CN103554268A - 长效重组促卵泡激素及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了长效重组促卵泡激素融合蛋白(Human follicle-stimulating hormone-Fc fusion protein，简称hFSH-Fc)及其制备方法，该hFSH-Fc蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包括hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、柔性肽接头和人IgG Fc变体，其体内半衰期比现有人促卵泡激素更长，药效更好。本发明还涉及重组hFSH-Fc融合蛋白组合物在制备动物繁殖领域药物中的用途。

Description

长效重组促卵泡激素及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和兽药领域。更具体地，本发明涉及长效重组人促卵泡激素融合蛋白、其制备方法及应用。该融合蛋白体内半衰期显著延长，其在动物繁殖领域中的疗效优于现有促卵泡激素产品。

背景技术

促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，简称FSH)是动物繁殖领域常用的药物主要成分，现有上市FSH主要为猪垂体中提取的生化品种，可用于青年母猪提前发情和同期发情、及超期不发情母猪促发情，在牛和羊繁殖领域也有更广泛的应用。生化提取的FSH存在病毒污染、原料来源有限、采集困难、含量低及纯化过程复杂等缺陷。另外，因检测方法及病毒灭活技术的局限性以及一些不可预知的新致病病毒感染时有发生，并不能完全杜绝生化提取产品发生病毒污染的可能性。

相比而言，重组FSH在其纯度、抗原性、安全性、无病毒感染等方面具有生化FSH产品无法比拟的优点。迄今为止，还未有重组FSH产品用于兽药领域。FSH是一种糖基化蛋白，SDS-PAGE检测其分子量为43KD。另外，hFSH是具有两条单链(α链和β链)的糖基化蛋白，链间以非共价键连接，两条链的正确折叠才能保证hFSH的生物活性。如何在蛋白表达和纯化过程中保持两条链的正常结合是一个挑战。作为一种治疗药物，保证其生物活性，必要的条件是具有正确的三维结构和糖基化修饰。具有完善翻译后修饰功能是哺乳动物细胞被选作大多数生物药蛋白表达宿主的主因。其中，中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster OvaryCell，CHO)是用于真核生物外源基因表达最为成功的宿主细胞，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，很多人用重组蛋白药物已上市。与其它表达系统相比，该系统具有许多优点，如拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。

不同哺乳动物种属之间的FSH蛋白的氨基酸序列同源性很高，例如，人FSHα链和β链与猪FSHα链和β链的氨基酸序列同源性分别为83％和96％，人FSH与牛FSH的氨基酸序列同源性高达88％，提示hFSH在其他哺乳动物繁殖领域的潜在应用。目前已有利用CHO细胞生产的人用药物重组hFSH(Human follicle-stimulating hormone，简称hFSH)上市，但仍然存在如下问题：首先，现有方法生产的重组hFSH表达量太低，制备过程复杂，生产成本太高；其次，其半衰期短，需要频繁注射给药。因此，利用分子生物学和细胞培养方法，开发具有生物活性和更长半衰期的hFSH药物是本领域的一个挑战。

发明内容

本发明旨在提供长效重组人促卵泡激素融合蛋白(Human follicle-stimulating hormone-Fcfusion protein，简称hFSH-Fc)、其制备方法及应用，该重组hFSH-Fc融合蛋白应用于动物繁殖领域，与现有生化提取产品活性类似，且具有纯度高、半衰期显著延长等特点。

本发明的一个目的是提供重组hFSH-Fc融合蛋白，该融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、肽接头(Linker，简称L)和人IgG Fc变体(vIgG4Fc、vIgGlFc)，如SEQ ID NO：2和4所示(hFSHβ-CTP-hFSHα-L-vIgG4Fc、hFSHβ-CTP-hFSHα-L-vIgGl Fc氨基酸序列)，上述融合蛋白统称为hFSH-Fc。

所述的hFSHβ亚基的氨基酸序列去除了常规hFSHβ亚基中的1-18位氨基酸残基，如SEQ ID NO：7所示。

所述的CTP(carboxy-terminal peptide，羧基端肽)的氨基酸序列来自HCGβ链羧基末端的28-34个氨基酸残基，优选CTP为来自HCGβ链羧基末端的33个氨基酸残基序列，如SEQ ID NO：6所示。

所述的hFSHα亚基的氨基酸残基序列去除了常规hFSHα亚基中的1-24位氨基酸残基，如SEQ ID NO：5所示。

所述的肽接头含有2-20个氨基酸残基，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸残基，优选的肽接头氨基酸序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。

所述的人IgG Fc变体包括：(1)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域；(2)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域。

以下具体介绍本发明的人IgG Fc变体、肽接头和CTP功能：

IgG Fc变体

IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质，它们的半衰期可高达21天，而Fc片段是IgG保持体内较长半衰期的主要原因，同时具有稳定蛋白的作用。

