JP2001333772A - 可変性の活性を有する単鎖稔性ホルモン - Google Patents
可変性の活性を有する単鎖稔性ホルモンInfo
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）活性と比較しての
比が変化する黄体形成ホルモン（ＬＨ）活性を共に有す
る、単鎖型稔性誘導ホルモンを提供すること。 【解決手段】 次の式で表わされるグリコシル蛋白質、
または非グリコシル蛋白質は、ホルモンのヘテロダイマ
ー型の代用物として、不妊症の治療の補助などに有用で
ある。 式＝ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−Ｘ）−（リンカ
ー）ｎ−α。 ここでＦＳＨβは卵胞刺激ホルモンβサブユニット。Ｃ
ＴＰはヒト繊毛性性線刺激ホルモン、ＬＨβ（１−Ｘ）
は黄体ホルモンの１〜Ｘ位を含むβサブユニット、リン
カーは１−１００アミノ酸残基よりなる親水性のアミノ
酸配列で好ましくは上記に規定するＣＴＰであり、αは
脊椎動物の糖蛋白質のαサブユニットである。以上に記
したサブユニット及びアミノ酸配列はいずれも改変体を
含む。
比が変化する黄体形成ホルモン（ＬＨ）活性を共に有す
る、単鎖型稔性誘導ホルモンを提供すること。 【解決手段】 次の式で表わされるグリコシル蛋白質、
または非グリコシル蛋白質は、ホルモンのヘテロダイマ
ー型の代用物として、不妊症の治療の補助などに有用で
ある。 式＝ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−Ｘ）−（リンカ
ー）ｎ−α。 ここでＦＳＨβは卵胞刺激ホルモンβサブユニット。Ｃ
ＴＰはヒト繊毛性性線刺激ホルモン、ＬＨβ（１−Ｘ）
は黄体ホルモンの１〜Ｘ位を含むβサブユニット、リン
カーは１−１００アミノ酸残基よりなる親水性のアミノ
酸配列で好ましくは上記に規定するＣＴＰであり、αは
脊椎動物の糖蛋白質のαサブユニットである。以上に記
したサブユニット及びアミノ酸配列はいずれも改変体を
含む。
Description
【０００１】（技術分野）本発明は、特定のクラスの単
鎖稔性ホルモンに関する。これらの単鎖形態は、αサブ
ユニットの上流に２つのβサブユニットを含む。本発明
のホルモンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）機能につい
ては同様の活性を有するが、黄体形成ホルモン（ＬＨ）
機能については異なる活性を有する。従って、本発明の
化合物は、比率が可変であるＦＳＨ活性およびＬＨ活性
を有する。
鎖稔性ホルモンに関する。これらの単鎖形態は、αサブ
ユニットの上流に２つのβサブユニットを含む。本発明
のホルモンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）機能につい
ては同様の活性を有するが、黄体形成ホルモン（ＬＨ）
機能については異なる活性を有する。従って、本発明の
化合物は、比率が可変であるＦＳＨ活性およびＬＨ活性
を有する。
【０００２】（背景技術）ヒトにおいて、重要な４つの
糖タンパク質ホルモンヘテロダイマー（ＬＨ、ＦＳＨ、
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および絨毛性性腺刺激
ホルモンＣＧ）は、同じαサブユニットおよび異なるβ
サブユニットを有する。これらのホルモンのうち３つ
は、事実上他の全ての脊椎動物種にも存在し、ＣＧは、
今までには、霊長類ならびに妊娠した雌馬の胎盤および
尿にしか認められていない。ＦＳＨは、稔性の調節にお
いて重要なホルモンであり、ＦＳＨは、稔性を増強する
ために、インビボおよびインビトロの両方で使用されて
きた。ＬＨもまた、このような処置において役割を果た
すようである。
糖タンパク質ホルモンヘテロダイマー（ＬＨ、ＦＳＨ、
甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および絨毛性性腺刺激
ホルモンＣＧ）は、同じαサブユニットおよび異なるβ
サブユニットを有する。これらのホルモンのうち３つ
は、事実上他の全ての脊椎動物種にも存在し、ＣＧは、
今までには、霊長類ならびに妊娠した雌馬の胎盤および
尿にしか認められていない。ＦＳＨは、稔性の調節にお
いて重要なホルモンであり、ＦＳＨは、稔性を増強する
ために、インビボおよびインビトロの両方で使用されて
きた。ＬＨもまた、このような処置において役割を果た
すようである。
【０００３】公開された２つのＰＣＴ出願は、このαユ
ニットおよびβユニットが共有結合的に連結されて、以
下の一般式の融合ペプチドを生じる、これら４つのホル
モン（ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨおよびＣＧ）の単鎖形態を
記載する：β（リンカー）nα、または α（リンカー）nβ ここでｎは０または１であり、そしてαおよびβはこれ
らのホルモンのそれぞれのサブユニットを示す（Ｍｏｙ
ｌｅ，Ｗ．Ｒ．、１９９５年８月２４日に公開されたＰ
ＣＴ出願ＷＯ９５／２２３４０、および本明細書中の発
明者の出願である、１９９６年２月２２日に公開された
ＷＯ９６／０５２２４）。これらの書類の開示は、本明
細書中に参考として援用される。
ニットおよびβユニットが共有結合的に連結されて、以
下の一般式の融合ペプチドを生じる、これら４つのホル
モン（ＦＳＨ、ＬＨ、ＴＳＨおよびＣＧ）の単鎖形態を
記載する：β（リンカー）nα、または α（リンカー）nβ ここでｎは０または１であり、そしてαおよびβはこれ
らのホルモンのそれぞれのサブユニットを示す（Ｍｏｙ
ｌｅ，Ｗ．Ｒ．、１９９５年８月２４日に公開されたＰ
ＣＴ出願ＷＯ９５／２２３４０、および本明細書中の発
明者の出願である、１９９６年２月２２日に公開された
ＷＯ９６／０５２２４）。これらの書類の開示は、本明
細書中に参考として援用される。
【０００４】シスチン架橋数が使い尽くされた、上記に
記載の単鎖糖タンパク質ホルモンの形態は、１９９７年
９月１９日に出願され、そして本明細書中に参考として
援用される米国特許出願第０８／９３３，６９３号に開
示される。
記載の単鎖糖タンパク質ホルモンの形態は、１９９７年
９月１９日に出願され、そして本明細書中に参考として
援用される米国特許出願第０８／９３３，６９３号に開
示される。
【０００５】ＷＯ９９／２５８４９として公開されたＰ
ＣＴ出願（１９９９年５月２７日公開）は、単一のαサ
ブユニットに結合した２つのβサブユニットを含む、さ
らなる単鎖形態を開示する。これらのタンパク質は、以
下の式である： β1（リンカー1）m−β2−（リンカー2）n−α； α−（リンカー1)）m−β1−（リンカー2)）n−Ｂ2およ
び β1−（リンカー1)）m−α−β2−（リンカー2)）n。
ＣＴ出願（１９９９年５月２７日公開）は、単一のαサ
ブユニットに結合した２つのβサブユニットを含む、さ
らなる単鎖形態を開示する。これらのタンパク質は、以
下の式である： β1（リンカー1）m−β2−（リンカー2）n−α； α−（リンカー1)）m−β1−（リンカー2)）n−Ｂ2およ
び β1−（リンカー1)）m−α−β2−（リンカー2)）n。
【０００６】この属は、大多数の独立したメンバーを含
み、そしてこの公開は、いずれの特定のサブクラスに対
しても重点をおいていない。この書類の内容は、本明細
書中に参考として援用される。
み、そしてこの公開は、いずれの特定のサブクラスに対
しても重点をおいていない。この書類の内容は、本明細
書中に参考として援用される。
【０００７】さらに、１９９９年１０月１２日に出願さ
れ、そしてまた本明細書中に参考として援用される、Ｐ
ＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ ９９／２３５５５は、２つのβ
サブユニットを含むホルモンのさらなる形態を開示する
が、ここでこのβサブユニットの１つは、単一のβサブ
ユニットおよびαサブユニットを含む単鎖形態に、非共
有結合的に結合されている。
れ、そしてまた本明細書中に参考として援用される、Ｐ
ＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ ９９／２３５５５は、２つのβ
サブユニットを含むホルモンのさらなる形態を開示する
が、ここでこのβサブユニットの１つは、単一のβサブ
ユニットおよびαサブユニットを含む単鎖形態に、非共
有結合的に結合されている。
【０００８】ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのカルボキシ
末端ペプチド（ＣＴＰ）またはその改変体を使用して、
一般に医薬品を、および特にこれらのホルモンを改変す
る刊行物が、本発明にさらに関連する。従って、ＰＣＴ
出願公開番号ＷＯ９０／０９８００（１９９０年９月７
日公開され、そして本明細書中に参考として援用され
る）は、これらのホルモンの種々の改変型（ＣＴＰによ
るβサブユニットのＣ末端伸長またはその改変体を含
む）を記載する。これらのホルモンの他のムテインもま
た、記載される。「ＣＴＰ」は、ヒト絨毛性性腺刺激ホ
ルモンのβサブユニットの１１２位〜１１８位の任意の
１つから１４５位にわたるアミノ酸の配列である。さら
に、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９４／２４１４８（１９９
４年１０月２７日公開され、そして本明細書中に参考と
して援用される）は、Ｃ末端以外の位置でのＣＴＰの伸
長による、あるいは挿入による、および１１２位〜１１
８位から１４５位にわたる配列より短いＣＴＰフラグメ
ントを用いる、これらのホルモンおよび他の化合物の改
変を記載している。
末端ペプチド（ＣＴＰ）またはその改変体を使用して、
一般に医薬品を、および特にこれらのホルモンを改変す
る刊行物が、本発明にさらに関連する。従って、ＰＣＴ
出願公開番号ＷＯ９０／０９８００（１９９０年９月７
日公開され、そして本明細書中に参考として援用され
る）は、これらのホルモンの種々の改変型（ＣＴＰによ
るβサブユニットのＣ末端伸長またはその改変体を含
む）を記載する。これらのホルモンの他のムテインもま
た、記載される。「ＣＴＰ」は、ヒト絨毛性性腺刺激ホ
ルモンのβサブユニットの１１２位〜１１８位の任意の
１つから１４５位にわたるアミノ酸の配列である。さら
に、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９４／２４１４８（１９９
４年１０月２７日公開され、そして本明細書中に参考と
して援用される）は、Ｃ末端以外の位置でのＣＴＰの伸
長による、あるいは挿入による、および１１２位〜１１
８位から１４５位にわたる配列より短いＣＴＰフラグメ
ントを用いる、これらのホルモンおよび他の化合物の改
変を記載している。
【０００９】ＦＳＨのＣＴＰ伸長βサブユニットもま
た、本明細書中の出願人による２つの報文に記載されて
いる：ＬａＰｏｌｔ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ（１９９２）１３１：２５１４−２５２０、お
よびＦａｒｅｓ，Ｆ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２）８９：４３０４−
４３０８。これらの両報文は、本明細書に参考として援
用されている。単鎖化合物（ＦＳＨβ−ＣＧ β−α）
の活性を記載する本明細書中の発明者による論文（Ｍａ
ｓａｔｏｓｈｉ Ｋａｎｄａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１３：１８７
３〜１８８１）もまた、参考として援用される。
た、本明細書中の出願人による２つの報文に記載されて
いる：ＬａＰｏｌｔ，Ｐ．Ｓ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ（１９９２）１３１：２５１４−２５２０、お
よびＦａｒｅｓ，Ｆ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９２）８９：４３０４−
４３０８。これらの両報文は、本明細書に参考として援
用されている。単鎖化合物（ＦＳＨβ−ＣＧ β−α）
の活性を記載する本明細書中の発明者による論文（Ｍａ
ｓａｔｏｓｈｉ Ｋａｎｄａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１３：１８７
３〜１８８１）もまた、参考として援用される。
【００１０】ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのヘテロダイ
マー形態の結晶構造は、ほぼ同時期の論文中に公開さ
れ；１つは、Ｌａｐｔｈｏｒｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９９４）３６９：４５５−４６１であり、もう
一方は、Ｗｕ，Ｈ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９
４）２：５４５−５５８である。これらの論文の結果
は、Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９
４） ３６９：４３８−４３９に要約されている。
マー形態の結晶構造は、ほぼ同時期の論文中に公開さ
れ；１つは、Ｌａｐｔｈｏｒｎ，Ａ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９９４）３６９：４５５−４６１であり、もう
一方は、Ｗｕ，Ｈ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９
４）２：５４５−５５８である。これらの論文の結果
は、Ｐａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９
４） ３６９：４３８−４３９に要約されている。
【００１１】１９９１年１１月１４日に公開されたＰＣ
Ｔ出願ＷＯ９１／１６９２２は、多くのキメラ形態およ
びさもなければ改変形態の、ヘテロダイマー糖タンパク
質ホルモンを記載している。概して、この開示は、それ
