JP3330373B2 - 変容免疫学的特性、性能および／またはレセプター特異性を有する糖タンパク質ホルモンの類似体 - Google Patents

変容免疫学的特性、性能および／またはレセプター特異性を有する糖タンパク質ホルモンの類似体

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の技術分野 本発明は糖タンパク質ホルモン類似物、その使用方法
およびその他の用途に関するものである。本発明の分子
は天然産の脊椎動物糖タンパク質ホルモンの類似物また
は誘導体並びにそれらをコード化したDNA分子である。
天然産のホルモンは典型的にはアルファおよびベータ−
サブユニットから構成される。天然産アルファおよびベ
ータ−サブユニットのアミノ酸配列は第一表に示され
る。両サブユニットの単量体並びにヘテロ二量体および
ホモ二量体が存在することが知られている。本発明の分
子中では、ベータ−サブユニットもしくはアルファ−サ
ブユニットまたは両方の化学構造は天然ホルモンと異な
るものとすることができる。また、本発明の糖タンパク
質ホルモン類似物は、その生物学的、生理学的、薬学的
および／または免疫学的特性において天然産ホルモンと
相違する。分子の特異的性質を選択的に変え得る種々の
変化が天然産糖タンパク質のサブユニット中で成し得る
という観察によって、ホルモンの構造についての知識が
増加した。
本発明のホルモン誘導体は、種々の内分泌および代謝機
能を操作し機能障害を処理する道具として有用である。
本発明の一つの側面は哺乳類の繁殖を調節することに関
するものである。
本発明のホルモンは、治療、免疫、診断およびその他
の利用を含む多くの用途に有用である。本発明のある種
のホルモンは、生体例えば哺乳類および他の脊椎動物中
の生殖過程を変えることができる。ある種のホルモンは
生殖力を増進する。他のものはコントラジェスティブ
（contragestives）である。本発明の種々の側面は以下
詳細に説明される。本発明ホルモンは、遺伝子工学、化
学合成および／またはそれらの方法の組合わせにより製
造することができる。本発明の糖タンパク質ホルモン
は、関連技術分野での重要でかつ実際的な必要性を満た
すのに貢献する。
本発明の背景 糖タンパク質ホルモンはゴナドトロピンおよびチロト
ロピンを含む。ヒトでは、これらは柔毛性ゴナドトロピ
ン（CG）、黄体形成ホルモン（LH）、卵胞刺激ホルモン
（FSH）および甲状腺刺激ホルモン（TSH）である。これ
らはヘテロ二量体タンパク質の一グループであり、共通
のアルファ−サブユニットを有するが、ホルモン特異性
のベータ−サブユニットにおいて異なるものである。ゴ
ナドトロピン例えばCG、LHおよびFSHは生殖工程で重要
な役割を果たすが、一方TSHは甲状腺機能にとって重要
である。内分泌と代謝機能におけるこれらホルモンの重
要性のために、ホルモンの構造と機能との間の関係を特
性ずけるのに相当な関心が払われた。
多くの糖タンパク質ホルモンの一次構造は多年の間分
っていたが、ホルモンの構造と機能との間の関係は、化
学修飾（１で記載）、デグリコシル化（１−４）、免疫
特性の決定（５−８）、およびペプチド類似物の使用
（９−12）を含む多くの研究にも拘らず部分的に特性付
けられたに過ぎない。ベータ−サブユニットはホルモン
の活性を規定するが、遊離のサブユニットは生物学的活
性を有しない（１）。アルファ、ベータ−ヘテロ二量体
が最も活性のある形態である理由は分かっていない。そ
の活性は、一種のサブユニットまたは両方のサブユニッ
トが結合した後に形成する独特の配座の結果と考えられ
（13）、および／または両方のサブユニットの部分がレ
セプターと直接に相互反応する結果と考えられる（９、
10）。ある抗原が、hCG−サブユニットがアルファ−サ
ブユニットを伴う場合のみ、それの上でエピトープと結
合するという観察にから、ベータ−サブユニットの配座
は、それがアルファ−サブユニットと結合している場合
には変化していることを示唆している（14）。これら抗
原の結合に関与する残基は同定されていて、Cys−38とC
ys−57の間（15）、即ちレセプターと相互反応すると提
案されている分子の部分（10）にそれらを含む。同様
に、アルファ−サブユニットに対するある単一クローン
抗体および多クローン抗血清は（16）、遊離のアルファ
−サブユニットに対するよりアルファ、ベータ−ヘテロ
二量体に対して高い親和性を有し、このことはアルファ
−サブユニットの配座は、ベータ−サブユニットと結合
する場合に変化することを示唆している。レセプターへ
の結合にするのに両サブユニットが関係している証拠
は、アルファおよびベータ−サブユニットペプチドがhC
Gのレセプターへの結合を阻害することができることに
基ずき（９、10）、両サブユニットがレセプターに架橋
結合することができることに基ずく（17−19）。アルフ
ァ−サブユニットは異なったホルモンでは異なった配座
を有するようである。何故なら、すべてではないがある
種のヒト糖タンパク質ホルモンのヘテロ二量体の形態で
アルファ−サブユニットと結合する抗アルファ−サブユ
ニット抗体が見出だされているからである（29）。
Asn−連鎖炭水化物基はホルモンの効能に影響する。
化学的（３、４）、酵素的（20、21）、または遺伝的
（22）操作によるデグリコシル化により、それらは生体
外で活性を減少する。炭水化物基、特にAsn−52のアル
ファ−サブユニット上のそれら（22）が必要である理由
は分かっていない。炭水化物基は、ホルモン−レセプタ
ー複合体を他の細胞表面タンパク質に架橋結合するのに
関与することができる（２、23）。またそれらは、分子
の配座を変えることができる（24）。しかしこれは分光
分析的に示すことは困難であった（25）。炭水化物基は
ホルモンの融通性を増加し、ホルモンがレセプターに結
合した後に生起する配座の変化を促進することができる
（26）。hCGに対する抗体のFab断片はデグリコシル化ホ
ルモンを作用体に変換することができるという報告（2
7）によって、hCGの配座への炭水化物の効果がさらに支
持される。またAsn−連結糖は二量体安定化の役割を有
するようである。何故ならば、二量体を解離してデグリ
コシル化に続くことがさらに困難であり（28）、デグリ
コシル化サブユニットが天然アルファおよびベータ−サ
ブユニットより急速に再結合するからである（25）。
糖タンパク質ホルモンの構造と機能との間の関係を理
解することにとって、二つの主要な障害がある。第一
に、このホルモンの三次構造が決定されていない。この
ホルモンは結晶化が困難であって、近年になって糖タン
パク質ホルモン（hCG）のＸ線回折研究のための高純度
の結晶が得られた（71、72）。さらに、サブユニット中
のジスルフィド結合の位置に関して疑問がある（１、
２）。ホルモンの活性に影響すると知られている、炭水
化物鎖の三次構造を得るのに予想される困難性のため
に、結晶学的および／またはNMRアプローチでも、ホル
モンレセプターと相互反応して応答を誘導する残基の特
性付けを保証することができない。
構造と機能の間の関係を理解するのに第二の主要な障
害は類似体を調製することの困難性であった。1985年ま
で（30）、類似体を調製する唯一の方法は化学的または
酵素的方法であった。特異的に修飾できる残基の数が制
限されていること、および特殊なＮ−連結糖鎖を除去す
ることが困難であることが実質的に進歩を阻害した。
現在では、組換DNA技術によって、広範囲の類似体の
製造が可能である。今日では、幾つかの糖タンパク質ホ
ルモンが哺乳類細胞中に導入されたDNAから培養中に発
現し、またその幾つかの類似体も発現している（22、30
−36）。
本発明はDNA突然変異誘発および遺伝子発現を利用し
て糖タンパク質ホルモン類似体を製造する。これらの類
似体によって、レセプター結合と特異性、サブユニット
相互反応、および抗体結合に重要な残基の同定が可能と
なった。これらのホルモン中に多種類の転換を行うこと
ができることが発見された。例えば、レセプターまたは
抗体結合のような各親分子の特異的性質を結合したキメ
ラサブユニットを作成することができる（第II、III、I
V、VI、XIII表および第11図）。さらに、ある種の部分
を欠失すると、その結果分子は効能を減少した（第VII
表および第14図）。
生物学的、生理学的、薬学的および／または免疫学的
特性に貢献するホルモン中のアミノ酸残基を同定するこ
とによって（第７−12、14図）、多種類の有用な類似体
の製造が可能になった。この発明は生殖腺および甲状腺
機能を操作するのに有用な化合物を提供する。これらの
利用の内には、雄性および雌性哺乳類での生殖能の誘
発、雌性不妊症の増進、コントラジェスション並びに動
物での生殖能力の生体外および生体内調節がある。
背景技術 糖タンパク質ホルモンは広範囲に研究されてきた。こ
れらの分子の構造／機能の関係に相当な関心が払われて
きた。以下に記載する一般的な文献はこの分野における
知識の最近の状況を反映している。
ピアース，ジェー・ジー アンド パーソン，ティー
・エフ、Ann.Rev.Biochem.50,465（1981）．この広範な
総説には、天然産糖タンパク質ホルモンの化学的および
酵素的に誘導された種々の類似体について、その構造と
機能の関係を験らべた結論が要約さている。著者は、糖
タンパク質ホルモンとそのレセプターとの相互反応につ
いて未知なところが多く残されていると結論している。
ライアン，アール・ジェー,Recent.Progress Hormone
Res.43,383（1987）．ライアン，アール・ジェーら，
「糖タンパク質ホルモン：構造−機能の関係の最近の研
究」、FASEB Journal,２,2661（1988）．これらの報告
は、合成ペプチドを使用して糖タンパク質ホルモン構造
と機能を研究した研究を要約している。
コートマン，エイチ・ティら,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U
SA 84,2038（1987）．この報告では、hCGおよびhLHのベ
ータ−サブユニット中のインターシステイン38−57ルー
プ配列は、これらの分子中での生物学的活性の発現のと
つて決定因子であると結論している。
シュニヤー，エイ・エルら,Biochemistry 27,666（19
88）．この研究では、hFSHベータ−サブユニット配列33
−52がレセプター結合に重要であり、配列TRDL（34−3
7）は特にに重要であると結論している。
結合特異性を決定する際のサブユニットの役割を同定
した研究例が、ストリックランド，ティ・ダブリュ ア
ンド ピュット，デー，「黄体形成ホルモン／ヒト柔毛
膜性ゴナドトロピン組換え体の作用に対するサブユニッ
トの貢献」、Endocrinology 109,1933（1981）にある。
ウシおよびブタLHから調製された雑種組換え体とヒトCG
が使用された。アルファおよびベータ−サブユニットが
数種の生体外システム中組換え体の性質に寄与している
ことが観察された。いずれの場合も、この組換え体はベ
ータ−サブユニットが誘導されたホルモンと同じ様に挙
動する。
生殖内分泌学に関する一般的文献としては、ヤン，エ
ス・エス・シー アンド ジェッフ，アール・ビー「生
殖内分泌学：生理学、病態生理学および臨床管理」、第
二版、ダブリュ・ビー サウンダース社、フィラデルフ
ィア、1986年を参照のこと（以下「ヤン アンド ジェ
ッフ」と呼称する）。このテキストの第19章には、受精
に関する機構と不妊症の臨床上の問題点の両方が総説さ
れている。このテキストには、生殖能の誘導のために糖
タンパク質ホルモンを使用することを記載されている。
図および表の簡単な説明 第１図は、hCGベータ−サブユニットcDNAのヌクレオ
チド配列およびコード化アミノ酸配列を数種の制限エン
ドヌクレアーゼ認識部位と共に示す。
第２図は、hCGアルファ−サブユニットcDNAのヌクレ
オチド配列およびコード化アミノ酸配列を数種の制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位と共に示す。
第３図は、プラスミドpKMtおよびpKBMを構成するのに
使用される配列DNAオリゴヌクレオチドを示す。
第4A図は、類似体hCG−ベータのヌクレオチド配列お
よびコード化アミノ酸配列を示し、それは、hCGベータ
−サブユニットcDNA中に存在する制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を除去する二種の沈黙突然変異を含有する。
第4B図は、カセット突然変異誘発によりこの類似体を構
成するのに使用されるDNAオリゴヌクレオチドを示す。
第５図は、類似体F8（第VII表参照）、B9、およびB11
（第II表参照）を構成するのに使用されるDNAオリゴヌ
クレオチドカセットのヌクレオチド配列を示す。
第６図は、合成ウシアルファ−サブユニット遺伝子の
ヌクレオチド配列およびコード化アミノ酸配列を数種の
制限エンドヌクレアーゼ認識部位と共に示す。
第７図は、抗体結合にクリティカルなヒトアルファ−
サブユニット残基を示す。
第８図は、抗体結合にクリティカルなhCGベータ−サ
ブユニット残基を示す。
第９図は、ヒトアルファ−サブユニットでCOS7細胞中
で共発現されたhCG/hFSHキメラベータ−サブユニットに
よるLHレセプター結合の供与量・応答曲線であり、hCG
とhFSHとが比較される。
第10図は、ヒトアルファ−サブユニットでCOS7細胞中
で共発現されたhCG/hFSHキメラベータ−サブユニットに
よるFSHレセプター結合の供与量・応答曲線であり、hCG
とhFSHとが比較される。
第11図は、ヒトアルファ−サブユニットでCOS7細胞中
で共発現されたhCG/hFSHキメラベータ−サブユニットの
ステロイド産生活性を仲介されたLHレセプター結合の供
与量・応答曲線であり、hCGとhFSHとが比較される。
第12図は、ヒトアルファ−サブユニットでCOS7細胞中
で共発現されたhCG/hFSHキメラベータ−サブユニットの
ステロイド産生活性を仲介されたFSHレセプター結合の
供与量・応答曲線であり、hCGとhFSHとが比較される。
第13図は、ヒトアルファ−サブユニットでC127細胞中
で共発現されたhCGベータ−サブユニット欠失類似体
（８）によるLHレセプター結合の供与量・応答曲線であ
り、hCGと比較される。
第14図は、ヒトアルファ−サブユニットでC127細胞中
で共発現されたhCGベータ−サブユニット欠失類似体（F
8）のアデニールシクラーゼ活性を仲介されたLHレセプ
ター結合の供与量・応答曲線であり、hCGと比較され
る。
第Ｉ表は数種の天然産糖タンパク質ホルモンアルファ
−サブユニットおよびベータ−サブユニットのアミノ酸
配列を示す。
第II表は数種のhCG/hFSHベータ−サブユニットキメラ
のアミノ酸配列を示す。
第III表は数種のhCG/hTSHベータ−サブユニットキメ
ラのアミノ酸配列を示す。
第IV表は数種のhCG/bLHベータ−サブユニットキメラ
のアミノ酸配列を示す。
第Ｖ表は数種のhCG/eLHベータ−サブユニットキメラ
のアミノ酸配列を示す。
第VI表は数種のhCG/hLHベータ−サブユニットキメラ
のアミノ酸配列を示す。
第VII表は数種のベータ−サブユニット欠失突然変異
株のアミノ酸配列を示す。
第VIII表は数種の他のベータ−サブユニット類似体の
アミノ酸配列を示す。
第IX表は数種のベータ−サブユニット類似体のアミノ
酸配列を示す。
第Ｘ表は数種のベータ−サブユニット／融合タンパク
質の実例を示す。
第XI表はhCGベータ−サブユニットで共発現されたキ
メラヒト／ウシベータ−サブユニット間の単一クローン
