAA GAG TTT GGT GCT TCT GTT GAA CTG CTG TCT TTC CTG CCG 60

61 TCT GAC TTC TTC CCG TCT ATC CGT GAC CTG CTG GAC ACC GCT TCT GCT CTG TAC CGT GAA 120

121 GCT CTG GAA TCT CCG GAA CAC TGC TCT CCG CAC CAC ACC GCT CTG CGT CAG GCT ATC CTG 180

181 TGC TGG GGT GAA CTG ATG AAC CTG GCT ACC TGG GTT GGT TCT AAC CTG GAA GAC TCT GGT 240

241 GGT TCT GGT GGT AAA GTC GAC AAG CTG GAA GGT GGT TCT GGT GGT TCT CGT GAA CTG GTT 300

301 GTT TCT TAC GTT AAC GTT AAC ATG GGT CTG AAA ATC CGT CAG CTG CTG TGG TTC CAC ATC 360

361 TCT TGC CTG ACC TTC GGT CGT GAA ACC GTT CTG GAA TAC CTG GTT TCT TTC GGT GTT TGG 420

421 ATT CGT ACC CCG CCG AAA CTC GAG CCG CCG AAC GCT CCG ATC CTG TCT ACC CTG CCG GAA 480

481 ACC ACC GTT GTT（SEQ ID NO:6）

进一步改良的，所述乙肝病毒核心抗原编码基因以及氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽编码基因之间也设有多克隆位点。

为了便于实验室纯化，所述乙肝病毒核心抗原编码基因与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽编码基因的融合基因之后还可增设用于纯化的Histag编码基因。

进一步的，所述融合基因与所述Histag编码基因还设有多克隆位点。

如本发明实施例具体列举的，所述产生病毒样颗粒的表达载体中，表达载体的多克隆位点插入如下序列的基因（插入基因序列为SEQ ID NO:8，其编码的多肽序列为SEQ ID NO:9）：

1 ATG GAC ATC GAC CCG TAC AAA GAG TTT GGT GCT TCT GTT GAA CTG CTG TCT TTC CTG CCG 60

481 ACC ACC GTT GTT TCT CCG AAC GGT ACC GGT GCG CTG AAC GAA ATC AAC AAC AAC CTG CAG 540

161 Thr Thr Val Val Ser Pro Asn Gly Thr Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln 180

541 CGT GTT CGT GAA CTG GCG GTT CAG TCT GCG AAC GGC ACC AAC TCT CAG TCT GAC CTG GAC 600

181 Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Gly Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp 200

601 TCT ATC CAG GCG GAA ATC ACC CAG ACC GAA AAC CCG CTG CAG AAA ATC GAC GCG GCG CTG 660

201 Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu 220

661 GCG CAG GTT GAC ACC CTG CGT TCT GAC CTG GGT GCG GTT CAG AAC CGT TTC AAC TCT GCG 720

221 Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala 240

721 ATC ACC AAC CTG GGT ACC CAT CAT CAC CAT CAC CAC TAA 759

241 Ile Thr Asn Leu Gly Thr His His His His His His End 253

上述序列的说明：

氨基酸第79-84位及89-95位为柔性氨基酸短肽铰链顺序

氨基酸第85、88、146位为导入的赖氨酸，用于多肽抗原的化学偶联

核苷酸序列第256-261、439-444位为导入多肽抗原顺序的克隆和化学偶联位点（SalI和XhoI位点，其中SalI位点为抗原递呈主位点，XhoI位点为抗原递呈次位点）

核苷酸序列第502-507,733-738位是克隆位点（KpnI位点），用于功能基团顺序的克隆

氨基酸序列第170-244位为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽序列

碱基序列第508-732位为氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的基因序列

氨基酸序列第247-252位为Histag顺序用于人乙肝核心抗原病毒样颗粒的分离和纯化

其余顺序皆为人乙肝核心抗原顺序。

本发明第三方面提供了一种免疫增强型病毒样颗粒的制备方法，为将前述表达免疫增强型病毒样颗粒的表达载体导入合适的宿主，在适合表达所述免疫增强型病毒样颗粒的条件下培养所述宿主，再从培养物中分离出所述免疫增强型病毒样颗粒。

本发明第四方面，提供了所述免疫增强型病毒样颗粒或所述表达免疫增强型病毒样颗粒的表达载体在制备免疫治疗、免疫预防或免疫诊断用药物或试剂中的用途。

所述免疫治疗药物或试剂可为增强自身抗原免疫原性的疫苗。

进一步的，所述疫苗为用于治疗或预防慢性病毒性感染，慢性过敏性疾病，慢性神经性疾病以及肿瘤的疫苗。

本发明第五方面提供了一种增强抗原肽免疫原性的方法，为将目标抗原肽呈递于所述免疫增强型病毒样颗粒的表面。

进一步的所述目标抗原肽通过形成融合蛋白或通过化学偶联的方式递呈在所述免疫增强型病毒样颗粒的表面。

所述目标抗原肽可以为免疫耐受的自身抗原的抗原决定簇，包括但不限于慢性病毒性感染，慢性过敏性疾病，慢性神经性疾病以及肿瘤相关抗原的抗原决定簇，如从以下抗原挑选的抗原决定簇：细胞因子，例如TNF-α,IL-β,IL-6,MCP-1,NGF,VEGF；细胞表面受体，例如VEGFR，EGFR，PDGFR，CD20，PD-1，PD-1R，CTLA-4，白细胞介素受体；离子通道，例如TRP离子通道家族，钠离子通道家族，钙离子通道家族；G-蛋白偶联受体（GPCR）等。

所述目标抗原肽通过形成融合蛋白的方式递呈在免疫增强型病毒样颗粒表面具体为，将目标抗原肽的基因插入前述表达载体中乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域（MIR）或次要免疫显性区域的多克隆位点中融合表达获得。目标抗原肽通过形成融合蛋白的方式递呈在免疫增强型病毒样颗粒表面时，所述目标抗原肽的长度一般是五十个氨基酸残基以下，更优选的是在四十个氨基酸残基以下，再好的是在三十个氨基酸残基以下，最好是在二十个氨基酸残基以下。

