JPH11263799A - 受精能を変化させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】血中を循環するルトロピン（ＬＨ）活性を有す
る糖蛋白質ホルモンの活性および／またはレベルを減少
させることにより受精能を増強する方法を提供する。 【解決手段】Ｎ−末端における脊椎動物のゴナドトロピ
ンβ−サブユニットと、Ｃ−末端における脊椎動物α−
サブユニットと、脊椎動物のゴナドトロピンβ−サブユ
ニットを脊椎動物α−サブユニットに結合させる１〜１
６個のアミノ酸残基を有するリンカーとからなる単一鎖
ゴナドトロピン。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ルトロピン（Ｌ
Ｈ）活性を有する循環する糖蛋白質ホルモンの活性およ
び／またはレベルを減少させることによる受精能の増大
方法に関するものである。本発明の分子は、ＬＨの生物
学的活性を減少させる抗体または他の結合剤である。さ
らに本発明は、ＬＨおよびヒト絨毛性ゴナドトロピン
（ｈＣＧ）を包含する蛋白の特定部分に対する抗体を開
発および／または選択して、その生物学的活性を所望程
度まで減少させることができる新規な方法にも関するも
のである。さらに本発明は、ＬＨ活性を有するホルモン
の活性を減少させ、かつ／またはフォリトロピン活性を
有するホルモンの活性を増大させる新規な糖蛋白質ホル
モン作用剤および拮抗剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】発明の背景を説明すると共にその実用に
関し一層詳細に説明すべくここに引用した開示を参考の
ためここに引用し、便利には以下の文中に数字で示し、
それぞれ添付文献に分類する。

【０００３】糖蛋白質ホルモン群（１）は、下垂体前葉
腺に存在してそこで作成される３種のα，βヘテロ二量
体の糖蛋白質で構成される。これら糖蛋白質ホルモンは
黄体形成ホルモン（ルトロピンもしくはＬＨとしても知
られる）、濾胞刺激ホルモン（フォリトロピンもしくは
ＦＳＨ）および甲状腺刺激ホルモン（チロトロピンもし
くはＴＳＨとしても知られる）である。人間からのホル
モンはそれぞれｈＬＨ、ｈＦＳＨおよびｈＴＳＨとして
知られる。ある動物種類において、ＬＨと呼ばれる絨毛
性ゴナドトロピンもしくはＣＧに構造上類似した糖蛋白
質ホルモンは胎盤により作成されて循環系に放出され
る。人間において、この糖蛋白質ホルモンはｈＣＧと呼
ばれる。霊長類において、これら全てのホルモンは著量
に尿中に排泄物質としても見られる。下垂体前葉部から
のＬＨおよびＦＳＨの分泌が著しく増大する閉経期の
後、著量のＬＨおよびＦＳＨが尿中に見られる。閉経期
の女性から得られる尿のゴナドトロピン抽出物はヒト閉
経ゴナドトロピン（ｈＭＧ）と呼ばれる。ＬＨ受容体に
はＬＨと同様に作用するがＦＳＨ受容体には極く僅かし
か相互作用しないｈＣＧとは異なり、ｈＭＧはＬＨおよ
びＦＳＨの両受容体に対し相互作用する。ｈＭＧの二重
活性はｈＬＨ、ｈＦＳＨおよびその代謝物の尿抽出物に
おける存在に起因する。妊娠女性および閉経女性から得
られる尿はゴナドトロピン活性の主たる原料であって、
重要な産業上の用途を有する。

【０００４】たとえばＦＳＨ、ＬＨおよび幾つかの種に
おいて、ＣＧのようなゴナドトロピンが繁殖過程にて主
たる役割を果たす一方（１〜６）、構造上関連したホル
モン（すなわちＴＳＨ）は甲状腺機能に重要である
（１）。ＬＨおよびＦＳＨの両者は思春期および正常な
繁殖機能につき必須である。適する時点における充分量
のＦＳＨ、ＬＨもしくはｈＣＧの欠如は不妊症または妊
娠停止をもたらす。過剰量のこれらホルモンは尚早な思
春期または生殖腺の過敏症をもたらし得る。男性におい
て、ＦＳＨは精子形成の開始および維持に必須である
（７、８）。ＦＳＨの免疫中和は精子形成の低下と受精
能の喪失とをもたらす。女性において、ＦＳＨは排卵に
際し女性生殖体の産生をもたらす濾胞の発達に必須であ
る。多卵胞性卵巣病は女性における不妊症の一般的な原
因であって、不完全な濾胞の発達を特徴とする症状であ
る。受精能は一般にＦＳＨもしくはｈＭＧの投与により
回復することができる。しばしば受精能は抗エストロゲ
ン（すなわちＦＳＨ分泌に対するエストロゲンの陰性フ
イードバック作用を抑制する化合物）での処理によりＦ
ＳＨレベルを上昇させて回復することもできる。男性に
おいてはＬＨが思春期につき必要とされ、これが存在し
ないと性的特徴および成人の受精能を獲得することがで
きない。ＬＨは主として睾丸におけるアンドロゲンの合
成をもたらす。これらステロイドは精子形成に有利な影
響を有し、以上に高レベルのアンドロゲンは開始された
後の精子形成を維持することができる（９）。女性にお
いて、ＬＨは排卵および黄体の形成につき必須である。
さらにＬＨは濾胞の発達に対しＦＳＨとの相乗作用を有
し（４）、濾胞性アンドロゲンの合成を促進することが
周知されている。これらアンドロゲンはＦＳＨ刺激され
たエストロゲン形成の先駆体として作用する。さらにＬ
Ｈは、特に顆粒膜細胞がＬＨ受容体を獲得した際の濾胞
成熟の後期段階にて、顆粒膜細胞に対するＦＳＨの作用
を開始させることもできる。栄養芽細胞により作成され
たｈＣＧは、早期ヒト妊娠に際し黄体からのプロゲスト
ロン分泌の維持につき重要である。これらホルモンの臨
床的活性およびその使用についてはイエンおよびヤッフ
ェによる文献（２）を含め幾つかの標準的刊行物に広く
検討されている。

【０００５】ＦＳＨとＬＨとの作用における相違および
これら２種のホルモン間における複雑な内分泌相互作用
は、これらホルモンにより濾胞の発達およびエストラジ
オール合成につき相乗作用を生させる（４）。たとえば
正常な卵巣エストロゲン生成はアンドロゲン生成に対す
るＬＨの作用およびアンドロゲンからエストラジオール
への変換に対するＦＳＨの作用に起因する。次いで、エ
ストラジオールは下垂体からのＦＳＨ分泌を抑制するこ
とができる。正常な月経周期に際し、ＦＳＨレベルは濾
胞が拡大して増加量のエストラジオールを分泌する際に
低下する。エストラジオール量が濾胞期に際し充分量に
達すると、これらは下垂体からのＬＨ分泌の増加を開始
させて排卵をもたらしうる。ＬＨ／ＦＳＨ活性の比およ
び血液におけるホルモンの絶対量が、たとえば月経周期
および発情サイクルに際し適正個数の卵母細胞の排卵な
ど繁殖機能につき重要である。

【０００６】ＬＨおよびＦＳＨの両者の分泌をステロイ
ドホルモンにより抑制することができるが、ＦＳＨの分
泌は一般にエストロゲンによる陰性フィードバック調整
に対しＬＨの分泌よりも鋭敏である。実際に、多くの動
物種類において高レベルのエストロゲンは、特にプロゲ
ステロン量が低くなければＬＨの分泌を増加させうる。
抗エストロゲン、すなわちＦＳＨ分泌に対するエストラ
ジオールの正常な陰性フィードバック調節を破壊する化
合物）を投与すれば、しばしばＦＳＨ放出を増大させる
と共に生殖体産生をも増大させる。臨床的に、抗エスト
ロゲンは多卵胞性卵巣病を有する女性における排卵の確
立を増大させるべく広く使用される。残念ながら、ＦＳ
Ｈ分泌に対するエストラジオールのマイナス作用は排卵
の時点まで発生する濾胞の個数の調節につき部分的な原
因となるので、正常なエストロゲン−ＦＳＨ陰性フィー
ドバックループの破壊は不適正な個数の卵子を流出させ
うる。ＦＳＨ分泌の陰性フィードバック調整を除去する
ことなくＦＳＨ分泌を増大させるメカニズムは、受精能
を増大させる貴重な用途を有する。

【０００７】精製されたＦＳＨは、特にある種の内在性
ＬＨも存在すれば、女性における濾胞の発達を刺激する
ことができる。ＦＳＨ／ＬＨの比は、濾胞の発達が開始
される月経周期の時点で最高となる。しかしながら、両
ホルモンが受精能につき必須である。ＬＨの免疫中和は
雄および雌における不妊症をもたらす（１０〜１２）。
同様に、ＣＧ（すなわちＬＨ受容体を介し作用するホル
モン）の免疫中和も霊長類にて受精能を阻止することが
示された（１３〜１６）。ＬＨに対する抗体は、受精能
を刺激することが従来示されていない。

【０００８】ｈＣＧに対するモノクローナル抗体（ｈＣ
Ｇ−ｍＡｂと称する）は、in vitroにて受容体に対する
ｈＣＧの結合を抑制することが示されている（１７）。
エピトープの位置に応じ、ｈＣＧ−ｍＡｂはＬＨ受容体
に対するｈＣＧの結合を抑制する異なる能力を有する。
Ｂ１０５およびＢ１１０は、ホルモンがＬＨ受容体に結
合する際に露出され続けるｈＣＧおよびＬＨにおけるエ
ピトープを認識するモノクローナル抗体の例である。こ
れらモノクローナル抗体とホルモンとの複合体は、遊離
ホルモンよりも低い親和性を有するが、ＬＨ受容体に結
合する。その結果、これら抗体はＬＨ受容体に対するホ
ルモンの結合を抑制する。しかしながら、過剰の抗体の
存在下で観察される最大の抑制程度は１００％未満であ
り、ＬＨ受容体に結合しないホルモンとの複合体を形成
する抗体よりも低い。充分量のＢ１０５もしくはＢ１１
０の存在下で、生物学的反応を誘発するのに必要なホル
モンの量は増加する。すなわち、実際に分析にて全ての
遊離ｈＣＧもしくはＬＨを結合するのに充分な大過剰の
抗体でさえ、ホルモン−抗体複合体の濃度が閾値レベル
を越えれば、いずれのホルモンに対する反応をも防止す
ることができない。

【０００９】上記したよに、ＬＨの免疫中和は数年前に
受精能を妨げることが示された。この現象は、これら試
験に用いた抗血清がＬＨの生物学的活性を中和したため
に生ずる。しかしながら、適正な抗血清またはＢ１０５
もしくはＢ１１０のような抗体を使用する場合はＬＨの
生物学的活性が除去されない。寧ろ、これは所定量だけ
減少する。このようになると、アンドロゲン合成が減少
する。アンドロゲンはエストロゲンの先駆体であるた
め、エストロゲン合成も減少する。エストラジオールの
低下は、ＬＨ分泌に対するよりもＦＳＨ分泌に対し大き
い衝撃を与える。ＦＳＨ分泌が増大し、これはＦＳＨ／
ＬＨの比を増大させると共に濾胞の発達を増大させる。
雌において、このＦＳＨ／ＬＨの比は濾胞の発達の増加
をもたらす。雄において、このＦＳＨ／ＬＨの比はセル
トリ細胞機能の増大および精子形成の増加をもたらす。

【００１０】ＬＨレベルの減少に基づき受精能を増大さ
せる手法は従来使用されていない。これは１部にはＬＨ
に対する抗体が受精能を抑制すると言う多くの報告に起
因し、ＬＨ活性を減少させるが中和しない抗体を作成お
よび選択する方法は従来未知であった。したがって、受
精能に対するこの手法は成功を収めないと予想される。
後記するように、受精能を増大させるこの手法は、主と
してＬＨおよびＦＳＨをその下垂体から作成および放出
する女性にて、現在の技術に関し幾つかの利点を有す
る。ＬＨレベルの減少は下垂体機能に対するエストラジ
オールとＦＳＨとの間の正常な内分泌フイードバック関
係を破壊しないので、現存する技術よりも卵巣過敏症の
誘発の機会はずっと少ない。このことは、高価かつ要求
される患者の監視に関し要求が少ないことを意味する。
さらに、受精能を誘発するには１回のみあるいは多くと
も数回の処置しか必要でない。

【００１１】受精能を増大させる他の新規な方法は、月
経周期の濾胞期に際しＬＨ拮抗剤を用いることである。
数年間にわたり、糖蛋白質ホルモンにおけるオリゴ糖鎖
がシグナル伝達を示す能力につき必須であることが知ら
れている（１）。炭水化物残基を欠損する糖蛋白質ホル
モンは、生物学的反応を示す能力を阻害した。これらア
ナログを使用して受容体に対するＬＨの結合を阻止する
ことができる。これは循環ＬＨの能力を減少させること
により受精能を向上させる。脱グリコシル化されたゴナ
ドトロピンは短い生物学的半減期を有することが判明し
ており、その初期の所定用途には有用でないと判明し、
すなわち黄体プロゲステロン合成を減少させると共に流
産させて受精能を抑制することが判明した。グリコシル
化シグナル（すなわちアミノ酸配列：アスパラギン−Ｘ
−スレオニンもしくはアスバラギン−Ｘ−セリン（ここ
でＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である））を１部
位から除去すると共にαおよびβ−サブユニットの他の
部位にグリコシル化シグナルを形成させてホルモンの他
の部分まで炭水化物残基を移動させることにより、充分
長い半減期を有する減少した作用剤活性を有する有用な
アナログを設計することができる。さらに、αおよびβ
−サブユニットが共有結合した単一鎖ゴナドトロピンを
作成することにより、循環におけるホルモンの安定性を
増大させることもできる。これは、ヘテロ二量体 ゴナ
ドトロピンの受容体結合活性および血漿半減期がいずれ
のサブユニットよりも大であるからである。共有結合は
循環における２種のサブユニットの結合を防止する。

【００１２】受精能の刺激が不妊症カップルに受精能を
回復させるのに重要であるが、受精能の抑制はしばしば
家族設計の方法として望ましい。さらに、受精能の抑制
は家畜の産業生産にも有用である。何故なら、これは去
勢の必要性を排除しあるいは飼育場で飼育されるウシ群
における発情を防止するからである。イヌおよびネコを
含む他の動物における受精能の抑制も、これらを卵巣切
除または去勢する代案として望ましい。ウマにおける受
精能の抑制も、特に逆転させうれば去勢ウマにつき好ま
しい。上記したように、受精能はＬＨもしくはＦＳＨに
対する中和抗体の投与により抑制することができる。さ
らに、これら抗体の生成を誘発させるワクチンを用いて
抑制することもできる。妊娠を維持するｈＣＧの作用に
基づき、ｈＣＧ分泌もしくは活性の低下をもたらす処置
も不妊症を生ぜしめると予想される。女性においては、
ｈＬＨもしくはｈＦＳＨでなくｈＣＧを抑制して受精能
を抑制することが一層望ましい。これは、ｈＬＨもしく
はｈＦＳＨを中和する処置が卵巣機能の停止をもたらす
と共に閉経期に関連する諸問題の開始を促進するからで
ある。ウシおよび他の家畜動物においては、ＬＨを抑制
して思春期を防止しあるいは発情を抑えることが一層重
要である。上記したように、絨毛性ゴナドトロピンに対
する適正な抗体は霊長類および女性にて受精能を抑制す
ることができ、ｈＣＧに対する抗体の発生は永年にわた
り重要かつ有力な避妊法であると認識されている（１
８）。ｈＣＧは多数のヒト癌により生成されると共にｈ
ＣＧに対する抗体はこれら腫瘍を破壊しうるので、免疫
処理はさらに癌療法もしくは予防に対し有益な作用をも
有する（１９）。

【００１３】この種のｈＣＧに基づく避妊ワクチンをｈ
ＣＧと他の糖蛋白質ホルモンとの相違を考慮して案出す
るため幾つかの試験がなされている（１４、１８）。残
念ながら、ワクチンの開発は全ての糖蛋白質ホルモンの
間の構造の相同性により妨げられている。好適免疫原は
高い抗原性を有し、しかもたとえばヒトＦＳＨ、ＬＨも
しくはＴＳＨのような他の糖蛋白質と交叉反応する抗体
を誘発させてはならない。上記糖蛋白質ホルモン活性の
知見に基づきＬＨ、ＦＳＨもしくはＴＳＨと相互作用す
る抗体を誘発したワクチンは、不妊症および／または甲
状腺機能の阻止をもたらすであろう。残念ながら、ＬＨ
もしくはＦＳＨの中和は正常な月経周期の停止および女
性における受精能に関連したエストロゲン産生の喪失を
もたらす。卵巣機能の停止は、閉経期に伴う骨粗鬆症お
よび他の諸問題の尚早な発生をもたらすと思われる。甲
状腺機能の抑制は甲状腺機能低下をもたらす。ｈＣＧお
よびｈＬＨの構造における類似性は、特に交叉反応性抗
体を発生させない好適な免疫原の設計を困難にする。ｈ
ＣＧβ−サブユニット特異的Ｃ−末端に対する抗体を作
成すべく多くの努力がなされている。何故なら、この分
子部分はｈＬＨに見られないからである（１）。しかし
ながら、この領域は殆ど抗原性はない。免疫原を開発す
る努力も用いられ、β−サブユニットから得られるペプ
チド（１４）、β−サブユニットと他の蛋白との結合体
（２０）、またはｈＣＧβ−サブユニット結合体を含有
するヘテロ二量体、並びにヒツジα−サブユニット（１
８）も用いられている。残念ながら、これら免疫原の大
部分は殆ど効果的でなく、より良好な免疫原がこの方法
を実用的にすべく必要とされる。

【００１４】ｈＣＧに基づくワクチンを開発する困難性
は、糖蛋白質ホルモンの構造を理解すれば了解すること
ができる。糖蛋白質ホルモンは全て共通のα−サブユニ
ットを有する。α−サブユニットの部分の構成は全ての
ホルモンにて相違すると共にモノクローナル抗体の選択
により識別することができるが（２１）、α−サブユニ
ットの部分は各糖蛋白質ホルモンにて同じ構成を有す
る。従って、α−サブユニットに対する多くの抗体はＬ
Ｈ、ＦＳＨ、ｈＣＧおよびＴＳＨを識別する。抗−α−
サブユニット抗体はしばしばホルモンの活性を阻害でき
るので（２２）、α−サブユニットに対する反応を誘発
した免疫原は望ましくない副作用を有すると思われる。
したがって、避妊ワクチンを開発する殆どの対策はｈＣ
Ｇのホルモン特異性β−サブユニットに向けられる。

【００１５】ｈＣＧのβ−サブユニットはｈＬＨのβ−
サブユニットに最も近縁である。完全ｈＣＧβ−サブユ
ニットに向けられる多くの抗体はＬＨ β−サブユニッ
トにも結合する。他のホルモンのβ−サブユニットはｈ
ＣＧのβ−サブユニットとは相当に異なるが、全てのβ
−サブユニットにおける幾つかの残基は同一であって、
少ないながらある程度の抗−β−サブユニット抗体はこ
れらホルモンとも交叉反応する可能性がある。ｈＣＧ
β−サブユニットのカルボキシ末端３１アミノ酸（ＣＴ
Ｐ）は、他の糖蛋白質ホルモンにおける残基には無関係
である。理論的に、この領域に対する抗体は他のホルモ
ンとの交叉反応を示すことができない。予想通り、この
領域を免疫原として使用すれば、他の糖蛋白質ホルモン
とは交叉反応しない抗体が発生する。残念ながら、合成
ＣＴＰペプチドに対し産生される抗体はｈＣＧに対し高
親和性を以て結合しない。これは、部分的にｈＣＧのこ
の領域が４個の有力なセリン結合グリコシル化部位を有
すると共に高度にグリコシル化されるという観察に基づ
く。さらに、このｈＣＧの領域の殆どはＬＨ受容体との
相互作用につき必須でない。したがって、ｈＣＧのＣＴ
Ｐに向けられる抗体はｈＣＧ受容体複合体に結合し、主
として非中和性型である。その結果、これらはＬＨ受容
体に対するｈＣＧの結合を防止するＢ１０１のような抗
体と同様なｈＣＧ作用を抑制しない（２２）。

【００１６】さらに、ｈＣＧ β−サブユニットの他の
部分に対する抗体を開発すべく努力がなされている。広
く検討されている１つの領域は、システイン残基３８と
５７との間に存在する領域である。蛋白質のこの部分は
大きいループを形成することが知られ、研究が示した所
ではこのループはステロイド産生を刺激することができ
る（２３、２４）。したがってこのループに対する抗体
は中和性型であると予想される。実際に、Ｂ１０１（す
なわち、このループ内の残基を識別することが示された
抗体（２２、２５、２６））はｈＣＧ活性を中和するこ
とができる。このループ構造を用いることに伴う問題
は、産生される抗体がしばしば低い親和性を有すること
である。さらにｈＣＧおよびｈＬＨはこの分子領域にて
類似する（すなわち、相違する３個のアミノ酸しか存在
しない）ので、このループでの免疫処理はｈＬＨに対す
る抗体の産生をもたらすと予想される。実際に、Ｂ１０
１（すなわち、この分子領域に結合する抗体は）ｈＬＨ
につき許容しえない高い親和性を有する。

【００１７】糖蛋白質ホルモンの三次構造を同定する最
近の努力はモノクローナル抗体のパネルにおける結合部
位の特性化に依存している（２６）。ｈＣＧの生物学的
活性を抑制しあるいは生物学的活性を部分的にのみ中和
する抗体が同定されている。本発明の実施例７に要約す
るように、これらおよび同様な抗体を使用して、後記実
施例６および７に要約する陽性および陰性選択手法を用
い、ｈＣＧを中和するがｈＬＨを中和しない能力を有す
る免疫原を開発することができる。これらホルモンは結
晶化されておりかつ結晶構造は分子の特定部分に対する
高い力価の免疫反応を与える免疫原の種類を決定するの
に貴重であるが、結晶構造を解明する困難性はこの手法
を排除している。すなわち、ｈＣＧ構造に関する現在の
知識状態にて、最も効果的である免疫原の種類を予測す
べく使用できる良好な方法は存在しない。

【００１８】受精能を増大させる他の有用な方法はＦＳ
Ｈ活性のレベルを増大させることである。これを達成す
る１つの方法は少量の長時間作用性フォリオトロピンを
投与することである。これらは、フォリオトロピン活性
を有する分子を長い血漿半減期を有する分子（すなわち
免疫グロブリン）に結合させてあるいはフォリオトロピ
ン活性を有する単一鎖ゴナドトロピンのアナログを作成
して達成することができる（第１表および第２表）。単
独であるいはＬＨに対する抗体および／またはＬＨ拮抗
剤と組合せてこれらホルモンは多卵胞性卵巣病を有する
女性にて濾胞の発達を容易化させる。

【００１９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ルトロピン
（ＬＨ）活性を有する循環する糖蛋白質ホルモンの活性
および／またはレベルを減少させることによる受精能の
増大方法に関する。本発明の分子は、ＬＨの生物学的活
性を減少させる抗体または他の結合剤である。さらに本
発明は、生物学的活性を所望する程度まで減少させ得る
ＬＨおよびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を含む
蛋白の特定部分に対する抗体を工夫および／または選択
するための新規な方法にも関する。さらに本発明は、受
精能の刺激および抑制においての使用、および卵巣過敏
症を制御に対する単一サブユニットゴナドトロピンおよ
びゴナドトロピン拮抗剤の調製に関するものである。