ぞれ種々のα鎖部分あるいはβ鎖部分を含有する、αサ
ブユニットあるいはβサブユニットのキメラを重点的に
取り扱っている。ＷＯ９１／１６９２２に単に掲載され
ているだけで他には記載されていない１つの構築物は、
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβ鎖の実質的に全体をα
サブユニットプレタンパク質（すなわち、このサブユニ
ットの分泌シグナル配列を含有する）に融合する。
Ｔ出願ＷＯ９１／１６９２２は、多くのキメラ形態およ
びさもなければ改変形態の、ヘテロダイマー糖タンパク
質ホルモンを記載している。概して、この開示は、それ
ぞれ種々のα鎖部分あるいはβ鎖部分を含有する、αサ
ブユニットあるいはβサブユニットのキメラを重点的に
取り扱っている。ＷＯ９１／１６９２２に単に掲載され
ているだけで他には記載されていない１つの構築物は、
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンのβ鎖の実質的に全体をα
サブユニットプレタンパク質（すなわち、このサブユニ
ットの分泌シグナル配列を含有する）に融合する。
【００１２】上記に参照されたＰＣＴ公開ＷＯ９９／２
５８４９に開示される、生物機能的な単鎖化合物の属の
特定のサブセットが、インビトロおよびインビボで稔性
の増強のためのプロトコルにおいて使用される場合に、
特に有利な特性を有することが、現在見出されている。
このサブセットにおいて、ＦＳＨ活性は、ネイティブの
ホルモンのＦＳＨ活性に匹敵するレベルで維持される
が、ＬＨ活性は、ネイティブＬＨのＬＨ活性よりも一般
的に低い範囲にわたり変化される。
５８４９に開示される、生物機能的な単鎖化合物の属の
特定のサブセットが、インビトロおよびインビボで稔性
の増強のためのプロトコルにおいて使用される場合に、
特に有利な特性を有することが、現在見出されている。
このサブセットにおいて、ＦＳＨ活性は、ネイティブの
ホルモンのＦＳＨ活性に匹敵するレベルで維持される
が、ＬＨ活性は、ネイティブＬＨのＬＨ活性よりも一般
的に低い範囲にわたり変化される。
【００１３】（発明の開示）本発明は以下を提供する： １． 下式の、ＦＳＨに関してアゴニスト活性を有し、
かつＬＨに関してより弱いアゴニスト活性を有する、グ
リコシル化タンパク質または非グリコシル化タンパク質
であって： ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−Ｘ）−（リンカー）n
−α ここでＦＳＨβは、脊椎動物卵胞刺激ホルモンβサブユ
ニットまたはその改変体であり；ＣＴＰとは、ヒト絨毛
性性腺刺激ホルモンβサブユニットまたはその改変体の
１１２位〜１１８位から１４５位のアミノ酸配列をい
い；ＬＨβ（１−Ｘ）とは、１〜Ｘ位を含む脊椎動物黄
体形成ホルモンのβサブユニットまたはその改変体をい
い、ここでＸは１１４〜１２１の整数であり；「リンカ
ー」とは、１〜１００アミノ酸残基を含む親水性の、可
動性のアミノ酸配列であり；ｎは０または１であり；そ
してαは脊椎動物糖タンパク質ホルモンのαサブユニッ
トまたはその改変体であり、但し、ｎが１でありかつリ
ンカーが完全なＣＴＰである場合、Ｘは１１４であり得
ない、タンパク質。 ２．ｎが１である、項１に記載のタンパク質。 ３．リンカーが、少なくとも１つのグリコシル化部位を
含む完全ＣＴＰまたは部分ＣＴＰ、あるいはその改変体
である、項２に記載のタンパク質。 ４．Ｘが１１９〜１２１である、項１に記載のタンパク
質。 ５．ＦＳＨβがヒトＦＳＨβであり、ＬＨβがヒトＬＨ
βであり、そしてαがヒトのαサブユニットである、項
１に記載のタンパク質。 ６．項１に記載のタンパク質であって、ＦＳＨβ−ＣＴ
Ｐ−ＬＨ（１−１２１）−ＣＴＰ−αまたはＦＳＨβ−
ＣＴＰ−ＬＨ（１−１１４）−ＣＴＰ−αまたはＦＳＨ
β−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２１）−αまたはＦＳＨβ
−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−αまたはＦＳＨβ−
ＣＴＰ−ＣＧβ−αである、タンパク質。 ７．適切な薬学的賦形剤と混合された項１に記載のタン
パク質を含む、薬学的組成物。 ８．固体支持体に結合された、項１に記載のタンパク
質。 ９．項１に記載のタンパク質に対して免疫特異的な、抗
体。 １０．項１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含む、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子。 １１．ＦＳＨおよびＬＨのアゴニストの産生のための発
現系であって、この発現系は、項１に記載のタンパク質
をコードする第１のヌクレオチド配列を、この第１のヌ
クレオチド配列の発現に影響する制御配列と作動可能に
連結して含む、発現系。 １２．上記第１のヌクレオチド配列によりコードされる
タンパク質に作動可能に連結されるシグナルペプチドを
コードする、第２のヌクレオチド配列をさらに含む、項
１１に記載の発現系。 １３．項１１に記載の発現系を含むように改変された、
宿主細胞。 １４．項１２に記載の発現系を含むように改変された、
宿主細胞。 １５．ＦＳＨおよびＬＨのアゴニストである単鎖タンパ
ク質を産生するための方法であって、この方法は、上記
のタンパク質が産生される条件下で項１３に記載の細胞
を培養する工程；およびその培養物から上記タンパク質
を回収する工程を含む、方法。 １６．ＦＳＨおよびＬＨのアゴニストである単鎖タンパ
ク質を産生するための方法であって、この方法は、上記
タンパク質が産生される条件下で項１４に記載の細胞を
培養する工程；およびその培養物から上記タンパク質を
回収する工程を含む、方法。
かつＬＨに関してより弱いアゴニスト活性を有する、グ
リコシル化タンパク質または非グリコシル化タンパク質
であって： ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−Ｘ）−（リンカー）n
−α ここでＦＳＨβは、脊椎動物卵胞刺激ホルモンβサブユ
ニットまたはその改変体であり；ＣＴＰとは、ヒト絨毛
性性腺刺激ホルモンβサブユニットまたはその改変体の
１１２位〜１１８位から１４５位のアミノ酸配列をい
い；ＬＨβ（１−Ｘ）とは、１〜Ｘ位を含む脊椎動物黄
体形成ホルモンのβサブユニットまたはその改変体をい
い、ここでＸは１１４〜１２１の整数であり；「リンカ
ー」とは、１〜１００アミノ酸残基を含む親水性の、可
動性のアミノ酸配列であり；ｎは０または１であり；そ
してαは脊椎動物糖タンパク質ホルモンのαサブユニッ
トまたはその改変体であり、但し、ｎが１でありかつリ
ンカーが完全なＣＴＰである場合、Ｘは１１４であり得
ない、タンパク質。 ２．ｎが１である、項１に記載のタンパク質。 ３．リンカーが、少なくとも１つのグリコシル化部位を
含む完全ＣＴＰまたは部分ＣＴＰ、あるいはその改変体
である、項２に記載のタンパク質。 ４．Ｘが１１９〜１２１である、項１に記載のタンパク
質。 ５．ＦＳＨβがヒトＦＳＨβであり、ＬＨβがヒトＬＨ
βであり、そしてαがヒトのαサブユニットである、項
１に記載のタンパク質。 ６．項１に記載のタンパク質であって、ＦＳＨβ−ＣＴ
Ｐ−ＬＨ（１−１２１）−ＣＴＰ−αまたはＦＳＨβ−
ＣＴＰ−ＬＨ（１−１１４）−ＣＴＰ−αまたはＦＳＨ
β−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２１）−αまたはＦＳＨβ
−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−αまたはＦＳＨβ−
ＣＴＰ−ＣＧβ−αである、タンパク質。 ７．適切な薬学的賦形剤と混合された項１に記載のタン
パク質を含む、薬学的組成物。 ８．固体支持体に結合された、項１に記載のタンパク
質。 ９．項１に記載のタンパク質に対して免疫特異的な、抗
体。 １０．項１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含む、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子。 １１．ＦＳＨおよびＬＨのアゴニストの産生のための発
現系であって、この発現系は、項１に記載のタンパク質
をコードする第１のヌクレオチド配列を、この第１のヌ
クレオチド配列の発現に影響する制御配列と作動可能に
連結して含む、発現系。 １２．上記第１のヌクレオチド配列によりコードされる
タンパク質に作動可能に連結されるシグナルペプチドを
コードする、第２のヌクレオチド配列をさらに含む、項
１１に記載の発現系。 １３．項１１に記載の発現系を含むように改変された、
宿主細胞。 １４．項１２に記載の発現系を含むように改変された、
宿主細胞。 １５．ＦＳＨおよびＬＨのアゴニストである単鎖タンパ
ク質を産生するための方法であって、この方法は、上記
のタンパク質が産生される条件下で項１３に記載の細胞
を培養する工程；およびその培養物から上記タンパク質
を回収する工程を含む、方法。 １６．ＦＳＨおよびＬＨのアゴニストである単鎖タンパ
ク質を産生するための方法であって、この方法は、上記
タンパク質が産生される条件下で項１４に記載の細胞を
培養する工程；およびその培養物から上記タンパク質を
回収する工程を含む、方法。
【００１４】本発明は、ＦＳＨ活性と比較しての比が変
化するＬＨ活性を有する、稔性誘導ホルモンの単鎖形態
を提供する。一般に、単鎖形態は、等量のネイティブの
ＦＳＨにより示される活性に匹敵するＦＳＨアゴニスト
活性を有するが、このクラスの種々の実施態様のうちで
変化し得るＬＨアゴニスト活性を有する。一般に、この
化合物は、種々の程度のＬＨアゴニスト活性を有する
が、代表的に、そのネイティブのホルモンと関連するＬ
Ｈ活性に劣る。本発明の単鎖形態は、グリコシル化され
るか、部分的にグリコシル化されるか、またはグリコシ
ル化されないかのいずれかであり得、そしてＦＳＨβ
は、ＣＴＰを介してＬＨβに連結される。αサブユニッ
トは両方の下流である。
化するＬＨ活性を有する、稔性誘導ホルモンの単鎖形態
を提供する。一般に、単鎖形態は、等量のネイティブの
ＦＳＨにより示される活性に匹敵するＦＳＨアゴニスト
活性を有するが、このクラスの種々の実施態様のうちで
変化し得るＬＨアゴニスト活性を有する。一般に、この
化合物は、種々の程度のＬＨアゴニスト活性を有する
が、代表的に、そのネイティブのホルモンと関連するＬ
Ｈ活性に劣る。本発明の単鎖形態は、グリコシル化され
るか、部分的にグリコシル化されるか、またはグリコシ
ル化されないかのいずれかであり得、そしてＦＳＨβ
は、ＣＴＰを介してＬＨβに連結される。αサブユニッ
トは両方の下流である。
【００１５】従って、１つの局面において、本発明は、
以下の式： ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−Ｘ）−（リンカー）n
−α のグリコシル化タンパク質または非グリコシル化タンパ
ク質に関し、ここで「α」は糖タンパク質ホルモンの共
通αサブユニットまたはその改変体を表し、ＦＳＨβは
卵胞刺激ホルモンのβサブユニットをいい、ＣＴＰは、
本明細書中以下にさらに規定される絨毛性性腺刺激ホル
モンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドをいい、
ＬＨβ（１−Ｘ）は、必要に応じて上記のカルボキシ末
端から７つまでのアミノ酸の欠失を含む、黄体形成ホル
モンβサブユニットをいい、「リンカー」は、可動性お
よび親水性であるアミノ酸配列であり、そしてＣＴＰ’
（すなわち、完全なＣＴＰまたは部分ＣＴＰ）であり得
る。ｎは０または１である。しかし、ｎ＝１およびリン
カー＝ＣＴＰの場合、Ｘは１１４であり得ない。
以下の式： ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−Ｘ）−（リンカー）n
−α のグリコシル化タンパク質または非グリコシル化タンパ
ク質に関し、ここで「α」は糖タンパク質ホルモンの共
通αサブユニットまたはその改変体を表し、ＦＳＨβは
卵胞刺激ホルモンのβサブユニットをいい、ＣＴＰは、
本明細書中以下にさらに規定される絨毛性性腺刺激ホル
モンβサブユニットのカルボキシ末端ペプチドをいい、
ＬＨβ（１−Ｘ）は、必要に応じて上記のカルボキシ末
端から７つまでのアミノ酸の欠失を含む、黄体形成ホル
モンβサブユニットをいい、「リンカー」は、可動性お
よび親水性であるアミノ酸配列であり、そしてＣＴＰ’
（すなわち、完全なＣＴＰまたは部分ＣＴＰ）であり得
る。ｎは０または１である。しかし、ｎ＝１およびリン
カー＝ＣＴＰの場合、Ｘは１１４であり得ない。
【００１６】その他の局面では、本発明は、本発明のタ
ンパク質を生産するための組換え材料および方法、本発
明のタンパク質を含有する薬学的組成物、本発明のタン
パク質に特異的な抗体、および本発明のタンパク質の使
用方法に関する。
ンパク質を生産するための組換え材料および方法、本発
明のタンパク質を含有する薬学的組成物、本発明のタン
パク質に特異的な抗体、および本発明のタンパク質の使
用方法に関する。
【００１７】（発明の実施の形態）ヒトの４つの「糖タ
ンパク質」ホルモンは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（ｈＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホ
ルモン（ＬＨ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）
を含むファミリーを提供する。これらのホルモンは全
て、所定の種について、グループ間でアミノ酸配列が同
じであるαサブユニット、およびファミリーの各メンバ
ーに従って異なるβサブユニットから構成されたヘテロ
ダイマーである。従って、通常これらの糖タンパク質ホ
ルモンは、非共有結合で会合しているαサブユニットお
よびβサブユニットから構成されたヘテロダイマーとし
て存在する。ほとんどの脊椎動物は、ＦＳＨ、ＴＳＨ、