所述目标抗原肽通过化学偶联的方式递呈在免疫增强型病毒样颗粒表面具体为，将目标抗原肽与所述病毒样颗粒的主要免疫显性区域（MIR）或次要免疫显性区域的赖氨酸化学偶联后获得。目标抗原肽通过化学偶联的方式递呈在免疫增强型病毒样颗粒表面时，所述目标抗原肽的长度一般是五个氨基酸残基以上，无上限。

本发明第六方面，提供了一种增强自身抗原免疫原性的疫苗，所述疫苗的主要有效成分为表面呈递有目标抗原肽的免疫增强型病毒样颗粒，所述目标抗原肽为免疫耐受的自身抗原肽的抗原决定簇。

进一步的，所述疫苗中还可包括药学上可接受的辅料。

本发明第七方面，提供了所述增强自身抗原免疫原性的疫苗中主要有效成分的制备方法，选自以下任一：

方法一，包括下列步骤：

1.根据已知的自身抗原氨基酸序列，设计和挑选抗原决定簇；

2.根据挑选的抗原决定簇序列合成相应的寡聚核苷酸双链；

3.通过DNA克隆的方法将步骤2合成的寡聚核苷酸双链插入前述表达产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体的多克隆位点中，并通过DNA测序验证正确的克隆；

4.在合适的宿主菌中表达正确的克隆DNA，经过分离纯化得到表面递呈所述设计的抗原决定簇的免疫增强型病毒样颗粒。

所述步骤3中，所述多克隆位点为所述表达产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体中，乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域（MIR）或次要免疫显性区域的多克隆位点。

方法二，包括下列步骤：

2.根据挑选的抗原决定簇序列合成相应的多肽；

3.将前述产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体导入合适的宿主菌，并表达产生免疫增强型病毒样颗粒，分离纯化病毒样颗粒；

4.将步骤2合成的多肽与步骤3分离的免疫增强型病毒样颗粒偶联获得表面递呈所述设计的抗原决定簇的免疫增强型抗原病毒样颗粒。

采用方法二时，步骤3选用的产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体应当选用乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域（MIR）或次要免疫显性区域插入有赖氨酸编码基因的表达载体。

本发明第八方面，提供了所述疫苗在制备治疗或预防慢性病毒性感染，慢性过敏性疾病，慢性神经性疾病以及肿瘤药物中的用途。

本发明第九方面，提供了一种刺激免疫系统对于免疫耐受的自身抗原产生免疫应答的方法，为经合适的方式将前述增强自身抗原免疫原性的疫苗免疫生物体，从而得到抗自身抗原的抗血清或抗体。

本发明通过基因工程重组技术，在人乙肝核心抗原病毒样颗粒的基础上，增加了一段特殊设计的多肽序列，改进并构建了免疫增强型病毒样颗粒表达载体，并利用该表达载体通过形成融合蛋白或通过化学偶联的方法将抗原决定簇递呈在免疫增强型病毒样颗粒表面制成一系列免疫原以激活，提高，调节机体免疫反应，以此来突破自身抗原的免疫耐受性，从而能诱导机体免疫系统产生高亲和力，高滴度，针对自身抗原的抗体。本发明的免疫增强型病毒样颗粒相比现有技术，能最大限度的增强疫苗的免疫原性。

附图说明

图1：免疫增强型病毒样颗粒电镜观察结果。标尺为100nm

图2：小鼠福尔马林痛觉试验建模结果

图3小鼠福尔马林痛觉试验给药结果

图4：携带小鼠多肽抗原pain的免疫增强型病毒样颗粒抗血清滴度ELISA检测结果5P：5μg接种，15P：15μg接种，50P：50μg接种，箭头指示免疫接种时间

图5：携带小鼠多肽抗原TNF-a的免疫增强型病毒样颗粒抗血清滴度ELISA检测结果5P：5μg接种，15P：15μg接种，50P：50μg接种，箭头指示免疫接种时间

图6：小鼠多肽抗原VEGF的免疫增强型病毒样颗粒和小鼠多肽抗原VEGF的病毒样颗粒抗血清滴度ELISA检测结果

图中，纵坐标为450nm读数，柱形为:5μg和30μg两种接种剂量组合并为一组

FV：小鼠多肽抗原VEGF的免疫增强型病毒样颗粒组

V：小鼠多肽抗原VEGF的病毒样颗粒组

图7小鼠多肽抗原VEGF的免疫增强型病毒样颗粒和小鼠多肽抗原VEGF的病毒样颗粒抗血清滴度ELISA检测结果比较

图中，纵坐标为450nm读数

FV5：小鼠多肽抗原VEGF的免疫增强型病毒样颗粒5μg接种剂量组

FV30：小鼠多肽抗原VEGF的免疫增强型病毒样颗粒30μg接种剂量组

V5：小鼠多肽抗原VEGF的病毒样颗粒5μg接种剂量组

V30：小鼠多肽抗原VEGF的病毒样颗粒30μg接种剂量组

图8：携带人N-型钙离子通道细胞表面抗原决定簇的免疫增强型病毒样颗粒的抗血清特异识别N型钙离子通道的CaV2.2亚基与其他亚型的钙离子通道无交叉反应。

左栏说明：DIC：细胞相差显微镜图，EGFP：增强型绿色荧光蛋白荧光图，mN1：AlexaFluor594-conjugated抗小鼠二抗和1:1000鼠抗人N-型钙离子通道（病毒颗粒融合抗原免疫）抗血清荧光图。

上栏说明：EGFP-N:EGFP-IRES N-型钙离子通道真核表达表达质粒。上述质粒DNA经用Lipofectamine试剂（Invitrogen公司产品，详细试验步骤参见该公司产品说明）转染HE293K细胞，EGFP-PQ:EGFP P/Q-型钙离子通道融合蛋白表达质粒转染HEK293细胞，EGFP+L:EGFP表达质粒和L-型钙离子通道表达质粒共转染HEK293细胞，EGFP+R:EGFP表达质粒和R-型钙离子通道表达质粒共转染HEK293细胞。（EGFPN、EGFPPQ、EGFP+L及EGFP+R为将人的N，L,P/Q以及R型钙离子通道基因全长cDNA分别克隆进荧光蛋白表达质粒（pEGFP系列）的多克隆位点后获得，荧光蛋白哺乳动物细胞表达质粒pEGFP均购自Clontech公司（详细质粒图谱请参见该公司网站www.clontech.com））

