CN107108731A

CN107108731A - 增强促性腺素的生物活性的配体

Info

Publication number: CN107108731A
Application number: CN201580061162.9A
Authority: CN
Inventors: 埃洛迭·卡拉; 杰里米·德库尔蒂耶; 索菲·卡斯特雷; 马里-克里斯蒂内·莫雷尔
Original assignee: Repropharm SA
Current assignee: Eagle company can Oswald
Priority date: 2014-09-10
Filing date: 2015-09-10
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2035-09-10
Also published as: JP2017533257A; WO2016038309A1; JP6705608B2; US20170190774A1; JP2017537971A; EP3191515A1; CN107108731B; PL3191514T3; EP3191514B1; US10584166B2; ES2845674T3; SI3191514T1; AU2015314029C1; IL250978A0; DK3191515T3; BR112017004739A2; PT3191514T; US10703815B2; CN107108732B; FR3025517A1

Abstract

本发明涉及针对促卵泡激素(FSH)并能够增强促性腺素的生物活性的抗体。

Description

增强促性腺素的生物活性的配体

技术领域

本发明具有主要在人和兽医学中用于诱导雌性哺乳动物的排卵的应用。

在下面的描述中，在([])之间的参考是指在说明书末尾列出的参考列表。

背景技术

促性腺素(或促性腺激素)是通过作用于性腺(卵巢和睾丸)功能而在脊椎动物的生殖调节中起中心作用的复杂的糖蛋白激素。这些激素中的两种在所有脊椎动物中分泌：促黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)。在两组哺乳动物(马科和灵长类的成员)中，还存在由胎盘分泌的绒毛膜促性腺素(CG)：人绒毛膜促性腺素(hCG)和马绒毛膜促性腺素(eCG)，它们都通过LH受体起作用。

在由下丘脑产生的GnRH的刺激下，促黄体生成素(LH)由垂体前叶的促性腺细胞产生。LH刺激雄性中的睾酮产生，而LH参与雌性中的卵巢周期的修饰，其中它负责终末卵泡(终端卵泡)生长和排卵，然后负责将破裂的排卵卵泡转化为黄体。在月经周期的黄体期期间，LH刺激黄体的孕酮分泌，该孕酮对于胚胎的早期发育和着床是必需的。LH由一种或相同种(如FSH、CG和促甲状腺激素、TSH)的所有糖蛋白激素共有的α-亚基和负责激素活性的特异性的β-亚基组成；只有当两个亚基以二聚体的形式非共价地连接时才存在活性。

在来自由下丘脑产生的GnRH的刺激下，促卵泡激素(或FSH)由垂体前叶产生。在雄性中，促卵泡激素刺激对于精子发生至关重要的塞尔托利细胞(Sertoli cell)。在雌性中，促卵泡激素负责未成熟的原始卵泡的补充，用于它们的生长，并且用于通过刺激颗粒细胞的FSH受体而分化成排卵前卵泡。FSH由两个亚基(α和β)组成，并且具有与LH类似的结构。只有二聚体能够刺激FSH受体。

在雌性中，LH和FSH水平是周期性的：在休情期(sexual rest)或在排卵期之外非常低，在排卵前期具有分泌峰。

促性腺素用于兽医和人类医学中，以诱导雌性哺乳动物的排卵。虽然有效，但是这些治疗由于使用从生物流体(血液，尿)或从组织(垂体腺)提取的激素因而存在健康风险，特别是在兽医领域中。对于妊娠母马血提取的马绒毛膜促性腺素(eCG)，以及从猪垂体腺提取的猪LH和FSH而言，情况就是这样。在兽医领域中，还使用从怀孕妇女的尿中提取的hCG，(MSD实验室)。

在人类临床领域中，并且特别是辅助生殖技术(或者ART)领域中，使用了从绝经妇女的尿中提取的激素，如纯化的FSH的(Laboratoire Genévrier)以及是一种hMG(人绝经期促性腺素)的(Ferring制药实验室)，FSH和LH的混合物以及是纯化的hCG(Schering-Plough实验室)的绒毛膜促性腺素Endo5000。还使用重组人FSH，如(Merck Serono实验室)和(Merck Schering-Plough实验室)；以及重组hCG和LH，如和(Merck Serono实验室)。

此外，重复使用这些激素通常引起中和激素作用的免疫反应，因此导致治疗功效降低。然而，在一些情况下已证实，当共给予时，免疫反应可以产生能够增强激素活性的抗体(专利EP 1 518 863)[1]。自此，还证实了能够增强其作用的三种抗-LH单克隆抗体，以及它们中的两种增强FSH的作用(国际申请WO 2012/066519)[2]。

发明内容

本发明人现在已经获得了针对FSH的β-亚基产生的单克隆抗体，其能够增强FSH的作用以及LH和hCG的作用。

这些单克隆抗体被称为CF12。

根据布达佩斯条约，将产生CF12抗体的杂交瘤于2013年10月3日(10/03/2013)以编号CNCM I-4803于CNCM(国家微生物保藏中心，巴斯德研究院，法国巴黎15区鲁大夫25街75724)保存。

已经确定了CF12抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列，并且已经推断了相应的肽序列。它们示于以下表1中。

表1

由以上的CF12抗体的重链(VH-CDR)和轻链(VL-CDR)的可变区的序列已经确定了编码CDR(互补决定区)的序列。已经推导出相应的肽序列并且分别示于下表2中。

表2

本发明的主题是增强FSH、促黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性的促卵泡激素(FSH)配体，其特征在于，其包含抗-FSHβ-亚基抗体的互补位。

对于本发明的目的，术语“抗-FSHβ-亚基抗体”旨在表示通过基于FSH的初次注射，随后通过FSHβ-亚基注射的多次加强而由动物的免疫所获得的任何抗体。可以使用来自各种哺乳动物，例如绵羊、人、牛、山羊或猪、马、犬、鼠等的FSH，同源或异源来源的FSH，以及同源或异源来源的FSH的β-亚基来给予注射。因此，在使用人FSH和人FSHβ-亚基免疫后获得CF12单克隆抗体。

特别地，本发明的主题因此是根据本发明的配体，其特征在于：

重链可变区包含以下CDR：

-由序列GFTFSSSY(SEQ ID NO：5)限定的VH-CDR1；

-由序列IYAGTGGT(SEQ ID NO：6)限定的VH-CDR2；

-由序列ARHGSYFDY(SEQ ID NO：7)限定的VH-CDR3；以及

轻链可变区包含以下CDR：

-由序列QSVDYDGDSY(SEQ ID NO：8)限定的VL-CDR1；

-由序列AAS限定的VL-CDR2；

-由序列QQSNEDPYT(SEQ ID NO：9)限定的VL-CDR3。

为了本发明的目的，术语“CDR”旨在表示抗体的重链和轻链的可变区的三个高变区，其构成互补位的要素，并且使得可以用抗原的表位确定抗体的互补性。这三个高变区由组成“框架”区(FR)的四个恒定区构成，并且给予可变区一种稳定的构型。

根据本发明的配体是例如：

-由CNCM I-4803杂交瘤产生的CF12单克隆抗体；

-单独或作为混合物使用的以上抗体的VH或VL片段；

-以上抗体的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv或scFv片段或纳米抗体。优选地，其是Fab片段或scFv片段；

-分别为两个、三个或四个scFv片段的二价、三价或四价形式(双抗体，三抗体，四抗体)；

-包含以上抗体的互补位的重组抗体，并且已将其恒定区修饰以使针对其使用的动物或人的免疫原性最小化。例如，其是嵌合的(人源化的、绵羊源化的、山羊源化的、牛源化的、猪源化的等)或完全人源化的、绵羊源化的、山羊源化的、牛源化的、猪源化的抗体。

作为非限制性的实例，已经测定了源自CF12抗体的scFv的核苷酸序列，并推导出相应的肽序列，并且分别示于以下表3中。

表3

本发明的主题还是一种编码根据本发明的配体的核苷酸序列。

本发明的主题还是一种重组载体，特别是表达载体，其包含根据本发明的核苷酸序列。

本发明的主题还是一种包含根据本发明的核苷酸序列或根据本发明的重组载体的宿主细胞。例如，它是CNCM I-4803杂交瘤或者用根据本发明的核苷酸序列或重组载体转化的细胞。

本发明的主题还是一种用于产生根据本发明的配体的方法，其特征在于，该方法包括在合适的培养基中培养根据本发明的宿主细胞，并且从所述培养物中回收所述配体。

发明人已经证实了，与CF12抗体强烈增强的人FSH相反，尽管显著地，但是CF12抗体几乎不增强猪、绵羊和牛FSH。此外，本发明人已经证实，源自CF12抗体的scFv具有与其来源的抗体相同的结合和增强性质。

本发明的主题还是一种根据本发明的配体，其用作为药物，特别是用于增强FSH、LH和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性，用于诱导雌性哺乳动物的排卵以及用于降低雄性或雌性哺乳动物的激素依赖性的不育或低生育力问题。

本发明的主题还是一种由配体和由促性腺素或由其活性肽形成的复合物，该活性肽能够结合至所述配体并且由所述配体增强其活性。例如，其是配体与从生物组织或液体提取的或重组的LH、绒毛膜促性腺素(CG)激素或FSH，或其活性肽的复合物，该活性肽能够结合所述配体，并且其活性由所述配体增强。

本发明的主题还是一种根据本发明的配体或复合物，其用作药物，特别是用于增强FSH、LH和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性，用于诱导雌性哺乳动物的排卵或甚至多排卵或者用于降低雄性或雌性哺乳动物的激素依赖性的不育或低生育力问题。所述药物还使得可以增加雌性哺乳动物中的一种或多种黄体分泌的循环内源性孕酮的水平，从而促进早期胚胎发育以及降低堕胎的风险。

本发明的主题还是一种肉类生产的方法，其中，所述方法包括向非人动物的雌性哺乳动物给予本发明的配体和/或复合物。

本发明的主题还是一种本发明的配体和/或复合物，其用于治疗哺乳动物的激素依赖性的不育或低生育力。在患有不育或低生育力的雌性哺乳动物的情况下，给予本发明的配体或复合物将使得可能刺激自然的、医学辅助的或人为的生殖。应当注意的是，将本发明的配体或复合物给予至健康的雌性哺乳动物也将使得可能地在自然的或人为的生殖环境下引发排卵。

对于本发明的目的，术语“激素依赖性的不育/低生育力”旨在表示由于激素不足而引起的不育/低生育力，例如由于外因(例如，杀虫剂)或内因(例如，垂体或下丘脑机能不全，或者由于LH、FSH或CG受体或促性腺素异常引起的对LH和/或FSH的性腺接受性的问题，例如受体突变或多态性)引起的低循环浓度的FSH和LH，或这些的激素的缺乏。

本发明的配体和复合物可用于人或动物，特别是绵羊、牛、山羊、马、猪、鼠、犬、骆驼等科的成员。

根据本发明的配体、激素或复合物可以通过注射，例如肌内、静脉内、腹膜内、皮下、经皮、皮内、眶内、眼内或眼部注射，或经由经眼的途径，单独或顺序地或联合地给予，且不改变它们的增强作用。