【００２０】

【課題を解決するための手段】本発明は、ルトロピン
（ＬＨ）活性を有する循環糖蛋白質ホルモンの活性およ
び／またはレベルを減少させることによる受精能の増大
方法に関するものである。本発明の分子は、ＬＨの生物
学的活性を減少させる抗体または他の結合剤である。結
合剤は、免疫処理に呼応して投与しあるいは生成させる
ことができる。ルトロピン活性を有する分子は受精能に
つき必須であるため、その活性の阻止は受精能を増大さ
せずに低下させると予想される。しかしながら、ルトロ
ピンは一般に、フォリロピン（ＦＳＨ）すなわち受精能
に重要な役割を果たすホルモンの分泌を減少さることが
できるステロイドの産生を増大させることが判明した。
その結果、ルトロピンの活性低下はフォリトロピンのレ
ベルおよび／またはフォリトロピン／ルトロピンの比率
の増加をもたらす。ＬＨ活性が排除されずに減少させら
れる場合、ＦＳＨ活性および／またはＦＳＨ／ＬＨの比
率の増加は人間および動物における生殖体の産生増加お
よび受精能の上昇をもたらす。本発明はさらに、ＬＨお
よびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を包含する蛋
白質の特定部分に対する抗体を工夫および／または選択
して生物学的活性を所望する程度まで減少させることが
できる新規な方法にも関するものである。選択されたゴ
ナドトロピンの特異的部分に対する抗体および免疫原、
たとえば構造が極めて類似する抗体および免疫原をどの
ように開発したかを示す実施例をここに示す。ある種の
これら抗体および免疫原は受精能を抑制する用途を有
し、他の抗体および免疫原は受精能を増大させる用途を
有する。

【００２１】さらに本発明は、ＬＨおよびＦＳＨ受容体
に結合しうると共に投与の時点に応じ受精能増大もしく
は受精能抑制の各作用を有する分子の製造に関するもの
である。これらの幾つかは、ＬＨ受容体に結合すると共
にＬＨの作用を阻止する分子である。これらを濾胞期に
投与すると、ＬＨ活性を抑制することによりアンドロゲ
ンおよびエストロゲンの分泌を抑制する。その結果、Ｆ
ＳＨレベルが上昇すると共に受精能が増大する。これら
を月経周期の黄体期に際し排卵後に投与すると、ｈＣＧ
の活性を抑制して妊娠を停止させる。他の分子はＦＳＨ
受容体に結合すると共にＦＳＨ活性を有する。これらは
ＦＳＨの長時間作用性アナログであり、少量で投与する
と濾胞成熟を刺激する。これらはエストロゲン合成を刺
激するので、エストロゲンのレベルが上昇すると共に下
垂体ＦＳＨレベルの分泌が低下する。制限量にて投与す
る限り、これらは卵巣過敏症を誘発しない。さらに、こ
れらは雄における受精能の刺激に対し直接的作用を有す
る。さらに、本発明はＦＳＨ並びにＦＳＨおよびＬＨの
両者の作用を抑制する能力を有する分子の作成に関する
ものである。これら分子は、にしばしばゴナドトロピン
療法の結果として生じる過剰活性卵巣組織を有する女性
を処置するの有用である。卵巣の刺激過剰は極めて致命
的であり、これらアナログはＦＳＨ受容体に結合しある
いはＦＳＨおよびＬＨ受容体の両者に結合して、さらに
卵巣発育を抑制する。

【００２２】本発明によれば、受動的または能動的な免
疫処理を用いてルトロピンの活性を抑制する新規な方法
により、人間および動物における受精能を向上させるた
めの方法が提供される。従来の研究が示したところで
は、ＬＨの作用の阻止は受精能の抑制をもたらす。ここ
で、適するＬＨ抗体を使用して受精能を回復もしくは刺
激しうることが示される。この手法は刺激過剰の危険を
減少させると共に、より正常な受精能の調節をより少な
い監視にて可能にする。受精能を促進するのに必要とさ
れる抗体もしくは抗血清を産生および試験するための幾
つかの方法が提供される。

【００２３】ＦＳＨ／ＬＨの比率を変化させる他の方
法、たとえばＦＳＨを投与しあるいは抗エストロゲンを
与える方法も可能である。しかしながら、抗−ＬＨ抗体
の使用に基づくここに記載した手法はこれら他の方法よ
りも重要な利点を有する。各抗体につき最大阻害の程度
はin vitroでの試験により慎重に決定することができ
る。すなわち抗体の投与量とは無関係に、ＬＨ活性の抑
制を抗体の適当な選択により所定レベル以下に防止する
ことができる。たとえばＢ１０５は有効ｈＬＨレベルを
約４倍減少させるのに対し、Ｂ１１０は有効ｈＬＨレベ
ルを約２倍減少させる。ＬＨレベルの低下はＦＳＨレベ
ルを上昇させることができる。ＦＳＨレベルが上昇する
と、これらは濾胞の発達およびエストロゲンの産生をも
たらす。これらレベルが適する濾胞の発達の特徴である
生理学的濃度に達すると、これらは多量のＦＳＨの分泌
を阻害する。従って、ここに記載した処理はＦＳＨもし
くは抗エストロゲンを投与して受精能を刺激することに
依存する現存の方法において欠如する自己調節の優れた
な特徴を保持する。さらにＧｎＲＨ（ゴナドトロピン放
出ホルモン）もしくはＧｎＲＨアナログを用いる排卵誘
発とは異なり、抗−ＬＨ抗体に基づく方法はホルモンも
しくはホルモンアナログの脈動注入を必要としない。こ
の処置は、数日間にわたり１回または多くとも数回の処
置という有力な利点を与える。これは、人間もしくは動
物にて排卵の調節に特に重要である。人間において、こ
の方法はしばしば不適当に高いＬＨレベルを特徴とする
多卵胞性卵巣病の処置に最も適する。ＬＨレベルが減少
するにつれ、ＦＳＨレベルが上昇すると共に濾胞の発達
が生ずる。しかしながら濾胞の発達が生ずると、上昇し
たレベルのエストロゲンがさらにＦＳＨの分泌を阻止す
る。したがって、危険な潜在的結果を伴う多過ぎる濾胞
の発生を促進する傾向が最小化される。

【００２４】さらに、ここには鋳型およびエクスクルー
ジョン抗体の使用に基づく決定免疫原を産生させるため
の方法も提供される。これら抗体の使用は、蛋白の特定
ドメインに対する特異的免疫反応を開発することを可能
にする。この方法は、ここに例示するように受精能を誘
発もしくは抑制する際に用途を有する。ｈＣＧに対する
抗体は腫瘍成長を抑制しうるので、この方法はｈＣＧ分
泌性腫瘍の発生もしくは進行を抑制するのに必要とされ
るワクチンを開発するにも有用である。さらに、この方
法は特定免疫原を必要とする任意の系にも用途を有す
る。

【００２５】ｈＬＨもしくは他のＬＨを結合するという
事実以外に、受精能の誘発に対し有用である抗体の構造
に関し特異的なものは何もない。すなわち、ＬＨを結合
する能力を保持する抗体の部分は同様な活性を有すると
予想される。これらは、ｈＬＨもしくはＬＨに結合して
その生物学的活性を減少させるＦａｂ断片、（Ｆａ
ｂ′）2 断片、単一鎖抗体または任意の分子を包含す
る。Ｆａｂ断片は、抗原結合部位を有すると共にパパイ
ン消化により発生する抗体の一部分である。（Ｆａ
ｂ′）2 断片は、２個の抗原結合部位を有すると共にペ
プシン消化により発生する抗体の一部分である。

【００２６】好ましくは受精能を増大させる方法は哺乳
動物の濾胞期に際し、より好ましくは月経周期の濾胞期
に際し実施される。

【００２７】本発明にて調節すべき糖蛋白質ホルモン
は、結合対照物間の反応における反応体である。結合対
照物は、互いに特異的結合親和性を有する蛋白質であ
る。１つの対照物は抗原およびハプテンよりなる群から
選択される結合剤である。好適な結合剤は抗原である。
他の結合相手は抗体および特異的結合性蛋白よりなる群
から選択される結合剤である。好適結合剤は、抗体であ
る。

【００２８】抗原は、抗体の産生を誘発すると共に検出
可能な方法で誘発抗体と特異的に反応しうる物質であ
る。抗原は可溶性物質（たとえば毒素および外来蛋白
質）または粒状物質（たとえば細菌もしくは組織細胞）
とすることができる。一般に抗原は高分子量物質、たと
えば単一および結合蛋白質および炭水化物である。

【００２９】抗体は、リンパ組織にて合成を誘発する抗
原またはこの抗原に近縁の抗原に対してのみ相互作用し
うる特定アミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子であ
る。免疫グロブリンは２個の軽鎖と２個の重鎖とで構成
された蛋白質である。

【００３０】結合剤はたとえば膜未結合受容体蛋白質も
しくは移動性蛋白質のような特異的結合蛋白質とするこ
ともできる。受容体蛋白質は、たとえば抗体のような細
胞に付着し続ける蛋白質および血清に放出されてその特
異的結合親和性を保持する膜未結合蛋白質を包含する。
移動性蛋白質は、生物系における細胞に出入すると共に
表皮層を介して物質を移動させる蛋白質である。

【００３１】結合剤は天然源からの物質とすることがで
き、あるいは合成もしくは組換手段より作成された物質
とすることもできる。好適実施形態において、結合剤は
組換蛋白質および合成ペプチドよりなる群から選択され
た抗体である。

【００３２】本発明の化合物は、哺乳動物（たとえば動
物もしくは人間）に対し所望の活性を与えるのに有効な
量にて投与することができる。化合物の活性および所望
する治療効果の程度は変化するので、用いる化合物の投
与レベルも変化する。実際の投与量は、患者の体重およ
び特定患者の個々の過敏性など一般的に認められた因子
によって判定される。すなわち、特定患者（男性）に対
する単位投与量は体重１ｋｇ当り約０．１μｇ程度の低
い程度で変化することができ、これは医者が所望する効
果につき測定することができる。測定に好適な最小投与
量は体重１ｋｇ当り１μｇである。

【発明の実施の形態】１実施形態において本発明は、循
環における黄体形成ホルモン活性を有する糖蛋白質ホル
モンの活性を減少させ、これにより濾胞刺激ホルモンの
産生を刺激することによる哺乳動物における受精能の刺
激方法に関し、この方法は黄体形成ホルモンを結合する
治療上有効量の結合剤を哺乳動物に投与することからな
る。

【００３３】他の実施形態において本発明は、循環にお
ける黄体形成ホルモン活性を有する糖蛋白質ホルモンの
活性を減少させるが排除しないことにより濾胞刺激ホル
モンの産生を刺激する哺乳動物における受精能を刺激す
るためのワクチン接種法に関し、この方法は： （ａ） 陽性鋳型として黄体形成ホルモンを結合する結
合剤を供給し； （ｂ） 黄体形成ホルモンβ−サブユニットのランダム
突然変異により得られた黄体形成ホルモンβ−サブユニ
ット突然変位体のライブラリーを供給し； （ｃ） 工程（ｂ）からの黄体形成ホルモンβ−サブユ
ニットの突然変異体を工程（ａ）からの陽性鋳型結合剤
でスクリーニングし； （ｄ） 工程（ｃ）における陽性鋳型結合剤に結合しな
い黄体形成ホルモンβ−サブユニット突然変異体を捨
て； （ｅ） 工程（ｄ）における黄体形成ホルモンβ−サブ
ユニット突然変異体をコードするＤＮＡ配列を決定し； （ｆ） 黄体形成ホルモンとは相違するが工程（ｅ）に
て高親和性で黄体形成ホルモン結合剤に結合する黄体形
成ホルモンβ−サブユニット突然変異体をコードするＤ
ＮＡ配列を選択し； （ｇ） 選択された黄体形成ホルモンβ−サブユニット
突然変異体の蛋白質を工程（ｆ）におけるＤＮＡ配列か
ら原核性細胞もしくは真核細胞宿主にて発現させ； （ｈ） 工程（ｇ）からの治療上有効量の蛋白質を哺乳
動物に抗原として投与して免疫反応を生じさせることに
より黄体形成ホルモンに対する抗体を発生させて、黄体
形成ホルモン活性を減少させるが排除せずに濾胞刺激ホ
ルモンの産生を刺激して哺乳動物における受精能を刺激
する各工程からなる。

【００３４】さらに他の実施形態において本発明は、循
環における絨毛性ゴナドトロピンホルモンの活性を有す
る糖蛋白質ホルモンの活性を減少させることによる雌哺
乳動物における不妊症を誘発させるためのワクチンの設
計方法に関し、この方法は： （ａ） 陽性鋳型として絨毛性ゴナドトロピンホルモン
を結合する結合剤を供給し； （ｂ） 絨毛性ゴナドトロピンホルモンβ−サブユニッ
トのランダム突然変異により得られた絨毛性ゴナドトロ
ピンホルモンβ−サブユニット突然変異体のライブラリ
ーを供給し；（ｃ） 工程（ｂ）からの絨毛性ゴナドト
ロピンホルモンβ−サブユニット突然変異体を工程
（ａ）からの陽性鋳型結合剤でスクリーニングし； （ｄ） 工程（ｃ）における陽性鋳型結合剤に結合しな
い絨毛性ゴナドトロピンホルモンβ−サブユニット突然
変異体を捨て； （ｅ） 工程（ｄ）における絨毛性ゴナドトロピンホル
モンβ−サブユニット突然変異体をコードするＤＮＡ配
列を決定し； （ｆ） 絨毛性ゴナドトロピンホルモンとは相違するが
絨毛性ゴナドトロピンホルモン結合剤に工程（ｅ）にて
高親和性で結合する絨毛性ゴナドトロピンβ−サブユニ
ット突然変異体をコードするＤＮＡ配列を選択し； （ｈ） 選択された絨毛性ゴナドトロピンホルモンβ−
サブユニット突然変異体の蛋白質を工程（ｇ）における
ＤＮＡ配列から原核細胞もしくは真核細胞宿主にて発現
させ； （ｉ） 工程（ｈ）からの治療上有効量の蛋白質を哺乳
動物に抗原として投与して免疫反応を生じさせることに
より絨毛性ゴナドトロピンホルモンに対する抗体を発生
させて、絨毛性ゴナドトロピンホルモン活性を減少させ
ることにより雌哺乳動物における不妊性を誘発させる各
工程からなる。

【００３５】さらに他の実施形態において本発明は、循
環における濾胞刺激ホルモン活性を有する糖蛋白質質ホ
ルモンの活性を減少させることによるヒト男性における
受精能を抑制するためのワクチンの設計方法に関するも
のであり、この方法は： （ａ） 陽性鋳型として濾胞刺激ホルモンを結合する結
合剤を供給し； （ｂ） 濾胞刺激ホルモンβ−サブユニットのランダム
突然変異により得られた濾胞刺激ホルモンβ−サブユニ
ット突然変異体のライブラリーを供給し； （ｃ） 工程（ｂ）からの濾胞刺激ホルモンβ−サブユ
ニット突然変異体を工程（ａ）からの陽性鋳型結合剤で
スクリーニングし； （ｄ） 工程（ｄ）にて陽性鋳型結合剤に結合しない濾
胞刺激ホルモンβ−サブユニット突然変異体を捨て； （ｅ） 工程（ｄ）における濾胞刺激ホルモンβ−サブ
ユニット突然変異体をコードするＤＮＡ配列を決定し； （ｆ） 濾胞刺激ホルモンとは相違するが濾胞刺激ホル
モン結合剤に工程（ｅ）にて高親和性で結合する濾胞刺
激β−サブユニット突然変異体をコードするＤＮＡ配列
を選択し； （ｇ） 選択された濾胞刺激ホルモンβ−サブユニット
突然変異体の蛋白質を工程（ｆ）におけるＤＮＡ配列か
ら原核性もしくは真核性宿主にて発現させ； （ｈ） 工程（ｈ）からの治療上有効量の蛋白をヒト男
性に抗原として投与することにより免疫反応を生じさせ
て濾胞刺激ホルモンに対する抗体を発生させ、濾胞刺激
ホルモン活性を減少させると共にヒト男性における受精
能を抑制する各工程からなる。

【００３６】さらに他の実施形態において本発明は、循
環における黄体形成ホルモン活性を有する糖蛋白質ホル
モンの活性を減少させることによる非ヒト哺乳動物にお
ける受精能を抑制するためのワクチンの設計方法に関す
るものであり、この方法は： （ａ） 陽性鋳型として黄体形成ホルモンを結合する結
合剤を供給し； （ｂ） 黄体形成ホルモンβ−サブユニットのランダム
突然変位により得られた黄体形成ホルモンβ−サブユニ
ット突然変異体のライブラリーを供給し； （ｃ） 工程（ｂ）からの黄体形成ホルモンβ−サブユ
ニット突然変異体を工程（ａ）からの陽性鋳型結合剤で
スクリーニングし； （ｄ） 工程（ｃ）にて陽性鋳型結合剤に結合しない黄
体形成ホルモンβ−サブユニット突然変異体を捨て； （ｅ） 工程（ｄ）における黄体形成ホルモンβ−サブ
ユニット突然変異体をコードするＤＮＡ配列を決定し； （ｆ） 黄体形成ホルモンとは相違するが工程（ｅ）に
て高親和性で黄体形成ホルモン結合剤に結合する黄体化
β−サブユニット突然変異体をコードするＤＮＡ配列を
選択し； （ｇ） 選択された黄体形成ホルモンβ−サブユニット
突然変異体の蛋白質を工程（ｆ）におけるＤＮＡ配列か
ら原核細胞もしくは真核細胞宿主にて発現させ； （ｈ） 工程（ｇ）からの治療上有効量の蛋白質を哺乳
動物に抗原として投与して免疫反応を生じさせることに
より黄体形成ホルモンに対する抗体を発生させ、黄体形
成ホルモン活性を減少させると共に非ヒト哺乳動物にお
ける受精能を抑制する各工程からなる。

【００３７】好適実施形態において、ワクチンの設計方
法は： （ｉ） 工程（ａ）にて陰性鋳型として結合する結合剤
をさらに供給し； （ｊ） 工程（ｃ）に先立ち、工程（ｂ）からのホルモ
ンβ−サブユニット突然変異体を工程（ｉ）からの陰性
鋳型結合剤でスクリーニングし； （ｋ） 工程（ｃ）にて、工程（ｊ）からの陰性鋳型結
合剤には結合しないホルモンβ−サブユニット突然変異
体を工程（ａ）からの陽性鋳型結合剤でスクリーニング
する各工程をさらに含む。

【００３８】以下、実施例により本発明をさらに説明す
るが、これらは本発明の範囲を決して限定するものでな
い。実施例および明細書における部数および％は特記し
ない限り全て最終組成物の重量による。

【００３９】

【実施例】黄体形成ホルモンおよびヒト絨毛性ゴナドト
ロピンの生物学的活性を減少させてその生物学的活性を
所望程度まで減少させる結合剤 実施例１ 受精能を誘発する抗−ＬＨ抗体の使用 ある種の抗−ホルモン抗体はホルモンが受容体に結合し
ないよう阻害し、または代謝を増大させてホルモンの生
物学的活性を抑制するので、これらは循環における活性
ホルモンのレベルを減少させるのに有用である。ＬＨに
対する抗体は、循環における生物学的活性なＦＳＨとＬ
Ｈとの比を増大させることができる。これは部分的に、
これらがＬＨの活性を減少させるからである。さらに、
ＬＨはエストロゲンまで変換しうるステロイド物質の合
成を刺激するホルモンであるため（４）、ＬＨ活性の低
下はエストロゲンの低下を伴う。エストロゲンのレベル
の低下はＦＳＨ分泌の抑制を減少させると共にＦＳＨの
レベルを上昇させる。その結果、女性において濾胞の発
達が増大する。男性の場合、精子形成が開始される。必
ずしも全ての抗体が非中和的にＬＨレベルを減少させる
能力を有するとは限らない。ＬＨの作用を中和する抗体
は、制限的（すなわち抗体の全投与量が循環ＬＨの全量
より少ない）で投与しなければ受精能を完全に削減す
る。受精能を向上させるためには非中和性工程が好適で
ある。何故なら、これらはＬＨの全量を越えて投与でき
るからである。すなわち大部分のＬＨは抗体に結合しう
るが、ＬＨ活性は減少するが中和されない。濾胞の発達
につき充分量より多いＬＨが存在するので、ＬＨ活性に
おける部分的低下は濾胞の発達を阻害しない。さらに、
濾胞がその発生を増大する際に作成されるエストロゲン
の増加はＦＳＨ分泌の正常なフィードバック調節に類似
して卵巣刺激過剰を防止する。１０μｇ〜１０ｍｇの高
親和性抗体（すなわちＫａ＞５×１０7 Ｍ-1）の投与
は、多卵胞性卵巣病を有する女性にて受精能を誘発する
のに充分である。適する抗体の同定および特徴化につい
ては実施例２に示す。

【００４０】実施例２ 最良ＬＨ抗体の同定および選択 ＬＨ活性を抑制する抗体の全てが不妊症の処置に同等に
有用であるとは限らない。たとえば、高過剰濃度の抗体
（たとえばｈＣＧおよびＬＨに結合するＢ１０１）（た
だし低い親和性を有する）は、ホルモンがＬＨ受容体に
結合するのを防止することができる（２２）。過剰に存
在する場合、受容体に対するＬＨもしくはｈＣＧの結合
を防止する抗体はホルモンの生物学的活性を「中和」す
る。ＬＨの中和に続いてアンドロゲンおよびエストロゲ
ンのレベルの低下とＦＳＨレベルの上昇とが生じると
（ＬＨが受精能に必要とされるため）、受精能に必要と
される最小レベル以下のＬＨ活性の低下は過剰の抗体が
存在する限り受精能を抑制する。実際に、中和抗体また
は中和抗体の産生を誘発する抗原は、動物にて受精能を
抑制することが示されている（１０）。制限量の中和抗
体を投与してＬＨ濃度を所定レベルまで減少させ、ある
いは抗−イデオタイプ抗体を投与することにより中和抗
体の抑制作用を逆転させることができる。しかしなが
ら、個人間の変動により、ほぼ完全なＬＨ活性の抑制が
所望されなければあるいはＦＳＨおよび／または生殖機
能の測定（たとえば血漿ステロイドのレベルの測定）を
行わなければ、所望の作用を得るのにどの程度の量の抗
体が必要されるかを判定するのは困難である。これらは
可能であるが、これら測定を行う必要性は、ＬＨ活性を
完全に中和して受精能を開始させる抗体の使用の魅力を
減少させる。さらに、中和性抗体を投与して、ＦＳＨレ
ベルが上昇するまでＬＨの作用を一時的に防止すること
もできる。次いで過剰の中和性抗体を、抗−イデオタイ
プ抗体の投与により抗−ＬＨ抗体を中和して受精能を回
復させまたはＬＨもしくはＣＧを用いて抗体の作用を解
消することにより、またはＬＨの中間周期急増の作用を
可能にするために充分減少する量の抗体を用いることに
より除去することができる。しかしながら、この手法は
下記するように非中和抗体の使用よりも複雑である。

【００４１】好適抗体はＬＨの活性を抑制するが、循環
に存在する全ＬＨを結合するのに充分な濃度で投与して
もその作用を完全には阻害しない。これら抗体は一般に
遊離ホルモン、並びにホルモン−受容体複合体に結合す
ることができる。これらは、受容体に対するホルモンの
親和性を低下させ、結合ホルモンの活性を減少させ、か
つ／またはホルモン除去を増大させることによりホルモ
ン作用を抑制する。この種の抗体の例はＢ１０５および
Ｂ１１０を包含する。これら抗体はホルモンの生物学的
活性を異なる程度まで減少させ（１７）、コロンビア大
学、ニューヨーク、ＮＹまたはＵＭＤＮＪ−ロバート・
ウッド・ジョンソン・メジカル・スクール、ピスカタウ
ェイ、ＮＪから購入することができる。他の市販の抗体
は５１８Ｂ７（ジャネット・ローザ博士、カリフォルニ
ア大学、デービス、ＣＡから入手できる）およびＺＭＣ
Ｇ７（ピアス・ケミカル・カンパニー社、３７４７ノー
ス・メリジアン・ロード、ロックフォード、ＩＬから入
手できる）を包含する。これら抗体とｈＣＧとの複合体
は受容体に結合しうるので、抑制の程度は大過剰の抗体
の存在下でも制限される。抑制の程度は、in vivo にて
使用する前に簡単なin vitro分析にて判定することがで
きる。たとえば大過剰のＢ１１０はｈＣＧの活性を僅か
約半分だけ減少させるのに対し、大過剰のＢ１０５はｈ
ＣＧの活性を約３／４減少させることが示された。これ
ら各抗体はｈＬＨに結合すると共に、ｈＬＨ活性に対し
同じ作用を有すると予想される。

