ES2338317T3

ES2338317T3 - Variante de corte y empalme de la hormona hipofisaria humana del crecimiento.

Info

Publication number: ES2338317T3
Application number: ES03778588T
Authority: ES
Inventors: Richard Joseph Fagan; Christopher Benjamin Phelps; Tania Maria Rodrigues; Melanie Yorke-Smith; Mariastella De Tiani
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2002-12-05
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2010-05-06
Anticipated expiration: 2023-12-05
Also published as: ATE456576T1; DK1569961T3; EP1569961B1; WO2004050703A8; GB0228441D0; PT1569961E; EP1569961A1; US20060275293A1; DE60331166D1; AU2003285589A1; NO20052525L; JP2006525782A; NO20052525D0; CA2507631A1; US7531508B2; AU2003285589B2; WO2004050703A1

Abstract

Un polipéptido aislado que actúa como una hormona del crecimiento y que: (i) comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:8 ó SEQ ID NO: 10; ó (ii)posee más del 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de (i).

Description

Variante de corte y empalme da la hormona hipofisaria humana del crecimiento.

Esta invención se refiere a una proteína nueva, denominada INSP101, identificada en esta memoria como una nueva variante de corte y empalme de la hormona hipofisaria humana del crecimiento (GH-N; P01241) y al uso de esta proteína y de secuencias de ácidos nucleicos procedentes del gen codificante, para el diagnostico, prevención y tratamiento de enfermedades. La variante posee un lazo A-B alterado y, por consiguiente, se pronostica que posee propiedades alteradas de unión al receptor.

Fundamento

El proceso de descubrimiento de fármacos está experimentando actualmente una revolución fundamental puesto que la época de la genonomía funcional ha llegado a alcanzar su mayoría de edad. La expresión "genonomía funcional" se aplica a un enfoque que utiliza herramientas bioinformáticas para atribuir una función a secuencias de proteínas de interés. Tales herramientas están llegando a ser más y más necesarias a medida que la velocidad de generación de datos de secuencias está dejando atrás rápidamente la aptitud de los laboratorios de investigación para asignar funciones a estas secuencias de proteínas.

A medida que las herramientas bioinformáticas aumentan tanto en potencia como en exactitud, estas herramientas van reemplazando con rapidez a las técnicas convencionales de caracterización bioquímica. Sin duda, las herramientas bioinformáticas avanzadas utilizadas en la identificación de la presente invención, son ahora capaces de producir un alto grado de resultados fidedignos.

Diversas instituciones y organizaciones comerciales está, examinando datos de secuencias a medida que estos datos se van haciendo disponibles y se están obteniendo descubrimientos importantes continuamente. No obstante, permanece la necesidad de identificar y caracterizar genes adicionales y los polipéptidos que estos genes codifican, como dianas para investigar y descubrir medicamentos.

El corte y empalme alternativo pre-mRNA es un proceso celular importante mediante el cual proteínas funcionalmente diversas pueden ser generadas a partir del transcrito primario de un gen único, con frecuencia en estructuras específicas de tejidos.

Experimentalmente, las variantes de corte y empalme son identificadas por aislamiento fortuito y secuenciación siguiente de mRNAs variantes. Sin embargo, este enfoque experimental no ha sido completado exhaustivamente para el transcriptoma humano (dado que esto requeriría el aislamiento y secuenciación sistemáticos de todos los mRNAs procedentes de todos los tejidos humanos en todas las condiciones medioambientales posibles) y debido a esta limitación experimental permanece un gran número de variantes de corte y empalme que todavía no han sido identificadas.

Los presente inventores han usado enfoques bioinformáticos propios para llevar a cabo una investigación dirigida, intencionada, para la existencia de variantes de corte y empalme del gen de la hormona humana del crecimiento. Mediante este método, el conjunto limitado de datos de las variantes de corte y empalme que se ha llegado a conocer experimentalmente puede ampliarse a un conjunto mucho mayor de variantes de corte y empalme pronosticadas.

Hormonas endocrinas

Las hormonas regulan un amplia variedad de funciones fisiológicas que comprenden el metabolismo intermediario, el crecimiento y la diferenciación celular. Dichas hormonas poseen dos mecanismos de acción fundamentales, que dependen de sus características físico-químicas. Las hormonas esteroideas lipófilas y las hormonas tiroideas son hidrófobas y actúan principalmente a nivel intracelular, modulando la transcripción génica, mientras que las hormonas peptídicas tales como la adrenalina y la melatonina son hidrófilas y actúan en la membrana celular, desencadenando una cascada de acontecimientos de transducción de la señal que conducen a efectos reguladores intracelulares (Lodish et al. (1995) Molecular Cell Biology, Scientific American Books Inc., Nueva York, NY, Páginas 856-864.

Las hormonas son producidas en células especializadas de las glándulas endocrinas y alcanzan sus células diana por medio de la circulación sanguínea. Las hormonas esteroideas derivan del colesterol mediante una serie de reacciones enzimáticas que tienen lugar en el citosol y en las mitocondrias de células principalmente de la corteza adrenal, los ovarios y los testículos.. En algunos casos la hormona esteroidea debe ser sometida a modificación en el tejido diana, o bien para ser activada o para producir un derivado más activo. La mayor parte de las hormonas peptídicas son sintetizadas en forma de proteínas precursoras (prohormonas) y son almacenadas en la célula endocrina. Antes de ser liberada a la circulación, la prohormona es desdoblada a la hormona activa. Diversas hormonas (principalmente las hormonas esteroideas y las hormonas tiroideas) son transportadas en la circulación mientras están unidas a proteínas de unión específicas. Estas proteínas sirven como depósitos de hormonas, liberando la hormona cuando es necesaria, protegiéndola también de una inactivación rápida.

Debido a la naturaleza central de las hormonas en la fisiología general del H. sapiens, se ha indicado que el desajuste de la función hormonal desempeña un papel importante en muchos procesos de enfermedades, que incluyen, aun cuando no se limitan a ella, la oncología (Sommer S. y Fuqua S.A. (20011) Semin Cancer Biol. Oct; 11(5):339-52, Bartucci M., Morelli C., Mauro L, Ando S., y Surmacz E. (2001) Cancer Res. Sep. 15:61(18):6747-54, Oosthuizen G.M., Joubert G., y du Toit R.S. (2001) S. Afr. Med. J., Jul;91(7):576-79, Nickerson T., Chang F., Lorimer D., Smeekens S.P., Sawyers C.L., y Pollak M., (2001) Cancer Res. Ago. 15; 61(16):6276-80), enfermedad cardiovascular (Liu Y., Ding J., Bush T.L.,Longenecker J.C., Nieto F.J., Golden S.H., y Szklo M., (2001) Am. J. Epidemiol. Sept. 15; 154(6):489-94), enfermedades metabólicas (Flyvbjerg A., (2001) Growth Horm. IGF Res. Jun; 11 Suppl., A:S115-9, Diamond T., Levy S., Smith A., Day P., y Manoharan A (2001) Intern. Med. Jul;31(5)272-8, Toprak S., Yonem A., Cakir B., Guler S., Azal O., Ozata M., y Corakci A., (2oo1) Horm. Res.,55(2):65-70), inflamación (McEvoy A.N., Bresnihan B., FitzGerald O., y Murphy E.P. (2001) Arthritis Rheum. Ago; 44(8):1761-7, Lipsett P.A. (2001) Crit. Care Med. Ago:29(8); 1642-4) y trastornos relacionados con el SNC (Bowen R.L. (2001) JAMA. Ago 15;286(7):
790-1).

Familia de la hormona del crecimiento

La hormona del crecimiento es un miembro de una familia de hormonas polipeptídicas que comparten semejanzas estructurales y actividades biológicas, y que son producidas en las glándulas hipófisis de todos los vertebrados y en la placenta de algunos mamíferos. Los miembros de la familia incluyen la prolactina pituitaria, los lactógenos placentarios (denominados también somatomamotropinas coriónicas de los seres humanos [hCS]), proteínas afines a la prolactina de los rumiantes y los roedores, proliferinas del ratón, y somatolactina del pez.

Los genes que codifican la mayor parte de los miembros de la familia GH comprenden cinco exones y cuatro intrones y parece que han surgido por duplicación de un gen ancestral único antes de la aparición de los vertebrados. Se han descrito variantes de corte y empalme y de procesamiento para diversos miembros de la familia.

La familia génica relacionada con la GH humana localizada en el cromosoma 17q22-24, consiste en un conjunto génico de genes de secuencia altamente conservada y un único gen de prolactina sobre el cromosoma 6 (Owerbach D. et al., Science, 1981). El conjunto génico incluye cinco genes estructurales, dos genes de GH y tres genes de CS, cuya expresión es específica del tejido: hGH-N (N=normal), hGH-V (V= variante), semejante a la hormona somatomamotropina coriónica humana (hCS-L), somatomamotropina coriónica A Y B humana (hCS-A y hCS-B) (Misra-Press, A. et al., JBC 1994, Boguszewski C et al, JBC 1998).

La familia de proteínas relacionada con la GH posee semejanzas estructurales compartidas dado que su estructura terciaria forma cuatro hélice-\propto, lo que se conoce también como un haz de cuatro hélices antiparalelas. Las hélices-\propto están firmemente empaquetadas y dispuestas en una orientación arriba y abajo, con dos lazos largos que enlazan los pares paralelos.

La familia de genes hGH/hCS es importante para la regulación del metabolismo maternal y fetal y para el crecimiento y desarrollo del feto. Durante el embarazo la expresión de la GH hipofisaria (hGH-N) de la madre es suprimida y la hGH-V, una variante de la GH expresada por la placenta, llega a ser la GH predominante en la madre, hCS, que es el producto de los genes hCS-A y hCS-B, es secretado tanto en la circulación maternal como en la fetal, ambas, después de la sexta semana de embarazo, Las hGH-V y hCS actúan en concierto en la madre estimulando la producción del factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF) y modulando el metabolismo intermediario, dando como resultado la disponibilidad de glucosa y aminoácidos para el feto. En el feto, la hCS actúa a través de receptores lactógenos y, posiblemente, un receptor único de la CS modulando el desarrollo del embrión regulando el metabolismo intermediario y estimulando la producción de IGFs, insulina, hormonas adrenocorticales y el tensioactivo pulmonar. La hGH-N, que es expresada por la glándula hipófisis fetal, ejerce pequeñas acciones fisiológicas o no ejerce acciones fisiológicas en el feto hasta el final del embarazo debido a la ausencia de receptores funcionales de la GH existentes en el tejido fetal. La hGH-V, que también es una potente hormona somatogénica, no es liberada en el feto. Tomado en conjunto, los estudios de la familia génica hGH/hCD durante el embarazo, revelan una interacción compleja de las hormonas, unas con otras y con otros factores del crecimiento. Son necesarias investigaciones adicionales para clarificar los papeles relativos de los miembros de la familia en la regulación del crecimiento y desarrollo del feto, y de los factores que modulan la expresión de los genes (Handwergwer S. y Freemark M.J., Pediatr. Endocrinol. Metab., 2000, Abril; 13(4):343-56).

La hormona humana del crecimiento, conocida también como somatotropina, es una hormona proteínica de aproximadamente 190 aminoácidos que es sintetizada y secretada por las células denominadas somatotrofas en la glándula hipósis anterior. Es el participante principal en la regulación de varios procesos fisiológicos complejos, que incluyen el crecimiento y el metabolismo. La hormona del crecimiento tiene, asimismo, un interés considerable como medicamento, usado tanto en seres humanos como en animales.

La hormona del crecimiento ejerce dos tipos diferentes de efectos. Los efectos directos son el resultado de la unión de la hormona de crecimiento a su receptor sobre células diana. Las células grasas (adipocitos), por ejemplo, poseen receptores de la hormona del crecimiento y la hormona del crecimiento los estimula desdoblando los triglicéridos y suprimiendo su capacidad para absorber y acumular los lípidos en circulación. Los efectos indirectos son mediados, principalmente, por el factor-1 del crecimiento semejante a la insulina (IGF-1). El papel principal de la hormona del crecimiento en la estimulación del crecimiento corporal consiste en estimular el hígado y otros tejidos para secretar IGF-1. La mayoría de los efectos de la hormona de crecimiento que favorecen el crecimiento, son debidos, de hecho, al IGF-1 que actúa sobre sus células diana. Por ejemplo, el IGF-1 estimula la proliferación de condrocitos (células del cartílago), dando por resultado el crecimiento óseo. La hormona del crecimiento tiene también efectos importantes sobre el metabolismo de las proteínas, los lípidos y los hidratos de carbono. En algunos casos, se ha demostrado con claridad un efecto directo de la hormona del crecimiento, en otros, se ha opinado que el IGF-1 es el mediador crítico y en algunos casos parece que están en juego tanto efectos directos como indirectos.

Además de sus efectos complejos sobre el crecimiento, los estados tanto de deficiencia como de exceso de la hormona del crecimiento, proporcionan testamentos muy visibles acerca del papel de esta hormona en la fisiología normal. Tales trastornos pueden reflejar lesiones o bien en el hipotálamo, la glándula hipófisis o en células diana. Un estado de deficiencia puede resultar no solo de una deficiencia en la producción de la hormona, sino también en la respuesta a la hormona de las células diana.

Clínicamente, la deficiencia en la hormona del crecimiento o los defectos del receptor, son tales como el retardo del crecimiento o el enanismo. La manifestación de la deficiencia en la hormona del crecimiento depende de la edad de iniciación del trastorno y puede resultar o bien de una enfermedad hereditaria o bien de una enfermedad adquirida.

El efecto de una secreción excesiva de la hormona del crecimiento también es muy dependiente de la edad de iniciación y se aprecia como dos trastornos distintivos. El gigantismo es el resultado de una secreción excesiva de la hormona del crecimiento que comienza en niños o adolescentes. Es un trastorno muy raro que resulta, habitualmente, de un tumor de las somatotropas.

La acromegalia resulta de una secreción excesiva de la hormona del crecimiento en los adultos. La iniciación del trastorno es, típicamente, insidioso. Clínicamente, un crecimiento excesivo del hueso y del tejido conjuntivo conduce a un cambio de aspecto que pudiera describirse como tener "características gruesas". El exceso de la hormona del crecimiento y del IGF-1 conduce también a desarreglos metabólicos, incluyendo intolerancia a la glucosa.

La hormona del crecimiento purificada procedente de glándulas hipófisis humanas de cadáveres, ha sido usada durante largo tiempo para tratar niños con retardo grave del crecimiento. Más recientemente, la disponibilidad de hormonas del crecimiento recombinantes ha conducido a otras diversas aplicaciones a poblaciones humanas y de animales. Por ejemplo, la hormona humana del crecimiento se utiliza comúnmente para tratar niños de estatura patológicamente corta. El papel de la hormona del crecimiento en el envejecimiento normal permanece mal entendido, pero algunos de los síntomas cosméticos del envejecimiento parecen ser atribuibles a la terapia con la hormona del crecimiento. La hormona del crecimiento está actualmente aprobada y comercializada para intensificar la producción de leche del ganado vacuno de leche; otra aplicación de la hormona del crecimiento en la agricultura animal es el tratamiento del crecimiento de cerdos con la hormona porcina del crecimiento. Se ha demostrado que tal tratamiento estimula significativamente el crecimiento muscular y hace disminuir el depósito de grasa.

Puesto que la hormona del crecimiento desempeña un papel crucial tal en los procesos celulares. el estudio de esto y de su método de regulación tienen un interés primordial. La identificación de variantes de corte y empalme de esta hormona tendría una gran importancia científica.

Matsuda et al., (1988), Biochemica el Biophysica acta, 949, 125-131, describen las secuencias de una variante de corte y empalme de 20 kDa, de la hormona humana del crecimiento.

Proctor et al., (1998), Hum. Genet. 103.255-272 hacen una revisión de la estructura de la hormona humana del crecimiento y de las mutaciones identificadas en la publicación. Se describen numerosas sustituciones sencillas de pares de bases que afectan al mRA.

La entrada en la base datos OMIM con No. de registro 139250 resume el estado de la técnica en lo que respecta a la hormona humana del crecimiento.

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La invención

La invención está basada en el descubrimiento de que la proteína INSP101 es una nueva variante de corte y empalme de la hormona hipofisaria humana del crecimiento (GH-N; P01241)

Se describe un polipéptido que:

(i): comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ó SEQ ID NO:10;

(ii): es un fragmento de la misma que actúa como hormona del crecimiento o que posee un determinante antigénico en común con un polipéptido según (i); o

(iii): es un equivalente funcional de (i) ó (ii).

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Este péptido puede:

(i): comprender la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:8 ó SEQ ID NO:10,

(ii): ser un fragmento de la misma que actúa como hormona del crecimiento o que tiene un determinante antigénico en común con un polipéptido según (i); o

(iii): ser un equivalente funcional de (i) ó (ii).

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Se describe un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ó SEQ ID NO:10.

Al polipéptido que posee la secuencia indicada en SEQ ID NO:2 se hace referencia en lo sucesivo como "el polipéptido del exón 2nov de INSP101" Al polipéptido que posee la secuencia indicada en SEQ ID NO:4 se hace referencia en lo sucesivo como "el polipéptido del exón 3nov de INSP101". Al polipéptido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:6 se hace referencia en lo sucesivo como "el polipéptido de los exones contiguos 2nov-3nov de INSP101". Al polipéptido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:8 se hace referencia en lo sucesivo como "el polipéptido completo de INSP101". Al polipéptido que tiene la secuencia indicada en SEQ ID NO:10 se hace referencia en lo sucesivo como "el polipéptido maduro completo de INSP101".

La figura 2 compara la estructura de corte y empalme de P01241, hormona hipofisaria del crecimiento (GH-N) procedente de H. sapiens, con la estructura de corte y empalme de la nueva variante de corte y empalme de INSP101. Como queda claro de la figura, la proteína comprende 5 exones separados. El polipéptido del exón 2nov de INSP101 y el polipéptido del exón 3nov de INSP101 son exones alternativos producidos mediante corte y empalme alternativo; la variante de corte y empalme posee el exón2 extendido (2nov) y el exón3 truncado (3nov).

El diagrama expone también los elementos estructurales secundarios principales de la hormona hipofisaria del crecimiento (GH-N)- La hormona GH-N está compuesta de cuatro hélices alfa (A, B, C y D) y de particular importancia es el "lazo A-B" que conecta la hélice A con la hélice B. El lazo A-B es un componente crítico de la superficie de interacción de GH-N que fija el receptor de la Hormona del Crecimiento (Wells JA, PNAS vol. 93, páginas 1-6 1996, "Binding in the growth hormone receptor complex"). Es evidente que la nueva variante de corte y empalme INSP101 posee restos nuevos insertados en el lazo A-B (debido a la extensión del exón 2). De modo semejante, el truncamiento del exón 3 lleva a la separación de algunos restos de GH-N en el lazo A-B. Así pues, INSP101 se diferencia principalmente de GH-N en la composición del lazo A-B, y dado que este lazo es un determinante principal en la unión al receptor de la hormona del crecimiento, es de esperar que INSP101 manifieste propiedades de unión del receptor alteradas (en términos de afinidad de unión y/o de selectividad del receptor).