本发明的主题还是一种包含本发明的配体或复合物和药学上可接受的载体的药物组合物。所述药物组合物还可以包含FSH和/或LH和/或绒毛膜促性腺素(CG)激素。

通过阅读由作为图解说明的方式给出的附图所示的以下实施例，本领域技术人员还可以想到其它的优点。

附图说明

-图1示出了在牛颗粒细胞上，CF12单克隆抗体对人FSH(hFSH)的生物活性的体外增强作用。

-图2表示在稳定转染有人FSH受体的HEK 293细胞系上，CF12单克隆抗体对人FSH(hFSH)的生物活性的体外增强作用。

-图3表示在稳定转染有人FSH受体和载体的HEK 293细胞系上，CF12单隆抗体对人FSH(hFSH)的生物活性的体外增强作用。

-图4表示在稳定转染有人FSH受体和载体的HEK 293细胞系上，CF12单克隆抗体和CF12 scFv对人FSH(hFSH)的生物活性的体外增强作用。

-图5表示在稳定转染有人FSH受体和载体的HEK 293细胞系上，CF12单克隆抗体对绵羊FSH(oFSH)的生物活性的体外增强作用。

-图6表示在稳定转染有人FSH受体和载体的HEK 293细胞系上，CF12单克隆抗体对猪FSH(pFSH)的生物活性的体外增强作用。

-图7表示在人颗粒细胞上，CF12单克隆抗体对人FSH(hFSH)(B)和(C)的生物活性的体外增强作用。

-图8表示在人颗粒细胞上，CF12单克隆抗体对人FSH(hFSH)的生物活性上的体外增强作用。

-图9表示在雌性大鼠中，CF12单克隆抗体对人FSH(hFSH) 和(A)和绵羊FSH(oFSH)(B)的生物活性的体内增强作用。

-图10表示在雌性大鼠中，CF12 scFv对人FSH(hFSH)(A和B)、和(A)的生物活性，以及在雌性大鼠中，CF12单克隆抗体对根据各种给予方法的人FSH(hFSH)Gonal-F(C)的生物活性的体内增强作用。

-图11表示在雄性大鼠中，CF12单克隆抗体对人绒毛膜促性腺素(hCG)和Endo的生物活性的体内增强作用。

-图12表示在性季节期间CF12单克隆抗体对在母牛中的内源性促性腺素的生物活性的体内增强作用。

-图13表示在25IU的hFSH后单独注射的CF12单克隆抗体对雌性猴的卵泡刺激的体内增强作用。

-图14表示在37.5IU的hFSH后单独注射的CF12单克隆抗体对雌性猴的卵泡刺激的体内增强作用。

-图15表示在37.5IU的hFSH后单独注射的CF12单克隆抗体对雌性猴中的雌二醇和孕酮分泌的体内增强作用。

-图16表示CF12配体对hFSH、hCG、hLH、oLH、pLH、oFSH和pFSH激素和人FSH受体的构象表位。

-图17表示CF12单克隆抗体的多种片段对hFSH的生物活性的体外增强作用。

-图18表示，在雌性大鼠中，CF12单克隆抗体的多种片段对hFSH的生物活性的体内增强作用。

具体实施方式

实施例

实施例1：获得本发明的配体及其特征

1/小鼠免疫策略

注射全部均在小鼠(Balb/C)腹膜内进行。使用五只小鼠。

CF12抗体的小鼠免疫策略

使用几次注射重组的人FSH(rhFSH)进行免疫。用50μg的具有完全弗氏(Freund's)佐剂的rhFSH进行第一次注射(D0)。然后根据以下顺序进行几次加强注射：

-D21和D35：加强注射50μg的具有不完全弗氏(Freund's)佐剂的rhFSH；

-D55、D56和D57：注射30μg的无佐剂的rhFSHβ-亚基；

-D58：融合。

2/分型

根据制造商的建议，使用由RD Biotech(参考RDB 3255)出售的FastElysa分型试剂盒进行CF12抗体的分型。

CF12抗体是IgM类和κ同种型的免疫球蛋白。所获得的光密度(OD)值分别为0.639和0.6。

3/测序

根据以下方案由其信使RNA(mRNA)确定由CNCM I-4803杂交瘤分泌的CF12抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变部分的核苷酸序列。

根据制造商的建议，使用RNA试剂盒(Macherey Nagel，德国)从细胞中提取RNA。通过测量在260nm处的吸光度(A)估计纯化的RNA浓度，并且通过A260nm/280nm比率评估它们的质量，以及在琼脂糖凝胶上电泳迁移后在视觉上进行评估。

然后根据制造商的建议，使用寡核苷酸-dT₁₈作为引物通过与M-MLV酶(Ref.M1701，Promega，USA)的逆转录反应合成mRNA的互补DNA。

根据以下方案通过聚合酶链反应(PCR)进行第二DNA链的合成：在50μl的终体积中，将以下加入至4μl的逆转录反应中；反应缓冲液(1×终浓度)、200μM的每种dNTP、300nM的正向引物和反向引物、1.25U的GoTaq聚合酶(Ref M3175，Promega，USA)。

对于轻链的可变部分的扩增，使用5种不同的引物对(MKRev2至8+MKC5For)以及2对引物对(VHRev1或VHRev2+MμCFor)用于重链。

表4：用于测序CF12抗体的重链(VH)和轻链(VL)的引物的核苷酸序列。

表5：用于测序CF12抗体的重链(VH)和轻链(VL)的5'部分的引物的核苷酸序列。

使用的PCR程序由在95℃下初始变性2min，然后在95℃下变性30秒，在47℃下杂交30秒，并且在72℃下扩增1min，30次循环，最后，在72℃下最终扩增5min。获得的PCR产物用凝胶提取试剂盒(Ref 28704，Qiagen GmbH，德国)脱盐，然后与pGEMT easy载体质粒(Ref A1360，Promega，USA)连接，以在细菌中转化。将从各种细菌克隆提取的质粒DNA送于测序分析(Macrogen Europe，荷兰)。

随后通过设计锚定在cDNA前导序列中的特异性引物(Fw引物)来测定CF12抗体的VH和VL的5'-末端核苷酸序列。在通过先前获得的VL和VH序列与IMGT/V-QUEST软件的数据库之间的比对，鉴定同源性(Brochet等人，Nucl.Acids Res.,36：W503-508,2008；Giudicelli等人，Cold Spring Harb Protoc.,2011(6)：695-715,2011)[3,4]以及在从IMGT/GENE-DB中提取研究的前导序列(Giudicelli等人，Nucl.Acids Res.,33：D256-261,2005)[5]之后，设计这些引物。在先前测定的每种抗体的各自VH和VL序列中设计反向(Rev)引物。用于获得5'部分的方案与前面段落中描述的相同。

使用MultAlin软件，从序列比对中推导出一致的核苷酸序列(Corpet,Nucl.AcidsRes.,16(22)：10881-10890,1988)[6]。使用IMGT/V-QUEST软件进行多肽序列的转录和CDR的注释。结果示于表6和7中。

表6：CF12抗体的重(VH)和轻(VL)可变部分的核苷酸和肽序列。

表7：CF12抗体的重(VH)和轻(VL)可变部分的CDR

4/scFv的构建、制备和表征

a/scFv抗体片段的构建

由ATG：Biosynthetics GmbH(德国)合成源自CF12抗体的单链可变片段(scFv)的合成基因。

由通过编码确保蛋白的功能的肽(Gly₄Ser)₃的序列连接的重链和轻链可变部分(SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：3)的融合设计每个序列，并且以编码将允许scFv纯化的His6肽(HIS-标签肽)的序列结束。为了使它们插入表达质粒，序列侧面连接有PstI和SalI限制酶位点。在VL的3'末端和SalI位点之间加入另外的序列，如果需要的话，允许消除His6肽。优化密码子，用于在大肠杆菌中表达。下面详细地给出了scFv合成基因的构建的图示：

根据E.S.Ward等人(Ward等人，Nature，341：544-546,1989)[7]，将抗体片段插入于pSW1表达质粒(ATG：Biosynthetics GmbH，德国)的PstI和XhoI酶促位点之间，表达质粒在LacZ诱导型启动子的控制下含有PelB信号序列，该抗体片段在具有重组抗体片段的基因的阅读框中融合，允许合成的蛋白运输到细菌周质。在周质中，该信号序列被肽酶消除。

在通过测序来验证构建体的质量后，通过热休克，使用pSW1-CA5、pSW1-CH10和pSW1-CF12质粒以转化感受态HB2151细菌(T53040，Interchim，法国)(Li等人，Afr.J.Biotechnol.,9(50)：8549-8554,2010)[8]。

表8：CF12 scFv的核苷酸和肽序列

b/重组抗体片段的制备

-细菌培养

在5ml的含有50μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中制备预培养物，在37℃下过夜。第二天，将500μl的这种预培养物接种到500ml的相同的培养基中，并在37℃下以150RPM生长，直到获得1.4的OD_600nm。加入0.1mM的IPTG诱导scFv合成，在16℃、150RPM下持续16小时。

-提取

将培养基在4℃下以4500g离心30min。制备物的剩余部分保持在4℃下。为了提取细菌周质，将颗粒重悬浮并且在10ml的TES(0.2M Tris，pH 8，0.5M EDTA，0.5M蔗糖)中温育30min，然后向其中加入稀释至1/4的15ml的TES，随后进一步温育30min。将细菌提取物以10000g离心30min。将上清液对PBS透析过夜。立即处理透析的上清液，以纯化scFv或在-20℃下储存直至使用。

根据制造商的使用建议，使用抗-His-Tag HRP抗体(Ref R93125 LifeTechnologies，法国)，通过蛋白印迹分析周质中scFv的产生。

-纯化

将周质在4℃下以5000g离心20min。用Nickel Affinity Gel(Sigma-Aldrich，MO，USA)孵育上清液，在4℃下搅拌1h。用含有0.3M NaCl的0.05M的磷酸钠缓冲液(pH 8)洗涤凝胶，然后向其中加入含有20mM咪唑的相同缓冲液，直至获得接近于0的OD_280nm。然后用含有0.3M NaCl和250mM咪唑的0.05M磷酸钠缓冲液(pH 8)洗脱scFv。洗脱物对PBS透析过夜。储存于-20℃。

-质量控制

通过在用考马斯蓝染色之后的15％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并通过在Sephadex^TM 75 10/300GL柱(Ref 17-5174-01GE Healthcare，德国)上排阻色谱，分析纯化的scFv。

5/特异性

通过ELISA技术研究CF12抗体及其scFv的特异性。在0.1M碳酸钠缓冲液(pH 9.6)中，以10μg/ml的浓度制备待评估的每种激素，并以100μl/孔的比例分布在ELISA板上。在+4℃下的吸附时间为18小时。在洗涤5次后，用100μl的补充有0.1％吐温和1％BSA的PBS在37℃下处理孔45分钟，然后将每种抗体或scFv以100μl/孔的比例分布，并在37℃下孵育1小时。在评价的每种激素上，抗体和scFv以各种浓度分布，对于抗体为10至250μg/ml，对于scFv为10至150或200μg/ml。

在洗涤5次后，将偶联过氧化物酶(HRP)的第二抗体以100μl/孔的比例分布，并在37℃下孵育1小时。取决于所研究的单克隆抗体的同种型，第二抗体是抗-IgG1 HRP(Ref.115-035-205，Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc)、抗-IgG2a HRP(Ref.115-035-206，Jackson Laboratories)或抗-IgM HRP(Ref.115-035-075，JacksonLaboratories)。对于scFv，使用抗-His标签HRP(Ref.R93125Life Technologies，法国)。在洗涤5次后，用以100μl/孔的比例分布的TMB来显示酶促活性。在室温下，显示时间为5至30min，取决于反应速率。在已经用1M H₂SO₄(50μl/孔)终止反应后，使用用于ELISA板的分光光度计测量有色反应的强度(光密度)。

-CF12 scFv的特异性

基于抗体(以增加的浓度制备)与吸附的各种激素的结合(结合至饱和，Bmax)的显示，CF12 scFv使得可以通过ELISA方法获得可定量的结合。结果以显示后获得的光密度单位表示。

表9表示在猪FSH(pFSH)和绵羊FSH(oFSH)和多种人FSH上，以200μg/ml的浓度孵育的CF12 scFv获得的光密度值。

表9

CF12 scFv表现出对吸附的pFSH和oFSH的较强结合，以及对hFSH和hMG(Menopur)的较弱结合。

表10表示在猪LH(pLH)、绵羊LH(oLH)、牛LH(bLH)、eCG和hCG Chorulon和Endo5000上，以200μg/ml的浓度孵育的CF12 scFv获得的光密度值。

表10

	oLH	pLH	bLH	eCG	Chorulon	Endo 5000
							CF12 scFv	2	2.2	2.2	0.6	0.35	0.38

与其中结合较弱的吸附的hCG和eCG不同，CF12 scFv与动物LH的结合是相当大的。

因此，CF12的结合和CF12 scFv的结合似乎受到表位构象的极大限制，特别是对于人激素。鉴于CF12及其scFV在体外和体内对人FSH和hCG Chorulon以及Endo 5000的活性获得的显著的生物学效应(参见实施例2和3中的结果)，可能的是，CF12 scFv的结合，正如整个抗体一样，完全依赖于激素的构象。由于吸附到ELISA板的塑料上的激素构象的改变而损害CF12和CF12 scFv的结合的假说可以解释这些结果，并且加强了CF12及其scFv对于极端构象表位特异性的假说。

在GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA，第5版)上，使用以饱和结合模型(“饱和结合实验模型”，GraphPad PRISM软件)的“一个位点-特异性结合”功能来计算scFv相对于所研究的多种FSH、LH和CG的解离常数Kd的估计。获得的各种值在表11和12中示出。

表11

表12

因此，所估计的解离常数Kd的比较表明，scFv对绵羊、猪和人FSH(Gonal-F和Fostimon)具有更强的亲和力，其中Kd值范围为对于pFSH和hFSH Fostimon为2.6μM，对于oFSH为3.77μM以及对于hFSH Gonal-F为4.87μM。

对于动物LH、eCG和hCG Chorulon以及Endo 5000的Kd值相对均匀并且在4.72和6.23μM之间变化，证明了与以上FSH相比，CF12 scFv对这些激素的亲和力稍微弱一些。

对于hFSH Puregon和hMG Menopur，CF12 scFv表现出甚至更弱的亲和力，Kd分别为约10μM左右：14和25.22μM。

实施例2：本发明的配体对FSH的生物活性的增强作用的体外测量

通过比较，用单独的FSH，或者FSH/单克隆抗体(MAb)复合物刺激的各种细胞类型或品系获得的生物反应，证实本发明的配体对FSH的生物活性的增强作用。

在每种情况下，获得的剂量-应答曲线的比较使得可能将MAb对复合FSH的生物活性的体外增强作用进行定量。使用Prism软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA，第5版)进行结果的统计分析。

1/在牛颗粒细胞的原代培养物上

CF12MAb对人FSH(hFSH)的增强作用首先表征于内源性表达牛FSH受体的牛颗粒细胞上。

用一系列的范围为3ng/ml至25ng/ml的人FSH将终浓度为0.1μg/ml的CF12抗体的杂交瘤上清液在37℃下孵育30分钟。

根据Chopineau等人(Mol.Cell Endocrinol.,92(2)：229-39,1993)[8]和Wehbi等人(Endocrinology,151(6)：2788–2799,2010)[9]所描述的方案，通过在牛卵巢上从具有2至6mm范围内直径的卵泡卵巢穿刺而获取牛颗粒细胞。将在以每0.5ml 80000个细胞制备的McCoy's 5A培养基(Lonza，比利时，参考BE12-688F)的悬浮液中的牛颗粒细胞，在37℃、在搅拌下，在48μg/ml的IBMX(Sigma Aldrich，法国，参考I5879)存在下，在3ng/ml至25ng/ml范围的FSH(单独的或与根据以上方案的单克隆抗体预复合的)情况下，刺激3小时。测量的生物反应是cAMP分泌。

在离心后，使用ELISA试剂盒(Biomedical Technologies Inc.，MA，USA，BT-730)在培养物上清液中测定所产生的cAMP。

结果示于图1中。

结果示出了CF12对人FSH活性的2.5倍扩增。通过双因素方差分析(双因素ANOVA，GraphPad PRISM软件)的统计分析示出了，对于CF12的p<0.01(**)至p<0.001(***)的显著效果。CF12抗体对所测试的所有hFSH浓度具有显著效果。

2/在用人FSH受体稳定转染的HEK293细胞系上

在稳定表达人FSH受体的HEK 293细胞上测量MAb对多种物种的FSH的增强作用。该系统使得可以在用单独的FSH或用FSH/MAb复合物刺激后在37℃下测量FSH受体活化后的cAMP产生，持续1小时。

为此，将60000个细胞分布到96孔板(Becton Dickinson，NJ，USA，参考353072)的孔中，并且在37℃、5％CO₂下在潮湿气氛中，在100μl的含有10％SVF(Lonza，Belgium，参考DE14-801F)、1％青霉素/链霉素(Sigma Aldrich，法国，参考P-4333)和400μg/ml的G418(Sigma Aldrich，法国，参考A1720)的MEM培养基(Sigma，法国，参考P-4333)中培养24h。在MEM培养基中驯化(饥饿，weaning)2h后，将细胞在37℃下刺激1h。回收培养物上清液并使用ELISA试剂盒(Biomedical Technologies Inc.，MA，USA，BT-730)进行测定。结果表示在终点分泌的cAMP的量。使用Prism软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA，第5版)分析它们。

图2表示CF12单克隆抗体体外地在用人FSH受体的稳定转染有HEK293细胞上，对人FSH的生物活性的增强作用。为此，用在0.3ng/ml至3ng/ml范围内的人FSH(Gonal-F，SeronoLaboratory)刺激细胞，或者用在刺激细胞前具有单克隆抗体(终浓度为0.1μg/ml)的、先前在37℃下孵育30分钟的相同FSH范围点来刺激细胞。双因素方差分析(双因素ANOVA，GraphPad PRISM软件)使得可以将用单独的FSH或用FSH/单克隆抗体复合物获得的剂量-应答曲线进行比较。用重组人FSH(Gonal-F，Serono Laboratory)获得的结果表明，CF12抗体分别地对0.5ng/ml具有140％的激素活性增强作用，对1和3ng/ml的浓度具有160％的激素活性增强作用。通过配对t-检验(Wilcoxon检验)，该作用对于3ng/ml的人FSH点是显著的(p<0.01)。

3/在用人FSH受体和体系稳定转染的HEK293细胞系上

在稳定表达人FSH受体和GloSensor^TM载体(Promega，法国)的HEK 293细胞上，实时测量MAb对多种物种的FSH的增强作用。该细胞体系使得可以在用激动剂(仅FSH或者FSH/单克隆抗体复合物)实时刺激FSH受体后，监测cAMP产生。在cAMP结合于GloSensor^TM蛋白上之后，将GloSensor^TM底物(Promega，法国，参考E1291)水解，并导致发光发射，该发光通过PolarStar Optima酶标仪(BMG Labtech，德国)测量并且以RLU表示(相对发光单位)。这种稳定的细胞系由在INRA[法国国家农学研究中心，Val de Loire，37380Nouzilly，法国)的信号系统团队的生物学和生物信息学开发，并且较好地可用于这些测定。

为此，将HEK 293细胞以透明底部的白色96孔微孔板(Dominique Dutscher，法国，参考655903)的每孔80000个细胞的比例进行培养，并且在100μl的补充有10％SVF(Lonza，Belgium，参考DE14-801F)、1％的青霉素/链霉素(Sigma Aldrich，法国，参考P-4333)、200μg/ml的潮霉素B(Life Technologies^TM，法国，参考10687010)和400μg/ml的G418(SigmaAldrich，法国，参考A1720)的MEM培养基(Ozyme，法国，参考BE12-611F)中培养过夜。在100μl的补充有1％BSA(PAA，法国，参考K45012)且含有4％的GloSensor^TM底物的MEM培养基中驯化2h(在室温下在黑暗中2h)后，将细胞板置于PolarStar Optima酶标仪中，并且第一次读数进行5分钟，以测量基础发光水平。然后从酶标仪中移出板，并且向其中加入11μl的配体(仅FSH或FSH/单克隆抗体复合物)，以获得所示的浓度。然后测量发射的发光，持续大约1小时30分钟。

使用Prism软件(GraphPad Prism Software Inc.，San Diego，CA，USA，第5版)分析所获得的结果。使用非线性函数“log(激动剂)对反应”绘制作为FSH浓度的函数的反应。这使得可以将单独的FSH和与单克隆抗体复合的FSH的EC50进行表征和比较。对于每个实施例，通过双因素方差分析(双因素ANOVA，GraphPad PRISM软件)，以两条曲线的整体进行比较来测量FSH/增强抗体复合物的显著效果。

-CF12单克隆抗体

CF12单克隆抗体的增强作用的特征在于，对人、绵羊和猪FSH的生物活性。

图3示出了CF12对人FSH(Gonal-F，Serono Laboratory)的生物活性的显著增强作用。在hFSH的0.01nM和0.03nM的低浓度下(对细胞体系未饱和)，该显著的效果是完全可量化的(曲线A和B)。观察到，发光信号增加分别为280％和341％，其是高度显著的(p<0.001)。对于较高的浓度(0.1-0.3和1nM)，细胞应答的增加分别为181％、147％和120％，这可能是由于发光信号逐渐饱和达到46000RLU(曲线C、D和E)。对于曲线C、D和E，增加仍然非常显著(p<0.001)。对于hFSH，由GraphPad Prism测量的EC50值为4.25×10^-10M，并且对于hFSH/CF12复合物为9.38×10^-11M，反映了当其与增强抗体CF12复合时，激素的生物活性增加0.7LogEC50单位(分别地10^-9.37至10^-10.03)(曲线F)。

还测量了CF12 scFv(40nM)对以0.01nM的浓度制备的人FSH(Gonal-F，SeronoLaboratory)的活性的增强作用(图4)。平行测量整个CF12抗体(6nM)的效果用于比较。用hFSH/CF12scFv或hFSH/CF12抗体复合物获得的曲线完全彼此重叠，表明一价抗体片段具有相同的效果。

如图5所示，由CF12发挥的增强作用对绵羊FSH也是非常显著的，其中在用CF12/oFSH复合物刺激期间，对于0.01nM-0.03nM和0.1nM的激素浓度，观察到细胞应答增加240％、300％和350％(曲线A、B、C)。CF12制备为10nM。以与对于hFSH相同的方式，对于较高浓度0.3nM和1nM(曲线D和E)，由于发光信号的逐渐饱和高达40000RLU，细胞应答的增加分别为200％和130％。对于oFSH，通过GraphPad Prism测量的EC50值为2.29×10^-9M，并且对于oFSH/CF12复合物，测量的EC50值为1.98×10^-10M，反映了当其与增强抗体CF12复合时，激素的生物活性增加1.06LogEC50(分别地从8.64至9.7)(曲线F)。观察到的对细胞应答的增强作用在所有情况下是高度显著的(p<0.001)。

图6的曲线示出了CF12(10nM)对以0.01-0.03-0.1-0.3和1nM的浓度制备的猪FSH的增强作用。在细胞体系不是处于饱和的最低pFSH浓度(0.01nM-0.03nM和0.1nM)下，这种效果是完全可量化的(曲线A、B、C)。因此，观察到，分别地，发光信号非常显著且相当大地增加了220％、350％和330％。对于更高的浓度(0.3和1nM)，由于发光信号逐渐饱和直到40000RLU的极限，细胞应答的增加分别小于175％和114％(曲线D和E)。对于pFSH，通过GraphPad Prism测量的EC50值为1.92×10^-9M，对于pFSH/CF12复合物，测量的EC50值为3.69×10^-10M，反映了当其与增强抗体CF12复合时，激素的生物活性增加0.717LogEC50(分别为10^-8.715至10^-9.432)(曲线F)。

4/在人颗粒细胞的原代培养物上

如Reverchon等人中所描述的回收和培养人颗粒细胞(Reverchon等人，HumanReprod.,27(6)：1790-1800,2012)[11]。

从在辅助生殖技术(ART)的环境下，在体外受精(IVF)治疗的妇女的卵母细胞穿刺后收获的卵泡液中回收这些细胞。这些细胞通过在40％Percoll梯度上离心分离，在完全的McCoy's 5A培养基中重悬浮(Lonza，Belgium，参考BE12-688F)，然后以最终体积为500μl的每孔30,000个细胞的比例，接种到24孔板(Becton Dickinson，NJ，参考353047)中，并培养48小时。然后仅用人FSH或用人FSH/MAb复合物将它们刺激48小时。所使用的人FSH主要是由制药实验室Serono(Serono，Europe，Limited)销售的重组激素Gonal-F以及由制药实验室Genevrier(法国)销售的Fostimon(一种从绝经妇女的尿提取的FSH)。在刺激之后，回收上清液并离心。使用ELISA试剂盒(Biomedical Technologies Inc.，MA，USA，BT-730)在每个培养物上清液中测定所产生的cAMP。