Fc来自免疫球蛋白的Fc区域，Fc在消灭病原体的免疫防御中具有重要作用。IgG的效应子功能由Fc介导，通过两种主要机制：(1)与细胞表面Fc受体(FcγRs)的结合，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)途径消化病原体，或(2)与第一补体成分C1的Clq部分的结合，引发依赖于补体的细胞毒性(CDC)途径，从而裂解病原体。

在四种人IgG同种型((IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)中，IgG1能有效的结合FcγRs，IgG4与FcγRs的结合亲和力比IgG1低一个数量级。人IgG1还能有效地结合C1q，并激活补体级联反应，而IgG4表现极端缺乏激活补体级联的能力。对于医疗用途而言，重组二聚化蛋白的Fc区域必须不会介导效应子功能而裂解或除去这些细胞。因此，hFSH-Fc的Fc区域必须是非裂解性的，即在结合FcγRs和C1q而触发效应子功能方面，Fc最好是无活性的。显然，没有一种天然的IgG同种型适合产生hFSH-L-Fc重组二聚化蛋白。为了得到非裂解性的Fc，必须使天然Fc区域中的一些氨基酸突变，以减少其效应子功能。

通过分析不同种属的IgG同种型的氨基酸序列，发现CH2区域氨基末端附近的Fc部分显示在IgG Fc与FcγRs的结合中起作用，而与Clq结合至关重要的部分位于人IgG的CH2区域羧基端附近。为了减少Fc与FcγRs和C1q的结合而引发的效应子功能，本发明使用下列人IgG Fc变体：

(1)IgG4Fc变体(vlgG4Fc)：含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域；

(2)IgG1Fc变体(vlgGlFc)：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域。

上述Fc变体比天然IgG4Fc和IgG1Fc表现出低得多的效应子功能，更适于制备重组hFSH-F_c融合蛋白。

肽接头

连接肽的长度对重组二聚化蛋白的活性非常重要。本发明人经过长期而深入的研究，首次设计了一种独特的绞链区肽接头来降低空间位阻效应，可以制得hFSHα链的C端与Fc变体偶联的重组二聚化蛋白，中间有柔软的肽接头。此重组二聚化蛋白不仅不会导致hFSH的功能丧失，反而能够维持、甚至提高hFSH-Fc重组二聚化蛋白的生物活性。优选肽接头的氨基酸残基序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。

此外，本发明还发现，在hFSHα和人IgG Fc变体间添加的肽接头以两种方式提高hFSH-Fc的体外生物活性：(1)使Fc区域远离hFSH上的结构域，和(2)使一个hFSH远离另一个hFSH的结构域，从而降低空间位阻效应。且人的IgG Fc变体在CH2区域在228、234、235、331位点含有氨基酸突变，从而降低Fc的效应子功能。

CTP

糖基化对于蛋白的活性和半衰期有重要作用，蛋白上的糖基化位点有两类，包括O-糖肽链和N-糖肽链。CTP是一段来自HCGβ键羧基末端的28-34个氨基酸残基，有文献报道HCG较hFSH相对长的半衰期，主要来源于此CTP肽段。它含有4个O-连接的糖基化位点，可以增加蛋白的糖基化水平，提高蛋白的活性和延长蛋白在体内的半衰期。

本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白具有以下特征：该重组融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、肽接头和人IgG Fc变体。人IgG Fc变体具有延长体内半衰期和稳定蛋白的作用，Fc变体是非裂解性的，可减少与FcγRs和Clq结合而触发的效应子功能。CTP可提高蛋白活性及延长体内半衰期，其无免疫原性，通过CTP连接hFSH的α链和β链，不仅无副作用，且可以使两条链之间有一定的位阻，有利于其正确折叠而不影响功能。通过柔软的肽接头进行hFSHα链的C端与Fc变体的偶联，能够维持、甚至提高重组hFSH-Fc融合蛋白的生物活性。

本发明首次将CTP、肽接头和人IgG Fc变体(vIgG4Fc或vIgGlFc)有序地连接到FSH中而形成新型的重组hFSH-Fc融合蛋白，并首次应用于动物繁殖领域。该融合蛋白中人IgGF_c变体、CTP和肽接头的位置排列能维持FSH正确的空间构型，而不影响其生物活性，并可显著延长半衰期，与现有动物繁殖用药方案比较，可大大减少注射次数。

本发明另一个目的是提供重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，该制备方法包括：

(1)构建编码重组hFSH-Fc融合蛋白的基因表达载体；

(2)重组hFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达；

(3)高密度细胞培养重组hFSH-Fc融合蛋白；

(4)重组hFSH-Fc融合蛋白的纯化制备。

具体来说，构建编码重组hFSH-Fc蛋白的基因表达载体步骤为：采用人工合成方法获得编码重组hFSH-Fc融合蛋白基因进行了密码子优化的核苷酸序列(如SEQ ID NO：1、3所示)，插入到哺乳动物细胞表达载体，获得含有hFSH-Fc目的基因表达质粒pCDNA3-hFSH-Fc(图5)。基因的核苷酸序列优化是基于哺乳动物宿主细胞偏爱的密码子来选择设计。