およびＬＨを産生し、絨毛性性腺刺激ホルモンは、ヒト
を含む霊長類、および妊娠中の雌馬にのみ見出されてい
る。
ンパク質」ホルモンは、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン
（ｈＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホ
ルモン（ＬＨ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）
を含むファミリーを提供する。これらのホルモンは全
て、所定の種について、グループ間でアミノ酸配列が同
じであるαサブユニット、およびファミリーの各メンバ
ーに従って異なるβサブユニットから構成されたヘテロ
ダイマーである。従って、通常これらの糖タンパク質ホ
ルモンは、非共有結合で会合しているαサブユニットお
よびβサブユニットから構成されたヘテロダイマーとし
て存在する。ほとんどの脊椎動物は、ＦＳＨ、ＴＳＨ、
およびＬＨを産生し、絨毛性性腺刺激ホルモンは、ヒト
を含む霊長類、および妊娠中の雌馬にのみ見出されてい
る。
【００１８】動物において、各ホルモンのαサブユニッ
トおよびβサブユニットは、異なる遺伝子によりコード
され、そして別々に合成され、次いで非共有結合性ヘテ
ロダイマー複合体へと組み立てられる。本発明の化合物
において、βサブユニットは、αサブユニットに共有結
合的に連結されて、１次構造が本質的に線状である単鎖
分子になる。２次構造および３次構造を考慮することな
らびにコンホーメーションのエネルギーにより与えられ
る３次元構造は、βサブユニットに代表されるヘテロダ
イマーの機能性が示されることを可能にする、ヘテロダ
イマー形態に明らかに十分に類似している。単鎖中にα
サブユニットおよび２つのβサブユニットを含む化合物
の属の一般的特性は、上記に引用されたＰＣＴ出願公開
ＷＯ９９／２５８４９に記載される。しかし、本発明の
化合物（上記に引用されたＰＣＴ出願に記載される、非
常に小さいサブセットの化合物を形成する）は、稔性の
誘導のための薬物の設計において特に有利である。
トおよびβサブユニットは、異なる遺伝子によりコード
され、そして別々に合成され、次いで非共有結合性ヘテ
ロダイマー複合体へと組み立てられる。本発明の化合物
において、βサブユニットは、αサブユニットに共有結
合的に連結されて、１次構造が本質的に線状である単鎖
分子になる。２次構造および３次構造を考慮することな
らびにコンホーメーションのエネルギーにより与えられ
る３次元構造は、βサブユニットに代表されるヘテロダ
イマーの機能性が示されることを可能にする、ヘテロダ
イマー形態に明らかに十分に類似している。単鎖中にα
サブユニットおよび２つのβサブユニットを含む化合物
の属の一般的特性は、上記に引用されたＰＣＴ出願公開
ＷＯ９９／２５８４９に記載される。しかし、本発明の
化合物（上記に引用されたＰＣＴ出願に記載される、非
常に小さいサブセットの化合物を形成する）は、稔性の
誘導のための薬物の設計において特に有利である。
【００１９】稔性の誘導のために、インビトロかまたは
インビボのいずれかで細胞を処置する際に、主要成分と
して卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の効果を提供すること
が所望され得る。しかし、絨毛性性腺刺激ホルモン／黄
体形成ホルモンについてのレセプターに関して、典型的
にはより少ない、しかしそれにも関わらず、有意な量の
活性を提供することが有利である。（同じレセプター
が、ＣＧおよびＬＨの両方を認識する）。所望され得る
ＬＨ活性の程度は、処置される特定の被験体または細胞
によりいくらか変化するが、しかし、これは、代表的に
は、ＦＳＨ活性の程度よりも実質的に低い。本発明の化
合物は、ＦＳＨと実質的に同じアゴニスト活性を共有す
るが、代表的に、ＦＳＨアゴニスト刺激の約１％の活性
から、ＦＳＨアゴニスト刺激の約１００％までに及ぶＬ
Ｈ活性の範囲を提供する、一群の生物学的活性分子を提
供する。この範囲は、以下にさらに記載されるように、
グリコシル化のレベルに関して、リンカーを含む（また
は含まない）ことおよびリンカーの長さに関して、なら
びにＣ末端欠失に関して、ＬＨβ成分を操作することに
より、生じる。
インビボのいずれかで細胞を処置する際に、主要成分と
して卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の効果を提供すること
が所望され得る。しかし、絨毛性性腺刺激ホルモン／黄
体形成ホルモンについてのレセプターに関して、典型的
にはより少ない、しかしそれにも関わらず、有意な量の
活性を提供することが有利である。（同じレセプター
が、ＣＧおよびＬＨの両方を認識する）。所望され得る
ＬＨ活性の程度は、処置される特定の被験体または細胞
によりいくらか変化するが、しかし、これは、代表的に
は、ＦＳＨ活性の程度よりも実質的に低い。本発明の化
合物は、ＦＳＨと実質的に同じアゴニスト活性を共有す
るが、代表的に、ＦＳＨアゴニスト刺激の約１％の活性
から、ＦＳＨアゴニスト刺激の約１００％までに及ぶＬ
Ｈ活性の範囲を提供する、一群の生物学的活性分子を提
供する。この範囲は、以下にさらに記載されるように、
グリコシル化のレベルに関して、リンカーを含む（また
は含まない）ことおよびリンカーの長さに関して、なら
びにＣ末端欠失に関して、ＬＨβ成分を操作することに
より、生じる。
【００２０】（サブユニット成分）本明細書中で使用さ
れる場合、共通αサブユニット、ならびにＦＳＨ βサ
ブユニット、ＬＨ βサブユニット、およびＣＧ βサ
ブユニット、ならびにヘテロダイマー形態は、その従来
の定義を有し、そしてそれ自体が当該分野で公知である
アミノ酸配列を有するタンパク質か、またはその対立遺
伝子改変体をいい、このことは、示されるグリコシル化
パターン、またはアミノ酸側鎖の他の誘導体化に関わら
ない。
れる場合、共通αサブユニット、ならびにＦＳＨ βサ
ブユニット、ＬＨ βサブユニット、およびＣＧ βサ
ブユニット、ならびにヘテロダイマー形態は、その従来
の定義を有し、そしてそれ自体が当該分野で公知である
アミノ酸配列を有するタンパク質か、またはその対立遺
伝子改変体をいい、このことは、示されるグリコシル化
パターン、またはアミノ酸側鎖の他の誘導体化に関わら
ない。
【００２１】これらのペプチドの「ネイティブ」形態
は、関連の脊椎動物組織から単離されており、かつそれ
自身これらの既知の配列を有するアミノ酸配列を有する
ペプチドであるか、またはそれらの対立遺伝子改変体の
ペプチドである。７アミノ酸以下のアミノ酸欠失に達す
るＬＨβサブユニットのＣ末端の短縮は、この定義に含
まれる。
は、関連の脊椎動物組織から単離されており、かつそれ
自身これらの既知の配列を有するアミノ酸配列を有する
ペプチドであるか、またはそれらの対立遺伝子改変体の
ペプチドである。７アミノ酸以下のアミノ酸欠失に達す
るＬＨβサブユニットのＣ末端の短縮は、この定義に含
まれる。
【００２２】これらタンパク質の「改変体」形態および
ＣＴＰユニット（以下を参照のこと）の「改変体」形態
は、ネイティブのタンパク質のアミノ酸配列における意
図的変化（短縮を含む）を有する形態であり、この変化
は、例えば、部位特異的変異誘発または他の組換え操作
により生成されるか、あるいは合成的に調製される。
ＣＴＰユニット（以下を参照のこと）の「改変体」形態
は、ネイティブのタンパク質のアミノ酸配列における意
図的変化（短縮を含む）を有する形態であり、この変化
は、例えば、部位特異的変異誘発または他の組換え操作
により生成されるか、あるいは合成的に調製される。
【００２３】これらの変化は、欠失、および／または挿
入、および／または置換（非保存的置換に加えて、保存
的アミノ酸置換を含む）を含む、１〜５個、好ましくは
１〜３個、そしてより好ましくは１個のアミノ酸変化か
らなる。得られた改変体は、ネイティブのホルモンの活
性を反映する活性を保持しなければならない（すなわ
ち、得られた改変体は、アゴニストとして挙動するよう
にネイティブのホルモンの生物学的活性を保持しなけれ
ばならない）。
入、および／または置換（非保存的置換に加えて、保存
的アミノ酸置換を含む）を含む、１〜５個、好ましくは
１〜３個、そしてより好ましくは１個のアミノ酸変化か
らなる。得られた改変体は、ネイティブのホルモンの活
性を反映する活性を保持しなければならない（すなわ
ち、得られた改変体は、アゴニストとして挙動するよう
にネイティブのホルモンの生物学的活性を保持しなけれ
ばならない）。
【００２４】「保存アナログ」は、従来の意味で、置換
される残基が、置換がなされる残基と同じ一般的なアミ
ノ酸カテゴリーにあるアナログを意味する。アミノ酸
は、当該分野で理解されているように、例えば、Ｄａｙ
ｈｏｆｆ，Ｍ．ら、Ａｔｌａｓｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１
９７２）５：８９〜９９によって、このようなグループ
に分類された。一般的には、酸性アミノ酸は、１つのグ
ループに帰属し；塩基性アミノ酸は別のグループに；中
性の親水性アミノ酸は別のグループに、などに帰属す
る。より詳細な分類は、上記で参考として援用されるＷ
Ｏ ９６／０５２２４に記載される。
される残基が、置換がなされる残基と同じ一般的なアミ
ノ酸カテゴリーにあるアナログを意味する。アミノ酸
は、当該分野で理解されているように、例えば、Ｄａｙ
ｈｏｆｆ，Ｍ．ら、Ａｔｌａｓｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１
９７２）５：８９〜９９によって、このようなグループ
に分類された。一般的には、酸性アミノ酸は、１つのグ
ループに帰属し；塩基性アミノ酸は別のグループに；中
性の親水性アミノ酸は別のグループに、などに帰属す
る。より詳細な分類は、上記で参考として援用されるＷ
Ｏ ９６／０５２２４に記載される。
【００２５】好ましい改変体の１つのセットは、αもし
くはβサブユニットのいずれかのグリコシル化部位、ま
たはその両方のグリコシル化部位、あるいはＣＴＰのグ
リコシル化部位または部分ＣＴＰのグリコシル化部位が
改変された改変体である。本明細書に記載されているホ
ルモンカルテットのいくつかの有用な改変体は、１９９
３年１月５日に発行された米国特許第５，１７７，１９
３号に記載されており、そしてこれは本明細書に参考と
して援用される。グリコシル化パターンは、関連部位の
破壊、１つ以上の部位の付加、あるいは代替的に、タン
パク質が生産される宿主細胞の変更によって、改変され
得る。
くはβサブユニットのいずれかのグリコシル化部位、ま
たはその両方のグリコシル化部位、あるいはＣＴＰのグ
リコシル化部位または部分ＣＴＰのグリコシル化部位が
改変された改変体である。本明細書に記載されているホ
ルモンカルテットのいくつかの有用な改変体は、１９９
３年１月５日に発行された米国特許第５，１７７，１９
３号に記載されており、そしてこれは本明細書に参考と
して援用される。グリコシル化パターンは、関連部位の
破壊、１つ以上の部位の付加、あるいは代替的に、タン
パク質が生産される宿主細胞の変更によって、改変され
得る。
【００２６】改変体はまた、非重要領域が改変または除
去された改変体を包含する。このような欠失および変化
はループ全体を含み得、その結果、１０個より相当多い
アミノ酸の配列が欠失または変更され得る。しかし、得
られる改変体は、少なくともレセプター結合ドメインお
よびシグナル伝達に関与する領域を保持しなければなら
ない。
去された改変体を包含する。このような欠失および変化
はループ全体を含み得、その結果、１０個より相当多い
アミノ酸の配列が欠失または変更され得る。しかし、得
られる改変体は、少なくともレセプター結合ドメインお
よびシグナル伝達に関与する領域を保持しなければなら
ない。
【００２７】糖タンパク質ホルモンの改変体についての
かなりの文献が存在し、そして、アゴニスト活性を生じ
る多くの可能な改変体が調製され得ることが、明白であ
る。このような改変体は、例えば、Ｃｈｅｎ，Ｆ．ら、
Ｍｏｌｅｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９２）６：９
１４〜９１９；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ
ｍ（１９９３）２６８：１３０３４〜１３０４２；Ｙｏ
ｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９１）２６
６：１７７４１〜１７７４３；Ｐｕｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｇ
ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ、Ｌｕｓｂ
ａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌ
ａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）１２２〜１３４；
Ｋｕｅｔｍａｎｎ，Ｈ．Ｔ．ら、（同書）１０３〜１１
７頁；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ（１９９０）１２６：２５５５〜２５６
０；およびＢｉｅｌｉｎｓｋａ，Ｍ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ（１９９０）１１１：３３０ａ（抄録１８４
４）に開示されている。
かなりの文献が存在し、そして、アゴニスト活性を生じ
る多くの可能な改変体が調製され得ることが、明白であ
る。このような改変体は、例えば、Ｃｈｅｎ，Ｆ．ら、
Ｍｏｌｅｃ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９９２）６：９
１４〜９１９；Ｙｏｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅ
ｍ（１９９３）２６８：１３０３４〜１３０４２；Ｙｏ