【００４２】ｈＬＨに対し作成されたモノクローナル抗
体のパネルからの適する抗体の同定は次のように行うこ
とができる。これら抗体は、ｈＬＨ、ｈＣＧ、他の動物
のＬＨ、またはＬＨ、ｈＣＧ断片、部分的もしくは完全
に脱グリコシル化されたＬＨ、もしくは所望する動物の
ＬＨに免疫反応を誘発できるｈＣＧアナログをマウスに
免疫接種する標準的方法（２２、２７〜３２）により得
ることができる。これら抗体は人工抗体の選択により得
ることもできる（３３〜３６）。この同じ手法を用い
て、ほぼ全ての他の動物からＬＨに対する抗体を同定す
ることができる。さらに、同様な特徴を有する抗血清を
同定するために使用するこもできる。これら抗血清はＬ
ＨもしくはｈＣＧアナログに対応するよう作成すること
ができ、または望ましくない抗体成分の免疫吸着または
除去によって得ることもできる。

【００４３】所望する抑制特性を有する抗体は、ＬＨ受
容体に対するＬＨの結合を阻害する能力を測定して同定
することができる。この種の分析は受容体結合を測定す
る当業者により行うことができ、以下の実施例はどのよ
うにｈＬＨに対する抗体を選択するかを示す。明かに、
これは抗体を入手しうる任意のＬＨの動物種類に適用す
ることもできる。ｈＬＨは囓歯類ＬＨ受容体に良好に結
合するので、この分析にはヒトＬＨ受容体を使用する必
要もないが、ヒトＬＨ受容体も可能である。簡単な第１
工程は、ラットの卵巣黄体ＬＨ受容体に対する放射能標
識ｈＬＨの結合に対する抗体の作用を監視することであ
る。放射能標識ｈＬＨは、１０μｇのｈＬＨを５００μ
ＣｉのＮａ^１２５Ｉと共に、１．５μｇのイオド−ゲン
（ピアス・ケミカル・カンパニー社）で被覆された小ガ
ラス管にて４℃で３０秒間にわたり温置して作成するこ
とができる。^１２５Ｉ−ｈＬＨおよび未反応の^１２５Ｉ
をゲル濾過によって分離する。これら受容体は、ＰＭＳ
ＧもしくはウマＣＧとしても知られる妊娠雌ウマ血清ゴ
ナドトロピン（シグマ・ケミカル・カンパニー社、セン
トルイス、ＭＯから入手）の５０ＩＵを２３〜２６日令
である雌スプラグ・ドーリー種ラットに投与して作成す
ることができる。ＰＭＳＧは濾胞の発達を刺激する。約
５６〜６５時間後、動物には２５ＩＵのｈＣＧ（これも
シグマ・ケミカル・カンパニー社から入手）を投与して
黄体の形成を生じさせる。高度に黄体化された卵巣を１
週間後に摘出し、４０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）と５
ｍＭのＭｇＣｌ_２とを含有する緩衝液にてホモゲナイズ
する。ホモゲナイズ物の粗製核および膜分画を１０００
×ｇにて４℃での２０分間にわたるホモゲナイズ物の遠
心分離により回収する。これをトリス−ＭｇＣｌ_２緩衝
液に懸濁させると共に１０００×ｇで４℃にて２０分間
にわたり再沈降させることにより１回洗浄する。最終ペ
レット（「卵巣ホモゲナイズ沈殿物」と称する）を、ホ
モゲナイズの開始時点で存在する各卵巣当り２ｍｌの容
量を用いトリス−ＭｇＣｌ_２緩衝液に再懸濁させる。卵
巣の１／２０にほぼ等しい量（すなわち緩衝液１００μ
ｌ中に約５ｍｇの物質）の卵巣ホモゲナイズ沈殿物を、
約１〜２ｎｇの放射性ヨウ素化されたｈＬＨ（すなわち
約１００，０００ｃｐｍ）と種々異なる量の抗体（すな
わち１ ｐｇ〜１０μｇの範囲もしくはそれ以上）とを
含有するチューブに添加する。放射能標識ＬＨが受容体
に結合するのに充分な時間（すなわち３７℃にて３０〜
６０分間または室温にて１晩）にわたりチューブを温置
した後、結合受容体および遊離放射能標識を０．９％Ｎ
ａＣｌ溶液で２ｍｌまで反応混合物を希釈すると共に混
合物を遠心分離し、次いで上澄液を吸引して分離させ
る。ラット卵巣ＬＨ受容体に結合した放射能標識ｈＬＨ
の量をγカウンターにおける沈殿物の分析により測定す
る。第１図に示した阻害の型を観察する。ある種の抗体
は放射能標識ｈＬＨの結合を大過剰の未標識ｈＬＨもし
くはｈＣＧと同程度まで完全に阻害するのに対し、他の
抗体は結合を阻害せず、または放射能標識ｈＬＨに対し
大過剰のモル濃度で存在する場合にも結合を強化するこ
とができる。これら抗体の両者は、ｈＬＨ結合を中間レ
ベルまで抑制するような抗体よりも望ましくない（第１
図参照）。すなわち、大抵の有用な抗体は放射能標識Ｌ
Ｈの結合を阻害するが、大過剰の未標識ＬＨと同程度で
はない。大過剰の未標識ＬＨと同程度まで放射能標識Ｌ
Ｈの結合を抑制する抗体も有用であるが、in vivoで使
用する場合にこの抗体がＬＨ活性を阻害し過ぎないこと
を確認するよう一層の注意が必要とされる。高過ぎるＬ
Ｈ活性がＬＨ上昇で中和されれば、不妊が生ずる。

【００４４】ＬＨ活性を減少させる所望の能力を有する
抗体を同定する他の有用な方法は、in vitro試験を行
い、抗体がステロイド生合成に対するｈＬＨの作用を阻
害するかどうかを判定することである。この分析におい
て、雄の囓歯類の睾丸を用いることができる。ｈＬＨを
用いる典型例を第２図に示す。粗製ラット・ライディッ
ヒ細胞懸濁液を引用文献（３７）に記載されたようにコ
ラゼナーゼを用いて作成し、これら細胞を変化量のＬＨ
および試験すべき抗体と共に培養する。３７℃にて約２
〜４時間の後、チューブにおけるテストステロン含有量
を放射性免疫分析により測定する。増加濃度のｈＬＨを
ライディッヒ細胞と共に培養すると、これらはテストス
テロンの生産増加をもたらし、１〜１０ｐＭのｈＬＨ濃
度がステロイド産生を最大レベルの約５０％上昇させる
のに充分となる典型的な投与量反応曲線をもたらす（第
２図、曲線Ａ参照）。ほとんどの有用な抗体は、ＬＨ誘
発ステロイド生成を抑制する能力により同定される。種
々異なるモノクローナル抗体をホルモンが細胞に添加さ
れる前にＬＨに添加すれば、あるものはテストステロン
生成を刺激するＬＨの能力を減少させることが判明す
る。ほとんどの有用な抑制抗体は投与量反応曲線をより
低い感度まで移動させる（第２図、曲線ＢおよびＣ参
照）。移動の程度はまず最初に抗体の濃度に依存する
が、大過剰の抗体（すなわち使用するｈＬＨの最大量よ
りも１００倍大）はＬＨ誘発テストステロン生成を抑制
しない。最も有用でない抗体は、この抗体が１００倍モ
ル過剰で存在する場合にテストステロン生成の刺激を抑
制する（第２図、曲線Ｄ参照）。この種類の分析は、Ｌ
Ｈ受容体に対する結合を減少させることによりＬＨ活性
を阻害する抗体を検出し、さらに結合したＬＨの活性を
阻害する抗体をも検出する。有用な抗体の例は上記Ｂ１
０５、Ｂ１１０、５１８Ｂ７およびＺＭＣＧ７を包含す
る。これらは、女性にて反復使用する前に下記するよう
に改良する必要がある。

【００４５】抗体もしくは抗血清が選択されて上記基準
（第１図および第２図に示す）を満たすことが判明した
後、これらをin vivoにてＬＨの作用を阻害する能力に
つき試験すべきである。雄ラットに大過剰の抗体（すな
わち１００μｇもしくはそれ以上）を投与する。２０分
間の後、何匹かのラットを抗体を含まない溶液のみで処
理し（対照）、他のラットには抗体を使用すべき動物か
らのものと構造的に類似しまたは同一であるｈＬＨもし
くはＬＨを投与する。１時間の後、血漿テストステロン
のレベルをラジオイムノ分析により測定する。典型例を
第３図に示す。ほとんどの有用な抗体もしくは抗血清は
ｈＬＨの効能を減少させるが、投与するＬＨの全量を越
えて存在する場合は活性を抑制しない。この分析は、受
容体に結合するＬＨを阻害し、結合するＬＨの活性を阻
害し、かつ／またはＬＨ除去を増加させることによりホ
ルモン活性を減少させる抗体を検出する。in vivoにお
ける阻害の原因とは無関係に、ほとんどの有用な抗体も
しくは、抗血清はこれらが循環するＬＨが過剰量で存在
する場合には、ＬＨの高レベルの活性を抑制しない。こ
れは、抗体を投与した後の放射性ヨウ素化ｈＬＨを結合
する血清の能力を測定して監視することができる。血清
試料（０．０１〜１μｌ）を、０．９％のＮａＣｌと１
ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンと０．０２Ｍの燐酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．２）とを含有する溶液で２５
μｌまで希釈する。これに２５μＬの放射性ヨウ素化さ
れたＬＨ（約１ｎｇを含有する約５０ｎＣｉ）を添加す
る。得られた溶液を３７℃にて３０分間培養する。上記
５０μｌのＮａＣｌ−アルブミン溶液中に２μｇのＩｇ
Ｇを含有するヤギ−抗マウス免疫グロブリンＧ（Ｉｇ
Ｇ）溶液（カッペル社、オルガノン・テクニア・コーポ
レーション、ウエスト・チェスター、ＰＡから入手）を
添加し、得られた溶液を３７℃にて９０分間または４℃
にて１晩培養する。この溶液に、水で再構成した１００
μｌの１％ＩｇＧｓｏｒｂ（ザ・エンザイム・センター
・インコーポレーション、３６フランクリン・ストリー
ト、マルデン、ＭＡから入手）を添加する。この懸濁液
を２２℃にて３０分間混合し、次いで３ｍｌのＮａＣｌ
−アルブミン溶液を添加して希釈し、氷冷する。混合物
を２０００×ｇにて４℃で１０分間、遠心分離する。上
澄液を吸引し、沈降物における放射能をγカウンターで
測定する。陰性対照としては、活性的もしくは不活的に
免疫化していない動物の血清を用いる。陽性対照として
は、最初に動物に注射された０．１〜１ｎｇの抗体を使
用する。陰性対照からの沈殿物で測定された放射能を陽
性対照における放射能および試験される血清試料の沈降
物における放射能から引算する。陽性対照および血清試
料につき得られた数値を比較して、ＬＨを越えて抗体を
含有する血清は陽性対照としての放射性ヨウ素化ＬＨの
少なくとも１〜１０％を免疫沈降させることができる。

【００４６】ヒトにおけるｈＬＨに対する抗体の投与は
循環するＬＨの有効濃度を減少させる。最大の減少程度
は、ＬＨにおける抗体の結合部位の位置に依存する。Ｌ
Ｈ活性の低下は卵巣ホルモンおよび睾丸ホルモンの分泌
を低下させることによりＦＳＨのフイードバック抑制を
減少させる。その結果、ＦＳＨレベルが上昇し、受精能
が増大する。他の動物からのＬＨと交叉反応するｈＬＨ
に対する抗体、または他の動物からのＬＨに結合する能
力につき選択されてホルモン活性を減少させるが除去し
ない抗体は他の動物においても同様な作用を示す。ひと
において使用するのに最も適する抗体は、ヒト免疫グロ
ブリンに類似すると共にそれ自身では抗原性はなく、ま
たはヒトに注射した場合にのみ、弱抗原性になるような
フレームおよび不変領域を有する。適する抗体は、マウ
スのモノクローナル抗体の「人体に適用」（すなわち、
マウスのフレームおよび不変領域をヒト免疫グロブリン
に見られる同様な配列で置換する）ことにより調製する
ことができる。これを達成する方法は当業界で周知され
ている（３８〜４０）。適する抗体を作成する他の方法
は、たとえばカニクイザルのような霊長類の免疫化（４
１）に続く単一リンパ球の分離およびクローン化（４
２）を包含する。これら霊長類における免疫グロブリン
はヒト免疫グロブリンと同様なフレーム領域を有する。
これら動物から作成されたモノクローナル抗体は、人間
に使用できる抗体の良好な開始点として作用する。

【００４７】実施例３ 所望の抗体を得ると共に選択する代案方法 ｈＬＨ活性を部分阻害できる多くの抗体は、プラスチッ
ク表面または他の表面に吸着されたｈＬＨもしくは他の
ＬＨ分子に結合する傾向を有する。したがって、所望す
る抗体のスクリーニングはしばしば、プラスチック微小
測定板に吸着されたｈＬＨもしくは他のＬＨあるいはＬ
Ｈ受容体複合体に結合したＬＨに結合する抗体の能力を
関して容易化される。プラスチック表面に吸着されたｈ
ＬＨに結合する抗体のスクリーニングは次のように行う
ことができる。プラスチック微小測定板の穴部を、０も
しくは１μｇのｈＬＨを０．９％ＮａＣｌ−０．０２Ｍ
燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中に含有する５０
μｌの溶液で被覆する。これは、ｈＬＨを微小測定板の
表面に吸着させることができる。３７℃にて１時間の
後、溶液を除去すると共に２００μｇのウシ血清アルブ
ミンを含有する２００μｌの０．９％ＮａＣｌ−０．０
２Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）で３７℃にて
１時間より長く置換する。これは大部分の残留吸着部位
を埋める。アルブミン溶液を排除し、^１２５Ｉで標識さ
れた５０，０００〜１００，０００ｄｐｍの試験モノク
ローナル抗体を含有する５０ｍＬの０．９％ＮａＣｌ−
０．０２Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｏＨ７．２）で置換
する。モノクローナル抗体の標識は、ＬＨにつき上記し
たようなイオド−ゲンまたは他の酸化剤を用い（２２、
４３）、１０μｇの抗体と５００μＣｉのＮａ^１２５Ｉ
とを使用して行われ、ただし反応時間を１〜５分間まで
延長させる。３７℃にて１時間の後、液体を除去し、微
小測定板の表面に付着した放射能をγカウンターで測定
する。ｈＬＨ活性を阻害するのに有用である高い能力を
有する抗体は、ｈＬＨで被覆されてないウェルに対する
よりも多量にｈＬＨで被覆されたウェルに結合すること
が判明した。この分析は他の種類の抗体をも検出し、陽
性抗体の他のスクリーニングについては下記に要約する
ようにあるいは実施例２におけるように行われる。

【００４８】ＬＨ−受容体複合体に対する結合は抗体が
ＬＨ活性の部分的中和に有用であることを保証しない
が、多くの好適抗体はＬＨ−受容体複合体に結合する。
したがって、最初にＬＨ−受容体複合体に結合する能力
を測定することにより、所望の抗体につきスクリーニン
グすることができる。この分析は上記（４４）のＢｉｏ
−ＩＲＭＡと実質的に同じであり、順次にあるいは同時
的に行うことができる。同時的Ｂｉｏ−ＩＲＭＡにおい
ては、０．０２５μＣｉ〜０．１μＣｉの放射性ヨウ素
化された試験抗体（すなわち上記のように作成）をラッ
ト卵巣ホモゲナイズ物（すなわち上記のように作成）に
添加すると共に０ｎｇ、０．０１ｎｇ、０．１ｎｇ、
１．０ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇおよび１０００ｎｇ
を含む増加量のＬＨを添加する。３７℃にて１時間の
後、ホモゲナイズ物の膜部分を１０００×ｇでの１０〜
２０分間にわたる遠心分離により沈殿させ、上澄液を吸
引すると共にペレットにおける放射能をγカウンターで
測定する。ＬＨ受容体複合体に結合する抗体は、分析ブ
ランク（すなわちＬＨを添加せず）よりも高いＬＨ濃度
の少なくとも１つと共に培養された膜に対する結合能力
の増大により検出される。順次のＢｉｏ−ＩＲＭＡにお
いては膜を先ず最初にＬＨと共に３７℃にて１時間培養
し、上記したように遠心分離および吸引により洗浄し、
次いで５０，０００〜１００，０００ｄｐｍの放射性ヨ
ウ素化された抗体と共に培養する。３７℃にてさらに１
時間培養した後、結合抗体分画および遊離抗体分画を上
記したように遠心分離および吸引により分離すると共に
ペレットをγカウンターで計測する。ほとんどの有用な
抗体はＬＨ−受容体複合体に結合する。しかしながら、
この手順は唯一の有用なスクリーニング法であって、抗
体の一層決定的な試験は実施例２に記載したテストスト
ロン産生に基づくようなin vitroの生物学的分析の使用
を含む。

【００４９】ＬＨを含有する膜表面またはＬＨとＬＨ受
容体との複合体に結合する最も有用な抗体の特徴は、サ
ルもしくはマウスの免疫化後における設計手順を用いた
リンパ球の分離を容易化させることもできる。この手順
にて、リンパ球をヒト血清アルブミンまたは非特異的結
合を防止する他の蛋白質で被覆されたプラスチック表面
に添加し、その場合これらを１ｍｇ／ｍｌのヒト血清ア
ルブミンを０．９％ＮａＣｌ−０．０２Ｍ燐酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．２）中に含有する溶液に３７℃にて
１時間より長くさらす。これら膜表面に結合しないリン
パ球を、ｈＬＨにさらし、次いで上記したようにヒト血
清アルブミンにさらして被覆された膜表面に添加する。
ｈＬＨの使用量は、充分な材料がプラスチックに吸着さ
れる限り臨界的でない。これは、２０〜５０μｇのｈＬ
Ｈ／ｍｌを用いて達成することができる。しかしなが
ら、それより少量および多量も可能である。ＬＨで被覆
された表面に付着するリンパ球を選択し、骨髄腫細胞と
融合させてハイブリドーマを作成し（３０）、エプスタ
イン・バールもしくは他のウィルスで形質転換させ、ラ
ムダファージにてクローニングし（３６）、あるいは単
一細胞をポリラーゼ連鎖反応クローニングに対して選択
する（４２）。産生された抗体を実施例２に要約したよ
うにスクリーニングする。これら手法は、望ましい抗体
の比率を増大させる。

【００５０】ＬＨを部分阻害できる多くの抗体は、ＬＨ
受容体に結合したＬＨへの結合の能力に基づく方法によ
っても選択することができる。ｈＬＨによるマウスもし
くはサルの免疫化に続き、脾細胞および他のリンパ球を
分離すると共にＬＨ受容体を発現する真核細胞単一層に
積層する。これら細胞単一層は、当業界で標準的な方法
（４８、４９）によりラット（４５）、ヒト（４６）、
ブタ（４７）または他のＬＨ受容体ｃＤＮＡを発現しう
る発現ベクターで細胞を遺伝子導入して作成することが
できる。単一層に付着するリンパ球は廃棄する。単一層
に付着しないリンパ球を、ｈＬＨもしくは他のＬＨを含
有するＬＨ受容体を発現する細胞の同様な単一層に添加
する。これらは、１００ｎｇのｈＬＨまたは他のＬＨを
単一層に４℃で１晩添加すると共に結合しなかったホル
モンを洗浄除去して作成することができる。これら細胞
に付着するリンパ球を選択すると共に、骨髄腫細胞と融
合させてハイブリドーマを作成し（３０）、エプスタイ
ン・バールもしくは他のウィルスで形質転換させ、ある
いはポリメラーゼ連鎖反応クローニングを行う（４
２）。生成された抗体を実施例２に要約したようにスク
リーニングにかける。これら手法は、望ましい抗体の比
率をも増大させる。この受容体に基づく手法はＬＨで被
覆されたプラスチック表面におけるリンパ球のスクリー
ニングに基づく手法よりも面倒であるが、有用な抗体の
一層高い比率をもたらす。

【００５１】実施例４ 多卵胞性卵巣症候群を処置するための抗体の使用 多卵胞性卵巣症候群（ＰＣＯ）は不完全な濾胞の発達お
よび女性の正常に排卵不能を特徴とする。その卵巣は多
くの小さい未成熟濾胞を含有するが、臨床的処置無しに
は排卵の点までほとんど進行しない。これら女性はしば
しば、正常サイクルの受精可能な女性と対比し増大した
アンドロゲンとＬＨ／ＦＳＨの高い比とを有する。ＰＣ
Ｏを有する女性にて排卵を誘発するには２つの主たる方
法がある。これらは濾胞の発達を促進するためのＦＳＨ
の投与または下垂体後葉部からのＦＳＨの分泌を促進す
る抗−エストロゲンの投与を包含する。両処置は排卵を
誘発させうるが、これらは多重排卵を誘発する危険もあ
る。何故なら、これらはＦＳＨ分泌を調節する正常な陰
性エストロゲンのフィードバックループを迂回するから
である。その結果、これら薬剤で処置された女性は一般
に過敏症、すなわち処置の致命的副作用を防止すべく慎
重に監視される。

【００５２】ＦＳＨ分泌における一時的かつ自律性上昇
をもたらすＬＨに対する非中和性抗体を１０μｇ〜１０
ｍｇ投与すれば、ゴナドトロピンでの処置よりも低い刺
激過剰の危険性にて排卵を誘発する。この作用は抗体が
体謝されあるいは循環から除去されてその効果が投与の
１〜２週間以内に喪失するので一時的である。この処置
は、ＦＳＨ分泌に対するエストラジオールの陰性フィー
ドバック作用が除去されないので自律的である。したが
って、ＦＳＨレベルが上昇すると共に濾胞の発達を刺激
する場合、エストラジオール分泌が上昇してＦＳＨ分泌
の上昇をさらに阻害する。

【００５３】実施例５ 排卵誘発の１回もしくは２回の投与処置誘発 １回あるいは二回のみの処方を含むＰＣＯの女性におけ
る排卵を誘発するために使用できる良好な方法は存在し
ない。この症候群のほとんどの処方はＦＳＨ、ＦＳＨ＋
ＬＨまたはｈＣＧ、ｈＭＧ、抗エストロゲン、ＧｎＲＨ
またはこれら薬剤の各種の組合せによる多重処置を必要
とする。ある種の手法はＧｎＲＨ拮抗剤をも用いてＬＨ
およびＦＳＨの両者の循環レベルを減少させることによ
り、排卵を外来性ホルモンでの処置にり誘発する。ここ
に説明した種類の好適抗体を高濃度で１回投与すれば排
卵を誘発することができる。これは抗体を大過剰で安全
に投与できるからであり、抗体は長い血漿半減期を有す
るので抗体はＦＳＨレベルを数日間にわたり増大させる
のに有効であり続ける。ＦＳＨ分泌に対するエストラジ
オールの天然フィードバック作用のため、ＦＳＨ分泌は
濾胞の発達により濾胞で産生されたエストロゲンにより
調節される。優性な濾胞が選択されてエストラジオール
のレベルが増大した時点で、抗体の殆どは循環から除去
されている。抗体は、幾つかの理由の１つもしくはそれ
以上により排卵に必要とされるＬＨ上昇の作用を抑制し
ない。第１に、ＬＨ放出量は排卵に必要な量を越える。
第２に、抗体はＬＨの活性を減少させるに過ぎず、これ
を中和しない。第３に、ＬＨ上昇の時点で抗体の多くは
循環から除去されるであろう。従って、抗体での処方に
続き、濾胞の発達および排卵が生じる。