所述的哺乳动物细胞表达载体可采用市售的但不限于，如：pCDNA3、pCMV／ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体，优选，pCDNA3。

重组hFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达步骤为：将含有hFSH-Fc蛋白的表达质粒转染到合适的哺乳动物宿主细胞，筛选获得稳定高表达目的蛋白的细胞株。

所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO、HEK293、COS、BHK、NS0和Sp2／0细胞。优选，CHO细胞；更优选，已驯化适应无血清培养基中悬浮生长的DHFR(Dihydrofolate Reductase，二氢叶酸还原酶)缺陷型CHO细胞(简称CHO-DHFR-)。

所述的转染方法包括磷酸钙法，电穿孔转染法，脂质体转染，优选的转染方法是电穿孔转染法。

所述的筛选方法是先利用筛选标记进行筛选，然后用扩增选择性标记可提高表达量并获得稳定高表达细胞株。筛选标记是本领域内已知的任何一个合适的选择性抗性标记，如ZEO(Zeocin，博来霉素)、G418(氨基糖苷类抗生素)、PUR(puromycin，嘌呤霉素)、HYP(Hygromycin，潮霉素)，优选的抗性基因为ZEO；筛选标记也可为本领域内已知的任何一个荧光标记基因，包括GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)、RFP(Red FluorescentProtein，红色荧光蛋白)，优选的荧光标记基因为GFP。扩增选择性标记是本领域内已知的DHFR序列或GS(Glutaminesynthetase，谷氨酰胺合成酶)序列，优选的扩增选择性基因是DHFR。由于CHO-DHFR-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶(DHFR)，无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤(hypoxanthine)、胸腺嘧啶(Thymidine)和甘氨酸的培养液中才能得以存活。而通过目的基因与DHFR基因共转染，不仅得到在不合上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，更为重要的是由于DHFR可被叶酸类似物MTX(Methotrexate，氨甲喋呤)所抑制，在MTX浓度选择压力下，DHFR基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存，从而得到抗MTX细胞系；又由于与DHFR基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的序列片段也随着DHFR基因的扩增而扩增，可得到大量表达外源蛋白的细胞克隆。

高密度细胞培养重组hFSH-Fc融合蛋白的步骤为：将上述筛选到的稳定细胞株转入摇瓶或生物反应罐进行大规模培养，特别是，本发明通过对细胞培养条件的优化，获得高表达重组hFSH-Fc融合蛋白的细胞培养液。本发明的细胞培养方法可实现高密度细胞培养、重组蛋白质量和产量提升、重组蛋白的糖基化程度增加以及唾液酸含量提高。

所述的细胞培养条件的优化包括降温培养法，具体来说，当细胞密度达到1×10⁷个／mL时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加。该方法可以提高表达蛋白的活力水平及重组蛋白的累积产量。

所述的细胞培养条件的优化方法还包括在培养基中加入特殊的添加剂，优选，在基础培养基加入100μM Cu2+，feeding培养基加入2mM ManNAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。该方法可使重组hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高约20％。

重组hFSH-Fc融合蛋白的纯化制备步骤为：

1)Protein A亲和层析：离心，收集上清，根据本发明蛋白偶联Fc片段的特性，利用亲和ProteinA柱层析。

2)疏水层析柱纯化：采用疏水层析柱，根据重组hFSH-Fc融合蛋白的疏水性不同，进一步去除上述ProteinA纯化后目标蛋白中的杂质。

所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow，Octyl Sepharose4Fast Flow，PhenylSepharose6Fast Flow，Butyl-S Sepharose6Fast Flow，Butyl Sepharose4B，Octyl SepharoseCL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。优选，Phenyl Sepharose6Fast Flow。

本发明所公开的重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，该制备方法可获得表达产量高重组hFSH-Fc融合蛋白。因与IgG Fc变体的偶联，所形成的重组蛋白可以通过ProteinA亲和层析得到高效便捷的纯化。经疏水层析进一步纯化后得到的融合蛋白纯度达到98％以上。此外，本发明所公布的重组hFSH-Fc融合蛋白中α链和β链可正确折叠在一起，避免了α-α二聚体、β-β二聚体的出现，大大简化了纯化步骤，降低了生产成本。

本发明的还一个目的是提供了含有重组长效hFSH-Fc融合蛋白的药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的本发明所述的重组长效hFSH-Fc融合蛋白。

具体来说，所述的药物组合物含有有效量(如0.000001-90wt％；较佳的0.1-50wt％；更佳的，5-40wt％)的本发明的重组长效hFSH-Fc融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将有效量的本发明融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于)：蔗糖、甘露醇、吐温20(Tween20)、蛋氨酸、盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、及其组合物。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；动物所要治疗疾病的严重程度、动物的体重、动物的免疫状况、给药途径等。

本发明的再一个目的是重组hFSH-Fc融合蛋白在动物繁殖领域中的应用。

本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白体内半衰期显著延长，从而改善了药物动力学和药效，与现有FSH比较，可减少注射次数，减轻经济负担。