图9：鼠N-型钙离子通道（CaV2.2IS5-S6loop）及其表面抗原决定簇示意图

N1epitope:为N-型钙离子通道细胞表面抗原决定簇，其多肽序列为FPNSTDTEPVGDFP

图10：HEK293细胞株中，抗血清对鼠N-型钙离子通道（CaV2.2N-type亚基）的抑制效应检测结果

N=每组12个细胞

***p<0.001

黑线和红线分别对应加入抗血清前后的钡电流记录

图11：小鼠SCG交感神经节神经细胞中，抗血清对鼠N-型钙离子通道（CaV2.2N-type亚基）的抑制效应检测结果

N=每组3个交感神经节神经细胞

*p<0.05

图12：抗小鼠TNF-a，MCP-1，IL-1β多肽融合抗原IgG痛觉试验结果一

图13：抗小鼠TNF-a，MCP-1，IL-1β多肽融合抗原IgG痛觉试验结果二

1^stphase:0-10分钟

2^ndphase：10-40分钟

具体实施例

本发明通过基因工程重组技术将经过氨基酸顺序改进过的人乙肝核心抗原病毒样颗粒作为免疫原载体，通过形成融合蛋白或通过化学偶联的方法将多种与疾病相关的靶抗原分别递呈在病毒样颗粒表面，制成一系列免疫原从而激活，提高和调节机体免疫反应，产生的高滴度抗体可广泛用于免疫诊断，免疫鉴定试剂制备，以及预防和治疗疾病，例如慢性病毒性感染，慢性过敏性疾病，慢性神经性疾病以及肿瘤等疾病。本发明提供了该系列重组蛋白疫苗载体的氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列，本发明还提供了一系列与疾病相关的多肽靶抗原氨基酸序列以及编码靶抗原氨基酸序列的核苷酸序列，本发明还提供了该系列重组蛋白质免疫原的产生方法，以及应用。

使用本发明的技术，我们构建了一系列针对自身抗原的免疫原，并通过免疫，获得了高滴度高亲和力的抗血清和抗体，并且证明了可以利用这些抗体去影响自身抗原的生物学功能，从而达到免疫治疗的效果。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如分子克隆试验手册中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配制。

实施例1携带鼠MCP-1抗原肽的增强型病毒样颗粒的制备与检测

1.表达产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体的构建

按SEQ ID NO:8的序列全合成基因。

PCR合成基因：

用于全基因合成的寡聚核苷酸:

（SEQ ID NO：10-53）

R0 TGTACGGGTCGATGTCCAT

F0 ATGGACATCGACCCGTACAAAGAGTTTGGTGCTTCTGTTG

R19 GGCAGGAAAGACAGCAGTTCAACAGAAGCACCAAACTCTT

F40 AACTGCTGTCTTTCCTGCCGTCTGACTTCTTCCCGTCTA

R59 TCCAGCAGGTCACGGATAGACGGGAAGAAGTCAGAC

F79 TCCGTGACCTGCTGGACACCGCTTCTGCTCTGTA

R95 AGATTCCAGAGCTTCACGGTACAGAGCAGAAGCGGTG

F113 CCGTGAAGCTCTGGAATCTCCGGAACACTGCTCTCC

R132 CAGAGCGGTGTGGTGCGGAGAGCAGTGTTCCGG

F149 GCACCACACCGCTCTGCGTCAGGCTATCCTGTGC

R165 GGTTCATCAGTTCACCCCAGCACAGGATAGCCTGACG

F183 TGGGGTGAACTGATGAACCTGGCTACCTGGGTTGG

R202 CCAGAGTCTTCCAGGTTAGAACCAACCCAGGTAGCCA

F218 TTCTAACCTGGAAGACTCTGGTGGTTCTGGTGGTAAAGTCG

R239 ACCACCTTCCAGCTTGTCGACTTTACCACCAGAACCA

F259 ACAAGCTGGAAGGTGGTTCTGGTGGTTCTCGTGAA

R276 ACGTTAACGTAAGAAACAACCAGTTCACGAGAACCACCAGA

F294 CTGGTTGTTTCTTACGTTAACGTTAACATGGGTCTGAAAATCCG

R317 GGAACCACAGCAGCTGACGGATTTTCAGACCCATGTTA

F338 TCAGCTGCTGTGGTTCCACATCTCTTGCCTGACCT

R355 ACGGTTTCACGACCGAAGGTCAGGCAAGAGATGT

F373 TCGGTCGTGAAACCGTTCTGGAATACCTGGTTTCTTTCG

R389 GGGGTACGAATCCAAACACCGAAAGAAACCAGGTATTCCAGA

F412 GTGTTTGGATTCGTACCCCGCCGAAACTCGAGCCG

R431 GGATCGGAGCGTTCGGCGGCTCGAGTTTCGGC

F447 CCGAACGCTCCGATCCTGTCTACCCTGCCGGA

R463 CGGAGAAACAACGGTGGTTTCCGGCAGGGTAGACA

F479 AACCACCGTTGTTTCTCCGAACGGTACCGGTGCGC

R498 AGGTTGTTGTTGATTTCGTTCAGCGCACCGGTACCGTT

F514 TGAACGAAATCAACAACAACCTGCAGCGTGTTCGTGAAC

R536 GCAGACTGAACCGCCAGTTCACGAACACGCTGC

F553 TGGCGGTTCAGTCTGCGAACGGCACCAACTCTCA

R569 GGATAGAGTCCAGGTCAGACTGAGAGTTGGTGCCGTTC

F587 GTCTGACCTGGACTCTATCCAGGCGGAAATCACCCA

R607 GCAGCGGGTTTTCGGTCTGGGTGATTTCCGCCT

F623 GACCGAAAACCCGCTGCAGAAAATCGACGCGGCG

R640 GGTGTCAACCTGCGCCAGCGCCGCGTCGATTTTCT

F657 CTGGCGCAGGTTGACACCCTGCGTTCTGACCTGGG

R675 ACGGTTCTGAACCGCACCCAGGTCAGAACGCAG

F692 TGCGGTTCAGAACCGTTTCAACTCTGCGATCACCA

R708 GATGATGGGTACCCAGGTTGGTGATCGCAGAGTTGAA

F727 ACCTGGGTACCCATCATCACCATCACCACTAAtcgcc

R745 acagactgttaggaccccggcgaTTAGTGGTGATGGT

R764 ggggtcctaacagtctgt

合成的寡聚核苷酸以100uM浓度溶解于水，各取5ul等体积混合，在50ul PCR反应体积中（Phusion HF DNA聚合酶，Finnzymes），加入200uM dNTP，2ul混合的寡聚核苷酸，5单位DNA聚合酶，95°C变性3分钟，然后95°C 30秒，52°C 30秒，72°C一分钟，30个循环，最后72°C延长5分钟后终止反应。