【００５４】実施例６ 適する抑制性抗血清を誘発する抗原 実施例１に示した適する抗体の投与を用いて受精能を増
大させることができる。しかしながら、これは「不活
的」免疫化であるため、抗体のレベルを数日間もしくは
数週間以上にわたり高く保つには抗体の反復投与を必要
とする。短期間の上昇（たとえば数日間）で女性におけ
る排卵を誘発するのに充分であり、あるいは１周期また
は数周期にて動物における排卵の回数を増大させるのに
充分である。ＬＨの活性を部分的に阻害することにより
受精能をより長期間または数周期にわたり増大させるこ
とが望ましければ、ＬＨに対する抗体の活発な生成を引
き起こす免疫反応を誘発させるのが有用である。最も有
用な抗体を得るには、ある程度のＬＨ活性を保持するＬ
Ｈと複合体を生成するＢ１０５、Ｂ１１０または他の抗
体により認識されるものと同様なＬＨ分子の一部分に対
し反応を誘発できる免疫原を設計することが必要であ
る。最も適する免疫原はＬＨβ−サブユニットから得ら
れる。何故なら、このサブユニットはＬＨに対し特異的
であるからである。α−サブユニットはＬＨ、ＴＳＨお
よびＦＳＨに共通である。その構成はホルモンにて若干
相違すると思われ（２１）、従ってα−サブユニットに
対する有用な抗体も作成することができる。しかしなが
ら、α−サブユニットに対する抗体は３種全てのホルモ
ンの作用を阻害する能力を有する。免疫反応がｈＦＳＨ
に向けられれば、これは受精能を増大させず、しかも不
妊性をもたらし得る。ｈＬＨに対し女性を活発に免疫化
して受精能を増大させることが望ましければ、ｈＣＧに
対する抗体の誘発を抑制するように注意を払わねばなら
ない。ｈＣＧに対する抗体は、受精能を低下させる能力
を有する（下記参照）。これは一般に、上記の受動的免
疫処理に伴う問題でない。何故なら、ＬＨに対する投与
抗体は一般にｈＣＧが受精能につき必要とされる時点に
先立ち循環から除去されるからである。

【００５５】ＬＨ活性を中和しないＬＨの一部分に対す
る抗体の生成を誘発できる抗原（すなわち所望の免疫反
応）は、ＬＨβ−サブユニットの部分から得られる配列
を有する。しばしば、これはＬＨがＬＨ受容体に結合し
た後に露出され続けるβ−サブユニットの領域である。
最も抗原性のある免疫原になるためには、免疫原は免疫
すべきヒトまたは動物に対し異質である配列を含有しな
ければならない。ＬＨβ−サブユニットの全体を用いて
免疫処理すれば、ＬＨ活性を完全に抑制する抗体の産生
を得ることができる。高力価の中和性抗体は、不妊症を
もたらし、または例えば尚早な閉経を誘発したり睾丸の
寸法もしくは機能の喪失をもたらすような他のマイナス
の結果を示すかもしれない。免疫原に伴わせるべきＬＨ
β−サブユニット残基の最良の選択は、ホルモンがＬＨ
受容体に結合する際に露出され続けるものである。これ
らはホルモンの７４〜７７残基に近い部分、すなわちｈ
ＬＨもしくはｈＣＧβ−サブユニットおよびｈＬＨ−も
しくはｈＣＧ−受容体複合体に結合する抗体により認識
されるホルモンの領域を包含する（２６、５０）。免疫
化において使用してはならないβ−サブユニットの領域
は、残基８９〜９２および４７〜５１に近い配列を包含
する。これらは、活性を中和する抗体に関する結合部位
の位置である。

【００５６】最小合成抗原の設計は、ＬＨがＬＨ受容体
に結合する際に露出されるｈＬＨβ−サブユニットの残
基を包含する。これらの幾種かはＰｒｏ７３−Ａｒｇ７
４−Ｇｌｙ７５−Ｖａｌ７６−Ａｓｐ７７−Ｐｒｏ７８
−Ｖａｌ７９−Ｖａｌ８０−Ｓｅｒ８１を包含する。こ
れら配列を有する合成ペプチドを大型キャリヤ分子に結
合させると共に当業界で周知された方法（１４〜１６、
５１〜５３）を用いて免疫化に使用することができる。
産生された非中和抗体はｈＬＨと結合して、その生物学
的活性を阻害する。

【００５７】しばしば、高力価免疫反応を示す小型のペ
プチド抗原の能力は低い。以下の説明は、ホルモンがＬ
Ｈ受容体に結合する際に露出され続けるｈＬＨの領域に
対する抗体を産生する場合、一層効果的である抗原をど
のように作成するかを例示する。同様な手法を用いて、
他の脊椎動物ＬＨを包含する任意の蛋白質につき免疫原
を設計することもできる。最も良好な免疫原は、動物に
存在する蛋白質とは実質的に相違するが免疫反応を所望
するエピトープの三次構造を保持するものであることが
周知されている。適する免疫原は、たとえばｉ）Ｂ１０
５および／またはｈＬＨの作用を部分抑制する他の抗体
に結合する能力を保持し、ｉｉ）ＬＨ活性を中和する抗
体に結合する能力を喪失し、かつｉｉｉ）抗原性を有す
る、ｈＬＨβ−サブユニットを改良して作成することが
できる。さらに、適する免疫原は、ＬＨβ−サブユニッ
ト以外の蛋白質から出発すると共にＢ１０５および／ま
たはｈＬＨの作用を部分抑制する他の抗体に結合する能
力を獲得するよう改良して設計することもできる。ｈＬ
Ｈの作用を部分阻害する抗体を「鋳型」抗体と称し、こ
れらを用いて所望エピトープの保持を監視しあるいは積
極的に選択する。鋳型抗体の好適例は実施例２に要約し
たように受精能を増大させるのに有効であることが判明
したものである。「排除」抗体と称する他の抗体を使用
して、望ましくないエピトープを含有する抗原アナログ
に対し選択することもできる。「排除」抗体の例は、ｈ
ＬＨの生物学的活性を完全中和しかつ／またはこれがそ
の受容体に結合しないよう抑制するものである。 鋳型
および排除抗体に基づく陽性／陰性の選択手法を用い抗
原を構築するには、「Ａ」および「Ｂ」と称する全体的
に異なる２つの手法が存在する。手法「Ａ」において
は、ＬＨβ−サブユニットから出発し、ランダム突然変
異を用いて「鋳型」抗体により識別されるエピトープ外
部の分子領域の置換を行う。産生される新たな分子を発
現させ（下記参照）、その鋳型抗体に結合する能力を監
視する。鋳型抗体に結合し続けると共に分子の他の領域
に突然変異を有するものは、分子の他の部分における第
２回の突然変異に用いられる。この過程を、抗体結合部
位に含まれるもの（たとえばＢ１０５）を除き蛋白質の
全領域が改良されるまで継続する。最終アナログは鋳型
抗体に結合するが、排除抗体には結合しない。この方法
の変法においては、鋳型抗体に結合するホルモンキメラ
から出発する。この種のキメラは、鋳型抗体に結合しな
いことあるいはｈＬＨに対する中和性免疫反応を誘発す
ることが知られた異なる動物種類のＬＨから出発して作
成することができる。この種の免疫原の例はヒトＬＨお
よびウシＬＨのβ−サブユニットのキメラである。これ
らは、プロリン４７をアルギニン（すなわちこの位置に
てヒトＬＨβ−サブユニットに見られる残基）で置換し
て改良されたウシＬＨβ−サブユニットを包含する。ｈ
ＬＨの残基は、ＬＨの異なる種類の相同性領域につき置
換して、鋳型抗体のための結合部位を形成する。相同性
領域は、ｈＬＨの配列と他のＬＨとをその高度に保存さ
れたシステイン残基（ピアス・アンド・パーソンズ
（１）により示される）の位置により整列させて同定さ
れる。

【００５８】手法「Ｂ」においては、糖蛋白質ホルモン
β−サブユニットの構造には関連しないあるいは極く僅
か類似するフレーム分子を使用する。これは、たとえば
免疫グロブリン腕または４個のヘリックス束の蛋白質中
の螺旋間に存在するループ構造を有する任意の蛋白質を
包含する。残基６５〜８５間のｈＬＨの配列は、標準的
な突然変異導入手法によりループの１つにつき置換され
る。この蛋白質を適するＥ．ｃｏｌｉ発現ベクター（た
とえばノバゲン社から入手できるＴ７ベクターの１種）
にて作成する場合、これをｈＬＨ受容体複合体に結合す
るモノクローナル抗体に対し結合する能力につき試験す
ることができる。エピトープを形成する残基の１部のみ
が発現する蛋白質に存在するので、その親和性は抗体に
対するｈＬＨの親和性よりも低い。 手法「Ａ」もしく
は「Ｂ」にて作成された蛋白の選択性および親和性を向
上させるには、細菌発現系またはバクテリオファージ発
現系のいずれかを使用することができる（３４、３６、
５５〜５８）。いずれの場合も、突然変異アナログのラ
イブラリーを作成すると共にＢ１０５、Ｂ１１０または
実施例２にて有用であると判明した他の同様な鋳型抗体
につき最高の親和性を有する突然変異体を選択する。さ
らに、実施例２では有用でないと判明した中和抗体もし
くは抗血清を用いて陰性の選択を用いることもできる。
これは、ワクチンで使用する場合、所望しない抗体を生
ずる抗原の能力を最小化させる。

【００５９】以下の説明はファージ表示に基づく選択法
にも適用されるが、ほぼ全ての発現系に対しライブラリ
ーを作成およびスクリーニングする当業者により容易に
適合させることができる。選択に推奨される１つの系は
蛋白質ブロッティングに基づく系である（５９）。数種
の異なるファージ表示系も使用することができる。１つ
はｐｈＧＨ−Ｍ１３ｇＩＩＩに類似するベクター（すな
わちｐＸ−Ｍ１３ｇＩＩＩ）を使用する（３４）。上記
手法「Ａ」を使用する場合、ｐＡ−Ｍ１３ｇＩＩＩと称
するこの新規なベクターはｈＬＨβ−サブユニットまた
はｈＬＨ−ＬＨβ−サブユニットキメラのいずれかを、
ｐｈＧＨ−Ｍ１３ｇＩＩＩの成長ホルモンをコードする
配列の位置に有する（第４図）。上記手法「Ｂ」を使用
する場合、ｐｈＧＨ−Ｍ１３ｇＩＩＩの成長ホルモンを
コードする配列は残基７４に近いｈＬＨβ−サブユニッ
トをコードする配列を含む以外は、ｈＬＨβ−サブユニ
ットに無関係な分子をコードする遺伝子で置換してｐＢ
−Ｍ１３ｇＩＩＩと称する新規なベクターを得る。
「Ｂ」配列をコードするベクターの領域をコードする配
列は、カセットまたは他の種類の突然変異を可能にして
ランダム配列を導入できる制限部位をも有する。ランダ
ム配列がｐＡ−Ｍ１３ｇＩＩＩもしくはｐＢ−Ｍ１３ｇ
ＩＩＩベクターのコード化領域に導入されると共に、こ
れらベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉを形質転換させると
突然変異種のライブラリーが形成される。これら突然変
異蛋白質は、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７をＥ．ｃｏ
ｌｉに添加することにより遺伝子ＩＩＩ融合蛋白として
Ｍ１３ファージミド粒子の表面にて発現することができ
る。これらファージミド粒子は、抗体に対する改良蛋白
質「Ａ」もしくは「Ｂ」の親和性に比例して抗体に結合
する。鋳型抗体に結合するファージミド粒子を選択する
ための１つの便利な方法は固相分析手法を用いることで
ある。この分析においては、鋳型抗体を用いて文献（２
２）に記載されたように表面を被覆し、次いでファージ
ミド粒子を含有する溶液を添加する。表面に結合しない
ファージミド粒子を捨てることができる。表面における
抗体に結合するような粒子を低いｐＨ緩衝液（すなわち
ｐＨ３）の添加により抗体から除去すると共に、Ｅ．ｃ
ｏｌｉを再形質転換させるべく使用することができる。
陰性選択が望ましければ、表面における鋳型抗体の代わ
りに排除抗体を用いることもできる。この場合、表面に
付着する粒子を捨てる。この過程を数回反復し、次いで
「Ａ」および「Ｂ」蛋白に関する数種の遺伝子のコード
化領域をＤＮＡ配列決定にかける。このようにして、鋳
型抗体結合につき臨界的である配列を同定することがで
きる。さらに、排除抗体を使用すれば、望ましくないエ
ピトープに対し選択することもできる。さらに、所望の
抗体結合領域の構成に対し殆どまたは全く作用を示さな
い分子の他の部分にて置換を同定することもできる。こ
れら配列によりコードされた分子を使用して動物または
ヒトを免疫化する場合、これらはｈＬＨと交叉反応する
抗体の形成を示す。これら抗体は、ｈＬＨがその受容体
に結合した後に露出されることが知られた分子の部分を
識別するので、これらはｈＬＨの作用を阻害できるが、
その生物学的活性を完全には抑制しない。

【００６０】ある場合は、鋳型抗体および排除抗体を用
いることができない。これらの場合は、鋳型抗血清およ
び排除抗血清を作成して次の手法により抗体の代わりに
使用することができる。ラットの卵巣黄体は、雌ラット
をＰＭＳＧおよびｈＣＧにより上記したように処理して
作成される。これら黄体をｈＬＨと共に培養して、膜に
おけるＬＨ受容体に対しホルモンが結合することを可能
にする。次いで膜を洗浄して遊離するｈＬＨを除去し、
膜を抗血清と共に培養する。膜のＬＨ受容体に結合した
ｈＬＨに結合する抗体を、次いで膜の洗浄により抗血清
の残部から分離する。これら抗体は５未満のｐＨにおけ
る膜の処理により放出される。この処理は抗体とｈＬＨ
との両者を受容体から放出させる。これら抗体をゲル濾
過または他の方法によりｈＬＨから分離し、次いで鋳型
として使用することができる。鋳型抗体が欠失した血清
に残留する抗体を排除抗体として使用することができ
る。

【００６１】実施例７ ｈＣＧを中和する抗体を誘発する抗原の開発 好適な受精抑制の免疫原は、ｈＬＨではなくｈＣＧに対
する抗体の産生を誘発すると考えられる。これは、異る
抗体を使用して実施例６記載の鋳型／排除方法を用いる
ことができる。Ｂ１０７およびＢ１０９を含む鋳型抗体
は、コロンビア大学から入手できる。これら抗体は、高
親和性でｈＣＧに結合し、遊離ｈＣＧβ−サブユニット
またはｈＬＨに対し低い親和性を有している。ｈＣＧの
ヘテロ二量体（例えば、分子の生物学的活性化形態）に
対し特異的であり、循環中のｈＣＧの殆どの他の不活性
化形態には結合せず、抗体により中和されるという理由
から、高親和性（Ｋａ＞５×１０７Ｍ-1）でそれら抗体
により認識され得る免疫原は、ｈＣＧに対する抗体の中
和の形成を誘発する。この免疫原に好適に維持されるべ
きβ−サブユニットの蛋白質は、４３〜５３および９１
〜９２残基を含有する。さらに、他の有用な鋳型抗体
は、ＨＣＺ１０７およびＨＣＯ５１４であり、ハイブリ
テック、サン ディエゴ、ＣＡから入手可能である。こ
れら抗体は、ｈＣＧおよびその遊離β−サブユニットの
両方に高親和性で結合し、ホルモンの活性を中和する
が、さらにｈＬＨに対して低い親和性を有している。ｈ
ＣＧとのＨＣＺ１０７の相互作用に対する重要な残基
は、１１４残基の付近が含まれ、ｈＣＧとのＨＣＯ５１
４の相互作用に対する重要な残基は、７７残基の付近が
含まれる。

【００６２】実施例８ 免疫学的活性の増強 ＬＨまたは絨毛性ゴナドトロピンに対する免疫化の活性
化において、１つは部位−決定自己免疫反応を引き起こ
すことである。従って、抗原性の高い蛋白質を用いるこ
とが不可欠である。可能な限り外来性の免疫原を作る実
施例６記載の鋳型／排除の手法を用いることにより可能
となる。さらに、免疫系を使用して相互作用し得る機会
を増加する多価の蛋白質を作ることが所望される。多価
の蛋白質を作る１つの良好な方法は、Ｃ−末端またはＮ
−末端のどちらかに他の分子と多重螺旋を形成するα−
ヘリックスの形成させると考えられる残基を添加するこ
とである。多重螺旋を形成するペプチド配列の設計の法
則は、公知のことである（６０，６１）。さらに、イン
フルエンザウイルスのヘマグルチニン蛋白質、ラミニ
ン、ＧＣＮ４または任意の幾つかの他の蛋白質中に見出
されているような多重螺旋を形成することが知られてい
る蛋白質から自然に生じる配列を使用することもでき
る。Ｃ−末端またはＮ−末端にコラーゲン見出されてい
るのと類似する３重ヘリックスの形成を生じさせる残基
を添加することもできる。これら３重ヘリックスは、抗
原の３個またはそれ以上の分子と結合させることを可能
にする。免疫原の抗原性を増加させるための他の方法と
して、免疫原の末端同士を供役させることによるポリ蛋
白質の作成を伴うものもまた使用することができる。図
５に概略を示しように、この方法の使用によりユニット
の反復の任意の数を有する蛋白質を設計することは可能
である。

【００６３】ＬＨ活性の非−中和阻害を与える好適な抗
体は、通常遊離β−サブユニットおよびそのヘテロ二量
体とよく相互作用する。従って、これら抗体の形成を誘
発する免疫原の調製において、遊離β−サブユニットを
用いて開始するのが通常便利である。これに対し、ｈＣ
Ｇ活性の中和阻害を与える多くの好適な抗体は、遊離β
−サブユニットよりα，β−ヘテロ二量体とよく結合す
る。これら抗体形成の誘発は、ｈＣＧβ−サブユニット
の１〜１１４残基からなるペプチドのＣ−末端とグリシ
ンおよびセリンの６回反復単位を構成する柔軟性蛋白質
リンカーのＮ−末端とを供役させることにより調製する
融合蛋白質である免疫原と始めるのがしばしば有用であ
る。この融合蛋白質のＣ−末端は、ウシα−サブユニッ
トの１〜９６残基のＮ−末端と供役させる。これは、ｈ
ＣＧにおいて見出されるβ−サブユニットの残基の全体
的構成を有する単一の蛋白質を提供し、かつ直接免疫化
に使用でき、または実施例６における開始化合物として
使用することができる。抗原の投薬は、当業者に公知の
任意の方法において実施することができる。投薬は、注
射、アジュバンド中における注射および抗原のウイルス
との供役を伴うのもである。

【００６４】実施例９ ｈＣＧ効果の逆転 妊娠を誘発するためにｈＣＧを用いる女性への接種は、
次の幾つかの所望する特徴を有する、１）抗体は受精を
生じさせることのみに機能する、２）処方は長期にわた
る（多数の月経周期に対して生じる）および３）女性
は、ピルを接種する必要がなくあるいは着床する。さら
に、接種は子宮による胎児の排除を妨げることが知られ
ているプロゲスチンを用いることにより可逆性である。
プロゲスチンには、ジドロゲステロンのような多くのプ
ロゲステロンの化合物が含まれる（６２）。この化合物
は、ソルベイ、ファルマシティカル、９０１ ソーヤ
ロード、マリエッタ、ジョ−ジア州から商業的に入手可
能であり、免疫分析においてプロゲステロンと交叉反応
しない所望される特徴を有している。従って、ジドロゲ
ステロンの処方は、プロゲステロンのレベルの正確な測
定を妨げない。ｈＣＧに対し活性的に免疫化した女性
は、正常な月経周期を有し続け、月経周期の中間点中、
期待される時間に排卵される。受精を伴う本方法におい
て、排卵される時を知ることが所望される。ところが、
月経周期の１８日目において排卵されることだけが予想
することができる。排卵時において、プロゲステロン
は、ＬＨの影響下において黄体において産生される。プ
ロゲステロンは、排卵と相関しかつ排卵を監視する方法
として知られている基礎体温の上昇を引き起こす。ＬＨ
の上昇を監視する他の方法は、測定排卵検出キットのう
ちの１つを用いて尿中のＬＨを測定することである。２
０日目以後、妊娠し始めることが所望される女性は、ジ
ドロゲステロン（１日に３〜６ｍｇを３回）および０．
６２５〜１．２５ｍｇのプレマリン（アイルスト リミ
テッド、ニューヨーク、ＮＹ）を投与し始める。この投
与量は、接種の結果として中和されなければ、ｈＣＧに
より引き起こされる黄体のプロゲステロンを模倣するの
に充分である。ジドロゲステロンの投与は、６週間生理
を阻害し続ける。そのときにジドロゲステロン治療が終
了する。血清中のプロゲステロンのレベルが低ければ、
妊娠は起きず、生理が続いて起こり、かつ妊娠において
もう１回試みることができる。血清中のプロゲステロン
のレベルが高ければ、プロゲステロンのレベルは妊娠お
よびプロゲステロンの胎盤における産生により高いので
ある。ジドロゲステロンの終了は、妊娠を中絶させない
と考えられる。血清中のプロゲステロンのレベルもま
た、標準的ラジオイムノ分析技術を用いて監視すること
ができる。

【００６５】実施例１０ ＦＳＨを用いた接種による男性の受精能の抑制 ＦＳＨの免疫中和は、サルにおいて受精を阻害すること
が示され、ヒトにおいて受精を阻害することが期待され
ている（８）。ＦＳＨのβ−サブユニットが高く保存さ
れている特徴により、任意の種において使用するＦＳＨ
に対し、高い力価を有する中和抗体の誘発を可能にする
高特異性ｈＦＳＨを開発することは非常に困難である。
ｈＣＧに対する抗体の開発に関して記載した方法は、ｈ
ＦＳＨに対する抗体の開発に適用することができる。従
って、ｈＦＳＨのβ−サブユニットの１〜１１１残基を
ｈＣＧのβ−サブユニットの１〜１１４または１〜１１
７に置換する分子を用いて開始する。鋳型抗体として、
１つはＦＳＧ７６１（ハイブリテック）を使用すること
ができる。中和抗体を所望することにより、好適開始分
子はグリシン−セリンリンカーを介してｈＦＳＨのβ−
サブユニットと供約するウシα−サブにユニットポリペ
プチドもまた含有し得る。ヒトにおいてこのワクチンの
使用は受精を妨げることができる。