本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白及其制备方法的优点概括如下：。

1.本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白是由IgG Fc变体(vIgG4Fc或vIgGlFc)和CTP与hFSH有序偶联形成的新型融合蛋白，维持了FSH的正确空间构型，可显著延长蛋白的体内半衰期，大大提高hFSH在CHO细胞中的表达量，且其体外和体内活性与现有猪垂体FSH类似。

2.二聚化单链hFSH-Fc融合蛋白的α链与β链以共价键正确折叠，避免形成α-α二聚体和β-β二聚体，大大简化了纯化工艺，降低生产成本。

3.本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白体内半衰期显著延长，其半衰期是现有猪垂体FSH的10倍，可减少注射次数，且其疗效更优。

附图说明

图1.显示了人IgG1、IgG4和它们变体的绞链区和CH2区域的氨基酸序列的比对。比较这三部分氨基酸序列：氨基酸区域228、234-237和330-331。这些变体的氨基酸突变以粗斜体显示。氨基酸残基编号是根据EU编号体系标定。

图2.显示了hFSH-Fc单链及二聚化结构示意图。a)单链hFSH-Fc；b)二聚化的hFSH-Fc。

图3.显示了在pCDNA3表达载体内HindIII-EcoRI片段的hFSH-Fc(hFSHβ-CTP-hFSHc-L-vIgG4Fc)的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。hFSH-Fc的核苷酸序列包括编码含前导肽(1-18)、hFSHβ链、CTP、成熟hFSHα链、肽接头、IgG4Fc变体(vIgG4Fc)。成熟的重组hFSH-Fc融合蛋白含有成熟hFSHβ链(19-129)、CTP(130-162)、成熟α链(163-254)、肽接头(255-270)和IgG4Fc变体(vIgG4Fc)(271-499)。

图4.显示了在pCDNA3表达载体内HindIII-EcoRI片段的hFSH-Fc(hFSHβ-CTP-hFSHα-L-vIgGlFc)的核苷酸序列及推导的氨基酸序列。hFSH-Fc的核苷酸序列包括编码含前导肽(1-18)、hFSHβ链、CTP、成熟hFSHα链、肽接头、IgG1Fc变体(vIgG1Fc)。成熟的重组hFSH-Fc融合蛋白含有成熟hFSHβ链(19-129)、CTP(130-162)、成熟α链(163-254)、肽接头(255-270)和IgG1Fc变体(vIgG1Fc)(271-497)。

图5.显示了所构建编码hFSH-Fc融合蛋白的真核表达质粒图谱。该表达质粒全长9063bp，含有10个主要基因片断，包括1.CMV启动子；2.目标基因hFSH-Fc；3.IRES；4.Zeocin抗性筛选基因；5.BGH终止子；6.SV40启动子；7.DHFR扩增基因；8.SV40终止子；9.氨苄青霉素抗性基因(Ampicillin)；10.ColEl复制起点(Ori)。

图6.显示了在7L生物反应器中重组hFSH-Fc细胞株表达分泌hFSH-Fc蛋白的累积趋势曲线图。

图7.Western bloting结果显示了重组hFSH-Fc融合蛋白在CHO细胞中的成功表达。非还原胶，Lane1：尿来源的hFSH(约43kDa)；Lane2：本发明的重组hFSH-vIgG1Fc融合蛋白(约140kDa)；Lane3：本发明的重组hFSH-vIgG4Fc融合蛋白(约140kDa)。

图8.显示了单链和二聚化hFSH-Fc在还原条件和非还原条件下的10％SDS-PAGE电泳图谱。Lane1：非还原胶，重组二聚化hFSH-vIgGlFc融合蛋白(约140kDa)；Lane2：非还原胶，重组二聚化hFSH-vIgG4Fc融合蛋白(约140kDa)；Lane3：还原胶，重组单链hFSH-vIgG1Fc融合蛋白(约70kDa)；Lane4：还原胶，重组单链hFSH-vIgG4Fc融合蛋白(约70kDa)。

图9.显示了纯化的重组hFSH-Fc融合蛋白与猪垂体FSH在大鼠体内的代谢曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.构建编码重组hFSH-Fc融合蛋白的基因表达载体

基因序列设计是基于CHO细胞偏爱密码子进行优化，采用人工合成的方法合成经过优化的含有编码hFSH蛋白β链的信号肽及其成熟肽段、CTP和hFSHα链成熟肽段的融合基因，将所合成的756bp DNA片段插入转移载体如pUC57中的EcoRV限制性酶切位点间，获得了hFSH质粒(phFSH)，使用DNA测序方法验证插入序列的正确性。