ｏ，Ｊ．ら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９１）２６
６：１７７４１〜１７７４３；Ｐｕｅｔｔ，Ｄ．ら、Ｇ
ｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ、Ｌｕｓｂ
ａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌ
ａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）１２２〜１３４；
Ｋｕｅｔｍａｎｎ，Ｈ．Ｔ．ら、（同書）１０３〜１１
７頁；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｏｌｏｇｙ（１９９０）１２６：２５５５〜２５６
０；およびＢｉｅｌｉｎｓｋａ，Ｍ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ（１９９０）１１１：３３０ａ（抄録１８４
４）に開示されている。
【００２８】他の改変体は、１つ以上のシスチン結合
が、代表的には、結合に関与する一方または両方のシス
テインを中性アミノ酸で置換することによって、欠失さ
れる改変体を包含する。欠失され得る特に好ましいシス
チン結合は、２６位と１１０位との間、および２３位と
７２位との間のシスチン結合である。
が、代表的には、結合に関与する一方または両方のシス
テインを中性アミノ酸で置換することによって、欠失さ
れる改変体を包含する。欠失され得る特に好ましいシス
チン結合は、２６位と１１０位との間、および２３位と
７２位との間のシスチン結合である。
【００２９】本明細書で使用される場合、「ペプチド」
および「タンパク質」は、それらの間の長さの区別は恣
意的であるので、互換的に使用される。
および「タンパク質」は、それらの間の長さの区別は恣
意的であるので、互換的に使用される。
【００３０】αサブユニットおよびβサブユニットの
「非重要」領域は、生物学的活性に必要とされない分子
領域である。一般的には、これらの領域は、結合部位、
前駆体切断部位、および触媒部位から遠い。適切な折り
畳みの誘導、レセプターへの結合、触媒活性などに対し
て重要な領域は検討されるべきである。ダイマーの場合
に重要であるいくつかの領域は、この分子によって課さ
れるコンフォメーション上の制限がこれらの領域に対す
る必要性を不必要にし得るので、一本鎖形態では重要で
なくなることに、留意されるべきである。非重要領域で
あることの確認は、候補領域の欠失あるいは改変、およ
び、所望の活性についての適切なアッセイの遂行によっ
て、容易に完了される。改変が活性の損失を生じる領域
は重要であり、改変が同じ活性あるいは同様の活性を生
じる領域は非重要であると考えられる。
「非重要」領域は、生物学的活性に必要とされない分子
領域である。一般的には、これらの領域は、結合部位、
前駆体切断部位、および触媒部位から遠い。適切な折り
畳みの誘導、レセプターへの結合、触媒活性などに対し
て重要な領域は検討されるべきである。ダイマーの場合
に重要であるいくつかの領域は、この分子によって課さ
れるコンフォメーション上の制限がこれらの領域に対す
る必要性を不必要にし得るので、一本鎖形態では重要で
なくなることに、留意されるべきである。非重要領域で
あることの確認は、候補領域の欠失あるいは改変、およ
び、所望の活性についての適切なアッセイの遂行によっ
て、容易に完了される。改変が活性の損失を生じる領域
は重要であり、改変が同じ活性あるいは同様の活性を生
じる領域は非重要であると考えられる。
【００３１】本明細書で使用される場合、「ＣＴＰユニ
ット」とは、アミノ酸１１２位〜１１８位からＣ末端の
残基１４５位にまで広がる、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモ
ンβサブユニットのカルボキシ末端に認められるアミノ
酸配列をいう。従って、各「完全」ＣＴＰユニットは、
ＣＴＰのＮ末端に依存して、２８〜３４個のアミノ酸を
含有する。
ット」とは、アミノ酸１１２位〜１１８位からＣ末端の
残基１４５位にまで広がる、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモ
ンβサブユニットのカルボキシ末端に認められるアミノ
酸配列をいう。従って、各「完全」ＣＴＰユニットは、
ＣＴＰのＮ末端に依存して、２８〜３４個のアミノ酸を
含有する。
【００３２】「部分」ＣＴＰユニットによって、１１２
位〜１１８位から１４５位までの間を含めて存在する
が、最も短い可能な「完全」ＣＴＰユニットから（すな
わち、１１８位〜１４５位から）少なくとも１つのアミ
ノ酸が欠失されたアミノ酸配列が意味される。これらの
「部分」配列は、ＣＴＰに関する「改変体」の定義に含
まれる。「部分」ＣＴＰユニットは、少なくとも１つの
Ｏ−グリコシル化部位を含有する。このＣＴＰユニット
は、１２１位（部位１）、１２７位（部位２）、１３２
位（部位３）、および１３８位（部位４）のセリン残基
に、４つのグリコシル化部位を含む。アゴニストにおい
て有用なＣＴＰの部分形態は、介在する部位は削除され
得るが、ネイティブのＣＴＰ配列で出現する順序で配置
された、１つ以上のこれらの部位を含む。
位〜１１８位から１４５位までの間を含めて存在する
が、最も短い可能な「完全」ＣＴＰユニットから（すな
わち、１１８位〜１４５位から）少なくとも１つのアミ
ノ酸が欠失されたアミノ酸配列が意味される。これらの
「部分」配列は、ＣＴＰに関する「改変体」の定義に含
まれる。「部分」ＣＴＰユニットは、少なくとも１つの
Ｏ−グリコシル化部位を含有する。このＣＴＰユニット
は、１２１位（部位１）、１２７位（部位２）、１３２
位（部位３）、および１３８位（部位４）のセリン残基
に、４つのグリコシル化部位を含む。アゴニストにおい
て有用なＣＴＰの部分形態は、介在する部位は削除され
得るが、ネイティブのＣＴＰ配列で出現する順序で配置
された、１つ以上のこれらの部位を含む。
【００３３】本発明の化合物において、ＦＳＨβは、改
変体を形成するために、任意の置換または挿入が保存的
であり得るが保存的である必要はない、起こり得る１〜
５アミノ酸の欠失、および／または挿入、および／また
は置換を除いて、本質的に改変されていない形態の、適
切な種由来のＦＳＨβサブユニットを表す。従って、こ
の分子のＦＳＨβ部分は、主要でない改変は許容される
が、本質的には一定の特徴である。
変体を形成するために、任意の置換または挿入が保存的
であり得るが保存的である必要はない、起こり得る１〜
５アミノ酸の欠失、および／または挿入、および／また
は置換を除いて、本質的に改変されていない形態の、適
切な種由来のＦＳＨβサブユニットを表す。従って、こ
の分子のＦＳＨβ部分は、主要でない改変は許容される
が、本質的には一定の特徴である。
【００３４】このＦＳＨβサブユニットは、完全ＣＴＰ
リンカーを介してこの分子の下流部分に連結されてい
る。この位置におけるＣＴＰリンカーは、委任される。
このリンカーは、この位置において、アミノ酸１１２〜
１１８から１４５のＣＧ／βを含む完全なＣＴＰリンカ
ーである。さらに、単なる主要でない改変（すなわち、
１〜５アミノ酸置換、および／または挿入、および／ま
たは欠失）が含まれる。このような変化は、グリコシル
化部位に影響してはならない。
リンカーを介してこの分子の下流部分に連結されてい
る。この位置におけるＣＴＰリンカーは、委任される。
このリンカーは、この位置において、アミノ酸１１２〜
１１８から１４５のＣＧ／βを含む完全なＣＴＰリンカ
ーである。さらに、単なる主要でない改変（すなわち、
１〜５アミノ酸置換、および／または挿入、および／ま
たは欠失）が含まれる。このような変化は、グリコシル
化部位に影響してはならない。
【００３５】この分子のＬＨβ（１−Ｘ）部分は、より
変化し得る。名称１−Ｘは、含まれるＬＨβのアミノ酸
配列を表し；Ｘは１１４〜１２１である。従って、ＬＨ
βサブユニットは、天然のヒトホルモンで生じる１２１
位の、またはもちろん、異なる種由来のＬＨβの対応す
る位置の、Ｎ末端の１１４個のアミノ酸のみを含み得
る。従って、ＬＨβは、１〜１１４位、１〜１１５位、
１〜１１６位、１〜１２１位までを含み得る。さらに、
ＬＨβサブユニットは、１〜５アミノ酸置換、および／
または挿入、および／または欠失を含み得る。絨毛性性
腺刺激ホルモンにおいて対応する位置に存在するアミノ
酸の置換が、特に好ましい。従って、ＬＨ活性の変化を
許容するさらなる可変が、ＬＨβサブユニットとＣＧβ
サブユニットとの間の相違を乗り越える選択された変異
により、含まれ得る。一般に、１〜１２１位のＬＨは、
対応する位置のＣＧよりも疎水性である。細胞内活性
は、ＣＧの方を選ぶように歪められるようである；実
際、本発明の好ましい実施態様は、「ＬＨβ−リンカ
ー」の代わりに、種々の短縮型（または非短縮型）形態
のＣＧβを含む。本発明の好ましい実施態様は、ＬＨβ
部分に存在する１つ以上のアミノ酸が、ＣＧβ中のその
位置にある対応するアミノ酸によって置換される実施態
様を含む。
変化し得る。名称１−Ｘは、含まれるＬＨβのアミノ酸
配列を表し；Ｘは１１４〜１２１である。従って、ＬＨ
βサブユニットは、天然のヒトホルモンで生じる１２１
位の、またはもちろん、異なる種由来のＬＨβの対応す
る位置の、Ｎ末端の１１４個のアミノ酸のみを含み得
る。従って、ＬＨβは、１〜１１４位、１〜１１５位、
１〜１１６位、１〜１２１位までを含み得る。さらに、
ＬＨβサブユニットは、１〜５アミノ酸置換、および／
または挿入、および／または欠失を含み得る。絨毛性性
腺刺激ホルモンにおいて対応する位置に存在するアミノ
酸の置換が、特に好ましい。従って、ＬＨ活性の変化を
許容するさらなる可変が、ＬＨβサブユニットとＣＧβ
サブユニットとの間の相違を乗り越える選択された変異
により、含まれ得る。一般に、１〜１２１位のＬＨは、
対応する位置のＣＧよりも疎水性である。細胞内活性
は、ＣＧの方を選ぶように歪められるようである；実
際、本発明の好ましい実施態様は、「ＬＨβ−リンカ
ー」の代わりに、種々の短縮型（または非短縮型）形態
のＣＧβを含む。本発明の好ましい実施態様は、ＬＨβ
部分に存在する１つ以上のアミノ酸が、ＣＧβ中のその
位置にある対応するアミノ酸によって置換される実施態
様を含む。
【００３６】１位〜１１４位には、ＬＨおよびＣＧβに
おいて異なる、１７残基が存在する。１１５位〜１２１
位の全てのアミノ酸は異なる。ＬＨアミノ酸を、ＣＧβ
のアミノ酸で組織的に置換することにより、ＬＨ／ＣＧ
レセプターアゴニストとしてのこの化合物の活性を変化
し得る。従って、特定の置換は、本発明の化合物により
包含されるＬＨ活性の範囲内の化合物を拡張する。
おいて異なる、１７残基が存在する。１１５位〜１２１
位の全てのアミノ酸は異なる。ＬＨアミノ酸を、ＣＧβ
のアミノ酸で組織的に置換することにより、ＬＨ／ＣＧ
レセプターアゴニストとしてのこの化合物の活性を変化
し得る。従って、特定の置換は、本発明の化合物により
包含されるＬＨ活性の範囲内の化合物を拡張する。
【００３７】ＬＨβ（１−Ｘ）の下流のリンカーは、必
要に応じる。このリンカーは、アミノ酸、代表的には１
〜１００アミノ酸、好ましくは１〜７５アミノ酸、好ま
しくは１〜５０アミノ酸、そしてより好ましくは１〜４
０アミノ酸の配列である。このアミノ酸配列は、可動
性、かつ親水性であるべきである。このリンカーに包含
されるための代表的なアミノ酸は、グリシン、セリンを
含み、そして反復するグリシン／セリン配列が好まし
い。特に好ましい実施態様は、ＣＴＰ’であり、これは
部分ＣＴＰユニットまたは完全ＣＴＰユニットである。
要に応じる。このリンカーは、アミノ酸、代表的には１
〜１００アミノ酸、好ましくは１〜７５アミノ酸、好ま
しくは１〜５０アミノ酸、そしてより好ましくは１〜４
０アミノ酸の配列である。このアミノ酸配列は、可動
性、かつ親水性であるべきである。このリンカーに包含
されるための代表的なアミノ酸は、グリシン、セリンを
含み、そして反復するグリシン／セリン配列が好まし
い。特に好ましい実施態様は、ＣＴＰ’であり、これは
部分ＣＴＰユニットまたは完全ＣＴＰユニットである。
【００３８】αサブユニットおよびその改変体は、一般
に、改変体について本明細書中で規定される通りであ
る。
に、改変体について本明細書中で規定される通りであ
る。
【００３９】本発明のホルモンの特に好ましい実施態様
は、以下が挙げられる（Ｎ−Ｃで示される）：ＦＳＨβ
−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−α；ＦＳＨβ−ＣＴ
Ｐ−ＬＨβ（１−１１５）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−Ｌ
Ｈβ（１−１１６）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ
（１−１１７）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−
１１８）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１
９）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２０）−
α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２１）−α；Ｆ
ＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）ＣＴＰ’−α；
ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１５）ＣＴＰ’−
α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１６）ＣＴＰ’
−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１７）ＣＴ
Ｐ’−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１８）Ｃ