La expresión "polipéptidos de INSP101" tal como se emplea en esta memoria, incluye polipéptidos que comprenden o que consisten en el polipéptido del exón 2nov de INSP101, el polipéptido del exón 3nov de INSP101, el polipéptido de los exones 2nov-3nov, contiguos, de INSP101, el polipéptido completo de INSP101, y el polipéptido maduro completo de INSP101.

Por "actúa como una hormona del crecimiento" se hace referencia a polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos o características estructurales que pueden ser identificadas como características conservadas dentro de las hormonas humanas del crecimiento., de tal modo que la actividad del polipéptido ni resulta afectada sustancialmente, perjudicialmente, en comparación con la función del polipéptido de tipo salvaje completo. Por ejemplo, pueden usarse diversos ensayos para determinar los efectos de las hormonas humanas del crecimiento sobre la unión (véase, por ejemplo, la referencia bibliográfica de Well J.A. PNAS Vol. 93, páginas 1-6, 1996), que incluye el uso de anticuerpos monoclonales para precipitar complejos 1:1 de hormona del crecimiento y receptor, y la dimerización inducida por hGH de moléculas hGHbp en solución, mediante la extinción de una marca fluorescente colocada cerca del extremo carboxilo terminal de la hGHbp (véase, Well J.A. PNAS Vol. 93, páginas 1-6, 1996). [hGHbp = dominio extracelular del receptor de GH].

Se dispone de varios ensayos que permiten detectar la actividad de las hormonas del crecimiento. Estos incluyen los siguientes ensayos endocrinológicos metabólicos:

i) Diferenciación para ensayos de adipocitos

La inhibición de la diferenciación de adipocitos es un modelo in vitro para la reducción de la masa de adipocitos que se cree que es importante para reducir la resistencia a la insulina en enfermedades tales como las diabetes y el Síndrome Ovárico Policístico (PCOS). El objetivo es identificar la proteína o proteínas que inhiben la diferenciación de pre-adipocitos a adipocitos. La línea celular 3T3-L1 de pre-adipocitos del ratón es inducida para diferenciar a adipocitos con insulina + IBMX. El descubrimiento de que la diferenciación ha sido inhibida por TNF\alpha+ ciclohexamida, se usa como testigo positivo.

ii) Absorción de glucosa tritiada (3T3 L1)

El objetivo es identificar la proteína o proteínas que estimulan la absorción de glucosa como modelo de resistencia a la insulina en la adiposis durante la diabetes o el PCOS. Los adipocitos utilizados son los pre-adipocitos 3T3-L1 del ratón que han sido diferenciados.

iii) Absorción de glucosa tritiada (adipocitos primarios humanos)

El objetivo es identificar la proteína o proteínas que estimulan la absorción de glucosa como modelo de resistencia a la insulina en la adiposis durante la diabetes o el PCOS. Se usan adipocitos primarios humanos.

iv) Absorción de glucosa tritiada (células primarias humanas de músculos esqueléticos)

El objetivo es identificar la proteína o proteínas que estimulan la absorción de glucosa como modelo de resistencia a la insulina del tejido muscular durante la diabetes o el PCOS. Células primarias humanas de músculos esqueléticos son diferenciadas en miotubos y usadas luego en el ensayo.

La invención proporciona una molécula de ácido nucleico purificada que codifica un polipéptido de la invención.

La molécula de ácido nucleico purificada puede comprender la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO:1 (que codifica el polipéptido del exón 2nov de INSP101), SEQ ID NO:3 (que codifica el polipéptido del exón 3nov de INSP101), SEQ ID NO:5 (que codifica el polipéptido de los exones 2nov-3nov contiguos de INSP101), SEQ ID NO:7 (que codifica el polipéptido completo de INSP101), o SEQ ID NO: 9 ( que codifica el polipéptido maduro, completo, de INSP101), o es un equivalente o un fragmento sobrante de una cualquiera de estas secuencias.

La molécula de ácido nucleico purificada puede consistir en la secuencia de ácido nucleico indicada en SEQ ID NO:1 (que codifica el polipéptido de exón 2nov de INSP101), SEQ ID NO:3 (que codifica el polipéptido del exón 3nov de INSP101), SEQ ID NO:5 (que codifica el polipéptido de los exones 2nov-3nov contiguos de INSP101), SEQ ID NO: 7 (que codifica el polipéptido completo de INSP101), o SEQ ID NO:9 (que codifica el polipéptido maduro, completo, de INSP101), o es un equivalente o fragmento sobrante de una cualquiera de estas secuencias.

La secuencia codificante que codifica la hormona hipofisaria humana del crecimiento, de tipo salvaje, NM_000515, está excluida específicamente del alcance de la presente invención.

Se describe una molécula de ácido nucleico purificada que se híbrida en condiciones de alta rigurosidad con una molécula de ácido nucleico de la invención.

La invención proporciona un vector, tal como un vector de expresión, que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención.

La invención proporciona una célula huésped transformada con un vector de la invención.

Se describe un ligando que se une específicamente a las hormonas del crecimiento del primer aspecto de la invención. Preferiblemente, el ligando inhibe la función de un polipéptido de la invención que es una hormona del crecimiento. Los ligandos para un polipéptido según la invención, pueden tener formas diversas, que incluyen sustratos naturales o modificados, enzimas, receptores moléculas orgánicas pequeñas tales como moléculas orgánicas pequeñas, naturales o sintéticas, de hasta 2000 Da, preferiblemente 800 Da o menos, moléculas que simulan péptidos, molécula inorgánicas, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, o imitaciones estructurales o funcionales de los antes citados.

Se describe un compuesto que es eficaz para alterar la expresión de un gen natural que codifica un polipéptido de la invención, o que regula la actividad de un polipéptido de la invención.

Un compuesto tal puede o bien aumentar (agonista) o disminuir (antagonista) el nivel de expresión del gen o la actividad del polipéptido.

De modo importante, la identificación de la función del polipéptido INSP101 permite el diseño de métodos de selección capaces de identificar compuestos eficaces para el tratamiento y/o el diagnóstico de enfermedades. Ligandos y compuestos según la invención, pueden ser identificados usando tales métodos. Estos métodos están incluidos como aspectos de la presente invención.

La invención proporciona un polipéptido de la invención o una molécula de ácido nucleico de la invención, o un vector de la invención, o un ligando de la invención, para usar en la terapia o el diagnóstico de una enfermedad en la que esté implicada la hormona humana del crecimiento. Tales enfermedades y trastornos pueden incluir trastornos reproductivos, trastornos del embarazo, tales como la enfermedad trofoblástica de la gestación, trastornos del desarrollo tales como el síndrome de Silver-Russell, trastornos del crecimiento, deficiencia de hormonas del crecimiento, la enfermedad de Cushing, trastornos endocrinos, trastornos celulares proliferativos, incluyendo neoplasmas, carcinomas, tumores hipofisarios, tumores ováricos, melanoma, tumores trofoblásticos del pulmón, tumores colorrectales, de mama, del páncreas, de cabeza y cuello, tumores trofoblásticos de la placenta, adenocarcinoma, coriocarcinoma, osteosarcoma y otros tumores sólidos; angiogénesis, trastornos proliferativos, trastornos autoinmunitarios/inflamatorios; trastornos cardiovasculares, trastornos neurológicos, dolor; trastornos metabólicos que incluyen diabetes mellitus, osteoporosis, y obesidad, caquexia, SIDA, enfermedades renales; daño pulmonar; envejecimiento; infecciones con inclusión de infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas e infección por parásitos, y otros estados patológicos. Preferiblemente, la enfermedad es una en la que están implicadas funciones endocrinas, en particular hormonas del crecimiento (véase, por ejemplo, los trabajos de Arato G., Fulop V., Degrell P. Szigetvari I. Pathol. Oncol. Res. 2000 6(4):292-4; Hitchins M.P., Stainer P., Preece M.A. y Moore GE., J. Med. Genet. 2001 Dic 38(12):810-9; Rhoton-Vlasak A., Wagner J.M., Rutgers J.L., Baergen R.N., Young R.H., Roche P.C., Plummer T.B. y Gleich G.J., Hum. Pathol. 1998 Mar. 29(3):280-8; Lovera M., Pichard C., Bernichtein S., Jeay S., Touraine P., Kelly P.A. y Goffin V., Oncogene, 2000 Sep. 28 19(41):4695-705; Savage M.O., Scommegna S., Carroll P.V., Ho J.T., Monson J.P., Besser G.M. y Grossman AB., Horm. Res. 2002 58 Suppl 1:39-43; Aimaretti G., Corneli G., Bellone S., Baffoni C., Camanni F., y Ghigo E., J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 2001 14 Suppl 5:1233-42; Berger P., Untergasser G., Hermann M., Hittmair A., Madersbacher S. y Dirnhofer S., Hum. Pathol. 1999 Oct. 30(10):1201-6; Hamilton J., Chitayat D., Blaser S., Cogen L.E., Phillips J.A., 3^{rd} y Daneman D., Am. J. Med. Genet. 1998 Nov. 2 80(2):128-32; Gonzalez.Rodriguez E., Jaramillo-Rangel G. y Barrera-Saldana H.A., Am. J. Med. Genet. 1997 Nov 12 72(4):399-402; Perez Jurado L.A., Argente J., Barrios V., Pozo J., Muñoz M.T., Hernandez M. y Francke U., J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 1997 Mar.-Abr. 10(2):185-90; Saeger W. y Lubke D., Endocr. Pathol. 1996 Spring 7(1):21-35; Conzemius M-G., Graham J.C., Haynes J.S. y Graham C.A., Am. J. Vet. Res. 2000 Jun. 61(6):646-50; Bartlett D.L., Charland S., Torosian M.H., Cancer 1994 Mar. 1 73(5).1499-504). Estas moléculas pueden ser usadas también para fabricar un medicamento para el tratamiento de tales trastornos.

Se describe un método de diagnóstico de una enfermedad de un paciente, que comprende evaluar el nivel de expresión de un gen natural que codifica un polipéptido de la invención o la actividad de un polipéptido de la invención, en un tejido de dicho paciente, y comparar dichos nivel de expresión o actividad con un nivel testigo, en el que un nivel diferente de dicho nivel testigo es indicativo de una enfermedad. Tal método se llevará a cabo, preferiblemente, in vitro. Métodos similares pueden ser usados para monitorizar el tratamiento terapéutico de la enfermedad de un paciente, en el que la alteración del nivel de expresión o de actividad de un polipéptido o de una molécula de ácido nucleico a lo largo del tiempo con respecto a un nivel testigo, es indicativo de regresión de la enfermedad.

Un método preferido para detectar polipéptidos de la invención comprende las etapas de: (a) poner en contacto un ligando, tal como un anticuerpo, del sexto aspecto de la invención, con una muestra biológica, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) detectar dicho complejo.

Existen varios métodos diferentes de tales diagnósticos, como conocerá el lector experimentado, tales como métodos de hibridación de ácidos nucleicos con sondas cortas, análisis de mutaciones puntuales, amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y métodos que utilizan anticuerpos para detectar niveles aberrantes de proteínas. Pueden utilizarse métodos similares de corto o largo plazo, para permitir el tratamiento terapéutico de una enfermedad que haya de ser monitorizada en un paciente. También se describen kits que son útiles en estos métodos de diagnóstico de enfermedades.

La invención proporciona el uso de los polipéptidos del primer aspecto de la invención, como una hormona del crecimiento o como modulador de la actividad de hormonas del crecimiento. Los usos adecuados de los polipéptidos de la invención como hormonas del crecimiento incluyen el uso como un regulador del crecimiento, metabolismo o diferenciación celular, el uso como parte de un par receptor-ligando y el uso como marcador de diagnóstico de un estado fisiológico o patológico. Como se ha citado anteriormente, la hormona del crecimiento estimula el desdoblamiento de los triglicéridos de los adipocitos. La hormona humana del crecimiento estimula asimismo el crecimiento corporal estimulando al hígado para que secrete IGF- 1. Esto, a su vez, resulta en la proliferación de condrocitos, lo que da por resultado el crecimiento óseo. La hormona del crecimiento también tiene efecto sobre el metabolismo. La administración de hormona del crecimiento es un tratamiento conocido del enanismo. Se sabe también que es usada para aumentar la producción de leche del ganado vacuno de leche y para aumentar el crecimiento de los cerdos. Todas estas utilidades pueden ser realizadas por los polipéptidos de la invención. Además, pueden utilizarse antagonistas de los polipép-
tidos de la invención para tratar la superproducción de la hormona del crecimiento, que puede dar lugar a gigantismo.

Como se ha discutido antes, pueden usarse diversos ensayos para determinar los efectos de Hormonas humanas del Crecimiento, sobre la unión (véase, por ejemplo, la referencia de Well J.A. PNAS Vol. 93, páginas 1-6. 1996), que incluye el uso de anticuerpos monoclonales para precipitar complejos 1:1 de hormona de crecimiento y receptor, y la dimerización de moléculas hGHbp inducida por hGH, en solución, mediante la extinción de una marca fluorescente colocada cerca del extremo carboxilo terminal de la hGHbp (véase la referencia de Well J.A. PNAS Vol. 93, páginas 1-6, 1996) [hGHbp = domino extracelular del receptor de GH].

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la invención, o una molécula de ácido nucleico de la invención, o un vector de la invención, o un ligando de la invención, en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona un polipéptido de la invención, o una molécula de ácido nucleico de la invención, o un vector de la invención, o un ligando de la invención, para usar en tratamientos terapéutico o de diagnóstico. Estas moléculas pueden ser utilizadas también para fabricar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad.

La invención proporciona un método de tratamiento de una enfermedad de un paciente, que comprende administrar al paciente un polipéptido de la invención, o una molécula de la invención, o un vector de la invención, o un ligando de la invención.

Para enfermedades en las que la expresión de un gen natural que codifica un polipéptido de la invención, o en las que la actividad de un polipéptido de la invención, es mas baja en un paciente enfermo en comparación con el nivel de expresión o actividad de un paciente sano, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico o el ligando que se administra al paciente debe ser un agonista. Al revés, para enfermedades en las que la expresión del gen natural o la actividad del polipéptido es mayor en un paciente enfermo en comparación con el nivel de expresión o actividad de un paciente sano, el polipéptido, la molécula de ácido nucleico o el ligando que se administra al paciente debe ser un antagonista. Ejemplos de tales antagonistas incluyen moléculas de ácidos nucleicos antisentido, ribozimas y ligandos tales como anticuerpos.

Se describen animales no hunos transgénicos o producidos que han sido transformados para expresar niveles superiores, inferiores o ausentes, de un polipéptido de la invención. Tales animales transgénicos son modelos muy útiles para el estudio de enfermedades y también pueden ser usados en regímenes de selección, para identificar compuestos eficaces para el tratamiento o el diagnóstico de tales enfermedades.

Un resumen de técnicas y procedimientos operatorios estándar que pueden emplearse con objeto de utilizar la invención, se proporciona más adelante en esta memoria. Ha de entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reactivos particulares que se describen Ha de entenderse también, que la terminología utilizada en esta memoria tiene por finalidad solamente describir realizaciones particulares y no ha de interpretarse que esta terminología pudiera limitar el alcance de la presente invención. La extensión de la invención está limitada. solamente, por los términos de las reivindicaciones que se acompañan.

En esta memoria descriptiva se emplean abreviaturas estándar para nucleótidos y aminoácidos.

La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, tecnología de DNA recombinante, e inmunología, que están dentro de la experiencia de los expertos en la materia.

Tales técnicas están explicadas completamente en la bibliografía científica. Ejemplos de textos de consulta particularmente adecuados, incluyen los siguientes: Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); DNA Cloning, Volúmenes I y II (D.N Glover, compilador, 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, compilador, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hanes and S.J. Higgins, compiladores, 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, compiladores, 1984); Animal Cell Culure (R.I. Freshney compilador, 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRI, Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especialmente los volúmenes 154 y 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller y M.P. Calos, compiladores, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer y Walker, compiladores, 1987, Academic Press, Londres); Scopes, (1987) Protein Purification; Principles and Practice, Segunda Edición (Springer Verlag, N.Y.); y Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV (D.M.. Weir y C.C.Blackwell, compiladores, 1986).

Tal como se usa en esta memoria, el término "polipéptido" incluye cualquier péptido o proteína que comprende dos o más aminoácidos unidos uno a otro mediante uniones peptídicas o uniones peptídicas modificadas, es decir, isoésteres peptídicos. Este término se refiere tanto a cadenas cortas (péptidos y oligopéptidos) como a cadenas largas (proteínas).

El polipéptido de la presente invención puede estar en forma de una proteína madura o puede ser una pre-, pro- o prepro-proteína que puede ser activada por escisión de la parte pre-, pro- o prepro- produciendo un polipéptido maduro activo. En tales polipéptidos la secuencia pre-, pro- o prepro- puede ser una secuencia conductora o secretora o puede ser una secuencia que se emplea para purificar la secuencia del polipéptido maduro.

El polipéptido que se describe puede formar parte de una proteína de fusión. Por ejemplo, con frecuencia es ventajoso incluir una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden contener secuencias secretoras o conductoras, pro-secuencias, secuencias que ayudan a la purificación, o secuencias que confieren mayor estabilidad proteínica, por ejemplo, durante la producción de recombinantes. Alternativa o adicionalmente, el polipéptido maduro puede ser fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la semi-vida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol).

Los polipéptidos pueden contener aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes, modificados o bien mediante procesos naturales tales como tratamiento posterior a la traducción, o bien técnicas químicas de modificación, bien conocidas en la técnica. Entre las modificaciones conocidas que pueden estar presentes comúnmente en los polipéptidos, están la glicosilación, la fijación de lípidos, la sulfación, la carboxilación-gamma, por ejemplo de restos de ácido glutámico, la hidroxilación y la ribosilación de ADP. Otras modificaciones potenciales incluyen acetilación, acilación, amidificación, fijación covalente de flavina, fijación covalente de un resto hemo, fijación covalente de un nucleótido o un derivado de un nucleótido, fijación covalente de un derivado de un lípido, fijación covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, formación de anclaje de GPI, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, adición de aminoácidos a proteínas por medio de transferencia de RNA, tales como arginilación y ubiquitina-
ción.

Las modificaciones pueden ocurrir en cualquier lugar de un polipéptido, incluyendo la cadena principal del polipéptido, las cadenas laterales de aminoácidos y el extremo carboxilo o amino. En efecto, el bloqueo de los extremos carboxilo o amino de un polipéptido, o ambos, mediante una modificación covalente es común en polipéptidos naturales y sintéticos.