根据以上描述的方法，分别制备和分别培养来自23名患者的细胞。将来自患者的每种细胞培养物分成两批：一组用10^-11M至10^-8M范围的FSH刺激，另一组用在各种浓度范围的CF12单克隆抗体/hFSH复合物刺激。将抗体制备为0.1nM或4nM的终浓度。对于每个患者，比较在两种条件下获得的剂量-应答曲线，以评价抗体对所使用的人激素的生物活性的增强作用。

来自23名患者的细胞培养物示出了对用hFSH和/或用hFSH/抗体复合物刺激的非常不同的应答。只有来自总共23名中的12名患者的细胞应答于单独的FSH刺激(而不管所使用的hFSH)，以及应答于FSH/抗体复合物的刺激(图7，曲线A、B、C)。这些结果示于图7中。曲线A表示患者对Gonal-F和Fostimon的刺激的细胞应答；测量的EC50值分别为7.10^-11和1.10^-9。曲线B和C示出了代表性的患者的两种情况，即患者的颗粒细胞对单独的hFSH刺激(对于曲线B为Gonal-F并且对于曲线C为Fostimon)以及对CF12/hFSH复合物刺激两者均应答。在曲线B的情况下，用复合物获得的剂量-应答曲线的EC50值大于用单独的激素获得的剂量-应答曲线的EC50值(7.52×10^-10M相比于2.42×10^-9M)。在曲线C的情况下，EC50值没有不同(2.28×10^-9M相比于3.61×10^-9M)。

在剩余的11名患者中，来自其中的四名的细胞既不对FSH的刺激应答也不对FSH/CF12复合物的刺激应答。相反地，令人惊奇的是，来自其它7名患者的细胞仅对FSH/增强抗体复合物的刺激应答，而在相同浓度范围内单独用hFSH刺激后，没有观察到cAMP分泌增加。这些显著的结果由图8，曲线A至F示出，每个曲线代表不同患者的颗粒细胞的应答。在每种情况下，CF12抗体以0.1nM使用。两名患者给出由曲线D示出的相同的剂量-应答曲线。这些结果非常清楚地证实，在这些患者中，与没有活化hFSHR受体的单独的FSH不同，只有hFSH/CF12抗体复合物能够诱导hFSHR受体的功能性刺激。在用hFSH/CF12抗体复合物刺激下，获得的最大cAMP分泌水平位于6至15pmol/ml之间，相当于用具有对hFSH正常应答的细胞培养物获得的最大分泌水平(图12)。通过GraphPad Prism测量的剂量-应答曲线中的每一个的EC50值示于表13中：

表13

*：患者G获得的EC50值与患者D获得的EC50值相同。

因此，hFSH/CF12抗体复合物表现为新的配体，作为能够在患者(用重组的或提取的hFSH的常规刺激天然地难以治疗的)中活化hFSHR的新的激动剂。因此，使用hFSH/增强抗体混合物可以在对人生殖生物学中使用的常规激素治疗无应答的患者的诱导排卵(单排卵或多排卵)的激素治疗上提供新的替代方案。

实施例3：本发明的配体在大鼠模型中对FSH和LH/CG的生物活性的增强作用的体内测量

在已经进行体外表征之后，对单克隆抗体的增强作用进行体内表征，用于其在雌性大鼠中对FSH的生物活性的影响，以及还认识到，在雄性大鼠中对LH/CG的生物活性的影响。

为了测量FSH生物活性，使用的方案是由Steelman和Pohley描述的生物测定(Steelman SL，Pohley FM.Endocrinology，53：604-616,1953)[12]。为了测量LH生物活性，使用的方案是由Scobey等人描述的测定(Scobey et al.,Reprod.Biol.Endocr.3:61,2005)[13]。

使用人FSH评价抗体对FSH活性的影响。在hCG(人绒毛膜促性腺素)的两种制剂上，评价了抗体对LH活性的影响。

使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA，USA，第5版)进行统计分析。由于与实验相关的结果在五只动物的批次上进行，应用了非参数的、单因素方差分析(Kruskal Wallis检验)，接着进行Dunns校正，或者应用非参数t-检验(Mann-Whitney检验)。对于由多个生物测定的汇总产生的有关较大数目(n>30)的结果，应用了参数检验(非配对Student’s t检验)，随后进行Bonferroni校正。

1/抗体对FSH在雌性大鼠中的生物活性的增强作用

在辅助生殖技术治疗的环境中，在用于人类生殖的人FSH的各种制剂上，研究了CF12抗体及其scFv的增强作用：Gonal-F和Puregon(分别地来自Merck Serono和MerckSchering-Plough实验室的重组FSH)以及Fostimon和Menopur(分别地由实验室Genevrier和Merck Schering-Plough出售的提取的FSH)。

如在Steelman和Pohley的方案中所描述的，21天龄的未成熟的雌性大鼠连续三天接受在早晨和傍晚两次注射100μl的hCG和FSH的混合物，该混合物包含恒定量的补充有0.5至1.5IU范围内的可变量的FSH(对于人FSH)的hCG(3.5IU)(Gonal F，Puregon，Fostimon，Menopur)。进行皮下注射到脖子的颈背中。每个实验包括至少四批：用生理盐水(血清Φ)处理的一批，用抗体或单独scFv处理的一批，用hCG+FSH混合物处理的一批，以及用补充有2μg的纯化的scFv或抗体的hCG/FSH混合物处理的一批。

在用激素/抗体或scFv复合物处理的情况下，在注射前，将FSH+抗体混合物在37℃下或在室温下无差别地预孵育20分钟，然后加入至hCG中。在复合物的孵育期间，hCG可以无差别地与FSH混合。

在第四天，对雌性大鼠称重，并且取出它们的卵巢、解剖，然后称重。结果以毫克卵巢/100克体重表示。卵巢重量的增加与注射的生物活性FSH的量成比例。这使得可以将单独注射的或作为与抗体的复合物注射的相同量的激素的生物活性进行定量和比较。

单独注射或与抗体或与scFv复合的FSH的生物活性的比较使得可以测量应答的差异，并且因此定量抗体或其scFv的增强作用。

CF12抗体及其scFv的增强作用

评价了针对人FSH制备的CF12抗体对人FSH的多种制剂的生物活性以及对绵羊FSH的生物活性的体内作用。

图9A示出了在人FSH的三种不同制剂上的CF12抗体发挥的显著增强作用。结果是包括5名雌性的批次的代表性生物测定的结果。使用非参数t-检验(Mann-Whitney检验)进行批次之间的统计分析。在hFSH Gonal-F的活性上记录了相当大的和显著的增强作用，在卵巢的平均重量上增加了210％(74相比于155mg/100g体重，p<0.001)。同样地，在Puregon上，获得了190％的增加(141相比于224mg，p<0.05)，并且对于Fostimon，记录了卵巢平均重量增加160％(85相比于161mg，p<0.05)。

将这些实验重复5至7次，并且将结果汇总(对于批次hCG+hFSH Gonal-F和hCG+hFSH Gonal-F+CF12，n＝40只和47只雌性大鼠)。应用参数检验(非配对Student’s t检验)，然后进行Bonferroni校正。如在表14中所示，它显示了在用hCG+hFSH(Gonal-F)混合物常规处理的雌性动物的卵巢的平均重量与在用hFSH Gonal-F/CF12复合物处理的雌性动物中测量的卵巢的平均重量之间，非常显著地增加170％：在雌性动物中，平均重量从79.51±2.178mg卵巢/100g体重增加到134.8±4.985mg卵巢/100g体重(***，p<0.001)。

表14

进行相同的方法以评价和定量CF12抗体对绵羊来源的FSH的增强作用。

图9B示出了通过用0.5μg的绵羊FSH+hCG或用hCG+0.5μg的与CF12预复合的绵羊FSH处理雌性大鼠获得的生物测定(5只雌性的批次)的代表性实例。与没有接受CF12的处理相比，在用oFSH/CF12复合物+hCG处理的雌性中，获得了卵巢平均重量增加170％：卵巢的平均重量从107mg上升至183mg/100g体重(**，p<0.01)。

在较大数量(n＝10)上重复本研究非常显著地证实了，CF12对oFSH的生物活性的增强作用(表15)，平均重量从常规处理的情形下的115.5±7.45mg增加至在用oFSH/CF12复合物+hCG处理的那些中的166.4±9.54mg(***，p<0.001)。

表15

以相同的方式评价从抗体的可变区VH和VL的序列发展的CF12 scFv对人FSH的生物活性的影响。之前，从对应于全部抗体的相同注射量的每次注射的0.06μg/注射(对应于与全部抗体等摩尔的2.5×10-9mol的量)至2μg，评价多种剂量的scFv。生物测定中的各种剂量的scFv的比较证实，通过注射2μg的scFv/注射，即8×10^-8mol，获得最佳的增强作用。

对人FSH的各种制剂所获得的结果示于图10A中。它们示出了，在三种人FSH制剂上，用scFv记录的效果非常接近于用全部抗体测量的效果。与用hFSH+hCG常规处理的那些相比，用hFSH/scFv/CF12复合物+hCG处理的雌性大鼠中的卵巢的平均重量系统地更高。因此，对hFSH Gonal-F，记录了增加190％(与不含CF12 scFv的批次中的89mg相比，在+CF12scFv的批次中的平均重量为170mg，p<0.01)，对hFSH Puregon增加了151％(与不含scFv的批次中的86mg相比，在+CF12 scFv的批次中平均重量为130mg，p<0.05)，以及对hFSHFostimon增加148％(与不含scFv的批次中的77mg相比，在+CF12 scFv的批次中的平均重量为114mg，P<0.05)。使用非参数t-检验(Mann-Whitney检验)进行分析。应当注意的是，卵巢应答上增加的大小等同于用全部CF12抗体获得的(相同的倍增因子)。这个显著和主要的结果表明，无论是通过scFv还是全部抗体，都可以在体内获得循环的促性腺素的一种和相同的增强作用，导致器官中的生理应答的切实扩增。

在CF12的情况下，还评估了注射激素/抗体或scFv混合物的各种方法，并与常规方案(皮下注射)进行比较。因此，进行生物测定，用于比较腹膜内注射激素混合物与，腹膜内注射激素混合物及随后在15分钟后第二次延迟注射CF12 scFv进行比较。结果呈现于图10B中，并且表明在以两个步骤腹膜内注射的雌性中的卵巢重量增加122％：1)用hCG+hFSH混合物，然后2)在延迟注射15分钟后用scFv：与在hCG+hFSH Gonal-F接着是scFv的批次中每100g体重72mg的卵巢相比，在hCG+hFSH Gonal-F批次中每100g体重58.8mg的卵巢。由于数量少，两个批次之间的差异不显著，但是结果表明，趋势趋向于以两个步骤和在两个不同的注射点由注射激素和scFv的FSH的增强。因此，对于随后的应用，可以设想在时间和不同注射点方面独立地注射待增强的激素，然后注射抗体或scFv。

在用激素/抗体复合物处理的动物中评估了另一注射模式：一种具有单次皮下注射hCG+FSH+CF12，并且另一种具有FSH+CF12的第一次皮下注射，然后15分钟后也是皮下地注射hCG。图19C中所示的结果显示，在两种情况下观察到的增强作用没有不同：与用CF12抗体处理的雌性中的159mg卵巢/100g体重相比为160mg，对于无抗体处理的批次的卵巢平均重量为83mg。

抗体在大鼠中对LH/CG的生物活性的增强作用

由于绵羊LH的成本非常高，用易于可获得的以非常纯的和便宜的形式的hCG进行这些生物测定。在提取的hCG(人绒毛膜促性腺素)的两种制剂上研究抗体的效果，一种用于在辅助生殖技术治疗的环境下的人类生殖：ENDO 5000(Schering-Plough实验室)以及另一种用于兽医学：Chorulon(MSD实验室)。