ＴＰ’−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１９）
ＣＴＰ’−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２
０）ＣＴＰ’−α；およびＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ
（１−１２１）ＣＴＰ’−α；ここでＣＴＰ’は、完全
ＣＴＰを表す。
は、以下が挙げられる（Ｎ−Ｃで示される）：ＦＳＨβ
−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−α；ＦＳＨβ−ＣＴ
Ｐ−ＬＨβ（１−１１５）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−Ｌ
Ｈβ（１−１１６）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ
（１−１１７）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−
１１８）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１
９）−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２０）−
α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２１）−α；Ｆ
ＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）ＣＴＰ’−α；
ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１５）ＣＴＰ’−
α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１６）ＣＴＰ’
−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１７）ＣＴ
Ｐ’−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１８）Ｃ
ＴＰ’−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１９）
ＣＴＰ’−α；ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２
０）ＣＴＰ’−α；およびＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ
（１−１２１）ＣＴＰ’−α；ここでＣＴＰ’は、完全
ＣＴＰを表す。
【００４０】ＬＨβサブユニットとαサブユニットとの
間のＣＴＰ’が部分ＣＴＰである、上記の実施態様もま
た好ましい。
間のＣＴＰ’が部分ＣＴＰである、上記の実施態様もま
た好ましい。
【００４１】ＬＨβサブユニット残基の１つ以上のアミ
ノ酸が、ＣＧβサブユニット由来の対応するアミノ酸に
より置換される、列挙された実施態様と類似の実施態様
もまた好ましい。従って、１〜１１４領域の任意の関連
位置にあるアミノ酸が置換され得、その結果、１〜１７
のそのような置換がなされ得、さらに、ＬＨβサブユニ
ットの１１５位〜１２１位の任意の数のアミノ酸が、Ｃ
Ｇβサブユニットにあるそれらの位置の対応するアミノ
酸により置換され得る。１つの特定の好ましい実施態様
において、全てのこのような置換がなされ、そしてαサ
ブユニットに対するＣＴＰリンカーは、単に、ＣＧβサ
ブユニット中に天然に存在するものである。さらに、Ｃ
Ｇβサブユニットは、少なくともＣＴＰの一部によりさ
らに伸長され得る。以下の実施態様は、例示目的のみの
ために、ＬＨβサブユニット残基がＣＧβサブユニット
に「変形される」型のなされ得る置換を例示する。この
例示は、ヒトホルモンに関して示されるが、類似の置換
が他の動物種由来のホルモンに関して生じ得る。
ノ酸が、ＣＧβサブユニット由来の対応するアミノ酸に
より置換される、列挙された実施態様と類似の実施態様
もまた好ましい。従って、１〜１１４領域の任意の関連
位置にあるアミノ酸が置換され得、その結果、１〜１７
のそのような置換がなされ得、さらに、ＬＨβサブユニ
ットの１１５位〜１２１位の任意の数のアミノ酸が、Ｃ
Ｇβサブユニットにあるそれらの位置の対応するアミノ
酸により置換され得る。１つの特定の好ましい実施態様
において、全てのこのような置換がなされ、そしてαサ
ブユニットに対するＣＴＰリンカーは、単に、ＣＧβサ
ブユニット中に天然に存在するものである。さらに、Ｃ
Ｇβサブユニットは、少なくともＣＴＰの一部によりさ
らに伸長され得る。以下の実施態様は、例示目的のみの
ために、ＬＨβサブユニット残基がＣＧβサブユニット
に「変形される」型のなされ得る置換を例示する。この
例示は、ヒトホルモンに関して示されるが、類似の置換
が他の動物種由来のホルモンに関して生じ得る。
【００４２】ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨ（１−１１４，Ｈ
１０Ｒ，Ｍ４２Ｔ）−ＣＴＰ’−αＦＳＨβ−ＣＴＰ−
ＬＨ（１−１１６，Ｔ８Ｒ，Ｎ７１Ｄ，Ｌ１１５Ｆ，Ｓ
１１６Ｑ）−ＣＴＰ’−α ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨ（１−１１４，Ｒ２Ｋ，Ｉ１５
Ｔ，Ｔ５３Ｎ，Ｐ８３Ａ）−ＣＴＰ−α ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨ（１−１１８，Ｗ８Ｒ，Ｐ５１
Ａ，Ｆ８２Ｙ，Ｇ１１７Ｄ）−ＣＴＰ’−α ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＣＧβ−α。
１０Ｒ，Ｍ４２Ｔ）−ＣＴＰ’−αＦＳＨβ−ＣＴＰ−
ＬＨ（１−１１６，Ｔ８Ｒ，Ｎ７１Ｄ，Ｌ１１５Ｆ，Ｓ
１１６Ｑ）−ＣＴＰ’−α ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨ（１−１１４，Ｒ２Ｋ，Ｉ１５
Ｔ，Ｔ５３Ｎ，Ｐ８３Ａ）−ＣＴＰ−α ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨ（１−１１８，Ｗ８Ｒ，Ｐ５１
Ａ，Ｆ８２Ｙ，Ｇ１１７Ｄ）−ＣＴＰ’−α ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＣＧβ−α。
【００４３】上記の化合物において、標準の１文字アミ
ノ酸コードを使用し；数字は位置を示し、そして左側の
残基はＬＨの残基であり、右側の残基はＣＧβ由来の残
基であり；従って、例えば、「Ｗ８Ｒ」は、８位のＬＨ
のトリプトファン残基がアルギニン残基により置換され
る実施態様をいう。
ノ酸コードを使用し；数字は位置を示し、そして左側の
残基はＬＨの残基であり、右側の残基はＣＧβ由来の残
基であり；従って、例えば、「Ｗ８Ｒ」は、８位のＬＨ
のトリプトファン残基がアルギニン残基により置換され
る実施態様をいう。
【００４４】ヒトでの使用に関しては、ヒト型のαサブ
ユニットおよびβサブユニットが望ましいが、他の脊椎
動物における対応形態が獣医学的状況において有用であ
ることに留意すべきである。ウシ、ヒツジ、ウマ、ブ
タ、ネコ、イヌ、および他の種由来のＦＳＨ、ＴＳＨ、
およびＬＨのサブユニットは、これらの種に影響を与え
る指標に適切である。
ユニットおよびβサブユニットが望ましいが、他の脊椎
動物における対応形態が獣医学的状況において有用であ
ることに留意すべきである。ウシ、ヒツジ、ウマ、ブ
タ、ネコ、イヌ、および他の種由来のＦＳＨ、ＴＳＨ、
およびＬＨのサブユニットは、これらの種に影響を与え
る指標に適切である。
【００４５】いかなる理論によっても拘束されることを
望まないが、出願人は、分子のＬＨ活性がＬＨ成分のＣ
末端を伸長することにより増強されると考える。従っ
て、活性のスペクトルは、ＬＨβが１位〜１１４位とし
て存在し、そしてＣＴＰが含まれない（最も低い活性を
有する）化合物から、ＬＨβサブユニットが完全に含ま
れ、そしてＣＴＰによりさらに伸長され（最も高い活性
の分子を提供す）る実施態様までの範囲にわたる。この
関係は、もちろん完全ではなく、そしてこの成分のアミ
ノ酸配列における任意の改変に影響される。それにも関
わらず、上記は、本発明の化合物において望ましい活性
の範囲を構築する際の、いくつかの一般的な指針を提供
する；ＬＨアゴニスト活性は、一般に、その分子のＬＨ
βサブユニット部分のＣ末端配列を伸長することにより
増強し得、そしてＬＨアゴニスト活性は、この伸長の長
さを減少することにより減衰し得る。
望まないが、出願人は、分子のＬＨ活性がＬＨ成分のＣ
末端を伸長することにより増強されると考える。従っ
て、活性のスペクトルは、ＬＨβが１位〜１１４位とし
て存在し、そしてＣＴＰが含まれない（最も低い活性を
有する）化合物から、ＬＨβサブユニットが完全に含ま
れ、そしてＣＴＰによりさらに伸長され（最も高い活性
の分子を提供す）る実施態様までの範囲にわたる。この
関係は、もちろん完全ではなく、そしてこの成分のアミ
ノ酸配列における任意の改変に影響される。それにも関
わらず、上記は、本発明の化合物において望ましい活性
の範囲を構築する際の、いくつかの一般的な指針を提供
する；ＬＨアゴニスト活性は、一般に、その分子のＬＨ
βサブユニット部分のＣ末端配列を伸長することにより
増強し得、そしてＬＨアゴニスト活性は、この伸長の長
さを減少することにより減衰し得る。
【００４６】（他の改変）本発明の単鎖タンパク質は、
リン酸化、グリコシル化（Ｎ結合型およびＣ結合型の両
方）、通常グリコシル化された形態の脱グリコシル化、
アシル化、アミノ酸側鎖の改変（例えば、プロリンのヒ
ドロキシプロリンへの転換）、および、一般的に生じる
ことが認められている翻訳後の事象に類似した同様の改
変のような、アミノ酸配列を改変すると一般的に理解さ
れている方法で、さらに結合体化または誘導体化され得
る。
リン酸化、グリコシル化（Ｎ結合型およびＣ結合型の両
方）、通常グリコシル化された形態の脱グリコシル化、
アシル化、アミノ酸側鎖の改変（例えば、プロリンのヒ
ドロキシプロリンへの転換）、および、一般的に生じる
ことが認められている翻訳後の事象に類似した同様の改
変のような、アミノ酸配列を改変すると一般的に理解さ
れている方法で、さらに結合体化または誘導体化され得
る。
【００４７】本発明のホルモンのグリコシル化状態は、
特に重要である。ホルモンは、原核生物宿主中で産生す
ること、またはサブユニットおよび／もしくは存在し得
る任意のＣＴＰユニットに通常存在するグリコシル化部
位を変異させることのいずれかによって、非グリコシル
化形態で調製され得る。非グリコシル化形態のホルモン
および部分的にグリコシル化された形態のホルモンの両
方は、グリコシル化部位を操作することによって調製さ
れ得る。通常は、もちろん、グリコシル化形態もまた、
本発明の範囲内に包含される。
特に重要である。ホルモンは、原核生物宿主中で産生す
ること、またはサブユニットおよび／もしくは存在し得
る任意のＣＴＰユニットに通常存在するグリコシル化部
位を変異させることのいずれかによって、非グリコシル
化形態で調製され得る。非グリコシル化形態のホルモン
および部分的にグリコシル化された形態のホルモンの両
方は、グリコシル化部位を操作することによって調製さ
れ得る。通常は、もちろん、グリコシル化形態もまた、
本発明の範囲内に包含される。
【００４８】当該分野で一般に公知のように、本発明の
単鎖タンパク質はまた、所望の適用に応じて、標識、キ
ャリア、固体支持体などにカップリングされ得る。標識
形態は、それらの代謝運命の追跡に使用され得る。この
目的のための適切な標識は、特に、ヨウ素１３１、テク
ネチウム９９、インジウム１１１などのような放射性同
位体標識を含む。標識はまた、アッセイ系中の単鎖タン
パク質の検出を媒介するために使用され得る。この場
合、放射性同位体はまた、酵素標識、蛍光標識、発色標
識などと同様に使用され得る。このような標識の使用
は、関連のレセプターの位置決めを可能にする。なぜな
ら、これらは、このようなレセプターに関する標的化剤
として使用され得るからである。
単鎖タンパク質はまた、所望の適用に応じて、標識、キ
ャリア、固体支持体などにカップリングされ得る。標識
形態は、それらの代謝運命の追跡に使用され得る。この
目的のための適切な標識は、特に、ヨウ素１３１、テク
ネチウム９９、インジウム１１１などのような放射性同
位体標識を含む。標識はまた、アッセイ系中の単鎖タン
パク質の検出を媒介するために使用され得る。この場
合、放射性同位体はまた、酵素標識、蛍光標識、発色標
識などと同様に使用され得る。このような標識の使用
は、関連のレセプターの位置決めを可能にする。なぜな
ら、これらは、このようなレセプターに関する標的化剤
として使用され得るからである。
【００４９】本発明のタンパク質はまた、これらの新規
な改変形態と特異的に免疫反応する抗体の調製におい
て、それらの免疫原性を増強するために、キャリアにカ
ップリングされ得る。この目的のための適切なキャリア
は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびジフテリアトキソイ
ドなどを含む。二官能性リンカーの使用を含む、本発明
の改変ペプチドをキャリアに連結させるための標準的な
カップリング技術が、使用され得る。
な改変形態と特異的に免疫反応する抗体の調製におい
て、それらの免疫原性を増強するために、キャリアにカ
ップリングされ得る。この目的のための適切なキャリア
は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびジフテリアトキソイ
ドなどを含む。二官能性リンカーの使用を含む、本発明
の改変ペプチドをキャリアに連結させるための標準的な
カップリング技術が、使用され得る。
【００５０】他の技術とともに、同様の結合技術が、本
発明のタンパク質を固体支持体にカップリングさせるた
めに使用され得る。カップリングされる場合、これらの
タンパク質は、次いで、特異的反応が示される所望の成