分别人工合成含有BamHI(5’端)和EcoRI(3’端)酶切位点的编码柔性肽接头(Linker，检测“L”)和Fc变体(vIgG4Fc和vIgG1Fc)片段的融合基因L-vIgG4Fc和L-vIgG1Fc。将获得的融合基因片段分别插入到转移载体如PUC19的BamHI和EcoRI位点间，得到含三种变体的质粒，分别为pL-vIgG4Fc和pL-vIgG1Fc。通过DNA测序验证L-vIgG4Fc和L-vIgG1Fc的基因序列。为制备两种hFSH-L-Fc融合基因，用限制性内切酶SpeI和BamHI双酶切phFSH质粒，凝胶电泳后胶回收编码hFSH蛋白β链的信号肽及其成熟肽段、CTP和hFSHα链成熟肽段的融合基因片段，经纯化的上述基因片段分别插入到pL-vIgG4Fc和pL-vIgG1Fc质粒中肽接头的5′-端，T4连接酶连接构成phFSH-L-vIgG2Fc、phFSH-L-vIgG4Fc和phFSH-L-vIgG1Fc质粒。所构建的融合基因由hFSHβ、CTP、hFSHα、肽接头和Fc变体基因组成，其单链结构如图2a所示，二聚化结构如图2b所示。

限制性内切酶SpeI／EcoRI分别双酶切phFSH-L-vIgG4Fc和phFSH-L-vIgG1Fc质粒，DNA凝胶纯化得到hFSH-L-vIgG4Fc和hFSH-L-vIgG1Fc片段。将纯化好的两种hFSH-L-Fc片段插入到哺乳动物细胞表达质粒如pCDNA3(Invitrogen)的相应酶切位点间，最终获得含融合基因表达质粒pCDNA3-hFSH-L-vIgG1Fc和pCDNA3-hFSH-L-vIgG4Fc，简称为pCDNA3-hFSH-Fc质粒，如图5所示。该质粒含哺乳动物细胞高效表达外源基因蛋白所需的启动子CMv；该质粒还含有两种选择性标记基因，从而在细菌中可以具有氨苄青霉素抗性，在哺乳动物细胞中可以具有博来霉素(zeocin)抗性。此外，当宿主细胞是DHFR基因表达缺陷型时，PCDNA3表达载体所含有的小鼠的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，使其在氨甲蝶呤(MTX)存在时，能共扩增pFSH-Fc融合基因和DHFR基因。

用CTP肽段连接hFSH的α链和β链，可便于两条链正确折叠。通过肽接头(较佳地为柔性接头)进行hFSH和Fc片段的偶联可提高蛋白的生物活性，对本发明而言，优选的是长度为约20个或更少(但不能少于2个)氨基酸的肽接头，当然由1个氨基酸构成的肽接头也在本发明的保护范围内，宜使用含有或由2个或更多选自以下氨基酸构成的肽接头：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。本发明实施例的肽接头含有Gly-Ser肽构件，其氨基酸序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。

实施例2.重组hFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物细胞中的稳定表达

将实施例1构建的表达质粒pCDNA3-hFSH-L-Fc转染入DHFR酶缺陷型CHO宿主细胞(CHO-DHFR^-)，图2b显示了重组二聚化hFSH-Fc融合蛋白的示意图。采用电穿孔方法进行转染，使用960μFd电容的Gene Pulser Ehectroporator(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，将其电场设置为250V，在比色杯内的2～5×10⁷个细胞中加入10μg用PvuI线性化的质粒DNA。在转染两天后，将培养基改成含100μg／mL Zeocin抗性标记基因的生长培养基，获得经抗性初筛的转染子。采用western blotting的方法，用抗hFSH抗体检测hFSH-Fc的表达，如图7。利用DHFR扩增选择性标记基因提高重组二聚化蛋白的表达水平，为此在含有递增浓度MTX的生长培养基中，用DHFR基因共扩增转染的重组二聚化蛋白基因。用极限稀释法亚克隆能在高达10μM／mLMTX培养基中生长的转染子。对亚克隆细胞系的分泌率作进一步分析。筛选分泌水平超过约10(较佳地约20)μg／10⁶(即百万)个细胞／24小时的细胞株，获得稳定高表达重组hFSH-Fc融合蛋白的细胞株。

实施例3.重组hFSH-Fc融合蛋白的生产和纯化

将实施例2得到的高产量细胞株，首先在培养皿中进行无血清驯化培养，然后转移到摇瓶中进行悬浮驯化培养，驯化过程中同时进行培养基的筛选，加入不同的成分观察细胞的生长状态、生长趋势，以及表达产物的活性和唾液酸等生化指标，优选的细胞培养条件为：基础培养基加入100μM Cu2+，feeding培养基加入2mM ManNAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)，该方法可使重组hFSH-Fc融合蛋白的糖基化程度增加，唾液酸含量提高约20％。驯化成功后，进行细胞扩增，扩增到足够量，进行7L生物反应器监测培养，在细胞密度超过1×10⁷个／mL时开始降温至33℃培养，批次生长周期为20天。用1ml ProteinA柱层析对重组蛋白进行初步纯化，测定重组hFSH-Fc融合蛋白的表达量，结果显示，重组hFSH-L-vIgG4Fc和重组hFSH-L-vIgG1Fc细胞株表达的累积产量分别为0.82g/L、0.73g／L(图6)。