Las modificaciones que tienen lugar en un polipéptido con frecuencia son función de cómo se ha obtenido el polipéptido. Para polipéptidos obtenidos recombinantemente, la naturaleza y extensión de las modificaciones vendrá determinada, en gran parte, por la capacidad de la modificación posterior a la traducción de la célula huésped particular y de las señales de modificación presentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido en cuestión. Por ejemplo, las estructuras de glicosilación varían entre tipos diferentes de células huésped.

Los polipéptidos de la presente invención pueden prepararse de cualquier modo adecuado. Tales polipéptidos incluyen polipéptidos naturales aislados (por ejemplo purificados partiendo de cultivos celulares), polipéptidos producidos recombinantemente (incluyendo proteínas de fusión), polipéptidos producidos por síntesis o polipéptidos que han sido obtenidos mediante una combinación de estos métodos.

Polipéptidos funcionalmente equivalentes pueden ser polipéptidos homólogos con los polipéptidos INSP101. Se dice que dos polipéptidos son "homólogos", tal como el término se usa en esta memoria, cuando la secuencia de uno de los polipéptidos posee un alto grado, suficiente, de identidad o semejanza con la secuencia del otro polipéptido. "Identidad" indica que en una posición particular de las secuencias alineadas, el resto de aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Semejanza" indica que, en una posición particular de las secuencias alineadas, el resto de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Los grados de identidad y de semejanza pueden ser calculados fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., compilador, Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.., compilador, Academic Press, Nueva York, 1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., compiladores, Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M y Devereux, J., compiladores, M Stockton Press, Nueva York, 1991).

Por consiguiente, los polipéptidos homólogos incluyen variantes biológicas naturales (por ejemplo, variantes alélicas o variaciones geográficas existentes dentro de las especies desde las que los polipéptidos han sido derivados) y mutantes (tales como mutantes que contienen sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos) de los polipéptidos INSP101. Tales mutantes pueden incluir polipéptidos en los que uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un resto de aminoácido conservado) y tal resto de aminoácido sustituido puede ser o no ser codificado por el código genético. Son típicas sustituciones tales entre Ala,Val, Leu e Ile; entre Ser y Thr; entre los restos ácidos Asp y Glu; entre Asn y Gln; entre los restos básicos Lys y Arg; o entre los restos aromáticos Phe y Tyr. Son particularmente preferidas las variantes en las que varios, es decir, entre 5 y 10, 1 y 5, 1 y 3, 1 y 2, o, justamente 1, aminoácidos han sido sustituidos, delecionados o añadidos, en cualquier combinación. Son especialmente preferidas las sustituciones, adiciones y deleciones silenciosas, que no alteren las propiedades y las actividades de la proteína. Asimismo, son especialmente preferidas a este respecto las sustituciones conservativas. Tales mutantes incluyen también polipéptidos en los que uno o más de los restos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente.

Típicamente, se considera que una identidad entre dos polipéptidos mayor del 30%, es una indicación de equivalencia funcional. De preferencia, los polipéptidos funcionalmente equivalentes descritos poseen un grado de identidad de secuencias con el polipéptido INSP101, o con fragmentos activos del mismo, mayor del 90% en toda la longitud de la secuencia del INSP101. Los polipéptidos más preferidos tienen grados de identidad de más del 92%, 95% ó 99% en toda la longitud de la secuencia del INSP101, respectivamente.

Los polipéptidos funcionalmente equivalentes descritos pueden ser también polipéptidos que han sido identificados usando una o más técnicas de alineación estructural. Por ejemplo, puede usarse la tecnología Inpharmatica Genome Threader^{TM} que forma un aspecto de las herramientas de búsqueda utilizadas para generar la base de datos de investigación Biopendium, (véase la Solicitud de Patente Internacional en tramitación junto con la presente, No. PCT/GB01/01105), para identificar polipéptidos de función actualmente desconocida que, al tiempo que tienen baja identidad de secuencia en comparación con el polipéptido INSP101, se predice que son proteínas de hormonas del crecimiento, utilizando dicho método un polipéptido del primer aspecto de la invención, en virtud de compartir una homología estructural importante con las secuencia del polipéptido INSP101. Por "homología estructural importante" se entiende que la tecnología Inpharmatica Genome Threader^{TM} predice dos proteínas que comparten homología estructural con una certeza de 10% por lo menos, y superior.

Los polipéptidos descritos incluyen también fragmentos de los polipéptidos INSP101 y fragmentos de los equivalentes funcionales de los polipéptidos INSP101, con tal que esos fragmentos retengan actividad de hormonas del crecimiento o que posean un determinante antigénico en común con los polipéptidos INSP101.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "fragmento" alude a un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que es la misma que parte, pero no toda, de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos INSP101 o de uno de sus equivalentes funcionales. Los fragmentos deben comprender al menos n aminoácidos consecutivos procedentes de la secuencia y, dependiendo de la secuencia particular, n es, preferiblemente, 7 ó más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó más). Los fragmentos pequeños pueden formar un determinante antigénico.

Los fragmentos de los polipéptidos INSP101 completos pueden consistir en combinaciones de 2 ó 3 de las secuencias de exones contiguos de las secuencias de los polipéptidos INSP101, respectivamente. Por ejemplo, tales combinaciones incluyen los exones 1 y 2, 2 y3 ó 1, 2 y 3.

Tales fragmentos pueden ser "independientes" es decir, no parte de otros aminoácidos o polipéptidos ni fusionados a ellos, o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido mayor del que forman una parte o una región. Cuando está comprendido dentro de un polipéptido mayor, el fragmento de la invención forma, lo más preferiblemente, una región continua única. Por ejemplo, ciertas realizaciones preferidas se refieren a un fragmento que posee una región pre- y/o pro-polipéptidica fusionada al extremo amino terminal del fragmento, y/o una región adicional fusionada al extremo carboxilo terminal del fragmento. No obstante, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro un polipéptido mayor único.

Los polipéptidos de la presente invención o sus fragmentos inmunógenos (que comprenden al menos un determinante antigénico) pueden ser usados para generar ligandos, tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, que son inmunoespecíficos para los polipéptidos. Tales anticuerpos pueden ser empleados para aislar o identificar clones que expresan los polipéptidos, o para purificar los polipéptidos por cromatografía de afinidad. Los anticuerpos pueden emplearse también como ayudas de diagnóstico o terapéuticas, entre otras aplicaciones, como será evidente para el lector experimentado.

El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos poseen una afinidad sustancialmente mayor para los polipéptidos de la invención que su afinidad para otros polipéptidos afines de la técnica anterior. Tal como se emplea en esta memoria, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas intactas así como a sus fragmentos, tales como Fab, F(ab')2 y Fv, que son capaces de unirse al determinante antigénico en cuestión. Tales anticuerpos, por tanto, se unen a los polipéptidos del primer aspecto de la invención.

Por "afinidad sustancialmente mayor" se significa que existe un aumento mensurable de la afinidad para un polipéptido de la invención en comparación con la afinidad para hormonas humanas del crecimiento conocidas.

Preferiblemente, la afinidad es por lo menos 1,5-veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 100 veces, 10^{3} veces, 10^{4} veces. 10^{5} veces, 10^{6} veces o mayor para un polipéptido de la invención que para proteínas secretadas conocidas tales como hormonas del crecimiento.

Si se desean anticuerpos policlonales, un mamífero seleccionado tal como un ratón, un conejo, una cabra o un caballo, puede ser inmunizado con un polipéptido. El polipéptido utilizado para inmunizar el animal puede ser obtenido mediante tecnología del DNA recombinante o puede ser sintetizado químicamente. Si se desea, el polipéptido puede ser conjugado a una proteína de soporte. Los soportes usados comúnmente en los que los polipéptidos pueden acoplarse químicamente incluyen albúmina de suero bovino, tiroglobulina y hemocianina de lapa. El polipéptido acoplado se usa después para inmunizar el animal. Se recoge suero procedente del animal inmunizado y se trata según procedimientos operatorios conocidos, por ejemplo, mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Anticuerpos monoclonales para los polipéptidos del primer aspecto de la invención pueden ser producidos también fácilmente por los expertos en la técnica. La metodología general para la obtención de anticuerpos monoclonales que utiliza la tecnología de hibridomas, es bien conocida (véase, por ejemplo, Kohler, G., y Milstein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., 77-96 en Monoclonal Antobodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Grupos de anticuerpos monoclonales producidos contra los polipéptidos de la invención, pueden ser seleccionados según diversas propiedades, es decir, por isotipo, epítopo, afinidad, etc. Los anticuerpos monoclonales son particularmente útiles para la purificación de los polipéptidos individuales contra los que están dirigidos. Alternativamente, genes que codifican los anticuerpos monoclonales de interés pueden ser aislados a partir de hibridomas, por ejemplo, mediante procesos de PCR conocidos en la técnica, y clonados y expresados en vectores apropiados.

También pueden utilizarse anticuerpos quiméricos en los que regiones variables no humanas están unidas o fusionadas a regiones constantes humanas (véase, por ejemplo, la publicación de Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439, 1987).

El anticuerpo puede ser modificado para hacerle menos inmunógeno en un individuo, por ejemplo, por humanización (véase Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 34181 (1991); y Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)). La expresión "anticuerpo humanizado" tal como se emplea en esta memoria, alude a moléculas de anticuerpos en las que los aminoácidos de la región de determinación de la complementariedad (CDR) y otros aminoácidos seleccionados de los dominios variables de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo de un donante no humano, han sido sustituidos en lugar de los aminoácidos equivalentes de un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado se asemeja estrechamente, por tanto, a un anticuerpo humano, pero tiene la aptitud de unión del anticuerpo del donante.

En otra alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo "biespecífico", es decir, un anticuerpo que posee dos dominios diferentes de unión antigénica, estando dirigido cada uno de los dominios contra un epítopo diferente.

La tecnología de presentación fágica puede ser utilizada para seleccionar genes que codifican anticuerpos con actividades de unión hacia los polipéptidos de la invención o bien partiendo de repertorios de genes V amplificados por PCR, de linfocitos procedentes de seres humanos, seleccionados por la posesión de anticuerpos importantes, o bien procedentes de colecciones sencillas (McCafferty, J. et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks, J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). La afinidad de estos anticuerpos puede mejorarse también mediante mezcla de cadenas (Clackson, T., et al., (1991) Nature 352, 624-628).

Los anticuerpos generados mediante las técnicas anteriores, tanto si son policlonales como monoclonales, poseen utilidad adicional dado que pueden ser empleados como reactivos en inmunoensayos, radioinmunoensayos (RIA) o ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). En estas aplicaciones, los anticuerpos pueden ser marcados con un reactivo detectable analíticamente, tal como un radioisótopo, una molécula fluorescente o una enzima.

Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas de la invención son aquellas que codifican una secuencia polipeptídica tal como se indica en SEQ ID NO:8, ó SEQ ID NO:10, y polipéptidos funcionalmente equivalentes. También se describen moléculas de ácidos nucleicos que codifican una secuencia polipeptídica tal como se indica en SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO.6 y polipéptidos funcionalmente equivalentes. Estas moléculas de ácidos nucleicos pueden ser utilizadas en los métodos y aplicaciones que aquí se describen. Las moléculas de ácidos nucleicos comprenden, preferiblemente, al menos n nucleótidos consecutivos procedentes de las secuencias descritas en esta memoria, en las que, dependiendo de la secuencia particular, n es 10 ó más (por ejemplo, 12. 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 ó más).

Las moléculas de ácidos nucleicos incluyen también secuencias que son complementarias de las moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente (por ejemplo, con fines de antisentido o de sondas).

Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención pueden estar en forma de RNA, tal como mRNA, o en forma de DNA, incluyendo, por ejemplo, cDNA, DNA sintético o DNA genómico. Tales moléculas de ácidos nucleicos pueden ser obtenidas por clonación, mediante técnicas de síntesis químicas o por una combinación de ambas. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser preparadas, por ejemplo, mediante síntesis químicas usando técnicas tales como síntesis química de fosforoamidita de fase sólida, partiendo de genotecas, genómicas o de cDNA, o por separación desde un organismo. Las moléculas de RNA pueden generarse, generalmente, mediante las transcripción in vitro o in vivo de secuencias de DNA.

Las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser de doble cadena o de una sola cadena. El DNA de una sola cadena puede ser la cadena codificante, conocida también como la cadena en orientación sentido, o puede ser la cadena no codificante, a la que se alude también como la cadena anti-sentido.

La expresión "molécula de ácidos nucleicos" incluye también análogos de DNA y RNA, tales como aquellos que contienen cadenas principales modificadas, y ácidos nucleicos peptídicos (PNA). El término "PNA", tal como se emplea en esta memoria, alude a una molécula antisentido o un agente antigénico que comprende un oligonucleótido de una longitud de cinco nucleótidos por lo menos enlazado a una cadena principal peptídica de restos de aminoácidos que, preferiblemente, termina en lisina. La lisina terminal confiere solubilidad a la composición. Los PNAs pueden ser pegilados para ampliar su lapso de vida en una célula, donde ellos unen preferentemente DNA y RNA de una sola cadena, complementarios, y detienen el alargamiento del transcrito (Nielsen et al., (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).

La molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de esta invención puede ser idéntica a la secuencia codificante de una o más de las moléculas de ácidos nucleicos aquí descritas.

Estas moléculas pueden tener también una secuencia diferente que, como resultado de la degeneración del código genético, codifican un polipéptido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 ó SEQ ID NO:10.

Tales moléculas de ácidos nucleicos pueden incluir, aun cuando no se limita a ellas, la secuencia codificante para el polipéptido maduro por sí mismo; la secuencia codificante para el polipéptido maduro y secuencias codificantes adicionales, tales como las que codifican una secuencia conductora o secretora, tal como una secuencia pro-, pre- o prepro-polipéptídica; la secuencia codificante del polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificantes adicionales anteriormente citadas, junto con otras secuencias no codificantes, adicionales, que incluyen secuencias de 5' y 3' no codificantes, tales como las secuencias transcritas, sin traducir, que desempeñan un papel importante en la transcripción (incluyendo señales de terminación), ribosomas de unión y estabilidad de mRNA. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden incluir también secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales, tales como las que proporcionan funcionalidades adicionales.

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Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden codificar también los fragmentos o los equivalentes funcionales de los polipéptidos y fragmentos de la invención. Tal molécula de ácidos nucleicos puede ser una variante natural tal como una variante alélica natural, o la molécula puede ser una variante que no se conozca que es natural. Tales variantes no naturales de la molécula de ácidos nucleicos pueden ser obtenidas mediante técnicas de mutagénesis, que incluyen las aplicadas a moléculas de ácidos nucleicos, células u organismos.

A este respecto, entre las variantes se encuentran las variantes que difieren de las moléculas de ácidos nucleicos citadas por sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos. Las sustituciones, deleciones o inserciones pueden implicar a uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en las regiones codificantes, en las regiones no codificantes o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos conservativas o no conservativas.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden ser obtenidas también usando métodos conocidos en general en la técnica, por una variedad de motivos, que incluyen la modificación de la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico (el polipéptido). Las mezclas de DNA por fragmentación aleatoria y reasociación por PCR de fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos, están incluidas como técnicas que pueden ser usadas para formar las secuencias de nucleótidos. Puede usarse mutagénesis dirigida al sitio para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los esquemas de glicosilación, cambiar la preferencia de codones, producir variantes de corte y empalme, introducir mutaciones y así sucesivamente.

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la invención, pueden ser ligadas a una secuencia heteróloga de modo que la molécula de ácido nucleico combinada codifique una proteína de fusión. Por ejemplo, seleccionar colecciones de péptidos y determinar inhibidores de la actividad del polipéptido, puede ser útil para expresar, utilizando una molécula de ácido nucleico combinada tal, una proteína de fusión que puede ser reconocida por un anticuerpo de que se disponga en el comercio. También puede prepararse una proteína de fusión que contenga un sitio de escisión situado entre la secuencia del polipéptido y la secuencia de una proteína heteróloga, de modo que el polipéptido puede ser escindido y purificado partiendo de la proteína heteróloga.

Se describen también moléculas antisentido que son parcialmente complementarias de moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la presente invención y que, por tanto, se hibridan con las moléculas de ácidos nucleicos codificantes (Hibridación). Dichas moléculas antisentido, tales como oligonucleótidos, pueden diseñarse para reconocer, unirse específicamente y evitar la transcripción de una molécula de ácido nucleico diana que codifica un polipéptido de la invención, como es bien sabido por los expertos en la técnica (véanse, por ejemplo, las publicaciones de Cohen, J.S., Trends in Pharm Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J. Neurochem. 56, 560 (1991): Lee et al., Nuceic Acids Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, 456 (1988); Dervan et al., Science, 1360 (1991).

El término "hibridación" tal como se emplea en esta memoria, se refiere a la asociación de dos moléculas de ácidos nucleicos, una con otra, mediante puentes de hidrógeno. Típicamente. una molécula estará fijada a un soporte sólido y la otra estará libre, en solución. Luego, las dos moléculas pueden ponerse en contacto, una con otra, en condiciones que favorezcan la formación de los puentes de hidrógeno. Los factores que afectan a este método de unión incluyen: el tipo y el volumen del disolvente, la temperatura de reacción, el tiempo de hibridación, la agitación, agentes que bloquean la fijación inespecífica de la molécula de la fase líquida al soporte sólido (reactivo de Denhardt o BLOTTO), la concentración de las moléculas, el uso de compuestos que aumentan el grado de asociación de las moléculas (sulfato de dextrano o polietilenglicol) y la rigurosidad de las condiciones del lavado que sigue a la hibridación (véase, Sambrook et al [referencia bibliográfica anterior].

La inhibición de la hibridación de una molécula completamente complementaria con una molécula diana, puede examinarse usando un ensayo de hibridación, tal como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de Sambrook et al [referencia anterior]. Una molécula sustancialmente homóloga puede competir e inhibir después la unión de una molécula completamente homóloga con la molécula diana bajo diversas condiciones de rigurosidad, como enseña la publicación de Wahl, G.M. y S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) y de Kimmel, A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511).

"Rigurosidad" alude a las condiciones de una reacción de hibridación que favorecen la asociación de moléculas muy similares sobre la asociación de moléculas que se diferencian. Las condiciones de hibridación de rigurosidad alta se definen como incubación durante la noche a 42ºC en una disolución que comprende formamida al 50%, SSC 5X (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), solución de Denhadrt 5x, sulfato de dextrano al 10%, y DNA de esperma de salmón sometida a cizalladura, desnaturalizada, 20 microgramos/ml, seguido de lavado de los filtros con SSC 0,1X a 65ºC aproximadamente. Las condiciones de hibridación de rigurosidad baja implican que la reacción de hibridación sea llevada a cabo a 35ºC (véase la referencia bibliográfica de Sambrook et al. citada). Preferiblemente, las condiciones usadas para la hibridación son la de rigurosidad alta.

También se describe un procedimiento para detectar una molécula de ácido nucleico de la invención, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una sonda nucleica según la invención con una muestra biológica, en condiciones de hibridación para formar dúplex; y (b) detectar cualquiera de los dúplex que se hayan formado.