抗体結合の差異を示し、hCGベータ−サブユニットで共
発現されたキメラヒト／ウシアルファ−サブユニットと
比較される。
第XII表は、膜結合hCG−ベータ−サブユニット/VSV−
Ｇ融合タンパク質がhCGアルファ−サブユニットと結合
し、ベータ−サブユニット（B105）、アルファ−サブユ
ニット（A111）、およびアルファ、ベータ−ヘテロ二量
体（B109）に対する単一クローン抗体により認識される
能力を示す。
第XIII表は、キメラhFSH/hCGベータ−サブユニットに
結合する単一クローン抗体を示す。
第XIV表は、キメラアルファ−サブユニットまたはア
ルファ−サブユニット欠失を含有するアルファ、ベータ
ヘテロ二量体によるLHレセプター結合を示す。
第XV表は、強固に形質移入されたCOS7細胞上のhCG−
ベータ/VSV融合タンパク質への単一クローン抗体の結合
を示し、hCGベータ−サブユニットで強固に形質移入さ
れたCOS7と比較される。
本発明の要旨 本発明は、脊椎動物の両性において種々のホルモン調
節生理学的機能を制御できるように「設計」されたタン
パク質ホルモン類似物を提供する。特に、本発明は糖タ
ンパク質ホルモンおよびその個々のサブユニットに関す
る。ホルモンのヘテロ二量体の形態は最も活性であると
教示されている。このグループに属する４種のヒトホル
モンは柔毛膜性ゴナドトロピン（CG），黄体形成ホルモ
ン（LH）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、および甲状腺し
刺激ホルモン（TSH）である。
本発明によれば、用語「ホルモン類似体」、「糖タン
パク質ホルモン類似体」および「突然変異株」は最も広
義に解釈される。説明中で、用語「キメラ」は、二つま
たはそれ以上の異なった糖タンパク質ホルモンから誘導
されるアミノ酸配列を含有するホルモン類似体を示すの
に使用される。これらのキメラは、低い配列相同性を持
つタンパク質から構成されることができる。例えば、ベ
ータ−サブユニットキメラは、極めて低い配列相同性の
領域でhCGおよびhFSHベータ−サブユニットから作成す
ることができる（第II表）。これらキメラは以下詳細に
記載するが、LHおよびFSHレセプターの両方と結合し刺
激することができるような有用な性質を示す。ある事例
では、ホルモン配列の単一アミノ酸の修飾のような比較
的小さい変化によって、天然ホルモンと比較して顕著に
その活性が変質される。
本発明により考えられた類似物は、新規の生物学的、
生理学的、薬学的および／または免疫学的（以下、「生
物学的」）活性を有する分子および、このような活性分
子にとって有用な中間体である分子を含む。連鎖した二
量体のみならずアルファおよび／またはベータ−サブユ
ニットもまた本発明の範囲内にある。これらのサブユニ
ット類似物は単量体形態（「有利サブユニット」）でで
も使用することができる。修飾サブユニットも適切な他
のサブユニットと連鎖することができる。さらに、記載
によって明らかになるが、本発明のホルモン類似物は同
一動物種から構成される必要がないので、それらはどの
脊椎動物から得られたホルモンの一部または組合わせ即
ち「交差種」を使用して調製することができる（例えば
第IV、Ｖ、およびIX表参照）。さらに、ヒト分野、脊椎
動物分野および他の利用分野での用途および利用は他の
脊椎動物での用途を含めて本発明の範囲である。さらに
記載するように、本発明のいくつかの類似物はヒトおよ
び動物における生殖能に影響する性質を有する（例え
ば、増進または阻害）。
本発明によれば、特異的な生理学的機能および他の生
物学的活性の原因とされる特殊な領域のアミノ酸が同定
される。本発明は、二量体または単量体で新規なまたは
改造された生物学的活性を示すアルファおよびベータ−
サブユニットの多種類の変種を包含する。本発明の幾つ
かの類似物は、一つまたはそれ以上の異なった糖タンパ
ク質ホルモンのためのレセプターとして働くことができ
る作用物質または拮抗物質として有用であると考えられ
る。
本発明の他の側面では、融合タンパク質が糖タンパク
質ホルモンベータ−サブユニット（hCG−ベータ）およ
び他のタンパク質（第Ｘ表）の間に作成される。特に、
hCGベータ−サブユニット/VSVG−タンパク質類似物が記
載され、その中では水胞性口内炎ウイルスＧ−タンパク
質の膜内外および細胞質領域のアミノ酸残基が、Sm I制
限エンドヌクレアーゼの残基135−137の部位を使用し
て、hCG−ベータでCys−110のhCG−ベータ−サブユニッ
ト下流中に挿入されてる（第XII表）。この類似物は突
然変異誘発生成物の分析のためのスクリーニングシステ
ムとして、それを生産する細胞または生体（例えばウイ
ルス）に接触した動物またはヒトに導入することがで
き、そのことによってタンパク質自体を単離および精製
する必要がなくなる免疫原として有用であると考えられ
る。
本発明は糖タンパク質ホルモンサブユニットからのア
ミノ酸残基が他のタンパク質中に挿入されたタンパク質
を提供する。例えば、抗体認知に関与するホルモン残基
は非糖タンパク質ホルモン（例えば、リゾチーム）に移
入され、その結果得られるタンパク質は、糖タンパク質
ホルモンの選択された領域に対する免疫反応を誘い出す
免疫原として使用される。本発明の他の側面は、一つま
たはそれ以上の糖タンパク質ホルモンの作用を特異的に
阻害することができる免疫反応を誘導する免疫原として
有用なペプチドのデザインを提供する。
また、糖タンパク質ホルモンの領域、例えばhCG−ベ
ータ39−56またはhFSH−ベータ33−50は非糖タンパク質
ホルモンからの配列と取り替えることができ、挿入配列
に対する抗血清または抗体を発生する抗原として使用で
きると考えられる。
本発明の一つの側面は、LHおよびFSHレセプターの両
方にホルモン結合を指示することができるベータ−サブ
ユニットキメラを提供する。これらのキメラはヒト糖タ
ンパク質ホルモン（例えば、hCG/hFSHまたはhLH/hFSH）
または非糖タンパク質ホルモン（例えば、ウシLH/ウシF
SHまたはウマLH（またはCG）／ウマCG）から誘導するこ
とができる。これらのキメラは男性および女性での不妊
症の処理並びに雌雄動物の生殖能の増進に有用であると
考えられる。
本発明はアルファ−サブユニット類似物を提供する。
これらの中には、異なった種からのアルファ−サブユニ
ットからの配列からなるキメラアルファ−サブユニット
がある（第IX表）。これらの類似物は新規な免疫学的性
質を示す。これらの類似物は有用な免疫原であると考え
られる。ウシ／ヒトアルファ−サブユニットキメラは、
抗体結合に関与するサブユニットの特殊な領域の同定を
可能にし、免疫原への免疫反応を制限または変えるのに
使用することができる。
交差−種ベータ−サブユニットキメラ、例えばhCG/ウ
シLH（第IV表）またはウシLH/ウマLHも本発明により提
供される。同様に、他の脊椎動物から誘導された交差−
種キメラが考えられる。これらのキメラは獣医学的用途
を有し、レセプター結合および生物学的性能に関与する
ホルモンの領域をマッピングするのに有用である。
本発明により提供される他の種類のキメラはゴナドト
ロピン／チロトロピンを含む。これらの類似物は生殖腺
または甲状腺機能を操作するのに有用であると期待され
る。それらはホルモン機能の原因であるアミノ酸を同定
するのにも有用である。この情報は、種々のレセプター
への改良ホルモン作用物質、拮抗物質、部分的作用物質
並びに種々のレセプターへの作用物質／拮抗物質活性を
結合した類似物の生産を促進する。
本発明により提供される幾つかの構成物は、糖タンパ
ク質ホルモン上の特異な領域に対する抗体を発生させる
ことができる。これらの抗体はホルモン−特異性であ
り、それ故他のホルモンへの好ましくない結合を示さな
い。この種の構成物はアルファおよびベータ−サブユニ
ットキメラ並びに炭水化物基が導入されてホルモンの選
択された領域の抗原性を遮蔽している類似物を包含す
る。既知のＴ−細胞エピトープがホルモン中に入れられ
てその免疫抗原性が促進されている他の類似物が考えら
れる。二つの利用が予想される。第一は、これらの構成
物は免疫コントラジェスチブなワクチンとして有用であ
ると考えられる。これらの免疫原は、発生した抗体は高
力価であり、hCG分子の特殊な部分に特異的である点で
有用であると考えられる。誘導されたhCG−抗体複合体
は胎盤からのhCGが黄体を刺激しないようにして、その
ことによって妊娠を初期に停止させる。第二の用途は動
物の生殖能力を調節することである。さらに詳しくは、
本発明の免疫原性構成物はウシ、ウマ、イヌ、ネコ、お
よびその他の動物の免疫去勢に有用であると考えられ
る。さらに、若雌ウシの生殖システムの発生の抑制がフ
ィードロット中の熱を調節する方法としてが考えられ
る。
本発明は糖タンパク質ホルモンレセプター拮抗物質で
ある構成物質も提供する。これらの拮抗物質は数種の用
途を有すると考えられる。特に、ホルモン拮抗物質異所
性妊娠を停止させ、多嚢胞性卵巣症でのLHの作用を遮断
し、癌化学療法中に生殖腺活性を低下させ、またはグレ
ーブス病での甲状腺への刺激性免疫グロブリンの作用を
遮断するのに使用することができる。
要約すれば、本発明は多種類の生物学的特性を有する
糖タンパク質ホルモンの類似物を提供する。
本発明の詳細な説明 本発明は三つの主要な実施態様を含む。第一は、男
性、女性および両性の動物での生殖能を誘導することが
できる糖タンパク質ホルモンの類似物を含む。第二は、
免疫コントラジェスチブなワクチン、免疫去勢剤および
生殖システム発生の抑制剤として機能する類似物を含
む。実施態様はホルモンまたはレセプター活性を阻害す
ることができる拮抗物質を含む。
男性、女性および動物における生殖能の誘導 生殖能は重要な臨床的、社会的、および人間健康上の
問題である。妊娠を望む女性の多くは優生卵胞を発生し
排卵を必要なhCGサージを起こさない。排卵がゴナドト
ロピン欠乏により起こる場合、卵胞成熟および排卵はヒ
ト閉経期ゴナドトロピン（fMG）投与それにと続くhCGの
投与により誘導することができる。hMGは、閉経期後の
女性の尿から調製された抽出物であり、hLHおよびhFSH
を含有する。それは商品名ペルパノール（TM）として市
販されている。
女性では、卵巣ステロイド形成、卵胞成熟および排卵
にはhLHおよびhFSHが必要である。卵巣での卵胞発生の
間、LHは卵胞を囲む細胞を刺激しアンドロゲン産生を誘
導する。卵母細胞を囲む卵胞内の細胞はFSHに反応四、
包膜および間細胞により生産されたアンドロゲンをエス
トロゲンに変換する。
本発明のある種の構成物は、ゴナドトロピン欠乏によ
り起こる女性不妊症の処理に有用であると考えられる。
これらの分子は、不妊女性に投与された場合、LHおよび
FSHレセプターと相互反応して、エストロン生成および
濾胞成熟が誘導される。そこで、本発明は、不妊症の処
理でペルガノール（TM）、hMGもしくはhLHおよびhFSHの
他の混合物に代わり得るタンパク質を開示する。
本発明の好適な実施態様は,hFSHのＣ−末端領域の近
辺の残基がhCGの対応する領域で置換されているキメラ
である。これらのキメラはヒトアルファ−サブユニット
と結合して生物学的活性を有する二量体を生成する。四
つの特異的なキメラについて以下に述べる。これらの構
成物の配列は第II表に示し、B11、B17、B18およびB19と
表記する。これら構成物のすべてはアルファ−サブユニ
ットと結合してヘテロ二量体を生成し、それはhFSHレセ
プターと結合して果粒膜細胞ステロイド形成を刺激する
のみならず、LHレセプターと結合してレイデッヒ細胞ス
テロイド形成（20）も刺激する。これらの類似物への抗
体結合も特性付けされた。代表的なアッセイの結果を第
一XIII表および第９−12図に示す。
本発明の好適な実施態様は構成物B18である。この構
成物はその他にベータ−CF94−114と表示され、Ｃおよ
びＦは各々hCGベータおよびhFSH−ベータ配列の型を表
示し、数字は第一および第二の置換の各領域中の未同定
残基を表示する。構成物B18はその他にDG′とも表示す
る。この構成物中では、hFSH−ベータの残基88−108がh
CG−ベータの残基94−145と代っている。この構成物は
アルファ−サブユニットと結合して、LHおよびFSHレセ
プターの両方に結合しステロイド産生を刺激するするこ
とができるヘテロ二量体を生成する（第11および12
図）。
hCG/hFSHベータ−サブユニットキメラの他の実施態様
は構成物B11、B17およびB19である。構成物B11は、その
他にベータ−CF94−117またはDGと表記され、hCG−ベー
タの残基94−145の代わりにhFSH−ベータの残基88−111
を含有する。構成物B17は、その他にベータ−CFCF39−5
8/94−117またはABCDGと表記され、各々hCG−ベータの
残基39−58および94−145の代わりにhFSH−ベータの残
基33−52および残基88−111を含有する。構成物B19は、
その他にベータ−CFCF39−58/94−113、114QまたはABCD
G′と表記され、キメラのおよび非キメラの置換並びに
削除とを組合せる構成物B17の変種である。アミノ酸配
列は、位置114でグルタミンがグルタミン酸にで置き変
わり最終の三つの残基（115−117）が削除されている以
外は17と同一である。
これらの実施態様の他に、hFSH−ベータの小さい領域
例えば配列DSDSTDCTVRGLGPSY（hFSH−ベータ残基88−10
3）、TVRGLGPSY（hFSH−ベータ残基95−103）またはTVR
GLG（hFSH−ベータ残基95−190）がhCG（またはhLH）ベ
ータ−サブユニットの適切な領域に挿入されることが考
えられ、その結果得られたキメラベータ−サブユニット
がアルファ、ベータ−ヘテロ二量体のFSHレセプターへ
の結合を指示し、分子の天然のLHレセプター結合活性お
よび性能の他に生物学的反応を誘導することが考えられ
る。
また、構成物B25についてはhCG−ベータまたはhLH−
ベータ配列がFSHのＣ−末端で置換され得ること、構成
物B26についてはhCG−ベータがhFSH−ベータ中で置換さ
れ得ること、およびこれらキメラタンパク質がアルフ
ァ、ベータ−ヘテロ二量体のLHレセプターへの結合を指
示し、生物学的反応を誘導することが考えられる。さら
に、これら種々のキメラがLHおよびFSHレセプターで異
なった効力を示し、FSHのLHへの高いまたは低い比率の
ために、ある種の用途に一つのものを他のものから選別
することが考えられる。
hCG−ベータ残基94−145の代わりにhFSH−ベータ残基
を含有する本発明の構成物はLHおよびFSHレセプターへ
の結合を指示し、ステロイド産生を刺激するという発見
は予期されないものであった。従来技術は、ベータ−サ
ブユニットの他の領域はレセプター結合に重要であると
考えられていたことを示している。シュニヤーら（12）
よって、hFSH−ベータ（残基34−37）はFSHレセプター
への結合に必要であることが示されている。サンタ・コ
ロマら（76）によるその後の研究により、hFSH−ベータ
残基33−53はFSHレセプターと結合し刺激することが示
されている。コウトマンら（10）は、hCG−ベータおよ
びhLH−ベータの対応する領域、残基38−57はLHレセプ
ターへの結合および刺激に必要であると結論した。これ
らの著者らも、hCG−ベータ残基93−101がLHレセプター
への結合に必要であると結論した。ベータ−サブユニッ
トのこれらの領域がレセプター結合特異性に重要なら
ば、その領域中に配列変質を含有するキメラhCG/hFSHベ
ータ−サブユニット 変質した結合特異性を示すと考えられる。これは事実