取1ul PCR合成产物作为PCR模板进行PCR克隆：

在50ul PCR反应体积中（Phusion HF DNA聚合酶，Finnzymes），加入1ul上述PCR合成产物，200uM dNTP，0.2uM引物一（5‘-GGAGATATACCATGGACATCGACCCGTACAAAGAG-3’）（SEQID NO:54），0.2uM引物二（5‘-TTAGCAGCCGGATCCTTAGTGGTGATGGTGATGATG-3’）（SEQ ID NO:55），5单位DNA聚合酶，95°C变性5分钟，然后95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 一分钟，32个循环，最后72°C延长5分钟后终止反应。PCR产物经过纯化后（Qiagen PCR纯化试剂盒），NcoI和BamHI双酶切PCR产物与大肠杆菌表达载体pET5b后连接，将SEQ ID NO:8的基因定向克隆进大肠杆菌表达载体pET5b的NcoI和BamHI双位点，克隆质粒经DNA测序验证为正确，获得表达产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体。

2.目标抗原肽基因的插入

根据鼠MCP-1抗原顺序：KWVKNSINHLDK（SEQ ID NO:56）合成双链寡聚核苷酸:

5’-tcgacAAATGGGTTAAAAACTCTATCAACCACCTGGACAAAg-3’（SEQ ID NO:57）

5’-tcgacTTTGTCCAGGTGGTTGATAGAGTTTTTAACCCATTTg-3’（SEQ ID NO:58）

退火后形成双链DNA，经连接酶克隆进步骤1获得的表达产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体的SalI位点，克隆经DNA测序后证实为正确。

3.免疫增强型病毒样颗粒的获得

将步骤2获得的插入有目标抗原肽基因的表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，挑选3-5个单独克隆，接种入3ml 2xYT培养液含100ug/ml氨苄青霉素，34ug/ml氯霉素，37°C摇床培养至O.D.值达到1.0-1.5，将3ml细菌培养液转接入300ml 2xYT含100ug/ml氨苄青霉素，37°C摇床培养至O.D.值为0.6后加入IPTG至终浓度为0.5mM，在30°C继续摇床培养3-5小时。细菌培养液经5000g，4°C离心15分钟，弃去上清，菌体可以-80°C保存或直接进行颗粒纯化。

菌体重新悬浮于适量（1-2克菌体加10ml缓冲液）冷的平衡缓冲液（pH8.0的50mM磷酸缓冲液含0.3M NaCl），15秒10次超声破菌体，每次超声间隔二分钟并置于湿冰中以保持菌体冷却。超声后的菌体在4°C经过12000g，30分钟离心后收集上清进一步经Ni纯化柱纯化。

2ml的Ni纯化预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取细菌破碎上清10ml样品上样，15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，然后用9ml洗脱缓冲液（pH8.0的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含250mM咪唑）洗脱病毒样颗粒，洗脱液经100KD Amico15离心浓缩以及交换缓冲液至pH8.0的50mM磷酸缓冲液含0.15M NaCl,0.5mM EDTA。纯化样品经SDS-PAGE电泳鉴定，以及电镜鉴定为纯病毒样颗粒，如图1所示。

实施例2携带鼠TNF-a抗原肽的免疫增强型病毒样颗粒和携带鼠IL-6抗原肽的免疫增强型病毒样颗粒的制备与检测

1.采用实施例1步骤1的方法构建表达产生病毒样颗粒的表达载体

2.免疫增强型病毒样颗粒的获得

将步骤1获得的表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，挑选3-5个单独克隆，接种入3ml 2xYT培养液含100ug/ml氨苄青霉素，34ug/ml氯霉素，37°C摇床培养至O.D.值达到1.0-1.5，将3ml细菌培养液转接入300ml 2xYT含100ug/ml氨苄青霉素，37°C摇床培养至O.D.值为0.6后加入IPTG至终浓度为0.5mM，在30°C继续摇床培养3-5小时。细菌培养液经5000g，4°C离心15分钟，弃去上清，菌体可以-80°C保存或直接进行颗粒纯化。

2ml的Ni纯化预装柱，用10ml平衡缓冲液平衡，然后取细菌破碎上清10ml样品上样，15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，然后用9ml洗脱缓冲液（pH8.0的50mM磷酸缓冲液含0.5M NaCl，含250mM咪唑）洗脱病毒样颗粒，洗脱液经100KD Amico15离心浓缩以及交换缓冲液至pH8.0的50mM磷酸缓冲液含0.15M NaCl,0.5mM EDTA。纯化样品经SDS-PAGE电泳鉴定，以及电镜鉴定为纯病毒样颗粒。

3.鼠TNF-a抗原肽的偶联

化学合成序列为CSDKPVAHVVANHQVEEQ（SEQ ID NO:59）的鼠TNF-a抗原肽。

化学合成序列为CESQKEWLRTKT（SEQ ID NO:60）的鼠IL-6抗原肽。

用Sulfo-SMCC异源双功能交联试剂参照Pierce公司的试剂说明书分别将鼠TNF-a抗原肽和鼠IL-6抗原肽与步骤2获得的病毒样颗粒交联。

4.免疫小鼠

小鼠福尔马林痛觉试验：将小鼠置于观察室中习惯1小时，而后将10ul 2.5%的福尔马林注入小鼠右后爪，将小鼠放回观察室，观察并记录其注射后0-60分钟内的舔爪情况，如图2所示，急性及持续性/慢性炎症性疼痛小鼠模型建立成功。