根据Scobey等人的方案[13]，相对于精囊重量的增加，将LH或hCG的生物活性进行定量，精囊的发育是雄激素依赖性的。重量与hCG的活性成比例地变化，因此使得可以将单独注射的或与所研究的抗体复合的激素的生物活性进行定量和比较。该方案用25天龄的年轻大鼠进行，每天对大鼠皮下注射100μl的1.5IU的hCG或1.5IU hCG+2μl的在37℃下预孵育20min的抗体的混合物一次，持续四天。在第五天，称重大鼠，然后将其处死。取出它们的精囊(SV)，解剖并称重。精囊的重量以mg/100g体重表示，以便能够将用各批次获得的结果比较和组合。在每个实验中，对一批五只大鼠测试每一种条件。相同的实验重复数次。

图11A、B和C示出了用与hCG Chorulon和hCG Endo 5000复合的CF12抗体处理的大鼠获得的结果。

图11A示出了对6批的5只大鼠进行的生物测定的代表性结果。使用hCG Chorulon/CF12复合物获得了非常显著的增强作用(p<0.0001，Krustal和Wallis试验)，与使用单独hCG处理的批次相比，精囊重量增加了220％。在用hCG Endo 5000/CA5复合物处理的批次上也获得了显著的效果，重量增加了189％(p<0.0001)。观察到，与用生理盐水处理的对照动物相比，使用单独CF12抗体处理的批次示出了精囊的重量没有变化。因此未与激素复合的CF12对靶器官没有特别的作用。

在图11的柱状图B和C上示出了使用CF12进行的各种生物测定得到的结果的汇总。用hCG Chorulon和hCG Endo 5000测量了激素/CF12复合物的高度显著的增强作用(p<0.0001，非配对t-检验)：

-对于分别为33只和36只动物的数量，用hCG Chorulon处理的大鼠

中的SV的平均重量为29.36mg/100g，与之相比用复合物处理的大鼠

中的SV的平均重量为51.40mg/100g(增加了175％)(图11B)

-对于分别为18只和20只动物的数量，用hCG Endo 5000处理的大

鼠中SV的平均重量为25.35mg/100g，并且用复合物处理的大鼠中的

SV的平均重量为50.54mg/100g(增加了208％)(图11C)。

实施例4：本发明的配体对母羊中的内源性促性腺素的生物活性的增强作用的体内测量

在已经于啮齿动物(小动物)中证实并表征了CF12单克隆抗体在体内的增强作用之后，本目的是研究每种抗体对生产性家畜中的FSH的活性的影响，该家畜是体型更大的母羊。

为此，对所有相同年龄的有软毛的，法兰西岛的母羊进行研究，目的是评价抗体对处理的母羊自身激素(内源性激素)的增强作用。特异性的研究示出了CF12抗体对绵羊FSH的强结合以及对于绵羊LH的更可变的结合。为此目的，开发了仅包含单独注射抗体的处理以评价其功效。

在母羊中建立的方案中，如在雌性大鼠的研究中进行的那样，因此单独注射抗体而不与外源性FSH预孵育。此外，将每种抗体注射到没有任何事先刺激卵巢的母羊中：在注射抗体之前，动物没有接受用促性腺素刺激排卵的激素处理。

在正好发情季节的中期(1月)或发情季节结束(3月底)期间进行的方案中，评价了抗-FSH CF12抗体的增强作用。方案全都在母羊上进行，其中通过将用孕激素(45mg的醋酸氟孕酮(FGA)-MSD)浸渍的阴道海绵植入14天来预同步化排卵周期。通过比较在对照母羊(生理盐水批次)、用猪FSH处理刺激的母羊(FSH批次)和用单独的抗体刺激的母羊(抗体批次)中的排卵反应(排卵数量)以及一种或多种良好质量的功能性黄体的建立(孕酮分泌的规模)，来分析增强作用。

在每种方案中，通过ELISA方法进行血浆LH测定，以检测和记录LH的排卵前的峰值。为了评价排卵应答，在摘除阴道海绵8天后，在麻醉下，通过腹腔镜检查进行卵巢的内窥镜观察，以计数黄体的数量并观察其外观。

为了评价黄体(corpus luteum)或黄体(corpora lutea)的功能性和质量，使用从取出海绵后的第1天至第21天的每日血液样品进行定量性孕酮ELISA测定。

用GraphPad Prism Version 5.0软件(GraphPad，San Diego，CA，USA)进行所有的统计分析。

CF12抗体及其scFv

使用建立的黄体的排卵和功能质量的测量参数研究和比较CF12(IgM)及其scFv的增强作用。注射的剂量为2×1mg。

在发情季节进行的方案包括四个批次：

-CF12抗体批次(n＝7)，在取出海绵前24h，接受肌内注射1mg的抗体，并且在取出海绵时第二次注射1mg；

-CF12 scFv批次(n＝5)，在取出海绵前24h，接受肌内注射1mg的scFv，并且在取出海绵时第二次注射1mg；

-“对照”批次(n＝9)，在取出海绵前24h以及取出时，肌内注射生理盐水；

-“FSH”批次(n＝11)，在取出海绵前24小时接受肌内注射100μg的猪FSH(pFSH)以及在取出海绵前12h，注射90μg。

在取出海绵8天后进行卵巢内窥镜检查。

从取出海绵后的第1天至第21天，提取每日的血液样品，以通过ELISA测定法测定血浆孕酮。

排卵应答的分析给出了下表16中所示的结果。通过Fisher精确检验进行统计分析。

表16

*，p<0.05；***，p<0.0001

与对照和FSH批次相比，在CF12和CF12 scFv批次中所获得的结果示出了单独注射的抗体或其scFv对排卵应答的非常显著的效果。事实上，相比于对于血清Φ批次和FSH批次分别为44％和36％，已经接受1mg的抗体或scFv两次注射的雌性100％(对于CF12，7/7以及对于CF12 scFv，5/5)排卵(p<0.0001，Fisher精确检验)。与FSH和血清Φ批次相比，在CF12scFv批次中，对于总批次数量中的每只雌性所获得的黄体的数量显著更高：分别地，相比于0.9(FSH)和0.67(血清Φ)为2.2个黄体(p<0.05，Kruskall Wallis检验)。在CF12 scFv和CF12批次之间没有显著差异。

在三个批次之间，LH峰的平均出现时间没有显著差异。尽管如此，与FSH批次，并且特别是血清Φ批次相比，观察到在CF12和CF12 scFv批次中，在达到LH峰(并且因此在排卵时刻)上倾向于更少变化。在这种假设中，这将表明在已经接受抗体或其scFv的母羊中排卵同步更佳。

在多个批次中，在排卵后的黄体期期间的孕酮分泌曲线示于图12A中。对于每个个体，相对于黄体的数量将孕酮浓度值(ng/ml)标准化。该图的每个曲线表示，在每个批次的雌性中的每个采样点处测量的孕酮值的平均值。用CF12和CF12 scFv批次获得的分泌曲线非常明显高于FSH和血清Φ批次。所获得的结果表明，对于CF12 scFv、CF12、FSH和血清Φ批次，在取出海绵后的D10处平均孕酮值分别为1.46-1.4-1.1和0.6ng/ml，在D15处平均孕酮值分别为1.93-1.78-1.22和1ng/ml。

通过配对非参数t检验(Wilcoxon检验)进行了四条曲线的比较。CF12和CF12 scFv批次的曲线与血清Φ批次的曲线显著不同(p<0.01)。同样，FSH批次的曲线与对照批次的曲线显著不同(p<0.001)。用CF12和CF12 scFv处理的母羊的曲线与用FSH处理的母羊的曲线之间的差异不显著，因此代表了一种趋势。

使用GraphPad Prism软件版本5.0进行曲线下面积(AUC)的分析，以便定量孕酮分泌曲线之间的差异。结果示于图12B中，并且表明CF12 scFv曲线的AUC(16.98单位)比血清Φ曲线(8个单位)的AUC显著高出1.55倍(p<0.01，非参数Mann--Whitney t-检验)。同样，CF12曲线的AUC(16.78单位)和血清Φ曲线的AUC(8单位)显著不同(p<0.05，Mann-Whitney非参数t-检验)。在另一方面，在FSH曲线的AUC(10.82单位)和血清Φ曲线的AUC之间没有显著差异，表明在本实验的上下文中用CF12或用CF12 scFv处理比用FSH处理更有效。

总之，所有结果表明CF12的一价片段具有与二价CF12抗体相同的增强作用。在所涉及的两批母羊的应答之间，没有观察到显著差异。与常规的用FSH处理相比，以两次肌内注射(每次给予1mg)形式的两种分子中的任一种处理，非常显著地得到更佳的结果：

-在排卵诱导的有效性方面(在总数量内，母羊100％排卵，并且每只

母羊获得1.3个和0.8个另外的黄体)；

-在整个黄体期以较高的孕酮分泌建立的黄体的质量方面。

所有的结果表明，在母羊体内注射的CF12增强抗体能够复合动物的内源性促性腺素以及增强动物自身激素的生物活性。

CF12抗体在母羊中的增强作用能够诱导比常规FSH激素处理更强的卵巢刺激：在发情季节，排卵诱导为100％，并且在所有情况下，在整个黄体期保持循环孕酮浓度的相当大的增加。这种额外的效果主要是减少孕激素依赖性胚胎发育失败率和堕胎的风险。

示出了CF12的一价scFv片段诱导了与全部抗体相同的增强作用，包括对排卵的诱导和对黄体的质量两方面，以及增加母羊中的孕酮分泌。此外，注意到，在我们的方案中，注射CF12 scFv不会在所处理的母羊中诱导抗-CF12 scFv抗体分泌。因此，使用一价片段的观点降低了可以在某些母羊中诱导的体液免疫应答的风险。

实施例5：在雌性猴中，本发明的CF12配体对FSH的生物活性的增强作用的体内测量

在已经证实和表征了CF12单克隆抗体在大鼠、雌性大鼠和母羊体内的增强作用后，在接近人类的物种(食蟹猴(Macaca fascicularis))中研究了其增强作用。为此，对至少36个月龄的有软毛的雌性猴进行研究，目的是评价抗体对人FSH(hFSH)的增强作用。

在建立的方案中，将抗体作为与hFSH的复合物(抗体已经与外源性FSH预孵育)注射，或者单独地注射抗体，在20分钟后注射hFSH。

在月经的第一天，雌猴进行肌内注射1.5mg的缓释GnRH制剂(L.P.3mg-IPSEN Pharma)。在注射GnRH 15天后，根据各种方案处理雌性猴。每个方案处理单只雌性猴。

在最后一次注射hFSH 36小时后，将1000IU的hCG(绒毛膜促性腺素Endo 5000-MSD)注射到动物中。在注射hCG 36小时后，通过剖腹，经穿刺取出卵母细胞，并在显微镜下观察，以评价其成熟程度。

通过比较诱导的卵泡生长(卵泡的表面面积和雌二醇分泌的规模)以及良好质量的黄体的建立(孕酮分泌的规模)来分析增强作用。为此，每48小时进行经腹的卵巢超声，以计数卵泡并测量它们的表面面积(以mm²表示)。从处理的第一天直到卵泡穿刺后的第30天，每48小时采集一次血液样品，使得可以进行定量的雌二醇(以pg/ml表示)和孕酮(以ng/ml表示)ELISA测定。

所有统计分析用GraphPad Prism Version 5.0软件(GraphPad，San Diego，CA，USA)进行。

1/注射25IU的hFSH后单独给予CF12配体的效果

首先在hFSH上评价CF12的增强作用。为此，进行了表示为1至3的三种方案：

1-用单次注射25IU的hFSH处理动物：在处理的第一天，皮下注射25IU的人FSH(预填充的注射笔-Merck Serono)(“hFSH 25IU×1”)；

2-用CF12+hFSH处理动物：在处理的第一天和第五天，在注射25IU的人FSH(预填充的注射笔-Merck Serono)20分钟后，进行皮下注射CF12抗体(400μg)20分钟(“hFSH 25IU+CF12×2”)；