ではない。構成物B9、B15およびB16で得られたデータが
このことを反映している（第９−12図）。構成物B15
は、その他にCFC39−58またはABCと表記され、hCG−ベ
ータ残基39−59の代りにhFSH−ベータ残基33−52を含有
する。アルファ、ベータ−B15のレセプター結合活性は
実質的にhCGと区別できないものである（第９および10
図）。構成物B9は、その他にCFC94−97またはＤと表記
され、hCG−ベータ94−97の代りにhFSH−ベータ残基88
−91を含有する（hCG−ベータ98−100に対応する残基は
hFSH−ベータおよびhCG−ベータ中のものと同一であ
る）。アルファ、ベータ−B9ヘテロ二量体はLHレセプタ
ーと結合し刺激するが、hCGよりも約39倍少ない効力し
かない（第９および11図）。アルファ、ベータ−B9ヘテ
ロ二量体は試験した量ではFSHレセプター結合を示さな
い（第10図）。構成物B16は、その他にCFC39−58/94−9
7またはABCDと表記され、B9およびB16中に存在する置換
と結合する。B19については、アルファ、ベータ−B16ヘ
テロ二量体はLHレセプターでhCGよりも約３倍活性が少
ない（第９−11図）。それはhFSHレセプターへの結合に
おいてhCGより良好ではない（第10図）。
さらに、本発明のキメラ構成物は男性および雄性の動
物での生殖能の増強即ち精子形成を刺激するのに有用で
あると考えられる。精子形成の誘導にはLHおよびFSHが
必要である。LHは精巣のライデッヒ細胞のよるテストス
テロン産生を刺激する。hFSH並びにLHへの反応で生産さ
れるテストステロンの高い局所濃度はセルトリ細胞を刺
激して、それにより精子形成を誘導する。この理由のた
めに、FSHおよびLHの両方に作用する化合物が望まし
い。さらに、hCGはhFSHよりも長い半減期を有するか
ら、hCG/hFSH−ベータ−サブユニットキメラを含有する
ホルモン類似物はhFSHよりも長い生物学的半減期を有す
ると期待される。これらの類似物はhCGもしくはhFSH単
独またはhCGおよびhFSHの組み合わせよりも効能が高い
と予想される。
生殖過程の免疫学的調節 本発明の糖タンパク質ホルモン類似物は、hCGに対す
る高力価特異性抗血清を発生させ、長期抗受精剤として
有用である。ホルモンの診断用免疫アッセイおよびhCG
に対するワクチンの開発のために、糖タンパク質ホルモ
ンに対する特異性抗血清を誘導できる抗原への要望が長
い間認識されてきたと考えられる。
hCG−ベータ中に存在する三次構造の領域を持つ本発
明の類似物は、hCGの特殊領域に対する免疫反応を誘導
する点で合成ペピチドよりもかなり効能があり、そして
免疫避妊ワクチンとしてより効能があると予想される。
炭水化物がタンパク質に添加される最近の研究から、そ
れらの抗原性を減少させることが可能であることが示さ
れた（39）。hCG−ベータ−サブユニットのある領域に
炭水化物を添加すると、本発明の類似物と他の糖タンパ
ク質ホルモンの間の免疫学的交差−反応性が減少するこ
とが考えられる（ヒトでは、これらはLH、FSHおよびTSH
である）。本発明の好適な実施態様は類似物G9である
（第VIII表）。この類似物では、hCGベータ−サブユニ
ット残基78は他のアミノ酸で置き換えられ、残基79はセ
リンまたはスレオニン残基で置き換えられて、Asn−77
のためのグリコシル化信号を生成四、それによりhLHお
よびhCGの間の主要な共通のエピトープの抗原性を減少
する。本発明の類似物は、適切な担体、例えばムラミル
ジペプチド（MDP）、その誘導体またはその他の適当な
担体と組み合わされた場合、免疫原性があり、または高
い免疫原性があることは除外できない。担体は免疫原性
があるものとも無いものともすることができる。本発明
の免疫原性類似物は、従来技術で既知の適切なワクチン
アジェバントと配合される。ヒトおよび動物のためのワ
クチン化の方法は従来技術で知られている。
本発明の抗原はhCG分子の特異領域への免疫反応を生
起する。生起した抗原は、胎盤により生産された内生循
環hCGに結合し、それが黄体LHレセプターに結合しない
ように遮断し、その結果黄体はプロゲステロンの分泌を
停止する。初期妊娠を維持するのに卵巣プロゲステロン
が必要であるので、このステロイドホルモンが欠乏する
ことにより妊娠が停止する結果となる。
動物の生殖能および第二性徴を調節するのに有用な本
発明の構成物について考えられる。この種の利用の一つ
は雄ウシの外科的去勢の免疫学的置換としてのものであ
る。雄ウシは去勢して、互いに闘争して損傷しないよう
に防止される。しかし、去勢が原因で生ずる多くの問題
がある。かなり高い感染率と罹患率がある。その結果得
られた去勢ウシは手術後の長期間に規則的に食べなくな
り、その結果として重量増加が遅延する。動物は手術が
回復した後でも、重量増加率は低く、その動物により生
産される肉は高い脂肪分を有する。この結果を保障する
ために、農家はウシにアンドロゲン補足物を与える。そ
の結果として循環アンドロゲンが増加し、それにより重
量増加が加速され高タンパク質含量の肉が得られる。し
かし、この実施はすべては許容し得るものではないこと
が分かっている。本発明の構成物は、ウシLHの特異的な
構造領域への抗体を発生する免疫原として有用である。
この抗体はホルモンを部分的に中和して発情を抑える
が、循環テストステロンの充分量を提供して重量増加に
明確な効果を示す。さらに、本発明の免疫原は生殖シス
テムの発達を抑制して雌ウシの発情を調節すること、ネ
コおよびイヌの去勢、ウマの去勢およびその他のようと
に有用である分かっている。
この免疫原性構成物の数多くの実際的な利用および用
途は、この本発明の範囲内にあると考えられる。生成す
る抗体が他の糖タンパク質ホルモン種に対して交差−反
応的でない糖タンパク質ホルモンの特殊な領域への高力
価免疫反応の発生によつって、特殊な糖タンパク質ホル
モンが伴う生理学的機能の調節が可能になる。
ホルモン拮抗物質 本発明によれば、本発明の構成物は妊娠および異所的
妊娠の非外科的停止に有用である。コントラジェスショ
ンは、黄体への天然hCGの接近を遮断する本発明のある
種の構成物により達成される。これらの構成物はhCGレ
セプター結合特異性を示すが、ステロイド産生誘導の効
能は減少する。プロゲステロン形成の誘導が減少する結
果、妊娠の維持にとって不十分なレベルになる。
hCG拮抗物質の好適な特殊な実施態様は構成物F8であ
る（第VII表）。この構成物では、天然hCGから残基47−
50が削除され、残基51がアラニンからプロリンに変えら
れている。アルファ−サブユニットと結合した場合、こ
の構成物はLHレセプターと結合し（第13図）、hCGの性
能の約50％でhCG誘導環状AMP蓄積を刺激することが示さ
れた。この構成物はまた、hCG−誘導環状AMP蓄積を阻害
することが分かっている（第14図）。このことは類似物
のステロイド形成能を減少させる。
hCG拮抗物質は、化学療法中に生殖腺活性の抑制に有
用あると考えられる。さらに、TSH阻害剤はグレービス
症での治療法として有用であり、LH阻害剤は多嚢胞性卵
巣の処置法として有用であると考えられる。
他のキメラ 本発明は他の糖タンパク質ホルモンキメラまたは類似
物に関する。これらのキメラは、構造／機能残基マッピ
ング、免疫学的目的、拮抗物質、コントラゲスチブおよ
び種々の動物の生殖能影響化合物に有用である。
本発明の重要な実施態様は交差種アルファまたはベー
タ−サブユニット類似物である。ヒト／ウシアルファ−
サブユニット類似物は第IX表に示す。これらはhCGベー
タ−サブユニットと組んで、LHレセプターと結合する
（第XIおよびXIV表）。これらのキメラは、他の天然産
糖タンパク質ホルモンと交差反応性の抗体が生産されな
いような免疫原として仕様され得るホルモン二量体の構
成に有用であると考えられる。交差−種キメラはヒトホ
ルモン中にあって分子の性質をさらに変えることができ
る別の配列を与えることができる。
交差−種サブユニットキメラを示す本発明の他の実施
態様は、hCG/ウシLHおよびhCG/ウマLH（またはCG）ベー
タ−サブユニットキメラである。この種の構成物を各々
第IV表および第Ｖ表に示す。これらの構成物は、ヒトレ
セプターへの結合に重要な残基を同定するのに有用であ
ると考えられる。これらはまた、免疫原、作用物質およ
び／または拮抗物質としての用途を有する。
本発明の他の実施態様はhCG/hTSHキメラを含む。この
種の構成物は第III表に示す。これらの類似物はTSH拮抗
物質として有用であり、甲状腺機能亢進の処理に有用せ
あると考えられる。
また、キメラ中のアルファおよびベータ−サブユニッ
ト配列は脊椎動物からのものであることも本発明の範囲
内である（例えば、哺乳類、鳥、両性類または魚類）。
さらに、本発明は、システイン残基の配向および／ま
たは数および／または位置を修飾することにより、修飾
例えば一般的には糖タンパク質ホルモンの安定性および
特に本発明のキメラの安定性（所望に応じて）を増加す
ることを考える。ここに記載した種々の構造的変化にも
かかわらず、それらが生物学的活性を有する事実から明
らかなように、本発明の分子は適切な配座に折り畳れて
いることは注目すべきことである。
他の類似物 本発明は、メチオニンおよび他のアミノ酸が置換され
ている糖タンパク質ホルモン類似物も提供する。この種
の類似物は第VII表および第VIII表に示す。種々の天然
糖タンパク質ホルモンの構造は、そのジスルフィド結合
の同定を可能にする酵素分解に抵抗するようなものであ
る（１、２）。第VIII表で示したような構成物は、タン
パク質を開裂するための付加部位を導入するように修飾
されていて、ホルモンのジスルフィド結合を決定するの
に有用であると考えられる。これらの特殊な類似物（付
加メチオニン残基を含有する）はシアノーゲンブロミド
（CNBr）で開裂され、その結果得られたペプチドの配列
は決定された。これらの配列に基ずいて、特殊なジスル
フィド連鎖対からのCys残基を同定することが可能であ
る。この方法は、突然変異生成が、ここで記載した類似
物の「正規」のジスルフィド様式を変化させないことを
示すために使用することができ、そしてタンパル質の折
り畳みを検討するもう一つの方法である。
使用方法 本発明の化合物は適切な薬学的、生理学的活性組成物
と配合されることができる。これらの組成物は、静脈、
筋肉、腸管外、経口またはタンパク質に適切な他の経路
で投与することができる。本発明の活性類似物の量は所
望の生理学的反応を増進するのに十分な量で使用され、
好適には最適反応を起こすのに必要な量より過剰量では
ない。その量は数ナノグラムから10キログラムの範囲で
変化し、投与されるヒトまたは動物、処理される条件お
よび考慮すべき変数に依存する。当事者は不適当な実験
なしで投与する最適量を決定する。組成物は標準的には
薬学的または生理学的に許容しうる担体または希釈剤を
本発明の活性タンパク質と共に含む。組成物は注射製剤
のような適切な形態とすることができる。
本発明の化合物を組み込んだ本発明のワクチンは、抗
原が適切なビヒクルとの混合物中に配合される既知の方
法で製造することができる。適切なビヒクルは例えば食
塩水、種々の既知のアジュバンドおよびワクチン組成物
中で使用する従来から知られている他の添加物を含む。
生、弱毒化または死の組換え細胞がワクチン化のための
抗原を与えるのに利用されると考えられる。この種のワ
クチンは本発明の糖タンパク質の有効量を含有し、宿主
への有効な投与に有用なワクチンを製造するために適切
量のビヒクルを含有する。抗原、ワクチン開発および製
造についての詳細な背景には、「抗体、実験マニュア
ル」、イー・ハーロウとディ・レイン編、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド
・スプリング・ハーバー、1988年；「獣医学と比較医学
おける進歩、第33巻、ワクチン・バイオテクノロジ
ー」、ジェ・エル・ビットルとエフ・エー・マーフィ
編、アキャデミック・プレス、サンディエゴ、1989年；
および「ワクチンにおける最近の動向と発展」、エー・
ボレスとエイチ・フリードマン編、ユニバーシティー・
パーク・プレス、バルチモア1978年を参照のこと。これ
らは参考としてここに取り込まれている。
実施例 以下に提供される実施例は説明のためのものであっ
て、限定のためのものではない。当事者ならば、不適切
な実験なしで、成分を変更し他の類似物を構成すること
ができる。実施例１は、真核性発現ベクターPSVL中への
hCGアルファ−サブユニットおよびベータ−サブユニッ
トCDNAの挿入を示す。実施例２は、ベクターpKBM、pKBM
−hCG−アルファ、およびpKBM−hCG−ベータの構成を示
す。実施例３は、pBMT2X−hCG−ベータの構成を示し、
それはhCG−ベータcDNAヌクレオチド配列中に二つの沈
黙突然変異を含有しその結果二つの制限部位が除去され
る。実施例４は、類似物F8、削除構成物を構成するカセ
ット突然変異形成の使用を示す（第VII表参照）。実施
例５は、キメラhCG/hFSHベータ−サブユニット、類似物
B9を示す（第II表参照）。実施例６は、キメラhCG/hFSH
ベータ−サブユニット、類似物B11の構成を示す（第II
表参照）。実施例７は、類似物H3およびH6、キメラヒト
／ウシアルファ−サブユニットの構成を示す（第IX表参
照）。実施例８は、発現ベクターpCMの構成を示し、COS
−１およびCOS−７細胞に強固に形質移入するのに使用
することができる。実施例９は、C127細胞中で使用する
pBMT2X−hCG−アルファ、pBMT2X−hCG−ベータおよびpB
MT2X−F8発現構成物の構成を示す。実施例10は、突然変
異形成および類似物の調製に使用する技術を示す。実施
例11は、プラスミドDNAによる哺乳類細胞（COS−１、CO
S−７、C127、COH）形質移入を示す。実施例12は、類似
物の免疫学的アッセイを示す。実施例13は、レセプター
結合のアッセイを示す。実施例14は、レセプター刺激の
アッセイを示す（ステロイド産生またはcAMP蓄積）。
特記しない限り、標準分子生物学的手法を使用した
（例えば、41参照）。制限エンドヌクレアーゼおよび他
のDNA修飾酵素（例えば、T4DNAポリメラーゼ、thermus
aquaticus（Taq）DNAポリメラーゼ、T4DNAリガーゼ、子
ウシ腸アルカリホスファターゼ、細菌アリカリホスファ
ターゼ）は、ニュ・イングランド・バイオラボ社、ベセ
スダ・リサーチ・ラボラトリ（ライフ・テクノロジー）
社（BRL）、ベーリンガー・マンハイム社、ユナイテッ
ド・ステート・バイオケミカル社またはセトス社から入
手して、特記しないかぎり製造業者の指示通り使用し
た。サブクローン効率応答能のあるHB101およびDF5−ア
ルファE.コリはBRL社から入手し、記載のように改良し
て製造業者の指示通りに形質移入した。DNA配列決定は
シークエンナーゼ（TM）キット（ユナイテッド・ステー
ト・バイオケミカル社）を使用して製造業者の指示通り
に実施した。COS127およびCOH−K1（CHO）細胞はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC−ロッ
クビル、MD）から入手した。COS−１、COS−７およびC1
27細胞は、10％子ウシ胎児血清（FCS）または10％補充
子ウシ血清を含有するダルベッコ改良イーグル培地（DM
EM）中で定常的に保持した。CHO細胞は、10％FCSを含有
するＦ−12培地でATCCの指示通りに培養した。組織培養
試薬はGIBCOラボラトリーズ社およびハイクローン・ラ
ボラトリーズ社から入手した。モノクローン抗体は、R.