建立空白病毒样颗粒组、鼠TNF-a病毒样颗粒组和鼠IL-6抗原肽的病毒样颗粒组，每组3只小鼠，于注射福尔马林之前分别采用各病毒药颗粒免疫小鼠，100ug初次免疫，两次加强免疫均为50ug，时间间隔为两周，第二次加强免疫后的第10天做小鼠福尔马林痛觉试验，结果见图3。

福尔马林痛觉试验结果：

1.鼠IL-6抗原肽的病毒样颗粒组：在0-10分钟内（急性期），累积舔爪时间显著少于对照组，表明急性炎性疼痛显著减低（P=0.023）。

2.鼠TNF-a病毒样颗粒组：在10-60分钟内（慢性期），累积舔爪时间少于对照组，表明慢性炎性疼痛有减低趋势（P=0.058）。

实施例3携带小鼠多肽抗原pain的免疫增强型病毒样颗粒的制备与检测I:携带小鼠多肽抗原pain的免疫增强型病毒样颗粒的制备

1.采用实施例1步骤1的方法构建表达产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体

2.目标抗原肽基因的插入

根据TNF-a和IL-6融合多肽Pain抗原顺序：SSDKPVDLKDNQLVTPEGAELKPDDALAENNLKLPE（SEQ ID NO:61）合成下列单链寡聚核苷酸:

（SEQ ID NO:62-70）

PAN1 GAAGAGTCGACTTTACCACCA

PAN2 TGGTGGTAAAGTCGACTCTTCTGACAAACCGGTTGACC

PAN3 CCAGCTGGTTGTCTTTCAGGTCAACCGGTTTGTCA

PAN4 TGAAAGACAACCAGCTGGTTACCCCGGAAGGTGC

PAN5 CGTCCGGTTTCAGTTCCGCACCTTCCGGGGTAA

PAN6 GGAACTGAAACCGGACGACGCGCTGGCGGAAAA

PAN7 CCGGCAGTTTCAGGTTGTTTTCCGCCAGCGCGT

PAN8 CAACCTGAAACTGCCGGAAGTCGACAAGCTGGAAG

PAN9 CTTCCAGCTTGTCGACTT

如实施例1步骤1的方法通过PCR合成抗原肽基因，用连接酶克隆经步骤1获得的表达产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体的SalI位点，克隆经DNA测序后证实为正确。

3.免疫增强型病毒样颗粒的获得

采用如实施例1步骤3的方法，利用步骤2获得的插入有目标抗原肽基因的表达载体制备并纯化获得免疫增强型病毒样颗粒。纯化样品经SDS-PAGE电泳鉴定，以及电镜鉴定为纯病毒样颗粒.

II．携带小鼠多肽抗原TNF-a的免疫增强型病毒样颗粒的制备

2.目标抗原肽基因的插入

根据融合TNF-a多肽顺序：SSDKPVDLKDNQLVTPEGAELKP（SEQ ID NO:71），合成单链寡聚核苷酸:

（SEQ ID NO:72-78）

TN1 GTCGACTTTACCACCA

TN2 TGGTGGTAAAGTCGACTCTTCTGACAAACCGG

TN3 GTTGTCTTTCAGGTCAACCGGTTTGTCAGAAGA

TN4 TTGACCTGAAAGACAACCAGCTGGTTACCCC

TN5 TTCCGCACCTTCCGGGGTAACCAGCTG

TN6 GGAAGGTGCGGAACTGAAACCGGTCGACAAGCTGGAAG

TN7 CTTCCAGCTTGTCGACCGGTTTCAG

3.免疫增强型病毒样颗粒的获得

采用如实施例1步骤3的方法，利用步骤2获得的插入有目标抗原肽基因的表达载体制备并纯化获得免疫增强型病毒样颗粒。纯化样品经SDS-PAGE电泳鉴定，以及电镜鉴定为纯病毒样颗粒。

III.动物免疫：

分别采用携带小鼠多肽抗原pain的免疫增强型病毒样颗粒与携带小鼠多肽抗原TNF-a的免疫增强型病毒样颗粒经腹部皮下接种或腹腔接种小鼠，每剂量组3只小鼠，接种蛋白量为5-50ug病毒样颗粒/只，体积为50-100微升，两周接种一次。

IV.抗血清滴度测试：

血清采取最后一次加强免疫后的7-14天内进行，采取心脏采血方式，血液经37°C孵育一小时后，再在冰上保存一小时，7000g，4°C离心15分钟，取上清即为抗血清，采用人工合成多肽SSDKPVDLKDNQLVTPEGAELKP为抗原，包被（2ug/ml，pH9.6碳酸钠缓冲液，100ul/孔，37℃两小时然后4℃过夜包被），次日，弃去孔内溶液，用200ul磷酸缓冲液（PBS）洗2次，每次3分钟。加含200ul 2％BSA，0.05％Tween20的PBS缓冲液（封闭缓冲液）4°C过夜封闭。用200ul不含BSA的封闭缓冲液（洗涤液）洗2次。加100ul 1∶2000稀释的小鼠血清，37°C孵育两小时。用200ul洗涤液洗四次，加100ul含1∶5000稀释的羊抗鼠IgG-HRP的封闭液，室温孵育两小时，然后用200ul洗涤液洗四次，进行显色反应。

ELISA滴度检测结果如图：

结果如图4和图5所示：

图4结果表明：在无任何佐剂的情况下，抗原多肽融合病毒颗粒能有效诱导机体产生针对自身抗原序列的抗体，经多次（三次）免疫后，抗体滴度基本与抗原用量无太大相关性。若无追加免疫，抗体滴度随时间呈下降趋势。

图5结果表明：本发明的自身多肽融合病毒样颗粒抗原能引起典型的机体体液免疫反应，为维持较高滴度的抗体水平需要持续加强免疫。

实施例4携带VEGF抗原肽的免疫增强型病毒样颗粒的制备与检测

1.采用实施例1步骤1的方法构建表达产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体。

2.对比人乙肝核心抗原病毒样颗粒表达载体的构建：SEQ ID NO:79的序列全合成基因，经PCR定向克隆进大肠杆菌表达载体pET5b的NcoI和BamHI双位点，克隆质粒经DNA测序验证为正确，获得不含氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽编码基因的对比病毒样颗粒表达载体。