分を分離するためのアフィニティー試薬として使用され
得る。従って、これらは、適切なβサブユニットが相互
作用するレセプターの精製および単離において有用であ
る。
発明のタンパク質を固体支持体にカップリングさせるた
めに使用され得る。カップリングされる場合、これらの
タンパク質は、次いで、特異的反応が示される所望の成
分を分離するためのアフィニティー試薬として使用され
得る。従って、これらは、適切なβサブユニットが相互
作用するレセプターの精製および単離において有用であ
る。
【００５１】（調製方法）本発明のタンパク質を構築す
るための方法は、当該分野で周知である。現在最も実用
的なアプローチは、所望のタンパク質をコードするヌク
レオチド配列の発現によって、これらの物質を組換え法
により合成することである。改変体を含む単鎖形態をコ
ードするヌクレオチド配列を含有する核酸は、ネイティ
ブ配列から調製され得るか、またはデノボで、もしくは
これらの技術の組み合わせを用いて合成され得る。部位
特異的変異誘発、さらなる配列の連結、ＰＣＲによるよ
うな増幅、および適切な発現系の構築のための技術は、
現在までに全て当該分野で周知である。所望のタンパク
質をコードするＤＮＡの部分あるいは全部は、好ましく
は連結を容易にするための制限部位を含むように、標準
的な固相法によって合成して構築され得る。含まれるコ
ード配列の転写および翻訳のための適切な制御エレメン
トが、ＤＮＡコード配列に提供され得る。周知のよう
に、発現系は、広範囲の宿主（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓのような原核生物宿主、ならびに酵
母、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒ
ａのような他の真菌、植物細胞、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞
のような哺乳動物細胞、鳥類細胞などのような真核生物
宿主を含む）に適合するものが、現在入手可能である。
るための方法は、当該分野で周知である。現在最も実用
的なアプローチは、所望のタンパク質をコードするヌク
レオチド配列の発現によって、これらの物質を組換え法
により合成することである。改変体を含む単鎖形態をコ
ードするヌクレオチド配列を含有する核酸は、ネイティ
ブ配列から調製され得るか、またはデノボで、もしくは
これらの技術の組み合わせを用いて合成され得る。部位
特異的変異誘発、さらなる配列の連結、ＰＣＲによるよ
うな増幅、および適切な発現系の構築のための技術は、
現在までに全て当該分野で周知である。所望のタンパク
質をコードするＤＮＡの部分あるいは全部は、好ましく
は連結を容易にするための制限部位を含むように、標準
的な固相法によって合成して構築され得る。含まれるコ
ード配列の転写および翻訳のための適切な制御エレメン
トが、ＤＮＡコード配列に提供され得る。周知のよう
に、発現系は、広範囲の宿主（Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓのような原核生物宿主、ならびに酵
母、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒ
ａのような他の真菌、植物細胞、昆虫細胞、ＣＨＯ細胞
のような哺乳動物細胞、鳥類細胞などのような真核生物
宿主を含む）に適合するものが、現在入手可能である。
【００５２】宿主の選択は、翻訳後の事象（最も具体的
にはグリコシル化を含む）に対して特に適切である。グ
リコシル化の位置は、分子内のグリコシル化部位の性質
によって、ほとんどの場合制御される。しかし、この部
位を占める糖の性質もまた、宿主の性質により影響され
る。従って、本発明のホルモンの特性の微調整は、宿主
の適切な選択によって達成され得る。
にはグリコシル化を含む）に対して特に適切である。グ
リコシル化の位置は、分子内のグリコシル化部位の性質
によって、ほとんどの場合制御される。しかし、この部
位を占める糖の性質もまた、宿主の性質により影響され
る。従って、本発明のホルモンの特性の微調整は、宿主
の適切な選択によって達成され得る。
【００５３】αサブユニット部分の遺伝子の特に好まし
い形態（αサブユニットは改変されていようと、あるい
は改変されてなかろうと）は、「ミニ遺伝子」構築物で
ある。本明細書で使用される場合、αサブユニット「ミ
ニ遺伝子」は、ｐＭ2／ＣＧαあるいはｐＭ2／αの構築
物の記載において、Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８８）２：９５〜１００
に開示されている遺伝子構築物のことである。
い形態（αサブユニットは改変されていようと、あるい
は改変されてなかろうと）は、「ミニ遺伝子」構築物で
ある。本明細書で使用される場合、αサブユニット「ミ
ニ遺伝子」は、ｐＭ2／ＣＧαあるいはｐＭ2／αの構築
物の記載において、Ｍａｔｚｕｋ，Ｍ．Ｍ．ら、Ｍｏｌ
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９８８）２：９５〜１００
に開示されている遺伝子構築物のことである。
【００５４】組換え産生については、発現系を用いる改
変宿主細胞が使用され、所望のタンパク質を産生するた
めに培養される。これらの用語は、本明細書では以下の
ように使用される。
変宿主細胞が使用され、所望のタンパク質を産生するた
めに培養される。これらの用語は、本明細書では以下の
ように使用される。
【００５５】「改変（された）」組換え宿主細胞、すな
わち、本発明の組換え発現系を「含むように改変され
た」細胞とは、この発現系を導入するために、トランス
フェクション、ウイルス感染などを含む任意の都合のよ
い様式によって、この発現系を含むように改変された宿
主細胞のことである。「改変（された）細胞」とは、系
が染色体中に組み込まれようと、あるいは染色体外性で
あろうと、この発現系を含有する細胞のことである。
「改変された細胞」は、発現系の含有に関して安定であ
り得るか、あるいはコード配列が一過的に発現され得る
かのいずれかである。簡単に言えば、本発明の発現系を
用いて「改変された」組換え宿主細胞とは、この取り込
みをもたらす様式に関係なく、ネイティブでは含まない
場合に、この発現系を含ませる操作の結果として、この
発現系を含む細胞をいう。
わち、本発明の組換え発現系を「含むように改変され
た」細胞とは、この発現系を導入するために、トランス
フェクション、ウイルス感染などを含む任意の都合のよ
い様式によって、この発現系を含むように改変された宿
主細胞のことである。「改変（された）細胞」とは、系
が染色体中に組み込まれようと、あるいは染色体外性で
あろうと、この発現系を含有する細胞のことである。
「改変された細胞」は、発現系の含有に関して安定であ
り得るか、あるいはコード配列が一過的に発現され得る
かのいずれかである。簡単に言えば、本発明の発現系を
用いて「改変された」組換え宿主細胞とは、この取り込
みをもたらす様式に関係なく、ネイティブでは含まない
場合に、この発現系を含ませる操作の結果として、この
発現系を含む細胞をいう。
【００５６】「発現系」とは、発現されるべきコードヌ
クレオチド配列、および、コード配列の発現をもたらす
のに必要な制御配列を伴うコードヌクレオチド配列を含
む核酸分子のことである。代表的には、これらの制御
は、プロモーター、終止調節配列、および、いくつかの
場合には、オペレーターあるいは発現を調節するその他
の機構を含む。制御配列は、特定の標的組換え宿主細胞
で機能的であるように設計されたものであり、従って、
宿主細胞が、構築された発現系で制御配列に適するよう
に選択されなければならない。
クレオチド配列、および、コード配列の発現をもたらす
のに必要な制御配列を伴うコードヌクレオチド配列を含
む核酸分子のことである。代表的には、これらの制御
は、プロモーター、終止調節配列、および、いくつかの
場合には、オペレーターあるいは発現を調節するその他
の機構を含む。制御配列は、特定の標的組換え宿主細胞
で機能的であるように設計されたものであり、従って、
宿主細胞が、構築された発現系で制御配列に適するよう
に選択されなければならない。
【００５７】産生されたタンパク質の分泌が所望される
場合、シグナルペプチドをコードするさらなるヌクレオ
チド配列もまた、プレタンパク質を産生するために所望
の単鎖ホルモンに作動可能に連結される、シグナルペプ
チドを産生するように含まれる。翻訳の間に、このシグ
ナルペプチドは、成熟単鎖ホルモンを放出するために切
断される。
場合、シグナルペプチドをコードするさらなるヌクレオ
チド配列もまた、プレタンパク質を産生するために所望
の単鎖ホルモンに作動可能に連結される、シグナルペプ
チドを産生するように含まれる。翻訳の間に、このシグ
ナルペプチドは、成熟単鎖ホルモンを放出するために切
断される。
【００５８】本明細書で使用されている場合、「細
胞」、「細胞培養（物）」および「細胞株」は、意味の
微妙な差に特に注意を払うことなく、互換的に使用され
る。それらの間の区別が重要な場合、その区別は文脈か
ら明白である。いずれかが意味される場合、全てが包含
されることが意図される。
胞」、「細胞培養（物）」および「細胞株」は、意味の
微妙な差に特に注意を払うことなく、互換的に使用され
る。それらの間の区別が重要な場合、その区別は文脈か
ら明白である。いずれかが意味される場合、全てが包含
されることが意図される。
【００５９】産生されたタンパク質は、細胞内で産生さ
れるときは細胞溶解物から、あるいは、分泌されるとき
は培地から回収され得る。細胞培養物から組換えタンパ
ク質を回収する技術は、当該分野で周知であり、これら
のタンパク質は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、
選択沈降などのような公知の技術によって、精製され得
る。
れるときは細胞溶解物から、あるいは、分泌されるとき
は培地から回収され得る。細胞培養物から組換えタンパ
ク質を回収する技術は、当該分野で周知であり、これら
のタンパク質は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、
選択沈降などのような公知の技術によって、精製され得
る。
【００６０】本発明のホルモンの全体あるいは一部は、
当該分野で公知のペプチド合成技術を使用して直接合成
され得、そして合成部分は、化学的にまたは酵素を用い
て連結され得る。
当該分野で公知のペプチド合成技術を使用して直接合成
され得、そして合成部分は、化学的にまたは酵素を用い
て連結され得る。
【００６１】（抗体）本発明のタンパク質は、これらの
新規化合物と特異的に免疫反応する抗体を生成するため
に使用され得る。これらの抗体は、種々の診断適用およ
び治療適用に有用である。
新規化合物と特異的に免疫反応する抗体を生成するため
に使用され得る。これらの抗体は、種々の診断適用およ
び治療適用に有用である。
【００６２】抗体は、一般的に、ウサギ、マウス、ヒツ
ジ、またはラットのような哺乳動物での標準免疫プロト
コールを使用して調製され、そして抗体は、十分な免疫
を確実にするためにポリクローナル抗血清として力価測
定される。次に、ポリクローナル抗血清は、例えば、イ
ムノアッセイでの使用のために、採取される。宿主から
の抗体分泌細胞、例えば、脾細胞または末梢血白血球
は、公知の技術を使用して不死化され得、そして本発明
のタンパク質に免疫特異性であるモノクローナル抗体の
産生のためにスクリーニングされ得る。「抗体」は、必
要とされる免疫特異性を維持する任意のフラグメント
（例えば、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、Ｆvなど）を含む。
従って、この抗体はまた、組換え技術（代表的には、適
切な特異性を有するモノクローナル抗体の少なくとも可
変領域をコードするヌクレオチド配列を単離すること、
および適切な発現系を構築することによる）を用いて調
製され得る。このアプローチは、Ｆv形態、キメラ形
態、「ヒト化」形態などの産生のような任意の所望の改
変を可能にする。
ジ、またはラットのような哺乳動物での標準免疫プロト
コールを使用して調製され、そして抗体は、十分な免疫
を確実にするためにポリクローナル抗血清として力価測
定される。次に、ポリクローナル抗血清は、例えば、イ
ムノアッセイでの使用のために、採取される。宿主から
の抗体分泌細胞、例えば、脾細胞または末梢血白血球
は、公知の技術を使用して不死化され得、そして本発明
のタンパク質に免疫特異性であるモノクローナル抗体の
産生のためにスクリーニングされ得る。「抗体」は、必
要とされる免疫特異性を維持する任意のフラグメント
（例えば、Ｆab、Ｆab'、Ｆ(ab')2、Ｆvなど）を含む。
従って、この抗体はまた、組換え技術（代表的には、適
切な特異性を有するモノクローナル抗体の少なくとも可
変領域をコードするヌクレオチド配列を単離すること、
および適切な発現系を構築することによる）を用いて調
製され得る。このアプローチは、Ｆv形態、キメラ形
態、「ヒト化」形態などの産生のような任意の所望の改
変を可能にする。
【００６３】「本発明のタンパク質に免疫特異的な」に
よって、本発明の参照化合物を特異的に結合するが、ヘ
テロダイマーにも、含まれるサブユニット自体または任
意の単鎖形態（これは、親和性または非親和性を決定す
るために考慮される一般的なパラメーター内で単一のβ
サブユニットのみを含む）のいずれにも結合しない抗体
を意味する。特異性とは、相対的な用語であって、１０
０倍以上の特異的結合の差異のような、任意の限定が選
択され得ることが理解される。従って、本発明内に包含
される免疫特異的抗体は、対応のヘテロダイマー、先行
技術の単鎖形態または別個のサブユニットに対するより
も、特定のタンパク質に対して少なくとも１００倍高く
反応性である。このような抗体は、例えば、本発明の化
合物を結合するものについてスクリーニングすること、
およびヘテロダイマー、サブユニットまたはＷＯ９５／
２２３４０、ＷＯ９６／０５２２４、およびＷＯ９９／
２５８４９に記載される先行技術の単鎖形態にも結合す