E.キャンフィールド博士、R.J.ライアン博士、E.G.アー
ムストロング博士、R.ワルフェルト博士、およびR.クロ
グスラッド博士とS.ベルベ博士から提供されたものであ
る。
実施例 １ pSVL−hCG−ベータおよびpSVL−hCG−アルファの構成 hCG−アルファおよびベータ−サブユニットのためのc
DNAは、ヒト胎盤からクローンされ、E.コリ複製プラス
ミドpBR322なかに挿入され、そしてフィデスとグッドマ
ンにより配列決定された（40、43）。これらのクローン
（pBR322−Ｃ−アルファ−hCGおよびpBR322−ｃ−ベー
タ−hCG）はJ.フィドスから入手した。cDNA挿入物をE.
コリ複製プラスミド／真核性発現ベクターpSVL（ファマ
シア社）中に移入してpSVL−hCG−アルファおよびpSVL
−hCG−ベータを作成した。
第１図はhCG−ベータ−サブユニットcDNAのヌクレオ
チド配列を示し、それは成熟タンパク質のコード化配列
および信号配列並びに隣接５′と３′非−解釈領域およ
びmRNAのポリ（Ａ）尾部に対応するポリ（Ａ）／ポリ
（Ｔ）領域を含む。cDNAによりコード化されたhCGベー
タ−サブユニットアミノ酸配列が、ヌクレオチド配列の
下に標準単文字コードで示される（第Ｉ表の凡例を参
照）。数字付け方式はフィデスとグッドマンにより使用
されたものと同一である（40）。数種の制限部位がヌク
レオチド配列の上に示されている。pSVL−hCG−ベータ
およびpKBM−hCG−ベータ中の独特な部位ｈには下線を
付してある（実施例２を参照）。
プラスミドpBR322−ｃ−ベータ−hCGの10マイクログ
ラムを制限酵素Hind IIIで消化され、カットDNAの３′
陥凹末端はT4DNAポリメラーゼで充填された。全579塩基
対（bp）hCG−ベータcDNAを含有するDNA断片は、別記し
た１％低融点アガローズ（シー・ピラーク［TM］−FMC
社）／エチジウムブロミド・ゲル（42）中の電気泳動法
で精製された。hCG−ベータcDNAを含有するDNA断片はUV
光箱上で視覚し、剃刀刃でDNAを含有するゲル片を分離
して回収した。プラスミドpSVLの10ミクロングラムが、
制限酵素Sma Iで切断され、５′燐酸基が、子ウシ腸ア
ルカリホスファターゼでの処理により切断DNAの末端か
ら除去された。線状化ベクターDNA（4889bp）は電気泳
動法で精製され、上記のように単離された。hCG−ベー
タcDNAおよび線状化pSVLベクターDNAを含有するゲル片
は65℃に10分間加熱して融解させ、その後８マイクログ
ラムのhCG−ベータcDNAを２マイクログラムのpSVLとを
合して、20マイクロリットル中の400単位のT4DNAリガー
ゼ（ニュウ・イングランド・バイオラボ社）で15℃で一
夜連結した。連結化混合物を65℃に10分間加熱し、180
マイクロリットルのCaCl2/PIPES緩衝液（60mMCaCl2、10
mMピペラジン−Ｎ−Ｎ′−ビス［２−エタンスリホン
酸］、pH7）で希釈し、30マイクロリットルの希釈反応
物はE.コリDH5−アルファ細胞を形質転換するのに使用
された。アンピシリン耐性クローンからのプラスミドDN
Aは、制限酵素Pst IおよびXba Iでの共消化によりスク
リーンされ、それは、cDNAが正しい配向で挿入された場
合、約233bpのDNA断片を生成する（即ち、センスmRNAの
転写にとつて正しい配向）。
第２図はhCGアルファ−サブユニットcDNAのヌクレオ
チド配列を示し、それは成熟タンパク質のコード化配列
およびシグナル配列並びに隣接５′および３′非−解釈
領域を含む。cDNAによりコード化されたhCGアルファ−
サブユニットアミノ酸配列が、ヌクレオチド配列の下に
標準単文字コードを使用して示される。数字付け方式は
フィデスとグッドマンにより使用されたのと同一である
（43）。数個の制限部位がヌクレオチド配列上に示され
る。pSVL−hCG−アルファまたはpKBM−hCG−アルファに
独特の部位は下線が付される（実施例２を参照）。hCG
アルファサブユニット（43）のためのcDNAは、pSVL−hC
G−アルファのためのスクリーニングがXba I単独での消
化および約400bp断片を示すクローンの選択により実施
された以外は、hCG−ベータで記載されたのと同一の方
法でpSVL中に入れられた。
これらベクターはCOS細胞中で共にまたは別々でhCGサ
ブユニットを発現するのに使用され（44）、また糖タン
パク質ホルモンサブユニットを発現および／または修飾
するプラスミドする親構成物として使用された。さら
に、cDNA配列への多くの修飾がpSVL−hCG−ベータおよ
びpSVL−hCG0アルファ中で直接行われた。この研究の過
程で使用された他のプラスミドベクターはpTZ19R（4
6）、pUCX2（下記）、pBNT2X（47）およびpCM（下記）
である。
実施例 ２ pKBMt、pKBM、pKBM−hCG−アルファ、pKBM−hCG−ベー
タ、pUCX2の構成 E.コリ複製プラスミドpKBMはpUC18（45）の誘導体で
あり、次のポリリンカー（pUC18のHind III部位から始
めて）、Hind III、Xho I、Xba I、Sac I（Sst I）、Ba
mH I、BssH II、Sal I、Sac II（Sst II）、およびEcoR
Iを含有するように修飾されている。このベクターはは
発生して糖タンパク質ホルモンのカセット突然変異誘発
を促進する。pSVLとは異なって、pKBMおよびpKBMTは制
限酵素Pst I、PPUM I、Nar IおよびBsm Iの開裂部位を
持たない。pKBM中にこれら部位を持たないことにより、
hCGアルファおよびベータ−サブユニットcDNAs中のこれ
ら部位を使用するカセット突然変異誘発が促進される。
第３図は、pKBMt（3a）およびpKBM（3b）の構成で使
用されるオリゴヌクレオチドカセットを示す。各カセッ
ト二よりコード化された制限エンドヌクレアーゼ開裂部
位を示す。
２マイクログラムのPuc18は制限エンドヌクレアーゼH
ind IIIおよびXba Iで消化して、実施例１記載のように
低融点アガロース中の電気泳動法で精製された。第3a図
で示した二つの合成DNAオリゴヌクレオチドをアプライ
ド・バイオシステムズ380B DNAシンテサイザーおよび
ホスホラミジト法（51）を使用して合成し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により精製し（アプライド・バ
イオシステムズ・ユーザー・ブレチン、No.13、1987年
記載）、分光光度法で定量した（260nmでの吸収）。次
いで、オリゴヌクレオチドを、100mMKCl中の各オリゴヌ
クレオチドの１マイクログラム、10mMトリスpH8.0、1mM
EDTA配合し（全量＝200マイクロリットル）、100℃で５
分間加熱し、室温で30分間冷却すことによりアニールし
た。約30ナノグラムのHind III/Xba IカットpUC18を100
ナノグラムのアニール化オリゴヌクレオチドと合し、20
マイクロリットル中の１単位T4DNAリガーゼ（ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリー社）で一夜15℃で連結した。
連結反応物を65℃で10分間加熱し、180マイクロリット
ルのCaCl2/PIPESで希釈した。30マイクロリットルの希
釈連結反応物を使用してE.コリＫ−12株JM83（87）を形
質転換し、次いでそれを50マイクロリットルの２％５−
ブロモ,4−クロロ,1−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラク
トシド（Ｘ−gal）DMSO溶液でプレートした。アンピシ
リン−耐性ブルーコロニーからのプラスミドDNAをXho I
でスクリーンしてカセットの存在を確認した。その結果
得られたプラスミドをpKMtと記載した。プラスミドをpK
BMを構成するために、二つの他のDNAオリゴヌクレオチ
ドを合成しアニールして第3b図で示したカセットを生成
し、EcoR I/BamH I消化pKBMTで連結した。アンピシリン
−耐性ブルーコロニーからのプラスミドDNAをBssH IIで
スクリーンして、新しいカセットを含有するプラスミド
をpKBMと記載した。hCGアルファおよびベータ−サブユ
ニットcDNAsを、pSVLからXho IおよびBamH Iの間のpKBM
に移入して、pKBM−hCG−アルファおよびpKBM−hCG−ベ
ータを生成した。ベクターpUCX2は、変容ポリリンカー
を持つpUC18の他の誘導体である。pUCX2中のポリリンカ
ー（pUC18のHind III部位から始めて）はBssH II、Sac
II、Hind III、Xho IおよびEcoR Iである。
実施例 ３ pKBM−hCG−ベータ′ hCGベータ−サブユニットcDNAの類似体はhCG−ベー
タ′と呼ばれ、制限部位を除去する二つの沈黙突然変異
を含有して、多くの突然変異株の出発構成物である。
第4a図は、hCG−ベータ′DNAのヌクレオチド配列を示
す。hCG−ベータcDNAのように、それは、成熟タンパク
質およびシグナル配列、隣接５′−と３′非解釈領域お
よびmRNAのポリ（Ａ）尾部に対応するポリ（Ａ）／ポリ
（Ｔ）領域のためのコード化配列を含む。ヌクレオチド
配列下に示されたコード化アミノ酸配列hCG−ベータの
それから変化していない。DNA配列中に沈黙突然変異の
位置は、位置229および232の塩基対の上に三角形で示
す。数字付け方式はフィッデスとグッドマンにより使用
されたものと同一である。ヌクレオチド配列上に数個の
制限部位を示す。pSVL−hCG−ベータ′またはpKBM−hCG
−ベータ′中の独特な部位には下線を付した。
第4b図は、pKBM−hCG−ベータ′を構成するのに使用
するオリゴヌクレオチドカセットを示す。第4a図のよう
に、変異化塩基を三角形で示す。
約５マイクログラムのpKBM−hCG−ベーを制限エンド
ヌクレアーゼPst IおよびOxa1N I（Oxa1N IはBau36Iお
よびMst IIのisoschizomerである）で消化し、大きい制
限断片を、上記の低融点アガロース中の電気泳動法で精
製した。二種の合成DNAオリゴヌクレオチド（第一4a
図）を合成し、精製し、実施例２のようにアニールし
た。200ナノグラムのPst I/OxaN IカットPkbm−hCG−ベ
ータは80ナノグラムのアニール化オリゴヌクレオチドカ
セットと合し、連結させ、次いで記載のようにE.コリJM
83を形質転換するために使用した。アンピシリン耐性ホ
ワイトコロニーを釣菌し、このコロニーからプラスミド
DNAを制限エンドヌクレアーゼPpuM Iでの消化によりス
クリーンし，それはpKBM−hCG−ベータから約200bp断片
を切り出したが、pKBM−hCG−ベータ′からの断片はな
かつた。pKBM−hCG−ベータ′中のhCG−ベータDNAは、
独特なNae IおよびPpuM I制限部位を含有し、カセット
突然変異誘発によるその変異を促進する点において、天
然hCG−ベータcDNAとは異なっている。
実施例 ４ 類似物F8の構成 第5a図は、類似物およびコード化アミノ酸配列を構成
するのに使用するDNAオリゴヌクレオチドカセットを示
す。残基47−50の削除および天然hCGベータサブユニッ
ト中のプロリンのアラニンによる位置５（三角形）での
置換が示される。これらのオリゴヌクレオチドを合成
し、精製し、実施例２のようにアニール化し、次いで実
施例３のようにPst I/OxaN I消化したpKBM−hCG−ベー
タで連結した。形質転換JM83E.コリのアンピシリイン耐
性クローンからのプラスミドDNAを、実施例２記載のよ
うにPpuM Iでの消化により挿入物の存在でスクリーンし
た。適切な挿入物を持つプラスミドをpKBM−F8と記載す
る（pKBM−ベータ−デルタ３またはpKBM−ベータ−デル
47−50、51Pと呼称する）。この類似物をコードしたDNA
を、実施例５のB9で記載したように制限エンドヌクレア
ーゼXho IおよびBamH Iを使用して発現ベクターpSVL中
に形質移入し、pSVL−F8を形成した。
実施例 ５ 類似物B9の構成 第5b図は、類似物B9およびコード化アミノ酸配列を構
成するのに使用するDNAオリゴヌクレオチドカセットを
示す。hFSHベータサブユニット残基88−91（DSDS）のhC
Gベータ−サブユニットの対応する残基即ち残基94−97
（RRST）での置換を三角形で示し、制限エンドヌクレア
ーゼSca Iの認識部位も示される。約25マイクログラム
のプラスミドpKBM−hCG−ベータ′を、100マイクロリッ
トル中の制限エンドヌクレアーゼApaL Iでのタイムコー
ス消化に使用した。反応物の一部を取り出し、氷上に置
き、37℃での保温０分（酵素の添加前に12マイクロリッ
トル取り出す）、10分後（12マイクロリットル）、20分
後（12マイクロリットル）、30分後（24マイクロリット
ル）、45分後（12マイクロリットル）、60分後（16マイ
クロリットル）に20mMEDTAに調節した。これらは、実施
例１記載のように低融点アガロースでの電気泳動法によ
り精製した。この特殊なタイム・コースで、プラスミド
の最適の線状化は20分後に見られた。単一カットプラス
ミド（約3280bp）を含有するバンドをゲルから切り出
し、マイクロヒュージ・チューブに移し、65℃で10分間
保温してゲルを融解し、その後200マイクロリットル脱
イオン水で希釈した。200マイクロリットルのフェノー
ル（文献41に記載のように調節）を添加し、チューブを
振とうし、乾燥氷／エタノールバス中で15分間放置し、
その後それをエペンドルフ・マイクロフュージ中で20℃
15分間全速で遠心分離した。水性区分を収集し有機区分
をさらに200マイクロリットル脱イオン水で抽出した。
この第二抽出からの水性区分を最初の抽出からの水性区
分と共に集め、400ミクロリットルのクロロフォルム／
イソアミルアルコール（24:1混合物、文献40に記載）で
抽出し、その後DNAを、酢酸ナトリウムとエタノールに
よる沈殿により水相から回収した。このDNAを14マイク
ロリットル脱イオン水中に懸濁させ、PpuM Iで消化し、
電気泳動法で精製した。第5b図に示したオリゴヌクレオ
チドを合成し、精製し、アニール化し、ApaL I/Ppu1M I
消化pKBM−hCG−ベータ′DNAと連結した。形質転換JM83
E.コリのアンピシリン耐性クローンからのプラスミドDN
Aを、Sca Iでの消化により挿入物の存在でスクリーン