ATGGACATCGACCCGTACAAAGAGTTTGGTGCTTCTGTTGAACTGCTGTCTTTCCTGCCG

M D I D P Y K E F G A S V E L L S F L P

TCTGACTTCTTCCCGTCTATCCGTGACCTGCTGGACACCGCTTCTGCTCTGTACCGTGAA

S D F F P S I R D L L D T A S A L Y R E

GCTCTGGAATCTCCGGAACACTGCTCTCCGCACCACACCGCTCTGCGTCAGGCTATCCTG

A L E S P E H C S P H H T A L R Q A I L

TGCTGGGGTGAACTGATGAACCTGGCTACCTGGGTTGGTTCTAACCTGGAAGACTCTGGT

C W G E L M N L A T W V G S N L E D S G

GGTTCTGGTGGTAAAGTCGACAAGCTGGAAGGTGGTTCTGGTGGTTCTCGTGAACTGGTT

G S G G K V D K L E G G S G G S R E L V

GTTTCTTACGTTAACGTTAACATGGGTCTGAAAATCCGTCAGCTGCTGTGGTTCCACATC

V S Y V N V N M G L K I R Q L L W F H I

TCTTGCCTGACCTTCGGTCGTGAAACCGTTCTGGAATACCTGGTTTCTTTCGGTGTTTGG

S C L T F G R E T V L E Y L V S F G V W

ATTCGTACCCCGCCGAAACTCGAGCCGCCGAACGCTCCGATCCTGTCTACCCTGCCGGAA

I R T P P K L E P P N A P I L S T L P E

ACCACCGTTGTTTCTCCGAACGGTCATCATCACCATCACCACTAA

T T V V S P N G H H H H H H *

克隆入载体的核苷酸序列为SEQ ID NO:79，其编码的多肽为SEQ ID NO:80。

3.目标抗原肽基因的插入

根据VEGF抗原多肽顺序：ESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMS（SEQ ID NO:81）合成单链寡聚核苷酸:

VEGa:TGGTGGTAAAGTCGACGAATCTAACATCACCATGCAGATCATGCGTATCAAACCGCACCA（SEQ ID NO:82）

VEGb:CTTCCAGCTTGTCGACAGACATTTCACCGATGTGCTGACCCTGGTGCGGTTTGATACGCAT（SEQ IDNO:83）

经变性和退火后用Klenow酶补齐后形成双链DNA，经Infusion克隆系统（Clontech）分别克隆进经步骤1获得的免疫增强型病毒样颗粒的表达载体和步骤2获得的对比人乙肝核心抗原病毒样颗粒表达载体。

4.病毒样颗粒的获得

采用如实施例1步骤3的方法，利用步骤3获得的插入有目标抗原肽基因的免疫增强型病毒样颗粒的表达载体制备并纯化获得小鼠多肽抗原VEGF的免疫增强型病毒样颗粒,利用步骤3获得的插入有目标抗原肽基因的对比人乙肝核心抗原病毒样颗粒表达载体制备并纯化获得小鼠多肽抗原VEGF的病毒样颗粒。纯化样品经SDSPAGE电泳鉴定，以及电镜鉴定为纯病毒样颗粒。

5.采用实施例3步骤III的方法免疫小鼠,每剂量组9只小鼠一组。

6.采用实施例3步骤IV的方法，分别以小鼠多肽抗原VEGF的免疫增强型病毒样颗粒和小鼠多肽抗原VEGF的病毒样颗粒为抗原，以合成的小鼠VEGF抗原多肽（ESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMS （SEQ ID NO:81））包被ELISA测定抗血清滴度，无佐剂，免疫2次，两个剂量组，每组的剂量分别为5ug和30ug，两次免疫时间间隔为14天，第二次免疫后第十四天采血，血清ELISA检测。检测结果如图6和图7：

结果表明：相比对比人乙肝核心抗原病毒样颗粒载体，本发明的免疫增强型病毒样颗粒能大幅增强抗体滴度。

实施例5携带人N-型钙离子通道细胞表面抗原决定簇的增强型病毒样颗粒的制备与检测

2.目标抗原肽基因的插入

根据人N-型钙离子通道细胞表面抗原决定簇多肽顺序FPNSTDTEPVGDFP（SEQ ID NO:84）人工合成寡聚核苷酸N1,N2：

N1:5’-tcgacTTCCCGAACTCTACCGACACCGAACCGGTTGGTGACTTCCCGg-3’（SEQ ID NO:85）

N2:5’-tcgacCGGGAAGTCACCAACCGGTTCGGTGTCGGTAGAGTTCGGGAAg-3’（SEQ ID NO:86）

N1和N2经变性和退火形成双链DNA，通过连接酶连接反应克隆进经步骤1获得的免疫增强型病毒颗粒表达载体的SalI位点，克隆经过DNA测序确认正确。

3.病毒样颗粒的获得

采用如实施例1步骤3的方法，利用步骤2获得的插入有目标抗原肽基因的免疫增强型病毒样颗粒的表达载体制备并纯化获得携带人N-型钙离子通道细胞表面抗原决定簇的免疫增强型病毒样颗粒。纯化样品经SDS-PAGE电泳鉴定，以及电镜鉴定为纯病毒样颗粒。

4.特异性试验

荧光试验表明，携带人N-型钙离子通道细胞表面抗原决定簇的免疫增强型病毒样颗粒的抗血清特异识别N型钙离子通道的CaV2.2亚基与其他亚型的钙离子通道无交叉反应。结果如图8所示。

人N-型钙离子通道细胞表面抗原决定簇经本专利所述方法克隆表达和纯化，并免疫动物后，取得抗血清，观察抗血清对人和鼠N-型钙离子通道的抑制效应。

图8结果说明通过病毒颗粒多肽融合抗原免疫，能产生特异的针对多肽顺序的抗体，针对N-型钙离子通道细胞表面抗原决定簇的抗体与其他型的钙离子通道无交叉反应。

5.抗血清对小鼠N-型钙离子通道（CaV2.2 N-type亚基）的抑制效应试验

在稳定表达钙离子通道辅助亚基β_1C和α₂δ-1的HEK293细胞株中瞬时表达人N-型钙离子通道（CaV2.2N-type亚基），两天后用膜片钳技术记录通过N-型钙离子通道的钡电流（黑线）。在chamber中每个细胞先记录钡电流基线，然后加入抗血清（1:100稀释），3-5分钟后再次记录钡电流（红线），结果如图10所示。空白增强型病毒样颗粒免疫后的抗血清（VLPab）对电流无抑制效应,而N-型钙离子通道抗原多肽融合增强型病毒样颗粒的抗血清（hN1ab）有35-40%的抑制效应。