3-用25IU的hFSH处理动物8天：每日皮下注射25IU的人FSH(预填充的注射笔-Merck Serono)，持续8天(“hFSH 25IU×8”)。

通过回波描记术测量诱导的卵泡生长(卵泡的表面面积)来监测三种处理的效果。将开始处理后九天(D9)所获得的结果示于图13A中。它们表明，在FSH处理开始后第9天，用单次注射25IU的hFSH处理的雌性猴没有表现出刺激的卵泡(曲线下面积为零)。相反，在处理的第1天和第5天，用CF12 400μg+hFSH 25IU混合物处理两次的雌性猴表现出受刺激卵泡的总表面面积为28mm²。在已经接受8次hFSH注射的雌性猴中，受刺激卵泡的总面积为35mm²。

处理开始后11天(D11)所获得的结果示于图13B中。它们示出了，雌性猴用CF12+hFSH处理两次，随后示出了具有6个刺激的卵泡的总卵泡面积为29mm²。相比之下，在已经接受8次hFSH注射的雌性猴中测量的卵泡面积为22.6mm²，具有11个刺激的卵泡。因此两次注射CF12 400μg+hFSH 25IU诱导了比8次注射25IU的hFSH更佳的卵泡生长：分别为4.83mm²/卵泡相比于2.05mm²/卵泡。与其中注意到刺激的卵泡的面积减少的包含8次注射FSH的处理相反，复合物对卵泡生长的影响恒定上升至D11。该结果证实CF12在雌性猴体内对循环FSH的增强作用，而不管其是内源性的还是外源性的。实际上，由于FSH的半衰期小于1小时，当在处理的第1天和第5天CF12与25IU的hFSH注射时，不能将所观察到的效果仅仅归因于对共注射的FSH的影响，而且也反映了对雌性猴的内源性FSH的影响。

2/注射37.5IU的hFSH后单独给予CF12配体的效果

然后研究了在注射37.5IU的hFSH后，延迟的单独注射的CF12的增强作用。为此，在注射GnRH 15天后建立了4个方案，表示为1至4。每个方案处理一只雌猴：

1-用37.5IU的hFSH处理动物12天：每天皮下注射37.5IU的人FSH(预填充的注射笔-Merck Serono)，持续12天(“hFSH 37.5IU×12”)；

2-每天用37.5IU的hFSH以及每两天400μg的CF12处理动物：每天皮下注射37.5IU的人FSH(预填充的注射笔-Merck Serono)12天，以及每两天在注射hFSH 20分钟后以400μg的剂量注射CF12抗体("hFSH 37.5IU×12+400μg CF12×6")；

3-每天用37.5IU的FSH以及每两天70μg的CF12处理动物：每天皮下注射37.5IU的人FSH(预填充的注射笔-Merck Serono)12天，以及每两天在注射hFSH 20分钟后以70μg的剂量注射CF12抗体(“hFSH 37,5IU×12+70μg CF12×6”)；

4-用75IU的FSH处理动物8天：每天皮下注射75IU的人FSH(预填充的注射笔-Merck Serono)，持续8天(“hFSH 75IU×8”)。

通过由回波描记测量诱导的卵泡生长(以mm²计卵泡的表面面积)来监测四种处理的效果。图14表示，在卵泡穿刺当天(D15)，在每种处理后获得的刺激的卵泡的表面面积。卵泡刺激的强度根据处理而变化。在已经接受“hFSH 37.5IU×12+70μg CF12×6”处理的雌性猴中，其是处于最大的并且非常显著的，其中测量了387.5mm²的表面面积。它是对照雌性猴“hFSH 37.5IU×12”中测量的表面面积(为112.3mm²)的3.5倍，并且其是在用“hFSH 37.5IU×12+400μg CF12×6”处理的雌性猴中获得的124.2mm²的表面面积的3.2倍。在用hFSH75IU处理8天的雌性猴中获得最小面积的卵泡(87.2mm²)。

利用“hFSH 37.5IU×12+400μg CF12×6”和“hFSH 75IU×8”在刺激当天获得的卵泡总数为7，以及利用“hFSH 37.5IU×12”和“37.5IU×12+70μg CF12×6“在刺激当天获得的卵泡总数为10(表17)。

表17：在各种处理后刺激的卵泡数量及其尺寸的变化

应该强调的是，最大的卵泡的尺寸在处理之间变化很大。因此，“37.5IU×12+70μgCF12×6”处理诱导直径大于7mm的5个卵泡形成(其中最大的卵泡的直径为9.15mm)，而所有其它处理仅诱导小于7mm的卵泡。

利用“hFSH 37.5IU×12+400μg CF12×6”和“hFSH 75IU×8”，通过穿刺获得的卵母细胞数为11个卵母细胞，利用hFSH 37.5IU×12，获得8个卵母细胞。利用hFSH 37.5IU×12+70μg CF12×6处理的雌性猴在卵巢上显示出年轻的黄体，由此表明在穿刺之前其自发地排卵。

这些结果证实，以70μg的剂量给予的CF12的非常大的增强作用，以高度刺激的和高级的排卵应答形式，导致卵泡生长比单独FSH诱导的卵泡生长大得多。在“hFSH 37.5IU×12+400μg CF12×6”和“hFSH 37.5IU×12+70μg CF12×6”处理之间，观察到应答差异也表明CF12发挥的增强作用是剂量依赖性的，70μg的剂量诱导最强的卵巢刺激。

通过测量从处理的第一天直至卵泡穿刺后30天的每48小时的雌二醇和孕酮的分泌，还分析和比较了四种处理的效果。

结果示于图15中，每个处理由曲线(A-B-C-D)表示，示出了在整个周期中对于每只雌性猴所获得的雌二醇和孕酮分泌曲线。

用37.5IU的单独的hFSH(图15A)或与400μg(图15B)和70μg(图15C)的CF12的处理组合处理的雌性猴存在彼此显著不同的雌二醇分泌曲线(****p<0.0001，双因素ANOVA)。在D9，浓度分别为157pg/ml、323pg/ml和220pg/ml，表明使用结合CF12的处理具有更好的雌激素应答。在D13，在卵泡穿刺前两天，雌二醇浓度分别为70pg/ml(图15A)，200pg/ml(图15B)和1950pg/ml(图15C)。相比之下，在卵泡穿刺前两天，在用hFSH 75IU×8(图15D)处理的雌性猴中为395ng/ml。这些结果证实了CF12对雌激素应答的非常大的增强作用，导致相对于单独使用FSH的对照处理，利用400μg剂量的CF12，雌二醇峰增加的系数为3，并且利用70μg剂量的CF12，雌二醇峰增加的系数为28。在“hFSH 37.5IU×12+70μg CF12×6”的情况下，在D13时观察到的相当大的雌二醇峰可以解释在卵泡穿刺之前发生的早期排卵的诱导。

测量了孕酮分泌曲线，反映了良好质量的黄体的建立。图15A、15B和15C的比较非常清楚地示出了，与用单独FSH处理的雌性猴相比，在用CF12和FSH处理的雌性猴中，孕酮水平的剂量依赖性增加。因此，在卵泡穿刺四天后的D19时，使用单独的FSH的孕酮浓度为2.4ng/ml(图15A)，使用CF12 400μg的孕酮浓度为14.5ng/ml(×6)(图15B)，并且使用CF1270μg孕酮浓度达到37ng/ml(×15)(图15C)。相比之下，在以75IU×8使用单独的FSH处理的雌性猴中，在卵泡穿刺4天后测量的孕酮水平为1.5ng/ml(图15D)，并且与37.5IU×12处理相比，无统计学差异。相反，用CF12 400μg和70μg处理诱导了与使用单独的FSH处理具有统计学差异的孕酮水平(****p<0.0001，双因素ANOVA)。

这些结果非常清楚地表明CF12对孕酮血液水平的增强作用，反映了在已经接受抗体的雌性猴中的更佳的黄体质量。孕酮在子宫内膜的准备、胚胎的着床和早期发育中的重要作用使其成为动物物种中的重要的激素，并且适用于妇女。

鉴于FSH的半衰期非常短(小于1小时)，所有的结果(使用25或37.5IU的hFSH)证明CF12抗体能够在体内对循环FSH(不管是内源性的还是外源性的)发挥增强作用。在用70μg抗体处理的雌性猴中观察到的非常大的效果实际上与抗体对雌性猴的内源性激素的“长持续时间”作用有关。

由于这些结果，我们还证实了CF12抗体可以为人类临床上，特别是在ART治疗中的诱导排卵的新的治疗方法的建立开辟道路，无论是在人工授精的环境下诱导单排卵，还是通过限定合适的剂量在体外受精(IVF)的环境下诱导多排卵。

实施例6：由本发明的CF12配体识别的表位的预测及其互补位的预测

使用蛋白-对接算法(基于使用图的蛋白结构建模)以及通过各种得分函数进化学习方法的优化对各种物种的促性腺素进行CF12抗体的表位的测定，使得可以区分天然和非天然的构象(Bernauer等人，Bioinformatics 2007,5：555)[14]，(Bernauer等人，Bioinformatics 2008,24：652)[15]，(Bourquard等人，PLoS One 2011，6：e18541)[16]以及(Bourquard et al.,Sci.Reports 2015，5:10760)[17]。

将每种抗体与人FSH(hFSH)、人LH(hLH)、人CG(hCG)、绵羊FSH(oFSH)和绵羊LH(oLH)、猪FSH(pFSH)和猪LH(pLH)对接。hFSH和hCG的晶体结构在蛋白数据库(PDB)中可获得：分别为4MQW和1QFW。使用与人FSH受体的胞外结构域复合的人FSH的结构(Fan和Hendrickson，Nature 2005，433：269)[18]。对于其它激素(hLH、oFSH、oLH、pFSH和pLH)，制备同源性模型，并且随后用于对接。

由于CF12抗体的3D结构不可用，所以使用CF12的一价VH和VL片段的序列进行研究。为此，制备可变部分的同源模型。由不同的结构单独地产生VH和VL模型，并且由用作为VH建模支撑的结构确定它们的相对取向。用于同源模型的结构在蛋白数据库(PDB)中可获得：1PLV用于CF12的VH，以及3TT1用于CF12的VL。

对接结果示于图16中。表现为CF12配体在七种目标激素上相似地对接。表位由在所研究的促性腺素的α-亚基和β-亚基上不连续定位的几个区域限定。表位还包括人FSH受体的胞外域的序列His7-Cys8-Ser9-Asn10。CF12配体的表位因此是非常构象的：它由激素的α-亚基和β-亚基的多个区域和受体的序列两者组成。所有这些不连续区域在激素和其活化的受体的天然构象上在空间上接近。

在与CF12配体的接触面中所涉及的激素和受体的各种残基由图16中的矩形包围。由hFSH的α-亚基上的阴影区域表示的两个残基参与主要的相互作用，因此在抗体/抗原识别中具有主要作用：这些是hFSH的α-亚基的位置9的谷氨酸(Glu9)和位置33的苯丙氨酸(Phe33)。这两种残基是相同的，并且在其它目标激素的序列中被识别。在涉及接触面的α-亚基的其它残基中，注意到包括包含Glu9的九个残基的区域。即Gln5-Asp6-Cys7-Pro8-Glu9-Cys10-Thr11-Leu12-Gln13基序。

在表位中还注意到，在天然激素中空间上接近的在35位的精氨酸残基(Arg35)和在56位的谷氨酸残基(Glu56)的存在。这两种残基固定β-亚基的C-末端，从而固定围绕α-亚基的“安全带”。这两种残基不变地存在并在所有目标激素中被识别。它们在激素的稳定性和生物活性中起重要作用。由于这种机制，抗体与这些残基的结合将因此使得可以增加FSH二聚体的稳定性。

CF12配体还识别构成安全带的β-亚基的C-末端的残基100至102以及108-109。由于这种安全带的作用是稳定激素的α/β二聚体的结合，所以CF12配体与这两种残基的结合也被认为有助于使安全带的闭合稳定，从而允许二聚体的稳定性更佳，其对于激素的生物活性是必需的。

CF12配体的表位的另一个特征是涉及，在由CF12识别的接触面中的人FSH受体的N-末端区域的残基7至10(His7-Cys8-Ser9-Asn10)。还认为CF12配体的结合，通过这种机制，有助于促进激素与其受体的相互作用，并导致建立“增强”作用。