し、それは初めpKBM−hCG−ベータ′を切断し、次にpKB
M−B9を含有するpKBM−hCG−ベータ′を切断した。新規
のベクターをここではpKBM−B9と記載する。類似物B9の
コード配列を、Xho IおよびBamH IでpKBM−B9を消化す
ることよりpSVLに移入し、約600bp断片を精製し、Xho I
/BamH I消化pSVLと連結した。このベクターの精製調製
物pSVLB9は、pSVL−ベータ−ＤまたはpSVL−ベータ−CF
94−97と呼称し、配列決定し、pSVL−hCG−アルファでC
OS7細胞を形質転換するのに使用する。
実施例 ６ 類似物B11の構成 幾つかの例では、例えばpSVL−B11の集合のように、
多発カセットがベクター中に連結された。この類似物
は、成熟hCGベータ−サブユニット中のアミノ酸94−145
が成熟hFSH−ベータ−サブユニットからのアミノ酸88−
111で置き換えらていて、プラスミドpSVL−B9（実施例
６）および二種のオリゴヌクレオチドカセットを使用し
て作成される。
第5c図は、B9からの類似物B11およびコード化アミノ
酸配列を構成するのに使用するDNAオリゴヌクレオチド
カセット（各々、オリゴヌクレオチドA+およびA-並びに
B+およびB-からなるＡおよびＢ）示す。hFSHベータ−サ
ブユニット残基95−111（TVRGLGPSYCSFGEMKE）のhCGベ
ータ−サブユニット残基101−145（GGPKDHPLTCDDPRFQD
・・・Ｑ、全配列は第１図を参照）による置換が三角形
で示され、制限エンドヌクレアーゼStu Iによる認識部
位が記載されている。カセットは、共に（四つの相補
的、非自己相補的塩基によりオーバーラップしている）
かつpSVL−B9のSca IおよびBamH I部位中に連結される
ように設計された。カセットのためのオリゴヌクレオチ
ドをpKBM−hCG−ベータ′で記載したように合成し、ア
プライド・バイオシステムズ社からの精製カートリッジ
を使用して精製した。オリゴヌクレオチドA-およびB+の
５′−末端をT4オリゴヌクレオチドキナーゼを使用して
リン酸化し、二種のカセットを連結させた。オリゴヌク
レオチドA+とA-およびB+とB-を合体して、上記のように
アニールした。４マイクログラムのpSVL−B9DNAを部分
的に制限エンドヌクレアーゼSca Iで消化し、ゲル電気
泳動法で精製し、上記のようにゲルから抽出した。精製
Sca I線状化pSVL−B9DNAを16マイクロリットルの脱イオ
ン水中に再懸濁し、制限エンドヌクレアーゼBamH Iで消
化し、ゲル電気泳動法で精製し、二つのアニール化カセ
ットと合体して連結反応させた。所望の挿入物を持つプ
ラスミド含有するアンピシリン−耐性クローンを、プラ
スミドDNAをPst Iで消化することにより単離し、それに
はpSVL−B9中に二つの認識部位があり、所望の挿入物を
持つプラスミド中には三つの認識部位があり、それらは
pSVL−B11と記載される（また、pSVL−ベータ−DGまた
はpSVL−ベータ−CH94′117）。
実施例 ７ 類似物H3およびH6の構成 第６図は、pTZ19R中の多発カセットから構成され、成
熟ウシアルファ−サブユニットタンパク質のコード化配
列およびヒトアルファ−サブユニットシグナル配列を含
む合成ウシアルファ−サブユニットcDNAのアミノ酸配列
を示す。cDNAによりコード化されたアルファ−サブユニ
ットアミノ酸配列はヌクレオチド配列の下の標準単文字
コードを使用して示される。数個の制限部位がヌクレオ
チド配列の上に示される。pSVL−ｂ−アルファまたはpT
Z19R−ｂ−アルファに下線が付けれる。天然ヒトcDNAに
共通する数個の制限部位を、キメラアルファサブユニッ
ト類似物を構成するのに使用した。
Xba I部位を、類似物H3（pSVLhum/bov34と呼称する）
およびH6（pSVLbov/hum34）構成するのに使用し，それ
を第IX表に示す。類似物H3を作成するために、約５マイ
クログラムのpSVL−ｂ−アルファまたはpSVL−hCG−ア
ルファを制限エンドヌクレアーゼXba IおよびEcoR Vで
消化し、ゲル電気泳動法で精製した。pSVL−hCG−アル
ファの消化物からの大きい断片およびpSVL−hCG−アル
ファの消化物の小さい断片を連結してDH5−アルファE.
コリを形質転換するのに使用した。アンピシリン耐性ク
ローンからのプラスミドDNAを、Xba Iでの消化によりス
クリーンした（pSVL−H3は単一Xba I部位を有し、pSVL
−hCG−アルファは二つの部位を有す）。類似物H6を作
成するために、約２マイクログラムのpSVL−ｂ−アルフ
ァを制限エンドヌクレアーゼXba IおよびSa IIで消化
し、ゲルで精製し、大きい断片を残した。約５マイクロ
グラムのpSVL−hCG−アルファをXba IおよびSa IIで消
化し、ゲルで精製し、中程の断片を残した。pSVL−ｂ−
アルファおよびpSVL−hCG−アルファの残した断片を連
結して、DH5−アルファを形質転換するのに利用した。
アンピシリン耐性クローンからのプラスミドDNAを、Xho
IおよびBamH Iでの消化によりスクリーンし、約600bp
断片を示すpSVL−H6の正クローンを得て、これに対しpS
VL−ｂ−アルファから約380bp断片が得られた。
実施例 ８ pCM、pCM−hCG−アルファ、pCM−hCG−ベータの構成 ベクターpCMは複製のシミアン・ウイルス40（SV40）
源、早期プロモターおよびポリアデニル化ｈ配列を含有
する；ネオマイシン（アミノグリコシド）ホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子とpMVBne
o（47）からの複製の細菌源（即ち、EcoR I/BamH I断
片）、複製のSV40源および後期プロモータ、pSVL（即
ち、Hind III/BamH I断片）からの合成ポリリンカー（X
ho I−Xba I−Sma I−Sst I−BamH I）、ウシパピロマ
ウイルス（BPV）のHind III/EcoR I断片、それはBpV遺
伝子E6、E7、E8、とE1の一部を含有する、二つのプラス
ミド保持配列、エンハンサ領域（文献48参照）。pCM中
に入れたBPVからのHind III/EcoR I断片は、複製のSV40
G源を持つプラスミドの複製を調節し、エオイソームベ
クターで強固に形質転換されたCOS細胞を創成できるこ
とが分かった（49）。
プラスミドpCMは次の通りに構成する。２マイクログ
ラムのpSVLを制限エンドヌクレアーゼEcoE IおよびBamH
Iで消化し、小さい断片を電気泳動法で実施例１に記載
にように精製した（約200bp）。ジー・エヌ・パブラキ
ス（ナショナル・キャンサー・インスティチュート）か
ら得た２マイクログラムのプラスミドpMVBneo（47）をE
coR IおよびBamH Iで消化し、大きい断片をゲル精製し
た（約5000bp）。これらを連結し、DH5−アルファE.コ
リのアンピシリン耐性クローンからのプラスミドDNAをH
ind IIIでの消化によりスクリーンした。約1100、2950
および3000bpのHind IIIカット断片を示すクローンは中
間プラスミドにポジチブであり、pSVLneoと記載した。
これらクローンからの他のDNAを、EcoR IおよびBamH I
のいずれか（約2000および5000bpの断片が得られると期
待された）またはEcoR I、BamH IおよびHind III（約45
0、500、1100、2500および2500bpの断片が得られると期
待される）で共消化してスクリーンした。最終ベクター
を組み合わせるために、pSVLneoからの約５マイクログ
ラムのDNAを反応中のHind IIIで部分的に消化し、そこ
から試料を取り出し、25mMEDTA（酵素を不活性化するた
め）に調整し、次の時点に氷上に置いた。酵素の添加
後、０分（10マイクロリットル）、10分（22マイクロリ
ットル）、30分（22マイクロリットル）、45分（22マイ
クロリットル）。これの試料をゲル精製し、線状化プラ
スミド（約7000bp）をゲルから切り出し、マイクロヒュ
ジ管に移した。ゲル片を65℃10間の保温により融解し、
10マイクロリットルをマイクロヒュジチューブから６マ
イクロリットルの水、２マイクロリットルのリアクト３
（TM）（BRL）および20単位のEcoR Iを含有する第二チ
ューブに移した。このチューブを37℃で１時間保温し、
約6500bpEcoR I/Hind IIIカットバンドをゲル電気泳動
法で精製した。ジー・エヌ・パブラキスから得たプラス
ミドpBMT2X（47）をHind IIIおよびEcoR Iで消化し、ゲ
ル精製し、BPVの2200bp断片に対応する2200bp断片をゲ
ルから切り出した。この断片をpSVLneoの6500bpEcoR I/
Hind IIIカット断片と連結しDH5−アルファE.コリのア
ンピシリン耐性クローンからのプラスミドDNAをHind II
Iで消化し、pBMT2Xからの2200挿入物を持つプラスミド
を同定した（正クローンは約1100、3000および4800bpの
バンドを示す）。この新プラスミドをpCMまたはpSVLneo
BPVと記載した。hCG−ベータcDNAを、pCMのXho Iおよび
BamH I部位の間に挿入し、アンピシリン耐性クローンか
らのプラスミドDNAを、Pst IまたはXho IおよびBamH I
での消化によりスクリーンした。この新プラスミドをpC
M−hcc−ベータと記載した。hCG−アルファcDNAおよびD
NAsコードホルモン類似物を同様の方法でpCM中に入れ
た。
新ベクトルpCMは真核性発現システム即ち一時的な高
レベル発現と安定な発現の二種の主要な現行タイプの属
性を単一システム中に組み合わせている。実施例11記載
の操作法を使用してCOS細胞中に形質移入した場合、pCM
−hCG−ベータは、組換えタンパク質の急速な高いレベ
ルの発現を与え、それはpSVL−hCG−ベータで得たもの
より優れている。これらCOS細胞を合成アミノグリコシ
ドG418（ゲネチシン−GIBCO）の500マイクログラム/ml
を含有する培地で保温した場合、安定的に形質転換した
細胞を作成することが可能であった。それは数百ナノグ
ラム／ミリオン細胞／日のレベルで長期間に組換えタン
パク質を生産し、そのことによりクローニングおよび遺
伝子生産物産物の特性決定を促進することができた。こ
れら細胞を凍結し液体窒素中で数か月間保存し、hCG−
ベータ−サブユニット分泌能の損失なしで再培養でき
た。
形質転換COS細胞からDNAベクターを回収し、細菌中に
それを再クローンすることは可能であつた。形質転換細
胞は培養皿の表面からかきとり15mlチューブに移した。
細胞は5mlの冷ホスフェト緩衝液で２回洗浄し、400マイ
クロリットルの0.6％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）/1
0mMEDTA中に再懸濁し、マイクロヒュージチューブに移
し、室温で20分間保温した。この混合物を1MNaClに調節
し（100マイクロリットルの5MNaClの添加による）、少
なくとも５時間氷上で保温した。この後、細胞デブリを
溶液から遠心分離し（全速、５分間）、その結果得られ
たプラスミドを含有する上澄液をフェノールで抽出し、
エタノールと10マイクログラムのミュッセルグリコ±ゲ
ンで沈殿した。単離DNAは20マイクロリットリの水中に
懸濁した。この１マイクロリットリを使用して、DH5−
アルファE.コリを形質転換し、63アンピシリイン耐性コ
ロニーを与えた（それはSV40初期プロモータの下流であ
るが、ベクター中のネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼ遺伝子の存在のために、これら細菌はG418と共に選
択されることができると分った）。プラスミドDNAは24
のクローンから調整され、Xho IとBamH Iで消化され
た。23の回収プラスミドはhCG−ベータ−cDNAに対応す
る約600bpの断片を含有し、一方液体倍地にはコロニー
は成育しないことが分った。プラスミドは再配列の証拠
を与えるものはなかった。この戦略と操作法は、既に一
時的な形質移入COS細胞で使用されているが、今回ヒブ
リドBPV−SV40ベクターを含有する安定な形質転換参謀
に拡張された。この種のベクターは、複製のSV40源を保
持する細胞タイプ中で多分使用できると考えられる。
他の関連ウイルス源（例えばポリオウイルス）はこの
システムでの作用することができる。他のプロモータ、
エンハンサ選択可能マーカーも単独でまたは組み合わせ
で使用することができる。pCMのようなベクター遺伝子
のクローン化、遺伝子生産物の特性決定、細胞の改造、
細胞プールから特殊な形質移入細胞の選択を含むたの用
途に使用することができる。pCMにサブクローンされ、C
OS細胞中で発現された類似物のなかに類似物J2があり、
その中では、hCG−サブユニットが、水胞性口内炎ウイ
ルスＧタンパク質（VSV−Ｇ）からの膜内外領域のhCG−
ベータのＣ末端への融合を介して細胞表面にアンカーさ
れている。
第XV表はpCM−ベータ−J2で形質転換し、500マイクロ
グラム/mlG418中に保持されたCOS−７細胞上のhCG−ベ
ータ−サブユニットの保持を示す。pCM−hCG−ベータで
形質転換されたCOS−７細胞はその表面上に多くのベー
タ−サブユニットを保有しない。このアッセイでは、融
合性75cm2の細胞を、500マイクログラム/mlG418を含有
する血清遊離DMEMで培養した。培地を取り出し、細胞を
10ml燐酸塩緩衝液（PBS）で静かに洗浄した。細胞を、
0.1％アジドナトリウム/10mMEDTAを含有するPBSで２時
間37℃で培養することにより、フラスコから取り出し
た。この細胞をこの中に懸濁し、450,000細胞を、75,00
0cpm125I−標識化抗体B105と300ナノグラム非標識化B10
5を含有するマイクロヒュジチューブに添加した。これ
らを、37℃１時間で保温し、1mlの0.9％食塩水/0.1％ウ
シ血清アルブミン溶液で希釈し、その細胞をマイクロヒ
ュジ中で全速で８分遠心分離してペレット化した。上澄
液はスピレートし、ペレットをガイガー・カウンターで
計測した。
実施例 ９ pBNT2X−hCG−アルファ、pBMT2X−hCG−ベータ、pBMT2X
−F8の構成 ベクターpBNT2Xにより、C127細胞中の組換えタンパク
質は安定して発現することができる。hCGサブユニット
および類似物はpBNT2Xの独特のXho I部位中にサブクロ