るものを捨てることによって入手され得る。
よって、本発明の参照化合物を特異的に結合するが、ヘ
テロダイマーにも、含まれるサブユニット自体または任
意の単鎖形態（これは、親和性または非親和性を決定す
るために考慮される一般的なパラメーター内で単一のβ
サブユニットのみを含む）のいずれにも結合しない抗体
を意味する。特異性とは、相対的な用語であって、１０
０倍以上の特異的結合の差異のような、任意の限定が選
択され得ることが理解される。従って、本発明内に包含
される免疫特異的抗体は、対応のヘテロダイマー、先行
技術の単鎖形態または別個のサブユニットに対するより
も、特定のタンパク質に対して少なくとも１００倍高く
反応性である。このような抗体は、例えば、本発明の化
合物を結合するものについてスクリーニングすること、
およびヘテロダイマー、サブユニットまたはＷＯ９５／
２２３４０、ＷＯ９６／０５２２４、およびＷＯ９９／
２５８４９に記載される先行技術の単鎖形態にも結合す
るものを捨てることによって入手され得る。
【００６４】（処方および使用方法）本発明のタンパク
質は、それらに対応するヘテロダイマーについて公知で
ある方法に匹敵する方法を使用して、処方および投与さ
れる。従って、処方および投与方法は、使用される特定
のホルモンまたは使用される特定のホルモンの組み合わ
せに従って変動する。しかし、用量レベルおよび投与頻
度は、特にＣＴＰユニットが、その存在に起因する生物
学的半減期の延長を考慮して存在するときには、ヘテロ
ダイマーに比較して変化され得る。
質は、それらに対応するヘテロダイマーについて公知で
ある方法に匹敵する方法を使用して、処方および投与さ
れる。従って、処方および投与方法は、使用される特定
のホルモンまたは使用される特定のホルモンの組み合わ
せに従って変動する。しかし、用量レベルおよび投与頻
度は、特にＣＴＰユニットが、その存在に起因する生物
学的半減期の延長を考慮して存在するときには、ヘテロ
ダイマーに比較して変化され得る。
【００６５】本発明のタンパク質の処方物は、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ中に見出される
ような、タンパク質薬物またはペプチド薬物に代表的な
処方物である。一般的に、タンパク質は、注射、代表的
には静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内注射により、
あるいは経粘膜送達または経皮送達のための処方物を用
いて、投与される。これらの処方物は一般的に、界面活
性剤あるいは浸透剤（例えば、胆汁酸塩、フシジン酸な
ど）を含有する。これらの処方物は、エアロゾルまたは
坐薬として、あるいは経皮投与の場合には、皮膚パッチ
の形態で投与され得る。経口投与もまた、その処方物が
消化系における分解から本発明のペプチドを保護すると
いう条件で可能である。
ｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ
ｇＣｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ中に見出される
ような、タンパク質薬物またはペプチド薬物に代表的な
処方物である。一般的に、タンパク質は、注射、代表的
には静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内注射により、
あるいは経粘膜送達または経皮送達のための処方物を用
いて、投与される。これらの処方物は一般的に、界面活
性剤あるいは浸透剤（例えば、胆汁酸塩、フシジン酸な
ど）を含有する。これらの処方物は、エアロゾルまたは
坐薬として、あるいは経皮投与の場合には、皮膚パッチ
の形態で投与され得る。経口投与もまた、その処方物が
消化系における分解から本発明のペプチドを保護すると
いう条件で可能である。
【００６６】投与レジメンおよび処方の最適化は、当該
分野での慣用問題としておよび一般的に実施されている
ように実行される。これらの処方物はまた、獣医学的使
用について適切なものを含むように改変され得る。
分野での慣用問題としておよび一般的に実施されている
ように実行される。これらの処方物はまた、獣医学的使
用について適切なものを含むように改変され得る。
【００６７】本発明の化合物は、多数の方法において、
最も明白には、ホルモンのヘテロダイマーの形態につい
ての代用物として、使用され得る。従って、ヘテロダイ
マーのように、本発明の単鎖ホルモンのアゴニスト形態
は、不妊症の処置において、インビトロ受精技術および
ネイティブホルモンに関連する他の治療方法の補助とし
て、使用され得る。これらの技術は、ヒトおよび他の動
物に対して適用可能である。その種誘導に関しての単鎖
抗体の選択は、当然に、その方法が適用される被験体に
依存する。
最も明白には、ホルモンのヘテロダイマーの形態につい
ての代用物として、使用され得る。従って、ヘテロダイ
マーのように、本発明の単鎖ホルモンのアゴニスト形態
は、不妊症の処置において、インビトロ受精技術および
ネイティブホルモンに関連する他の治療方法の補助とし
て、使用され得る。これらの技術は、ヒトおよび他の動
物に対して適用可能である。その種誘導に関しての単鎖
抗体の選択は、当然に、その方法が適用される被験体に
依存する。
【００６８】本発明の化合物はまた、ヘテロダイマーに
関して使用されるものと類似した様式において試薬とし
て有用である。
関して使用されるものと類似した様式において試薬とし
て有用である。
【００６９】さらに、本発明の化合物は，生物学的サン
プル中でそのような抗体がこれらの単鎖化合物の関連部
分に結合する程度に、ネイティブタンパク質に結合する
抗体の存在または非存在を検出するための診断ツールと
して使用され得る。これらはまた、種々のサンプルにお
けるこれらのホルモンのレベルを評価するためのアッセ
イキットにおいて、コントロール試薬として有用であ
る。ホルモン自体のレベルまたはそれらに対して惹起さ
れた抗体のレベルを評価するためのプロトコルは、当該
分野で一般に公知の標準的な免疫アッセイプロトコルで
ある。種々の競合的アッセイ方法および直接的なアッセ
イ方法が使用され、これは、放射性同位体標識，蛍光標
識，酵素標識などを含む種々の標識技術を含む。
プル中でそのような抗体がこれらの単鎖化合物の関連部
分に結合する程度に、ネイティブタンパク質に結合する
抗体の存在または非存在を検出するための診断ツールと
して使用され得る。これらはまた、種々のサンプルにお
けるこれらのホルモンのレベルを評価するためのアッセ
イキットにおいて、コントロール試薬として有用であ
る。ホルモン自体のレベルまたはそれらに対して惹起さ
れた抗体のレベルを評価するためのプロトコルは、当該
分野で一般に公知の標準的な免疫アッセイプロトコルで
ある。種々の競合的アッセイ方法および直接的なアッセ
イ方法が使用され、これは、放射性同位体標識，蛍光標
識，酵素標識などを含む種々の標識技術を含む。
【００７０】本発明の化合物はまた、ネイティブのホル
モンが結合するレセプターを検出することおよび精製す
ることにおいて有用である。従って、本発明の化合物は
固体支持体にカップリングされ得、そしてレセプターま
たは抗ホルモン抗体のアフィニティークロマトグラフィ
ー調製において使用され得る。得られたレセプターは、
それ自体が治療剤候補および試薬候補についてのスクリ
ーニング試験において、候補薬物についてホルモン活性
を評価する際に有用である。当然、βサブユニットが異
なるので、βサブユニットの二重特異性を考慮しなけれ
ばならない。
モンが結合するレセプターを検出することおよび精製す
ることにおいて有用である。従って、本発明の化合物は
固体支持体にカップリングされ得、そしてレセプターま
たは抗ホルモン抗体のアフィニティークロマトグラフィ
ー調製において使用され得る。得られたレセプターは、
それ自体が治療剤候補および試薬候補についてのスクリ
ーニング試験において、候補薬物についてホルモン活性
を評価する際に有用である。当然、βサブユニットが異
なるので、βサブユニットの二重特異性を考慮しなけれ
ばならない。
【００７１】最後に、本発明の化合物と独特に反応する
抗体は、次の調製においてこれらの物質を単離するため
の、精製手段として使用され得る。それらもまた、薬物
として投与されたこれらの化合物のレベルをモニターす
るのに使用され得る。
抗体は、次の調製においてこれらの物質を単離するため
の、精製手段として使用され得る。それらもまた、薬物
として投与されたこれらの化合物のレベルをモニターす
るのに使用され得る。
【００７２】以下の実施例は、本発明を例証することを
意図するが、限定することは意図しない。
意図するが、限定することは意図しない。
【００７３】（実施例１） （発明化合物の調製）発現ベクターを、タンパク質の生
成およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞か
らのこのタンパク質の分泌のために調製した。調製し、
そして試験した化合物は以下の通りである： ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−α； ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２１）−α；および ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−ＣＴＰ−
α。
成およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞か
らのこのタンパク質の分泌のために調製した。調製し、
そして試験した化合物は以下の通りである： ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−α； ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２１）−α；および ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−ＣＴＰ−
α。
【００７４】ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２１）
−ＣＴＰ−αの産生のための発現ベクターもまた構築し
た。
−ＣＴＰ−αの産生のための発現ベクターもまた構築し
た。
【００７５】（実施例２） （ＬＨレセプターの結合またはＦＳＨレセプターの結
合）実施例１の化合物を、Ｉ−１２５標識したｈＣＧま
たはＦＳＨヘテロダイマーと適切に競合するその能力に
ついて試験した。アッセイについての手順は、上記に引
用され、そして本明細書中に参考として援用される、Ｋ
ａｎｄａ，Ｍら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９
９９）１３：１８７３〜１８８１に示される。
合）実施例１の化合物を、Ｉ−１２５標識したｈＣＧま
たはＦＳＨヘテロダイマーと適切に競合するその能力に
ついて試験した。アッセイについての手順は、上記に引
用され、そして本明細書中に参考として援用される、Ｋ
ａｎｄａ，Ｍら、Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（１９
９９）１３：１８７３〜１８８１に示される。
【００７６】手短には、ＣＧ／ＬＨレセプターへの結合
を評価するために、ヒトＬＨレセプターを発現するＣＨ
Ｏ細胞（４×１０5／試験管）を、増加する濃度のスタ
ンダードとしての非標識ＣＧと競合して、または増加す
る量の試験するサンプルと競合して、２２℃で１８時
間、１ｎｇの標識ＣＧと共にインキュベートした。サン
プルの存在下における標識の減少は、そのサンプルにお
ける結合能力を測定する。その結果を図１に示す。
を評価するために、ヒトＬＨレセプターを発現するＣＨ
Ｏ細胞（４×１０5／試験管）を、増加する濃度のスタ
ンダードとしての非標識ＣＧと競合して、または増加す
る量の試験するサンプルと競合して、２２℃で１８時
間、１ｎｇの標識ＣＧと共にインキュベートした。サン
プルの存在下における標識の減少は、そのサンプルにお
ける結合能力を測定する。その結果を図１に示す。
【００７７】示されるように、どの構築物もＣＧヘテロ
ダイマー（黒色菱形）の活性に匹敵する活性を示さな
い。しかし、構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１
１４）−ＣＴＰ−α（黒丸および縦１本線）は、ネイテ
ィブホルモンよりも約１０倍を超えるＥＣ50を提供す
る。構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨ（１−１２１）−α
（黒四角および黒三角）は、なおいくらか大きいＥＣ50
を示す。構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１
４）−αは、このアッセイにおいてより大きな活性を全
く示さないようである（白丸および×印）。
ダイマー（黒色菱形）の活性に匹敵する活性を示さな
い。しかし、構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１
１４）−ＣＴＰ−α（黒丸および縦１本線）は、ネイテ
ィブホルモンよりも約１０倍を超えるＥＣ50を提供す
る。構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨ（１−１２１）−α
（黒四角および黒三角）は、なおいくらか大きいＥＣ50
を示す。構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１
４）−αは、このアッセイにおいてより大きな活性を全
く示さないようである（白丸および×印）。
【００７８】Ｉ−１２５で標識されたＦＳＨと競合して
（それ以外は上記に示されるプロトコルと同一のプロト
コルで）ＣＨＯ細胞上に提示されるＦＳＨレセプターに
結合する化合物の能力を試験する比較アッセイ（ｅｓｓ
ａｙ）において、全ての化合物は、概して匹敵するＦＳ
Ｈレセプター結合活性を示した。図２を参照されたい。
構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−ＣＴ