【００６６】実施例１１ ｈＣＧに対する本発明の試験的手法の詳細 １．１つは、モノクローナル抗体の作成またはそれらの
購入のいずれかにより中和抗体を得る。１つは、ｈＣＧ
に対するウサギまたは他の動物の免疫化により中和抗血
清を得る。ｈＬＨに対する抗体あるいは抗血清を得るこ
とも有用である。 ２．これら抗体あるいは抗血清は、ｈＣＧのβ−サブユ
ニットの突然変異体のライブラリーのスクリーニングに
陽性および陰性鋳型として使用する。これらのライブラ
リーは、ｈＣＧ分子の特定領域においてｈＣＧのβ−サ
ブユニットのランダム突然変異導入により作成すること
ができる。Ｃ−末端を欠損したあるいは、中和しない免
疫原に対し選択を無効にする分子の一部に関して異なる
配列を有するｈＣＧβ−サブユニットを使用するのが好
適であることに注目する。１つの便利な方法は、後にも
示すファージ表示技術の使用を伴う。しかしながらファ
ージ表示は、作業する技術に対し必須ではない。３．突
然変異体は、陽性選択抗体に最初に結合させることがで
きる。本実施例、即ちｈＣＧのワクチンの開発は、ＬＨ
に構造的に一致する突然変異体を取り除くＬＨに対する
抗体またはＬＨに対する抗血清に結合することを伴う。 ４．陰性選択抗体に結合しない突然変異体は、陽性選択
抗体、即ちｈＣＧの免疫化により作成される抗体に結合
させることができる。陽性選択方法中、遊離ｈＣＧβ−
サブユニットを、遊離サブユニットに結合する抗体を排
除するためおよび二量体特異的なこれら抗体の選択方法
を制限するために添加する。陽性選択抗体に結合しない
突然変異体は、廃棄する。ファージ発現蛋白質の場合に
は、ファージは陽性選択抗体から溶出し、Ｅ．ｃｏｌｉ
の感染に使用する。 ５．本方法は、ｈＬＨに結合し得る潜在的免疫原を削除
し、さらにｈＣＧ抗体に対し低親和性を有する免疫原を
排除するために数回繰り返す。免疫原をコードするＤＮ
Ａ配列を、配列決定する。ｈＣＧとは最も異なるがｈＣ
Ｇ特異的抗体または抗血清と高親和性で結合する可能性
が残る免疫原は、さらに使用する。 ６．必要であれば、潜在的免疫原とｈＣＧとの違いの数
を増加させるために２回の突然変異導入を実施する。目
標は、ｈＬＨとは異なりかつ可能な限りｈＣＧとは異な
るが高力価中和抗体の誘発を可能にするｈＣＧの構造の
重要な形態を残す免疫原を工夫することである。これら
は、ｈＬＨのβ−サブユニットとはほとんど異なるＣ−
末端とは別のβ−サブユニットの領域を含む。 ７．主要な特異的抗原決定因子を選択すると、免疫原は
多価として作られる。これを達成する幾つかの方法があ
る。その１つは、決定因子を自身多価であるまたは多量
体形態（例えば、免疫グロブリン）である蛋白質と融合
させることである。もう１つは、残基を多重螺旋形態お
よび会合を促進する蛋白質と融合させることである。可
能な点で、それらは免疫反応を誘発することが知られて
いる自然の蛋白質に由来する。 ８．Ａ．受精を妨げることを所望するのであれば、その
ままのｈＣＧ分子に対し高い力価を獲得することが必須
である。これは、ｈＣＧとα−サブユニットに類似する
分子との結合にも必要であるかもしれない。他の哺乳動
物の糖蛋白質のα−サブユニットは、開始物資として適
合する。 ８．Ｂ．開始点においても適合する分子は、単一ポリペ
プチドである所望し得る特徴を有し、かつヘテロ二量体
の特徴を残すものである。この場合において、α−サブ
ユニットに由来する分子の部分においてもまた突然変異
させることが望ましい。 ８．Ｃ．免疫原は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物
細胞において発現させるような任意の便利な方法を用い
て製造することができる。免疫原をグリコシル化する必
要はない。免疫原は、ウイルスのコート中に組込むこと
もできる。 ８．Ｄ．ｈＣＧβ−サブユニットと開始するために必要
ではなく、任意の蛋白質と開始することができる。所望
する蛋白質を選択する鋳型手法を用いることが重要であ
る。例えば、４個のヘリックスの束を用いて開始し、か
つｈＣＧのβ−サブユニットの３８〜５７残基および９
１〜９２残基に隣接する部分のアミノ酸配列を組込むこ
ともできる。ｈＣＧ−特異的抗体に対する抗イデオタイ
プモノクローナル抗体を伴う、免疫グロブリンを用いて
開始することもできる。 図１は、放射線標識したｈＬＨのＬＨ受容体への結合に
おける抗体および抗血清の影響を説明するグラフであ
る。図１は、ｈＬＨのＬＨ受容体への結合における３種
の異なったタイプの抗体または抗血清の影響を説明す
る。抗体“Ａ”は、ホルモンの受容体への結合において
殆どあるいは全く効果を有していない。in vivoでその
主要潜在的な阻害の影響は、ホルモンの代謝によるもの
である。抗体“Ｂ”は、ホルモンの受容体への結合を部
分的に阻害する能力を有している。従って、この抗体
は、in vivoでは阻害するが、ＬＨに関しこの抗体を大
過剰量使用しても、示すように４０％未満までその活性
を減少させることはできない。ＬＨの活性を阻害する異
なる能力を有する異なる抗体（例えば、Ｂ１０５および
Ｂ１１０）を製造できることを記す。抗体“Ｂ”は、in
vivoにおいて最も有用である抗体の一般的タイプの例
である。高濃度においてｈＬＨの活性を抑制することか
ら、抗体“Ｃ”は、中和抗体である。その潜在的ＬＨ活
性の抑制により、この抗体の過剰量は、受精を阻害す
る。図２は、in vitroにおいてステロイド産生を誘導す
るｈＬＨの活性において抗体および抗血清の影響を説明
するグラフである。図２は、ラット精巣Ｌｅｙｄｉｇ細
胞懸濁液からテストステロンの合成（つまりステロイド
産生）を誘導するＬＨの能力において、３種の抗体の効
果を示す。曲線“Ａ”は、抗体の不存在下においてのス
テロイド産生を誘導するｈＬＨの能力を示す。曲線
“Ｂ”は、ｈＬＨ活性を約３倍減少させる得る定量以上
の過剰量の抗体存在下においてのステロイド産生を誘導
するｈＬＨの能力を示す。曲線“Ｃ”は、、ｈＬＨ活性
を約２０倍減少させる得る定量以上の過剰量の抗体存在
下においてのステロイド産生を誘導するｈＬＨの能力を
示す。曲線“Ｄ”は、、ｈＬＨ活性を中和し得る定量以
上の過剰量の抗体存在下においてのステロイド産生を誘
導するｈＬＨの能力を示す。in vivoにおいて“Ｂ”お
よび／または“Ｃ”抗体の使用の決定は、ＬＨ／ＦＳＨ
との比率および所望するＬＨ活性を抑制するその程度に
依存する。ｈＬＨのレベルが高くかつ最も減少させる必
要がある場合には、抗体“Ｃ”を使用するのが好適であ
る。ｈＬＨ／ｈＦＳＨの比率が殆ど上昇しない場合に
は、抗体“Ｂ”が好適である。非常に高い投与量におい
ての抗体“Ｄ”の使用は、不妊を生じさせる。多くの有
用な抗体は精巣細胞と同様に卵巣細胞においてｈＬＨま
たは他のＬＨの活性を減少させる能力を有することが見
出されることが予測される。図３は、in vivoにおいて
ステロイド産生を誘導するｈＬＨの能力において抗体お
よび抗血清の影響を説明するグラフである。図３は、抗
体の定量以上の量は、投与されるｈＬＨの異なる量に先
立ち投与される場合に、雄におけるテストステロンの形
成における３種の異なる抗体の効果を示す。説明する全
ての実施例において、抗体の量は、モル濃度に基づいて
ｈＬＨの濃度より非常に多量が投与される。同様な効果
は、雌におけるステロイド産生における抗体に対して期
待される。曲線“Ａ”は、抗体不存在下でのステロイド
産生におけるｈＬＨの効果を示す。曲線“Ｂ”は、最大
４０％までのｈＬＨ活性を阻害し得る定量以上の量の抗
体の効果を示す。曲線“Ｃ”は、最大９５％までのｈＬ
Ｈ活性を阻害し得る定量以上の量の抗体の効果を示す。
曲線“Ｄ”は、抗体を中和する定量以上の量の抗体の効
果を示す。図４は、鋳型／排除選択手法において使用で
きるベクターを示す。これらベクターは、バス等（３
４）の記載のように設計において類似し、ヒト成長ホル
モンをコードする配列をｈＬＨのα−サブユニットまた
はホー等（６３）により記載されたＳＯＥ方法のように
当業界において標準であるポリメラーゼ連鎖反応を用い
て作成したｈＬＨのキメラをコードする配列で置換する
ことによって作成される。ｈＣＧおよびｂｈＦＳＨに対
する免疫原の産生のための同様なベクターは、ヒト成長
ホルモンをコードする配列をｈＣＧのβ−サブユニット
の１〜１１４残基をコードする配列、ｈＦＳＨのβ−サ
ブユニットの１〜１１１残基、ウシα−サブユニットを
コードする配列の５´に会合するグリシン−セリン−グ
リシン−セリン−グリシン−セリン−グリシン−セリン
−グリシン−セリン−グリシン−セリン−のアミノ酸を
コードする配列を５´に会合するｈＣＧのβ−サブユニ
ットの１〜１１４残基をコードする配列またはウシα−
サブユニットをコードする配列の５´に会合したグリシ
ン−セリン−グリシン−セリン−グリシン−セリン−グ
リシン−セリン−グリシン−セリン−グリシン−セリン
−のアミノ酸をコードする配列を５´に会合するｈＦＳ
Ｈのβ−サブユニットの１〜１１１残基をコードする配
列で置換することによって作成される。この図におい
て、“lac p”はlacプロモータを表し、stIIはリーダー
配列を表し、“hLH ベータ”はヒトＬＨβ−サブユニッ
トのコドン１〜コドン１１４をコードする配列を表し、
“M13 gene III”はstIIおよびヒトＬＨβのコドンのよ
うに同じ読み枠におけるM13 蛋白質の１９８〜４１０コ
ドンの配列をコードする配列を表す。“Amp耐性”は、
β−ラクタマーゼ酵素をコードするｐＢＲ３２２に由来
する遺伝子であり、“322 ori”はｐＢＲ３２２の複製
起点であり、“f1 ori”はM13の複製起点である。突然
変異は、このベクターの “hLH ベータ”の部分におい
て作成される。さらに、“hLH ベータ”のコドンは本明
細書に記載する他の蛋白質のコドンと置換することがで
きる。図５は、ＬＨ、ｈＣＧまたはＦＳＨに対する活性
的な免疫化に使用される抗原性を増加させる免疫原のタ
イプを示す。これらの幾つかは、多重螺旋（パネルＡ）
の形態として知られている７回反復を有する。他は、３
重ヘリックス（パネルＢ）の形態として知られている単
一反復を有する。これらは多量体であるために、抗原性
の増強を与える。多量体免疫原の作成の他の方法は、免
疫グロブリン（パネルＤ）のＣ−末端（パネルＣ）ある
いはＮ−末端（パネルＮ）との融合蛋白質の調製を伴
う。ウシα−サブユニット、ｈＣＧのβ−サブユニット
およびｈＦＳＨの融合蛋白質を構成する単一鎖の免疫原
は、ヒトにおいて増強した抗原性を有する。 挿絵Ａ：２個以上の７回反復のコドンは、コドン１１４
とｌｈまたはβサブニットのアナログの終止コドンとの
間のフレーム中に挿入される。７回反復の設計は、引用
文献６０に記載のものと類似する。各々の反復は、下記
する特徴を有する“Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ”のた
めに標識した７アミノ酸を含有する。アミノ酸ａおよび
ｄは、疎水性アミノ酸、つまりロイシン、イソロイシン
またはバリンである。アミノ酸ＥおよびＧは、電荷のあ
るアミノ酸である。アミノ酸Ｅは、ホモ二量体を形成す
るためにアミノ酸Ｇとは逆の電荷を有する。従って、Ｅ
がグルタミン酸であれば、Ｇはリジンである。アミノ酸
“Ｂ，Ｃ，Ｆ”は、ヘリックスの形成を支持するほぼ任
意のタイプとすることができる。従って、これらは、プ
ロリンまたはグリシンをほとんど含有しない。 挿絵Ｂ：６回以上の３アミノ酸反復のコドンは、コドン
１１４とβ−サブユニットの間のフレーム中に挿入され
る。これら３アミノ酸は、グリシン、Ｘ、Ｙのアミノ酸
をコードし、ＸおよびＹは３重ヘリックスを形成するコ
ラーゲンの配列の一部分として知られている任意のアミ
ノ酸である。 挿絵Ｃ：ＩｇＧ重鎖のコドンは、β−サブユニットのコ
ドン１の５´に即座に挿入される。これらの遺伝子が、
ラムダまたはカッパＩｇＧ軽鎖と共に発現する場合に
は、そのＣ−末端において２つのβ−サブユニットを含
有するＩｇＧの産生が引き起こされる。 挿絵Ｄ：可変および第１不変領域を欠損するＩｇＧ重鎖
のコドンは、β−サブユニットのコドン１１４と終止コ
ドンとの間のフレーム中に挿入される。 挿絵Ｅ：グリシン−セリン−グリシン−セリン−グリシ
ン−セリン−グリシン−セリン−グリシン−セリン−グ
リシン−セリン−のようなグリシン−セリン反復配列
（つまり、ＧＳ反復）のコドンは、β−サブユニットの
アナログのコドン１１４と終止コドンとの間のフレーム
中に挿入される。このアナログの最後のコドンは１２６
になる。次に、ウシあるいは他のα−サブユニットのコ
ドン１〜９６またはヒトのα−サブユニットのコドン１
〜９６は、ポリ−グリシン−セリン尾部を含有するβ−
サブユニット構成物のコドン１２６と終止コドンとの間
のフレーム中に挿入される。これは、糖蛋白質ホルモン
のヘテロ二量体の構造を運搬する、単一サブユニットの
ゴナドトロピンを形成する。 挿絵Ｆ：ヒト、ウシ、他の脊椎動物またはそのアナログ
配列のα−サブユニットのコドンは、遺伝子を調製しか
つ発現する標準的組換えＤＮＡ技術においていずれの当
業者に公知の方法を用いて、７回反復（つまり、７回反
復＃１）中の位置ＥおよびＧにおける陽電荷アミノ酸の
みを含有する７回反復をコードする遺伝子の最後のコド
ンと終止コドンとの間に添加される。この遺伝子が、細
菌、酵母、他の真核細胞または組織中で発現される場合
には、アミノ末端に陽電荷７回反復、カルボキシ末端に
α−サブユニットまたはα−サブユニットのアナログを
有する蛋白質が産生される。位置ＥおよびＧにおける陰
電荷アミノ酸をコードする７回反復（つまり、７回反復
＃２）のコドンは、β−サブユニットのアナログの最後
のコドンと終止コドンとの間に添加される。この遺伝子
が、細菌、酵母、他の真核細胞または組織中で発現され
る場合には、アミノ末端にβ−サブユニットまたはその
アナログ、カルボキシ末端には陰電荷７回反復を有する
蛋白質が産生される。 挿絵Ｇ：これは、挿絵Ｆに記載の形態を有する蛋白質が
混合される場合に形成されるヘテロ二量体を示す。７回
反復＃１および７回反復＃２の配列は、ヘテロ二量体の
形成の促進およびヘテロ二量体の削減を選択する。 挿絵Ｈ：多量体は、α−とβ−サブユニットおよび７回
反復の組合せにより挿絵ＦおよびＧの化合物が混合され
る場合に形成される。挿絵Ａ〜Ｈにおいて、“N-”およ
び“C-”は、蛋白質のアミノ末端およびカルボキシ末端
を参照する。“i”は、数回反復し得る単一の単位を示
す。ここに説明する７回反復は同一であるが、同一の反
復の使用は必須ではないことをさらに注目する。ホモ二
量体またはヘテロ二量体を形成し得る非同一反復を含有
する蛋白質は、非常に多数存在する（６０）。

【００６７】ルトロピンおよび／またはフォリトロピン
活性を有する単一鎖ゴナドトロピン 実施例１２ ルトロピン活性を有する単一鎖ゴナドトロピン（図６参
照）であるアナログ＃１の調製およびその使用（表１参
照） 表１に列記したアナログ＃１をコードする配列は、引用
文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、あるいはｈＣＧのβ−サブユニットおよびヒトα−
サブユニットをコードする配列を用いて開始することで
調製することができる。これらは、ヒト胎盤ｃＤＮＡラ
イブラリーからクローニングすることができる。ヒトα
−サブユニットに由来する単一ペプチドをコードする配
列は削除され、その蛋白質をコードする配列はＳＯＥ技
術を用いて下記するようにしてスプライスされる：5´-
ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGGATGGAGATGT TCCAGGG
GCTGCT-3´の配列を有するプライマー＃１（１００ｎ
ｇ）および3´- GGGAGCCTGTGGGGCTAGGAGGGGGTTCCTAGGCC
ATCGCCTGACCA TGC-5´の配列を有するプライマー＃２
（１００ｎｇ）を鋳型として供給したｈＣＧのβ−サブ
ユニットｃＤＮＡ（１μｇ）と混合し、９４℃（３０
秒），５０℃（６０秒），７２℃（６０秒）の２５回の
温度サイクルでストラタジーン、ラジョラ、ＣＡから購
入のPftポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸
および引用文献（６３）に記載するようにＰＣＲ緩衝液
を用いてＰＣＲを実施した。5´-GGATCCGGTAGCGGATCTGG
TAGCGCTCCTGATGTGCAGGATTGCCCA-3´の配列を有するプラ
イマー＃３（１００ｎｇ）および3´-ACGT CATGAACAAT
AATAGTGTTTAGAATTCCATGGCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCCT-5´
の配列を有するプライマー＃４（１００ｎｇ）を鋳型と
して供給したｈＣＧのα−サブユニットｃＤＮＡ（１μ
ｇ）と混合し、９４℃（３０秒），５０℃（６０秒），
７２℃（６０秒）の２５回の温度サイクルでストラタジ
ーン、ラジョラ、ＣＡから購入のPftポリメラーゼ、デ
オキシヌクレオチド三リン酸および引用文献（６３）に
記載するようにＰＣＲ緩衝液を用いてＰＣＲを実施し
た。これら２つのＰＣＲ反応は、クローニングに適合す
る形態において所望の構成物を与える３回目（最後）の
ＰＣＲ反応に対して中間鋳型として供給する産生物を与
える。最後のＰＣＲ反応は、最初の２つのＰＣＲ反応の
産生物１μｇを5´-ATGAAATCGACGGAATCAGACTCGAGCCAAGG
-3´の配列を有するプライマー＃５および3´-ATTCCATG
GCCTAGGTAGAGTTCGATTAGGCCT-5´の配列を有するプライ
マー＃６と混合し、９４℃（３０秒），５０℃（６０
秒），７２℃（６０秒）の２５回の温度サイクルでスト
ラタジーン、ラジョラ、ＣＡから購入のPftポリメラー
ゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸および引用文献（６
３）に記載するようにＰＣＲ緩衝液を用いてＰＣＲを実
施した。最終的ＰＣＲ産生物は、制限酵素XhoIおよびBg
lIIを用いて消化し、アナログ１を直接合成するベクタ
ーを作成するためにXhoIおよびBglIIを用いて消化しpSV
L（ファルマシア、ピスカタウェイ、ＮＪから得た発現
ベクター）中に連結した。XhoI部位は再度作成され、Bg
lIIおよびBamHI部位は削除される。図６にて説明する所
望するアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするものが
見出されるまで、幾つかの構成物のコードする領域（例
えば、XbaIとKpnIとの間の領域、図６参照）の配列を決
定する。これは、ＰＣＲおよび他のＤＮＡ操作の結果発
生する誤りの可能性を削除するために行い、所望する配
列が得られたことを確信するための標準的予防策であ
る。発現した蛋白質は、ｈＣＧのβ−サブユニット中に
見出されるシグナル配列の部分でありかつ蛋白質合成の
際に細胞により取り除かれるMEMFQGLLLLLLL SMGGTWAの
アミノ酸残基を欠損していることが期待され得る。この
ベクターは、引用文献（６４）の記載のようにＣＯＳ−
７細胞中で発現し、培地中に放出されるこの蛋白質は、
放射線標識したｈＣＧのｈＣＧに対するモノクローナル
抗体または抗血清への結合を阻害する能力が試験され
る。ＣＯＳ−７細胞により作られた蛋白質は、下記する
１種または２種以上の抗体に対する結合において放射線
標識したｈＣＧと競合する：Ｂ１０１（コロンビア大学
から入手），Ｂ１０５（コロンビア大学から入手），Ｂ
１０７（コロンビア大学から入手），Ｂ１０９（コロン
ビア大学から入手），Ａ２０１（コロンビア大学から入
手），ＨＣＵ０６１（ハイブリテクから入手），ＨＣＺ
１０７（ハイブリテクから入手），またはＨＣＯ５１４
（ハイブリテクから入手），ＺＭＣＧ１３（ピアスから
入手），ＺＭＣＧ７（ピアスから入手）または５１８Ｂ
７（デビスのカルフォルニア大学のジャネット ローザ
博士から入手）。培地中に放出された蛋白質は、キャン
ベル、ジーン−エマーグおよびモイル（６４）に記載さ
れたように、黄体濾胞にある受容体に対する結合におい
て放射線標識したｈＣＧと競合する。モイル等（３７）
により記載されたのと同様に実施するライディッヒ細胞
分析においてテストステロンの形成が刺激され、および
雌の動物において排卵が刺激されかつ雄の動物において
テストステロンの形成が刺激されることが期待される。
このアナログは、実施例１１において略述した要点の鋳
型手法を用いた避妊用ワクチンにおいて、その使用の良
好な出発点となることがさらに期待される。このアナロ
グは、表１にアナログ＃１として示し、GSGSGSGSのリン
カー配列を有する。このリンカーは、発現ベクターをエ
ンドヌクレアーゼ制限酵素ApaIおよびEco47IIIで消化
し、短い断片を捨て、合成２重鎖ＤＮＡのカセットを標
準方法によってグリシンまたはセリンのコドンあるいは
他のアミノ酸のコドンの任意の数を含有する所望するア
ミノ酸コドンとApaI/Eco47III部位中に連結し、所望す
る突然変異が作られたことを確かめるためにApaI/Eco47
IIIの間を配列決定し、ＣＯＳ−７細胞中で蛋白質を発
現させることによって改良することができる。これは単
一鎖ゴナドトロピン活性を最適化するために為される。
この蛋白質は、単量体として機能するまたは活性ホモ二
量体を形成するために結合することが期待される。さら
に、この蛋白質の数コピーは多量体を形成するために結
合することが期待される。

【００６８】実施例１３ ルトロピン活性を有する単一鎖ゴナドトロピンであるア
ナログ＃２の調製およびその使用（図７参照） 表１に列記したアナログ＃２をコードする配列は、引用
文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、あるいはプライマー＃１と＃７および鋳型として実
施例１２および図６に記載する発現構成物を使用してＰ
ＣＲにより調製することができる。プライマー＃７の配
列は、3´-TGGTGGGGAACTGGACACTAC TGGGCGCCCCTAGGCCAT
CG-5´である。最終的ＰＣＲ産生物は、制限酵素XhoIお
よびBglIIを用いて消化し、XhoIおよびBglIIを用いて実
施例１２に記載の発現構成物を消化することで得られる
ＤＮＡの大きな断片と連結した。図７に示すアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードするものが得られていること
が見出されるまで、幾つかの構成物のXbaIとKpnIとの間
をコードする領域の配列を決定する。これは、クローニ
ングの人為的要因が変化させた領域中に存在していない
ことの保証となる。発現した蛋白質は、ｈＣＧのβ−サ
ブユニット中に見出されるシグナル配列の部分でありか
つ蛋白質合成の際に細胞により取り除かれるMEMFQGLLLL
LLLSMGGTWAのアミノ酸残基を欠損していることが期待さ
れ得る。このベクターは、ＣＯＳ−７細胞中で発現し、
培地中に放出されるこの蛋白質は、放射線標識したｈＣ
ＧのｈＣＧに対するモノクローナル抗体または抗血清へ
の結合を阻害する能力が試験される。ＣＯＳ−７細胞に
より作られた蛋白質は、下記する１種または２種以上の
抗体に対する結合において放射線標識したｈＣＧと競合
する：Ｂ１０１（コロンビア大学から入手），Ｂ１０５
（コロンビア大学から入手），Ｂ１０７（コロンビア大
学から入手），Ｂ１０９（コロンビア大学から入手），
Ａ２０１（コロンビア大学から入手），ＨＣＵ０６１
（ハイブリテクから入手），またはＨＣＯ５１４（ハイ
ブリテクから入手），ＺＭＣＧ１８（ピアスから入
手），ＺＭＣＧ１３（ピアスから入手），ＺＭＣＧ７
（ピアスから入手）または５１８Ｂ７（デビスのカルフ
ォルニア大学のジャネット ローザ博士から入手）。培
地中に放出された蛋白質は、キャンベル、ジーン−エマ
ーグおよびモイル（６４）に記載されたように、黄体濾
胞にある受容体に対する結合において放射線標識したｈ
ＣＧと競合する。モイル等（３７）により記載されたの
と同様に実施するライディッヒ細胞分析においてテスト
ステロンの形成が刺激され、および雌の動物において排
卵が刺激されかつ雄の動物においてテストステロンの形
成が刺激されることが期待される。このアナログは、実
施例１１において略述した鋳型手法を用いた避妊用ワク
チンにおいて、その使用の良好な出発点となることがさ
らに期待される。このアナログは、表１にアナログ＃２
として示し、GSGSGSGSのリンカー配列を有する。このリ
ンカーは、発現ベクターをエンドヌクレアーゼ制限酵素
SstIIおよびEco47IIIで消化し、短い断片を捨て、合成
２重鎖ＤＮＡのカセットを標準方法によってグリシンま
たはセリンのコドンあるいは他のアミノ酸のコドンの任
意の数を含有する所望するアミノ酸コドンとSstII/Eco4
7III部位中に連結し、所望する突然変異が作られたこと
を確かめるためにSstII/Eco47IIIの間を配列決定し、Ｃ
ＯＳ−７細胞中で蛋白質を発現させることによって改良
することができる。これは単一鎖ゴナドトロピン活性を
最適化するために為される。この蛋白質は、単量体とし
て機能するまたは活性ホモ二量体を形成するために結合
することが期待される。さらに、この蛋白質の数コピー
は多量体を形成するために結合することが期待される。