ーンされる（実施例８参照）。約10マイクロリットルの
プラスミドpKBM−hCGおよびpKBM−hCG−ベータを制限エ
ンドヌクレアーゼXho IおよびSa IIで消化し、アルファ
−サブユニットおよびベータ−サブユニットcDNAを含有
する約66bp断片を実施例１のように単離した。２マイク
ログラムのプラスミドpBMT2XをXho Iで消化し、５′末
端燐酸をDNAから子ウシ腸アルカリホスファターゼで除
去し、線状化DNAを実施例１記載のようにゲル精製し
た。Xho I消化pBMT2およびcDNA断片をT4DNA リガーゼで連結し、これを使用して実施例１にDH5−ア
ルファE.コリで記載したようにHB101E.コリを形質転換
した。アンピシリン耐性クローンからのプラスミドDNA
をBssH IIで消化し、pKBMからのCDNA挿入物を含有する
クローンを線状化した。挿入物の配座はプラスミドDNA
のXho IおよびSst IIによる消化により決定し、約1400b
pの断片を示す適切な配座の挿入物であった。これら新
規のプラスミドをpBNT2X−hCG−アルファ、pBMT2X−hCG
−ベータと記載した。pBNT2X−hCG−アルファ、pBMT2X
−hCG−ベータのプラスミド調製物を使用して、既に記
載した方法でC127細胞を形質転換し（50。実施例11参
照）、hCG二量体またはアルファもしくはベータいずれ
かを生産する細胞を20−50マイクロＭ塩化カドニウムの
存在でサブクローンした。これらの細胞によるタンパク
質の生産は５マイクログラムhCG二量体／ミリオン細胞/
24時間のオーダーであつた。DNAコード化類似物F8はpKB
M−F8からp1￥BMT2X中に同様な方法でサブクローンし、
pBNT2X−hCG−アルファでC127細胞中に形質移入し、CdC
12耐性細胞をサブクローンした。
実施例 10 突然変異生成法 オリゴヌクレオチドカセット突然変異生成 多くの構成物が、pKBMhCG−ベータ′、pKBM−F8、pKB
M−B9またはpSVL−B18を作成した方法と同様のDNAオリ
ゴヌクレオチドカセット突然変異法により調製されてき
た。
制限断片突然変異生成 天然cDNAs、遺伝子またはその類似物を含有し共通の
制限部位を持つベクターは、類似物H13およびH6の構成
で行れたように制限断片を置き換えることにより新規の
類似物を作成するのに使用することができる。
制限部位フル・イン挿入突然変異生成 類似物G7はpSVL−hCG−ベータをOxaN Iで開裂し、線
状化DNAの末端をT4DNAポリメラーゼでフル・インし、ベ
クターをT4DNAリガーゼで再連結し、DH5−アルファE.コ
リを形質転換し、OxaN I部位を欠くクローンを選択する
ことにより構成した。同様の操作法を使用して、三塩基
オーバーラップを持つ他の制限部位を突然変異生成し
た。さらに、カセットを使用して、削除または挿入を導
入することができる。
部位−定方向オリゴヌクレオチド突然変異生成 一連のhCG/hLHベータ−サブユニットキメラを、hCG−
ベータcDNAの部位オリゴヌクレオチド−定方向突然変異
生成により調製した。これらの一つ、pTZ19R−A4（pTZ1
9RhCG/hLH96という）の構成を簡単に記載する。hCG−ベ
ータcDNA配列と相同の領域によりフランクされたhLHア
ミノ酸配列96−117をコードするDNAの領域を含有する合
成DNAオリゴヌクレオチドを調製した。hCG−ベータcDN
A、Sac IとSa II部位の間のpTZ19R中にサブクローンし
た。種々のオリゴヌクレオチドをアニールして、単鎖化
ベクターとし、これを使用してE,コリポリメラーゼＩの
Klenow断片で二鎖化ベクターの合成をプライムした。そ
の結果得られたプラスミドを使用して細菌を形質転換し
改造cDNAを持つプラスミド含有するクローンを単離し
た。
ポリメラーゼ連鎖飯能突然変異生成 hCG−ベータの数種の類似物は、合成オリゴヌクレオ
チダーゼおよびポリメラーゼ連鎖反応を使用することに
より作成された。例えば、F1、hCG−ベータアミノ酸配
列が残基111（Cys−110が最終アミノ酸である）で切形
されている類似物を作成するために、次のオリゴヌクレ
オチド、５′AAGGACCACCCCTTGACCTGTTAGGATCCTATATA−
３′を合成し、hCG−ベータcDNAに５′結合するpSVLへ
のプライマーを持つPCR反応中でプライマーとして使用
した。その結果得られたPCR生産物をXho IおよびBam1H
Iで開裂しゲル電気泳動法で精製し、すでに記載した方
法を使用してpSVLのXho IおよびBam1H I部位中にクロー
ン化した。
実施例 11 遺伝ベクターを哺乳類細胞への導入 燐酸カルシウム法およびDEAE−デキストラン法の両方
を使用して、糖タンパク質ホルモンサブユニットまたは
類似物を含有するベクターでCOS（COS−１またはCOS−
７）を形質転換した。燐酸カルシウム法はプロトコルの
改良法である（50）。形質転換されるCOS細胞は、前日
に６−cmまたは10cm径組織培養皿に平方当り10,000細胞
の密度でプレートされた。プラスミドDNAをCsCl勾配の
超遠心分離器で精製し、エタノールでの沈殿で滅菌し
た。形質転換操作で使用したDNAは、細胞のプレート当
たり１−２ミリグラムで変化した。DNA溶液の最終量は4
00マイクロリットリ（６−cmプレート）または1ml（10c
mプレータ）であった。サケ精子DNAは時々担体として使
用した。滅菌水中にDNAを懸濁した後、適切量の2MCaCl2
を添加し、200マイクロリットリ中または500マイクロリ
ットリ中で125mMの最終濃度のCaCl2を与えた。同量の2X
BES−緩衝食塩水（50mMNのＮ−,N−ビス［２−ヒドオ
キシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸、280mMNaC
l、1.5mMNa2HPO4;pH6.95に調節）をDNA/CaCl2溶液に添
加した。この混合液をふり混ぜ、室温で10−20分間保温
し、細胞プレートに滴下した。細胞およびDNAを一夜（1
3時間）37℃の2.5−６％二酸化炭素下の保温器中で保温
した。培地を取り出し、細胞を1XPBSで洗浄し、細胞を
完全培地で培養した。24時間後この培地を取り出し、細
胞を10ml PBSで二回洗浄し、血清を含まないDMEMを添
加した。培地を70−80時間後に分泌タンパク質の回収の
ために収穫した。
DEAE−デキストランを使用する形質転換をプロトコー
ル法にしたがって行った（86）。この操作法では、１ミ
リオン細胞を、形質転換の前日に100mmプレート上にい
れた。プラスミドDNAを調製し、上記のように滅菌し、
滅菌水中に懸濁し、１×PBS濃度および1.2ml中の200マ
イクロ/mlDEAE−デキストランに調節した。培地を細胞
のプレートから吸引し、プレートをPBSで二回洗浄し
た。DNA/DEAE−デキストラン溶液をプレートに添加し、
37℃の保温器中で40分間置いた。この後、クロロキンで
100マイクロＭとした10mlDMEMを各プレートに添加し
た。プレートを３−４時間間保温し、その後培地を10％
DMSO含有する培地で置き換えた。37℃で２−３分後、培
地を吸引し、プレートをPBSで二回洗浄し、10％FCSまた
は血清置換物（子ウシ血清、GIBCOから提供）を含有す
る10mlDMEMでカバーし、保温器中に戻した。12−24時間
後培地を取り出し、プレートをPBSで二回洗浄し、6ml血
清を含まないDMEMでカバーした。培地を70−80時間後に
分泌タンパク質の回収のために収穫した。
COS、C127またはCHO細胞の安定な形質転換を、上記の
燐酸カルシウム法を使用して実施した。pBMT2X−ベース
プラスミドで形質移入したC127細胞の安定クローンを、
形質移入２日後から出発したCdCl2の抵抗性により選択
した。ネオマイシン（アミノグリコシド）ホスホトラン
スフェラーゼ（例えば、pCM−ベースプラスミド）の遺
伝子を含有するプラスミドで形質移入した細胞を、形質
移入後１−４日から出発して500マイクログラム/ml培地
G418/ml組織培養培地（COS）または1000マイクログラ
ムG418/ml培地（CHO）を添加することにより合成アミノ
グリコシドG418（シグマ）で選択した。1kおん後、この
細胞を日常的に選択条件下で保持した。
実施例 12 サンドウィッチ・アッセイ ホルモンおよび類似物の免疫学的性質を、モイルらに
よりすでに実質的に記載されているモノクローン・サン
ドウィッチ・アッセイを使用して決定した（５）。これ
らのアッセイを使用して、類似物が天然分子と同様に折
り畳まれているか、培養培地に分泌されたアルファ、ベ
ータ−二量体を形成しているかを決定した。
第XIII表は、hCG/hFSHキメラの免疫学的特性の結果を
示す。すべてのアッセイは、hFSHのアッセイでB601、B6
02、A IIまたはE501を使用した以外は、「捕捉」抗体と
してB105を使用した（以下参照）。種々の標識化検出抗
体を表に示す・これらの抗体の特異性はすでに記載され
ている（５−７、52、53）。これらのアッセイでは、１
マイクログラムの捕捉抗体（例えば、B105）は、0.9％N
aCl/20マイクログラム/ml抗体溶液（蒸留水で作成）を
各ウエルに添加すうことにより96−ウエルマイクロタイ
タープレート中の各ウエルの表面に吸着させ、37℃で１
時間保温した。非結合抗体を取り出し、非特異性部位
を、0.1％BSA/0.9％NaCl溶液でウエルを満たすことによ
りウシ血清アルブミン（BSA）で遮断し,37℃で１時間保
温した。ホルモンおよ標準品および類似物を各ウエルに
添加し（容量を50マイクロリットリに調節した）、37℃
に１時間保温し手、類似物を吸着抗体に結合させた。ウ
エルを蒸留水で洗浄して、未結合類似物を除去し、BSA/
食塩水（50マイクロリットリ）中の毎分50,000カウント
（cpm）の標識化「検出」抗体をウエルに添加し、37℃
で１時間保温した。次いで、未結合抗体を吸引で除去
し、プレートを脱イオン水で洗浄し、各ウエル切り出
し、ガンマ・カウンターで計測した。検出抗体は、モイ
ルらにより記載されているヨードゲン法により放射性ヨ
ード化した（54）。
第XIII表は、アルファ、ベータ−ヘテロ二量体（B10
5、A113検出）、hCGベータ−サブユニットまたはhCG（B
105、B101検出）、およびhCG（B105）およびhFSH（B60
1）の両方からのベータ−サブユニットエピトープを持
つ類似物を検出するモノクローン抗体サンドウィッチの
性能を示す。放射性ヨード化検出抗体の捕捉ホルモンま
たはhCGに関する類似物（B601の場合以外）の性能を第X
III表に示す。第XIII表のデータは、＋＋（結合cpm−尿
hCG標準品に結合したものの50−120％）、＋（結合cpm
−尿hCG標準品に結合したものの10−49％）または−（1
0％結合以下）で表示され、ntは試験していないことを
示していることを注目のこと。B601では、hFSHに特異的
に種々な類似物に結合するモノクローン抗体が、hFSHア
ィッセイ、即ちE501/B6−１サンドウィッチ・アィッセ
でのその反応性に関して記載される。E501捕捉を使用す
るこのアィッセイでは、B601は、組換えhFSHとは区別が
つかないhFSH残基33−52を含有するキメラと結合する事
が分った。免疫学的データにより、類似物は折り畳ま
れ、アルファサブユニットと結合することが示された。
一種のホルモンの構造的特徴（例えば、FSH中のB601エ
ピトプ）は、極めて低相同性の領域においてでも、他の
ホルモンに転移することができることが示された。
第XI表は、hCGベータ−サブユニットで共発現したア
ルファ−サブユニット類似物へのモノクローン抗体結合
を示す。放射性ヨード化検出抗体の捕捉ホルモンまたは
hCGに関連する類似物に結合する能力は、＋＋＋＋（結
合cpm＝尿hCG標準品に結合したものの200％未満）、＋
＋＋（結合cpm＝尿hCG標準品に結合したものの110％を
越え200％未満）、＋＋（結合cpm＝尿hCG標準品に結合
したものの50−110％）、＋（結合cpm＝尿hCG標準品に
結合したものの10−49％）または−（10％結合以下）で
表示され、ntは試験していないことを示しす。これらの
アィッセイは捕捉抗体としてB105を使用した。これらの
類似物のすべてはアルファ、ベータ−ヘテロ二量体（B1
05捕捉、B109検出）を形成した。抗体B109はhCGベータ
−サブユニット上のエピトープに対して向けられている
が、それは遊離ベータ−サブユニットよりもアルファ、
ベータ−ヘテロ二量体に極めて良く結合し、それが、ベ
ータ−サブユニットのアルファとの結合により生起する
hCG−ベータ中の立体配座変化を認識することを示して
いる。このデータから、アルファ−サブユニット類似物
のすべてがこのhCG−ベータ中の立体配座変化を誘導す
ることができることが示された。データから、hCG−ア
ルファサブユニット（A101、A102、A109、A112、A202お
よびA501）に対して向けられた抗体はウシアルファ−サ
ブユニットに良く結合するものはないことが示された。
ウシアミノ酸配列のヒトアルファ−サブユニットからの
配列での置換により、これらの抗体が結合可能になっ
た。幾つかの例では、離散した隣接した配列の置換はhC
Gで見られるものと同様な結合を得るのみ充分である
（例えば、A102、A112、A202）。他の抗体では、大きな
隣接領域（A101）または数種の分離領域（A109、A501）
が、ウシ／ヒトキメラへの抗体結合を発生させるために
は置換されなければならない（類似物配列については、
第IX表を参照）。これらの結合データは第７図に要約さ
れ、それはhCG−アルファ−サブユニット抗体およびア
ルファ−サブユニットのアミノ酸配列に関する。
実施例 13 レセプター結合のアィッセイ 二種のアィッセイが、レセプター結合を特性決定する
のに使用された。一つは競争的アィッセイであり、他は
サンドウッチアッセイまたはBio I RMAアッセイであ
る。両者はすでにモイルらにより記載されている（20、
54）。
膜結合LHレセプターは、妊娠雌ウマ血清ゴナドトロピ
ンおよびhCGで過排卵化のラット黄体から得た（54）。
膜結合FSHレセプターは子ウシテストから得た（11）。B
io I RMAでは、ホルモンまたは類似物を膜結合レセプタ
ーの調製品と共に保温した。レセプターに結合するよう
になったホルモンは、ホルモンがレセプターと複合化し
た後露出しているhCGベータ−サブユニット上のエピト
ープに対する親和性を有する放射性標識化B105モノクロ