Ｐ−α（黒丸および白丸）は、試験された残りの分子
（組換えＦＳＨヘテロダイマーを含む）よりも、わずか
により効果的であるようである。
（それ以外は上記に示されるプロトコルと同一のプロト
コルで）ＣＨＯ細胞上に提示されるＦＳＨレセプターに
結合する化合物の能力を試験する比較アッセイ（ｅｓｓ
ａｙ）において、全ての化合物は、概して匹敵するＦＳ
Ｈレセプター結合活性を示した。図２を参照されたい。
構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−ＣＴ
Ｐ−α（黒丸および白丸）は、試験された残りの分子
（組換えＦＳＨヘテロダイマーを含む）よりも、わずか
により効果的であるようである。
【００７９】（実施例３） （ＬＨに関するアゴニスト活性）本発明の化合物のいく
つかを、ＣＧ／ＬＨレセプターかまたはＦＳＨレセプタ
ーを提示するＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産
生を刺激する能力について試験した。この手順は、上記
に引用されたＫａｎｄａら、（１９９９）の手順であっ
た。手短には、ｃＡＭＰの細胞外および細胞内の総量
を、ＡｄｅｎｙｌＣｙｃｌａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏ
ｎ Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ Ｋｉｔ（ＮＥＮ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ
ＭＡ）を製造者の指示により使用して決定した。ＬＨ
／ＣＧレセプターかまたはＦＳＨレセプターのいずれか
を発現するＣＨＯ細胞（１つのウェルにつき５×１０4
細胞）を、室温で２時間、リガンドとともにインキュベ
ートした。Ｉ−１２５で標識したｃＡＭＰを添加し、そ
して細胞を室温でさらに１６〜１８時間インキュベート
した。フラッシュするプレートをＰａｃｋａｒｄ Ｔｏ
ｐ γ線カウンターで読み、そして各実験を２〜３回行
った。ｃＡＭＰ含量を、ｐｍｏｌ／ｍｌで表した。
つかを、ＣＧ／ＬＨレセプターかまたはＦＳＨレセプタ
ーを提示するＣＨＯ細胞におけるサイクリックＡＭＰ産
生を刺激する能力について試験した。この手順は、上記
に引用されたＫａｎｄａら、（１９９９）の手順であっ
た。手短には、ｃＡＭＰの細胞外および細胞内の総量
を、ＡｄｅｎｙｌＣｙｃｌａｓｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏ
ｎ Ｆｌａｓｈ Ｐｌａｔｅ Ｋｉｔ（ＮＥＮ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ
ＭＡ）を製造者の指示により使用して決定した。ＬＨ
／ＣＧレセプターかまたはＦＳＨレセプターのいずれか
を発現するＣＨＯ細胞（１つのウェルにつき５×１０4
細胞）を、室温で２時間、リガンドとともにインキュベ
ートした。Ｉ−１２５で標識したｃＡＭＰを添加し、そ
して細胞を室温でさらに１６〜１８時間インキュベート
した。フラッシュするプレートをＰａｃｋａｒｄ Ｔｏ
ｐ γ線カウンターで読み、そして各実験を２〜３回行
った。ｃＡＭＰ含量を、ｐｍｏｌ／ｍｌで表した。
【００８０】図３Ａおよび図３Ｂは、ＣＧ／ＬＨ活性ア
ゴニストについての結果を示す。示されるように、構築
物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）ＣＴＰ−α
（黒四角または×印）は、このアッセイにおいて、ヘテ
ロダイマーである組換えｈＣＧ（ＣＲ１２７、黒菱形）
よりもいくらか有効でなかった。しかし、この化合物
は、構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−
α（黒三角）よりもとても有効であった。予想されたよ
うに、コントロールＦＳＨは、これらの細胞において応
答を提供しない。
ゴニストについての結果を示す。示されるように、構築
物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）ＣＴＰ−α
（黒四角または×印）は、このアッセイにおいて、ヘテ
ロダイマーである組換えｈＣＧ（ＣＲ１２７、黒菱形）
よりもいくらか有効でなかった。しかし、この化合物
は、構築物ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−
α（黒三角）よりもとても有効であった。予想されたよ
うに、コントロールＦＳＨは、これらの細胞において応
答を提供しない。
【００８１】図４Ａおよび図４Ｂは、ＦＳＨアゴニスト
活性についての結果を示す。予期されるように、ｈＣＧ
（黒四角）は、ＦＳＨレセプターを提示する細胞におい
てｃＡＭＰを生成し得ない。しかし、ＦＳＨへテロダイ
マー（黒菱形）は生成する。試験した本発明の両方の化
合物、すなわちＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１
４）−α（黒三角）およびＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ
（１−１１４）ＣＴＰ−α（×印）は、ヘテロダイマー
である組換えＦＳＨの応答に匹敵する応答を提供した。
活性についての結果を示す。予期されるように、ｈＣＧ
（黒四角）は、ＦＳＨレセプターを提示する細胞におい
てｃＡＭＰを生成し得ない。しかし、ＦＳＨへテロダイ
マー（黒菱形）は生成する。試験した本発明の両方の化
合物、すなわちＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１
４）−α（黒三角）およびＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ
（１−１１４）ＣＴＰ−α（×印）は、ヘテロダイマー
である組換えＦＳＨの応答に匹敵する応答を提供した。
【図１】図１は、本発明の種々の化合物の、標識化ｈＣ
Ｇと競合してのＬＨレセプターに対する結合を示す。
Ｇと競合してのＬＨレセプターに対する結合を示す。
【図２】図２は、本発明の種々の化合物の、ＦＳＨと競
合してのＦＳＨレセプターに対する結合を示す。
合してのＦＳＨレセプターに対する結合を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の種々の化合物が、ＬＨ／
ＣＧレセプターを生成するように改変されたＣＨＯ細胞
において、サイクリックＡＭＰの生成を誘導する能力を
示す。
ＣＧレセプターを生成するように改変されたＣＨＯ細胞
において、サイクリックＡＭＰの生成を誘導する能力を
示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の種々の化合物が、ＬＨ／
ＣＧレセプターを生成するように改変されたＣＨＯ細胞
において、サイクリックＡＭＰの生成を誘導する能力を
示す。
ＣＧレセプターを生成するように改変されたＣＨＯ細胞
において、サイクリックＡＭＰの生成を誘導する能力を
示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の種々の化合物が、ＦＳＨ
レセプターを生成するように改変されたＣＨＯ細胞にお
いて、サイクリックＡＭＰの生成を誘導する能力を示
す。
レセプターを生成するように改変されたＣＨＯ細胞にお
いて、サイクリックＡＭＰの生成を誘導する能力を示
す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の種々の化合物が、ＦＳＨ
レセプターを生成するように改変されたＣＨＯ細胞にお
いて、サイクリックＡＭＰの生成を誘導する能力を示
す。
レセプターを生成するように改変されたＣＨＯ細胞にお
いて、サイクリックＡＭＰの生成を誘導する能力を示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/26 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 21/08 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｆ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｇ０１Ｎ 33/15 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 33/50 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/53 (Ｃ１２Ｐ 21/08 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 37/38 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 2G045 AA16 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA54 4B024 AA01 AA11 BA01 BA43 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B064 AG15 AG26 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA93Y AA99Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA01 AA02 AA07 BA01 BA22 BA23 BA34 DB10 DB25 DB26 MA01 NA14 ZC042 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA30 EA30 FA74
Claims (16)
- 【請求項１】 下式の、ＦＳＨに関してアゴニスト活性
を有し、かつＬＨに関してより弱いアゴニスト活性を有
する、グリコシル化タンパク質または非グリコシル化タ
ンパク質であって： ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−Ｘ）−（リンカー）n
−α ここでＦＳＨβは、脊椎動物卵胞刺激ホルモンβサブユ
ニットまたはその改変体であり；ＣＴＰとは、ヒト絨毛
性性腺刺激ホルモンβサブユニットまたはその改変体の
１１２位〜１１８位から１４５位のアミノ酸配列をい
い；ＬＨβ（１−Ｘ）とは、１〜Ｘ位を含む脊椎動物黄
体形成ホルモンのβサブユニットまたはその改変体をい
い、ここでＸは１１４〜１２１の整数であり；「リンカ
ー」とは、１〜１００アミノ酸残基を含む親水性の、可
動性のアミノ酸配列であり；ｎは０または１であり；そ
してαは脊椎動物糖タンパク質ホルモンのαサブユニッ
トまたはその改変体であり、 但し、ｎが１でありかつリンカーが完全なＣＴＰである
場合、Ｘは１１４であり得ない、タンパク質。 - 【請求項２】 ｎが１である、請求項１に記載のタンパ
ク質。 - 【請求項３】 リンカーが、少なくとも１つのグリコシ
ル化部位を含む完全ＣＴＰまたは部分ＣＴＰ、あるいは
その改変体である、請求項２に記載のタンパク質。 - 【請求項４】 Ｘが１１９〜１２１である、請求項１に
記載のタンパク質。 - 【請求項５】 ＦＳＨβがヒトＦＳＨβであり、ＬＨβ
がヒトＬＨβであり、そしてαがヒトのαサブユニット
である、請求項１に記載のタンパク質。 - 【請求項６】 請求項１に記載のタンパク質であって、
ＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨ（１−１２１）−ＣＴＰ−αま
たはＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨ（１−１１４）−ＣＴＰ−
αまたはＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１２１）−α
またはＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＬＨβ（１−１１４）−αま
たはＦＳＨβ−ＣＴＰ−ＣＧβ−αである、タンパク
質。 - 【請求項７】 適切な薬学的賦形剤と混合された請求項
１に記載のタンパク質を含む、薬学的組成物。 - 【請求項８】 固体支持体に結合された、請求項１に記
載のタンパク質。 - 【請求項９】 請求項１に記載のタンパク質に対して免
疫特異的な、抗体。 - 【請求項１０】 請求項１に記載のタンパク質をコード
するヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ
分子。 - 【請求項１１】 ＦＳＨおよびＬＨのアゴニストの産生
のための発現系であって、該発現系は、請求項１に記載
のタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を、
該第１のヌクレオチド配列の発現に影響する制御配列と
作動可能に連結して含む、発現系。 - 【請求項１２】 前記第１のヌクレオチド配列によりコ
ードされるタンパク質に作動可能に連結されるシグナル
ペプチドをコードする、第２のヌクレオチド配列をさら
に含む、請求項１１に記載の発現系。 - 【請求項１３】 請求項１１に記載の発現系を含むよう
に改変された、宿主細胞。 - 【請求項１４】 請求項１２に記載の発現系を含むよう
に改変された、宿主細胞。 - 【請求項１５】 ＦＳＨおよびＬＨのアゴニストである
単鎖タンパク質を産生するための方法であって、該方法
は、該タンパク質が産生される条件下で請求項１３に記
載の細胞を培養する工程；およびその培養物から該タン
パク質を回収する工程を含む、方法。 - 【請求項１６】 ＦＳＨおよびＬＨのアゴニストである
単鎖タンパク質を産生するための方法であって、該方法
は、該タンパク質が産生される条件下で請求項１４に記
載の細胞を培養する工程；およびその培養物から該タン
パク質を回収する工程を含む、方法。
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