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Como se discute adicionalmente más adelante en relación con los ensayos que pueden ser utilizados según la invención, puede usarse una molécula de ácido nucleico según se ha descrito antes, como sonda de hibridación para RNA, cDNA o DNA genómico, con objeto de aislar cDNAs completos y clones genómicos que codifican los polipéptidos INSP101 y aislar cDNA y clones genómicos de genes homólogos u ortólogos que posean una alta semejanza de secuencias con el gen que codifica este polipéptido.

A este respecto pueden ser utilizados los procedimientos siguientes, entre otros conocidos en la técnica, y que se discuten más adelante con fines de ilustración. Métodos de secuenciación y análisis de DNA son bien conocidos y, en general, están disponibles en la técnica y, sin duda, pueden ser usados para poner en práctica muchas de las realizaciones de la invención que se discuten en esta memoria. Tales métodos pueden emplear enzimas tales como el fragmento de Klenow de DNA polimerasa I, Sequenase (US Biochemical Corp, Cleveland, OH), polimerasa Taq(Perkin Elmer), polimerasa T7 termoestable (Amersham, Chicago, Il), o combinaciones de polimerasas y exonucleasas de corrección de lectura tales como las que se encuentran en el Sistema de Amplificación ELONGASE comercializado por Gibco/BRL (Gaithersburg, MD). Preferiblemente, el proceso de secuenciación puede ser automatizado utilizando instrumentos tales como el Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), el Peltier Thermal Cycler (PTC200); MJ Research, Watertown, MA) y el ABI Catalyst y los Secuenciadores de DNA 373 y 377 (Perkin Elmer).

Un método para aislar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido con una función equivalente a la de los polipéptidos INSP101, es tratar una genoteca, genómica o de cDNA, con una sonda natural o diseñada artificialmente, usando procedimientos operatorios estándar reconocidos en la técnica (véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (compiladores). Greene Publishing Association and John Wiley Interscience, Nueva York, 1989, 1992). Son sondas especialmente útiles, las sondas que comprenden por lo menos 15, preferiblemente por lo menos 30 y más preferiblemente, por lo menos 50, bases contiguas que corresponden a secuencias de ácidos nucleicos o son complementarias de ellas, procedentes del gen codificante apropiado (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 ó SEQ ID NO:9). Tales sondas pueden ser marcadas con un reactivo detectable analíticamente para facilitar su identificación. Los reactivos útiles incluyen, aun cuando no se limita a ellos, radioisótopos, colorantes fluorescentes y enzimas, capaces de catalizar la formación de un producto detectable. Usando estas sondas, los expertos en la materia son capaces de aislar copias complementarias de polinucleótidos genómicos de DNA, cDNA o RNA que codifican proteínas de interés procedentes de origen humano, de mamíferos o de otros animales, y seleccionar tales sondas por secuencias afines, por ejemplo, por miembros adicionales de la familia, tipo y/o subtipo.

En muchos casos, las secuencias de cDNA aisladas pueden estar incompletas, ya que la región que codifica el polipéptido puede estar acortada, normalmente en el extremo 5'. Se dispone de varios métodos para obtener cDNAs completos, o extender cDNAs cortos. Tales secuencias pueden ser extendidas utilizando una secuencia parcial de nucleótidos y empleando diversos métodos conocidos en la técnica para detectar secuencias situadas aguas arriba tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, un método que puede ser empleado está basado en el método de Amplificación Rápida de Extremos de cDNA (RACE; véase, por ejemplo, la publicación de Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1988).Modificaciones recientes de esta técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon^{TM} (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de cDNAs más largos. Una técnica ligeramente diferente, denominada PCR de "sitio de restricción", utiliza cebadores universales para recuperar una secuencia de ácidos nucleicos desconocida adyacente a un lugar conocido (Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). También puede usarse PCR invertida para amplificar o extender secuencias usando cebadores divergentes basándose en una región conocida (Triglia, T. et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186).. Otro método que puede ser usado es el de PCR de captura que implica amplificación por PCR de fragmentos de fragmentos de DNA adyacentes a una secuencia conocida de DNA cromosómico artificial humano y de levadura (Lagerstrom, M. et al. (1991) PCR Methods Applic., 1, 111-119). Otro método que puede ser usado para recuperar secuencias desconocidas es el de Parker, J.D. et al, (1991); Nucleic Acids Res. 19:3055-3060). Adicionalmente, pueden usarse PCR, cebadores anidados, y bibliotecas PromoterFinder^{TM} para recorrer DNA genómico (Clontech, Palo Alto, CA). Este proceso evita la necesidad de explorar genotecas y colecciones y es útil para encontrar uniones intrón/exón.

Cuando se seleccionan cDNAs completos, es preferible utilizar genotecas que hayan sido seleccionadas por tamaños para incluir cDNAs más largos. Asimismo, son preferibles genotecas preparadas al azar dado que pueden contener más secuencias que contienen las regiones 5' de genes. El uso de una genoteca obtenida aleatoriamente puede ser especialmente preferible para situaciones en las que una colección de oligo d(T) no proporciona un cDNA completo. Las genotecas genómicas pueden ser útiles para la extensión de secuencias en regiones reguladoras de 5' sin transcribir.

También se describe el uso de moléculas de ácido nucleicos para la localización de cromosomas. En esta técnica, una molécula de ácido nucleico es especialmente considerada diana para una posición particular sobre un cromosoma humano individual y pueda hibridarse con ella. La elaboración de mapas de secuencias relevantes de cromosomas según la presente invención, es una etapa importante en la correlación confirmatoria de aquellas secuencias con la enfermedad asociada a un gen. Una vez ha sido elaborado el mapa de la secuencia para una posición cromosómica precisa, las posición física de la secuencia sobre el cromosoma puede ser correlacionada con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en la publicación de V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (que puede obtenerse "on-line" a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library). Las relaciones entre genes y enfermedades que han sido mapeadas para la misma región cromosómica son identificadas después mediante análisis de ligamiento. (coherencia de genes físicamente adyacentes). Esto proporciona una información valiosa a los investigadores que buscan genes de enfermedades usando clonación posicional u otras técnicas de descubrimiento de genes. Una vez la enfermedad o el síndrome ha sido localizado toscamente mediante ligamiento genético para una región genómica particular, cualquier secuencia que mapea tal zona puede representar genes asociados o reguladores para investigaciones posteriores. La molécula de ácido nucleico puede ser usada también para detectar diferencias en la posición cromosómica debido a translocación, inversión, etc. entre individuos normales, portadores o afectados.

Las moléculas de ácidos nucleicos son, asimismo, valiosas para localización de tejidos. Tales técnicas permiten determinar estructuras de expresión del polipéptido en tejidos mediante la detección de los mRNAs que los codifican. Estas técnicas incluyen técnicas de hibridación in situ y técnicas de amplificación de nucleótidos, tales como PCR. Los resultados de estos estudios proporcionan una indicación de las funciones normales del polipéptido en el organismo. Además, estudios comparativos de la estructura normal de expresión de mRNAs con la de mRNAs codificados por un gen mutante, proporcionan percepciones valiosas del papel de polipéptidos mutantes en la enfermedad. Tal expresión inapropiada puede ser de naturaleza temporal, espacial o cuantitativa.

Enfoques de silenciación de genes pueden llevarse a cabo también para regular en descenso la expresión endógena de un gen que codifica un polipéptido de la invención. La interferencia de RNA (RNAi) (Elbashir, SM et al., Nature 2001, 411, 494-498), es un método de silenciación génica posterior a a transcripción, específico de la secuencia, que puede ser empleado. Oligonucleótidos cortos de dsRNA son sintetizados in vitro e introducidos en una célula. La unión específica de la secuencia de estos oligonucleótidos dsRNA desencadena la degradación de mRNA diana, reduciendo o suprimiendo la expresión de la proteína diana.

La eficacia del enfoque de silenciación génica antes determinado, puede ser verificada mediante la medida de la expresión del polipéptido (Por ejemplo, por transferencia Western), y al nivel de RNA usando metodologías basadas en TaqMan.

Los vectores de la presente invención comprenden moléculas de ácidos nucleicos de la invención y pueden ser vectores de clonación o de expresión. Las células huésped de la invención, que pueden ser transformadas, transfectadas o transducidas con los vectores de la invención, pueden ser procarióticas o eucarióticas.

Los polipéptidos de la invención pueden ser preparados en forma recombinante por expresión de sus moléculas de ácidos nucleicos codificantes en vectores contenidos dentro de una célula huésped. Tales métodos de expresión son bien conocidos por los expertos en la técnica y muchos han sido descritos con detalle por Sambrook et al (referencia citada) y Fernandez y Hoeffler (1998, compiladores. "Gene expression systems, Using nature for the art of expression". Academic Press, Dan Diego, Londres, Boston, Nueva York, Sydney, Tokio, Toronto).

En general, puede usarse cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar moléculas de ácidos nucleicos y producir un polipéptido en el hospedante requerido. La secuencia de nucleótidos apropiada puede ser insertada en un sistema de expresión mediante cualquiera de una diversidad de técnicas rutinarias bien conocidas, tales como, por ejemplo, las descritas por Sambrook et al., (referencia citada). En general, el gen codificante puede ser colocado bajo el control de un elemento de control tal como un promotor, sitio de unión ribosómico (para expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de modo que la secuencia de DNA que codifica el polipéptido deseado es transcrita en RNA en la célula huésped transformada.

Los ejemplos de sistemas de expresión adecuados incluyen, por ejemplo, sistemas cromosómicos, episomales y derivados de virus, incluyéndose, por ejemplo, vectores que derivan de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, transponsones, episomas de levaduras, elementos de inserción, elementos cromosómicos de levaduras, virus tales como baculovirus, papovavirus tales como el SV40, virus vaccinia, adenovirus, poxvirus aviares, virus de la pseudo-rabia y retrovirus, o sus combinaciones, tales como los que derivan de plásmidos y elementos genéticos de bacteriófagos, incluyendo cósmidos y fagémicos. También pueden emplearse cromosomas humanos artificiales (HACs) para proporcionar fragmentos de DNA mayores que pueden estar contenidos y ser expresados en un plásmido.

Los sistemas de expresión particularmente adecuados incluyen microorganismos tales como bacterias transformadas con un bacteriófago recombinante, vectores de expresión de DNA plasmídicos o cósmidos, levaduras transformados con vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo baculovirus), sistemas de células vegetales transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV, el virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales. También pueden emplearse sistemas de traducción sin células.

La introducción de moléculas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la presente invención en células huésped, puede efectuarse mediante métodos que se describen en muchos manuales estándar de laboratorio, tales como los de Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook et al. (referencia citada). Los métodos particularmente adecuados incluyen transfección con fosfato de calcio, transfección mediada con DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección mediada con lípidos catiónicos, electroporación, transducción, carga raspadora, introducción balística o infección (véanse las publicaciones de Sambrook et al., 1989 (referencia citada); Ausubel et al., 1991 (referencia citada); Spector, Goldman and Leinwald, 1998). En las células eucarióticas los sistemas de expresión pueden ser o bien transitorios (por ejemplo, episomales) o bien permanentes (integración cromosómica), según las necesidades del sistema.

La molécula de ácido nucleico codificante puede incluir o no una secuencia que codifique una secuencia de control, tal como un péptido señal o una secuencia conductora, según se desee, por ejemplo, para la secreción del polipéptido traducido en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el medio ambiente extracelular. Estas señales pueden ser endógenas para el polipéptido o pueden ser señales heterólogas. Las secuencias conductoras pueden ser separadas por el hospedante bacteriano en un tratamiento posterior a la traducción.

Además de las secuencias de control, puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan regular la expresión del polipéptido con relación al crecimiento de la célula huésped. Son ejemplos de secuencias reguladoras aquellas que causan que la expresión de un gen aumente o disminuya en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador o dependiente de varias temperaturas o condiciones metabólicas. Son secuencias reguladoras aquellas regiones del vector sin traducir, tales como intensificadores, promotores y regiones 5' y 3' sin traducir. Esas secuencias interaccionan con proteínas celulares del hospedante llevando a cabo la transcripción y la traducción. Tales secuencias reguladoras pueden variar en su resistencia y especificidad. Dependiendo del sistema vector y del hospedante utilizados, puede usarse cualquier número de elementos adecuados de transcripción y de traducción, con inclusión de promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se lleva a cabo la clonación en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como el promotor híbrido lacZ del fagémido Bluescript (Stratagene, LaJolla, CA) o el plásmido pSportl^{TM} (Gibco BRL) y semejantes. El promotor poliédrico de baculovirus puede ser usado en células de insecto. Los promotores o intensificadores obtenidos de los genomas de células vegetales (por ejemplo, genes de choque térmico, RUBISCO y de proteínas de almacenamiento) o que proceden de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias conductoras), pueden ser clonados en el vector. En sistemas de células de mamífero, son preferibles promotores procedentes de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de la secuencia, pueden usarse vectores basados en SV40 o EBV, con un marcador seleccionable apropiado.

Se construye un vector de expresión para que la secuencia codificante de ácido nucleico, particular, esté situada en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, siendo tal el posicionamiento y orientación de la secuencia codificante con respecto a las secuencias reguladoras que la secuencia codificante es transcrita bajo el "control" de las secuencias reguladoras, es decir, la RNA polimerasa que se une a la molécula de DNA en las secuencias control transcribe la secuencia codificante. En algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de modo que pueda unirse a las secuencias control con la orientación apropiada, es decir, manteniendo el marco de lectura.

Las secuencias control y otras secuencias reguladoras pueden ligarse a la secuencia codificante de ácido nucleico antes de insertar en un vector. Alternativamente, la secuencia codificante puede ser clonada directamente en un vector de expresión que ya contenga las secuencias control y un sitio de restricción apropiado.

Para la producción a largo plazo, con alto rendimiento, de un polipéptido recombinante, se prefiere una expresión estable. Por ejemplo, pueden transformarse líneas celulares que expresan de modo estable el polipéptido de interés, usando vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación virales y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable sobre el mismo o sobre un vector separado. Después de la introducción del vector, pueden dejarse crecer las células durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de hacerlas pasar a medios selectivos. La finalidad del marcador seleccionable es comunicar resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de modo estable, pueden hacerse proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas para el tipo de célula.

Líneas de células de mamíferos disponibles como hospedantes para la expresión, son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas que pueden obtenerse desde American Type Culture Collection (ATCC). que incluyen, aun cuando no se limita a ellas, células de ovario de hámster chino (CHO), HeLa, de riñón de hámster joven, de riñón de mono (COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, de melanoma Bowes y de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo Hep G2), y muchas otras líneas celulares.

En el sistema de baculovirus, los materiales para sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto se encuentran disponibles en el comercio en forma de kit, que pueden adquirirse, entre otros, de Invitrogen, San Diego CA (el kit "MaxBac"). Estas técnicas son conocidas en general por los expertos en la técnica y han sido descritas completamente por Summers y Smith en Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin No. 1555 (1987). Las células huésped particularmente adecuadas para usar en este sistema, incluyen células de insecto tales como células de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9.

Existen muchos sistemas de expresión genética de cultivos de células vegetales y de vegetales totales conocidos en la técnica. Como ejemplos de sistemas de expresión genética de células vegetales se incluyen los descritos en los documentos US 5.693.506, US 5.659.122, y US 5.608.143. Ejemplos adicionales de expresión genética en cultivos de células vegetales han sido descritos por Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3862 (1991).

En particular pueden utilizarse todas las plantas a partir de las cuales puedan aislarse y cultivarse los protoplastos para proporcionar plantas regeneradas totales, con lo que se recuperan plantas totales que contienen el gen transferido. Prácticamente todas las plantas pueden ser regeneradas partiendo de células o tejidos cultivados, que incluyen, aun cuando no se limita a ellas, todas las especies principales de caña de azúcar, remolacha azucarera, algodón, árboles frutales y otros, legumbres y hortalizas.

Ejemplos de células huésped bacterianas particularmente preferidas, incluyen células de estreptococos, estafilococos, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis.

Ejemplos de células huésped particularmente adecuadas para expresión fúngica, incluyen células de levadura (Por ejemplo, S.cerevisiae) y células de Aspergillus.

Diversos sistemas de selección que son conocidos en la técnica, pueden ser usados para recuperar líneas celulares transformadas. Ejemplos de ellos incluyen genes de timidina quinasa (Wigler, M. et al., (1977) Cell 11:223-32) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy, I. et al., (1980) Cell 22:817-23) de virus herpes simplex que pueden emplearse en células tk^{-} o aptr^{\pm}, respectivamente.

Asimismo, pueden usarse antimetabolitos, antibióticos o resistencia a herbicidas como la base de selección; por ejemplo, la dihidrofolato reductasa (DHFR) que comunica resistencia al metotrexato (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, que comunica resistencia a los aminoglucósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150-14) y als o pat, que comunican resistencia al clorosulfurón y la fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente. Han sido descritos genes seleccionables adicionales, ejemplos de los cuales son claros para los expertos en la técnica.

Aun cuando la presencia o ausencia de expresión de un gen marcador sugiere que el gen de interés se encuentra presenta también, su presencia y expresión puede necesitar confirmación. Por ejemplo, si la secuencia relevante está insertada dentro de una secuencia de un gen marcador, pueden identificarse células transformadas que contienen las secuencias apropiadas por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, un gen marcador puede ser colocado en tándem con una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, bajo el control de un promotor único. La expresión del gen marcador en respuesta a inducción o selección, indica habitualmente, también expresión del gen en tándem.

Alternativamente, pueden identificarse células huésped que contienen una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención y que expresa dicho polipéptido, mediante una diversidad de procedimientos operatorios conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos operatorios incluyen, aun cuando no se limita a ellos, hibridaciones de DNA-DNA o DNA-RNA y bioensayos de proteínas, por ejemplo, clasificación de células activadas con fluorescencia (FACS) o técnicas de inmunoensayo (tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas [ELISA] y el radioinmunoensayo [RIA]), que incluyen tecnologías de membranas, disolución o a base de chips, para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o de proteína (véase Hampton, R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, MN) y Maddox, D.E. et al. (1983) J. Exp. Med., 158, 1211-1216).

Se conoce por los expertos en la técnica una amplia variedad de marcadores y de técnicas de conjugación y pueden usarse en diversos ensayos de ácidos nucleicos y aminoácidos. Medios para producir hibridación marcada o sondas para PCR, para detectar secuencias relacionadas con moléculas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de la presente invención, incluyen oligomarcado, desplazamiento de la mella, marcado final o amplificación por PCR, usando un polinucleótido marcado. Alternativamente, las secuencias que codifican el polipéptido de la invención pueden ser clonadas en un vector para producir una sonda de mRNA. Tales vectores son conocidos en la técnica, se encuentran disponibles en el comercio, y pueden ser usados para sintetizar sondas de RNA in vitro mediante adición de una RNA polimerasa apropiada tal como T7, T3 ó SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos operatorios pueden ser llevados a cabo usando diversos kits de que se dispone en el comercio (Pharmacia and Upjohn, (Kalamazoo, MI); Promega (Madison, WI); y U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH)).