表18给出了CF12配体的互补位的不同区域。所用的编号是序列SEQ ID NO：2和SEQID NO：4的编号。

两条VH和VL链通过它们的三个CDR和其框架的一些残基参与激素的识别。

对于主要相互作用，hFSH的α-亚基的Glu9残基分别由VH链的CDR3的Tyr102和Asp104残基以及VL链的Leu50残基识别。α-亚基的Phe33残基由VH链的CDR1的Ser31和Tyr33残基以及VH链的CDR2的Tyr52残基识别。

表18：CF12配体的表位和互补位

表18：构成CF12配体的表位的各种区域以及构成其互补位的那些。用阴影表示主要相互作用中涉及的残基。

在α-亚基的Arg35和Glu56残基上的相互作用涉及VH链的一些残基。CDR1的Ser30残基以及CDR2的Tyr52和Gly54-Thr55残基与Arg35相互作用。CDR2的Tyr52残基也与α-亚基的Glu56相互作用。

β链(安全带)的C-末端上的相互作用涉及VH链的一些残基：CDR1的Ser30残基、CDR2的Gly54残基以及框架3的Asp73-Thr74-Ser75残基。

只有VH链也涉及FSH受体的胞外域的识别，特别是其CDR1与位置26的甘氨酸(Gly26)以及框架1的某些残基(Gln1-Gly2-Gln3，Lys23-Thr24-Ser25)和框架3的残基(Ser75)的识别。

总之，CF12配体的特征在于，其识别高度构象的表位，该表位涉及hFSH的α-亚基、β-亚基，特别是其形成安全带的C-末端，以及FSH受体的胞外域。VH链必不可少地涉及与受体的相互作用，并且VL链涉及与激素的相互作用。该表位使得CF12配体一方面能够稳定激素二聚体联合，另一方面能够稳定激素与其受体的结合。这两种机制是互补的，用于产生激素对其受体更好的相互作用，并且可以构成CF12配体对促性腺素的增强作用的基础。

实施例7：本发明的CF12配体的多种片段的构建、制备和表征

构建CF12抗体的多种片段以评价它们增强绵羊FSH和人FSH的生物活性的能力。产生了仅包含称为“CF12 VL”的轻链可变链的片段、仅包含称为“CF12 VH”的重链可变链的片段以及，与本发明的实施例1，第4段中所描述的参考的CF12 scFv的VH-VL序列(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)相比，以反向VL-VH顺序构建的“反向CF12 scFv”。

1/抗体片段的构建和制备

由ATG：Biosynthetics GmbH(德国)合成编码源自CF12抗体的CF12VL和反向CF12scFv片段的合成基因。反向CF12 scFv由CF12 scFv融合物的CF12 scFv-接头-CF12VH的CF12 VL组成。每个合成基因通过包含在HindIII位点和编码PelB蛋白的序列的末端之间的pSW1质粒[7]的序列，与侧面连接有XhoI限制性位点的待合成的研究的蛋白的序列(SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：31)的融合设计。将序列插入于pSW1质粒的HindIII和XhoI位点之间。优化密码子，用于在大肠杆菌中表达。

通过将由pSW1反向CF12 scFv质粒的这些酶消化所得到的片段插入于pSW1质粒[7]的PstI-XhoI位点处获得pSW1CF12 VH表达质粒。

在通过对构建体的质量进行测序验证之后，通过热休克，使用pSW1-CF12VL、pSW1-CF12 VH和pSW1反向CF12 scFv质粒转化感受态的HB2151细菌(T53040，Interchim，法国)[8]。

表19：CF12 VL的核苷酸和肽序列

表20：CF12 VH的核苷酸和肽序列

表21：反向CF12 scFv的核苷酸和肽序列

根据先前在本发明的实施例1中所描述的方法进行片段制备。

2/CF12 VL、CF12 VH和反向CF12 scFv片段对FSH的生物活性的影响的体外测量

根据先前在本发明的实施例2中所描述的方案，使用稳定转染有人FSH受体和体系的HEK293细胞系研究“CF12 VL”、“CF12 VH”和“反向CF12 scFv”片段对人FSH的生物活性的体外作用。每次以40nM将“CF12 VL”和“CF12 VH”片段单独地或作为混合物进行测试。正如参考CF12 scFv一样，以80nM的浓度测试反向CF12 scFv。以0.1nM测试人FSH。

图17示出了在0.1nM的人FSH(hFSH)单独存在下或者与各种CF12片段复合下获得的以相对发光单位作为时间(以分钟计)的、函数表示的cAMP产生动力学曲线。将四种条件与单独的hFSH进行比较：hFSH+CF12 VL复合物(图17A)，hFSH+CF12 VH复合物(图17B)，hFSH+反向CF12 scFv复合物(图17C)以及hFSH与40nM的CF12 VL和40nM的CF12 VH的等摩尔混合物的复合物(图17D)。在刺激40分钟时比较发光应答的水平。

观察到，与0.1nM的hFSH复合的浓度为40nM的“CF12 VL”片段发挥非常显著的增强作用(p<0.001)，其与用单独的hFSH刺激相比，以与CF12 scFv相当的方式(增加180％)使细胞应答增加了218％(图17A)。与0.1nM的hFSH复合的浓度为40nM的“CF12 VH”片段发挥非常显著的增强作用(p<0.001)，其与用单独的hFSH刺激相比，以大于CF12 scFv(增加180％)的方式使细胞应答增加了250％(图17B)。

反向CF12 scFv(图17C)以与参考CF12 scFv相同的方式增强了FSH的作用，与FSH的应答相比，两者都给出了发光信号增加180％；这种作用是显著的(p<0.001)。

最后，与hFSH复合的两种CF12 VH+CF12 VL片段的混合物(图17D)在细胞应答上诱导了278％的显著增加(p<0.001)，其大于参考CF12 scFv(增加180％)。

所有这些结果表明分离的VL或VH片段能够对FSH的生物活性发挥增强作用。在这样做时，这些结果验证了在本发明的实施例6中描述的相互作用模型的预测，示出了两个可变链涉及FSH/受体复合物的相互作用。两个VL和VH片段的混合物在该测定中发挥最大的增强作用。

3/CF12 VL、CF12 VH和反向CF12 scFv片段对雌性大鼠中的FSH的生物活性的增强作用的体内测量

在已经体外表征后，在雌性大鼠中体内研究了多种CF12片段对hFSH的生物活性的增强作用。

为了测量FSH生物活性，使用的方案是如在本发明的实施例3中所描述的Steelman和Pohley的生物测定法(Steelman SL，Pohley FM.Endocrinology，53：604-616,1953)[12]。每批包括5只雌性大鼠。

结果示于图18中。用与反向CF12 scFv复合的hFSH处理的批次导致195±15mg/100g体重的卵巢平均重量，略高于用参照hFSH/复合有CF12 scFv处理的批次平均重量(160±5mg)，即与已经接受单独的激素处理的批次相比，增加了175％(p<0.01)。用与hFSH复合的CF12 VL和CF12 VH片段处理的批次分别地具有186±24mg和237±15mg的卵巢平均重量，换言之，与已经接受单独的激素治疗的批次相比，增加了167％和213％(p<0.05和p<0.001)。

这些结果证实，与hFSH复合的scFv(VL-VH对VH-VL)的构建顺序不影响scFv对FSH的生物活性的增强特性。结果还非常显著地证实，CF12的可变链，特别是VL片段，能够在体内和体外增强激素的生物活性。这反映了如通过本发明的实施例7中所描述的相互作用模型所预测的这两条链各自参与于这种作用中。

参考列表

1-专利EP 1518863

2-国际申请WO 2012/066519

3-Brochet et al.,Nucl.Acids Res.,36:W503-508,2008

4-Giudicelli et al.,Cold Spring Harb Protoc.,2011(6):695-715,2011

5-Giudicelli et al.,Nucl.Acids Res.,33:D256-261,2005

6-Corpet,Nucl.Acids Res.,16(22):10881-10890,1988

7-Ward et al.Nature,341:544-546,1989)

8-Li et al.,Afr.J.Biotechnol.,9(50):8549-8554,2010

9-Chopineau et al.,Mol.Cell Endocrinol.,92(2):229-239,1993

10-Wehbi et al.,Endocrinology,151(6):2788–2799,2010

11-Reverchon et al.,Human Reprod.,27(6):1790-1800,2012

12-Steelman SL,Pohley FM.,Endocrinology,53:604-616,1953

13-Scobey et al,Reprod.Biol.Endocr.3:61,2005

14-Bernauer et al.,Bioinformatics,5:555,2007

15-Bernauer et al.,Bioinformatics,24:652,2008

16-Bourquard et al.,PLoS One,6:e18541,2011

17-Bourquard et al.,Sci.Reports,5:10760,2015

18-Fan and Hendrickson,Nature,433:269,2005。

序列表

<110> 瑞普罗制药公司

埃洛迭·卡拉

杰里米·德库尔蒂耶

索菲·卡斯特雷

马里-克里斯蒂内·莫雷尔

<120> 增强促性腺素的生物活性的配体

<130> BNT213486PC00

<150> FR 1458469

<151> 2014-09-10

<160> 43

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CF12

<400> 1

cagggtcaga tgcagcagtc tggagctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaaga cttctggctt caccttcagc agtagctata taagttggtt gaagcaaaag 120

cctggacaga gtcttgagtg gattgcatgg atttatgctg gaactggtgg tactagctat 180

aatcagaagt tcacaggcaa ggcccaactg actgtagaca catcctccag cacagcctac 240

atgcaattca gcagcctgac aactgaggac tctgccatct attactgtgc aagacacggg 300

tcctactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CF12

<400> 2

Gln Gly Gln Met Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Ile Ser Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Trp Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Thr Gly Lys Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CF12

<400> 3

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttatat gaactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa tctagaatct 180

gggatcccag ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagc aaagtaatga ggatccgtac 300

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 333

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CF12

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR1 CF12

<400> 5

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR2 CF12

<400> 6

Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Gly Thr

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH-CDR3 CF12

<400> 7

Ala Arg His Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 8

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-CDR1 CF12

<400> 8

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL-CDR3 CF12

<400> 9

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 10

<211> 765

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScFv CF12

<400> 10

caggtgcagc tgcagcagtc gggtggcgca gagctggtga aaccgggtgc gagcgttaaa 60

ctgagctgca aaactagcgg ctttaccttt agctcgtcat atatttcgtg gctgaagcag 120

aaaccgggcc agtcactgga atggattgcg tggatctacg caggcacggg tggcacctca 180

tataatcaga aattcaccgg taaagcgcaa ctgacggtcg ataccagcag cagcacggcg 240

tacatgcagt tcagctcgct gaccactgaa gatagcgcaa tctactattg tgcacgccat 300

ggttcgtact tcgactattg gggccagggc accaccctga ccgtttcaag cggtggtggt 360

ggtagcggtg gtggtggttc aggtggcggc ggctcagata ttcagatgac ccagacccct 420

gcgagcctgg cagtgtcact gggccaacgc gcaaccatct cgtgtaaagc ctcgcagagc 480

gtggattatg acggcgatag ctacatgaac tggtatcagc aaaagcctgg tcaaccgccg 540

aagctgctga tttacgccgc cagcaacctg gaatcgggca tcccggcccg ttttagcggc 600

tcaggctcgg gtactgactt cacgctgaac attcacccgg tagaagaaga agacgcggcc 660

acgtattact gccagcaaag caatgaagac ccgtacactt ttggcggcgg cacgaaactc 720

gagatcaaac accatcacca tcaccattaa ctcgagatca agtaa 765

<210> 11

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ScFv CF12

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Ile Ser Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Ala Trp Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys

50 55 60

Phe Thr Gly Lys Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg His Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala

130 135 140

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

180 185 190

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Ile Lys His His His His His His

245

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VHRev1

<400> 12

cgggatcctc tagaggtcca actgcaggag tcagg 35

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VHRev2

<400> 13

agatctagaa agcttaggtc aagctgcagc agtcagg 37

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MuCFor

<400> 14

ggggaagaca tttgggaagg 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev2

<400> 15

gatattgtga tgacgcaggc t 21

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev3

<400> 16

gatattgtga taacccag 18

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev4

<400> 17

gacattgtgc tgacccaatc t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev5

<400> 18

gacattgtga tgacccagtc t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKRev8