【００６９】実施例１４ フォリトロピン活性を有する単一鎖ゴナドトロピンであ
るアナログ＃３の調製および使用、（図８参照） 表１に列記したアナログ＃３をコードする配列は、引用
文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、またはプライマー＃１と＃７をプライマー＃８と＃
９に置換しかつｈＣＧのβ−サブユニットのｃＤＮＡの
代わりに鋳型としてｈＬＨのβ−サブユニットのｃＤＮ
Ａを用いたことを除いて実施例１３においてアナログ＃
２に関して記載する方法において調製することができ
る。ｈＬＨのβ−サブユニットｃＤＮＡは、ヒト胎盤ｃ
ＤＮＡをスクリーニングすることにより得ることができ
る。プライマー＃８の配列は、5´-ATGAAATCGACGGAATC
AGACTCGAGCCAAGGAATGGAGATGCTCCAGGGGCTGCT-3´であ
り、プライマー＃９の配列は、3´-GTGGGGAACTGGACACTG
GTGGGGGTTCCTAG GCCATCGCCTAGACCATCG-5´である。最終
的ＰＣＲ産生物は、制限酵素XhoIおよびBamHIを用いて
消化し、実施例１２に記載に記載するように作成した発
現ベクターのXhoI/BamHI部位にサブクローニングした。
図８に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするも
のが見出されるまで、幾つかの構成物のXbaIとBamHIと
の間をコードする領域の配列を決定する。発現した蛋白
質は、ｈＬＨのβ−サブユニット中に見出されるシグナ
ル配列の部分でありかつ蛋白質合成の際に細胞により取
り除かれるMEMLQGLLLLLLLSMGGAWAのアミノ酸残基を欠損
していることが期待される。このベクターは、ＣＯＳ−
７細胞中で発現し、培地中に放出されるこの蛋白質は、
放射線標識したｈＣＧのｈＣＧに対するモノクローナル
抗体または抗血清への結合を阻害する能力が試験され
る。ＣＯＳ−７細胞により作られた蛋白質は、下記する
１種または２種以上の抗体に対する結合において放射線
標識したｈＣＧと競合する：Ｂ１０１（コロンビア大学
から入手），Ｂ１０５（コロンビア大学から入手），Ａ
２０１（コロンビア大学から入手），ＨＣＵ０６１（ハ
イブリテクから入手），ＺＭＣＧ７（ピアスから入手）
または５１８Ｂ７（デビスのカルフォルニア大学のジャ
ネット ローザ博士から入手）。培地中に放出された蛋
白質は、キャンベル、ジーン−エマーグおよびモイル
（６４）に記載されたように、黄体濾胞にある受容体に
対する結合において放射線標識したｈＣＧと競合する。
モイル等（３７）により記載されたのと同様に実施する
ライディッヒ細胞分析においてテストステロンの形成が
刺激され、および雌の動物において排卵が刺激されかつ
雄の動物においてテストステロンの形成が刺激されるこ
とが期待される。このアナログは、前述した鋳型手法を
用いて、受精を促進または阻害するために設計したワク
チンにおいて、その使用の良好な出発点となることがさ
らに期待される。このアナログは、表１にアナログ＃３
として示し、GSGSGSGSのリンカー配列を有する。このリ
ンカーは、発現ベクターをエンドヌクレアーゼ制限酵素
BamHIおよびEco47IIIで消化し、短い断片を捨て、合成
２重鎖ＤＮＡのカセットを標準方法によってグリシンま
たはセリンのコドンあるいは他のアミノ酸のコドンの任
意の数を含有する所望するアミノ酸コドンとBamHI/Eco4
7III部位中に連結し、所望する突然変異が作られたこと
を確かめるためにBamHI/Eco47IIIの間を配列決定し、Ｃ
ＯＳ−７細胞中で蛋白質を発現させることによって改良
することができる。これは単一鎖ゴナドトロピン活性を
最適化するために為される。この蛋白質は、単量体とし
て機能するまたは活性ホモ二量体を形成するために結合
することが期待される。さらに、この蛋白質の数コピー
は多量体を形成するために結合することが期待される。

【００７０】実施例１５ フォリトロピン活性を有する単一鎖ゴナドトロピンであ
るアナログ＃４の調製およびその使用（図９参照） 表１に列記したアナログ＃４をコードする配列は、引用
文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、またはプライマー＃１と＃７をプライマー＃１０と
＃１１に置換しかつｈＣＧのβ−サブユニットのｃＤＮ
Ａの代わりに鋳型としてｈＦＳＨのβ−サブユニットの
ｃＤＮＡを用いたことを除いて実施例１３においてアナ
ログ＃２に関して記載する方法において調製することが
できる。ｈＦＳＨのβ−サブユニットｃＤＮＡは、ヒト
胎盤ｃＤＮＡをスクリーニングすることにより得ること
ができる。プライマー＃１０の配列は、5´-ATGAAATCGA
CGGAATCAGACTCGAGCCAAGGATGAAGACACTCCAGTTTTTCTTCC-3
´であり、プライマー＃９の配列は、3´-GACGAGGAAACC
ACTTTACTTTCTTCCTA GGCCATCGCCTAGACCA-5´である。最
終的のＰＣＲ産生物は、制限酵素XhoIおよびBamHIを用
いて消化し、実施例１２に記載に記載するように作成し
た発現ベクターのXhoI/BamHI部位にサブクローニングし
た。図９に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードす
るものが見出されるまで、幾つかの構成物のXbaIとBamH
Iとの間をコードする領域の配列を決定する。発現した
蛋白質は、ｈＦＳＨのβ−サブユニット中に見出される
シグナル配列の部分でありかつ蛋白質合成の際に細胞に
より取り除かれるMKTLQFFFLFCCWKAICCのアミノ酸残基を
欠損していることが期待される。このベクターは、ＣＯ
Ｓ−７細胞中で発現し、ＣＯＳ−７細胞により作られる
蛋白質は、下記する１種または２種以上の抗体に対する
結合において放射線標識したｈＣＧと競合する：ＺＭＦ
Ｓ１（ピアスから入手），Ａ２０１（コロンビア大学か
ら入手），ＨＣＵ０６１（ハイブリテクから入手），Ｆ
ＳＧ７６１（ハイブリテクから入手），ＦＳＲ０９３．
３（ハイブリテクから入手），ＦＳＨ１０７（ハイブリ
テクから入手），ＦＳＢ０６１（ハイブリテクから入
手），ＦＳＭ２１０（ハイブリテクから入手）およびＦ
ＳＭ２６８（ハイブリテクから入手）。培地中に放出さ
れた蛋白質は、キャンベル、ジーン−エマーグおよびモ
イル（６４）に記載されたように、ウシ精巣の受容体に
対する結合においてｈＦＳＨと競合する。スカフ等（６
５）により記載されたのと同様に実施する顆粒膜細胞分
析においてエストラジオールの形成が刺激され、哺乳動
物の雌および雄において濾胞の発達および精子形成が刺
激されることが期待される。このアナログは、ＦＳＨに
対する抗体を誘発する免疫原を選択するための有用な出
発化合物となり、かつ避妊ワクチンの一部となることが
さらに期待される。このアナログは、表１にアナログ＃
４として示し、GSGSGSGSのリンカー配列を有する。この
リンカーは、発現ベクターをエンドヌクレアーゼ制限酵
素ApaIおよびEco47IIIで消化し、短い断片を捨て、合成
２重鎖ＤＮＡのカセットを標準方法によってグリシンま
たはセリンのコドンあるいは他のアミノ酸のコドンの任
意の数を含有する所望するアミノ酸コドンとApaI/Eco47
III部位中に連結し、所望する突然変異が作られたこと
を確かめるためにApaI/Eco47IIIの間を配列決定し、Ｃ
ＯＳ−７細胞中で蛋白質を発現させることによって改良
することができる。これは単一鎖ゴナドトロピン活性を
最適化するために為される。この蛋白質は、単量体とし
て機能するまたは活性ホモ二量体を形成するために結合
することが期待される。さらに、この蛋白質の数コピー
は多量体を形成するために結合することが期待される。

【００７１】実施例１６ ｈＦＳＨよりｈＣＧに構造的に類似するＦＳＨ活性を有
する単一鎖性腺刺激ホルモンであるアナログ＃５の調製
およびその使用（図１０参照） 表１に列記したアナログ＃５をコードする配列は、引用
文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、またはプライマー＃７をプライマー＃１２に置換し
たことを除いて実施例１３においてアナログ＃２に関し
て記載する方法において調製することができる。プライ
マー＃１２の配列は、3´-CGACAGTCGACAGTTACACGTGAGAC
GCTGTCGCTGTCGTGACTAACATGACACGCTCCGGACCCCGGGTCGATGA
CGAGGAAACCACTTTACTTTCTTCCTAGGCCATCG-5´である。最
終的のＰＣＲ産生物は、制限酵素XhoIおよびBamHIを用
いて消化し、実施例１２に記載に記載するように作成し
た発現ベクターのXhoI/BamHI部位にサブクローニングす
る。図１０に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコード
するものが見出されるまで、幾つかの構成物のXbaIとBa
mHIとの間をコードする領域の配列を決定する。発現し
た蛋白質は、ｈＣＧのβ−サブユニット中に見出される
シグナル配列の部分でありかつ蛋白質合成の際に細胞に
より取り除かれるMEMLQGLLLLLLLSMGGAWAのアミノ酸残基
を欠損していることが期待される。このベクターは、Ｃ
ＯＳ−７細胞中で発現し、培地中に放出されるこの蛋白
質は、放射線標識したｈＣＧのｈＣＧに対するモノクロ
ーナル抗体または抗血清への結合を阻害する能力が試験
される。ＣＯＳ−７細胞により作られる蛋白質は、下記
する１種または２種以上の抗体に対する結合において放
射線標識したｈＣＧと競合する：Ｂ１０１（コロンビア
大学から入手），Ｂ１０５（コロンビア大学から入
手），Ｂ１０７（コロンビア大学から入手），Ｂ１０９
（コロンビア大学から入手），Ａ２０１（コロンビア大
学から入手），ＨＣＵ０６１（ハイブリテクから入
手），またはＨＣＯ５１４（ハイブリテクから入手），
ＺＭＣＧ１８（ピアスから入手），ＺＭＣＧ１３（ピア
スから入手），ＺＭＣＧ７（ピアスから入手）または５
１８Ｂ７（デビスのカルフォルニア大学のジャネット
ローザ博士から入手）。培地中に放出された蛋白質は、
キャンベル、ジーン−エマーグおよびモイル（６４）に
記載されたように、ウシ精巣の受容体に対する結合にお
いてｈＦＳＨと競合する。スカフ等（６５）により記載
されたのと同様に実施する顆粒膜細胞分析においてエス
トラジオールの形成が刺激され、哺乳動物の雌および雄
において濾胞の発達および精子形成が刺激されることが
期待される。このアナログは、表１にアナログ＃５とし
て示し、GSGSGSGSのリンカー配列を有する。このリンカ
ーは、発現ベクターをエンドヌクレアーゼ制限酵素ApaI
およびEco47IIIで消化し、短い断片を捨て、合成２重鎖
ＤＮＡのカセットを標準方法によってグリシンまたはセ
リンのコドンあるいは他のアミノ酸のコドンの任意の数
を含有する所望するアミノ酸コドンとBamHI/Eco47III部
位中に連結し、所望する突然変異が作られたことを確か
めるためにApaI/Eco47IIIの間を配列決定し、ＣＯＳ−
７細胞中で蛋白質を発現させることによって改良するこ
とができる。これは単一鎖ゴナドトロピン活性を最適化
するために為される。この蛋白質は、単量体として機能
するまたは活性ホモ二量体を形成するために結合するこ
とが期待される。さらに、この蛋白質の数コピーは多量
体を形成するために結合することが期待される。

【００７２】実施例１７ ｈＦＳＨよりｈＣＧに構造的に類似するＦＳＨおよびＬ
Ｈ活性を有する単一鎖ゴナドトロピン アナログ＃６の
調製およびその使用（図１１参照） 表１に列記したアナログ＃６をコードする配列は、引用
文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、またはプライマー＃７をプライマー＃１３に置換し
たことを除いて実施例１３においてアナログ＃２に関し
て記載する方法において調製することができる。プライ
マー＃１３の配列は、3´-ACGGCGGCGTCG TGGTGACTGACGT
GACACGCTCCGGACCCCGGGTCGATGACGAGGAAACCACTTTACTTTCTT
CCTAGGCCATCG-5´である。最終的のＰＣＲ産生物は、制
限酵素XhoIおよびBamHIを用いて消化し、実施例１２に
記載に記載するように作成した発現ベクターのXhoI/Bam
HI部位にサブクローニングする。図１１に示すアミノ酸
配列を有する蛋白質をコードするものが見出されるま
で、幾つかの構成物のXbaIとBamHIとの間をコードする
領域の配列を決定する。発現した蛋白質は、ｈＣＧのβ
−サブユニット中に見出されるシグナル配列の部分であ
りかつ蛋白質合成の際に細胞により取り除かれるMEMLQG
LLLLLLLSMGGAWAのアミノ酸残基を欠損していることが期
待される。このベクターは、ＣＯＳ−７細胞中で発現
し、培地中に放出されるこの蛋白質は、放射線標識した
ｈＣＧのｈＣＧに対するモノクローナル抗体または抗血
清への結合を阻害する能力が試験される。ＣＯＳ−７細
胞により作られる蛋白質は、下記する１種または２種以
上の抗体に対する結合において放射線標識したｈＣＧと
競合する：Ｂ１０１（コロンビア大学から入手），Ｂ１
０５（コロンビア大学から入手），Ｂ１０７（コロンビ
ア大学から入手），Ｂ１０９（コロンビア大学から入
手），Ａ２０１（コロンビア大学から入手），ＨＣＵ０
６１（ハイブリテクから入手），またはＨＣＯ５１４
（ハイブリテクから入手），ＺＭＣＧ１８（ピアスから
入手），ＺＭＣＧ１３（ピアスから入手），ＺＭＣＧ７
（ピアスから入手）または５１８Ｂ７（デビスのカルフ
ォルニア大学のジャネット ローザ博士から入手）。培
地中に放出された蛋白質は、キャンベル、ジーン−エマ
ーグおよびモイル（６４）に記載されたように、ウシ精
巣の受容体に対する結合においてｈＦＳＨと競合する。
スカフ等（６５）により記載されたのと同様に実施する
顆粒膜細胞分析においてエストラジオールの形成が刺激
され、哺乳動物の雌および雄において濾胞の発達および
精子形成が刺激されることが期待される。培地中に放出
された蛋白質は、キャンベル、ジーン−エマーグおよび
モイル（６４）に記載されたように、黄体濾胞にある受
容体に対する結合において放射線標識したｈＣＧと競合
する。モイル等（３７）により記載されたのと同様に実
施するライディッヒ細胞分析においてテストステロンの
形成が刺激され、および雌の動物において排卵が刺激さ
れかつ雄の動物においてテストステロンの形成が刺激さ
れることが期待される。このアナログは、表１にアナロ
グ＃６として示し、GSGSGSGSのリンカー配列を有する。
このリンカーは、発現ベクターをエンドヌクレアーゼ制
限酵素ApaIおよびEco47IIIで消化し、短い断片を捨て、
合成２重鎖ＤＮＡのカセットを標準方法によってグリシ
ンまたはセリンのコドンあるいは他のアミノ酸のコドン
の任意の数を含有する所望するアミノ酸コドンとBamHI/
Eco47III部位中に連結し、所望する突然変異が作られた
ことを確かめるためにApaI/Eco47IIIの間を配列決定
し、ＣＯＳ−７細胞中で蛋白質を発現させることによっ
て改良することができる。これは単一鎖ゴナドトロピン
活性を最適化するために為される。この蛋白質は、単量
体として機能するまたは活性ホモ二量体を形成するため
に結合することが期待される。さらに、この蛋白質の数
コピーは多量体を形成するために結合することが期待さ
れる。

【００７３】実施例１８ ｈＦＳＨよりｈＣＧに構造的に類似するＦＳＨおよびＬ
Ｈ活性を有する単一鎖ゴナドトロピンであるアナログ＃
７の調製およびその使用 表１に列記したアナログ＃７をコードする配列は、引用
文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、またはプライマー＃７をプライマー＃１４に置換し
たことを除いて実施例１３においてアナログ＃２に関し
て記載する方法において調製することができる。プライ
マー＃１４の配列は、3´-ACGGCGGCGTCGTGGTGACTGACGTG
ACACGCTCCGGACCCCGGGTCGATGACGAGGAAACCACTTCCTAGGCCAT
CG-5´である。最終的のＰＣＲ産生物は、制限酵素XhoI
およびBamHIを用いて消化し、実施例１２に記載に記載
するように作成した発現ベクターのXhoI/BamHI部位にサ
ブクローニングする。図１２に示すアミノ酸配列を有す
る蛋白質をコードするものが見出されるまで、幾つかの
構成物のXbaIとBamHIとの間をコードする領域の配列を
決定する。発現した蛋白質は、ｈＣＧのβ−サブユニッ
ト中に見出されるシグナル配列の部分でありかつ蛋白質
合成の際に細胞により取り除かれるMEMLQGLLLLLLLSMGGA
WAのアミノ酸残基を欠損していることが期待される。こ
のベクターは、ＣＯＳ−７細胞中で発現し、培地中に放
出されるこの蛋白質は、放射線標識したｈＣＧのｈＣＧ
に対するモノクローナル抗体または抗血清への結合を阻
害する能力が試験される。ＣＯＳ−７細胞により作られ
る蛋白質は、下記する１種または２種以上の抗体に対す
る結合において放射線標識したｈＣＧと競合する：Ｂ１
０１（コロンビア大学から入手），Ｂ１０５（コロンビ
ア大学から入手），Ｂ１０７（コロンビア大学から入
手），Ｂ１０９（コロンビア大学から入手），Ａ２０１
（コロンビア大学から入手），ＨＣＵ０６１（ハイブリ
テクから入手），またはＨＣＯ５１４（ハイブリテクか
ら入手），ＺＭＣＧ１８（ピアスから入手），ＺＭＣＧ
１３（ピアスから入手），ＺＭＣＧ７（ピアスから入
手）または５１８Ｂ７（デビスのカルフォルニア大学の
ジャネット ローザ博士から入手）。培地中に放出され
た蛋白質は、キャンベル、ジーン−エマーグおよびモイ
ル（６４）に記載されたように、ウシ精巣の受容体に対
する結合においてｈＦＳＨと競合する。スカフ等（６
５）により記載されたのと同様に実施する顆粒膜細胞分
析においてエストラジオールの形成が刺激され、かつ哺
乳動物の雌および雄において濾胞の発達および精子形成
が刺激されることが期待される。培地中に放出された蛋
白質は、キャンベル、ジーン−エマーグおよびモイル
（６４）に記載されたように、黄体濾胞にある受容体に
対する結合において放射線標識したｈＣＧと競合する。
モイル等（３７）により記載されたのと同様に実施する
ライディッヒ細胞分析においてテストステロンの形成が
刺激され、および雌の動物において排卵が刺激されかつ
雄の動物においてテストステロンの形成が刺激されるこ
とが期待される。このアナログは、表１にアナログ＃７
として示し、GSGSGSGSのリンカー配列を有する。このリ
ンカーは、発現ベクターをエンドヌクレアーゼ制限酵素
ApaIおよびEco47IIIで消化し、短い断片を捨て、合成２
重鎖ＤＮＡのカセットを標準方法によってグリシンまた
はセリンのコドンあるいは他のアミノ酸のコドンの任意
の数を含有する所望するアミノ酸コドンとBamHI/Eco47I
II部位中に連結し、所望する突然変異が作られたことを
確かめるためにApaI/Eco47IIIの間を配列決定し、ＣＯ
Ｓ−７細胞中で蛋白質を発現させることによって改良す
ることができる。これは単一鎖ゴナドトロピン活性を最
適化するために為される。この蛋白質は、単量体として
機能するまたは活性ホモ二量体を形成するために結合す
ることが期待される。さらに、この蛋白質の数コピーは
多量体を形成するために結合することが期待される。