Moléculas informadoras o marcadores adecuados, que pueden ser empleados para facilitar la detección, incluyen radionúclidos, enzimas y agentes fluorescentes, quimiluminiscentes o cromógenos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y semejantes.

También pueden utilizarse moléculas de ácidos nucleicos para crear animales transgénicos, en particular animales roedores. Esto puede realizarse localmente mediante modificación de células somáticas, o mediante terapia de líneas germinales para incorporar modificaciones hereditarias. Tales animales transgénicos pueden ser particularmente útiles para generar modelos de animales para ensayar moléculas de fármacos eficaces como moduladoras de los polipéptidos de la presente invención.

El polipéptido puede ser recuperado y purificado partiendo de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatito y cromatografía de lectina. Es particularmente útil la cromatografía líquida de alta resolución para realizar la purificación. Pueden emplearse técnicas bien conocidas para replegar proteínas y regenerar una conformación activa cuando el polipéptido es desnaturalizado durante su aislamiento y/o su purificación.

También pueden usarse construcciones vectoriales especializadas para facilitar la purificación de proteínas, según se desee, uniendo secuencias que codifican los polipéptidos con una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio polipeptídico que puede facilitar la purificación de proteínas solubles. Ejemplos de tales dominios que facilitan la purificación incluyen péptidos de quelación de metales tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema FLAGS de purificación de extensión/afinidad (Immunex Corp., Seattle, WA). La inclusión de secuencias de engarces escindibles tales como las específicas para el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y el polipéptido de la invención, puede usarse para facilitar la purificación. Uno de tales vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene el polipéptido de la invención fusionado a varios restos de histidina que preceden a tiorredoxina o un sitio de escisión de enteroquinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación por IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados, según ha sido descrito por Porath, J. et al. (1992), Prot. Exp. Purif. 3:263-281) mientras que el sitio de escisión de tiorredoxina o enteroquinasa proporciona medios para purificar el polipéptido partiendo de la proteína de fusión. Una discusión de vectores que contienen proteínas de fusión ha sido proporcionada por Kroll, D.J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453).

Si el polipéptido ha de ser expresado para usar en ensayos de selección, es preferible, en general,, que sea producido en la superficie de la célula huésped en la que es expresado. En este caso, las células huésped pueden ser cosechadas antes de usar en el ensayo de selección, por ejemplo, usando técnicas tales como clasificación con células activadas por fluorescencia (FACS) o técnicas de inmunoafinidad. Si el polipéptido es secretado en el medio, el medio puede ser recuperado con objeto de recoger y purificar el polipéptido expresado. Si el polipéptido es producido intracelularmente, las células deben ser lisadas primeramente antes de recuperar el polipéptido.

El polipéptido puede ser usado para explorar colecciones de compuestos en una cualquiera de una diversidad de técnicas de selección de fármacos. Tales compuestos pueden activar (agonista) o inhibir (antagonista) el nivel de expresión del gen o la actividad del polipéptido. Los compuesto preferidos son eficaces para alterar la expresión de un gen natural que codifica un polipéptido, o para regular la actividad de un polipéptido.

Compuestos agonistas o antagonistas pueden ser aislados, por ejemplo, a partir de células, preparaciones exentas de células, colecciones de compuestos químicos, o mezclas de productos naturales. Estos agonistas o antagonistas pueden ser sustratos, ligandos, enzimas o compuestos simuladores estructurales o funcionales, naturales o modificados. Para una revisión adecuada de tales técnicas de selección véase la publicación de Coligan et al., en Current Protocols in Immunology 1(2): Capítulo 5 (1991).

Los compuestos con la mayor probabilidad de ser antagonistas son moléculas que se unen al polipéptido sin inducir los efectos biológicos del polipéptido al unirse a él. Los antagonistas potenciales incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen al polipéptido inhibiendo o extinguiendo con ello su actividad. De esta forma, puede inhibirse la unión del polipéptido a moléculas de unión celular, normales, de modo que se evita la actividad biológica normal del polipéptido.

El polipéptido que se emplea en tales técnicas de selección puede estar libre en disolución, fijado a un soporte sólido, llevado sobre una superficie celular o situado intracelularmente. En general, tales procedimientos de selección pueden llevar consigo el uso de células o membranas celulares apropiadas que expresan el polipéptido, puestas en contacto con un compuesto de ensayo para observar la unión, estimulación o inhibición de una respuesta funcional. La respuesta funcional de las células puestas en contacto con el compuesto de ensayo se compara después con células testigo que no habían sido puestas en contacto con el compuesto de ensayo. Un ensayo tal puede determinar si el compuesto de ensayo da por resultado una señal generada por activación del polipéptido, usando un sistema de detección apropiado. Los inhibidores de activación se ensayan, por lo general, en la presencia de un agonista conocido y se observa el efecto sobre la activación por el agonista en presencia del compuesto de ensayo.

Un método preferido para identificar un compuesto agonista o antagonista de un polipéptido comprende:

(a): poner en contacto una célula que expresa sobre su superficie el polipéptido; asociándose el polipéptido con un segundo componente capaz de producir una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto al polipéptido, con un compuesto que ha de ser seleccionado, en condiciones que permitan la unión al polipéptido; y

(b): determinar si el compuesto se une y activa o inhibe el polipéptido mediante la medida del nivel de la señal generada por la interacción del compuesto con el polipéptido.

Otro método preferido para identificar un agonista o un antagonista de un polipéptido comprende:

(a): poner en contacto una célula que expresa sobre su superficie el polipéptido, asociándose el polipéptido a un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto al polipéptido, con un compuesto que haya de ser seleccionado, en condiciones que permitan la unión al polipéptido; y

(b): determinar si el compuesto se une al polipéptido y le activa o inhibe, por comparación del nivel de una señal generada por la interacción del compuesto con el polipéptido, con el nivel de una señal producida en ausencia del compuesto.

Los métodos generales que se han descrito pueden comprender, además, llevar a cabo la identificación del agonista o antagonista en presencia de un ligando, marcado o sin marcar, para el polipéptido.

En otra realización del método de identificación de un agonista o un antagonista de un polipéptido, comprende:

Determinar la inhibición de unión de un ligando a células que poseen un polipéptido sobre su superficie, o a membranas celulares que contienen un polipéptido tal, en presencia de un compuesto candidato, en condiciones que permiten unión al polipéptido, y determinar la cantidad de ligando unido al polipéptido. Se considera que un compuesto capaz de causar reducción de la unión de un ligando, es un agonista o un antagonista. Preferiblemente el ligando está marcado.

Más particularmente, un método de selección de un compuesto antagonista o agonista de un polipéptido, comprende las etapas de:

(a): incubar una ligando marcado con una célula total que expresa un polipéptido sobre la superficie celular, o una membrana celular que contiene un polipéptido;

(b): medir la cantidad de ligando marcado unido a la célula total o a la membrana celular;

(c): añadir un compuesto candidato a una mezcla de ligando marcado y la célula total o la membrana celular de la etapa (a) y dejar que la mezcla alcance el equilibrio;

(d): medir la cantidad de ligando marcado unido a la célula total o a la membrana celular después de la etapa (c); y

(e): comparar la diferencia en el ligando marcado unido en la etapa (b) y (d), de modo que el compuesto que ocasiona la reducción de unión de la etapa (d) se considera que es un agonista o un antagonista.

Los polipéptidos INSP101 de la presente invención pueden modular una diversidad de procesos fisiológicos y patológicos, que incluyen procesos tales como la proliferación y emigración celular en el interior del sistema inmunitario. Así pues, la actividad biológica de los polipéptidos INSP101 puede examinarse en sistemas que permiten el estudio de tales actividades moduladoras, usando una diversidad de ensayos adecuados.

Por ejemplo, para observar las inhibición del crecimiento celular, puede usarse un medio sólido o líquido. En un medio sólido, pueden seleccionarse fácilmente células que experimentan inhibición del crecimiento, entre el grupo de células sujeto, por comparación del tamaño de las colonias formadas. En un medio líquido, la inhibición del crecimiento puede seleccionarse midiendo la turbiedad del medio de cultivo o la incorporación en el DNA de timidina marcada. Típicamente, la incorporación de un análogo de un nucleósido en DNA sintetizado de nuevo, puede emplearse para medir la proliferación (es decir, el crecimiento celular activo) de una población de células. Por ejemplo, puede emplearse bromodesoxiuridina (BrdU) como un reactivo de marcado de DNA y pueden emplearse anticuerpos monoclonales del ratón anti-BrdU como reactivo de detección. Este anticuerpo se une solamente a células que contienen DNA que ha incorporado bromodesoxiuridina. Varios métodos de detección pueden utilizarse en asociación con este ensayo, incluyendo inmunofluorescencia, ensayos inmunohistoquímicos, ELISA, y métodos colorimétricos. Pueden adquirirse en el comercio procedentes de Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN), kits que incluyen bromodesoxiuridina (BrdU) y anticuerpo monoclonal del ratón anti-BrdU).

Puede encontrarse que los polipéptidos INSP101 modulan en los ensayos descritos una diversidad de procesos fisiológicos y patológicos de un modo que depende de la dosis. Así pues, los "equivalentes funcionales" de los polipéptidos INSP101 incluyen polipéptidos que ponen de manifiesto en los ensayos descritos, algunas de las mismas actividades moduladoras de un modo dependiente de la dosis. Aun cuando no es necesarios que el grado de actividad que depende de la dosis sea idéntico al de los polipéptidos INSP101, preferiblemente los "equivalentes funcionales" deben poner de manifiesto dependencias de la dosis sustancialmente similares en un ensayo de actividad dado, en comparación con los polipéptidos INSP101.

En algunas de las realizaciones descritas, pueden usarse ensayos de unión sencillos en los que la adherencia de un compuesto de ensayo a una superficie que es portadora del polipéptido, se detecta por medio de una marca asociada directa o indirectamente con el compuesto de ensayo, o en un ensayo que implica competencia con un competidor marcado. En otra realización, pueden utilizarse ensayos competitivos de selección de fármacos en los que anticuerpos neutralizantes, capaces de unirse al polipéptido, compiten específicamente con un compuesto de ensayo por la unión. De este modo. los anticuerpos pueden ser usados para detectar la presencia de cualquier compuesto de ensayo que posea afinidad específica de unión para el polipéptido.

También pueden diseñarse ensayos para detectar el efecto de compuestos de ensayo añadidos sobre la producción de mRNA que codifica el polipéptido en células. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo ELISA que mida niveles de polipéptido secretados o asociados a células, usando anticuerpos monoclonales o policlonales, mediante métodos estándar conocidos en la técnica, y esto puede utilizarse para investigar compuestos que pueden inhibir o intensificar la producción del polipéptido partiendo de células o tejidos adecuadamente manipulados. Despues puede medirse la formación de los complejos de unión entre el polipéptido y el compuesto sometido a ensayo.

Otra técnica de selección de fármacos que puede usarse, proporciona una selección de alta productividad, de compuestos que poseen afinidad de unión adecuada al polipéptido de interés (véase la solicitud de patente internacional WO 84/03564). En este método, gran número de compuestos de ensayo pequeños, diferentes, son sintetizados sobre un sustrato sólido, que puede hacerse reaccionar luego con el polipéptido de la invención y lavarse. Un modo de inmovilizar el polipéptido consiste en usar anticuerpos no neutralizantes. El polipéptido unido puede detectarse luego usando métodos que son bien conocidos en la técnica. El polipéptido purificado puede también revestirse directamente sobre placas para su uso en las técnicas de selección de fármacos antes citadas.

El polipéptido puede ser usado para identificar receptores solubles o unidos a membranas, mediante técnicas estándar de unión de receptores, conocidas en la técnica, tales como ensayos de unión y reticulación de ligandos, en los que el polipéptido está marcado con un isótopo radiactivo, modificado químicamente, o está fusionado a una secuencia peptídica que facilita su detección o purificación, e incubado con una fuente del receptor putativo (por ejemplo, una composición de células, membranas celulares, sobrenadantes celulares, extractos de tejidos, o fluidos corporales). La eficacia de la unión puede medirse usando técnicas biofísicas tales como resonancia del plasmón superficial y espectroscopía. Pueden utilizarse ensayos de unión para la purificación y clonación del receptor, pero también pueden identificar agonistas y antagonistas del polipéptido que compiten con la unión del polipéptido a su receptor. Están bien entendidos en la técnica métodos estándar para llevar a cabo ensayos de selección.

Los polipéptidos INSP101 pueden modular diversos procesos fisiológicos y patológicos, que incluyen procesos tales como la secreción de hormonas, crecimiento celular y metástasis celular, incluyendo las metástasis de células cancerosas (Torosian, M.H. y Donoway, R.B., 1991, Cancer, 67(9):2280-2283). Así pues, puede examinarse la actividad biológica de los polipéptidos INSP101 en sistemas que permitan el estudio de tales actividades moduladoras, usando diversos ensayos adecuados.

Por ejemplo, para observar el efecto de los polipéptidos INSP101 de la presente invención sobre la metástasis celular, puede emplearse uno o más de los métodos descritos por Ohtaki et al., en Nature, 2001 May. 31:411(6837):613-7, o a las publicaciones a que se hace referencia en dicha referencia bibliográfica.

Por ejemplo, para observar el efecto de los polipéptidos INSP101 de la presente invención sobre la secreción de hormonas, puede emplearse uno o más de los métodos descritos por Hinuma et al., en Nature, 1998, May. 21:393(6682):272-6 o Hinuma et al., en Nat. Cell Biol. 2000, Oct. 2(10):703-8, o las publicaciones a que se hace referencia en este trabajo.

Los polipéptidos INSP101 pueden ser utilizados también para identificar y caracterizar receptores, en particular receptores de hormonas del crecimiento, que interaccionan con los polipéptidos INSP101. Los métodos adecuados de identificación y caracterización incluyen, aun cuando no se limita a ellos, los descritos por Hinuma et al., en Nat. Cell Biol., 2000, Oct. 2(10):703-8 y en la solicitud de patente internacional WO 01/17958, o las publicaciones a que se hace referencia en ella.

Puede encontrarse que los polipéptidos INSP101 modulan una diversidad de procesos fisiológicos y patológicos de un modo que depende de la dosis, en los ensayos antes descritos. Por consiguiente, los "equivalentes funcionales" de los polipéptidos INSP101 incluyen polipéptidos que manifiestan algunas de las actividades moduladores en los ensayos anteriormente descritos, de un modo que depende de la dosis. Aun cuando no es necesario que el grado de actividad que depende de la dosis sea idéntico al de los polipéptidos INSP101, de preferencia los "equivalentes funcionales" deben manifestar una dependencia de la dosis sustancialmente similar en comparación con los polipéptidos INSP101.

Se describe también un kit de selección útil en los métodos de identificación de agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos y enzimas que se han descrito antes.

Se describen agonistas, antagonistas, ligandos, receptores, sustratos y enzimas, así como otros compuestos que modulan la actividad o antigenicidad del polipéptido de la invención, descubiertos mediante los métodos anteriormente descritos.

La invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido, un ácido nucleico o un ligando de la invención, en combinación con un excipiente farmacéutico adecuado. Estas composiciones pueden ser adecuadas como agentes terapéuticos o reactivos de diagnóstico, como vacunas o como otras composiciones inmunógenas, según se describe con detalle más adelante.

De conformidad con la terminología utilizada en esta memoria, una composición que contiene un polipéptido, un ácido nucleico, un ligando o un compuesto [X], está "sustancialmente libre" de impurezas [aquí, Y], cuando al menos el 85% en peso del total X+Y de la composición es X. De preferencia, X comprende, al menos aproximadamente, el 90% en peso del total de X+Y de la composición, más preferiblemente, al menos, aproximadamente, el 95%, 98% o incluso el 99% en peso.

Las composiciones farmacéuticas deben comprender, preferiblemente, una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido, molécula de ácido nucleico, ligando o compuesto de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" tal como se emplea en esta memoria, se refiere a la cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o evitar una enfermedad o un estado que se considera diana, o poner de manifiesto un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser estimada inicialmente, o bien en ensayos realizados en cultivos celulares, por ejemplo, cultivo de células neoplásicas, o bien en modelos de animales, habitualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo de animal puede ser usado también para determinar el intervalo de concentraciones apropiado y la vía de administración. Tal información puede ser utilizada después para determinar las dosis y las vías útiles de administración a los seres humanos.

La cantidad eficaz precisa para un ser humano dependerá de la gravedad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y frecuencia de administración, las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y de la tolerancia/respuesta al tratamiento terapéutico. La cantidad puede determinarse mediante experimentación de rutina y está dentro del criterio del facultativo. En general, una dosis eficaz está entre 0,01 mg/kg y 50 mg/kg, de preferencia 0,05 mg/kg y 10 mg/kg. Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas. Una composición farmacéutica puede contener también un excipiente farmacéuticamente aceptable, para administrar un agente terapéutico. Tales excipientes incluyen anticuerpos y otros polipéptidos, genes y otros agentes terapéuticos tales como liposomas, con tal que el excipiente no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y que pueda ser administrado sin toxicidad indebida. Tales excipientes pueden ser macromoléculas grandes que se metabolizan lentamente tales como proteínas, polisacáridos, poliácidos lácticos, poliácidos glicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de poliácidos y partículas virales inactivas.

Pueden utilizarse en las composiciones sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, sulfatos y semejantes, y sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y semejantes. Una discusión completa de excipientes farmacéuticamente aceptables se encuentra disponible en la publicación Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N-J. 1991).

Los excipientes farmacéuticamente aceptables de composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerina y etanol. Asimismo pueden encontrarse presentes en tales composiciones, sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras del pH, y semejantes. Tales excipientes permiten formular las composiciones farmacéuticas en forma de comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, suspensiones, y semejantes, para ingestión por el paciente.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales, en particular pueden tratarse seres humanos.

Las composiciones farmacéuticas utilizadas en esta invención pueden ser administradas por cualquier vía que incluyen, aun cuando no se limita a ellas, las aplicaciones por vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica o transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO 98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, o por medios intravaginales o rectales. También pueden utilizarse para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención, pistolas génicas o hipoaerosoles. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden prepararse en forma de inyectables, o bien como soluciones o suspensiones líquidas, y también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para disolver o suspender en vehículos líquidos antes de inyección.

La distribución directa de las composiciones puede conseguirse, en general, mediante inyección por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o distribuirse al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones pueden administrarse también en una lesión. La dosificación del tratamiento puede ser un posología de una sola dosis o una posología de varias dosis.