<400> 19

gacatccagc tgactcagtc t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MKC5For

<400> 20

ggatacagtt ggtgcagcat c 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CF12VH_Fw

<400> 21

cagkaactgc aggtgtccwc t 21

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CF12VH_Rev

<400> 22

ctggaggatg tgtctacagt cag 23

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CF12VL_Fw

<400> 23

ctgctatggg tgctgctgct c 21

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CF12VL-Rev

<400> 24

agattggatg cagcatagat gag 23

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 连接子

<400> 25

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv的VL片段

<400> 26

Leu Glu Ile Lys His His His His His His Leu Glu Ile Lys Val Asp

1 5 10 15

<210> 27

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CF12

<400> 27

gatattcaga tgacccagac ccctgcgagc ctggcagtgt cactgggcca acgcgcaacc 60

atctcgtgta aagcctcgca gagcgtggat tatgacggcg atagctacat gaactggtat 120

cagcaaaagc ctggtcaacc gccgaagctg ctgatttacg ccgccagcaa cctggaatcg 180

ggcatcccgg cccgttttag cggctcaggc tcgggtactg acttcacgct gaacattcac 240

ccggtagaag aagaagacgc ggccacgtat tactgccagc aaagcaatga agacccgtac 300

acttttggcg gcggcacgaa acttgagatc aaacaccatc accatcacca ttaa 354

<210> 28

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL CF12

<400> 28

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys His

100 105 110

His His His His His

115

<210> 29

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CF12

<400> 29

caggtgcagc tgcagcagtc gggtggcgca gagctggtga aaccgggtgc gagcgttaaa 60

ctgagctgca aaactagcgg ctttaccttt agctcgtcat atatttcgtg gctgaagcag 120

aaaccgggcc agtcactgga atggattgcg tggatctacg caggcacggg tggcacctca 180

tataatcaga aattcaccgg taaagcgcaa ctgacggtcg ataccagcag cagcacggcg 240

tacatgcagt tcagctcgct gaccactgaa gatagcgcaa tctactattg tgcacgccat 300

ggttcgtact tcgactattg gggccagggc accaccctga ccgtttcaag ccaccatcac 360

catcaccatt aa 372

<210> 30

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH CF12

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly

1 5 10 15

Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

20 25 30

Ser Tyr Ile Ser Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Ala Trp Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys

50 55 60

Phe Thr Gly Lys Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg His Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser His His His His His His

115 120

<210> 31

<211> 750

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ScFv CF12 反向

<400> 31

gatattcaga tgacccagac ccctgcgagc ctggcagtgt cactgggcca acgcgcaacc 60

atctcgtgta aagcctcgca gagcgtggat tatgacggcg atagctacat gaactggtat 120

cagcaaaagc ctggtcaacc gccgaagctg ctgatttacg ccgccagcaa cctggaatcg 180

ggcatcccgg cccgttttag cggctcaggc tcgggtactg acttcacgct gaacattcac 240

ccggtagaag aagaagacgc ggccacgtat tactgccagc aaagcaatga agacccgtac 300

acttttggcg gcggcacgaa acttgagatc aaaggtggtg gtggtagcgg tggtggtggt 360

tcaggtggcg gcggctcaca ggtgcagctg cagcagtcgg gtggcgcaga gctggtgaaa 420

ccgggtgcga gcgttaaact gagctgcaaa actagcggct ttacctttag ctcgtcatat 480

atttcgtggc tgaagcagaa accgggccag tcactggaat ggattgcgtg gatctacgca 540

ggcacgggtg gcacctcata taatcagaaa ttcaccggta aagcgcaact gacggtcgat 600

accagcagca gcacggcgta catgcagttc agctcgctga ccactgaaga tagcgcaatc 660

tactattgtg cacgccatgg ttcgtacttc gactattggg gccagggcac caccctgacc 720

gtttcaagcc accatcacca tcaccattaa 750

<210> 32

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ScFv CF12 反向

<400> 32

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val

115 120 125

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

130 135 140

Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser Tyr

145 150 155 160

Ile Ser Trp Leu Lys Gln Lys Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile Ala

165 170 175

Trp Ile Tyr Ala Gly Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Thr

180 185 190

Gly Lys Ala Gln Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

195 200 205

Gln Phe Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg His Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser His His His His His His

245

<210> 33

<211> 92

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hFSH, hCG和HLH的α亚基

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Xaa = Leu 或Phe

<400> 33

Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro

1 5 10 15

Xaa Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys

20 25 30

Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu

35 40 45

Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser

50 55 60

Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr

65 70 75 80

Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser

85 90

<210> 34

<211> 96

<212> PRT

<213> 绵羊

<220>

<221> misc_feature

<223> oLH和oFSH的α亚基

<400> 34

Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu

1 5 10 15

Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro Ile Tyr Gln Cys

20 25 30

Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys

35 40 45

Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys

50 55 60

Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val

65 70 75 80

Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser

85 90 95

<210> 35

<211> 96

<212> PRT

<213> 野猪

<220>

<221> misc_feature

<223> pLH和 pFSH的α亚基

<400> 35

Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu

1 5 10 15

Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Leu Gly Ala Pro Ile Tyr Gln Cys

20 25 30

Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys

35 40 45

Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys

50 55 60

Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Ala Arg Val

65 70 75 80

Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser

85 90 95

<210> 36

<211> 111

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hFSH的β亚基

<400> 36

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu

1 5 10 15

Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys

20 25 30

Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln

35 40 45

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro

50 55 60

Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr

65 70 75 80

Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val

85 90 95

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu

100 105 110

<210> 37

<211> 132

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hCG的β亚基

<400> 37

Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu

1 5 10 15

Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn Thr Thr

20 25 30

Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Gln Gly Val

35 40 45

Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg Asp Val Arg Phe

50 55 60

Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asn Pro Val Val

65 70 75 80

Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu Cys Arg Arg Ser

85 90 95

Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys Asp Asp

100 105 110

Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu

115 120 125

Pro Ser Pro Ser

130

<210> 38

<211> 123

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hLH的β亚基

<400> 38

Ser Arg Glu Pro Leu Arg Pro Arg Pro Trp Cys His Pro Ile Asn Ala

1 5 10 15

Ile Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr Val Asn

20 25 30

Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Met Arg Val Leu Gln

35 40 45

Ala Val Leu Pro Pro Leu Pro Gln Val Val Cys Thr Tyr Arg Asp Val

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val Asp Pro

65 70 75 80

Val Val Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys Arg Cys Gly Pro Cys Arg

85 90 95

Arg Ser Thr Ser Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu Thr Cys

100 105 110

Asp His Pro Gln Leu Ser Gly Leu Leu Phe Leu

115 120

<210> 39

<211> 121

<212> PRT

<213> 绵羊

<220>

<221> misc_feature

<223> oLH的β亚基

<400> 39

Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Gln Pro Ile Asn Ala Thr Leu

1 5 10 15

Ala Ala Glu Lys Glu Ala Cys Pro Val Cys Ile Thr Phe Thr Thr Ser

20 25 30

Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Leu Ser Met Lys Arg Val Leu Pro Val Ile

35 40 45

Leu Pro Pro Met Pro Gln Arg Val Cys Thr Tyr His Glu Leu Arg Phe

50 55 60

Ala Ser Val Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val Asp Pro Met Val

65 70 75 80

Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro Cys Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Thr Asp Cys Gly Gly Pro Arg Thr Gln Pro Leu Ala Cys Asp His

100 105 110

Pro Pro Leu Pro Asp Ile Leu Phe Leu

115 120

<210> 40

<211> 121

<212> PRT

<213> 野猪

<220>

<221> misc_feature

<223> pLH的β亚基

<400> 40

Ser Arg Gly Pro Leu Arg Pro Leu Cys Arg Pro Ile Asn Ala Thr Leu

1 5 10 15

Ala Ala Glu Asn Glu Ala Cys Pro Val Cys Ile Thr Phe Thr Thr Ser

20 25 30

Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Ser Met Val Arg Val Leu Pro Ala Ala

35 40 45

Leu Pro Pro Val Pro Gln Pro Val Cys Thr Tyr Arg Glu Leu Ser Phe

50 55 60

Ala Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val Asp Pro Thr Val

65 70 75 80

Ser Phe Pro Val Ala Leu Ser Cys His Cys Gly Pro Cys Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Ser Asp Cys Gly Gly Pro Arg Ala Gln Pro Leu Ala Cys Asp Arg

100 105 110

Pro Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu

115 120

<210> 41

<211> 110

<212> PRT

<213> 绵羊

<220>

<221> misc_feature

<223> oFSH的β亚基

<400> 41

Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu Cys

1 5 10 15

Ser Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr

20 25 30

Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys

35 40 45

Ala Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro Gly

50 55 60

Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Glu

65 70 75 80

Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Arg Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg

85 90 95

Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Asp Ile Arg Glu

100 105 110

<210> 42

<211> 109

<212> PRT

<213> 野猪

<220>

<221> misc_feature

<223> pFSH的β亚基

<400> 42

Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu Cys Gly

1 5 10 15

Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr

20 25 30

Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys Thr

35 40 45

Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro Gly Cys

50 55 60

Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Glu Cys

65 70 75 80

His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly

85 90 95

Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Ser Glu Met Lys Glu

100 105

<210> 43

<211> 49

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<223> hFSH受体的N末端区域

<400> 43

Cys His His Arg Ile Cys His Cys Ser Asn Arg Val Phe Leu Cys Gln

1 5 10 15

Glu Ser Lys Val Thr Glu Ile Pro Ser Asp Leu Pro Arg Asn Ala Ile

20 25 30

Glu Leu Arg Phe Val Leu Thr Lys Leu Arg Val Ile Gln Lys Gly Ala

35 40 45

Phe

Claims

1.一种增强FSH、促黄体生成素(LH)和绒毛膜促性腺素(CG)的生物活性的促卵泡激素(FSH)配体，其特征在于，所述配体是抗体或其片段，并且在于：

重链可变区包含以下CDR：

-由序列GFTFSSSY(SEQ ID NO：23)限定的VH-CDR1；

-由序列IYAGTGGT(SEQ ID NO：24)限定的VH-CDR2；

-由序列ARHGSYFDY(SEQ ID NO：25)限定的VH-CDR3；以及

轻链可变区包含以下CDR：

-由序列QSVDYDGDSY(SEQ ID NO：26)限定的VL-CDR1；

-由序列AAS限定的VL-CDR2；

-由序列QQSNEDPYT(SEQ ID NO：27)限定的VL-CDR3。

2.根据权利要求1所述的配体，其特征在于，所述配体选自由以下各项组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dsFv、scFv、双抗体、三抗体、四抗体和纳米抗体。

3.根据权利要求1所述的配体，其特征在于，所述配体是由CNCMI-4803杂交瘤产生的CF12单克隆抗体。

4.根据权利要求2所述的配体，其特征在于，所述scFv的肽序列是序列SEQ ID NO：33。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的配体，用于作为药物的用途。

6.一种配体-促性腺素复合物，选自：

根据权利要求1至4中任一项所述的配体与FSH或其活性肽的复合物；

根据权利要求1至4中任一项所述的配体与LH或绒毛膜促性腺素(CG)激素或所述激素的活性肽的复合物。

7.根据权利要求6所述的复合物，用于作为药物的用途。

8.根据权利要求5所述的配体或根据权利要求7所述的复合物，其中，所述药物旨在诱导雌性哺乳动物中的排卵或多排卵。

9.根据权利要求5所述的配体或根据权利要求7所述的复合物，其中，所述药物旨在增加雌性哺乳动物中的循环内源性孕酮水平。

10.一种用于诱导雌性哺乳动物中的排卵或多排卵的药物组合物，其特征在于，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的配体和/或根据权利要求6所述的复合物以及药学上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含FSH和/或LH和/或CG。

12.根据权利要求1至4中任一项所述的配体或根据权利要求6所述的复合物，用于在治疗和/或预防哺乳动物的不育或低生育力中的用途。

13.根据权利要求1至4中任一项所述的配体或根据权利要求6所述的复合物，用于在雌性哺乳动物中刺激生殖的用途。