重组hFSH融合蛋白的纯化包括以下步骤：

1)ProteinA亲和层析：离心，收集上清，根据本发明蛋白偶联Fc片段的特性，利用亲和层析方法，将上清液加样到磷酸盐缓冲液盐水(PBS)平衡的ProteinA柱；待重组融合蛋白结合于ProteinA后，用PBS洗涤该柱，直至OD280值低于0.01，再用20mM pH为4.0的醋酸钠缓冲液洗脱结合的重组FSH-Fc融合蛋白，最后用pH10.0的1M Tris-HCl缓冲液中和活性收集液。纯化的hFSH-Fc蛋白纯度可达到95％以上。

2)疏水柱层析：用超滤方法将上述protein A活性收集液更换为20mMTris-HCl-1.5MNaCl(pH8.0)缓冲液，将该样品加样到用20mM Tris-HCl-1.5M NaCl(pH8.0)平衡过的phenyl-6Fast FloW柱，先用相同的平衡液淋洗，再用20mMTris-HCl-1.35M NaCl(pH8.0)淋洗，最后用20mM Tris-HCl-0.5M NaCl(pH8.0)缓冲液洗脱。

Western bloting结果显示了重组hFSH-Fc融合蛋白在CHO细胞中的成功表达，如图7所示，在非还原条件下SDS-PAGE胶电泳图谱，猪垂体FSH(商业产品)和本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白分别在43kDa和140kDa显示相对应的目标蛋白杂交条带，验证了本发明得到的重组hFSH融合蛋白中含有FSH蛋白。图8是纯化的hFSH-Fc融合蛋白在还原和非还原条件下的SDS-PAGE胶电泳图谱。结果显示，纯化的hFSH-Fc蛋白纯度可达到98％以上，hFSH-Fc在还原条件下的分子量为非还原条件下分子量的50％。

实施例4.重组hFSH-Fc融合蛋白的体内外活性测定

本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白(重组hFSH-vIgG1Fc和重组hFSH-vIgG4Fc)的体外活性(免疫原活性)采用BIOCHECK(美国)公司生产的FSH酶免疫定量检测试剂盒检测，方法参考试剂盒说明书。体内活性采用2010版《英国药典)》中的卵巢增重法进行检测。蛋白质含量测定使用LOWRY定量法。取HCG制剂，加0.1％自蛋白磷酸盐缓冲液(pH7.2±0.2)溶液，制成含有70IU／ml HCG的供试品稀释液。根据标准品标示量、猪垂体FSH和重组hFSH-Fc融合蛋白估计效价，用供试品稀释液(pH7.2±0.2)将标准品、猪垂体FSH和重组hFSH-Fc融合蛋白配制成含FSH3.33IU／ml、1.67IU／ml、0.83IU／ml高中低三个剂量的工作液。选用19～28日龄，年龄相差不得超过3日，体重相差不得超过10克的Wistar雌鼠。标准品、猪垂体FSH组和hFSH-Fc组均分为高中低三个剂量，每组6只动物。大鼠颈后皮下注射，每天注射两次，每次注射体积为0.2ml，连续注射三天，每天在相同时间给药。最后一次注射给药24小时后，按照给药顺序采用脱臼法处死动物，取卵巢，剥离吸干表面水分后称重，记录器官重量。根据标准品卵巢增重采用量反应平行线法计算猪垂体FSH和hFSH-Fc的活性。测得重组hFSH-L-vIgG4Fc、重组hFSH-L-vIgG1Fc和猪垂体FSH的体外活性分别为10005、10020和8321IU／ml，其体内活性分别为10120、10012和7523IU／ml。结果表明，本发明的重组hFSH-Fc融合蛋白具有体内外生物学活性。

实施例5.重组hFSH-Fc融合蛋白的药代动力学测定

分为重组hFSH-vIgG4Fc、重组hFSH-vIgG1Fc、猪垂体FSH给药组，每组选用体重200-250g的雄性wistar大鼠5只，分别按15IU／kg给予肌肉注射。猪垂体FSH组在给药后1、2、3、4、6、8、12、36、60h取血，重组hFSH-Fc融合蛋白分别在给药后1、2、4、8、12、24、56、120、176、200、264、340h取血，3000rpm离心5min后，吸取血清，-20℃保存。采用ELISA试剂盒(BIOCHECK，美国)测定各时间点血浆中FSH免疫活性。使用kinetica4.4软件，通过统计矩法计算各组主要药代动力学参数。各组药代动力学曲线如图9所示，半衰期结果如表1。结果显示，猪垂体FSH在大鼠体内的消除半衰期约为3.05h，而等剂量本发明重组hFSH-Fc融合蛋白的消除半衰期大大延长，重组hFSH-vIgG4Fc、重组hFSH-vIgG1Fc融合蛋白的消除半衰期分别为40.64h和38.34h，是猪垂体FSH的10倍以上。