【００７４】実施例１９ ｈＦＳＨよりｈＣＧに構造的に類似するＦＳＨおよびＬ
Ｈ活性を有する単一鎖ゴナドトロピン アナログ＃８の
調製およびその使用（図１３を参照） 表１に列記したアナログ＃８をコードする配列は、引用
文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、またはプライマー＃７をプライマー＃１５に置換し
たことを除いて実施例１３においてアナログ＃２に関し
て記載する方法において調製することができる。プライ
マー＃１５の配列は、3´-ACGGCGGCGTCGTGGTGACTGACGTG
ACACGCTCCGGACCCCGGGTCGATGACGCTACTGGGCGCCCCTAGGCCAT
CG-5´である。最終的のＰＣＲ産生物は、制限酵素XhoI
およびBamHIを用いて消化し、実施例１２に記載に記載
するように作成した発現ベクターのXhoI/BamHI部位にサ
ブクローニングする。図１３に示すアミノ酸配列を有す
る蛋白質をコードするものが見出されるまで、幾つかの
構成物のXbaIとBamHIとの間をコードする領域の配列を
決定する。発現した蛋白質は、ｈＣＧのβ−サブユニッ
ト中に見出されるシグナル配列の部分でありかつ蛋白質
合成の際に細胞により取り除かれるMEMLQGLLLLLLLSMGGA
WAのアミノ酸残基を欠損していることが期待される。こ
のベクターは、ＣＯＳ−７細胞中で発現し、培地中に放
出されるこの蛋白質は、放射線標識したｈＣＧのｈＣＧ
に対するモノクローナル抗体または抗血清への結合を阻
害する能力が試験される。ＣＯＳ−７細胞により作られ
る蛋白質は、下記する１種または２種以上の抗体に対す
る結合において放射線標識したｈＣＧと競合する：Ｂ１
０１（コロンビア大学から入手），Ｂ１０５（コロンビ
ア大学から入手），Ｂ１０７（コロンビア大学から入
手），Ｂ１０９（コロンビア大学から入手），Ａ２０１
（コロンビア大学から入手），ＨＣＵ０６１（ハイブリ
テクから入手），またはＨＣＯ５１４（ハイブリテクか
ら入手），ＺＭＣＧ１８（ピアスから入手），ＺＭＣＧ
１３（ピアスから入手），ＺＭＣＧ７（ピアスから入
手）または５１８Ｂ７（デビスのカルフォルニア大学の
ジャネット ローザ博士から入手）。培地中に放出され
た蛋白質は、キャンベル、ジーン−エマーグおよびモイ
ル（６４）に記載されたように、ウシ精巣の受容体に対
する結合においてｈＦＳＨと競合する。スカフ等（６
５）により記載されたのと同様に実施する顆粒膜細胞分
析においてエストラジオールの形成が刺激され、かつ哺
乳動物の雌および雄において濾胞の発達および精子形成
が刺激されることが期待される。培地中に放出された蛋
白質は、キャンベル、ジーン−エマーグおよびモイル
（６４）に記載されたように、黄体濾胞にある受容体に
対する結合において放射線標識したｈＣＧと競合する。
モイル等（３７）により記載されたのと同様に実施する
ライディッヒ細胞分析においてテストステロンの形成が
刺激され、および雌の動物において排卵が刺激されかつ
雄の動物においてテストステロンの形成が刺激されるこ
とが期待される。このアナログは、表１にアナログ＃８
として示し、GSGSGSGSのリンカー配列を有する。このリ
ンカーは、発現ベクターをエンドヌクレアーゼ制限酵素
ApaIおよびEco47IIIで消化し、短い断片を捨て、合成２
重鎖ＤＮＡのカセットを標準方法によってグリシンまた
はセリンのコドンあるいは他のアミノ酸のコドンの任意
の数を含有する所望するアミノ酸コドンとBamHI/Eco47I
II部位中に連結し、所望する突然変異が作られたことを
確かめるためにApaI/Eco47IIIの間を配列決定し、ＣＯ
Ｓ−７細胞中で蛋白質を発現させることによって改良す
ることができる。これは単一鎖ゴナドトロピン活性を最
適化するために為される。この蛋白質は、単量体として
機能するまたは活性ホモ二量体を形成するために結合す
ることが期待される。さらに、この蛋白質の数コピーは
多量体を形成するために結合することが期待される。

【００７５】実施例２０ フォリトロピン活性を有する単一鎖ゴナドトロピンであ
るアナログ＃９の調製およびその使用（図１４を参照） 表１に列記したアナログ＃９をコードする配列は、引用
文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、またはアナログ＃４を発現するために用いた実施例
１５に記載した構成物を制限酵素ApaIおよびBamHIを使
用して消化することにより調製できる。小断片を図１４
に記載した配列を与える合成ＤＮＡのカセットで置換す
る。図１４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコード
するものが見出されるまで、幾つかの構成物のApaIとBa
mHIとの間をコードする領域の配列を決定する。発現し
た蛋白質は、ｈＦＳＨのβ−サブユニット中に見出され
るシグナル配列の部分でありかつ蛋白質合成の際に細胞
により取り除かれるMKTLQFFFLFCCWKAICCのアミノ酸残基
を欠損していることが期待される。このベクターは、Ｃ
ＯＳ−７細胞中で発現し、ＣＯＳ−７細胞により作られ
る蛋白質は、下記する１種または２種以上の抗体に対す
る結合において放射線標識したｈＣＧと競合する：ＺＭ
ＦＳ１（ピアスから入手），Ａ２０１（コロンビア大学
から入手），ＨＣＵ０６１（ハイブリテクから入手），
ＦＳＧ７６１（ハイブリテクから入手），ＦＳＲ０９
３．３（ハイブリテクから入手），ＦＳＨ１０７（ハイ
ブリテクから入手），ＦＳＢ０６１（ハイブリテクから
入手），ＦＳＭ２１０（ハイブリテクから入手）および
ＦＳＭ２６８（ハイブリテクから入手）。培地中に放出
された蛋白質は、キャンベル、ジーン−エマーグおよび
モイル（６４）に記載されたように、ウシ精巣の受容体
に対する結合においてｈＦＳＨと競合する。スカフ等
（６５）により記載されたのと同様に実施する顆粒膜細
胞分析においてエストラジオールの形成が刺激され、哺
乳動物の雌および雄において濾胞の発達および精子形成
が刺激されることが期待される。このアナログは、ＦＳ
Ｈに対する抗体を誘発する免疫原を選択するための有用
な出発化合物となり、かつ避妊ワクチンの一部となるこ
とがさらに期待される。このアナログは、表１にアナロ
グ＃９として示し、GSGSGSGSのリンカー配列を有する。
このリンカーは、発現ベクターをエンドヌクレアーゼ制
限酵素ApaIおよびEco47IIIで消化し、短い断片を捨て、
合成２重鎖ＤＮＡのカセットを標準方法によってグリシ
ンまたはセリンのコドンあるいは他のアミノ酸のコドン
の任意の数を含有する所望するアミノ酸コドンとBamHI/
Eco47III部位中に連結し、所望する突然変異が作られた
ことを確かめるためにApaI/Eco47IIIの間を配列決定
し、ＣＯＳ−７細胞中で蛋白質を発現させることによっ
て改良することができる。これは単一鎖ゴナドトロピン
活性を最適化するために為される。この蛋白質は、単量
体として機能するまたは活性ホモ二量体を形成するため
に結合することが期待される。さらに、この蛋白質の数
コピーは多量体を形成するために結合することが期待さ
れる。

【００７６】実施例２１ フォリトロピン活性を有する単一鎖ゴナドトロピンであ
るアナログ＃１０の調製およびその使用（図１５を参
照） 表１に列記したアナログ＃１０をコードする配列は、引
用文献（５４）に記載の阻害連結手法を用いて合成でき
る、またはアナログ＃４を発現するために用いた実施例
１５に記載した構成物を制限酵素ApaIおよびBamHIを使
用して消化することにより調製できる。小断片を図１５
に記載した配列を与える合成ＤＮＡのカセットで置換す
る。図１５に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコード
するものが見出されるまで、幾つかの構成物のApaIとBa
mHIとの間をコードする領域の配列を決定する。発現し
た蛋白質は、ｈＦＳＨのβ−サブユニット中に見出され
るシグナル配列の部分でありかつ蛋白質合成の際に細胞
により取り除かれるMKTLQFFF LFCCWKAICCのアミノ酸残
基を欠損していることが期待される。このベクターは、
ＣＯＳ−７細胞中で発現し、ＣＯＳ−７細胞により作ら
れる蛋白質は、下記する１種または２種以上の抗体に対
する結合において放射線標識したｈＣＧと競合する：Ｚ
ＭＦＳ１（ピアスから入手），Ａ２０１（コロンビア大
学から入手），ＨＣＵ０６１（ハイブリテクから入
手），ＦＳＧ７６１（ハイブリテクから入手），ＦＳＲ
０９３．３（ハイブリテクから入手），ＦＳＨ１０７
（ハイブリテクから入手），ＦＳＢ０６１（ハイブリテ
クから入手），ＦＳＭ２１０（ハイブリテクから入手）
およびＦＳＭ２６８（ハイブリテクから入手）。培地中
に放出された蛋白質は、キャンベル、ジーン−エマーグ
およびモイル（６４）に記載されたように、ウシ精巣の
受容体に対する結合においてｈＦＳＨと競合する。スカ
フ等（６５）により記載されたのと同様に実施する顆粒
膜細胞分析においてエストラジオールの形成が刺激さ
れ、哺乳動物の雌および雄において濾胞の発達および精
子形成が刺激されることが期待される。このアナログ
は、ＦＳＨに対する抗体を誘発する免疫原を選択するた
めの有用な出発化合物となり、かつ避妊ワクチンの一部
となることがさらに期待される。このアナログは、表１
にアナログ＃１０として示し、GSGSGSGSのリンカー配列
を有する。このリンカーは、発現ベクターをエンドヌク
レアーゼ制限酵素ApaIおよびEco47IIIで消化し、短い断
片を捨て、合成２重鎖ＤＮＡのカセットを標準方法によ
ってグリシンまたはセリンのコドンあるいは他のアミノ
酸のコドンの任意の数を含有する所望するアミノ酸コド
ンとBamHI/Eco47III部位中に連結し、所望する突然変異
が作られたことを確かめるためにApaI/Eco47IIIの間を
配列決定し、ＣＯＳ−７細胞中で蛋白質を発現させるこ
とによって改良することができる。これは単一鎖ゴナド
トロピン活性を最適化するために為される。この蛋白質
は、単量体として機能するまたは活性ホモ二量体を形成
するために結合することが期待される。さらに、この蛋
白質の数コピーは多量体を形成するために結合すること
が期待される。

【００７７】実施例２２ グリコシル化部位を欠損するα−サブユニットのアナロ
グの調製（図１６を参照） アナログ１〜１０は、アスパラギン−Ｘ−スレオニン／
セリン（Ｘ：プロリンを除く任意のアミノ酸）のアミノ
酸配列のコドンの４つのセットを有しているという理由
から、４箇所のアスパラギン結合オリゴ糖を含有するこ
とが期待される。アスパラギン結合オリゴ糖の除去は、
特にα−サブユニットで、ホルモンの効果を減少させる
ことが知れている。アスパラギン結合オリゴ糖シグナル
は、ここに記載するようにＰＣＲを用いて単一鎖ゴナド
トロピンのα−サブユニットの部分から除去することが
できる。アナログ１を発現させることができ、かつ実施
例１２および図６に記載したベクターとのＰＣＲ反応
に、5´-TGCTTCTCTAGAGCATATC CCACTCCACTAAGGTCCAAGA
AGACGATGTTGGTCCAAAAGCAAGTCACCT-3´の配列を有するプ
ライマー＃１６および3´-CAAAGTTTCACCTCGTTG TGTGCCG
CACGGTGACGTCATGAACAATAATAGTGTTTAGAATTCCATGGCCATG-5
´の配列を有するプライマー＃１７を用いる。実施例１
２に記載する条件において２５サイクル後、ＰＣＲ産生
物およびベクターをXbaIおよびKpnIを用いて消化した。
ベクターの消化により生じる小さな断片を捨て、消化し
たＰＣＲ産生物をベクター中のこの場所に連結する。こ
れは、２箇所のアスパラギン結合オリゴ糖シグナルのみ
を含有するが、ｈＣＧに結合する抗体および抗血清に対
する親和性を有することが期待されるアナログである、
アナログ１１をコードする発現ベクターを生成する。ラ
ット黄体濾胞由来の細胞膜に対する結合においてｈＣＧ
と競合するその能力によって示されるように、ＬＨ受容
体に対し、親和性を残していることが期待される。しか
し、特に環状ＡＭＰを誘発する能力を試験する（３７）
場合に、シグナル伝達を誘導する能力が減少することが
期待される。発現ベクターをBamHIおよびKpnIを用いて
消化し、小さな断片を捨て、アナログ１１の消化により
得られる小さなBamHI/KpnI断片を連結することによっ
て、オリゴ糖をα−サブユニットに由来する蛋白質の部
分から除去して、アナログ２〜１０の類似誘導体を作成
することができる。従って、アナログ２はアナログ１２
に、アナログ３はアナログ１３に、アナログ４はアナロ
グ１４に、アナログ５はアナログ１５に、アナログ６は
アナログ１６に、アナログ７はアナログ１７に、アナロ
グ８はアナログ１８に、アナログ９はアナログ１９に、
およびアナログ１０はアナログ２０になる。合成するプ
ライマー１６および１７の配列を変更し、かつここに略
述する下記の手順によって簡単に、α−サブユニットに
由来する単一鎖ゴナドトロピンの部分における２箇所の
オリゴ糖シグナルのうち１箇所のみを除去することがで
きることをさらに注目する。これらのアナログのいずれ
も、それらの前駆体のように、同一の抗体および受容体
に対する結合性を示す。これらアナログは効率が減少し
ており、その結果、シグナル伝達を阻害する。アナログ
１１、１２および１３は、ＬＨの活性を減らすので、月
経周期の濾胞期のごく初期において投与される場合には
受精を刺激する。それらアナログは、ｈＣＧの活性を減
らすので、期待される生理の時期近くに投与される場合
には受精を抑制する。

【００７８】実施例２３ グリコシル化部位を欠損するアナログ１ａの調製（図１
７および１８を参照） ゴナドトロピンの効果は、炭水化物のその含有量に比例
し、アナログ１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８、および２０では効果がより低く、全てのオリ
ゴ糖鎖を削除することでさらに効果を減少させることが
できる。アスパラギン結合オリゴ糖鎖は、第１反応にお
いてプライマー＃１および＃１８を、第２反応において
プライマー＃２および＃１９を用いるＰＣＲ ＳＯＥ
（６３）を行うことによって アナログ１１から削除す
ることができる。アナログ１１のためのベクターを双方
の反応において鋳型として供給する。プライマー＃１８
の配列は5´-CGGGGTAGGTTCGGTGGGACCGACACCTCTTCCTCCCG
ACGGGG-3´であり、プライマ−＃１９の配列は3´-GTGG
AGAAGGAGGGCTGCCCCGTGTG CATCACCGTCAACACCACCATC-5´
である。９４℃（３０秒）、５５℃（６０秒）および７
２℃（６０秒）の２５回の温度サイクルの後、各々のＰ
ＣＲ反応液の１μｌをプライマー＃５および追加のプラ
イマー＃２、新しい緩衝液、酵素およびデオキシヌクレ
オチド三燐酸と混合する。追加の２５回のサイクルの後
に反応産生物をXhoIおよびBamHIを用いて消化し、アナ
ログ１１をコードするベクターのXhoI/BamHI部位間に見
出される元のＤＮＡと置換した。アナログ１ａは、ベク
ターをXhoIおよびBamHIを用いて消化し、小さな断片を
捨て、ＰＣＲ産生物を消化しXhoI/BamHI断片と連結する
ことで達成される。図１８において略述し、アナログ１
ａと名付けたアナログが得られるまで、幾つかのクロー
ンをＤＮＡの配列決定を行った。これをＣＯＳ−７細胞
中で発現させた場合には、作られるこの蛋白質は、アナ
ログ１のように同一の抗体および抗血清によって認識さ
れると考えられる。アナログ１ａは、さらにルトロピン
受容体に結合するが、ｈＣＧに対する効果は減少してい
ると考えられる。月経周期の濾胞期のごく初期において
投与される場合には、アナログ１ａはアンドロゲン合成
を減少させる。この結果、エストラジオールの合成が減
少し、ＦＳＨのレベルが上昇しかつ受精が刺激される。
アナログ１ａは、濾胞の未成熟黄体形成を阻害するのに
さらに有用である。アナログは、ｈＣＧの活性を減らす
ために、黄体期中の生理がおよそ期待される時期に投与
される場合には、アナログ１ａはｈＣＧの作用を阻害
し、生理の促進剤および受精の抑制剤として供給され
る。アナログ１ａは、前述した鋳型手法を用いるワクチ
ンを設計するための良好な開始化合物として供給される
と考えられる。

【００７９】実施例２４ アスパラギン結合オリゴ糖を欠損した他のゴナドトロピ
ンの調製 アナログ２ａ、５ａ、６ａ、７ａおよび８ａは、アナロ
グ１ａおよびアナログ１２、１５、１６および１７から
容易に調製される。アナログ１ａをKpnIおよびMstIIを
用いて消化し、小さな断片を捨て、大きな断片を、アナ
ログ１２、１５、１６および１７をコードするベクター
のKpnI/MstIIによる消化により調製した小さな断片と別
々に連結する。アナログ２ａ、５ａ、６ａ、７ａおよび
８ａは、各々アナログ２、５、６、７および８と同一の
抗体および受容体に結合すると考えれれる。しかし、シ
グナル伝達を誘発する能力は減少し、その結果、阻害剤
として供給される。アナログ２ａは、ホルモンのＬＨ受
容体への結合の阻害において主に有効である。投与する
時期に依存して、アナログ２ａは受精を誘発し（月経周
期の初期に投与された場合）、あるいは受精を阻害する
（着床の時期近くまたは期待される生理の時期に投与さ
れた場合）。これに関連して、アナログ１ａおよび２ａ
は、同様な活性を有する。アナログ５ａは、ホルモンの
ＦＳＨ受容体への結合の阻害において主に有効である。
アナログ５ａは、卵巣亢進刺激の抑制に有用である。ア
ナログ６ａ、７ａおよび８ａは、ＬＨ受容体およびＦＳ
Ｈ受容体への結合の阻害剤であると考えられる。これら
は、卵巣亢進刺激の抑制および未成熟黄体化の抑制に有
用である。

【００８０】アナログ３ａおよび４ａをコードするベク
ターは、アナログ１３および１４を鋳型として、ＳＯＥ
ＰＣＲ（６３）によって作成することができる。プラ
イマーの設計の手法は、アナログ１ａを発現するベクタ
ーの改良に用いたプライマーの調製に関して記載したの
と同様である。アナログ３ａおよび４ａがＣＯＳ−７細
胞中で発現される場合には、生成される蛋白質は、各々
アナログ３および４と同じ抗体および抗血清によって認
識される。アナログ３ａは、ＬＨ受容体に結合するホル
モンの活性の阻害に有用であり、濾胞期において初期に
投与される場合、受精を誘発する。アナログ４ａは、Ｆ
ＳＨ活性の阻害に有用である。アナログ３ａは、鋳型手
法およびＬＨの活性を部分的に中和できる抗体を用いて
受精を増加させるために使用するワクチンの設計のため
の開始物質として有用である。アナログ３ａは、さらに
鋳型手法およびＬＨ活性を中和できる抗体を用いて受精
を抑制させるワクチンの設計のための開始物質として有
用である。アナログ４ａは、鋳型手法を用いて前述した
抗ＦＳＨワクチンの設計のための開始物質としてさらに
有用である。

【００８１】アナログ９ａおよび１０ａをコードするベ
クターは、アナログ４ａをコードするベクターから調製
することができる。アナログ４ａをコードするベクター
をBalIおよびKpnIを用いて消化し、小さな断片を捨て
る。その大きな断片と、アナログ１９および２０をコー
ドするベクターのBalI/KpnIによる消化により調製した
小さな断片とを別々に連結し、アナログ９ａおよび１０
ａをコードするベクターを作成する。アナログ９ａおよ
び１０ａをＣＯＳ−７細胞中で発現させた場合、アナロ
グ９ａおよび１０ａは、アナログ９および１０のと同様
な抗体およびＦＳＨ受容体に対する結合特性を有すると
考えられる。アナログ９ａおよび１０ａは、効率がさら
に低く、ＦＳＨの活性を阻害する。従って、それらは、
卵巣の過刺激を減少させるのに有用であり、さらに鋳型
手法を用いた抗ＦＳＨワクチンの設計のための開始物質
として有用である。

【００８２】実施例２５ ゴナドトロピン中にグリコシル化部位を導入する典型的
方法 オリゴ糖残基が循環中のホルモンの安定性に良好な影響
を与えることから、蛋白質に余分なオリゴ糖鎖を添加す
ることはしばしば有用である。オリゴ糖の添加は、所望
しない抗体または受容体との相互作用を抑制するために
使用することができる。受容体と相互作用しない蛋白質
の表面は、ホルモンの機能を刺激するために使用される
オリゴ糖鎖を添加するための有用な場所である。これ
は、単一鎖の糖蛋白質ホルモンの活性の調節またはα、
β−ヘテロ二量体の糖蛋白質ホルモンの活性の調節にお
いて有益な効果を持たせることができる。例えば、７１
残基にアスパラギン結合オリゴ糖の生成を生じさせるた
めにＦＳＨβ−サブユニットの７１〜７３残基にグリコ
シル化シグナルを添加すると、より高い活性を有するホ
ルモンが得られる。逆に、蛋白質のこの領域において他
のグルコシル化部位の後にグルコシル化残基を添加する
と、その阻害活性が増強される。突然変異導入を実施す
る方法は、当業界においては標準であり、合成オリゴヌ
クレオチド連結阻害によるコードする配列の合成からＳ
ＯＥ ＰＣＲ（６３）にまで及ぶ。ＳＯＥ ＰＣＲによ
る突然変異導入の幾つかの例は既に記述している。

【００８３】実施例２６ ヒトのサブユニット由来配列とは別の配列の使用 アナログ１〜２０、アナログ１ｂ〜１０ｂ、特にアナロ
グ１ａ〜１０ａは、鋳型指示ワクチンの設計のための有
用な開始化合物として供給される。ヒトにおいて使用さ
れるホルモン特異的ワクチンの開発のために、ヒトのα
−サブユニットの代わりにヒトとは別のα−サブユニッ
トを用いて表１に列記するものに類似するアナログを作
成することが有用である。これは、ウシのα−サブユニ
ットは、表１に列記するアナログよりもヒトのホルモン
とはさらに異なる蛋白質を与えるとの理由による。単一
鎖糖蛋白質のホルモンを設計するための手順は、既に説
明しているヒトα−サブユニットの配列をヒトとは別の
α−サブユニットをコードする配列に置換すること以外
は、実施例１２〜２１に列記したことに同様である。同
様にして、グルコシル化シグナルを、アスパラギン、セ
リンまたはスレオニンのコドンを変える、あるいはアス
パラギンとセリンまたはスレオニンの間にプロリンを挿
入することにより、除去することができる。

【００８４】さらに、免疫原を設計する鋳型手法を用い
る場合、ほとんど親和性を有していないヒトではない分
子を用いて開始することが好ましく、陽性選択において
用いる鋳型に対して幾らか親和性があるならば、選択性
を生じる残基を導入することが好ましい。これらのアナ
ログは、実施例１２〜２５および表１に示すヒトＦＳ
Ｈ、ＬＨおよびｈＣＧの配列の代わりに、ヒトではない
別の起源由来のＦＳＨ、ＬＨまたはＴＳＨのβ−サブユ
ニットの配列で置換することによって調製することがで
きる。