Si la actividad del polipéptido es excesiva en un estado de enfermedad particular, se encuentran disponibles varios enfoques. Un enfoque comprende administrar a un sujeto un compuesto inhibidor (antagonista) según se ha descrito anteriormente, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad eficaz para inhibir la función del polipéptido, tal como por bloqueo de la unión de ligandos, sustratos, enzimas o receptores. o por inhibición de una segunda señal, aliviando con ello el estado anormal. Preferiblemente, tales antagonistas son anticuerpos. Lo más preferible, tales anticuerpos son quiméricos y/o humanizados para reducir al mínimo su inmunogenicidad, según se ha descrito anteriormente.

En otro enfoque, pueden administrarse formas solubles del polipéptido que retengan afinidad de unión para el ligando, sustrato, enzima o receptor en cuestión. Típicamente, el polipéptido puede ser administrado en forma de fragmentos que retengan las partes relevantes.

En un enfoque alternativo, puede inhibirse la expresión del gen que codifica el polipéptido usando técnicas de bloqueo de la expresión, tales como el uso de moléculas de ácidos nucleicos antisentido (según se ha descrito anteriormente), o bien generadas internamente o administradas por separado. Pueden obtenerse modificaciones de la expresión génica diseñando secuencias complementarias o moléculas antisentido (DNA, RNA PNA) para las regiones control, 5' o reguladoras (secuencia señal, promotores, intensificadores e intrones) del gen que codifica el polipéptido. De modo semejante, puede conseguirse inhibición usando metodología de apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice es útil debido a que ocasiona inhibición de la aptitud de la doble hélice para abrirse suficientemente para la unión de polimerasas, factores de transcripción o moléculas reguladoras. Avances terapéuticos recientes que utilizan DNA triple, han sido descritos en la bibliografía científica (Gee, J.E. et al., (1994) En: Huber, B.E. y B.I. carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). La secuencia complementaria o molécula antisentido puede ser diseñada también para bloquear la traducción de mRNA evitando que el transcrito se una a ribosomas. Tales oligonucleótidos pueden ser administrados o pueden ser generados in situ desde expresión in vivo.

Además, la expresión del polipéptido de la invención puede evitarse usando ribozimas específicas para ello que codifican secuencias de mRNA. Las ribozimas son RNAs catalíticamente activos que pueden ser naturales o sintéticos (véase, por ejemplo, la publicación de Usman, N, et al., en Curr. Opin. Struct. Biol (1996) 6(4), 527-33). Pueden diseñarse ribozimas sintéticas para escindir específicamente mRNAs en posiciones seleccionadas, evitándose con ello la traducción de los mRNAs en polipéptidos funcionales. Pueden sintetizarse ribozimas con una cadena principal natural de ribosa- fosfato y bases naturales, como se encuentra normalmente en las moléculas de RNA. Alternativamente, las ribozimas pueden ser sintetizadas con cadenas principales no naturales, por ejemplo, 2'-O-metil RNA, para proporcionar protección de la degradación de ribonucleasas y pueden contener bases modificadas.

Pueden modificarse moléculas de RNA para aumentar la estabilidad intracelular y la semi-vida. Las modificaciones posibles incluyen, aun cuando no se limita a ellas, la adición de secuencias de flanqueo en los extremos 5' y/o 3' de la molécula, o el uso de fosforotioato ó 2' O-metilo en vez de enlaces de fosfodiesterasa dentro de la cadena principal de la molécula. Este concepto es inherente a la producción de PNAs y puede ser extendido en todas estas moléculas mediante la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y butosina, así como también acetil-, metil-, tio- y formas modificadas de modo semejante de adenina, citidina, guanina, timina y uridina que no son reconocidas tan fácilmente por las endonucleasas endógenas.

Para tratar estados anormales relacionados con una subexpresión del polipéptido de la invención y de su actividad, también se encuentran disponibles varios enfoques. Uno de los enfoques comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que activa el polipéptido, es decir, un agonista, según se ha descrito antes, para aliviar el estado anormal. Alternativamente, puede administrarse una cantidad terapéutica del polipéptido en combinación con un excipiente farmacéuticamente adecuado, para restaurar el equilibrio fisiológico relevante del polipéptido.

Puede emplearse terapia génica para llevar a efecto la producción endógena del polipéptido por las células relevantes del sujeto. Se emplea la terapia génica para tratar permanentemente la producción inapropiada del polipéptido por reemplazo de un gen defectuoso por un gen terapéutico corregido.

La terapia génica de la presente invención puede tener lugar in vivo o ex vivo. La terapia génica ex vivo requiere el aislamiento y purificación de células del paciente, la introducción de un gen terapéutico y la introducción de nuevo en el paciente de las células genéticamente alteradas. Por el contrario, la terapia génica in vivo no requiere ni aislamiento ni purificación de las células del paciente.

El gen terapéutico, típicamente, es "empaquetado" para administrar a un paciente. Los vehículos para realizar la distribución génica pueden ser no virales, tales como liposomas, o virus deficientes de replicación, tales como adenovirus, según ha sido descrito por Berkner, K.L., en Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39-66 (1992) o vectores víricos adeno-asociados (AAV) como ha sido descrito por Muzyczka, N., en Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129 (1992) y en la patente de EE.UU. No. 5.252.479. Por ejemplo, puede construirse una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, para su expresión en un vector retroviral defectuoso en la replicación. Esta construcción de expresión puede aislarse luego e introducirse en una célula de empaquetado transducida con un vector plasmídico retroviral que contiene RNA que codifica el polipéptido, de tal modo que la célula de empaquetado produce ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés. Estas células productoras pueden ser administradas a un sujeto para producir células in vivo y expresar el polipéptido in vivo. (véase el Capítulo 20 de Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, (y las referencias bibliográficas citadas en esa publicación), en Human Molecular Genetics (1996), T Strachan y A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd).

Otro enfoque consiste en la administración de "DNA desnudo" en la que el gen terapéutico es inyectado directamente en la corriente sanguínea o en el tejido muscular.

En las situaciones en las que los polipéptidos o las moléculas de ácidos nucleicos, de la invención, son agentes causantes de enfermedades, la invención proporciona el que estos agentes puedan ser usados en vacunas para elevar la cantidad de anticuerpos contra el agente causante de la enfermedad.

Las vacunas según la invención pueden ser o bien profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar una enfermedad después de la infección). Tales vacunas comprenden inmunizar antigeno(s), inmunógeno(s), polipéptido(s), proteína(s) o un ácido nucleico, habitualmente en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables según se ha descrito anteriormente, que incluyen cualquier excipiente que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición. Adicionalmente, estos excipientes pueden actuar como agentes inmunoestimulantes ("adyuvantes"). Además, el antígeno o inmunógeno puede ser conjugado a un toxoide bacteriano, tal como un toxoide procedente de difteria, tétanos, cólera, H. pylori, y otros patógenos.

Dado que los polipéptidos pueden descomponerse en el estómago, las vacunas que comprenden polipéptidos han de administrarse, preferiblemente, por vía parenteral (por ejemplo, inyección por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica). Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles, acuosas y no acuosas, que pueden contener anti-oxidantes, tampones, agentes bacteriostáticos y solutos que hacen isotónica la formulación con la sangre del receptor, y suspensiones estériles, acuosas y no acuosas, que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes.

Las formulaciones de vacunas de la invención pueden presentarse en envases monodosis o en envases multidosis. Por ejemplo, las ampollas y los viales, herméticamente cerrados, pueden mantenerse en estado liofilizado requiriendo solamente la adición del vehículo líquido estéril inmediatamente antes de su uso. La dosis dependerá de la actividad específica de la vacuna y puede determinarse con facilidad por experimentación de rutina.

También puede efectuarse la distribución genética de anticuerpos que se unen a los polipéptidos según la invención, por ejemplo, según se describe en la solicitud de patente internacional WO 98/55607.

La tecnología a la que se alude como inyección de chorro (véase, por ejemplo, www.powderject.com) puede ser útil también para formular composiciones de vacunas.

Varios métodos adecuados de vacunación y de sistemas de distribución de vacunas, están descritos en la solicitud de patente internacional WO 00/29428.

También se describe el uso de moléculas de ácidos nucleicos como reactivos de diagnóstico. La detección de una forma mutada del gen caracterizada por las moléculas de ácidos nucleicos asociadas con una disfunción, puede proporcionar una herramienta de diagnóstico que puede añadirse al diagnóstico de una enfermedad o definirla, o establecer susceptibilidad a una enfermedad, que resulta de la subexpresión, sobreexpresión o expresión espacial o temporal alterada del gen. Individuos con mutaciones en el gen pueden ser detectados a nivel del DNA mediante una diversidad de técnicas.

Pueden obtenerse moléculas de ácidos nucleicos para diagnóstico partiendo de células de un sujeto, tales como de sangre, orina y saliva, de biopsia de tejidos o de materiales de autopsias. El DNA genómico puede utilizarse directamente para la detección o puede ser amplificado enzimáticamente usando PCR, reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), u otras técnicas de amplificación (véase, Saiki et al., Nature, 324, 163-166 (1986); Bej et al., Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol., 26, 301-334 (1991); Birkenmeyer et al., J. Virol. Meth., 35, 117-126 (1991); Van Brunt, J. Bio/Technology, 8, 291-294 (1990)) antes del análisis.

En una realización, esto proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad de un paciente, que comprende determinar el nivel de expresión de un gen natural que codifica un polipéptido, y comparar dicho nivel de expresión con respecto al de un nivel testigo, en el que un nivel diferente de dicho nivel testigo es indicativo de una enfermedad. El método puede comprender las etapas de:

a): poner en contacto una muestra de tejido procedente del paciente con una sonda de ácido nucleico, en condiciones de rigurosidad que permiten la formación de un complejo híbrido entre la molécula de ácido nucleico y la sonda;

b): poner en contacto una muestra testigo con dicha sonda en las mismas condiciones utilizadas en la etapa a); y

c): detectar la presencia de complejos híbridos en dichas muestras;

en cuyo método la detección de niveles del complejo híbrido en la muestra del paciente que difieren de los niveles del complejo híbrido en la muestra testigo, es indicativa de enfermedad.

También se describe un método de diagnóstico que comprende las etapas de:

a): obtener una muestra de tejido de un paciente que está siendo ensayado para detectar una enfermedad;

b): aislar una molécula de ácido nucleico desde dicho tejido; y

c): diagnosticar al paciente la enfermedad al detectar la presencia de una mutación en la molécula de ácido nucleico que está asociada con la enfermedad.

Para ayudar a la detección de moléculas de ácidos nucleicos en los métodos descritos, puede incluirse una etapa de amplificación, por ejemplo utilizando PCR.

Deleciones e inserciones pueden ser detectadas por un cambio del tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden ser identificadas por hibridación de DNA amplificado con RNA marcado de la invención, o, alternativamente, secuencias de DNA antisentido marcadas de la invención. Las secuencias perfectamente igualadas pueden distinguirse de los dúplex desiguales por digestión con RNasa o mediante la determinación de diferencias en las temperaturas de fusión. La presencia o ausencia de la mutación en el paciente puede ser detectada poniendo en contacto el DNA con una sonda de ácido nucleico que se hibrida con el DNA en condiciones rigurosas, formando una molécula híbrida bicatenaria, teniendo la molécula híbrida bicatenaria una parte sin hibridar de la cadena de la sonda de ácido nucleico en una parte que corresponde a una mutación asociada con una enfermedad; y detectar la presencia o ausencia de una parte sin hibridar de la cadena de la sonda como indicación de la presencia o ausencia de una mutación asociada a la enfermedad, en la parte correspondiente de la cadena de
DNA.

Tales diagnósticos son particularmente útiles para ensayos prenatales e incluso neonatales.

Las mutaciones puntuales y otras diferencias secuenciales existentes entre el gen de referencia y los genes "mutantes" pueden identificarse mediante otras técnicas bien conocidas, tales como la secuenciación directa de DNA o polimorfismo conformacional monocatenario (véase, Orita et al., Genomics, 5, 874-879 (1989)). Por ejemplo, puede usarse un cebador de secuenciación con un producto de PCR bicatenario, o una molécula de molde monocatenaria generada mediante PCR modificada. La determinación de la secuencia se lleva a cabo mediante procedimientos operatorios convencionales con nucleótidos radio-marcados o mediante procedimientos automáticos de secuenciación con marcadores fluorescentes. También pueden usarse como sondas segmentos de DNA clonados para detectar segmentos de DNA específicos. La sensibilidad de este método es intensificada en gran manera cuando se combina con PCR. Además, mutaciones puntuales y otras variaciones de las secuencias, tales como polimorfismos, pueden ser detectadas según se ha descrito antes, por ejemplo, mediante el uso de oligonucleótidos específicos de alelos para amplificación por PCR de secuencias que se diferencian en nucleótidos simples.

También pueden detectarse diferencias de secuencias de DNA por alteraciones de la movilidad electroforética en geles de fragmentos de DNA, con o sin agentes desnaturalizantes, o mediante secuenciación directa del DNA (por ejemplo, Myers et al., Science (1985) 230:1242). Los cambios de las secuencias en posiciones específicas pueden ser revelados también mediante ensayos de protección de nucleasas, tales como protección de RNasa y. S1, o el método químico de escisión (véase el trabajo de Cotton et al., en Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1985) 85:4397-4401).

Además de la electroforesis en gel convencional y de la secuenciación de DNA, mutaciones tales como microdeleciones, aneuploidías, translocaciones e inversiones, pueden ser detectadas asimismo mediante análisis in situ (véase, por ejemplo. el trabajo de Keller et al-, DNA Probes, 2ª Ed., Stockton Press. Nueva York, N.Y., EE. UU. (1993), es decir, secuencias de DNA o RNA de células pueden ser analizadas para determinar mutaciones sin necesidad de su aislamiento y/o inmovilización sobre una membrana. La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) es actualmente el método más comúnmente empleado y han aparecido numerosas revisiones de FISH (véase, por ejemplo, el trabajo de Trachuck et al., en Science, 250, 559-562 (1990) y el de Trask et al., Trends, Genet., 7, 149-154 (1991)).

En otra realización, puede construirse un conjunto de sondas de oligonucleótidos que comprenden una molécula de ácido nucleico, para llevar a cabo una selección eficaz de variantes genéticas, mutaciones y polimorfismos. Los métodos de la tecnología de conjuntos son bien conocidos y poseen aplicabilidad general, pudiendo ser usados para dar respuesta a una diversidad de cuestiones de características genéticas moleculares que incluyen la expresión génica, el enlace genético y la variabilidad genética (véase, por ejemplo, el trabajo de M. Chee et al., en Science (1996), Vol. 274, páginas 610-613).

En otra realización se prepara el conjunto y se usa según los métodos descritos en la solicitud de PCT WO 95/11995 (Chee et al.,); Lockhart, D.J. et al., (1996) Nat. Biotech.14: 1675-1680); y Schena, M. et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci, 93: 10614-10619). Los pares de nucleótidos pueden variar desde dos hasta más de un millón. Los oligómeros son sintetizados en zonas designadas sobre un sustrato, usando procedimiento químico dirigido por la luz. Los sustratos pueden ser papel, nailon u otro tipo de membrana, filtro, portas de vidrio o cualquier otro soporte sólido adecuado. En otro aspecto, un oligonucleótido puede ser sintetizado sobre la superficie del sustrato usando un procedimiento químico de acoplamiento y un aparato de aplicación de chorros de tinta, según se describe en la solicitud de patente PCT WO 95/251116 (Baldeschweiler et al., ).En otro aspecto, puede usarse un conjunto "enrejado" análogo al de una hibridación por puntos (o espacios) para disponer y enlazar fragmentos de cDNA o de oligonucleótidos con la superficie de un sustrato usando un sistema de vacío, un procedimiento térmico, de UV, mecánico o de unión química. Un conjunto, tal como los descritos, puede ser producido manualmente o usando dispositivos de que se dispone (aparato de transferencia de espacios o de transferencia de puntos), materiales (cualquier soporte sólido adecuado) y máquinas (incluyendo instrumentos robóticos), y pueden contener 8, 24, 96, 384, 1536 o 6144 oligonucleótidos, o cualquier otro número entre dos y más de un millón, lo que conduce por sí mismo al uso eficiente de instrumentación de que se dispone en el comercio.

Además de los métodos discutidos, pueden diagnosticarse enfermedades mediante métodos que comprenden determinar, pariendo de una muestra procedente de un sujeto, un nivel de polipéptido o de RNA anormalmente disminuido o aumentado. Una expresión disminuida o aumentada puede ser medida a nivel del RNA usando cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica para la cuantificación de polinucleótidos, tales como, por ejemplo, amplificación de los ácidos nucleicos, por ejemplo PCR, RT-PCR, protección de RNasa, transferencia Northern y otros métodos de hibridación.

Las técnicas de ensayo que pueden ser utilizadas para determinar los niveles de un polipéptido en una muestra que procede de un hospedante, son bien conocidas por los expertos en la materia y han sido discutidas con detalle anteriormente (que incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia Western y ensayos ELISA). Este aspecto proporciona un método de diagnóstico que comprende las etapas de (a) poner en contacto un ligando según se ha descrito anteriormente, con una muestra biológica, en condiciones adecuadas para la formación de un complejo ligando-polipéptido; y (b) determinar dicho complejo.

Protocolos tales como ELISA, RIA y FACS utilizados para medir niveles de polipéptidos, pueden proporcionar adicionalmente una base para diagnosticar niveles de expresión de polipéptidos, alterados o anómalos. Los valores normales, o valores tipo, de expresión de polipéptidos son establecidos combinando fluidos corporales o extractos celulares obtenidos de mamíferos normales, preferiblemente de seres humanos, con un anticuerpo para el polipéptido, en condiciones adecuadas para la formación de complejos. La cantidad de formación del complejo estándar puede ser cuantificada mediante métodos diversos, tales como por medios fotométricos.

Pueden usarse anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido, para establecer el diagnóstico de estados o enfermedades que se caracterizan por expresión del polipéptido, o en ensayos para monitorizar pacientes tratados con los polipéptidos, moléculas de ácidos nucleicos, ligandos y otros compuestos de la invención. Pueden prepararse anticuerpos útiles con fines de diagnóstico, del mismo modo que los anteriormente citados con fines terapéuticos. Los ensayos de diagnóstico para el polipéptido incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y una marca para detectar el polipéptido en fluidos corporales humanos o en extractos de células o tejidos. Los anticuerpos pueden usarse con o sin modificación y pueden ser marcados uniéndolos, covalente o no covalentemente, con una molécula informadora. Puede utilizarse una extensa variedad de moléculas informadoras conocidas en la técnica, algunas de las cuales han sido descritas anteriormente.

Las cantidades de polipéptido expresadas en muestras de un sujeto, muestras testigo y muestras de enfermedad, procedentes de tejidos obtenidos de biopsias, se comparan con los valores tipo. La desviación existente entre los valores tipo y los del sujeto establece los parámetros de diagnóstico de una enfermedad. Pueden usarse ensayos de diagnóstico para diferenciar entre ausencia, presencia y expresión excesiva del polipéptido y verificar la regulación de niveles de polipéptidos durante la intervención terapéutica. Tales ensayos pueden ser utilizados también para evaluar la eficacia de un régimen particular de tratamiento terapéutico en estudios en animales, en ensayos clínicos o en el seguimiento del tratamiento de un paciente individual.