表1重组hFSH-Fc融合蛋白和猪垂体FSH的半衰期

实施例6.重组hFSH-Fc融合蛋白促进青年小母猪提前发情的作用

选取初情期前后备小母猪(6月龄，90-100kg)，随机分为四组：重组hFSH-vIgG1Fc融合蛋白给药组(200IU／头)、重组hFSH-vIgG4Fc融合蛋白给药组(200IU／头)、猪垂体FSH对照组(200IU／头)、阴性对照组(生理盐水)，上述给药组均配合使用400IU／头HCG。分别按组进行肌肉注射，观察记录母猪发情状况，统计发情率和同期发情情况。结果见表2，数据表明，重组hFSH-Fc融合蛋白组和猪垂体FSH都能够明显促进青年小母猪的提前发情，但重组hFSH-Fc融合蛋白组3-4d内的同期发情率达到80％以上，相对阴性对照组都有显著性差异(P＜0.01)，相对猪垂体FSH对照组明显更高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表2重组hFSH-Fc融合蛋白对青年小母猪提前发情的作用

注：X²检验，与阴性对照组组比较，^**p＜0.01，^*p＜0.05，与猪垂体FSH对照组比较，^Δp＜0.05。

实施例7.重组hFSH-Fc融合蛋白对乏情后备母猪的治疗作用

选取超过10月龄，体重在140kg以上的乏情后备母猪，注射氯前列烯醇注射液1ml以排除因产生永久黄体而导致的不发情病例之后，随机分为四组：重组hFSH-vIgGlFc融合蛋白给药组(200IU／头)、重组hFSH-vIgG4Fc融合蛋白给药组(200IU／头)、猪垂体FSH对照组(200IU／头)、阴性对照组(生理盐水)，上述给药组均配合使用400IU／头HCG。分别按组进行肌肉注射，观察记录母猪的发情和受孕情况。结果见表3，数据表明，重组hFSH-Fc融合蛋白组能明显提高乏情后备母猪的发情率，且相对阴性对照组有显著性差异(P＜0.01)，重组hFSH-Fc融合蛋白组与猪垂体FSH对照组相比也明显更高(P＜0.05)。此外，重组hFSH-Fc融合蛋白组的情期受胎率也明显高于阴性对照组和猪垂体FSH对照组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3重组hFSH-Fc融合蛋白对乏情后备母猪的治疗作用

注：X²检验，与阴性对照组组比较，^**p＜0.01，^*p＜0.05；与猪垂体FSH组比较，^Δp＜0.05。

实施例8.重组hFSH-Fc融合蛋白对经产母猪超期不发情的治疗作用

选取断奶2周后没有发情的经产母猪，注射氯前列烯醇注射液1ml以排除因产生永久黄体而导致的不发情病例之后，随机分为四组：重组hFSH-vIgGlFc融合蛋白给药组(200IU／头)、重组hFSH-vIgG4Fc融合蛋白给药组(200IU／头)、猪垂体FSH对照组(200IU／头)、阴性对照组(生理盐水)，上述给药组均配合使用400IU／头HCG。分别按组进行肌肉注射，观察记录母猪的发情和受孕情况。结果见表4，数据表明，重组hFSH-Fc融合蛋白和猪垂体FSH都能提高断奶2周后不发情经产母猪的发情率，但相对于阴性对照组和猪垂体FSH组，重组hFSH-Fc融合蛋白组疗效更优，与阴性对照组相比具有显著性差异(P＜0.01)。而重组hFSH-Fc融合蛋白组的情期受胎率也高于猪垂体对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(p＜0.05)。

表4重组hFSH-Fc融合蛋白对经产母猪猪超期不发情的治疗作用

注：X²检验，与阴性对照组组此较，^**p＜0.01，^*p＜0.05；与猪垂体FSH组此较，^Δp＜0.05。

实施例9.重组hFSH-Fc融合蛋白对繁殖季节关中奶山羊的同期发情作用

在关中奶山羊繁殖季节(9-11月)，选取年龄为1～3岁，体重50～75kg、中等膘情以上、无繁殖疾病的健康母羊进行试验。试验分为重组hFSH-vIgG1Fc给药组、重组hFSH-vIgG4Fc给药组、垂体FSH对照组、空白阴性对照组。各组使用孕酮阴道海绵栓(CIDR)处理12天，重组hFSH-vIgG1Fc组、重组hFSH-vIgG4Fc组在解栓前24h肌肉注射40单位相应药物，垂体FSH对照组分别在在解栓前24h、12h肌肉注射25单位垂体FSH，空白对照组解栓前24h、12h肌肉注射相同体积生理盐水。所有组别在解栓时注射0.1mg氯前列烯醇。从撤栓后12h开始，每隔12h用公羊试情，母羊接近公羊、摇尾、接受公羊爬跨或母羊互相爬跨者判定为发情，96h内发情者为同期发情处理有效，计算发情率。发情结束后5d用腹腔镜观察发情羊卵巢上排卵及黄体发育情况，记录卵巢上卵泡正常发育、排卵并形成正常功能黄体的只数，计算排卵并形成功能黄体率。