ーン抗体（６）を使用して定量した。
第XIV表は、hCG−ベータサブユニットで共発現したア
ルファ−サブユニット類似物のLHレセプターに結合する
能力を示す。
さらに、類似物のレセプター結合性質の特性決定は、
モリルらの記載による放射リガンドレセプターアィッセ
イにより決定した（20）。このアィッセイは競争的置換
であり、そこでは類似物がレセプター結合を目指して放
射性ヨード化hCGおよびhFSHと競いあう。
第９図は、hCG、hFSHおよび類似物のLHへの125I−hCG
結合を阻害する能力を示す。その125I−hCG結合を阻害
する能力は、LHレセプターに結合する能力に相関する。
各類似物からのデータは第II表中の命名法を使用してマ
ークした。hCG様活性を持つ類似物からのデータは、黒
箱で、rhCG（−）、 B27（‥‥）でプロットした;hFSH様活性を持つ類似物か
らのデータは白箱で、rhFSH（−）、B11（−−）、B17
（−−−）、 でプロットした;hCGおよびhFSH両方と異なった行動する
類似物からのデータは白三角で、B9（−−）、B16（−
−−）でプロットした。
第10図は、hCG、hFSHおよび類似物のFSHレセプターへ
の125I−hCG結合を阻害する能力を示す。その125I−FSH
結合を阻害する能力は、FSHレセプターに結合する能力
に相関する。ホルモンおよび類似物の表示は、第９図の
LHレセプター結合の場合と同一である。
第13図は、アルファ、ベータ−F8ヘテロ二量体のLHレ
セプターへの125I−hCG結合を阻害する能力を示す。こ
れらのデータは、この類似物がhCGのみなわずLHレセプ
ターに結合することを示す。
競争的置換アッセイでは、組換えホルモンおよび類似
物は、アミコン・セ３ントリプレパ−10濃縮器を使用し
て濃縮し、ヒトアルファ−サブユニット（A110、A113）
およびhCGベータ−サブユニット（B105、B108）に対す
るモノクローン抗体を上記の方法で使用する二量体−得
意性サンドウッチ・アッセイにより定量した。尿由来hC
G（CR121またはCR123）を参考標準品として使用した。
同様の結果を、アルファまたはベータ−サブユニット捕
捉のいずれかを使用し、かつ種々の対の抗体で得た。さ
らに、抗−hFSH−ベータ抗体B601に結合する類似物は、
hFSH二量体特異的サンドウッチ・アッセイで定量した。
黄体化ラット卵巣からのLHレセプターへの標識化hCG結
合の阻害は記載のように決定された。FSH放射性リガン
ド−レセプターアッセイを、結合保温を37℃で２時間行
った以外は、実質的にすでに記載のように実施した。FS
Hレセプターアッセイに使用したウシテスト膜はデー・
ジェー・ボルト博士の贈物である。高純度尿hCG（CR121
またはCR123） および下垂体hFSH（NIADDK−hFSH−Ｉ−３およびAFP−4
822−Ｂ）を参考標準品として使用した。三本チューブ
からの平均結果を、阻害剤の存在で測定した全125I−hC
Gまたは125I−hFSH結合の置換％としてグラフで示す。
実施例 14 ホルモンレスポンスのアッセイ ステロイド形成を刺激するhCG、FSHおよび類似物の能
力を、ラットライデッヒ細胞によるテストステロン形成
およびラット顆粒膜細胞によるエストラヂオール合成の
放射性免疫検定法により既に記載の方法と同様の方法を
使用して監視した。
ラットライデッヒ細胞を分離し既に記載の方法と同様
の保温で調製した。簡単しは、この操作法は、22−40日
齢のSDラットからの被膜剥離テストをバイカーボナート
の代わりの1mgHEPESおよび1mgコラーゲナーゼ/mlを含有
するクレーブス・リンガー緩衝液中で、細管が相互に解
離するまで（10−20分）、消化することからなる。25ml
の酵素を含まない緩衝液を消化フラスコに添加した後、
細管を沈渣させ、間質細胞を遠心分離管中にダカントし
た。70×g10分の遠心分離に続いて、細胞を、1gのウシ
血清アルブミンを含有する緩衝液中に懸濁し、血球計で
計測した。ステロイド形成アッセイは、プラスチック管
（12×75mm）中の50マイクロリットリのホルモンと類似
物に、約350,000有核細胞を含有する50マイクロリット
リの細胞懸濁液を添加すること、および37℃３時間保温
後に生産されたテストステロンを測定することからな
る。
テストステロンを、ケンブッリジ・メヂカル・ダイア
グノステック社から入手した抗血清を利用して放射性免
疫検査法で測定した。この操作法では、175,000細胞を
含有する一定量の非抽出保温培地850マイクロリット
リ）を、100マイクロリットリの「ゲラチン／燐酸塩」
緩衝液中に溶解した0.2pmolの3H−テストステロンに添
加した。この緩衝液は0.01M燐酸カリウム（pH7）、0.82
％NaCl、0.1％NaN3および0.2％デフィコ・ブランド・ゲ
ラチンを含有した。0.06pmolのテストステロンと結合す
るに十分な抗テストステロン血清を、50マイクロリット
リのゲラチン／燐酸塩緩衝液中に添加し、37℃で１時間
保温した。氷スラリー中でさらに15分間放置した後、40
0マイクロリットリのデキストラン／木炭溶液（1.25gの
粉末木炭を0.125gのデキストランＴ−70および400mlの
ゲラチン燐酸塩緩衝液に添加して調製した）を添加し
て、結合および遊離テストステロンを分離した。４℃で
15分間後、混合物を800×ｇで10分遠心分離し、400マイ
クロリットリの上澄液を4mlのシンチラーション流体に
添加した。このアッセイで0.02−10pmolの非標識化テス
トステロンが測定された。
固体DESを1cm長のシアラスチック・チューブ中に充填
して作成した３−ジエチルスチベストロール（DES）を
移植されたラット（21−27日令）の卵巣から顆粒膜細胞
を分離した。エストロゲン処理は、細胞当たりのhFSHレ
セプターの数をかえることなしに、顆粒膜細胞を誘導す
ることが分かった（61）。顆粒膜細胞を、エリクソンと
ヒュエの記載の方法を少し改良した方法（59）で培養し
た（62）。細胞をマッコイ5a培地中に懸濁し、40,000−
50,000細胞を含有する100マイクロリットリまたは400,0
00−800,000細胞を含有する１マイクロリットリのいず
れかを、標準96−または24−ウエル培養皿の各々ウエル
に添加した。この培地はペニシリン、ストレプトマイシ
ンおよび100nMのアンドロステネジオンを含有した。顆
粒細胞はＣ−21ステロイドをＣ−19ステロイドに変換す
る能力がないので（62）、アンドロステネジオンがエス
トラジオール合成に基質として必要であった。さらに、
アンドロステネジオンは、それはこの機能には必要でな
いが、プロゲステロン形成の刺激として働く（63、6
4）。培地は培養中変化しない。エステラジオールおよ
びプロゲステロンを、0.02−0.2ml培養液から高特異性
抗血清を使用して直接測定した（65）。
第11図は、ヒトアルファサブユニットでCOS7中で共発
現したhCG/hFSHキメラデータ−サブユニットのLHレセプ
ター媒介ステロイド形成活性の投与量・レスポンス曲線
であり、hCGとhFSHとが比較される。各類似物からのデ
ータは第II表からの命名法を使用してマークされてい
る。hCG様活性を持つ類似物からのデータを、白箱で、r
hCG（−）、 B27（‥‥）でプロットした;rhFSHのデータは黒箱でプ
ロットした；少し低いhCG様活性を持つ類似物からのデ
ータは白三角で、B9（−−）、およびB16（−−−）で
プロットした；中程度のhCG活性を持つ類似物からのデ
ータは黒三角で、B11（−−）、B17（−−−）および でプロットした。このアッセイでの類似物のステロイド
形成能はそのレセプター結合活性に強く関連している
（第９図参照）。
第12図は、ヒトアルファ−サブユニットでCOS7中で共
発現したhCG/hFSHキメラベータ−サブユニットのFSHレ
セプター媒介ステロイド形成活性の投与量・レスポンス
曲線であり、hCGとhFSHとが比較される。各類似物から
のデータは第II表からの命名法を使用してマークされて
いる。hFSH様活性を持つ類似物からのデータを、白三角
で、B11（−−）、B17（−−−）および でプロットした;hFSHからのデータを黒箱でプロットし
た;rgqCGからのデータを白箱でプロットした。このアッ
セイでのこれら類似物のステロイド形成能はFSHレセプ
ター結合活性に強く関連している（第10図参照）。
hCGは、インテスチキュラ間質（ライデッヒ）細胞の
アデニルシクラーゼ活性を刺激することが知られてい
る。ライデッヒ細胞のホルモン蓄積に応答して蓄積する
cAMPは、LHレセプターで相互反応することができる。hC
Gまたは類似物の性能の尺度として使用することができ
る（20）。ライデッヒ細胞は、上記のコラゲナーゼでラ
ットテストを消化することにより調製し、50マイクロリ
ットリ中の500,000細胞を、ホルモン標準品または類似
物を含有するアッセイ管に添加し100マイクロリットリ
の最終量とした。この混合物を37℃45分間で保温し、そ
の後保温管を沸騰水浴中に５分間入れ、氷上にセットし
た。一定量の培地またはcAMP標準品を、3H−cAMPおよび
環状AMP依存タンパク質キナーゼで一夜氷上で保温し
た。６百マイクロリットリのデキストラン被覆木炭をこ
の試料に添加し、10−15分氷上で保温した。チューブを
2000rpmで15分間遠心分離し、600マイクロリットリの上
澄液を3mlのシンチレーション流体に添加した。
第14図は、アルファサブユニットでC127中で共発現し
たhCGに応答したまたはF8に応答したLHレセプター媒介c
AMP蓄積の投与量・レスポンス曲線である。この図は、h
CGとF8類とを共に保温した結果を示す。第14図は、F8が
hCGと比べて低い性能を有することを示す。さらに、F8
は、hCGのhCG−誘導cAMP蓄積を刺激する能力を阻害す
る。
ここでおよび以下で記載された引用文献はすべて参考
として取り込まれている。
引用文献 1.ピアース，ジェイ．ジー．およびパーソンズ，ティ
ー．エフ.;Ann.Rev.Biochem.50,465（1981）． 2.ライアン，アール．ジェイ．他;Recent Progress H
ormone Res.43,383（1987）． 3.セイラム，エム．アール.;Arch.Biochem.Biophys.20
4,199（1980）． 4.ケウトマン，エイチ．ティー．他;Biochem.22,3067
（1983）． 5.モイル，ダブリュ．アール．他;Proc.Nat′l.Acad.Sc
i.（USA）79,2245（1982）． 6.エールリッヒ，ピー．エイチ．他;Am.J.Immunol.Micr
obiol.８,48（1985）． 7.シュワルツ，エス．他;Endocrinol.118,189（198
6）． 8.ベルガー，ピー．他;Endocrinol.123,2351（1988）． 9.チャールスワース，エム．シー．他;J.Biol.Chem.26
2,13409（1987）． 10.ケウトマン，エイチ．ティー．他;Proc.Nat′l.Aca
d.Sci.（USA）84,2038（1987）． 11.スラス，ピー．エム．他;Biochem.25,2644（198
6）． 12.シュネイヤー，エイ．エル．他;Biochem.27,666（19
88）． 13.ストリックランド，ティー．ダブリュ．およびピュ
エット，ディー.;Int.J.Peptide Protein Res.21,374
（1983）． 14.アームストロング，イー．ジー．他;Biochemical A
ctions of Hormones（G.Litwack,Ed.），13,91（198
6）． 15.キヤンベル，アール．ケイ．他;Excerpta Medica
Int′l.Congr.,Series 798,pp.123−132（1988）． 16.ストリックランド，ティー．ダブリュ．およびピュ
エット，ディー.;Endocrinol.111,95（1982）． 17.クスダ，エス．およびデューフォウ，エム．エル.;
J.Biol.Chem.261,16161（1986）． 18.ワング，ジェイ．およびメノン，ケイ．エム．ジェ
イ.;Proc.Nat′l.Acad.Sci.（USA）81,4667（1984）． 19.ジイ，アイ．およびジイ，ティー．エイチ.;Proc.Na
t′l.Acad.Sci.（USA）78,5464（1981）． 20.モイル，ダブリュ．アール．他;J.Biol.Chem.250,91
63（1975）． 21.ガバーマン，ジェイ．エム．他;J.Biol.Chem.257,15
059（1982）． 22.マトツーク，エム．エム．他;1988 Endocrine So
c.Meeting,New Orleans,Abst.＃423（1988）． 22a.マトツーク，エム．エム．他;J.Cell Biol.109,14
29−1438（October 1989）,The Rockfeller Univers
ity Press. 23.カルボ，エフ．オー．およびライアン，アール．ジ
ェイ.;Biochem.24,1953（1985）． 24.ケウトマン，エイチ．ティー．他;FEBS Letters 1
85,333（1985）． 25.ボウレイ，ティー．エイ．およびセイラム，エム．
アール.;Int.J.Peptide Protein Res.26,612（198
5）． 26.モイル，ダブリュ．アール．他;J.Biol.Chem.262,16
920（1987）． 27.リボイス，アール．ブイ．およびフィッシュマン，
ピー．エイチ.;J.Biol.Chem.259,8087（1984）． 28.マンジュナス，ピー．およびセイラム，エム．アー
ル.;J.Biol.Chem.258,3553（1983）． 29.ホージョー，エイチ．およびライアン，アール．ジ
ェイ.;Endocrinol.117,2428（1985）． 30.レディ，ブイ．ビー．他;Proc.Nat′l.Acad.Sci.（U
SA）82,3644（1985）． 31.ルストバダー，ジェイ．他;J.Biol.Chem.262,14204
（1987）． 32.コーレス，シー．エル．他;J.Cell Biol.104,1173
（1987）． 33.コーレス，シー．エル．他;J.Biol.Chem.262,14197
（1987）． 34.カエツェル，ディー．エム．他;Proc.Nat′l.Acad.S
ci.（USA）82,7280（1985）． 35.マツーク，エム．エム．他;Proc.Nat′l.Acad.Sci.