小鼠SCG交感神经节神经细胞原代培养，用膜片钳技术记录钡电流，VLP ab有约5%的抑制效应，而hN1ab有20-25%的抑制效应，结果表明抗血清对人和鼠的N-型钙离子通道都有明显抑制效应，在小鼠神经细胞上的抑制效应略小于在HEK细胞株上的效果可能是因为这些原代细胞还同时表达其他型钙离子通道。

实施例6：抗小鼠TNF-a，MCP-1，IL-1β多肽融合抗原IgG对痛觉的影响

2.目标抗原肽基因的插入

分别根据小鼠多肽抗原TNF-a，MCP-1，IL-1β的多肽序列人工合成对应的寡聚核苷酸：

TNF-a：SDKPVAHVVANHQVEEQ（SEQ ID NO:87）

mTNF1：5′-tcgacTCTGACAAACCGGTTGCGCACGTTGTTGCGAACCACCAGGTTGAAGAACAGg-3’（SEQ ID NO:88）

mTNF2：5′-tcgacCTGTTCTTCAACCTGGTGGTTCGCAACAACGTGCGCAACCGGTTTGTCAGAg-3’（SEQ ID NO:89）

MCP-1：KWVKNSINHLDK（SEQ ID NO:56）

MCP-1a：5′-tcgacAAATGGGTTAAAAACTCTATCAACCACCTGGACAAAg-3’（SEQ ID NO:57）

MCP-1b：5′-tcgacTTTGTCCAGGTGGTTGATAGAGTTTTTAACCCATTTg-3’（SEQ ID NO:58）

IL-1β：RQLHYRLRDEQQ（SEQ ID NO:90）

1B1：5′-tcgacCGTCAGCTGCACTACCGTCTGCGTGACGAACAGCAGg-3’（SEQ ID NO:91）

1B2：5′-tcgacCTGCTGTTCGTCACGCAGACGGTAGTGCAGCTGACGg-3’（SEQ ID NO:92）

mTNF1和mTNF2，MCP-1a和MCP-1b，1B1和1B2分别经变性和退火形成双链DNA，通过连接酶连接反应克隆进免疫增强型病毒颗粒表达载体的SalI位点，克隆经过DNA测序确认正确。

3.病毒样颗粒的获得

采用如实施例1步骤3的方法，利用步骤2获得的插入有目标抗原肽基因的免疫增强型病毒样颗粒的表达载体制备并纯化获得分别携带人TNF-a、MCP-1及IL-1β的免疫增强型病毒样颗粒。纯化样品经SDS-PAGE电泳鉴定，以及电镜鉴定为纯病毒样颗粒。

4.免疫动物：

用纯化的空白免疫增强型病毒样颗粒以及抗原多肽融合的免疫增强型病毒样颗粒免疫，小鼠经四次免疫后（每次免疫间隔两周，30ug抗原/只/次，3只/抗原，CD-1小鼠）制备抗血清，方法同实施例3。同种抗原免疫的3只小鼠抗血清混合后分离纯化IgG（用MontageAntibody Purification Kit with PROSEP-G Media,Millipore详细方法参见厂商的使用手册）。

急性及持续性/慢性炎症性疼痛CD-1小鼠模型建立方法同实施例2

建立空白免疫增强型病毒样颗粒组抗血清组（anti-VLP）、鼠TNF-a，MCP-1，IL-1β抗原肽免疫增强型病毒样颗粒抗血清等量混合组(anti-cytokines)，每组3只小鼠，于注射福尔马林之前1-2天分别静脉注射各病毒样颗粒免疫小鼠的IgG(80ug/只)，做小鼠福尔马林痛觉试验，结果见图12。

结果表明：经过多肽融合病毒样颗粒免疫的TNF-a，MCP-1，IL-1β混合抗体IgG对小鼠的急性和慢性炎性痛都有显著抑制效应。

Claims

1.一种免疫增强型病毒样颗粒，构成该颗粒的蛋白质亚基为乙肝病毒核心抗原与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的融合蛋白。

2.如权利要求1所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽连接于所述乙肝病毒核心抗原的C端或N端。

3.如权利要求2所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原为乙肝病毒核心抗原全长或其片段，包括主要免疫显性区域和次要免疫显性区域，所述乙肝病毒核心抗原片段至少包括乙肝病毒核心抗原全长的第1-140位氨基酸残基以形成病毒样颗粒。

4.如权利要求3所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原片段至少包括乙肝病毒核心抗原全长的第1-149位氨基酸残基以形成病毒样颗粒。

5.如权利要求3所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原的主要免疫显性区域和/或次要免疫显性区域设有多克隆位点编码的氨基酸残基。

6.如权利要求5所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，在所述主要免疫显性区域和/或次要免疫显性区域所设的多克隆位点编码的氨基酸残基旁再增设柔性氨基酸短肽铰链。

7.如权利要求6所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述柔性氨基酸短肽铰链的序列选自SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。

8.如权利要求3-7任一权利要求所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域和/或次要免疫显性区域插入有赖氨酸。

9.如权利要求1所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。

10.如权利要求1所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原以及氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽之间设有多克隆位点编码的氨基酸残基。

11.如权利要求1所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的融合蛋白之后增设用于纯化的Histag。

12.如权利要求11所述免疫增强型病毒样颗粒，其特征在于，所述Histag之前还设有多克隆位点编码的氨基酸残基。

13.一种表达产生权利要求1所述免疫增强型病毒样颗粒的表达载体，为多克隆位点插入有乙肝病毒核心抗原编码基因与氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽编码基因的融合基因的表达载体，能表达产生权利要求1所述免疫增强型病毒样颗粒。

14.如权利要求13所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体选自原核表达载体、真核表达载体、哺乳动物细胞病毒、植物细胞病毒、动物细胞表达载体、植物细胞表达载体、噬菌体、逆转录病毒或其他表达载体。