Un kit de diagnóstico de la presente invención puede comprender:

(a): una molécula de ácido nucleico:

(b): un polipéptido; o

(c): un ligando.

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En un aspecto, un kit de diagnóstico puede comprender un primer recipiente que contiene una sonda de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico; un segundo recipiente que contiene cebadores útiles para amplificar la molécula de ácido nucleico; e instrucciones para usar la sonda y los cebadores y facilitar el diagnóstico de la enfermedad. El kit puede comprender, además, un tercer recipiente que contiene un agente para digerir el RNA sin hibridar.

En un aspecto alternativo de la invención, un kit de diagnóstico puede comprender un conjunto de moléculas de ácidos nucleicos.

Para detectar un polipéptido, un kit de diagnóstico puede comprender uno más anticuerpos que se unen al polipéptido, y un reactivo útil para detectar una reacción de unión entre el anticuerpo y el polipéptido.

Tales kits tienen uso para diagnosticar una enfermedad o un trastorno, o una susceptibilidad a una enfermedad o un trastorno, en los que están implicadas proteínas endocrinas. Tales enfermedades y trastornos pueden incluir trastornos reproductivos, trastornos del embarazo tales como la enfermedad trofoblástica de la gestación, trastornos del desarrollo tales como los del síndrome de Silver-Russell, trastornos del crecimiento, deficiencia de hormonas del crecimiento, enfermedad de Cushing, trastornos endocrinos, trastornos proliferativos celulares que incluyen neoplasmas, carcinomas, tumores hipofisarios, tumores ováricos, melanomas, tumores pulmonares, colorrectales, de mama, del páncreas, de cabeza y cuello, tumores trofoblásticos placentarios, adenocarcinomas, coriocarcinomas, osteosarcomas y otros tumores sólidos; angiogénesis, trastornos mieloproliferativos, trastornos autoinmunitarios/inflamatorios, trastornos cardiovasculares, trastornos neurológicos, dolor, trastornos metabólicos incluyendo diabetes mellitus, osteoporosis y obesidad, caquexia, SIDA, enfermedad renal, daño pulmonar, envejecimiento, infecciones que incluyen infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones fúngicas e infecciones por parásitos, y otros estados patológicos. Preferiblemente, la enfermedad es una en la que está implicada la función endocrina, en particular están implicadas hormonas del crecimiento.

Diversos aspectos y realizaciones de la presente invención serán descritos ahora con más detalle, a título de ejemplo, con referencia particular al polipéptido INSP101.

Descripción breve de las figuras

Figura 1: Muestra una alineación de INSP101 completo (SEQ ID NO. 8) frente a P01241, hormona hipofisaria del crecimiento (GH-N) procedente de H. sapiens. El lazo A-B está marcado por asteriscos.

Figura 2: Compara la estructura de corte y empalme de P01241, hormona hipofisaria del crecimiento (GH-N) procedente de H. sapiens con la estructura de corte y empalme de la nueva variante de corte y empalme de INSP101.

Figura 3:Secuencia de nucleótidos predicha de INSP101 con traducción. La secuencia subrayada denota la secuencia señal predicha.

Figura 4: Mapa del plásmido pCRII-TOPO-E00974

Figura 5: Alineación de INSP101 con el plásmido nº 13686

Figura 6: Secuencia de nucleótidos y traducción de producto INSP101 clonado

Figura 7: Mapa de pENTR-INSP101-6HIS

Figura 8: Mapa de pEAK12d-INSP101-6HIS.

Ejemplos Ejemplo 1

El INSP101 fue identificado como conteniendo cinco exones. La Figura 2 compara la estructura de corte y empalme de P01241, hormona hipofisaria del crecimiento (GH-N) procedente de H. sapiens, con la estructura de corte y empalme de la nueva variante de corte y empalme de INSP101. El exón 2nov del polipéptido INSP101 y el 3nov del polipéptido INSP101, son exones alternativos producidos por corte y empalme alternativo; la variante de corte y empalme posee un exón (2nov)extendido y un exón 3 (3nov) truncado en comparación con la proteína de tipo salvaje.

El diagrama muestra también los elementos estructurales secundarios principales de la hormona hipofisaria del crecimiento (GH-N). La GH-N está compuesta por cuatro hélices alfa (A,B,C y D), y es de importancia particular el "lazo A-B" que conecta la hélice A con la hélice B. El lazo A-B es un componente crítico de la superficie de interacción de GH-N que se une al receptor de la Hormona del Crecimiento (Wells JA, PNAS vol.93, páginas 1-6, 1996 Binding in the growth hormone receptor complex). Es evidente que la nueva variante de corte y empalme de INSP101 posee restos nuevos insertados en el lazo A-B (debido a la extensión del exón 2). Similarmente, el truncamiento del exón 3 conduce a la separación de algunos restos de GH-N en el lazo A-B. Así pues, el INSP101 se diferencia de la GH-N principalmente en la composición de lazo A-B, y dado que este lazo es un determinante principal en la unión al receptor de la hormona del crecimiento, puede predecirse que el INSP101 exhibe propiedades alteradas del unión al receptor (en términos de afinidad de unión y/o de selectividad del receptor). Estas predicciones experimentales pueden ser confirmadas seguidamente mediante un ensayo experimental dirigido. Por ejemplo, varios ensayos diferentes pueden ser usados para determinar los efectos de hormonas humanas del crecimiento sobre la unión (véase, por ejemplo, el trabajo de Well J.A. en PNAS Vol. 93, páginas 1-6, 1996), que incluye el uso de anticuerpos monoclonales para precipitar complejos 1:1 de hormona del crecimiento y receptor, y la dimerización inducida por hGH de moléculas de hGHbp en solución por el enfriamiento de una marca fluorescente colocada cerca del extremo carboxilo terminal de hGHbp (véase, Well J.A., PNAS Vol. 93 páginas 1-6, 1996). [hGHbp = dominio extracelular del receptor de GH].

Ejemplo 2 Clonación de INSP101 1.1 Preparación de cDNA hipofisario humano

Se preparó el cDNA de la primera cadena partiendo de RNA total hipofisario humano (Clontech) usando Transcriptasa Inversa, RNasa H^{--}, Superscript II (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Se combinaron 1 \mul de cebador Oligo(dT)_{15} (500 \mug/ml, Promega), 2 \mug de RNA total de pulmón humano, 1 \mul de mezcla de dNTP 10 mM (10 mM de cada uno de dATP, dGTP, dCTP y dTTP, a pH neutro) y agua destilada estéril hasta un volumen final de 12 \mul, en un tubo eppendorf de 1,5 ml, se calentó a 65ºC durante 5 minutos y después se enfrió en hielo. El contenido se recogió mediante centrifugación breve y se añadieron 4 \mul de Tampón de primera cadena 5X, 2 \mul de DTT 0,1 M y 1 \mul de Inhibidor de Ribonucleasa Recombinante RNaseOUT (40 unidades(/\mul, Invitrogen). El contenido del tubo se mezcló suavemente, se incubó a 42ºC durante 2 minutos, y después se añadió 1 \mul (200 unidades) de enzima SuperScript II y se mezcló suavemente por pipeteado. La mezcla se incubó a 42ºC durante 50 minutos y después de inactivo por calentamiento a 70ºC durante 15 minutos. Para separar el RNA complementario del cDNA, se añadió 1 \mul (2 unidades) de RNasa H de E. coli (Invitrogen) y la mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 20 minutos. La mezcla de reacción final, 21 \mul, se diluyó añadiendo 179 \mul de agua estéril, obteniendo un volumen total de 200 \mul.

1.2 Cebadores de clonación específicos, génicos, para PCR

Un par de cebadores de PCR que tenían una longitud de entre 18 y 25 bases, fueron diseñados para amplificar la secuencia codificante completa del cDNA virtual usando el soporte lógico Primer Designer (Scientific and Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, EE.UU.) Los cebadores de PCR fueron optimizados para tener una Tm próxima a 55 \pm 10ºC y un contenido por GC de 40-60%. Se seleccionaron cebadores que tenían alta selectividad para la secuencia diana (INSP101) con cebado pequeño o no inespecífico.

1.3 Amplificación por PCR de INSP101 procedente de cDNA hipofisario humano

Cebadores de clonación específicos de genes (INSP101-CP1 y INSP101-CP2 (tabla 1) fueron diseñados para amplificar un fragmento de DNA que cubría la secuencia codificante entera de la predicción de INSP101. Los cebadores de clonación específicos de genes, INSP101-CP1 e INSP101-CP2, fueron usados con cDNA hipofisario humano como molde. Se llevó a cabo la PCR en un volumen final de 50 \mul que contenía solución tampón AmpliTaq^{TM}, 1X, dNTPs 200 \muM, INSP101-CP1, 50 pmoles de INSP101-CP2, 2,5 unidades de AmpliTaq^{TM} (Perkin Elmer) y 100 ng de cDNA de pulmón, usando un MJ Research DNA Engine, programado como sigue: 94ºC, 2 minutos; 40 ciclos de 94ºC, 1 minuto, 50ºC, 1 minuto, y 72ºC, 1 minuto, seguido de 1 ciclo a 72ºC durante 7 minutos y un ciclo de retención a 4ºC. Los productos de la PCR fueron purificados directamente usando el Sistema Wizard de purificación de preparaciones de DNA por PCR (Promega).

1.4 Subclonación de productos de PCR

Se subclonaron productos de PCR en el vector de clonación modificado de topoisomerasa I (pCRII-TOPO) usando el kit de clonación TA adquirido de Invitrogen Corporation, usando las condiciones especificadas por el fabricante. Brevemente, 4 \mul de producto de PCR purificado en gel, procedente de la amplificación del conjunto P de una colección humana, se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente con 1 \mul de vector TOPO y 1 \mul de solución salina. La mezcla de reacción se transformó después en la cepa de E. coli TOP10 (Invitrogen) como sigue: una parte alícuota de 50 \mul de células TOP10 One Shot se descongeló sobre hielo y se añadió 2 \mul de reacción de TOPO. La mezcla se incubó durante 15 minutos sobre hielo y después se sometió a choque térmico por incubación a 42ºC durante exactamente 30 segundos. Se devolvieron muestras al hielo y se añadió 250 \mul de medio SOC templado (temperatura ambiente). Se incubaron las muestras con agitación (220 rpm) durante 1 horas a 37ºC. La mezcla de transformación se depositó sobre placas de caldo L (LB) que contenía ampicilina (100 \mug/ml) y se incubó durante la noche a 37ºC.

PCR de colonias

Se inocularon colonias en 50 \mul de agua estéril usando un palillo mondadientes estéril Una parte alícuota de 10 \mul del inóculo se sometió después a PCR en un volumen de reacción total de 20 \mul que contenía solución tampón AmpliTaq^{TM}, 1X, dNTPs 200 \muM, 20 pmoles de cebador T7, 20 pmoles de cebador SP6, 1 unidad de AmpliTaq^{TM} (Perkin Elmer) usando un MJ Research DNA Engine. Las condiciones de ciclación fueron las que siguen: 94ºC, 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC, 30 segundos, 47ºC, 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto. Después se mantuvieron muestras a 4ºC (ciclo de retención) antes del análisis posterior.

Los producto de PCR fueron analizados sobre geles de agarosa al 1% en solución tampón TAE, 1X. Una colonia que dio el tamaño esperado del producto de la PCR (+187 bp debido al sitio de clonación múltiple o MCS) se cultivó durante la noche a 37ºC en 5 ml de caldo L (LB) que contenía ampicilina (100 \mug/ml), con agitación a 220 rpm.

1.6 Preparación y secuenciación de DNA plasmídico

Se preparó DNA plasmídico Miniprep. partiendo de 5 ml de cultivo usando un sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Quiagen) o un kit Wizard Plus SV Minipreps. (Promega, nº de catálogo 1460) según las instrucciones del fabricante. Se eluyó el DNA plasmídico en 100 \mul de agua estéril. La concentración de DNA se midió usando un fotómetro Eppendorf BO Se sometió el DNA plasmídico (200-500 ng) a secuenciación de DNA con el cebador T7 y el cebador SP6 usando el sistema BigDye Terminator (Applied Biosystems, nº de catálogo 4390246) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 1. Los productos de las reacciones de secuenciación fueron purificados usando columnas Dye.Ex (Quiagen) o placas de limpieza Montage SEQ 96 (catálogo de Millipore nº LSKS09624) y luego se analizaron en un secuenciador de Applied Biosystems 3700. El análisis de la secuencia reveló que la secuencia clonada en el plásmido pCRII-TOPO era idéntica a GenBank E00974 (plásmido 13686) (figura 4).

1.7 Amplificación por PCR de los extremos 5' y 3' de INSP101 desde el plásmido 13686

Se diseñaron cebadores de PCR para amplificar los extremos 5' y 3' de INSP101, individualmente (tabla 1). El cebador directo para el extremo 5' de INSP101 (INSP101-B1P-5'F) contiene también la secuencia parcial del sitio attB1 de Gateway (5' GCAGGCTTC) y una secuencia Kozak (5' GCCACC). El cebador inverso para el extremo 5' de INSP101 (INSP101-5'-R) posee un solapamiento de 25 bases con el cebador directo para el extremo 3' de INSP101. El cebador directo para el extremo 3' de INSP101 (INSP101-3'-F) tiene un solapamiento de 26 bp con el cebador inverso para el extremo 5'. El cebador inverso para el extremo 3' de INSP101 (INSP101-3'-R) contiene una secuencia 5 HIS (figura 5).

Para amplificar el extremo 5' de INSP101, la reacción PCR se llevó a cabo en un volumen final de 50 \mul y contenía 0,5 \mul de DNA miniprep del plásmido 13683, 2 \mul de dNTPs 5 mM (Amersham Pharmacia Biotech), 6 \mul de INSP101-B1p-5'-F (10 \muM), 6 \mul de INSP101-5'R, 5 \mul de solución tampón Pfu, 10X, y 0,5 \mul de Pfu polimerasa (3 U/\mul) (No. M774B, Promega). Las condiciones de la PCR fueron: 94ºC durante 2 minutos; 3ociclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto y un ciclo de retención de 4ºC. Los productos de reacción fueron cargados sobre un gel de agarosa al 1,5% (TAE, 1X) y los productos de la PCR del tamaño correcto (211 bp) fueron purificados en gel usando un Kit de Extracción en Gel Qiaquick (Qiagen, nº de catálogo 28704) y eluídos en 50 \mul de solución tampón de elución (Quiagen).

El extremo 3' de INSP101 fue amplificado usando las mismas condiciones de reacción anteriores, pero con los cebadores INSP101-3'-F e INSP101-3'-R, 5 \mul de solución tampón AmpliTaq, 10X, y 0,5 \mul de DNA Polimerasa AmpliTaq (Applied Biosystems, nº N808-0155, 5 U/ml). Los productos de la PCR de 441 bp fueron purificados en gel como antes.

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2. Ajuste de los extremos 5' y 3' de INSP101 para generar INSP101 ORF

Los extremos 5' y 3' de INSP101 fueron ajustados en una reacción PCR que contenía 5 \mul del extremo 5' purificado en gel, 2 \mul del extremo 3' purificado en gel, 2 \mul de dNTPs 5 mM, 6 \mul de INSP101-B1P-5'-F (10 \muM), 6 \mul de INSP101-3'-R (10 \muM), 5 \mul de solución tampón Pfu, 10X, 0,5 \mul de Pfu polimerasa (3 U/\mul; Promega, nº de catálogo M774B). Las condiciones de reacción fueron: 94ºC, 4 minutos; 10 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 48ºC durante 30 segundos y 70ºC durante 2 minutos; 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 52ºC, durante 30 segundos y 70ºC durante 2 minutos; una etapa de alargamiento adicional de 70ºC durante 10 minutos; y un ciclo de retención a 4ºC. Los productos de la reacción fueron analizados sobre un gel de agarosa al 1,5% (TAE, 1X). Los productos de la PCR del tamaño predicho (627 bp) fueron purificados en gel usando un Kit de Extracción en Gel Qiaquick (Qiagen, nº de catálogo 28704) y eluídos en 50 \mul de solución tampón de elución(Qiagen). El producto resultante (INSP101 ORF) contiene el ORF del INSP101 flanqueado en el extremo 5' por un sitio attB1 y una secuencia Kozak, y en el extremo 3' por una secuencia codificante de marca 5HIS (figura 6).

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3. Subclonación del INSP101 ORF en el pDONR221

El INSP101 ORF fue subclonado en pDONR221 usando el sistema de clonación Gateway^{TM} (Invitrogen). Se añadió al extremo 5' de INSP101 ORF un sitio arrB1 de recombinación parcial y una secuencia con la marca 6HIS, y se añadió al extremo 3' del INSP101 ORF un sitio de recombinación attB2 y un codón de detección, en una reacción PCR de 50 \mul, que contenía 2 \mul de producto de PCR de INSP101 ORF purificado en gel, 2 \mul de dNTPs 5 mM (Amersham Pharmacia Biotech), 3 \mul de GCP-Directo (10 \muM), 3 \mul de GCP-Inverso (10 \muM), 5 \mul de solución tampón AmpliTaq, 10X, y 0,5 \mul de DNA Polimerasa AmpliTaq (Applied Biosystems, nº N808-0155, 5 U/ml), en un volumen final de 50 \mul. Las condiciones de la PCR fueron: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos; 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto; una etapa adicional de alargamiento de 72ºC durante 3 minutos y un ciclo de retención de 4ºC. Los productos de reacción fueron analizados sobre un gel de agarosa al 1,5% (TAE, 1X) y los productos de la PCR del tamaño correcto (685 bp) fueron purificados en gel usando un Kit de Extracción en Gel Qiaquick (Qiagen, nº de catálogo 28704) y sometidos a elución en 50 \mul de solución tampón de elución (Qiagen). El producto de la PCR purificado (INSP101 ORF modificado-Gateway) fue transferido después al pDONR221 usando clonasa BP como sigue: 1,5 \mul de INSP101 ORF modificado-Gateway fue incubado con 0,5 \mul de pDONR221 (0,1 \mug/\mul), 1 \mul de solución tampón BP y 1 \mul de mezcla de enzima clonasa BP (Invitrogen) en un volumen final de 5 \mul a temperatura ambiente durante 2 horas. La reacción se detuvo mediante la adición de 0,5 \mul de proteinasa K (2 \mug/\mul) y se incubó a 37ºC durante otros 10 minutos. Una parte alícuota de esta mezcla de reacción (3 \mul) se usó para transformar 50 \mul de células DH5alfa de E. coli (Invitrogen) mediante choque térmico. La mezcla de transformación se incubó en un tubo de PCR de 0,2 ml, sobre hielo, durante 30 minutos, y después se hizo pasar a una baño de agua a 42ºC durante 45 segundos. Los tubos fueron devueltos al hielo durante 2 minutos y la mezcla transformación se hizo pasar a un tubo de polipropileno de 12 ml. Se diluyeron luego muestras mediante la adición de 900 \mul de medio SOC y se incubó durante 1 hora a 37ºC con agitación. Los transformantes (200 \mul) fueron extendidos en placas LB que contenían 40 \mug de kanamicina y se incubó a temperatura ambiente durante 72 horas. Se aisló DNA miniprep plasmídico partiendo de 8 colonias resultantes, usando un sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen) y se sometió a secuenciación del DNA con los cebadores de secuenciación M13F y M13R, usando el sistema BigDyeTerminator (Applied Biosystems, nº de catálogo 4390246) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuenciación fueron purificadas usando columnas Dye-Ex o placas de limpieza SEQ 96 de Montage (Millipore, nº de catálogo LSKS09624) y luego se analizaron en un secuenciador 3700 de Applied Biosystems.