【００８５】

【表１】 表１における文字および配列の定義 “n-” は、蛋白質のＮ−末端を示す。“-c” は、蛋白
質のＣ−末端を示す。 “hCGβ(1-145)” は、ｈＣＧβ−サブユニットのアミ
ノ酸配列１〜１４５残基： SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLP
APLQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDC
GGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ を示す。 “hCGβ(1-114)” は、ｈＣＧβ−サブユニットのアミ
ノ酸配列１〜１１４残基： SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLP
APLQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALCRRSTTDC
GGPKDHPLTCDDPR を示す。 “hCGβ(1-93)” は、ｈＣＧβ−サブユニットのアミノ
酸配列１〜９３残基： SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMTRVLQGVLP
APLQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVALSCQCALC を示す。 “hLHβ(1-114)” は、ｈＬＨβ−サブユニットのアミ
ノ酸配列１〜１１４残基： SREPLRPWCHPINAILAVEKEGCPVCITVNTTICAGYCPTMMRVLQAVLP
PLPQVVCTYRDVRFESIRLPGCPRGVDPVVSFPVALSCRCGPCRRSTSDC
GGPKDHPLTCDHPQ を示す。 “hFSHβ(1-111)” は、ｈＦＳＨβ−サブユニットのア
ミノ酸配列１〜１１１残基： NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKT
CTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLG
PSYCSFGEMKE を示す。 “hFSHβ(1-108)” は、ｈＦＳＨβ−サブユニットのア
ミノ酸配列１〜１０８残基： NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKT
CTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLG
PSYCSFGE を示す。 “hFSHβ(1-104)” は、ｈＦＳＨβ−サブユニットのア
ミノ酸配列１〜１０４残基： NSCELTNITIAVEKEGCGFCITINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKT
CTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLG
PSYC を示す。 “hFSHβ(88-111)” は、ｈＦＳＨβ−サブユニットの
アミノ酸配列８８〜１１１残基： DSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE を示す。 “hFSHβ(95-111)” は、ｈＦＳＨβ−サブユニットの
アミノ酸配列９５〜１１１残基： TVRGLGPSYCSFGEMKE を示す。 “hFSHβ(95-108)” は、ｈＦＳＨβ−サブユニットの
アミノ酸配列の９５〜１０８残基： TVRGLGPSYCSFGE を示す。 “hFSHβ(95-103)” は、ｈＦＳＨβ−サブユニットの
アミノ酸配列の９５〜１０３残基： TVRGLGPSY を示す。 “N13X” は、ｈＣＧのβ−サブユニットおよびそのア
ナログの残基アスパラギン１３をグルタミンまたは他の
アミノ酸に置換したことを示す。 “N30X” は、ｈＣＧあるいはｈＬＨのβ−サブユニッ
トおよびそのアナログの残基アスパラギン３０をグルタ
ミンまたは他のアミノ酸に置換したことを示す。 “N52X” は、ヒトα−サブユニットおよびそのアナロ
グの残基アスパラギン５２をグルタミンまたは他のアミ
ノ酸に置換したことを示す。 “N78X” は、ヒトα−サブユニットおよびそのアナロ
グの残基アスパラギン７８をグルタミンまたは他のアミ
ノ酸に置換したことを示す。 “P78X” は、ｈＣＧあるいはｈＬＨのβ−サブユニッ
トおよびそのアナログのプロリン７８をプロリンを除く
任意のアミノ酸に置換したことを示す。 “V79T” は、ｈＣＧあるいはｈＬＨのβ−サブユニッ
トおよびそのアナログのバリン７９をスレオニンまたは
セリンに置換したことを示す。 “D71N” は、ｈＦＳＨのβ−サブユニットおよびその
アナログのアスパラギン酸７１をアスパラギンに置換し
たことを示す。 “L73T” は、ｈＦＳＨのβ−サブユニットおよびその
アナログのロイシン７３をスレオニンまたはセリンに置
換したことを示す。 “ヒトα(1-92)” は、ヒトα−サブユニットのアミノ酸
配列１〜９２残基： APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQ
KNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS を示す。 “リンカー” は、GS, GSGS, GSGSGS, GSGSGSGS, GSGSGSGSG
Sのような反復するグリシンとセリンのアミノ酸を含有
する配列あるいは、α−およびβ−サブユニットの部分
が同一あるいは他の分子のα−およびβ−サブユニット
の部分と結合することで複合体を形成することを可能に
する単一鎖のゴナドトロピンのβ−およびα−サブユニ
ットの配列である任意の他のアミノ酸配列を示す。 “DDPR” は、アスパラギン−アスパラギン−プロリン
−アルギニンのアミノ酸配列を示す。 表１の注釈 １．表において左から右の構成成分の順序は、アミノ末
端からカルボキシ末端までの蛋白質において生じる構成
成分の順序である。 ２．そのシステイン残基のアライメントにより示すこと
ができる、全ての脊椎動物のゴナドトロピンにおいてそ
のアミノ酸配列が高く保存されているという理由から、
単一鎖ゴナドトロピンは、ｈＣＧ、ｈＬＨおよびｈＦＳ
Ｈのβ−サブユニットの一致する部分の任意の相同な残
基を置換することで調製することができる。 ３．他の脊椎動物のゴナドトロピンのα−サブユニット
の配列は、ヒトα(1-92)と置換することができる。これ
は、ウシのα−サブユニットの１〜９６残基に制限され
ないことを包含する。 ４．示すように、構成成分の順序は、α−サブユニット
に由来する配列のアミノ末端はβ−サブユニットに由来
する配列である。表における構成成分の順序は、α−サ
ブユニットの配列は、β−サブユニットの配列のアミノ
末端であるというように逆転させることができる。 ５．アミノ酸配列は、注釈を除いて、標準的１文字記号
にて示す。 ６．すべてのこれらアナログをコードする配列は、当業
界においてよく知られた標準的組換えＤＮＡ方法によっ
て作成することができる。これらを作成する１つの方法
は、キャンベル等（５４）によって提供される。アナロ
グは、真核細胞で発現させるために設計しかつインビト
ロジェン、サンディエゴ、ＣＡから入手できるベクター
を用いて当業界においてよく知られた方法により、真核
細胞で発現させることができる。オリゴ糖鎖を含有しな
いアナログは、ノバジェンから入手できるｐＥＴベクタ
ーのようなベクターを用いて当業界においてよく知られ
た方法により、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて作ることができ
る。 ７．ｈＣＧβ−サブユニットのアスパラギン１３および
／または３０におけるグルコシル化部位は、説明のよう
にアスパラギンの置換、および／または残基１４および
／または３１のプロリンへの置換、および／または残基
１５および／または３２のスレオニンまたはセリンとは
別のアミノ酸への置換によって破壊することができる。 ８．ｈＬＨβ−サブユニットのアスパラギン３０におけ
るグルコシル化部位は、説明のようにアスパラギンの置
換、および／または残基３１のプロリンへの置換、およ
び／または残基３２のスレオニンまたはセリンとは別の
アミノ酸への置換によって破壊することができる。 ９．ヒトα−サブユニットのアスパラギン５２および／
または７８におけるグルコシル化部位は、説明のように
アスパラギンの置換、および／または残基５３および／
または７９のプロリンへの置換、および／または残基５
４および／または８０のスレオニンまたはセリンとは別
のアミノ酸への置換によって破壊することができる。 １０．ヒトα−サブユニットのアスパラギン５６および
／または８２におけるグルコシル化部位は、説明のよう
にアスパラギンの置換、および／または残基５７および
／または８３のプロリンへの置換、および／または残基
５８および／または８４のスレオニンまたはセリンとは
別のアミノ酸への置換によって破壊することができる。

【００８６】

【表２】 本発明の化合物は、哺乳動物、即ち動物またはヒトに対
して、所望する治療効果を提供するための有効量にて投
与することができる。化合物の活性および所望する治療
の効果の程度が変化することにより、使用する化合物の
投与量のレベルもまた変化させることができる。投与さ
れる実質的投与量は、患者の体重および特別な患者の個
々の過敏症のような、一般的に認識される要因によって
もまた判定される。

【００８７】この出願の全体にわたり、多くの刊行物を
引用した。これらの刊行物における開示は、この技術の
状況をより完全に記載するために引用文献として組み込
むものである。引 用 文 献 1. Pierce JG, Parsons TF (1981) Glycoprotein ho
rmones: structure andfunction. Ann Rev Biochem 50
: 465-495 2. Yen SSC, Jaffe RB (1986) Reproductive Endocr
inology: Physiology, Pathophysiology and Clinical
Management. W.B.Saunders, Philadelphia. 3. Moyle WR (1980) Biochemistry of gonadotropin
receptors. In: OxfordReviews of Reproductive Biol
ogy Volume 2, edited by Finn CA. Oxford University
Press, New York, pp 123-204. 4. Hsueh AJW, Adashi EY, Jones PBC, Welsh TH, J
r. (1984) Hormonal regulation of the differentiati
on of cultured ovarian granulosa cells. Endocr Rev
5: 76-127 5. Hodgen GD, Itskovitz J (1988) Recognition an
d maintenance of pregnancy. In: The physiology of
reproduction, edited by Knobil E, Neill JD.Raven P
ress, New York, pp 1995-2021 6. 	DiZerega GS, Hodgen GD (1981) Folliculog
enesis in the primateovarian cycle. Endocr Rev 2:
27-49 7. Vaishnav MY, Moudgal NR (1991) Effect of spe
cific FSH or LH deprivation on testicular function
of the adult rat. Indian J Biochem Biophys28: 513
-520 8. Aravindan GR, Ravindranath N, Moudgal NR (19
91) Use of DNA Flowcytometry in assessing gonadotr
opin regulation of spermatogenesis in monkeys. In:
Perspectives in Primate Reproductive Biology, edi
ted by Moudgal NR, Yoshinaga K, Rao AJ, Adiga PR.
Wiley Eastern Limited, New Delhi, pp 189-199. 9. Steinberger E (1971) Hormonal control of mam
malian spermatogenesis. Physiol Rev 51: 1-22. 10. Moudgal NR, Macdonald GJ, Greep RO (1972) R
ole of endogenous primate LH maintaining corpus lu
teum function of the monkey. J Clin Endocriol Meta
b 35: 113-116. 11. Moudgal NR (1976) Passive immunization with
antigonadotropin antisera as a method of menstrua
l regulation in the primate. In: Immunization with
hormones in reproduction research, edited by Nies
chlag E. North-Holland, Amsterdam, pp 233. 12. Moudgal NR, Sairam MR, Mahoney J (1985) On
the immunogenicity ofthe beta subunit of ovine lut
einizing hormone (oLH beta) and equine chorionic g
onadotropin (eCG) in the chimpanzee (Pan troglodyt
es): effect ofantiserum on monkey cycle and early
pregnancy. Am J Repord Immunol Microbiol 8: 120-12
4. 13. Moudgal NR, Macdonald GJ, Greep RO (1971) E
ffects of HCG antiserum on ovulation and corpus lu
teum formation in the monkey (Macaca fasciculari
s). J Clin Endocrinol Metab 32: 579-581. 14. Stevens VC (1990) Birth control vaccines an
d immunological approaches to the therapy of nonin
fectious diseases. Inf Dis Clin North Am 4:343-35
4. 15. Dunbar BS, Lo C, Powell J, Stevens VC (198
9) Use of a synthetic peptide adjuvant for the imm
unization of baboons with denatured and deglycosyl
ated pig zona pellucida glycoproteins. Fertil Ster
il 52: 311-318. 16. Stevens VC (1986) Use of synthetic peptides
as immunogens for developing a vaccine against hu
man chorionic gonadotropin. Ciba Found Symp119: 20
0-225. 17. Moyle WR, Pressey A, Dean Emig D, Anderson
DM, Demeter M, Lustbader J, Ehrlich P (1987) Detec
tion of conformational changes in human chorionic
gonadotropin upon binding to rat gonadal receptor
s. J Biol Chem 262: 16920-16926. 18. Singh O, Rao LV, Gaur A, Sharma NC, Alam A,
Talwar GP (1989) Antibody response and characteri
stics of antibodies in women immunized withthree c
ontraceptive vaccines inducing antibodies against
human chorionicgonadotropin. Fertil Steril 52: 739
-744. 19. Kumar S, Talwar GP, Biswas DK (1992) Necros
is and inhibition of growth of human lung tumor by
anti-α-human chorionic gonadotropin antibody. JN
CI 84: 42-47. 20. Gaur A, Arunan K, Sigh O, Talwar GP (1990)
Bypass by an alternate‘carrier’ of acquired unre
sponsiveness to hCG upon repeated immunization wit
h tetanus-conjugated vaccine. Int Immunol 2: 151-1
55. 21. Hojo H, Ryan RJ (1985) Monoclonal antibodie
s against human follicle-stimulating hormone. Endo
crinology 117: 2428-2434. 22. Moyle WR, Ehrlich PH, Canfield RE (1982) Us
e of monoclonal antibodies to hCG subunits to exam
ine the orientation of hCG in the hormone-receptor
complex. Proc Natl Acad Sci USA 79: 2245-2249. 23. Ryan RJ, Keutmann HT, Charlesworth MC, MacC
ormick DJ, Milius RP,Calvo FO, Vutyavanich T (198
7) Structure-function relationships of gonadotropi
ns. Recent Prog Horm Res 43: 383-429. 24. Keutmann HT, Charlesworth MC, Mason KA, Ost
rea T, Johnson L, RyanRJ (1987) A receptor-binding
region in human gonadotropin/lutropin betasubuni
t. Proc Natl Acad Sci USA 84: 2038-2042. 25. Moyle WR, Dean Emig DM, Lustbader JV, Keutm
ann HT (1988) Identification of an epitope on the
β-subunit of human chorionic gonadotropin (hCG) n
ear the receptor binding site. ICSU Short Rep 8: 1
16. 26. Moyle WR Matzuk MM, Campbell RK, Cogliani
E, Dean Emig DM, Krichevsky A, Barnett RW, Boime I
(1990) Localization of residues that conferantibo
dy binding specificity using human chorionic gonad
otropin/luteinizing hormone beta subunit chimeras
and mutants. J Biol Chem 265: 8511-8518. 27. Krichevsky A, Birken S, O’Connor J, Bikel
K, Schlatterer J, Yi C, Agosto G, Canfield R (199
1) Development and characterization of a new,highl
y specific antibody to the human chorionic gonadot
ropin-beta fragment. Endocrinology 128: 1255-1264. 28. Ehrlich PH, Moustafa ZA, Krichevsky A, Birk
en S, Armstrong EG, Canfield RE (1985) Characteriz
ation and relative orientation of epitopes for mon
oclonal antibodies and antisera to human chorionic
gonadotropin. Am J Reprod Immunol Microbiol 8: 48
-54. 29. Matteri RL, Roser JF, Baldwin DM, Lipovetsk
y V, Papkoff H (1987)Characterization of a monoclo
nal antibody which detects luteinizing hormones fr
om diverse mammalian species. Domest Anim Endocrin
ol 4 157-165. 30. Ehrlich PH, Moyle WR, Canfield RE (1983) Mo
noclonal antibodies togonadotropin subunits. Metho
ds Enzymol 50: 638-655. 31. Moyle WR, Anderson DM, Macdonald GJ, Armstron
g EG (1988) Bioimmunoassay (BIA): A sandwich immun
oassay scheme employing monoclonal antibodies and
hormone receptors to quantify anaytes. J Receptor
Res 8: 419-436. 32. Fielder R, Verbitskii MS (1990) Monoclonal
antibodies to human chorionic gonadotropin and cer
tain human and animal hormones of the adenohypophy
sis. Biomedical Science 1: 251-255. 33.	Winter G, Milstein C (1991) Man-made antibo
dies. Nature 349: 293-299. 34. Bass S, Greene R, Wells JA (1990) Hormone p
hase: an enrichment method for variant proteins wi
th altered binding properties. Proteins 8: 309-31
4. 35. Barrett RW, Cwirla SE, Ackerman MS, Olson A
M, Peters EA, Dower WJ(1992) Selective enrichment
and characterization of high affinity ligands from
collections of random peptides on filamentous pha
ge. AnalyticalBiochemistry 204: 357-364. 36. Huse WD, Sastry L, Iverson SA, Kang AS, Alt
ing-Mees M, Burton DR,Benkovic SJ, Lerner RA (199
2) Generation of a large combinatorial library of
the immunoglobulin repertoire in phage lamda. 1989
Biotechnology 24: 517-523. 37. Moyle WR, Bahl OP, Marz L (1975) Role of th
e carbohydrate of human choriogonadotropin in the
mechanism of hormone action. J. Biol Chem 250: 916
3-9169. 38. Lesk AM, Tramontano A (1992) Antibody struc
ture and structural predictions useful in guiding
antibody engineering. In: Antibody engineering: a
practical guide, edited by Borrebaeck CAK. W.H.Fre
eman and Co., New York, pp 1-38. 39. Cheetham JC (1992) Engineering antibody aff
inity. In: Antibody engineering: a practical guid
e, edited by Borrebaeck CAK. W.H.Freeman andCo., N
ew York, pp 39-68. 40. Morrioson SL, Johnson MJ, Herzenberg LA, Oi
VT (1984) Chimeric human antibody molecules: mous
e antigen-binding domains with human constant regi
ons. Proc Natl Acad Sci USA 81: 6851-6855. 41. Newman R, Alberts J, Anderson D, Carner K,
Heard C, Norton F, Raab R, Reff M, Shuey S, Hanna
N (1992) “Primitization” of recombinant antibodi
es for immunotherapy of human diseases: a macaque/
human chimeric antibody against human CD4. Biotech
nology 10: 1455-1460. 42. Danielsson L, Borrebaeck CAK (1992) Amplifi
cation of rearranged Ig variable region DNA from s
ingle cells. In: Antibody engineering: a practical
guide, edited by Borrebaeck CAK. W.H.Freeman and
Co., New York, pp 89-102. 43. Cruz RI, Anderson DM, Armstrong EG, Moyle W
R (1987) Nonreceptor binding of human chorionic go
nadotropin (hCG): detection of hCG or a related mo
lecule bound to endometrial tissue during pregnanc
y using labeledmonoclonal antibodies that bind to
exposed epitopes on the hormone. J Clin Endocrinol
Metab 64: 433-440. 44. Moyle WR, Anderson DM, Macdonald GJ, Armstr
ong EG (1988) Bioimunoassay (BIA): sandwich immuno
assay scheme employing monoclonal antibodiesand ho
rmone receptors to quantify analytes. J Recept Res
8: 419-436. 45. McFarland KC, Sprengel R, Phillips HS, Kohl
er M, Rosemblit N, Nikolics K, Segaloff DL, Seebur
g PH (1989) Lutropin-choriogonadotropin receptor:
an unusual member of the G protein-coupled recepto
r family. Science 245: 494-499. 46. Jia X, Oikawa M, Bo M, Tanaka T, Ny T, Boim
e I, Hsueh AJW (1991)Expression of human luteinizi
ng hormone (LH) receptor: Interaction withLH and c
horionic gonadotropin from human but not equine, r
at and ovine species. Mol Endocrinol 5: 759-768. 47. Loosfelt H, Miarahi M, Atger M, Salesse R,
Vu Hai Luu Thi MT, Jolivet A, Guiochon Mantel A, S
ar S, Jallal B, Garnier J, et al (1989) Cloning an
d sequencing of porcine LH-hCG receptor cDNA: vari
ants lacking transmembrane domain. Science 245: 52
5-528. 48. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989) M
olecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 49. Kriegler M (1990) Gene Transfer and Express
ion: A Laboratory Manual. Stockton Press, New Yor
k. 50. Cosowsky LN, Campbell RK, Papkoff HR, Moyle
WR, Macdonald GJ (1991) Use of hormone chimeras t
o identify the binding site for a monoclonalantibo
dy which binds a highly conserved site on mammalia
n LH and LH receptor complex. Biol Reprod 44, Supp
lement #1:70. 51. Stevens VC (1990) Birth control vaccines an
d immunological approaches to the therapy of nonin
fectious diseases. Infect Dis Clin North Am4: 343-
354. 52. Jones WR, Bradley J, Judd SJ, Denholm EH, I
ng RM, Mueller UW, Powell J, Griffin PD, Stevens V
C (1988) Phase I clinical trail of World Health Or
ganisation birth control vaccine. Lancet 1: 1295-1
298. 53. Bidart JM, Bellet DH, Alberici GF, Van Besi
en F, Bohuon C (1987)The immune response to a synt
hetic peptide analogous to the 109-145 betahCG car
boxyl-terminus is directed against two major and t
wo minor regions. Mol Immunol 24: 339-345. 54. Campbell RK, Erfle H, Barnett RW, Moyle WR
(1992) Assembly and expression of a synthetic gene
encoding the bovine glycoprotein hormone α-subun
it. Mol Cell Endocrinol 83: 195-200. 55. Lowman HB, Bass SH, Simpson N, Wells JA (19
91) Selecting high-affinity binding proteins by mo
novalent phase display. Biochemistry 30: 10832-108
38. 56. Hoogenboom HR, Winter G (1992) By-passing i
mmunisation. Human antibodies from synthetic reper
tories of germline VH gene segments rearranged in
vitro. J Mol Biol 227: 381-388. 57. Fersht A, Winter G (1992) Protein engineeri
ng. Trends Biochem Sci17: 292-295. 58. Scott JK, Smith GP (1990) Searching for pep
tide ligands with an epitope library. Science 249:
386-390. 59. Skerra A, Dreher ML, Winter G (1991) Filter
screening of antibodyFab fragments secreted from
individual bacteria colonies: specific detection o
f antigen binding with a two-membrane system. Anal
Biochem 196: 151-155. 60. Cohen, C and Parry D.A.D. (1990) α-Helical
coiled coils and bundles: how to design an α-hel
ical protein. Proteins: structure, function,and ge
netics 7: 1-15. 61. Hu, J.C., Newell N.E., Tidor, B., and Saue
r, R.T. (1993) Probingthe roles of residues at the
e and g positions of the GCN4 leucine zipper by c
ombinatorial mutagenesis. Protein Science 2: 1072-
1084. 62. King, R.J.B. and Whitehead, M.I. (1986) Ass
essment of the potencyor orally administered proge
stins in women. Fertility and Sterility 46:1062-10
66. 63. Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen,
J.K. and Pease, L.R.(1989) Site directed mutagene
sis by overlap extension using the polymerase chai
n reaction. Gene 77: 51-59. 64. Campbell RK, Dean Emig DM, Moyle WR (1991)
Conversion of human chorionic gonadotropin into a
follitropin by protein engineering. Proc Natl Acad
Sci USA 88: 760-764. 65. Skaf R, Macdonald GJ, Sheldon RM, Moyle WR
(1985) Use of antiserato fallicle-stimulating horm
one (FSH) to detect non-FSH factors in human serum
which modulate rat granulosa cell steroidgenesis.
Endocrinology117: 106-113. このように記載されている本発明は、多くの方法におい
て変化させることができることは明らかである。そのよ
うな変化は、本発明の意図および範囲から逸脱するもの
と見なされるべきのもではなく、すべてのそのような改
良は下記する特許請求の範囲に含まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＬＨ受容体に対する放射能標識したｈＬＨの結
合に対する抗体および抗血清の作用を示すグラフであ
る。

【図２】in vitroにてステロイド産生を誘発するｈＬＨ
の能力に対する抗体および抗血清の作用を示すグラフで
ある。

【図３】in vivoにてステロイド産生を誘発するｈＬＨ
の能力に対する抗体および抗血清の作用を示すグラフで
ある。

【図４】鋳型／排除選択手法で使用できるベクターを示
す。

【図５の１】ＬＨ、ｈＣＧもしくはＦＳＨに対する活性
免疫処理に使用するための抗原性が増大した免疫原の種
類を示す。

【図５の２】図５の１の分図である。

【図６】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃１およびプラ
イマー（下線）をコードする配列を示す。

【図７】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃２およびプラ
イマー（下線）をコードする配列を示す。

【図８】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃３およびプラ
イマー（下線）をコードする配列を示す。

【図９】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃４およびプラ
イマー（下線）をコードする配列を示す。

【図１０】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃５およびプ
ライマー（下線）をコードする配列を示す。

【図１１】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃６およびプ
ライマー（下線）をコードする配列を示す。

【図１２】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃７およびプ
ライマー（下線）をコードする配列を示す。

【図１３】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃８およびプ
ライマー（下線）をコードする配列を示す。

【図１４】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃９およびカ
セット（下線）をコードする配列を示す。

【図１５】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃１０および
カセット（下線）をコードする配列を示す。

【図１６】オリゴ糖シグナル配列を欠損するα−サブユ
ニットをコードする領域の調製を示す。

【図１７】ａｓｎ−結合オリゴ糖シグナル配列を欠損す
るβ−サブユニットをコードする領域の調製を示す。

【図１８】単一鎖ゴナドトロピンアナログ＃１ａをコー
ドする配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ // Ａ６１Ｋ 38/24 39/395 Ｄ 39/00 48/00 39/395 Ｃ０７Ｋ 16/26 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 16/26 Ａ６１Ｋ 37/38 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ−末端における脊椎動物のゴナドトロ
   ピンβ−サブユニットと、Ｃ−末端における脊椎動物α
   −サブユニットと、脊椎動物のゴナドトロピンβ−サブ
   ユニットを脊椎動物α−サブユニットに結合させる１〜
   １６個のアミノ酸残基を有するリンカーとからなる単一
   鎖ゴナドトロピン。
2. 【請求項２】 Ｎ−末端における脊椎動物α−サブユニ
   ットと、Ｃ−末端における脊椎動物のゴナドトロピンβ
   −サブユニットと、脊椎動物のゴナドトロピンβ−サブ
   ユニットを脊椎動物α−サブユニットに結合させる１〜
   １６個のアミノ酸残基を有するリンカーとからなる単一
   鎖ゴナドトロピン。