15.如权利要求13所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为大肠杆菌表达载体pET5b。

16.如权利要求13所述的表达载体，其特征在于，所述氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的编码基因连接于所述乙肝病毒核心抗原编码基因的3’端或5’端。

17.如权利要求13所述的表达载体，其特征在于，所述氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽的编码基因的序列为SEQ ID NO:2。

18.如权利要求13-17任一权利要求所述的表达载体，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原编码基因为乙肝病毒核心抗原全长或其片段的编码基因，包括主要免疫显性区域和次要免疫显性区域，至少包括乙肝病毒核心抗原全长的第1-140位氨基酸残基的编码基因以形成病毒样颗粒。

19.如权利要求18所述的表达载体，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原编码基因至少包括乙肝病毒核心抗原全长的第1-149位氨基酸残基的编码基因以形成病毒样颗粒。

20.如权利要求18所述的表达载体，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域和/或次要免疫显性区域设有多克隆位点。

21.如权利要求20所述的表达载体，其特征在于，所述主要免疫显性区域和/或次要免疫显性区域所设的多克隆位点旁再增设柔性氨基酸短肽铰链顺序的编码基因。

22.如权利要求21所述的表达载体，其特征在于，所述柔性氨基酸短肽铰链的序列选自序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的柔性氨基酸短肽铰链顺序的编码基因。

23.如权利要求18-22任一权利要求所述的表达载体，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域和/或次要免疫显性区域插入有赖氨酸的编码基因。

24.如权利要求18所述的表达载体，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原编码基因为SEQ IDNO:6。

25.如权利要求18所述的表达载体，其特征在于，所述乙肝病毒核心抗原编码基因以及氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多肽编码基因之间也设有多克隆位点。

26.如权利要求18所述的表达载体，其特征在于，所述融合基因之后还增设用于纯化的Histag编码基因。

27.如权利要求26所述的表达载体，其特征在于，所述融合基因与所述Histag编码基因之间设有多克隆位点。

28.如权利要求18所述的表达载体，其特征在于，所述产生病毒样颗粒的表达载体中，表达载体的多克隆位点插入有序列为SEQ ID NO:8的基因。

29.一种免疫增强型病毒样颗粒的制备方法，为将权利要求13-28任一权利要求所述表达免疫增强型病毒样颗粒的表达载体导入合适的宿主，在适合表达所述免疫增强型病毒样颗粒的条件下培养所述宿主，再从培养物中分离出所述免疫增强型病毒样颗粒。

30.如权利要求1-12任一权利要求所述免疫增强型病毒样颗粒或权利要求13-28任一权利要求所述表达免疫增强型病毒样颗粒的表达载体在制备免疫治疗、免疫预防或免疫诊断用药物或试剂中的用途。

31.如权利要求30所述免疫增强型病毒样颗粒或表达免疫增强型病毒样颗粒的表达载体的用途，其特征在于，所述免疫治疗药物或试剂为增强自身抗原免疫原性的疫苗。

32.如权利要求31所述免疫增强型病毒样颗粒或表达免疫增强型病毒样颗粒的表达载体的用途，其特征在于，所述疫苗为用于治疗或预防慢性病毒性感染、慢性过敏性疾病、慢性神经性疾病或肿瘤的疫苗。

33.一种增强抗原肽免疫原性的方法，为将目标抗原肽呈递于权利要求1-12任一权利要求所述免疫增强型病毒样颗粒的表面。

34.如权利要求33所述增强抗原肽免疫原性的方法，其特征在于，所述目标抗原肽通过形成融合蛋白或通过化学偶联的方式递呈在所述免疫增强型病毒样颗粒的表面。

35.如权利要求34所述增强抗原肽免疫原性的方法，其特征在于，所述目标抗原肽为免疫耐受的自身抗原的抗原决定簇。

36.如权利要求34所述增强抗原肽免疫原性的方法，其特征在于，所述目标抗原肽通过形成融合蛋白的方式递呈在免疫增强型病毒样颗粒表面具体为：将目标抗原肽的基因插入权利要求18-28中任一权利要求所述表达载体中乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域或次要免疫显性区域的多克隆位点中融合表达获得；所述目标抗原肽通过化学偶联的方式递呈在免疫增强型病毒样颗粒表面具体为：将目标抗原肽与权利要求8或9所述病毒样颗粒的主要免疫显性区域或次要免疫显性区域的赖氨酸化学偶联后获得。

37.一种增强自身抗原免疫原性的疫苗，所述疫苗的主要有效成分为表面呈递有目标抗原肽的权利要求1-12任一权利要求所述免疫增强型病毒样颗粒，所述目标抗原肽为免疫耐受的自身抗原肽的抗原决定簇。

38.表面呈递有目标抗原肽的权利要求1-12任一权利要求所述免疫增强型病毒样颗粒的制备方法，所述目标抗原肽为免疫耐受的自身抗原肽的抗原决定簇，选自以下任一：

方法一，包括下列步骤：

2.根据挑选的抗原决定簇序列合成相应的寡聚核苷酸双链；

3.通过DNA克隆的方法将步骤2合成的寡聚核苷酸双链插入权利要求18-28中任一权利要求所述的表达载体中乙肝病毒核心抗原编码基因的主要免疫显性区域或次要免疫显性区域的多克隆位点的多克隆位点中，并通过DNA测序验证正确的克隆；

4.在合适的宿主菌中表达正确的克隆DNA，经过分离纯化得到表面递呈所述设计的抗原决定簇的免疫增强型病毒样颗粒；

方法二，包括下列步骤：

2.根据挑选的抗原决定簇序列合成相应的多肽；

3.将权利要求23、24或28任一所述产生免疫增强型病毒样颗粒的表达载体导入合适的宿主菌，并表达产生免疫增强型病毒样颗粒，分离纯化病毒样颗粒；

39.如权利要求37所述疫苗在制备治疗或预防慢性病毒性感染，慢性过敏性疾病，慢性神经性疾病以及肿瘤药物中的用途。

40.一种刺激免疫系统对于免疫耐受的自身抗原产生免疫应答的方法，为经合适的方式将权利要求37所述的疫苗免疫生物体，从而得到抗自身抗原的抗血清或抗体。