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3. Mutagénesis del pDONR221-INSP101

La verificación de secuenciación mostró que la totalidad de los clones de pDONR221-INSP101 tenían un codón de detención entre ORF y la marca 6HIS. Se usó mutagénesis dirigida al sitio para delecionar el codón de detención. Se usaron un kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio Quik Change XL de Stratagene (nº de catálogo 200517) y los cebadores INSP101-mut-F e INSP101-mut-R, según las instrucciones del fabricante. Se aisló DNA mini- prep plasmídico partiendo de 8 de las colonias resultantes, usando un sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen) y se sometió a secuenciación de DNA con los cebadores de secuenciación M13F y M13R, usando el sistema BigDye Terminator (Applied Biosystems, nº de catálogo 4390246, según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuenciación fueron purificadas usando columnas Dye-Ex (Qiagen o placas de limpieza SEQ 96 de Montage (catálogo de Millipore nº LSKS09624) y luego se analizaron en un secuenciador 3700 de Applied Biosystens.

4. Subclonación del INSP101 ORF al vector de expresión pEAKI2d

El producto plasmídico de elución (1,5 \mul) procedente de un clon del pDONR221 que contenía la secuencia correcta del INSP101 ORF (pENTR-INSP101-6HIS, plásmido ID 14577)(figura 7), se utilizó luego en una reacción de recombinación que contenía 1,5 \mul de pEAK12d (0,1 \mug/\mul), 2 \mul de solución tampón LR y 1,5 \mul de clonasa LR (Invitrogen), en un volumen final de 10 \mul. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora, se paró la reacción mediante la adición de 1 \mul de proteinasa K (2 \mug/\mul) y se incubó a 37ºC durante otros 10 minutos. Se usó una parte alícuota de esta mezcla de reacción (1 \mul) para transformar 20 \mul de células DH10B de E. coli (Invitrogen) (diluidas 1/5 con agua estéril), por electroporación, usando un Biorad Gene Pulser según las recomendaciones del fabricante. Las células de la electroporación fueron hechas pasar a tubos de polipropileno de 12 ml, se diluyó por adición de 1 ml de medio SOC y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Los transformantes fueron extendidos en placas de ampicilina-LB y se incubo durante la noche a 37ºC. DNA miniprep se preparó a partir de 3 colonias usando el sistema robótico Qiaprep Turbo 9600 (Qiagen) y se eluyó con 50 \mul de solución tampón de elución. 0,5 \mul de cada miniprep se sometió después a PCR en un volumen total de reacción de 50 \mul que contenía 2 \mul de dNTPs 5 mM, 3 \mul de pEAK12-F 10 \muM, 3 \mul de pEAK12-R 10 \muM, 5 \mul de solución tampón AmpliTaq^{TM}, 10X, y 0,5 \mul de AmpliTaq^{TM} (Applied Biosystems, nº de catálogo N808-0155). Las condiciones de ciclación fueron las siguientes: 94ºC durante 2 minutos; 30 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto; 1 ciclo, 72ºC durante 3 minutos. Después se mantuvieron muestras a 4ºC (ciclo de retención) antes de realizar un análisis adicional.

Los productos de reacción de la PCR fueron analizados sobre geles de agarosa al 1% en solución tampón TAE,1X. Una colonia que dio el tamaño esperado del producto de la PCR (1010 bp) fue usada para preparar DNA maxi-prep purificado con gradiente de CsCl, del plásmido pEAK12d-INSP101-6HIS (plásmido ID 14578 (figura 6) procedente de un cultivo de 500 ml- (Sambrook J. et al., en Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). El DNA plasmídico resultante fue resuspendido en una concentración de 1 \mug/\mul, en solución tampón TE y se verificó la secuencia con los cebadores pEAK12d-F y pEAK12d-R, según se ha descrito ante

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TABLA 1 Cebadores para clonar y secuenciar INSP101

1

2

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Ejemplo 3 Expresión y purificación de INSP101

Experimentos adicionales pueden ser llevados a cabo ahora para determinar la distribución tisular y los niveles de expresión de los polipéptidos INSP101, in vivo, sobre la base la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos que se describen esta memoria.

La presencia de los transcritos de INSP101 puede ser investigada por PCR de cDNA procedente de diferentes tejidos humanos. Los transcritos de INSP101 pueden estar presentes en niveles muy bajos en las muestras ensayadas. Por consiguiente, es necesario tener un cuidado extremo en el diseño de experimentos que establezcan la presencia de un transcrito en diversos tejidos humanos dado que una pequeña cantidad de contaminación genómica en la preparación de RNA puede proporcionar un resultado falso positivo. Por tanto, todo el RNA ha de tratarse con DNAsa antes de usar para realizar la transcripción inversa. Además, para cada tejido puede establecerse una reacción testigo en la que no se acometa la transcripción inversa (un testigo -ve RT).

Por ejemplo, puede utilizarse 1\mug de RNA total procedente de cada tejido, para generar cDNA usando transcriptasa inversa Multiscript (ABI) y cebadores hexámeros aleatorios. Para cada tejido, se establece una reacción testigo en la que se han añadido todos los constituyentes excepto la transcriptasa inversa (testigo -ve RT). Se establecen reacciones PCR para cada tejido sobre las muestras de RNA obtenidas con la transcriptasa inversa y los testigos RT minus. Pueden diseñarse fácilmente cebadores específicos de INSP101 sobre la base de la información de la secuencia proporcionada aquí. La presencia de un producto del peso molecular correcto en la muestra obtenida con la transcriptasa inversa junto con la ausencia de un producto del testigo RT minus, puede ser tomada como evidencia de la presencia de un transcrito en tal tejido. Puede usarse cualquier genoteca aceptable de cDNA para seleccionar los trascritos de INSP101, no solo los generados como se ha descrito antes.

La estructura de distribución en los tejidos de los polipéptidos INSP101 puede proporcionar una información útil, adicional, en relación con la función de estos polipéptidos.

Además, ahora pueden llevarse a cabo experimentos adicionales usando los vectores de expresión pEAK12d-INSP101-6HIS. La transfección de líneas celulares de mamífero con estos vectores puede permitir la expresión de alto nivel de las proteínas de INSP101 y permitir, por tanto, la investigación continuada de las características funcionales de los polipéptidos INSP101. El material y los métodos que siguen son un ejemplo de los adecuados en tales experimentos:

Cultivo celular

Células 293 del Riñón del Embrión Humano que expresan el Antígeno Nuclear del virus Epstein-Barr (HEK293-EBNA, Invitrogen), son mantenidas en suspensión en medio VPRO exento de suero, procedente de las células ("stock" de siembra, medio de mantenimiento, JRH). Dieciséis a 20 horas antes de la transfección (Día 1), se siembran las células en 2 matraces T225, (50 ml por cada matraz en medio de siembra DMEM / F12 (1:1) conteniendo FBS al 2% (JRH) con una densidad de 2x10^{5} células/ml). El día siguiente (día 0 de transfección) tiene lugar la transfección usando el reactivo JetPEITM (2 \mul/\mug de DNA plasmídico, transfección-PolyPlus). Para cada matraz, el DNA plasmídico es transfectado conjuntamente con DNA de GFP (gen informador fluorescente). La mezcla de transfección se añade luego a los 2 matraces T225, y se incuba a 37ºC (CO_{2} al 5%) durante 6 días. La confirmación de transfección positiva puede llevarse a cabo por examen cualitativo de la fluorescencia el día 1 y el día 6 (Axiovert 10 Zeiss).

El día 6 (el día de la recolección), los sobrenadantes de los dos matraces son reunidos y centrifugados (por ejemplo, 4ºC, 400 g) y colocados en un recipiente que lleva un identificador único. Una parte alícuota (500 \mul) se mantiene para control de calidad (QC) de la proteína marcada con 6His (QC interno de bioprocesamiento).

Pueden producirse lotes a escala ampliada siguiendo el protocolo denominado "transfección PEI de células en suspensión", referenciado BP/PEI/HH/02/04, con polietilenimina de Polysciences como agente de transfección.

Procedimiento de purificación

La muestra del medio de cultivo que contiene la proteína recombinante con la marca 6His en el extremo carboxilo terminal, se diluye con solución tampón A frío (NaH_{2}PO_{4} 50 mM; NaCl 600 mM, glicerina 8,7% (p/v), pH 7,5). La muestra se filtra luego a través de un filtro estéril (Millipore) y se mantiene a 4ºC en un frasco cuadrado de medios, estéril (Nalgene).

La purificación se efectúa a 4ºC sobre la estación de trabajo VISION (Applied Biosystens) conectada a una cargador automático de muestras (Labormatic). El procedimiento de purificación se compone de dos etapas sucesivas, cromatografía de afinidad con metales, sobre una columna Poros 20 MC (Applied Biosystems) cargada con iones Ni (4,6 x 50 mm, 0,83 ml), seguido de filtración en gel en una columna de medio Sephadex G-25 (Amersham Pharmacia) (1,0 x 1,0 cm).

Para la primera etapa de cromatografía la columna de afinidad con metales es regenerada con 30 volúmenes de columna de solución de EDTA (EDTA 100 mM; NaCl 1M; pH 8,0) recargada con iones Ni por lavado con 15 volúmenes de columna de una solución de NiSO_{4} 100 mM, lavada con 10 volúmenes de columna de solución tampón A, seguido de 7 volúmenes de columna de solución tampón B (NaH_{2}PO_{4} 50 mM; NaCl 600 mM; glicerina, 8,7% (p/v), imidazol, 400 mM, pH 7,5), y finalmente equilibrada con 15 volúmenes de columna de solución tampón A que contenía imidazol 15 mM. La muestra se hace pasar, mediante el cargador de muestras Labomatic, a un lazo de muestras de 200 ml y seguidamente se carga sobre la columna de afinidad con el metal Ni, con un caudal de 10 ml/min. La columna se lava con 12 volúmenes de columna de solución tampón A, seguido de 28 volúmenes de columna de solución tampón A que contenía imidazol 20 mM. Durante el lavado con el imidazol 20 mM las proteínas contaminantes unidas débilmente son eluídas desde la columna. La proteína recombinante con la marca His es eluída finalmente con 10 volúmenes de columna de solución tampón B, con un caudal de 2 ml/minuto, y se recoge la proteína eluída.

Para la segunda etapa de la cromatografía, la columna de filtración en el gel Sephadex G-25 es regenerada con 2 ml de solución tampón D (NaCl 1,137 M; KCl 2,7 mM; KH_{2}PO_{4} 1,5 mM; Na_{2}HPO_{4} 8 mM; pH 7,2), y equilibrada seguidamente con 4 volúmenes de columna de solución tampón C (NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; KH_{2}PO_{4} 1,5 mM; Na_{2}HPO_{4} 8 mM; glicerina, 20% (p/v); pH 7,4). La fracción de pico eluída desde la columna con Ni es cargada automáticamente en la columna de Sephadex G-25 mediante el cargador de muestras integrado en el VISION y la proteína es eluída con la solución tampón C a un caudal de 2 ml/min. La fracción se filtró a través de un filtro estéril de centrifugación (Millipore) se congeló y se almacenó a -80ºC. Una parte alícuota de la muestra se analiza sobre SDS-PAGE (gel NuPAGE 4-12%, Novex) en transferencia Western, con anticuerpos anti-His. El gel NuPAGE puede ser teñido con solución de tinción de azul de coomasie R250 al 0,1% (metanol, 30%, ácido acético,10%) a temperatura ambiente, durante 1 hora, y desteñido seguidamente con metanol, 20%, ácido acético 7,5%, hasta que el fondo es claro y las bandas de proteína son claramente visibles.

Después de electroforesis, las proteínas son electrotransferidas desde el gel a una membrana de nitrocelulosa. La membrana es bloqueadas con polvo de leche al 5% en solución tampón E (NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; KH_{2}PO_{4} 1,5 mM; Na_{2}HPO_{4} 8 mM; Tween 20 al 0,1%; pH 7,4) durante 1 hora, a temperatura ambiente, y seguidamente se incuba con una mezcla de 2 anticuerpos policlonales anti-His, de conejo (G-18 y H-15, 0,2 \mug/ml de cada uno; Santa Cruz ) en polvo de leche al 2,5%, en solución tampón E, durante la noche, a 4ºC. Después de 1 hora adicional de incubación a temperatura ambiente, la membrana se lava con solución tampón E (3 x 10 minutos) y después se incuba con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con HRP (DAKO, HRP 0399) diluido 1/3000 en solución tampón E que contenía polvo de leche al 2,5%, durante 2 horas, a temperatura ambiente. Después de lavar con la solución tampón E (3 x 10 minutos) la membrana se desarrolla con el kit ECL (Amersham Pharmacia) durante 1 minuto. Seguidamente se expone la membrana a un Hyperfilm (Amersham Pharmacia), se revela la película y la imagen de la transferencia western se analiza visualmente.

Para muestras que ponen de manifiesto bandas de proteínas detectables mediante la tinción con el azul de coomasie, puede determinarse la concentración de proteína usando el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce) con albúmina de suero bovino como patrón.

Además. la sobreexpresión o la caída de la expresión del polipéptido en líneas celulares, puede utilizarse para determinar el efecto sobre la activación de la transcripción del genoma de la célula huésped. Los compañeros, co-activadores y co-repressores de dimerización del polipéptido INSP 101, pueden identificarse por inmunoprecipitación combinada con transferencia Western e inmunoprecipitación combinada con espectroscopía de masas.

Lista de secuencias específicas de INSP101 (Nota: para aminoácidos codificados por uniones exón-exón, el aminoácido será asignado al exón más 5').

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SEQ ID NO: 1 (exón 2nov de la secuencia de nucleótidos de INSP101)

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3

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SEQ ID NO: 2 (exón 2nov de la secuencia de la proteína INSP101)

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4

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SEQ ID NO: 3 (exón 3nov de la secuencia de nucleótidos de INSP101)

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5

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SEQ ID NO: 4 (exón 3nov de la secuencia de la proteína INSP101)

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6

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SEQ ID NO: 5 (exones 2nov y 3nov contiguos de la secuencia de nucleótidos de INSP101)

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7

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SEQ ID NO: 6 (exones 2nov y 3nov contiguos de la secuencia de la proteína INSP101)

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8

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SEQ ID NO: 7 (secuencia completa de nucleótidos de INSP101)

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9

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SEQ ID NO: 8 (secuencia completa de la proteína INSP101)

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10

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SEQ ID NO: 9 (secuencia completa de nucleótidos de INSP101 – sin la región del péptido señal)

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11

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SEQ ID NO: 10 (secuencia completa de la proteína INSP101 – sin la región del péptido señal)

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12

Claims

1. Un polipéptido aislado que actúa como una hormona del crecimiento y que:

(i): comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO:8 ó SEQ ID NO: 10; ó

(ii): posee más del 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de (i).

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2. Un polipéptido según la reivindicación 1, que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 8 ó SEQ ID NO:10.

3. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores

4. Una molécula de ácido nucleico purificada que codifica un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

5. Una molécula de ácido nucleico purificada, según la reivindicación 4, que comprende la secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 9.

6. Una molécula de ácido nucleico purificada, según la reivindicación 4, que consiste en la secuencia de ácidos nucleicos indicada en SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 9.

7. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Una célula huésped aislada transformada con un vector según la reivindicación 7.

9. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, un vector según la reivindicación 7, o una célula huésped aislada, según la reivindicación 8, para usar en la terapia o el diagnóstico de una enfermedad.

10. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para usar como una hormona del crecimiento o como un modulador de la actividad de hormonas del crecimiento.

11. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, un vector según la reivindicación 7, o una célula huésped aislada, según la reivindicación 8.

12. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 ó una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

13. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, un vector según la reivindicación 7, una célula huésped aislada, según la reivindicación 8, o una composición farmacéutica según la reivindicación 11, para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos reproductivos, trastornos del embarazo, trastornos del desarrollo, trastornos del crecimiento, deficiencia de hormonas del crecimiento, enfermedad de Cushing, trastornos endocrinos, trastornos proliferativos celulares que incluyen neoplasmas, carcinomas, tumores hipofisarios, tumores ováricos, melanomas, tumores pulmonares, colorrectales, de mama, de páncreas, de cabeza y cuello, tumores trofoblásticos placentarios, adenocarcinomas, coriocarcinomas, osteosarcomas y otros tumores sólidos; angiogénesis, trastornos mieloproliferativos; trastornos autoinmunitarios/inflamatorios; trastornos cardiovasculares; trastornos neurológicos, dolor; trastornos metabólicos; daño pulmonar; envejecimiento; e infecciones.

14. El uso del polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el vector, la célula huésped aislada o la composición farmacéutica, según la reivindicación 13, en el que el trastorno del embarazo es la enfermedad trofoblástica de la gestación.

15. El uso del polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el vector, la célula huésped aislada o la composición farmacéutica, según la reivindicación 13, en el que el trastorno inherente al desarrollo es el síndrome de Silver-Russell.

16. El uso del polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el vector, la célula huésped aislada o la composición farmacéutica, según la reivindicación 13, en el que el trastorno metabólico está seleccionado entre diabetes mellitus, osteoporosis, obesidad, caquexia, SIDA y enfermedad renal.

17. El uso del polipéptido, la molécula de ácido nucleico, el vector, la célula huésped aislada o la composición farmacéutica, según la reivindicación 13, en el que la infección está seleccionada entre infección viral, infección bacteriana, infección fúngica e infección parasítaria.

18. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, un vector según la reivindicación 7, una célula huésped aislada según la reivindicación 8 o una composición farmacéutica, según la reivindicación 11, para usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad en la que están implicadas proteínas de hormonas del crecimiento.

19. Un método de identificación de un compuesto eficaz para el tratamiento y/o el diagnóstico de una enfermedad, que comprende poner en contacto un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, con uno o más compuestos que se cree que poseen afinidad de unión para dicho polipéptido o dicha molécula de ácido nucleico, y seleccionar un compuesto que se une específicamente con dicha molécula de ácido nucleico o dicho polipéptido.