结果(表5)表明，与阴性对照组比较，重组hFSH-vIgG1Fc、重组hFSH-vIgG4Fc和垂体FSH都能明显提高发情率(P＜0.01)，说明上述三种药物都有明显促进羊发情的效果，但是本发明两种重组hFSH-Fc融合蛋白仅给药一次，本发明重组融合蛋白的剂量和给药次数相对垂体FSH更少。

表5重组hFSH-Fc融合蛋白对繁殖季节关中奶山羊的解栓后96h内同期发情结果

X²检验：与空白阴性对照组相比，*P＜0.01。

Claims (10)

1.重组hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白为二聚化融合蛋白，其氨基酸序列从N端到C端依次包含hFSHβ亚基、CTP、hFSHα亚基、肽接头和人IgG Fc变体。 

2.根据权利要求1所述的重组hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的hFSHβ亚基的氨基酸序列是去除了常规hFSHβ亚基中的1.18位氨基酸残基之后的hFSHβSEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；其中所述的CTP的氨基酸序列是来自HCGβ链羧基末端的33个氨基酸残基序列，如SEQ ID NO：6所示；其中所述的hFSHα亚基的氨基酸残基序列是去除了常规hFSHα亚基中的1-24位氨基酸残基之后的hFSHαSEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；其中所述的肽接头含有2-20个氨基酸，所述肽接头存在于hFSHα亚基和人IgG Fc变体之间，且肽接头含有两个或更多选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸，优选序列为GlySerGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer。 

3.根据权利要求1的重组hFSH-Fc融合蛋白，其中所述的人IgG Fc变体选自下组： 

(i)含有Ser228Pro和Leu235Ala突变的人IgG4绞链区、CH2和CH3区域； 

(ii)含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突变的人IgG1绞链区、CH2和CH3区域。 

4.根据权利要求1所述的重组hFSH-Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2和4所示。 

5.编码根据权利要求1的重组hFSH-Fc融合蛋白的核苷酸序列，特征在于其序列如SEQID NO：1和3所示。 

6.一种权利要求1的重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，其步骤包括： 

1)构建编码重组hFSH-Fc融合蛋白的基因表达载体： 

采用人工合成方法获得编码hFSH-Fc融合蛋白的基因，插入到哺乳动物细胞表达载体，获得含有hFSH-Fc融合蛋白基因的表达质粒； 

2)重组hFSH-Fc融合蛋白在哺乳动物宿主细胞中的稳定表达： 

将含有hFSH-Fc融合蛋白的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞，筛选稳定表达hFSH-Fc融合蛋白的细胞株； 

3)高密度细胞培养重组hFSH-Fc融合蛋白： 

将上述筛选到的稳定细胞株转入摇瓶或细胞反应罐进行大规模培养，当细胞密度达到1×10⁷个／mL时，将温度由37℃降至33℃，在该温度下培养直至表达产量不再增加； 

4)重组hFSH-Fc融合蛋白的纯化制备： 

a)Protein A亲和层析：离心，收集上清，根据本发明蛋白偶联F_c片段的特性，利用亲和ProteinA柱层析； 

b)疏水层析柱纯化：经疏水层析纯化进一步去除上述Protein A纯化后目标蛋白中的杂质； 

所述的疏水柱包括Butyl Sepharose4Fast Flow，Octyl Sepharose4Fast Flow，Phenyl Sepharose6Fast Flow，Butyl-S Sepharose6Fast Flow，Butyl Sepharose4B，Octyl Sepharose CL-4B，Phenyl Sepharose CL-4B。优选，Phenyl Sepharose6Fast Flow。 

7.根据权利要求6所述的重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，其中步骤1)中所述的基因表达载体为pCDNA3、pCMV／ZEO、pIRES、pDR、pBK、pSPORT或pCMV-DHFR，优选，pCDNA3；其中步骤2)中所述的细胞转染方法包括电穿孔转染方法、磷酸钙转染、脂质体转染和原生质融合，优选，电穿孔转染方法；所述的哺乳动物宿主细胞包括CHO，HEK293、BHK、NS0和Sp2／0细胞，优选，CHO细胞，更优选，DHFR酶缺陷型CHO-悬浮细胞(DHFR-CHO)。 

8.根据权利要求6所述的重组hFSH-Fc融合蛋白的制备方法，其中步骤3)中还包括在培养基中加入添加剂，优选，在基础培养基加入100μM Cu2+，feeding培养基加入2mM ManNAc(N-乙酰基-D-氨基甘露糖)。 

9.药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1-8任意一项权利要求所述的重组hFSH-Fc融合蛋白。 

10.权利要求1的重组hFSH-Fc融合蛋白在制备动物繁殖领域药物中的应用。 

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