（USA）84,6354（1987）． 36.カエツェル，ディー．エム．およびニルソン，ジェ
イ．エイチ.;J.Biol.Chem.263,6344（1988）． 37.ワング，シー.;Endocrine Rev.９,374（1988）． 38.ジョンズ，ダブリュ．アール．他;Lancet １,1295
（1988）． 39.ギヤラガー，ピー．他;J.Cell.Biol.107,2059（198
8）． 40.フィデス，ジェイ．シー．およびグッドマン，エイ
チ．エム.;Nature 286,684（1980）． 41.マニエイティス，ティー．他；“Molecular Clonin
g:A Laboratory Manual",Cold Spring Harbor Lab
oratory（1982）． 42.ストリュール，ケイ.;Biotechniques ３,6（198
5）． 43.フィデス，ジェイ．シー．およびグッドマン，エイ
チ．エム.;Nature 281,351（1979）． 44.グルツマン，ワイ.;Cell 23,175（1981）． 45.ヤーニッシュ−ペロン，シー．他;Gene 33,103（19
85）． 46.メード，ディー．エイ．他;Protein Engineering
１,67（1986）． 47.パプラキス，シー．エヌ．他；“Gene Transfer V
ectors for Mammalian Cells",ed.Miller,J.H.and
Calos,M.P.,Cold Spring Harbor Laboratory（198
7）． 48.ステフェンス，ピー．イー．およびヘンチェル，シ
ー．ジー.;Biochemical J.248,1（1987）． 49.ロバーツ，ジエイ．エム．およびウエイントラウ
ブ，エイチ.;Cel1 52,397（1988）． 50.チェン，シー．エイ．およびオカヤマ，エイチ.;Mo
l.Cell.Biol.７,2745（1987） 51.ビュウケージ，エス．エル．およびカルザース，エ
ム．エイチ.;Tetrahedron Letters 22,1859（198
1）． 52.ノーマン，ジェイ．他;J.Clin.End.Metab.61,1031
（1985）． 53.ミリウス，アール．ピー．他;Proc.Nat′l.Acad.Sc
i.（USA）80,7375（1983）． 54.モイル，ダブリュ．アール．他;J.Receptor Res.
８,419（1988）． 55.スカフ，アール．エイ．他;Endocrinology 117,106
（1985）． 56.デューフォウ，エム．エル．他;J.Biol.Chem.248,69
73（1973）． 57.モイル，ダブリュ．アール．およびラマチャンドラ
ン，ジェイ.;Endocrinology 93,127（1973）． 58.アンブレイト，ダブリュ．ダブリュ．他；“Monomet
ric Techniques",4th ed.,page 132,Brugess Publ.
Co.（1964）． 59.モイル，ダブリュ．アール．他;Am.J.Physiol.235,E
218（1978）． 60.ゴールデンバーグ，アール．エル．およびベイトケ
イティス，ジェイ．エル.;Endocrinology 90,1492（19
72）． 61.ルーベット，ジェイ．ピー．およびベイトケイティ
ス，ジェイ．エル.;Endocrinology 99,758（1976）． 62.エリクソン，ジー．エフ．およびフシュー，エイ．
ジェイ．ダブリュ.;Endocrinology 102,1275（197
8）． 63.ニムロッド，エイ．およびリンドナー，エイチ．ア
ール.;Mol.Cell Endocrinology ５,315（1976）． 64.ラッキー，エイ．ダブリュ．他;Endocrinology 10
0,128（1977）． 65.パウエル，ジェイ．イー．およびスティーブンス，
ジェイ．シー.;Clin Chem.19,210（1973）． 66.シュネイヤー，エイ．エル．他;Biochemistry 27,6
66（1988）． 67.“Recombinant Holmone Challenges Pig Protei
n for Superovulating Cows",Newswatch,May 4,198
7. 68.ディンソモア，アール．ピー．他;J.Am.Vet.Med.Ass
oc.195,327（1989）． 69.スティーブンス，ブイ．シー．他;Immonology Lett
ers 12,11（1986）． 70.セキネ，エス．他;Proc.Nat′l.Acad.Sci.（USA）8
6,8645（1989）． 71.ハリス，ディー．シー．他;J.Biol.Chem.264,6705
（1989）． 72.ルストベイダー，ジェイ．ダブリュ．他;Biochem.2
8,9239（1989）． 73.バーケン，エス．他;Endocrinology 123,572（198
8）． 74.クリチェブスキー，エイ．他;Endocrinology 123,5
84（1988）． 75.マニング，エム．シー．他;Pharm.Res.6,903（198
9）． 76.サンタ コルモア，ティー．エイ．他;Biochem.29,1
194（1990）． 77.ワトキンス，ピー．シー．他;DNA ６,205（198
7）． 78.ノース，ティー．他;J.Molec.Endocrinology ３,12
9（1989）． 79.ボウスフィールド，ジー．アール．他;J.Biol.Chem.
262,8610（1987）． 80.タルマッジ，ケイ．他;Nature 307,37（1984）． 81.モウラー，アール．エイ.;J.Biol.Chem.260,4684（1
985）． 82.ハヤシザキ，ワイ.;FEBS Lett.188,394（1985）． 83.バージン，ジェイ．ビー．他;J.Biol.Chem.260,7072
（1985）． 84.グッドウイン，アール．ジー．他;Nucleic Acid R
es.11,6873（1983）． 85.スティワート，エフ．他;J.Endocrinology 115,341
（1987）． 86.カレン，ビー．アール.;Methods Enzymol.152,684
（1987）． 87.メッシング，ジェイ.;Recombinant DNA Technical
Bulletin,NIH,Publication No.79−009,2,No.2,43−
48,（1979）． 本発明について以上の様に記載したが、同一のものが
多くの方法で改造され得ることは明らかである。この様
な変法は本発明の概念および範囲から出発したものと見
なすべきものではなく、この様な改良は次の特許請求の
範囲内に包含されるべきものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:19 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 モイル，ウィリアム アール アメリカ合衆国、ニュー ジャージー 08854、ピスカタウェイ、リバー ロー ド 952 審査官 本間 夏子 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/59 C07K 19/00 C12P 21/00 - 21/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】糖タンパク質ホルモンアルファ−サブユニ
    ットポリペプチドおよび非天然産ベータ−サブユニット
    ポリペプチドからなり、柔毛膜性ゴナドトロピン（CG）
    よりも卵胞刺激ホルモン（FSH）レセプターに大きい結
    合親和性を有するアルファ、ベータ−ヘテロ二量体ポリ
    ペプチドであって、ベータ−サブユニットポリペプチド
    は、Ｃ−末端領域においてヒト柔毛膜性ゴナドトロピン
    （hCG）のベータ−サブユニットの残基101−109のアミ
    ノ酸配列がヒト卵胞刺激ホルモン（hFSH）のベータ−サ
    ブユニットの残基95−103のアミノ酸配列に置換えられ
    たヒト柔毛膜性ゴナドトロピン（hCG）のベータ−サブ
    ユニットからなるキメラであることを特徴とするアルフ
    ァ、ベータ−ヘテロ二量体ポリペプチド。
  2. 【請求項２】糖タンパク質ホルモンアルファ−サブユニ
    ットポリペプチドおよび非天然産ベータ−サブユニット
    ポリペプチドからなり、柔毛膜性ゴナドトロピン（CG）
    よりも卵胞刺激ホルモン（FSH）レセプターに大きい結
    合親和性を有するアルファ、ベータ−ヘテロ二量体ポリ
    ペプチドであって、ベータ−サブユニットポリペプチド
    は、Ｃ−末端領域においてヒト柔毛膜性ゴナドトロピン
    （hCG）のベータ−サブユニットの残基94−109のアミノ
    酸配列がヒト卵胞刺激ホルモン（hFSH）のベータ−サブ
    ユニットの残基88−103のアミノ酸配列に置換えられた
    ヒト柔毛膜性ゴナドトロピン（hCG）のベータ−サブユ
    ニットからなるキメラであることを特徴とするアルフ
    ァ、ベータ−ヘテロ二量体ポリペプチド。
  3. 【請求項３】糖タンパク質ホルモンアルファ−サブユニ
    ットポリペプチドおよび非天然産ベータ−サブユニット
    ポリペプチドからなり、柔毛膜性ゴナドトロピン（CG）
    よりも卵胞刺激ホルモン（FSH）レセプターに大きい結
    合親和性を有するアルファ、ベータ−ヘテロ二量体ポリ
    ペプチドであって、ベータ−サブユニットポリペプチド
    は、Ｃ−末端領域においてヒト柔毛膜性ゴナドトロピン
    （hCG）のベータ−サブユニットの残基101−106のアミ
    ノ酸配列がヒト卵胞刺激ホルモン（hFSH）のベータ−サ
    ブユニットの残基95−100のアミノ酸配列に置換えられ
    たヒト柔毛膜性ゴナドトロピン（hCG）のベータ−サブ
    ユニットからなるキメラであることを特徴とするアルフ
    ァ、ベータ−ヘテロ二量体ポリペプチド。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705478A (en) * 1989-02-21 1998-01-06 Washington University Covalently linked β subunits of the glycoprotein hormones as antagonists
EP0673383B1 (en) * 1991-06-18 2000-05-31 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Analogs of glycoprotein hormones having altered receptor binding specificity and activity and methods for preparing and using same
US6028177A (en) * 1991-10-04 2000-02-22 Washington University Methods of detecting single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet
EP1849802A2 (en) * 1994-02-18 2007-10-31 Laboratoires Serono SA Methods for altering fertility
CA2173750C (en) * 1994-08-12 2011-03-22 Irving Boime Single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet
GB9514816D0 (en) 1995-07-19 1995-09-20 Ucli Ltd Substances and their medical use
US6361992B1 (en) 1996-05-08 2002-03-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Thyroid stimulating hormone superagonists
US5883073A (en) * 1997-04-03 1999-03-16 Washington University Single-chain double-alpha peptide
US6635256B1 (en) 1998-10-19 2003-10-21 Washington University Glycoprotein hormone compositions comprising two β subunits and methods of use thereof
US6103501A (en) * 1997-11-17 2000-08-15 Washington University Single chain glycoprotein hormones comprising two β and one α subunits and recombinant production thereof
US6486303B1 (en) * 1998-04-14 2002-11-26 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Method for making hormone heterodimers
US7994278B1 (en) * 1999-08-06 2011-08-09 Nobel Biosciences Llc Biologically active polypeptides derived from a novel early stage pregnancy factor designated maternin (MA)
JP2001333772A (ja) 2000-04-25 2001-12-04 Washington Univ 可変性の活性を有する単鎖稔性ホルモン
US6987172B2 (en) 2001-03-05 2006-01-17 Washington University In St. Louis Multifunctional single chain glycoprotein hormones comprising three or more β subunits
BRPI0620223A2 (pt) * 2005-12-22 2011-11-01 Serono Lab mutantes de fsh
EP2325194A1 (en) 2009-11-24 2011-05-25 Glycotope GmbH Process for the purification of glycoproteins
CA2880520C (en) 2012-07-30 2021-02-09 Trophogen Inc. Glycoprotein hormone long-acting superagonists
US10457713B2 (en) 2012-07-30 2019-10-29 Trophogen, Inc. Glycoprotein hormone long-acting superagonists
KR20160101906A (ko) 2013-11-05 2016-08-26 트로포젠 인코포레이티드 당단백질 호르몬의 장시간-작용하는 초작용제

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